CN101967467B - 一种高稳定性的重组羧肽酶b的生产及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高稳定性的重组羧肽酶B的生产及应用。公开了一种生产重组羧肽酶B的方法，所述方法包括：(1)重组表达N端带有突变的前导序列的羧肽酶B，获得包涵体形式的重组蛋白；(2)将包涵体形式的重组蛋白进行变性和复性，获得可溶性重组蛋白；和(3)切除所述可溶性重组蛋白N端带有前导序列的羧肽酶B的前导序列，获得重组羧肽酶B。本发明采用一种分子内分子伴侣提高了羧肽酶B的体外折叠，获得的重组羧肽酶B稳定性高，可良好地抗胰蛋白酶酶解。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高稳定性的重组羧肽酶B的生产及应用。
背景技术
羧肽酶B在胰腺中含量少，胰腺提取所得的羧肽酶B不能保证去除其它蛋白酶活性，重组羧肽酶B的生产解决了这一问题，但是在重组羧肽酶B的生产过程中，特别是大肠杆菌生产过程中，以包涵体的形式，需经进一步的变性复性可获得活性的羧肽酶B，但其复性率是影响其规模化生产的瓶颈。
很多原核和真核生物的蛋白酶以酶原形式合成，折叠成熟后，前导序列被相应的蛋白酶识别、切除并降解后，得到有活性的蛋白酶。前导序列作为分子内分子伴侣(InterMolecular Chaperon，IMC)，其中一类主要参与多肽链的延伸和正确折叠，它介导的蛋白酶折叠特点有：IMC在体内与多肽链以共价键结合，具有高度特异性；在结构及编码基因上与它作用的蛋白质紧密相连；IMC可与经它作用后以折叠形式存在的蛋白质(酶)相互作用，并是其竞争性抑制剂；IMC释放其作用的“底物”不依赖于ATP水解供能，但依赖于折叠完成的“底物”或胞内蛋白酶的酶解作用。
有些情况下，没有IMC的存在，蛋白质无法自发地完成折叠过程，这种依赖于前导序列的蛋白质折叠现象最早是1987年Ikemura等在研究枯草杆菌蛋白酶时发现的。而且在不同的IMC帮助下，一级结构完全一样的蛋白质折叠形成的最终构象表现出明显不同的酶学特性。
大量体内表达、体外重折叠研究结果表明，前导序列的IMC作用并不一定要求它与其所帮助折叠的蛋白质共价连接在一起，亦即IMC也可以反式地辅助蛋白质完成正确的折叠与成熟。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高稳定性的重组羧肽酶B的生产及应用。
在本发明的第一方面，提供一种生产重组羧肽酶B的方法，所述方法包括：
(1)重组表达N端带有突变的前导序列的羧肽酶B，获得包涵体形式的重组蛋白；
(2)将步骤(1)获得的包涵体形式的重组蛋白进行变性和复性，获得可溶性重组蛋白(具有正确构象的蛋白)；和
(3)切除所述步骤(2)获得的可溶性重组蛋白N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的前导序列，获得重组羧肽酶B(有酶活性)。
在一个优选例中，所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸；或
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第34位突变为Gln；或
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第55位突变为Arg；或
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一个或多个氨基酸缺失(包括：缺失1、2、3、4或5个氨基酸)。
在另一优选例中，步骤(3)中，用胰蛋白酶处理所述N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的前导序列，从而切除所述突变的前导序列。
在另一优选例中，在处理时胰蛋白酶与所述N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的质量比是1∶(5-15)；优选1∶10。
在另一优选例中，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达融合蛋白。
在另一优选例中，步骤(2)中，采用8±2M的尿素进行变性。
在另一优选例中，步骤(3)之后，还包括：将获得的重组羧肽酶B在4±2℃；20±10％(v/v)甘油中保存。优选地，将获得的重组羧肽酶B在4±1℃；20±5％(v/v)甘油中保存。
在本发明的另一方面，提供一种突变的前导序列，所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸；或
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第34位突变为Gln；或
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第55位突变为Arg；
所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一个或多个氨基酸缺失(包括：缺失1、2、3、4或5个氨基酸)。
在本发明的另一方面，提供所述的突变的前导序列的用途，用于与羧肽酶B的N端连接，促进羧肽酶B的重折叠。
