JP3915275B2 - Ｌ−ロイシンの製造法 - Google Patents
Ｌ−ロイシンの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3915275B2 JP3915275B2 JP29474898A JP29474898A JP3915275B2 JP 3915275 B2 JP3915275 B2 JP 3915275B2 JP 29474898 A JP29474898 A JP 29474898A JP 29474898 A JP29474898 A JP 29474898A JP 3915275 B2 JP3915275 B2 JP 3915275B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- leucine
- resistance
- strain
- escherichia
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−ロイシンの製造法に関し、詳しくは、Ｌ−ロイシンをエシェリヒア属細菌を用いて製造する方法に関する。Ｌ−ロイシンは、食品及び飼料用の栄養添加物、医療、製薬及び化学工業における試薬、あるいはリジンのような他のアミノ酸の製造に用いられる微生物の成長因子として用いられる必須アミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するＬ−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。最も高いレベルでＬ−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバクテリウム・フラバム VKPM B-2736である。この株は、研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた７２時間の醗酵で、Ｌ−ロイシンを２６ｇ／Ｌまで生産する（ＵＳＳＲ発明者証第１３９４７１１号）。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム３４株は、グルコースを含む培地でＬ−ロイシンを３４ｇ／Ｌまで生産する（Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1986)）。
【０００３】
上記のように、微生物のＬ−ロイシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−ロシインの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。
ところで、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料の豊富さ等から優れたＬ−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属細菌によるＬ−ロイシン生産の報告は少ない。Ｌ−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌としては、β−２−チエニルアラニン耐性を有する微生物、β−２−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する微生物（以上、特公昭62-34397号公報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフルオロロイシン耐性を有する微生物（特開平8-70879号公報）が知られている。しかし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるＬ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係については知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点から、エシェリヒア属に属する微生物のＬ−ロイシン生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア属細菌へのＬ−ロイシン耐性の付与が、Ｌ−ロイシン生産性の向上に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつＬ−ロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア属細菌である。
本発明はまた、前記エシェリヒア属細菌において、さらにロイシンアナログに対する耐性を有するエシェリヒア属細菌を提供する。ロイシンアナログとしては、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン、β−２−チエニルアラニンン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等、好ましくは４−アザロイシン及び３−ヒドロキシロイシンが挙げられる。
【０００７】
さらに本発明は、エシェリヒア属細菌から、ロイシンアナログに対する耐性及びＬ−ロイシンに対する耐性を有する株を、各々の耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階的に選択された、Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、前記エシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ−ロイシンの製造法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつ、Ｌ−ロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば特公昭62-34397号公報、特開平8-70879号公報に記載されるようなβ−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等のロイシンアナログに対する耐性を有するものや、WO96/06926号国際公開パンフレットに記載されるような遺伝子組換え技術によって育種されるもの等が挙げられる。
Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌から、Ｌ−ロイシンに対して耐性を有する株を選択すれば、それが本発明のエシェリヒア属細菌である。あるいは、Ｌ−ロイシンに対して耐性を示すエシェリヒア属細菌から、Ｌ−ロイシン生産能を示す株を選択しても、本発明のエシェリヒア属細菌である。
本発明のエシェリヒア属細菌として特に好ましい態様はＬ−ロイシン耐性に加えてロイシンアナログに対する耐性を有するエシェリヒア属細菌である。
【００１１】
エシェリヒア属細菌において、Ｌ−ロイシンは、Ｌ−バリン生合成系の最終中間体（２−ケトイソ吉草酸）から分岐するＬ−ロイシン固有の生合成経路を通って生合成される。エシェリヒア属細菌では、Ｌ−バリン生合成の最終段階の反応はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされている酵素群によって、Ｌ−ロイシン固有の生合成反応はｌｅｕＡＢＣＤオペロンによってコードされている酵素群によって、それぞれ行われている。
