KR102055874B1 - 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 - Google Patents

신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 L-류신의 생산 방법 {A Novel Isopropylmalate Synthase Variant and a Method of Producing L-Leucine Using the Same}
본 출원은 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-류신은 필수 아미노산의 일종으로 의약, 식품, 사료첨가물 및 공업 약품 등에 광범위하게 사용되는 고가의 아미노산으로서, 주로 미생물을 이용하여 생산된다. L-류신을 포함한 분지쇄 아미노산의 발효 생산은, 주로 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 2-케토이소카프로산 (2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다 (대한민국 등록특허 제10-0220018호, 대한민국 등록특허 제10-0438146호).
상기 류신 생합성에 관여하는 효소인 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase, 이하, "IPMS"로 지칭함)는 발린 생합성 경로 중 생성되는 2-케토아이소발러레이트 (2-ketoisovalerate)를 발린 대신 류신 생합성에 필요한 이소프로필말레이트 (isopropylmalate)로 전환하는 류신 생합성의 1 단계 효소로, 류신 생합성 과정에서 중요한 효소이다. 그러나 상기 IPMS는 최종 산물인 L-류신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해를 받는다. 이에 고농도 류신 생산을 목적으로 피드백 저해를 해제한 IMPS 변이체에 대하여 다양한 선행기술이 존재하나 (미국 공개특허 제2015-0079641호, 미국 등록특허 제6403342호), 여전히 더 나은 변이체 발굴에 대한 연구는 지속되고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 고농도의 L-류신 생산에 사용할 수 있는 IMPS 변이체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 IMPS 변이체를 개발하였다. 상기 변이체는 최종산물인 L-류신에 대한 피드백 저해가 해제되고 활성도 강화되어, 이를 포함하는 미생물로부터 고수율로 L-류신을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 출원을 완성하였다.
본 출원은 하나의 목적으로, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드를 포함한다.
본 출원은 다른 목적으로, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원은 또 다른 목적으로, 상기 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물을 포함한다.
본 출원은 또 다른 목적으로, 상기 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 방법을 포함한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 신규 변이형 폴리펩티드이다. 상기 신규 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 본 출원의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 활성이 높을 뿐 아니라 L-류신에 대한 피드백 저해가 해제된 특징을 가진다.
본 출원에서 용어, "이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)"는 2-케토아이소발러레이트 (2-ketoisovalerate)를 아세틸-CoA와 반응시켜 L-류신의 전구체 중 하나인 이소프로필말레이트 (isopropylmalate)로 전환하는 효소이다. 본 출원에서 이소프로필말레이트 신타제는 상기 전환 활성을 가지는 효소이면 미생물 유래에 상관없이 포함될 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움속 미생물 유래의 효소일 수 있다. 더욱 구체적으로 이소프로필말레이트 신타제는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래 이소프로필말레이트 신타제일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 이소프로필말레이트 신타제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 이소프로필말레이트 신타제에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "이소프로필말레이트 신타제의 활성 증가"는 이소프로필 말레이트로의 전환 활성 증가를 의미하므로, 본 출원의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 더 높은 수준의 이소프로필말레이트 전환 활성을 갖는다. 상기 이소프로필말레이트 전환 활성은 생성되는 이소프로필말레이트의 수준을 측정하여 직접 확인하거나, 또는 생성되는 CoA의 수준을 측정하여 간접적으로 확인할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "활성 증가"는 "활성 강화"와 병용하여 사용될 수 있다. 나아가, 이소프로필말레이트는 L-류신의 전구체 중 하나이므로 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 이용하는 경우 서열번호 1의 이소프로필 말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 결과적으로 더 높은 수준으로 L-류신을 생산할 수 있다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 갖는 폴리펩티드와 달리, 최종 산물인 L-류신 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 해제된 특징을 가지는 것일 수 있다. 본 출원에서 용어, "피드백 저해 (feedback inhibition)"는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하는 것을 말한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 출원의 목적상 상기 피드백 저해는 L-류신 또는 이의 유도체가 이의 생합성 경로의 첫 번째 단계를 매개하는 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 저해하는 것일 수 있다. 따라서, 이소프로필말레이트 신타제의 피드백 저해를 해제하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 L-류신의 생산성을 높일 수 있다.