在本发明的另一方面，提供一种核酸，所述的核酸编码所述的突变的前导序列。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体含有所述的核酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的细胞，所述的细胞含有所述的表达载体；或其基因组中整合有所述的表达载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、重组羧肽酶B在含有前导序列(pro(+))及不含前导序列(pro(-))的复性液中的复性动力学比较。
图2、含有分子内分子伴侣的重组羧肽酶原B的复性过程。
图3、Trypsin酶解proCPB不同时间的Tricine-SDS-PAGE。其中，泳道1～8分别是酶解20min；40min；1h；1.5h；2h；2.5h；3h；3.5h后酶解产物的电泳结果。箭头所示为前导肽(pro)。
图4、DEAE-FF连续梯度洗脱电泳图。泳道1～8分别是连续洗脱管号37；38；39；40；41；42；43；44。
图5、N-端延长的前导序列抑制羧肽酶的激活。其中，泳道1表示复性液，泳道2表示复性液酶解后，泳道3表示上清，泳道4表示上清酶解后。
图6、突变后前导序列的编码基因序列。
具体实施方式
为了解决现有技术中难以重组表达重组羧肽酶B或表达效率不高的技术缺陷，本发明人经过深入的研究，出乎意料地找到一种生产高活性的重组羧肽酶B的方法。本发明人采用一种分子内分子伴侣提高了羧肽酶B的体外折叠，该分子内分子伴侣来源于羧肽酶B的前导序列的突变体或截短体。本发明的方法获得的重组羧肽酶B稳定性高，可良好地抗胰蛋白酶酶解。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
羧肽酶B
如本文所用，重组羧肽酶B表示通过重组体DNA方法和其他人工方法制备的重组多肽，它具有与任何天然存在的羧肽酶B相同的或基本上相同的氨基酸序列。羧肽酶原B是羧肽酶B的前体形式，受胰蛋白酶酶解可被激活成具有活性的羧肽酶原B。
任何来源的重组羧肽酶B均可用于本发明。例如，一种鼠源的重组羧肽酶原B是具有的蛋白序列与GenBank登录号NP_036665.1所示的序列基本上相同，其编码序列如GenBank登录号P19223所示的序列基本上相同。其前导序列如SEQ ID NO：2所示。
众所周知，根据已公开的重组羧肽酶B序列，本领域技术人员可以通过PCR扩增等方法制备重组羧肽酶B的编码序列，然后将其插入表达载体，进而转化常见的宿主细胞(如大肠杆菌)，就可以表达重组羧肽酶B。例如，通过IPTG诱导使得大肠杆菌表达重组羧肽酶B，然后回收该重组羧肽酶B。
突变的前导序列
本发明提供了有助于生产高活性的重组羧肽酶B的分子内伴侣，即基于重组羧肽酶B的前导序列进行改造获得的突变形式的前导序列或截短体。与采用非改造的前导序列重组表达获得的重组羧肽酶B相比，所述经改造的突变的前导序列的编码分子与重组羧肽酶B的编码分子连接后重组表达获得的重组羧肽酶B具有显著高的酶活性和稳定性。
所述的突变的前导序列为：对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸(即：除了第19位上突变为天冬氨酸，该氨基酸序列其它位点的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同)；或对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第34位突变为Gln；或对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第55位突变为Arg；或对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一个或多个氨基酸缺失(包括：缺失1、2、3、4或5个氨基酸)。将突变引入蛋白序列中的方法是本领域人员所熟知的。
作为本发明的更优选方式，所述的突变的前导序列为：对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸；或对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的5个氨基酸缺失。
本发明还提供了编码所述的突变的前导序列的分离的核酸，也可以是其互补链。编码本发明突变的前导序列的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
通常可将所述的突变的前导序列的编码分子连接于成熟的羧肽酶B编码序列的5’端；或者，可直接获得带有前导序列的羧肽酶B的编码分子，然后在对应于指定的氨基酸突变位点的碱基位置引入突变。从而，获得带有突变的前导序列的羧肽酶B的编码序列。
在获得了编码带有突变的前导序列的羧肽酶B的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到带有突变的前导序列的羧肽酶B。
因此，本发明还提供了包含编码所述带有突变的前导序列的羧肽酶B的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述带有突变的前导序列的羧肽酶B的表达。“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码所述带有突变的前导序列的羧肽酶B的DNA序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。在本发明的一种实施方式中，所述的载体为原核载体。