【００１２】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤの各遺伝子を有しており、ｌｅｕＡがα−イソプロピルマレートシンターゼ、ｌｅｕＢがβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤがα−イソプロピルマレートイソメラーゼをコードしている。これらの酵素のうち、α−イソプロピルマレートシンターゼはα−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応を、α−イソプロピルマレートイソメラーゼはα−イソプロピルリンゴ酸からβ−イソプロピルリンゴ酸への異性化反応を、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼはβ−イソプロピルリンゴ酸からＬ−ロイシン生合成の最終中間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を、各々触媒する。α−ケトイソカプロン酸から最終産物であるＬ−ロイシンへのアミノ化反応は、主としてトランスアミナーゼによって触媒される。エシェリヒア属細菌には４種のトランスアミナーゼ、すなわち、ａｓｐＣ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＡ（アスパラギン酸−グルタミン酸トランスアミナーゼ）、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに含まれるｉｌｖＥ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＢ（ＢＣＡＡアミノトランスフェラーゼ）、ａｖｔＡ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＣ（アラニン−バリンアミノトランスフェラーゼ）、及びｔｙｒＢ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＤ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）が存在し、種々のアミノ化反応に関与している。これらのうち、上記のα−ケトイソカプロン酸からＬ−ロイシンへのアミノ化反応は、トランスアミナーゼＢ及びトランスアミナーゼＤによって触媒される。トランスアミナーゼＣ及びトランスアミナーゼＤは、Ｌ−ロイシン合成と共通の合成経路を有するＬ−バリン生合成経路の最終段階を触媒する。
【００１３】
上記のＬ−ロイシン生合成経路の反応のうち律速段階であるのは、α−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応であり、この反応を触媒するα−イソプロピルマレートシンターゼは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害を受ける。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現は、Ｌ−ロイシンにより抑制される。アセトヒドロキシ酸シンターゼＩをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子の発現はＬ−バリン及びＬ−ロイシンによる協奏抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIをコードするｉｌｖＧＭ遺伝子の発現はＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンによる協奏抑制を受け、そして、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIIをコードするｉｌｖＩＨ遺伝子の発現はＬ−ロイシンによる抑制を受ける。
【００１４】
Ｌ−ロイシンが過剰に存在しても、阻害を受けるα−イソプロピルマレートシンターゼも、抑制されるｌｅｕＡＢＣＤオペロンも、Ｌ−ロイシンの生合成にのみ関与するので、これらの阻害や抑制により供給路が絶たれることになる栄養物質はない。また、ｉｌｖＩＨ遺伝子の発現は抑制されるが、他のアイソザイムをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子とｉｌｖＧＭ遺伝子の発現は影響を受けない。したがって、Ｌ−ロイシンが過剰に存在しても細胞の生育に影響がないと考えられるが、本発明者は意外にもＬ−ロイシン過剰存在下で細胞の生育が阻害されることを発見し、さらにＬ−ロイシンに対する耐性を付与することによって、エシェリヒア属細菌のＬ−ロイシン生産能を向上させることに成功した。
【００１５】
以下に、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌を取得する方法について説明する。
Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、エシェリヒア属細菌をその生育が阻害される濃度のＬ−ロイシンを含む最小培地で培養し、生育する株を選択することによって取得することができる。ここで、生育阻害とは生育の遅れや生育阻止をいう。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよい。培地に添加するＬ−ロイシンの量は、Ｌ−ロイシン耐性を付与しようとする親株の生育が阻害される濃度であれば特に制限されないが、１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌが挙げられる。選択に先だって、エシェリヒア属細菌に突然変異処理を施してもよい。突然変異処理は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理によって行えばよい。
【００１６】
上記のようにして得られるＬ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、親株が生育できない濃度のＬ−ロイシン存在下でも、生育することができる。
上述のようにＬ−ロイシンは、Ｌ−ロイシン生合成の種々の段階の調節に関与しており、Ｌ−ロイシン耐性を付与する単独の変異のみでもＬ−ロイシン生産性向上に効果を示すが、複数の変異によってより多くの調節が解除されることが好ましい。また、単独の変異を有するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産性が低いものであっても、Ｌ−ロイシン生産菌育種の出発材料として用いることができる。
【００１７】
ロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌は、エシェリヒア属細菌をその生育を阻害する濃度のロイシンアナログを含む最小培地で培養し、生育する株を選択することによって取得することができる。ロイシンアナログとしては、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン、β−２−チエニルアラニンン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等、好ましくは４−アザロイシン及び３−ヒドロキシロイシンが挙げられる。ロイシンアナログ耐性株の選択は、１種のロイシンアナログについて行ってもよく、複数のロイシンアナログについて行ってもよい。また、選択は、１種のロイシンアナログについて１回でもよく、複数回行ってもよい。
【００１８】
培地に添加するロイシンアナログの量は、ロイシンアナログの種類によっても異なるが、例えば４−アザロイシン及びβ−ヒドロキシロイシンについては、０．１ｇ／Ｌ以上が好ましい。選択に先だって、エシェリヒア属細菌に前記と同様にして突然変異処理を施してもよい。
【００１９】
Ｌ−ロイシン耐性に加えてロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌を選択する場合には、各々の耐性を有する株の選択の順序に特に制限はなく、任意の順序で行えばよい。