본 출원에서 용어 "변이", "변이형" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻한다. 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase)에 상응하는 아미노산 서열이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가되거나, L-류신 및 이의 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되거나 활성 증가와 피드백 저해가 해제가 모두 이루어진 변이체를 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 상기 알지닌 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 글리신 이외의 다른 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 알지닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 리신, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 알지닌 아미노산 잔기가 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된 변이형 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 상기 558 번째 알지닌이 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로 치환되고, 상기 561 번째 글리신이 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 서열번호 35 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 이소프로필말레이트 신타제에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 특정 변이 위치인 558 번째 및/또는 561 번째 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열이 변이된 것은 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 한편, 특정 변이 위치인 558 번째 및 561 번째는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단을 기준으로 파악되는 위치를 의미하는 바, 서열번호 1의 N-말단에 일부 아미노산이 부가 또는 결손되는 경우 해당 아미노산의 개수를 고려하여 산정되는 것 역시 본 출원의 범위 내에 포함되는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 예컨대, 이소프로필말레이트 신타제를 암호화하는 유전자인 leuA는 서열번호 1에서는 616 개의 아미노산으로 표기하였으나, 문헌에 따라 번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 581개의 아미노산으로 공지한 경우도 있으므로, 이러한 경우 상기 558 번째 위치는 523 번째 위치로, 561 번째 위치는 526 번째 위치로 해석되어 본 출원의 범위에 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 아미노산인 알지닌이 알지닌 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 아미노산 잔기가 글리신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로는 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지면서 서열번호 21 내지 35의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 이와 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리펩티드 또는 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지며 상기 폴리펩티드에서 특정 변이 위치인 558 번째 및/또는 561 번째 아미노산 서열이 변이된 것은 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제한 없이 포함될 수 있다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열도 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 상동성이 높은 유전자끼리, 예를 들면, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 약 300bp 정도 길이의 프로브를 사용하는 경우에, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 제시될 수 있다.
한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36 내지 서열번호 50 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 변이형 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물이다.
본 출원에서 상기 미생물은 형질전환을 통해 인공적으로 제조되거나, 또는 자연적으로 발생되는 것을 모두 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물 일 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 본 출원에서 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법, 열 충격법 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환되는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체, 예를 들어 벡터의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함할 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) 같은 트랜스포존 (Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 pECCG117 벡터를 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현/치환 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수 있는 재조합 벡터일 수 있다.
본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균 등의 미생물에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에서 선별 마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린 (ampicilin), 테트라사이클린 (tetracyclin), 카나마이신 (kanamycin), 클로람페니콜 (chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신 (neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 것을 의미한다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어, "벡터가 도입된 (형질전환된) 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는, 상기의 벡터를 도입하여 이소프로필말레이트 신타제를 생산할 수 있는 변이형 폴리펩티드를 포함한 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 속 (Escherichia sp.), 어위니아 속 (Erwinia sp .), 세라티아 속 (Serratia sp .), 프로비덴시아 속 (Providencia sp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 및 브레비박테리움 속 (Brevibacterium sp .)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 상기 코리네박테리움 속의 미생물의 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 상기 이소프로필말레이트 신타제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물은 상기 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함한다.
본 출원의 또 다른 양태는, (a) 상기 L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 미생물 또는 배양 배지로부터 L-류신을 회수하는 단계를 포함하는, L-류신을 생산하는 방법이다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 35 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생성된 L-류신을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 배지로부터 목적하는 L-류신을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-류신을 회수할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 출원의 신규한 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 야생형 이소프로필말레이트 신타제에 비해 활성이 증가되고 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 것으로, 이를 이용하여 L-류신을 고수율로 대량 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 류신 생산능을 가지는 미생물 KCCM11661P의 leuA 염기서열 확인
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 121 ℃에서 15 분간 멸균한 하기 기재된 성분의 종배지에 접종하고, 13 시간 동안 배양한 후 배양액 25 ㎖을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액 (citrate buffer)으로 세척한 후, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 400 ㎍/㎖가 되게 첨가하여 30 분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액 (phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 하기 기재된 성분의 최소배지에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 99.6 %였다. 노르류신 (Norleucine, NL)에 대한 내성 변이주를 구하기 위해서, NTG가 처리된 균주를 NL의 최종농도가 각각 20 mM, 40 mM 및 50 mM이 되게 첨가된 최소배지에 도말하고, 30 ℃에서 5 일간 배양하여 NL 내성 변이주를 획득하였다.