此外，含有编码所述带有突变的前导序列的羧肽酶B的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。在本发明中，所述的“重组细胞”通常是原核细胞。常用的原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；优选的可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达所述带有突变的前导序列的羧肽酶B。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
生产重组羧肽酶B的方法
本发明提供了生产重组羧肽酶B的方法，所述方法包括：(1)重组表达N端带有突变的前导序列的羧肽酶B，获得包涵体形式的重组蛋白；(2)将步骤(1)获得的包涵体形式的重组蛋白进行变性和复性，获得可溶性重组蛋白(复性后的蛋白)；和(3)切除所述步骤(2)获得的可溶性重组蛋白N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的前导序列，获得重组活性羧肽酶B。
本发明的方法的特点是：先重组表达获得带有突变的前导序列的羧肽酶B，经变复性后将位于N端的前导序列切除，得到高活性的重组羧肽酶B。
切除带有前导序列的羧肽酶B的前导序列、以获得羧肽酶B的方法是本领域技术人员熟知的，通常采用一些适合的蛋白内切酶。优选地，采用胰蛋白酶处理所述的融合蛋白，从而切除N端的前导序列。利用胰蛋白酶处理来切除所述的前导序列，其能够识别Lys和Arg，在它们的羧基端切开。
作为本发明的优选方式，在处理时胰蛋白酶与所述N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的质量比是1∶(5-20)；优选地是1∶(5-15)；更优选1∶10。
作为本发明的优选方式，采用大肠杆菌重组表达所述N端带有突变的前导 序列的羧肽酶B，最优选的是大肠杆菌BL21(DE3)。
对于表达重组羧肽酶B的大肠杆菌，通过本领域人员常用的破细胞手段(如珠磨法破碎、液氮研磨破碎、压力杯法破碎、超声破碎等)，可以获得包涵体形式的重组羧肽酶B。作为本发明的优选方式，采用超声破碎细胞可以获得良好的细胞破碎效果。
获得包涵体形式的重组羧肽酶B后，可进一步进行变性和复性，以获得可溶性的重组羧肽酶B。对于包涵体的变性和复性的方法没有特别的限制。优选地，采用8±2M(优选8M)尿素而不是6M盐酸胍进行变性。复性优选采用含有100mM Gly-NaOH，pH9.5，GSH 1mM，0.1mM ZnCl2的复性液。
获得的复性的重组羧肽酶B可进一步进行纯化，或在激活后进一步进行纯化。一种优选的纯化方法为阴离子交换层析法；优选的阴离子树脂包括DEAE阴离子交换树脂(如DEAE-FF阴离子交换树脂)；优选的纯化方法包括连续NaCl梯度洗脱；优选的NaCl洗脱的浓度范围为0-0.5M。
为了提高重组羧肽酶B的稳定性，本发明人还研究了其经济实用的保存方法，结果发现，将获得的重组羧肽酶B在4±2℃；20±10％(体积比)甘油中保存是较为优选的，其在保存120天后仍然能够保留100％的酶活性。更优选地，在4±1℃；20±5％(体积比)甘油中保存。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明人找到了对于重组羧肽酶B非常合适的分子内分子伴侣，有效地提高了重组羧肽酶B的复性率以及酶活性。
(2)本发明的方法获得的重组羧肽酶B稳定性高，抗胰蛋白酶酶解，液体状态4℃放置，1年以上没有酶活损失。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、羧肽酶B的重组表达
1、带有前导序列的羧肽酶B(羧肽酶原B)的重组表达
设计以下引物：
正向：5’GCG CCA TGG CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GATGGC-3’(SEQ ID NO：3)，含Nco I限制性酶切位点；
反向：5’-CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATAATT-3’(SEQ ID NO：4)，含Hind III限制性酶切位点及终止密码子。
以胰腺cDNA文库(购自Invitrogen)为模板，用前述引物进行PCR扩增获得带有前导序列的羧肽酶B的编码序列。
前述获得的序列用Nco I/HindIII酶切后插入到pET表达载体(购自Invitrogen)的相应位点中，测序鉴定获得正确插入的重组表达载体。将该重组表达载体常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得转化子。
挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30mL LB培养液中(含100μg/mLAmp)，置于37℃摇床过夜培养(10～12h)后，以2％接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度至OD6000.5～0.6时，于37℃和12℃下分别加入终浓度0.5mmol/LIPTG诱导4小时，10000rpm离心收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心后获得包涵体形式的带有前导序列的重组羧肽酶B。
2、带有前导序列的羧肽酶B(羧肽酶原B)的包涵体的变性、复性，及激活纯化获得重组活性羧肽酶B