尚、エシェリヒア属細菌としてエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、Ｌ−ロイシン耐性及び／又はロイシンアナログ耐性に加えて、Ｌ−バリン耐性を付与することが好ましい。K-12株は、分岐鎖アミノ酸生合成経路の酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムのうち、アイソザイムIIの大サブユニットをコードしているｉｌｖＧ遺伝子がフレームシフト変異をもっているために、活性のあるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムIIが発現していない（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。このアイソザイムIIはＬ−バリンによるフィードバック阻害を受けないが、他のアイソザイムであるアイソザイムＩ及びアイソザイムIIIは、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受ける（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。そのために、Ｌ−バリンの過剰量存在下ではＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンの生合成が阻害され、生育することができない。したがって、K-12株由来のＬ−ロイシン生産菌を得ようとする場合には、活性のあるアイソザイムIIを発現するように、ｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。このようなｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株は、Ｌ−バリン耐性を示す（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。Ｌ−バリン耐性を有するK-12株は、Ｌ−ロイシン耐性又はロイシンアナログ耐性と同様に、Ｌ−バリンを含む最小培地で培養し、生育できる株を選択することによって得られる。
【００２０】
ただし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌の育種に、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受けないアセトヒドロキシ酸シンターゼを保持するエシェリヒア属細菌を用いる場合には、上記のK-12株のようにＬ−バリン耐性を付与する操作は必要ない。
【００２１】
本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに、通常の突然変異処理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素の活性の増強は、例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン又は／及びｌｅｕＡＢＣＤオペロン、又はこれらの一部を有するＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ又はトランスポゾンに挿入し、得られる組換えＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。
【００２２】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの塩基配列解析については、Nucleic Acid Res., 20, 3305-3308 (1992)に記載されており、全塩基配列はデータベース（DDBJ accession no. D10483、DDBJのインターネットアドレス：http://www.ddbj.nig.ac.jp）に登録されている。ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185 (1989)参照）によって、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含むＤＮＡ断片を増幅することによって取得できる。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、前記文献に記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりエシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、取得することができる。
【００２３】
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列及び該オペロンの上流域の塩基配列は、それぞれ Nucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987)及び Gene, 97, 21-27 (1991)に記載されている。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したプローブ又はプライマーを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得にエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ・アイソザイムIIを発現するように、ｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得法及びトランスポゾンを用いて該オペロンをエシェリヒア属細菌細胞内で増幅する方法は、それぞれWO96/06926国際公開パンフレット、フランス特許公開第2627508号に詳細に記載されている。
【００２４】
＜２＞Ｌ−ロイシンの製造法
上記のようにして得られるエシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ロイシンを採取することにより、Ｌ−ロイシンを効率よく製造することができる。
【００２５】
本発明の製造法におけるエシェリヒア属細菌の培養および培養液からのＬ−ロイシンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２６】
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中にＬ−ロイシンが蓄積する。
【００２７】
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によってＬ−ロイシンを採取、精製することが出来る。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２９】
【実施例１】
Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア・コリ菌株の誘導
＜１＞Ｌ−ロイシン耐性株の選択
標準的な研究室用野生株であるエシェリヒア・コリ K-12株から、以下に示すように段階的選択によって、Ｌ−ロイシン耐性及びロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア・コリ菌株を誘導した。尚、各々の耐性を有する株の選択は、自然突然変異を有する株を選択することによって得た。具体的には、以下に示す各々の濃度のＬ−ロイシン又はロイシンアナログを含有する平板培地に、選択に用いるエシェリヒア・コリ K-12株又はその変異株をまき、生育する株を選択した。
【００３０】
初めに、Ｌ−ロイシン耐性及びロイシンアナログ耐性を有する株の選択に先立って、エシェリヒア・コリ K-12株から５ｇ／ＬのＬ−バリンに対する耐性変異株を選択し、Ｂ−５株（Valr）とした。この株から１ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．３２５株とした（Valr、Leur）。次に、このＮｏ．３２５株から、０．１ｇ／Ｌの４−アザ−Ｄ、Ｌ−ロイシン（以下、アザロイシンという）に対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．２４４株を得た（Valr、Leur、ALr）。このＮｏ．２４４株から２ｇ／Ｌの４−アザロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．７０株を得た（Valr、Leur、ALrr）。尚、Valr、Leur、ALrは、それぞれ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、アザロイシン耐性を付与された菌株であることを表し、「ALrr」は、アザロイシン耐性付与が２回行われた菌株であることを表す。