<종배지>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준), pH 7.0
<생산배지>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 (Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1,000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3,000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0
상기의 방법으로 얻어진 변이주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-24 (Corynebacterium glutamicum KCJ-24)와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-28(Corynebacterium glutamicum KCJ-28)라 명명하였고, 2015년 1월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM11661P 및 KCCM11662P를 부여받았다. 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-24와 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-28은 각각 2.7, 3.1g/L의 농도로 L-류신을 생산하여, 모균주에 비해 약 10 배 이상 L-류신 생산성이 증가한 것을 확인하였다.
다음으로, 상기 변이주 KCCM11661P 에서 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase, IPMS)를 암호화하는 유전자 (leuA)의 변이 여부를 확인하고자 하였다. 야생형 leuA의 아미노산 서열 (서열번호 1)은 Genebank의 WP_003863358.1을 참고하여 확인하였다. 변이주의 염색체 DNA를 중합효소 연쇄반응방법 (이하 'PCR 방법'이라 함)을 통하여 증폭하였다. 상기 leuA는 616 개 아미노산으로 공지되었으나 문헌에 따라 번역 개시코돈을 35 개 뒤로 표기하여 581 개의 아미노산으로 공지한 경우도 있다. 이 경우 하기에 변이로 기재한 아미노산의 번호가 달라질 수 있어, 581 개의 아미노산임을 전제로 하는 경우는 괄호로 변이 위치를 추가 표기하였다.
구체적으로, 먼저 상기 변이주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 2 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 2700 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 이를 동일한 프라이머로 염기서열을 분석한 결과, KCCM11661P에서 leuA 유전자의 1673 번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 IPMS 단백질의 558 번째 (또는 523 번째; 이하 558 번째로만 표기) 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되는 변이임을 의미한다. 또한, 1682 번째, 1683 번째 뉴클레오티드인 GC가 AT로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 561 번째 (또는 526 번째, 이하 561 번째로만 표기) 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환되는 변이임을 의미한다.
실시예 2 : IPMS 변이체 치환 벡터 제작
상기 실시예 1에서 확인된 변이 염기서열을 포함하는 벡터를 제작하고자, 상기 변이주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 5과 6의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 SalI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1460 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 SalI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)로 라이게이션 (ligation)을 통해 pDZ-leuA(R558H, G561D)를 제작하였다. 또한, 각각의 변이가 들어간 벡터를 제작하기 위해 ATCC14067을 주형으로 프라이머 5, 7 및 프라이머 8, 6을 이용하여 각각 2 개의 단편을 증폭하였다. 제작한 두 개의 단편을 주형으로 하여 프라이머 5, 6을 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 SalI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1460 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 SalI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 라이게이션을 통해 pDZ-leuA(R558H) 를 제작하였다. 동일한 방법으로 프라이머 5, 9 및 프라이머 10, 6을 이용하여 pDZ-leuA(G561D)를 제작하였다.
실시예 3 : IPMS 변이체 치환 균주 제작
상기 변이주에서 발견된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 균주를 제작하기 위해, 모균주로서 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 사용하였다.
전기천공법에 의해 상기 실시예 2에서 제작된 각각의 pDZ-leuA(R558H), pDZ-leuA(G561D), pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 형질전환시켰다. 2 차 교차 과정을 거쳐 제작된 각각의 균주를 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)로 명명하였다. leuA의 염기치환 여부는, 서열번호 3과 4 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 2 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 2700 개 염기쌍의 단편을 증폭한 후 동일한 프라이머로 염기서열을 분석하여 확인하였다.
상기 pDZ-leuA(R558H, G561D) 벡터로 형질전환된 14067::leuA(R558H, G561D) 균주를 KCJ-0148이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2016 년 1 월 25 일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11811P를 부여받았다.
실시예 4 : IPMS 변이체 치환 균주에서의 L- 류신 생산
상기 실시예 3에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 상기 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 1과 같다.