将上述获得的包涵体用8M尿素按照20mg/ml进行溶解，离心，上清滴加到复性液(100mM Gly-NaOH，pH9.5，GSH 1mM，0.1mM ZnCl2)中，至终蛋白浓度为200μg/ml，放置复性24h。调pH8.0，按照1∶10(w/w)的比例加入胰蛋白酶，37℃激活2h，测活。
测活方法如下：以马尿酰-L-精氨酸(Sigma)为底物，或根据Sigma规定的测定羧肽酶B的方法。活力单位定义为在0.001M的底物浓度下每分钟的底物水解百分数，测活缓冲液为：0.025M Tris-HCl，pH7.65，含0.1M NaCl。
用2×15cm离子交换层析柱，离子交换柱事先用20mM Tris-HCl，pH8.0的缓冲液平衡，然后激活后的复性液上样，用相同的缓冲液平衡至基线平稳后，用含0～0.5M NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每管的OD280和酶活，把有酶活的收集液合并，测总酶活和总蛋白含量。合并酶活高的收集管，即得纯化的活性重组羧肽酶B(CPB)。纯化结果见图4。
此外，采用相同的方法，但是在复性后不进行胰蛋白酶酶解激活，纯化后可得带有前导序列的重组羧肽酶B(羧肽酶原B，proCPB)。
3、前导序列的制备
对不同酶解时间的羧肽酶原B样品进行Tricine-SDS-PAGE，由图3可以很清楚地看到酶解时间为20min时，前导肽(分子量为10kD)没有完全酶解；而40min时前导肽浓度与20min相比，浓度有所降低，此时酶解时间稍微过长，部分前导肽(pro)被消化；继续延长酶解时间，在3.5h时，前导肽几乎已经完全被酶解消化掉。所以，当胰蛋白酶和羧肽酶原B(proCPB)质量比为1∶140，37℃酶解时，选取30min为最佳酶解时间。
为了制备大量的前导肽，本发明人选取最佳酶解比例和时间，对羧肽酶原B复性液酶解，然后进行阴离子交换层析，利用连续浓度梯度洗脱，获得前导肽。测定蛋白浓度为0.1mg/ml。
4、N端添加6个组氨酸的带有前导序列的羧肽酶原B的重组表达
重组表达方法同前述“1”，不同点在于，通过引物设计在对应带有前导序列的羧肽酶原B的N端的编码序列之前加上编码6个组氨酸的一段编码序列，获得N端添加6个组氨酸的带有前导序列的羧肽酶原B的编码序列。
N端添加6个组氨酸的带有前导序列的羧肽酶原B的重组表达同前述“1”。
5、N-端前导序列突变的羧肽酶原B突变体的重组表达
重组表达方法同前述“1”，不同点在于，羧肽酶原B的N-端前导序列突变为如下序列：按照实施例1中的序列进行突变，选择的位点为：第19位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，该突变后前导序列的编码基因(SEQ ID NO：1)见图6；第2位由丙氨酸(A)突变为组氨酸(H)；第34位由谷氨酸(E)突变为谷胺酰胺(Q)；第49位由亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)；第55位由组氨酸(H)突变为精氨酸(R)。所述突变通过设计突变引物以及PCR扩增来实现。
N-端前导序列突变的羧肽酶原B突变体的重组表达同前述“1”。
实施例2、前导序列作为分子间分子伴侣对羧肽酶B折叠的作用
1mg/ml的纯化后所得重组羧肽酶B，在8M尿素中变性2h后，直接10倍稀释到复性缓冲液(100mM Gly-NaOH，pH 9.5，GSH 1mM，0.1mM ZnCl2)中，此时复性缓冲液中的蛋白终浓度为0.1mg/ml。从稀释复性开始计时，每间隔一定时间取样0.1ml测活。100％酶活定义为原酶液(1mg/ml)直接在pH9.5，0.1MGly-NaOH稀释10倍的活力。
活性测定以马尿酰-L-精氨酸为底物，活力单位定义为在0.001M的底物浓度下每分钟的底物水解百分数，测活缓冲液为：0.025M Tris-HCl，pH7.65，含0.1M NaCl。
按照摩尔比CPB∶pro＝1∶1，将前导序列(pro)加入到复性液中，之后将变性CPB滴加到复性液中，其余步骤同上述。
图1为重组羧肽酶B在含有及不含有前导序列的复性液中的复性动力学。重组羧肽酶B在8M尿素中变性2h后滴加到复性液中开始复性。0时的活力正好与图中CPB在8M尿素中变性2h时的活力相当。在整个复性过程中，羧肽酶B在加与不加前导序列的复性液中，活力基本没有明显区别；由此可见，复性液中加入小分子前导序列对于重组羧肽酶B来说并没有促进重折叠，也就是说，前导序列不能作为分子外伴侣对羧肽酶B的复性起作用。为了进一步确证这一结果，本发明人把活性CPB在8M尿素中变性24h，使活力完全丧失，然后重复以上复性过程，经过24h复性后测定酶活，依然未检测到活性。这就进一步说明，对于CPB来说，加入分子间分子伴侣对其活力恢复没有帮助，同时也说明了，当CPB完全变性后，本身不能自发复性。
实施例3、前导序列作为CPB的分子内分子伴侣对羧肽酶B的复性作用
0.5mg/ml的复性纯化后的酶原proCPB(即带有前导序列的重组羧肽酶B，复性后未经胰蛋白酶酶解激活，纯化后所得)在8M尿素中变性24h后，直接5倍稀释到复性缓冲液中，室温复性，此时终蛋白浓度为0.1mg/ml。从稀释复性开始计时，每间隔一段时间取1ml，立刻加入胰蛋白酶酶解激活，其中羧肽酶原B：胰蛋白酶的质量比为10∶1，37℃保温40min后，测定CPB活性。100％酶活定义为原酶液(1mg/ml)直接在稀释5倍后，相同方法酶解激活后测定的活力。