【００３１】
＜２＞Ｌ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係
Ｌ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係を調べるために、上記で得られたＮｏ．７０株から、１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに耐性な自然突然変異株を選択した。
【００３２】
Ｎｏ．７０株からランダムに選択した７個の単一コロニーと、Ｎｏ．７０株由来のＬ−ロイシン耐性変異株からランダムに選択した１０個の変異株について、Ｌ−ロイシン生産性を調べた。その結果、Ｎｏ．７０株由来のＬ−ロイシン耐性変異株は、親株よりもＬ−ロイシン生産性が上昇しており、上昇の平均は６０％であった。
【００３３】
【実施例２】
エシェリヒア・コリ K-12株からのＬ−ロイシン生産菌の育種
エシェリヒア・コリ K-12株から、以下に示すようにＬ−バリン、アザロイシン、ヒドロキシロイシン及びＬ−ロイシンに対する耐性変異株を段階的に選択することによって、Ｌ−ロイシン生産菌を誘導した。具体的には、以下に示す各々の濃度のＬ−バリン、ロイシンアナログ又はＬ−ロイシンを含有する最小培地プレートに、選択に用いるエシェリヒア属細菌をまき、生育する株を選択した。
【００３４】
エシェリヒア・コリ K-12株から５ｇ／ＬのＬ−バリンに対する耐性を有する自然突然変異株を選択し、Ｎｏ．１０１株を得た（Valr）。この株のＬ−ロイシン生産は認められなかった。
Ｎｏ．１０１株から、１．３ｇ／Ｌのアザロイシンに対する耐性を有する自然突然変異株を選択し、Ｎｏ．５１株を得た（Valr、ALr）。この株のＬ−ロイシン生産量は、約０．０５〜０．１ｇ／Ｌであった。
【００３５】
さらにＮｏ．５１株から、２ｇ／Ｌのヒドロキシロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．４株を得た（Valr、ALr、Hleur）。尚、HLeurは、ヒドロキシロイシン耐性を付与された菌株であることを表す。この株のＬ−ロイシン生産量は、約０．４〜０．６ｇ／Ｌである。
【００３６】
次に、Ｎｏ．４株をＮＴＧで処理し、１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対する耐性変異株を２株選択し、Ｎｏ．５７株及びＮｏ．１０３株とした（Valr、ALr、Hleur、Leur）。これらの株のＬ−ロイシン生産量は、１．５〜１．７ｇ／Ｌであった。
【００３７】
上記菌株のうち、Ｎｏ．４株（Escherichia coli K-12,4）、Ｎｏ．５７株（Escherichia coli K12,57）及びＮｏ．１０３株（Escherichia coli K-12,103）は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Russian National Collection of Industrial Microorganisms；Russia 113545 Moscow 1 Dorozhny proezd, 1）に、それぞれVKPM B-7387、VKPM B-7386及びVKPM B-7388の受託番号で寄託されている。
【００３８】
【実施例３】
Ｎｏ．５７株およびＮｏ．１０３株によるＬ−ロイシンの製造
Ｎｏ．５７株の菌体およびＮｏ．１０３株の菌体のそれぞれをＭ９寒天平板上で３７℃の温度条件下、３０時間かけて生育させた。得られた培養物の白金耳一杯ずつを、発酵培地（グルコース６％、硫酸アンモニウム１．５％、リン酸水素カリウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．１％、チアミン０．００００１％、炭酸カルシウム２％を含有）が１５ｍｌ入った振盪フラスコ（２５０ｍｌ）に、それぞれ接種した。培養はロータリー式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）を用いて３２℃の条件下で４８時間行われた。その結果、Ｎｏ．５７株の培養では１．５ｇ／Ｌの、またＮｏ．１０３株の培養では１．７ｇ／ＬのＬ−ロイシンがそれぞれ産生された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産菌として、又はＬ−ロイシン生産菌育種の出発材料として、利用することができる。本発明により、従来知られているエシェリヒア属細菌を用いたＬ−ロイシン製造法よりも、効率よくＬ−ロイシンを製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−ロイシンの製造法に関し、詳しくは、Ｌ−ロイシンをエシェリヒア属細菌を用いて製造する方法に関する。Ｌ−ロイシンは、食品及び飼料用の栄養添加物、医療、製薬及び化学工業における試薬、あるいはリジンのような他のアミノ酸の製造に用いられる微生物の成長因子として用いられる必須アミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するＬ−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。最も高いレベルでＬ−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバクテリウム・フラバム VKPM B-2736である。この株は、研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた７２時間の醗酵で、Ｌ−ロイシンを２６ｇ／Ｌまで生産する（ＵＳＳＲ発明者証第１３９４７１１号）。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム３４株は、グルコースを含む培地でＬ−ロイシンを３４ｇ／Ｌまで生産する（Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1986)）。
【０００３】
上記のように、微生物のＬ−ロイシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−ロシインの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。
ところで、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料の豊富さ等から優れたＬ−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属細菌によるＬ−ロイシン生産の報告は少ない。Ｌ−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌としては、β−２−チエニルアラニン耐性を有する微生物、β−２−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する微生物（以上、特公昭62-34397号公報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフルオロロイシン耐性を有する微生物（特開平8-70879号公報）が知られている。しかし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるＬ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係については知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点から、エシェリヒア属に属する微生物のＬ−ロイシン生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア属細菌へのＬ−ロイシン耐性の付与が、Ｌ−ロイシン生産性の向上に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつＬ−ロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア属細菌である。