IPMS 변이체 치환 균주에서의 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067::leuA(R558H) 1.2
14067::leuA(G561D) 1.6
14067::leuA(R558H, G561D) 2.5
상기 표 1에 나타난 바와 같이, leuA 유전자에 R558H, G561D 또는 R558H/G561D 변이가 있는 L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::leuA(R558H), 14067::leuA(G561D) 및 14067::leuA(R558H, G561D)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 비해 L-류신 생산능이 약 12 내지 25 배 향상됨을 확인하였다.
실시예 5 : IPMS 변이체 과발현 벡터 제작
상기 실시예 1에서 확인된 변이 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하고자, ATCC14067 및 실시예 3에서 제작한 변이주 3 종의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Pfu DNA 중합효소로 중합하는 조건을 25 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 NdeI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 2050 개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 NdeI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pECCG117 (Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726 (1991)) 벡터에 PCJ7 프로모터가 삽입된 p117_PCJ7를 이용하여 라이게이션을 통해 p117_PCJ7-leuA(WT), p117_PCJ7-leuA(R558H), p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 p117_ PCJ7-leuA(R558H, G561D) 발현 벡터를 제작하였다. PCJ7 프로모터는 유전자의 발현을 강화시키는 프로모터로 대한민국 등록특허 제10-0620092호 및 국제 공개특허 제2006-065095호에 공지되어 있다.
실시예 6 : IPMS 변이체 과발현 벡터가 형질전환된 균주 제작
상기 실시예 5에서 제작된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 균주를 제작하기 위해, 모균주인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 류신 생산균주 KCCM11661P, KCCM11662P를 사용하였다.
상기 실시예 5에서 제작된 각각의 p117_PCJ7-leuA(WT), p117_PCJ7-leuA(R558H), p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, KCCM11661P 및 KCCM11662P에 전기천공법으로 형질전환시켜 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)를 제작하였다.
실시예 7 : IPMS 변이체 과발현 벡터가 형질전환된 균주에서의 L- 류신 생산
상기 실시예 6에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D), KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11661P::117PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067, KCCM11661P, KCCM11662P 및 상기 실시예 6에서 제작한 균주들을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 2과 같다.
IPMS 변이체 과발현 균주에서 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067:: p117_PCJ7-leuA(WT) 0.3
14067:: p117_PCJ7-leuA(R558H) 4.5
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 5.1
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 9.8
KCCM11661P 2.7
KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(WT) 3.0
KCCM11661P:: p117_PCJ7-leuA(R558H) 6.1
KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 6.8
KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 12.3
KCCM11662P 3.1
KCCM11662P:: p117_PCJ7-leuA(WT) 3.3
KCCM11662P:: p117_PJ7-leuA(R558H) 6.3
KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 6.9
KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D) 13.1
상기 표 2에 나타난 바와 같이, ATCC14067 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 이의 모균주인 ATCC14067에 비해 L-류신 생산이 45 내지 98 배 향상되었으며, KCCM11661P 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 이의 모균주인 KCCM11661P에 비해 L-류신 생산이 2.3 배 내지 4.5 배 향상되었으며, KCKCM11662P 균주에서 leuA 유전자에 변이를 포함하는 과발현 벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA(R558H,G561D)는 이의 모균주인 KCCM11662P에 비해 L-류신 생산이 2 내지 4.2 배 향상됨을 확인하였다.
실시예 8: leuA의 과발현벡터가 형질전환된 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제 활성 측정
상기 실시예 6에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)에서 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
각각의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 상기 균주 4 종을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 16 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양종료 후 배양액을 원심분리하여 상층액은 버리고, 펠렛을 용균완충용액으로 세척 및 혼탁하여 구슬파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 용균액의 단백질 정량은 브래드포드법을 따랐으며, 100 ㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 CoA를 측정함으로써 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성측정 결과는 하기 표 3과 같다.
균주 상대적 IPMS 활성 (%)
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 100
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H) 105
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 130
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 328
다음으로, 상기 효소의 류신에 대한 피드백 저해에 대한 해제 정도를 확인하기 위해 류신이 3 g/l 첨가된 조건에서 100 ㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 CoA를 측정함으로써 이소프로필말레이트 신타제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 이소프로필말레이트 신타제의 활성측정 결과는 하기 표 4와 같다.