包涵体形式的酶原(即带有前导序列的重组羧肽酶B)在8M尿素中变性24h后，其活性的天然结构完全丧失。经过复性，活力在7h内即可恢复，之后稍微下降，并趋于稳定，最终活力恢复了约25％，见图2。由此可见，对于CPB来说，分子内前导序列的存在可帮助CPB重折叠，使其恢复活力，而前导序列不能作为分子间分子伴侣起作用。
实施例4、N-端延长的前导序列抑制羧肽酶的激活
N端添加6个组氨酸的带有前导序列的羧肽酶原B的激活测定方法同前述实施例3中对带有前导序列的重组羧肽酶B的激活测定。
结果发现，羧肽酶原B前导序列N端加6个组氨酸不能被激活。
见图5。复性液在43KDa处有条带，复性液经胰蛋白酶酶解后在35KDa处有条带，上清和上清酶解后均在43KDa处有条带。
实施例5、N-端的前导序列突变体增加羧肽酶B的激活
胰蛋白酶的激活方法如下：测定复性液中蛋白含量，根据蛋白含量按照10∶1(w∶w)的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解2小时测活。
酶活性的测定同前述实施例1中。
结果见表1。
表1
| 为精氨酸(R))的羧肽酶B |
可见，含突变体的前导序列(第19位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D))的羧肽酶B显著增加了羧肽酶激活后的酶活性，但突变序列G19E的效果最好。
实施例6、重组羧肽酶B对胰蛋白酶的稳定性
此处针对含突变体前导序列(第19位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)的羧肽酶B经胰蛋白酶激活处理后，纯化去除杂蛋白，收集活性峰获得的纯化的活性重组羧肽酶B。该重组羧肽酶B中加入不同量的胰蛋白酶，观察重组羧肽酶B的活性变化。
结果见表2，可见本发明获得的重组羧肽酶的稳定性非常好。
表2
实施例7、重组羧肽酶B在反复冻融过程的稳定性
此处针对含突变体前导序列(第19位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D))的羧肽酶B经胰蛋白酶激活处理后，纯化去除杂蛋白，收集活性峰获得的纯化的活性重组羧肽酶B。纯化的重组羧肽酶B于-20℃反复冻融数次(12次)，基本上没有活性损失，即保留了100％的活性。
实施例8、重组羧肽酶B放置过程中的稳定性
此处针对含突变体前导序列的羧肽酶B经胰蛋白酶激活处理后，纯化去除杂蛋白，收集活性峰获得的纯化的活性重组羧肽酶B。该重组羧肽酶B中加入20％甘油，分别于4℃、-20℃和室温(25℃)放置，一定时间测活，观察重组羧肽酶B在放置过程中的稳定性。
结果见表3，可见本发明获得的重组羧肽酶B在长期放置过程中的稳定性 非常好。20％(体积比)的甘油对重组羧肽酶B的长期放置具有很好的保护作用。4℃+甘油是最合适的保持方法。
表3保存过程中的稳定性
| 保存天数 | 常温 | 常温+甘油 | 4℃ | 4℃+甘油 | -20℃ | -20℃+甘油 |
| 12天 | 38％ | 83％ | 73％ | 100％ | 87％ | 95％ |
| 24天 | 28％ | 59％ | 87％ | 100％ | 100％ | 91％ |
| 120天 | 0 | 70％ | 67％ | 100％ | 46％ | 91％ |
实施例9、前导序列的N-端突变对于酶活的影响
设计以下引物(其中划线部分为限制性内切酶的酶切位点)实现前导序列的N-端突变，获得N端分别截短5、10、15或20个氨基酸的前导序列，分别为M1-C5、M2-C10、M2-C15或M2-C20。
M1-C5-5’5’-AA CATATG CACTTTGATGGCAAC(SEQ ID NO：5)；
M1-C5-3’ACAAGCTT CTAATATAGATGTTC(SEQ ID NO：6)；
M2-C10-5’5’-AA CATATGCGGGTGTACCGTGTC(SEQ ID NO：7)；
M2-C10-3’ACAAGCTT CTAATATAGATGTTC(SEQ ID NO：8)；
M3-C15-5’5’-AA CATATG AGTGTACATGGTGAA(SEQ ID NO：9)；
M3-C 15-3’ACAAGCTT CTAATATAGATGTTC(SEQ ID NO：10)；
M4-C20-5’5’-AA CATATG GATCACGTCAACTTA(SEQ ID NO：11)；
M4-C20-3’AC AAGCTT CTAATATAGATGTTC(SEQ ID NO：12)。
获得的突变后的CPB分别命名为M1-CPB，M2-CPB，M3-CPB，M4-CPB，结果见表4，发现M1，M2激活后具有酶活，其中M1-CPB的活性高于野生型CPB30％，说明N端5个氨基酸对于CPB构象并不必需。M3和M4均不能获得有活性的酶或者获得的酶不能被激活。说明5个以内的氨基酸的N端截短体可提高CPB 的活性；而超过5个以上的氨基酸的N端截短体对于突变CPB是不可取的。
表4
| 突变体 | 活性(U/mg) |
| 野生型 | 20 |
| M1-C5 | 26 |
| M2-C10 | 15 |
| M3-C15 | 5 |
| M4-C20 | 5 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海雅心生物技术有限公司
<120>一种高稳定性的重组羧肽酶B的生产及应用
<130>092936
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>249
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>突变后前导序列的编码基因