本発明はまた、前記エシェリヒア属細菌において、さらにロイシンアナログに対する耐性を有するエシェリヒア属細菌を提供する。ロイシンアナログとしては、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン、β−２−チエニルアラニンン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等、好ましくは４−アザロイシン及び３−ヒドロキシロイシンが挙げられる。
【０００７】
さらに本発明は、エシェリヒア属細菌から、ロイシンアナログに対する耐性及びＬ−ロイシンに対する耐性を有する株を、各々の耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階的に選択された、Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、前記エシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ−ロイシンの製造法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつ、Ｌ−ロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば特公昭62-34397号公報、特開平8-70879号公報に記載されるようなβ−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等のロイシンアナログに対する耐性を有するものや、WO96/06926号国際公開パンフレットに記載されるような遺伝子組換え技術によって育種されるもの等が挙げられる。
Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌から、Ｌ−ロイシンに対して耐性を有する株を選択すれば、それが本発明のエシェリヒア属細菌である。あるいは、Ｌ−ロイシンに対して耐性を示すエシェリヒア属細菌から、Ｌ−ロイシン生産能を示す株を選択しても、本発明のエシェリヒア属細菌である。
本発明のエシェリヒア属細菌として特に好ましい態様はＬ−ロイシン耐性に加えてロイシンアナログに対する耐性を有するエシェリヒア属細菌である。
【００１１】
エシェリヒア属細菌において、Ｌ−ロイシンは、Ｌ−バリン生合成系の最終中間体（２−ケトイソ吉草酸）から分岐するＬ−ロイシン固有の生合成経路を通って生合成される。エシェリヒア属細菌では、Ｌ−バリン生合成の最終段階の反応はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされている酵素群によって、Ｌ−ロイシン固有の生合成反応はｌｅｕＡＢＣＤオペロンによってコードされている酵素群によって、それぞれ行われている。
【００１２】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤの各遺伝子を有しており、ｌｅｕＡがα−イソプロピルマレートシンターゼ、ｌｅｕＢがβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤがα−イソプロピルマレートイソメラーゼをコードしている。これらの酵素のうち、α−イソプロピルマレートシンターゼはα−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応を、α−イソプロピルマレートイソメラーゼはα−イソプロピルリンゴ酸からβ−イソプロピルリンゴ酸への異性化反応を、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼはβ−イソプロピルリンゴ酸からＬ−ロイシン生合成の最終中間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を、各々触媒する。α−ケトイソカプロン酸から最終産物であるＬ−ロイシンへのアミノ化反応は、主としてトランスアミナーゼによって触媒される。エシェリヒア属細菌には４種のトランスアミナーゼ、すなわち、ａｓｐＣ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＡ（アスパラギン酸−グルタミン酸トランスアミナーゼ）、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに含まれるｉｌｖＥ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＢ（ＢＣＡＡアミノトランスフェラーゼ）、ａｖｔＡ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＣ（アラニン−バリンアミノトランスフェラーゼ）、及びｔｙｒＢ遺伝子がコードするトランスアミナーゼＤ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）が存在し、種々のアミノ化反応に関与している。これらのうち、上記のα−ケトイソカプロン酸からＬ−ロイシンへのアミノ化反応は、トランスアミナーゼＢ及びトランスアミナーゼＤによって触媒される。トランスアミナーゼＣ及びトランスアミナーゼＤは、Ｌ−ロイシン合成と共通の合成経路を有するＬ−バリン生合成経路の最終段階を触媒する。
【００１３】
上記のＬ−ロイシン生合成経路の反応のうち律速段階であるのは、α−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応であり、この反応を触媒するα−イソプロピルマレートシンターゼは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害を受ける。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現は、Ｌ−ロイシンにより抑制される。アセトヒドロキシ酸シンターゼＩをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子の発現はＬ−バリン及びＬ−ロイシンによる協奏抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIをコードするｉｌｖＧＭ遺伝子の発現はＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンによる協奏抑制を受け、そして、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIIをコードするｉｌｖＩＨ遺伝子の発現はＬ−ロイシンによる抑制を受ける。
【００１４】
Ｌ−ロイシンが過剰に存在しても、阻害を受けるα−イソプロピルマレートシンターゼも、抑制されるｌｅｕＡＢＣＤオペロンも、Ｌ−ロイシンの生合成にのみ関与するので、これらの阻害や抑制により供給路が絶たれることになる栄養物質はない。また、ｉｌｖＩＨ遺伝子の発現は抑制されるが、他のアイソザイムをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子とｉｌｖＧＭ遺伝子の発現は影響を受けない。したがって、Ｌ−ロイシンが過剰に存在しても細胞の生育に影響がないと考えられるが、本発明者は意外にもＬ−ロイシン過剰存在下で細胞の生育が阻害されることを発見し、さらにＬ−ロイシンに対する耐性を付与することによって、エシェリヒア属細菌のＬ−ロイシン生産能を向上させることに成功した。