균주 류신 0 g/l 류신 2 g/l
상대적 IPMS 활성 (%)
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 100 24
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H) 100 61
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 100 70
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D) 100 89
상기 표 3 및 4에 나타난 바와 같이, IPMS 변이체 발현벡터가 형질전환된 L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561D) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558H, G561D)는 대조군인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(WT)에 비해 이소프로필말레이트 신타제의 활성이 각각 1.05 배, 1.3 배, 3.2 배로 향상됨을 확인하였다. 또한, 상기 L-류신 생산균주들은 류신이 2 g/l 첨가된 조건에서도 IPMS 활성을 각각 61 %, 70 %, 89 %로 유지하는 것을 확인하여 류신에 의한 피드백 저해가 해제되었음을 확인하였다.
실시예 9: 이소프로필말레이트 신타아제 변이체 개량을 위한 벡터 제작
상기 실시예 4, 7 및 8에서, 이소프로필말레이트 신타아제의 아미노산 서열 (서열번호 1) 중 상기 558 번째 및 561 번째 아미노산이 IPMS 변이체 효소 활성에 중요한 위치임을 확인하였기 때문에, 상기 변이체 외 다른 아미노산으로 치환하였을 때에도 효소 활성이 강화되고 또는 피드백 저해가 더욱 해제될 수 있는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 구조적 변이를 일으킬 수 있는 다른 아미노산 그룹의 아미노산으로 치환한 변이체를 제작하기로 하였다.
558 번째 알지닌은 알라닌 (Ala) 또는 글루타민 (Gln)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 위치 지정 돌연변이 생성 (Site directed mutagenesis) 방법을 사용하여 p117_PCJ7-leuA(R558H) 벡터를 주형으로 서열번호 13 및 14의 프라이머, 및 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍을 이용하여 558 번째 아미노산을 알라닌 (Ala)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(R558A), 558 번째 아미노산을 글루타민 (Gln)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(R558Q) 벡터를 제조하였다.
561 번째 글리신은 알지닌 (Arg) 또는 타이로신 (Tyr)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 위치 지정 돌연변이 생성 방법을 사용하여 p117_PCJ7-leuA(G561D)를 주형으로 서열번호 17 및 18의 프라이머, 및 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍을 이용하여 561 번째 아미노산을 알지닌 (Arg)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(G561R), 561 번째 아미노산을 타이로신 (Tyr)으로 치환한 p117_PCJ7-leuA(G561Y) 벡터를 확보하였다.
실시예 10: 이소프로필말레이트 개량 변이체를 도입한 균주 제작
상기 실시예 9 에서 제작된 leuA 변이 염기서열을 포함하는 발현 벡터가 형질전환된 균주를 제작하기 위해, 모균주로서 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 사용하였다.
상기 실시예 9에서 제작된 각각의 p117_PCJ7-leuA(R558A), p117_PCJ7-leuA(R558Q), p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 p117_PCJ7-leuA(G561Y) 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 전기천공법으로 형질전환시켜 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)를 제작하였다.
실시예 11 : 이소프로필말레이트 신타아제 개량 변이체를 도입한 균주에서의 L-류신 생산
상기 실시예 10에서 제작한 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)로부터 L-류신을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양을 수행하였다.
각각의 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 상기 균주 4 종을 각각 1 백금이 접종한 후, 30 ℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-류신을 생산하였다.
배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-류신 농도는 아래 표 5과 같다.
IPMS 변이체 과발현 균주에서 L-류신 생산
균주 L-류신 농도 (g/ℓ)
ATCC14067 0.1
14067::p117_PCJ7-leuA(WT) 0.3
14067::p117_PCJ7-leuA(R558H)
(실시예 7)		 4.5
14067::p117_PCJ7-leuA(R558A) 3.8
14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q) 3.2
14067::p117_PCJ7-leuA(G561D)
(실시예 7)		 5.1
14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 4.0
14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y) 3.6
상기 표 5에 나타난 바와 같이, L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(R558A) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(R558Q)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 비해 L-류신 생산능이 32 내지 38 배 향상 됨을 확인하였다.
또한, L-류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 14067::p117_PCJ7-leuA(G561R) 및 14067::p117_PCJ7-leuA(G561Y)는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 에 비해 L-류신 생산능이 약 36 배 내지 40 배 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 이소프로필말레이트 신타아제의 아미노산 서열 (서열번호 1) 중 상기 558 번째 및 561 번째 아미노산이 IPMS 변이체 효소 활성에 중요한 위치이며, 또한 야생형 IPMS 단백질의 558 및 561 번째 아미노산이 각각 히스티딘 및 아스파르트산으로 치환되는 경우뿐만 아니라 다른 아미노산으로 치환되는 경우에도, 이러한 변이를 포함하는 균주에서 L-류신의 생산능이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명 보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터 KCCM11661P 20150122 한국미생물보존센터 KCCM11662P 20150122 한국미생물보존센터 KCCM11811P 20160125
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A Novel Isopropylmalate Synthase Variant and a Method of Producing L-Leucine Using the Same <130> KPA151346-KR-P1 <150> KR 10-2016-0181343 <151> 2016-12-28 <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 616 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> leuA AA <400> 1 Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg 20 25 30 Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val 35 40 45 Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr 50 55 60 Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala 65 70 75 80 Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu 85 90 95 Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala 100 105 110 Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Asp Met 115 120 125 Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His 130 135 140 Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile 145 150 155 160 Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe 165 170 175 Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu 180 185 190 Leu Ile Lys Thr Val Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp 195 200 205 Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys 210 215 220 Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn 225 230 235 240 Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn 245 250 255 Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg 260 265 270 Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly 275 280 285 Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu 290 295 300 Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val 305 310 315 320 Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp 325 330 335 Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln 340 345 350 Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr 355 360 365 Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala 370 375 380 Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp 385 390 395 400 Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp 405 410 415 Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser 420 425 430 Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly 435 440 445 Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln 450 455 460 Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp 465 470 475 480 Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln 485 490 495 Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser 500 505 510 Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly 515 520 525 His Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu 530 535 540 Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser 545 550 555 560 Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly 565 570 575 Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser 580 585 590 Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His 595 600 605 Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val 610 615 <210> 2 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuA NT <400> 2 atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60 cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120 tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180 aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240 ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380 accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa 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gtcctggctg gcggcgttta a 1851 <210> 46 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R558A, G561R NT <400> 46 atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60 cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120 tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180 aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240 ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380 accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440 gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500 gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560 ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggctgctta cgccaacgcg 1620 ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccagacctcg 1680 cgcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740 ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800 aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851 <210> 47 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R558A, G561Y NT <400> 47 atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60 cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120 tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180 aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240 ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt 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ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380 accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440 gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500 gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560 ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggctgctta cgccaacgcg 1620 ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccagacctcg 1680 gatgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740 ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800 aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851 <210> 49 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R558Q, G561R NT <400> 49 atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60 cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120 tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180 aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240 ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380 accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440 gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500 gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560 ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggctgctta cgccaacgcg 1620 ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccagacctcg 1680 cgcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740 ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800 aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851 <210> 50 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R558Q, G561Y NT <400> 50 atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60 cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120 tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180 aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240 ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300 ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360 cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420 gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480 gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540 gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600 tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660 gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720 ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780 tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840 ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900 gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960 accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020 cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080 tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140 ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200 gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260 ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320 tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380 accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440 gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500 gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560 ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggctgctta cgccaacgcg 1620 ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccagacctcg 1680 tacgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740 ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800 aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 알지닌 (arginine) 아미노산 잔기가 히스티딘 (histidine), 알라닌 (alanine) 또는 글루타민 (glutamine) 아미노산 잔기로, 또는 561 번째 글리신 (glycine) 아미노산 잔기가 알지닌 또는 타이로신 (tyrosine) 아미노산 잔기로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 (isopropylmalate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 558 번째 알지닌이 히스티딘, 알라닌 또는 글루타민으로 치환되고, 561 번째 글리신이 아스파르트산, 알지닌 또는 타이로신으로 치환된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  5. 서열번호 21 내지 서열번호 23 및 서열번호 25 내지 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된, 이소프로필말레이트 신타제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  6. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36 내지 서열번호 38 및 서열번호 40 내지 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성된, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 포함하는, L-류신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물.
  9. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된, L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  11. (a) 제8항의 L-류신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-류신을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 또는 배양 배지로부터 L-류신을 회수하는 단계를 포함하는,
    L-류신을 생산하는 방법.
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