<400>1
catgcttccg aggagcactt tgatggcaac cgggtgtacc gtgtcagtgt acatgatgaa 60
gatcacgtca acttaattca ggagctagcc aacaccaaag agattgattt ctggaaacca 120
gattctgcta cacaagtgaa gcctctcact acagttgact ttcatgttaa agcagaagat 180
gttgctgatg tggagaactt tctggaggag aatgaagttc actatgaggt actgataagc 240
aacgtgaga 249
<210>2
<211>83
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>2
His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser
1 5 10 15
Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr
20 25 30
Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val
50 55 60
Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser
65 70 75 80
Asn Val Arg
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
gcgccatggc atgcttccga ggagcacttt gatggc 36
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
cgcaagcttt cactaatata gatgttctcg gacataatt 39
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
aacatatgca ctttgatggc aac 23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
acaagcttct aatatagatg ttc 23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
aacatatgcg ggtgtaccgt gtc 23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
acaagcttct aatatagatg ttc 23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
aacatatgag tgtacatggt gaa 23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
acaagcttct aatatagatg ttc 23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>11
aacatatgga tcacgtcaac tta 23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>12
acaagcttct aatatagatg ttc 23
Claims (7)
1.一种生产重组羧肽酶B的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)重组表达N端带有突变的前导序列的羧肽酶B，获得包涵体形式的重组蛋白；所述的突变的前导序列对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸；
(2)将步骤(1)获得的包涵体形式的重组蛋白进行变性和复性，获得可溶性重组蛋白；和
(3)切除所述步骤(2)获得的可溶性重组蛋白N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的前导序列，获得重组羧肽酶B。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，用胰蛋白酶处理所述N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的前导序列，从而切除所述突变的前导序列。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在处理时胰蛋白酶与所述N端带有突变的前导序列的羧肽酶B的质量比是1∶(5-15)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达融合蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用8±2M的尿素进行变性。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后，还包括：将获得的重组羧肽酶B在4±2℃；按照体积20±10％甘油中保存。
7.一种突变的前导序列，其特征在于，所述的突变的前导序列对应于SEQID NO：2所示的氨基酸序列，其中第19位突变为天冬氨酸。
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