【００１５】
以下に、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌を取得する方法について説明する。
Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、エシェリヒア属細菌をその生育が阻害される濃度のＬ−ロイシンを含む最小培地で培養し、生育する株を選択することによって取得することができる。ここで、生育阻害とは生育の遅れや生育阻止をいう。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよい。培地に添加するＬ−ロイシンの量は、Ｌ−ロイシン耐性を付与しようとする親株の生育が阻害される濃度であれば特に制限されないが、１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌが挙げられる。選択に先だって、エシェリヒア属細菌に突然変異処理を施してもよい。突然変異処理は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理によって行えばよい。
【００１６】
上記のようにして得られるＬ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌は、親株が生育できない濃度のＬ−ロイシン存在下でも、生育することができる。
上述のようにＬ−ロイシンは、Ｌ−ロイシン生合成の種々の段階の調節に関与しており、Ｌ−ロイシン耐性を付与する単独の変異のみでもＬ−ロイシン生産性向上に効果を示すが、複数の変異によってより多くの調節が解除されることが好ましい。また、単独の変異を有するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産性が低いものであっても、Ｌ−ロイシン生産菌育種の出発材料として用いることができる。
【００１７】
ロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌は、エシェリヒア属細菌をその生育を阻害する濃度のロイシンアナログを含む最小培地で培養し、生育する株を選択することによって取得することができる。ロイシンアナログとしては、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン、β−２−チエニルアラニンン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等、好ましくは４−アザロイシン及び３−ヒドロキシロイシンが挙げられる。ロイシンアナログ耐性株の選択は、１種のロイシンアナログについて行ってもよく、複数のロイシンアナログについて行ってもよい。また、選択は、１種のロイシンアナログについて１回でもよく、複数回行ってもよい。
【００１８】
培地に添加するロイシンアナログの量は、ロイシンアナログの種類によっても異なるが、例えば４−アザロイシン及びβ−ヒドロキシロイシンについては、０．１ｇ／Ｌ以上が好ましい。選択に先だって、エシェリヒア属細菌に前記と同様にして突然変異処理を施してもよい。
【００１９】
Ｌ−ロイシン耐性に加えてロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア属細菌を選択する場合には、各々の耐性を有する株の選択の順序に特に制限はなく、任意の順序で行えばよい。
尚、エシェリヒア属細菌としてエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、Ｌ−ロイシン耐性及び／又はロイシンアナログ耐性に加えて、Ｌ−バリン耐性を付与することが好ましい。K-12株は、分岐鎖アミノ酸生合成経路の酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムのうち、アイソザイムIIの大サブユニットをコードしているｉｌｖＧ遺伝子がフレームシフト変異をもっているために、活性のあるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムIIが発現していない（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。このアイソザイムIIはＬ−バリンによるフィードバック阻害を受けないが、他のアイソザイムであるアイソザイムＩ及びアイソザイムIIIは、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受ける（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。そのために、Ｌ−バリンの過剰量存在下ではＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンの生合成が阻害され、生育することができない。したがって、K-12株由来のＬ−ロイシン生産菌を得ようとする場合には、活性のあるアイソザイムIIを発現するように、ｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。このようなｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株は、Ｌ−バリン耐性を示す（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981）。Ｌ−バリン耐性を有するK-12株は、Ｌ−ロイシン耐性又はロイシンアナログ耐性と同様に、Ｌ−バリンを含む最小培地で培養し、生育できる株を選択することによって得られる。
【００２０】
ただし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌の育種に、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受けないアセトヒドロキシ酸シンターゼを保持するエシェリヒア属細菌を用いる場合には、上記のK-12株のようにＬ−バリン耐性を付与する操作は必要ない。
【００２１】
本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに、通常の突然変異処理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素の活性の増強は、例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン又は／及びｌｅｕＡＢＣＤオペロン、又はこれらの一部を有するＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ又はトランスポゾンに挿入し、得られる組換えＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。
【００２２】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの塩基配列解析については、Nucleic Acid Res., 20, 3305-3308 (1992)に記載されており、全塩基配列はデータベース（DDBJ accession no. D10483、DDBJのインターネットアドレス：http://www.ddbj.nig.ac.jp）に登録されている。ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185 (1989)参照）によって、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含むＤＮＡ断片を増幅することによって取得できる。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、前記文献に記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりエシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、取得することができる。
【００２３】
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列及び該オペロンの上流域の塩基配列は、それぞれ Nucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987)及び Gene, 97, 21-27 (1991)に記載されている。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したプローブ又はプライマーを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得にエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ・アイソザイムIIを発現するように、ｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得法及びトランスポゾンを用いて該オペロンをエシェリヒア属細菌細胞内で増幅する方法は、それぞれWO96/06926国際公開パンフレット、フランス特許公開第2627508号に詳細に記載されている。
【００２４】
＜２＞Ｌ−ロイシンの製造法
上記のようにして得られるエシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ロイシンを採取することにより、Ｌ−ロイシンを効率よく製造することができる。
【００２５】
本発明の製造法におけるエシェリヒア属細菌の培養および培養液からのＬ−ロイシンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２６】
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中にＬ−ロイシンが蓄積する。
【００２７】
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によってＬ−ロイシンを採取、精製することが出来る。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２９】
【実施例１】
Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア・コリ菌株の誘導
＜１＞Ｌ−ロイシン耐性株の選択
標準的な研究室用野生株であるエシェリヒア・コリ K-12株から、以下に示すように段階的選択によって、Ｌ−ロイシン耐性及びロイシンアナログ耐性を有するエシェリヒア・コリ菌株を誘導した。尚、各々の耐性を有する株の選択は、自然突然変異を有する株を選択することによって得た。具体的には、以下に示す各々の濃度のＬ−ロイシン又はロイシンアナログを含有する平板培地に、選択に用いるエシェリヒア・コリ K-12株又はその変異株をまき、生育する株を選択した。
【００３０】
初めに、Ｌ−ロイシン耐性及びロイシンアナログ耐性を有する株の選択に先立って、エシェリヒア・コリ K-12株から５ｇ／ＬのＬ−バリンに対する耐性変異株を選択し、Ｂ−５株（Valr）とした。この株から１ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．３２５株とした（Valr、Leur）。次に、このＮｏ．３２５株から、０．１ｇ／Ｌの４−アザ−Ｄ、Ｌ−ロイシン（以下、アザロイシンという）に対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．２４４株を得た（Valr、Leur、ALr）。このＮｏ．２４４株から２ｇ／Ｌの４−アザロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．７０株を得た（Valr、Leur、ALrr）。尚、Valr、Leur、ALrは、それぞれ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、アザロイシン耐性を付与された菌株であることを表し、「ALrr」は、アザロイシン耐性付与が２回行われた菌株であることを表す。
【００３１】
＜２＞Ｌ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係
Ｌ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係を調べるために、上記で得られたＮｏ．７０株から、１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに耐性な自然突然変異株を選択した。
【００３２】
Ｎｏ．７０株からランダムに選択した７個の単一コロニーと、Ｎｏ．７０株由来のＬ−ロイシン耐性変異株からランダムに選択した１０個の変異株について、Ｌ−ロイシン生産性を調べた。その結果、Ｎｏ．７０株由来のＬ−ロイシン耐性変異株は、親株よりもＬ−ロイシン生産性が上昇しており、上昇の平均は６０％であった。
【００３３】
【実施例２】
エシェリヒア・コリ K-12株からのＬ−ロイシン生産菌の育種
エシェリヒア・コリ K-12株から、以下に示すようにＬ−バリン、アザロイシン、ヒドロキシロイシン及びＬ−ロイシンに対する耐性変異株を段階的に選択することによって、Ｌ−ロイシン生産菌を誘導した。具体的には、以下に示す各々の濃度のＬ−バリン、ロイシンアナログ又はＬ−ロイシンを含有する最小培地プレートに、選択に用いるエシェリヒア属細菌をまき、生育する株を選択した。
【００３４】
エシェリヒア・コリ K-12株から５ｇ／ＬのＬ−バリンに対する耐性を有する自然突然変異株を選択し、Ｎｏ．１０１株を得た（Valr）。この株のＬ−ロイシン生産は認められなかった。
Ｎｏ．１０１株から、１．３ｇ／Ｌのアザロイシンに対する耐性を有する自然突然変異株を選択し、Ｎｏ．５１株を得た（Valr、ALr）。この株のＬ−ロイシン生産量は、約０．０５〜０．１ｇ／Ｌであった。
【００３５】
さらにＮｏ．５１株から、２ｇ／Ｌのヒドロキシロイシンに対する耐性変異株を選択し、Ｎｏ．４株を得た（Valr、ALr、Hleur）。尚、HLeurは、ヒドロキシロイシン耐性を付与された菌株であることを表す。この株のＬ−ロイシン生産量は、約０．４〜０．６ｇ／Ｌである。
【００３６】
次に、Ｎｏ．４株をＮＴＧで処理し、１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対する耐性変異株を２株選択し、Ｎｏ．５７株及びＮｏ．１０３株とした（Valr、ALr、Hleur、Leur）。これらの株のＬ−ロイシン生産量は、１．５〜１．７ｇ／Ｌであった。
【００３７】
上記菌株のうち、Ｎｏ．４株（Escherichia coli K-12,4）、Ｎｏ．５７株（Escherichia coli K12,57）及びＮｏ．１０３株（Escherichia coli K-12,103）は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Russian National Collection of Industrial Microorganisms；Russia 113545 Moscow 1 Dorozhny proezd, 1）に、それぞれVKPM B-7387、VKPM B-7386及びVKPM B-7388の受託番号で寄託されている。
【００３８】
【実施例３】
Ｎｏ．５７株およびＮｏ．１０３株によるＬ−ロイシンの製造
Ｎｏ．５７株の菌体およびＮｏ．１０３株の菌体のそれぞれをＭ９寒天平板上で３７℃の温度条件下、３０時間かけて生育させた。得られた培養物の白金耳一杯ずつを、発酵培地（グルコース６％、硫酸アンモニウム１．５％、リン酸水素カリウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．１％、チアミン０．００００１％、炭酸カルシウム２％を含有）が１５ｍｌ入った振盪フラスコ（２５０ｍｌ）に、それぞれ接種した。培養はロータリー式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）を用いて３２℃の条件下で４８時間行われた。その結果、Ｎｏ．５７株の培養では１．５ｇ／Ｌの、またＮｏ．１０３株の培養では１．７ｇ／ＬのＬ−ロイシンがそれぞれ産生された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−ロイシン生産菌として、又はＬ−ロイシン生産菌育種の出発材料として、利用することができる。本発明により、従来知られているエシェリヒア属細菌を用いたＬ−ロイシン製造法よりも、効率よくＬ−ロイシンを製造することができる。
Claims (5)
- Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつ１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対して耐性を有するエシェリヒア・コリ細菌。
- さらにロイシンアナログに対する耐性を有する請求項１記載のエシェリヒア・コリ細菌。
- 前記ロイシンアナログが、４−アザロイシン及び３−ヒドロキシロイシンから選ばれる請求項２記載のエシェリヒア・コリ細菌。
- エシェリヒア・コリ細菌から、ロイシンアナログに対する耐性及び１５ｇ／ＬのＬ−ロイシンに対する耐性を有する株を、各々の耐性について少なくとも１回、かつ、任意の順序で段階的に選択された、Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア・コリ細菌。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア・コリ細菌を培地で培養し、該培養物中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ−ロイシンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29474898A JP3915275B2 (ja) | 1998-10-16 | 1998-10-16 | Ｌ−ロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29474898A JP3915275B2 (ja) | 1998-10-16 | 1998-10-16 | Ｌ−ロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000116393A JP2000116393A (ja) | 2000-04-25 |
| JP3915275B2 true JP3915275B2 (ja) | 2007-05-16 |
Family
ID=17811805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29474898A Expired - Lifetime JP3915275B2 (ja) | 1998-10-16 | 1998-10-16 | Ｌ−ロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3915275B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7300776B2 (en) | 2004-04-26 | 2007-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
| JP4984423B2 (ja) * | 2004-04-26 | 2012-07-25 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR102055874B1 (ko) * | 2016-12-28 | 2019-12-13 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 |
-
1998
- 1998-10-16 JP JP29474898A patent/JP3915275B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000116393A (ja) | 2000-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6124121A (en) | Method for producing L-leucine | |
| RU2201454C2 (ru) | Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина | |
| US7635579B2 (en) | Metabolic engineering of amino acid production | |
| US6737255B2 (en) | Mutant ilvH gene and method for producing L-valine | |
| JP2011147459A (ja) | 新規な細菌株、これを調製する方法、およびｌ−リジン産生のための発酵プロセスにおけるそれらの使用 | |
| JP3915275B2 (ja) | Ｌ−ロイシンの製造法 | |
| Komatsubara | Amino acids: genetically engineered Serratia marcescens | |
| CN1293184C (zh) | 生产l－亮氨酸的方法 | |
| CN100372927C (zh) | tdcBC/pckA基因失活的微生物和利用该微生物生产L-苏氨酸的方法 | |
| RU2264457C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ ESCHERICHIA, СОДЕРЖАЩЕЙ НЕАКТИВНЫЙ ГЕН gadB | |
| CN1222576A (zh) | 生产l－亮氨酸的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061010 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061211 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070129 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100216 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100216 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110216 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110216 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120216 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120216 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130216 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130216 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140216 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |