ES2932086T3 - Una variante novedosa de la isopropilmalato sintasa y un método para producir L-leucina mediante el uso de la misma - Google Patents
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Abstract
La presente descripción se refiere a un nuevo polipéptido modificado que tiene actividad de isopropilmalato sintasa, un polinucleótido que lo codifica, un microorganismo que comprende el polipéptido y un método para producir L-leucina cultivando el microorganismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Una variante novedosa de la isopropilmalato sintasa y un método para producir L-leucina mediante el uso de la misma
Campo técnico
La presente descripción se refiere a un polipéptido modificado novedoso que tiene una actividad de isopropilmalato sintasa, un polinucleótido que lo codifica, un microorganismo que comprende el polipéptido y un método para producir L-leucina mediante el cultivo del microorganismo.
Antecedentes de la técnica
La L-leucina es un aminoácido esencial, caro y muy usado en medicamentos, alimentos, aditivos para piensos, productos químicos industriales, etcétera. Además, la L-leucina se produce principalmente mediante el uso de un microorganismo. La fermentación de aminoácidos de cadena ramificada, que incluye la L-leucina, se lleva a cabo principalmente a través de un microorganismo del género Escherichia o un microorganismo del género Corynebacterium, conocido por realizar la biosíntesis de 2-cetoisocaproato como precursor del ácido pirúvico mediante varias etapas (patentes coreanas núms. 10-0220018 y 10-0438146).
La isopropilmalato sintasa (en lo adelante denominada "IPMS"), que es una enzima involucrada en la biosíntesis de leucina, es una enzima de la primera etapa en la biosíntesis de leucina, que convierte el 2-cetoisovalerato, producido durante la vía biosintética de la valina, en isopropilmalato, lo que permite la biosíntesis de leucina en lugar de valina y, por consiguiente, la IPMS es una enzima importante en el proceso de biosíntesis de leucina. Sin embargo, la IPMS está sujeta a la inhibición por retroalimentación de L-leucina, que es un producto final, o sus derivados. En consecuencia, aunque existe una variedad de técnica anterior relevante para las variantes de IPMS que suprimen la inhibición por retroalimentación con el fin de producir una alta concentración de leucina (Solicitud de publicación de patente de Estados Unidos núm. 2015-0079641 y Patente de Estados Unidos núm. 6403342), la investigación continúa para descubrir mejores variantes.
Descripción
Problema técnico
Los presentes inventores se han esforzado en desarrollar una variante de IPMS que pueda usarse para la producción de L-leucina con una alta concentración y, como resultado, los presentes inventores desarrollaron una variante novedosa de IPMS. Se confirmó que la variante suprimió la inhibición por retroalimentación de L-leucina, que es un producto final y aumentó su actividad de manera que la variante es capaz de producir L-leucina con un alto rendimiento a partir de un microorganismo que la contiene, lo que completa por consiguiente la presente descripción.
Solución técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar un polipéptido modificado novedoso que tiene actividad de isopropilmalato sintasa.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifique el polipéptido modificado. Aún otro objeto de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que produzca L-leucina, que contenga el polipéptido.
Aún otro objeto de la presente descripción es proporcionar un método para producir L-leucina mediante el cultivo del microorganismo en un medio.
Efectos ventajosos
El polipéptido modificado novedoso que tiene actividad de isopropilmalato sintasa es un polipéptido en el que la actividad se incrementa en comparación con la del tipo salvaje, suprime la inhibición por retroalimentación de L-leucina y por consiguiente puede producirse L-leucina con un alto rendimiento mediante el uso de dicho polipéptido modificado.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Para lograr los objetos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona un polipéptido modificado novedoso que tiene actividad de isopropilmalato sintasa. El polipéptido modificado novedoso puede ser un polipéptido modificado que tiene actividad de isopropilmalato sintasa, en donde la arginina en la posición 558 de un
extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 está sustituida con un residuo de aminoácido distinto de arginina o la glicina en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 está sustituida con un residuo de aminoácido distinto de glicina. El polipéptido modificado de la presente descripción no solo tiene una actividad superior a la de un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 que tiene actividad de isopropilmalato sintasa, sino que también tiene la característica de que está suprimida la inhibición por retroalimentación de L-leucina.
Como se usa en la presente descripción, el término "isopropilmalato sintasa" se refiere a una enzima que convierte 2-cetoisovalerato en isopropilmalato, que es un precursor de L-leucina, tras reaccionar con acetil-CoA. La isopropilmalato sintasa de la presente descripción puede incluirse siempre que la enzima tenga la actividad de conversión, independientemente del origen de un microorganismo. Específicamente, la isopropilmalato sintasa puede ser una enzima derivada de un microorganismo del género Corynebacterium. Más específicamente, la isopropilmalato sintasa puede ser una isopropilmalato sintasa derivada de Corynebacterium glutamicum y específicamente, puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, pero no se limita a ella. Además, la isopropilmalato sintasa puede incluir un polipéptido que tenga una homología de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, es obvio que una secuencia de aminoácidos que tiene tal homología y que exhibe un efecto correspondiente al de la isopropilmalato sintasa puede incluirse dentro del alcance de la presente descripción incluso si tiene una secuencia de aminoácidos en la que algunas de las secuencias se eliminan, modifican, sustituyen o adicionan.
Como se usa en la presente descripción, el término "incremento en la actividad de isopropilmalato sintasa" se refiere a un incremento en la actividad de conversión en isopropilmalato. Por lo tanto, el polipéptido modificado de la presente descripción tiene un nivel más alto de actividad de conversión de isopropilmalato en comparación con un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa. La actividad de conversión de isopropilmalato puede confirmarse directamente tras medir el nivel de isopropilmalato producido, o puede confirmarse indirectamente tras medir el nivel de CoA producido. Como se usa en la presente descripción, el término "incremento de actividad" puede usarse en combinación con "actividad aumentada". Además, el isopropilmalato es un precursor de la L-leucina y, por tanto, el uso del polipéptido modificado de la presente descripción da como resultado la producción de un nivel más alto de L-leucina en comparación con un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa.
Además, a diferencia de un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa, el polipéptido modificado de la presente descripción puede caracterizarse porque tiene suprimida la inhibición por retroalimentación de L-leucina, que es un producto final, o un derivado de esta. Como se usa en la presente descripción, el término "inhibición por retroalimentación" se refiere a la inhibición de una reacción en el estado inicial de un sistema enzimático por un producto final en el sistema enzimático. Para los objetos de la presente descripción, la inhibición por retroalimentación puede ser una inhibición por retroalimentación en la que la L-leucina o un derivado de esta inhibe la actividad de isopropilmalato sintasa, lo que media la primera etapa de la vía biosintética, pero no se limita a ella. Por lo tanto, cuando se suprime la inhibición por retroalimentación de la isopropilmalato sintasa, la productividad de L-leucina puede incrementarse en comparación con el caso de no suprimir la misma.
Como se usa en la presente descripción, el término "modificación", "modificado" o "variante" se refiere a un cultivo o un individuo que muestra una alternancia heredable o no heredable en un fenotipo estabilizado. Específicamente, el término "variante" tiene el propósito de denominar una variante en la que su actividad se incrementa de manera eficiente porque la secuencia de aminoácidos correspondiente a la isopropilmalato sintasa derivada de Corynebacterium glutamicum se modifica en comparación con el tipo salvaje, una variante en la que se suprime la inhibición por retroalimentación de L-leucina o un derivado de esta, o una variante en la que se suprimen tanto el incremento de la actividad como la inhibición por retroalimentación.
Específicamente, el polipéptido modificado de la presente descripción, que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa, puede ser un polipéptido modificado que tiene actividad de isopropilmalato sintasa, en donde la arginina, un aminoácido en la posición 558 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituida con un residuo de aminoácido distinto de arginina, o glicina, un residuo de aminoácido en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituido con un residuo de aminoácido distinto de glicina. El aminoácido distinto de arginina puede incluir alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; y el aminoácido distinto de glicina puede incluir alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, arginina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; pero los aminoácidos no se limitan a ellos. Más específicamente, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido modificado, en donde la arginina, un residuo de aminoácido en la posición 558 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituida con histidina, alanina, o glutamina; o glicina, un residuo de aminoácido en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituido con ácido aspártico, arginina o tirosina, pero no se limita a ellos. Además, el polipéptido modificado puede ser uno en el que la arginina en la posición 558 esté sustituida con histidina, alanina o glutamina; y la glicina en la posición 561 está sustituida con ácido aspártico, arginina o tirosina,
pero no se limita a ellos. Más específicamente, el polipéptido modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 21 a la SEQ ID nO: 35.
Además, el polipéptido modificado puede incluir un polipéptido que tenga una homología de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 21 a la SEQ ID NO: 35. Por ejemplo, es obvio que una variante de enzima que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que algunas de las secuencias se eliminan, modifican, sustituyen o adicionan, mientras que la secuencia de aminoácidos modificada correspondiente a la secuencia de aminoácidos en las posiciones 558 y/o 561 se fija, también debería pertenecer al alcance de la presente descripción siempre que la secuencia de aminoácidos tenga la homología anterior y exhiba un efecto correspondiente al de la isopropilmalato sintasa. Por otro lado, las posiciones 558 y 561, que son posiciones de modificación específicas, se refieren a posiciones que se determinan sobre la base del extremo N en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y por lo tanto, el hecho de que dichas posiciones se determinan tras considerar el número de aminoácidos que se adicionan o eliminan del extremo N de la SEQ ID NO: 1, es obvio para un experto en la técnica y, por consiguiente, también pertenece al alcance de la presente descripción. Por ejemplo, leuA, que es el gen que codifica la isopropilmalato sintasa, se representó por la SEQ ID NO: 1 que consiste en 616 aminoácidos. Sin embargo, en algunas referencias, el codón de inicio de la traducción se indica 35 aminoácidos cadena abajo de la secuencia del gen leuA, es decir, un gen que consiste en 581 aminoácidos. En tal caso, el aminoácido 558 se interpreta como el aminoácido 523 y el aminoácido 561 como el aminoácido 526 y por consiguiente se incluye en el alcance de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos porciones de polinucleótidos o de polipéptidos. La homología entre secuencias de una porción a otra porción puede determinarse mediante la tecnología conocida en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse tras ordenar directamente la información de la secuencia, es decir, parámetros, tales como puntuación, identidad, similitud, etcétera, de dos moléculas de polinucleótidos o dos moléculas de polipéptidos mediante el uso de un programa de computación de fácil acceso (Ejemplo: BLAST 2.0). Además, la homología entre polinucleótidos puede determinarse mediante la hibridación de polinucleótidos bajo la condición de formar una cadena doble estable entre las regiones homólogas y desensamblar con una nucleasa específica de cadena simple, seguido de la determinación del tamaño de los fragmentos desensamblados.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.
El polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa, en donde la arginina, un aminoácido en la posición 558 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituida con otro residuo de aminoácido distinto de arginina, o glicina, un residuo de aminoácido en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, está sustituido con otro residuo de aminoácido distinto de glicina. Específicamente, puede incluirse sin limitación un polinucleótido que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21 a la 35 y que tiene actividad de isopropilmalato sintasa; un polipéptido modificado que tiene una homología de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con el polipéptido anterior; o que codifica un polipéptido modificado que tiene actividad de isopropilmalato sintasa, en el que algunas de las secuencias se eliminan, modifican, sustituyen o adicionan mientras que la secuencia de aminoácidos modificada en las posiciones 558 y/o 561, que son posiciones de modificación específicas en el polipéptido anterior, se fija. Alternativamente, puede incluirse sin limitación la sonda que puede prepararse a partir de una secuencia de genes conocida, por ejemplo, una secuencia que codifica una proteína que tiene actividad de isopropilmalato sintasa mediante la hibridación de una secuencia complementaria para toda o parte de la secuencia de nucleótidos anterior en condiciones rigurosas.
Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones bajo las cuales se forma un llamado híbrido mientras que no se forman híbridos no específicos. Los ejemplos de tales condiciones incluyen condiciones bajo las cuales genes que tienen altos grados de homología, tales como genes que tienen una homología del 80 % o más, específicamente del 90 % o más, más específicamente del 95 % o más, además específicamente del 97 % o más, y más específicamente 99 % o más, se hibridan entre sí mientras que los genes que tienen bajos grados de homología no se hibridan entre sí, o condiciones en las que los genes se lavan 1 vez, y específicamente 2 y 3 veces, a una temperatura y una concentración de sal equivalentes a 60 °C, SSC 1 * y SDS 0,1 %, específicamente a 60 °C, SSC 0,1 * y SdS 0,1 %, y más específicamente a 68 °C, SSC 0,1 * y SdS 0,1 %, que son las condiciones para el lavado de hibridación Southern habitual (Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
La sonda usada en la hibridación puede ser parte de la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos. Dicha sonda puede construirse mediante PCR mediante el uso de un oligonucleótido preparado sobre la base de una secuencia conocida como cebador y un fragmento de gen que contiene dicha secuencia de nucleótidos como molde. Por ejemplo, puede usarse como sonda un fragmento de gen que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb. Más específicamente, en el caso de usar una sonda que tenga una longitud (aproximadamente 300 pb), pueden sugerirse 50 °C, SSC 2 x y SDS 0,1 % para las condiciones de lavado de hibridación.
Por otro lado, el polinucleótido puede ser un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 36 a la SEQ ID NO: 50 y es obvio que el polinucleótido también incluye un polinucleótido que puede traducirse en el polipéptido modificado por degeneración de codones.
Aún otro aspecto de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que produce L-leucina, que contiene el polipéptido modificado.
En la presente descripción, el microorganismo puede incluir un microorganismo producido artificialmente mediante transformación o un microorganismo natural.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la introducción de un gen en una célula huésped para su expresión. En la presente descripción, el método de transformación incluye cualquier método que introduzca un gen en una célula y pueda llevarse a cabo tras seleccionar una técnica estándar adecuada conocida en la técnica. Los ejemplos del método de transformación son electroporación, coprecipitación con fosfato cálcico, infección retroviral, microinyección, DEAE-dextrano, liposoma catiónico, método de choque térmico, etcétera, pero no se limitan a ellos.
El gen que va a transformarse puede incluir tanto una forma insertada en el cromosoma de una célula huésped como una forma ubicada fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. Además, el gen incluye ADN y ARN como polinucleótido capaz de codificar un polipéptido y puede usarse sin limitación cualquier gen que pueda introducirse y expresarse en la célula huésped. Por ejemplo, el gen puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción polinucleotídica que contiene todos los elementos necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión incluye habitualmente un promotor unido operativamente al gen, una señal de terminación de la transcripción, sitios de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, puede ser un gen introducido en la propia célula huésped o en forma de una construcción polinucleotídica, es decir, una forma de un vector, y unido operativamente a las secuencias requeridas para la expresión en la célula huésped.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a cualquier portador de nucleótidos para la clonación y/o transferencia a una célula huésped. Un vector puede ser un replicón que permita la replicación de los fragmentos combinados con otros fragmentos de ADN. El término "replicón" se refiere a cualquier unidad genética que actúe como autorreplicante para la replicación del ADN in vivo, es decir, que sea replicable por autorregulación (por ejemplo, plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas y virus). El término "vector" puede incluir portadores virales y no virales para introducir nucleótidos en una célula huésped in vitro, ex vivo o in vivo, y también puede incluir un ADN miniesférico. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido sin secuencia de ADN bacteriano. Se ha llevado a cabo la eliminación de secuencias de ADN bacteriano que son ricas en área CpG para reducir el silenciamiento de la expresión del transgén y promover una expresión más continua a partir de un vector de ADN plasmídico (por ejemplo, Ehrhardt, A. y otros (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25;Yet, N. S. (2002) Mol Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. y otros, (2004) Gene Ther 11: 856-64). El término "vector" también puede incluir un transposón como Sleeping Beauty (Izsvak y otros J. Mol. Biol. 302: 93-102 (2000)) o un cromosoma artificial. Los ejemplos de los vectores usados típicamente pueden ser plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, como el vector fago o el vector cósmido, pueden usarse pWE15, M13, AMBE3, AMBL4, AIXII, XASHII, aAp II, At10, At11, Charon4A, Charon21A, etcétera. Además, como vector plasmídico, pueden usarse el tipo pDZ, tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptlI, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET, etcétera. Específicamente, puede usarse el vector pECCG117. El vector que puede usarse en la presente descripción no se limita particularmente y puede usarse un vector de expresión/sustitución conocido.
Además, el vector puede ser un vector recombinante que puede incluir adicionalmente varios genes de resistencia a antibióticos.
Como se usa en la presente descripción, el término "gen de resistencia a antibióticos" se refiere a un gen que tiene resistencia a antibióticos y las células que comprenden este gen sobreviven incluso en un ambiente tratado con el antibiótico correspondiente. Por lo tanto, el gen de resistencia a antibióticos puede usarse eficazmente como marcador de selección para una producción a gran escala de plásmidos en microorganismos, tales como E. coli, etcétera. En la presente invención, como el gen de resistencia a antibióticos no es un factor que afecte significativamente la eficiencia de expresión que se obtiene mediante una combinación óptima de componentes del vector que es la característica clave de la presente invención, cualquier gen común de resistencia a antibióticos puede usarse como marcador de selección sin limitación. Específicamente, pueden usarse genes de resistencia contra ampicilina, tetraciclina, kanamicina, cloranfenicol, estreptomicina o neomicina.
Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" se refiere a la unión operativa de una secuencia reguladora para la expresión de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana para realizar su función general, lo que afecta por consiguiente la expresión de una secuencia de nucleótidos codificante. La unión operativa con un vector puede realizarse mediante el uso de una técnica de recombinación de
genes conocida en la técnica, y la escisión y ligación de ADN específicas del sitio pueden realizarse mediante el uso de una enzima de restricción y ligasa conocidas en la técnica.
Como se usa en la presente descripción, el término "célula huésped en la que se introduce (transforma) un vector" se refiere a una célula transformada con un vector que tiene un gen que codifica una o más proteínas diana. La célula huésped puede incluir cualquiera de un microorganismo procariótico y un microorganismo eucariótico siempre que el microorganismo incluya un polipéptido modificado capaz de producir isopropilmalato sintasa mediante la introducción del vector anterior. Por ejemplo, puede incluirse la cepa de microorganismo perteneciente a los géneros Escherichia, Erwinia, Serratia, Providencia, Corynebacterium y Brevibacterium. Un ejemplo del microorganismo del género Corynebacterium puede ser Corynebacterium glutamicum, pero no se limita a él.
El microorganismo del género Corynebacterium que produce L-leucina, que es capaz de expresar el polipéptido modificado con actividad de isopropilmalato sintasa, incluye todos los microorganismos capaces de expresar el polipéptido modificado mediante varios métodos conocidos además de la introducción de un vector.
Aún otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir L-leucina, que comprende: (a) cultivar el microorganismo del género Corynebacterium que produce L-leucina; y (b) recuperar L-leucina del microorganismo cultivado o del medio cultivado.
Como se usa en la presente descripción, el término “cultivo” se refiere a cultivar un microorganismo en condiciones ambientales controladas apropiadamente. El proceso de cultivo de la presente descripción puede llevarse a cabo en dependencia de un medio adecuado y las condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Tal proceso de cultivo puede ajustarse fácilmente y usarse por un experto en la técnica en dependencia de la cepa a seleccionar. Específicamente, el cultivo puede ser de tipo por lotes, tipo continuo y tipo de lote alimentado, pero no se limita a ellos.
Las fuentes de carbono contenidas en el medio pueden incluir azúcares y carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino, aceite de coco, etcétera; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes, tales como glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Estos materiales pueden usarse solos o en combinaciones de estos, pero no se limitan a ellos. Las fuente de nitrógeno contenidas en el medio pueden incluir fuentes de nitrógeno orgánico, tales como peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz y soja y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinaciones de estas, pero no se limitan a ellas. Las fuentes de fósforo contenidas en el medio pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio y las sales correspondientes que contienen sodio, pero no se limitan a ellas. Además, pueden estar contenidas las sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, pueden estar contenidos aminoácidos, vitaminas, precursores adecuados, etcétera. Estos medios o precursores pueden adicionarse a un cultivo en un proceso de cultivo por lotes o en un proceso de cultivo continuo, pero no se limitan a ellos.
El pH del cultivo puede ajustarse durante el cultivo tras adicionar un compuesto apropiado como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico y la generación de espumas puede inhibirse durante el cultivo mediante el uso de un agente antiespumante como éster de poliglicol de ácido graso. Para mantener las condiciones aeróbicas del cultivo, puede inyectarse oxígeno o gas que contenga oxígeno en el cultivo. Para mantener las condiciones anaeróbicas y microaeróbicas, no puede inyectarse gas ni nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono. La temperatura del cultivo puede ser de 27 °C a 37 °C, y específicamente de 30 °C a 35 °C, pero no se limita a ellas. El período de cultivo puede continuarse mientras se recupere la cantidad deseada de material útil y preferentemente durante 10 a 100 horas, pero el período de cultivo no se limita a ellas.
La etapa de recuperar la L-leucina producida en la etapa de cultivo de la presente descripción puede recoger la L-leucina deseada a partir del microorganismo o el medio mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica en dependencia de los métodos de cultivo. Por ejemplo, pueden usarse centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, HPLC, etcétera y puede usarse un método adecuado conocido en la técnica para recuperar la L-leucina deseada a partir del medio o del microorganismo. Además, la etapa de recuperación anterior puede incluir un proceso de purificación.
Modo de llevar a cabo la invención
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle con modalidades ilustrativas acompañantes. Sin embargo, las modalidades ilustrativas que se describen en la presente descripción son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1: Confirmación de la secuencia de nucleótidos leuA de KCCM11661P, microorganismo que produce leucina
Se inoculó Corynebacterium glutamicum ATCC14067 en un medio de siembra que tenía los ingredientes descritos a continuación a 121 °C durante 15 minutos, se cultivó durante 13 horas y después se recuperaron 25 ml del medio de cultivo. El medio de cultivo recuperado se lavó con un tampón citrato 100 mM y se trató con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) durante 30 minutos hasta una concentración final de 400 pg/ml. Después de eso, el resultante se lavó con un tampón fosfato 100 mM. Se determinó que la tasa de mortalidad de las cepas tratadas con NTG era del 99,6 % como resultado de extender las cepas en un medio mínimo que tenía los ingredientes descritos a continuación. Para lograr variantes resistentes a norleucina (NL), las cepas tratadas con NTG se extendieron en el medio mínimo con concentraciones finales de 20 mM, 40 mM y 50 mM, se cultivaron a 30 °C durante 5 días y después se obtuvieron las variantes resistentes a NL.
Medio de siembra
Glucosa (20 g), peptona (10 g), extracto de levadura (5 g), carbamida (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO47H2O (0,5 g), biotina (100 pg), cloruro de tiamina (1000 pg), ácido pantoténico-calcio (2000 pg) y nicotinamida (2000 pg; basado en 1 litro de agua destilada), a pH 7,0
Medio de producción
Glucosa (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos de maceración de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSo4-7H2O (0,5 g), biotina (100 pg), cloruro de tiamina (1000 pg), ácido pantoténico-calcio (2000 pg), nicotinamida (3000 pg), CaCO3 (30 g) (basado en 1 litro de agua destilada), a pH 7,0
Las variantes obtenidas por el método anterior se designaron como Corynebacterium glutamicum KCJ-24 y Corynebacterium glutamicum KCJ-28 y se depositaron en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea, una autoridad depositaria internacional, el 22 de enero de 2015, en virtud del Tratado de Budapest, y como un resultado, Corynebacterium glutamicum KCJ-24 y Corynebacterium glutamicum KCJ-28 se depositaron con los números de acceso KCCM11661P y KCCM11662P, respectivamente. Corynebacterium glutamicum KCJ-24 y Corynebacterium glutamicum KCJ-28 produjeron L-leucina en una concentración de 2,7 g/l y 3,1 g/l, respectivamente. Por tanto, se confirmó que la productividad de la L-leucina producida a partir de las variantes era diez veces mayor que la del tipo salvaje.
Además, se intentó confirmar si la variación de leuA que codifica la isopropilmalato sintasa (IPMS) se produjo en la variante KCCM11661P. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de leuA de tipo salvaje se confirmó tras hacer referencia a WP_003863358.1 de Genebank. El ADN cromosómico de la variante se amplificó mediante el uso de un método de reacción en cadena de la polimerasa (en lo adelante denominado "PCR"). Aunque se sabe que el gen leuA consiste en 616 aminoácidos, en algunas referencias se publica que el codón de inicio de la traducción se indica 35 aminoácidos cadena abajo de la secuencia del gen leuA y por consiguiente el gen leuA consiste en 581 aminoácidos. En tal caso, el número de posición que indica la variación del aminoácido correspondiente puede variar. Por lo tanto, en los casos en los que se considera que el gen leuA consiste en 581 aminoácidos, la posición de variación se indica además entre paréntesis.
Específicamente, la PCR se realizó mediante el uso del ADN cromosómico de la variante como molde y mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 3 y 4 en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 2 minutos mediante el uso de Taq ADN polimerasa. Dicha PCR se repitió un total de 28 veces para amplificar un fragmento de aproximadamente 2700 pares de bases. La secuencia de nucleótidos del fragmento se analizó mediante el uso del mismo cebador y, como resultado, se confirmó que G, que es el nucleótido 1673o de leuA en KCCM11661P, se sustituyó por A. Este resultado implica que la arginina, que es el 558o aminoácido (o 523o; en lo adelante sólo se indicará como 558o), se sustituyó con histidina. Además, también se confirmó que GC, que son los nucleótidos 1682o y 1683o, se sustituyeron con AT. Este resultado también implica que la glicina, que es el 561o aminoácido (o 526o, en lo adelante solamente se indica como 561o), se sustituyó con ácido aspártico.
Ejemplo 2: Producción del vector de sustitución de la variante de IPMS
Para producir un vector que contiene la secuencia de nucleótidos modificada confirmada en el Ejemplo 1, se realizó la PCR mediante el uso del ADN cromosómico de la variante anterior como molde y mediante el uso de cebadores de la SEQ ID NO: 5 y 6 en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 1 minuto mediante el uso de la ADN polimerasa de Pfu. Dicha PCR se repitió un total de 25 veces para amplificar un fragmento de aproximadamente 1460 pares de bases con sitios de enzimas de restricción Salí y Xbal. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción, Salí y Xbaí, y después se preparó pDZ-leuA (R558H, G561D) mediante ligación con el vector pDZ (patente coreana núm: 10-0924065 y publicación de patente internacional núm. 2008-033001) tratados con las mismas enzimas. Además, para preparar un vector con cada variación, se usó ATCC14067 como molde, y después se amplificaron 2 fragmentos mediante el uso de los cebadores 5 y 7, y los cebadores 8 y 6, respectivamente. La PCR se realizó mediante el uso de los dos fragmentos preparados como moldes en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C
durante 1 minuto mediante el uso de ADN polimerasa de Pfu. Dicha PCR se repitió un total de 25 veces para amplificar un fragmento de aproximadamente 1460 pares de bases con sitios de enzimas de restricción SalI y XbaI. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción SalI y XbaI, y después se preparó pDZ-leuA (R558H) mediante ligación con pDZ tratado con las mismas enzimas. Se preparó pDZ-leuA (G561D) mediante el uso de los cebadores 5 y 9, y los cebadores 10 y 6 por el mismo método anterior.
Ejemplo 3: Producción de cepa de sustitución de la variante de IPMS
Se usó Corynebacterium glutamicum ATCC14067 como cepa parental para preparar una cepa que contenga la secuencia de nucleótidos modificada con leuA que se encontró en la cepa modificada anterior.
Se transformó Corynebacterium glutamicum ATCC14067 con los vectores pDZ-leuA (R558H), pDZ-leuA (G561D) y pDZ-leuA (R558H, G561D), que se prepararon en el Ejemplo 2 por electroporación. Cada una de las cepas preparadas a través del cruce secundario se designó como 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) y 14067::leuA (R558H, G561D). Para confirmar si el nucleótido de leuA estaba sustituido, se realizó PCR mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 3 y 4 en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 2 minutos mediante el uso de Taq ADN polimerasa. Dicha PCR se repitió un total de 28 veces para amplificar un fragmento de aproximadamente 2700 pares de bases. Posteriormente, se confirmó la sustitución del nucleótido de leuA tras analizar la secuencia de nucleótidos con el mismo cebador.
La cepa, 14067::leuA (R558H, G561D) que se transformó con el vector pDZ-leuA (R558H, G561D), se designó como KCJ-0148 y se depositó en el Centro de cultivo de microorganismos de Corea el 25 de enero de 2016, y como resultado, la cepa se depositó con el núm. de acceso KCCM11811P.
Ejemplo 4: Producción de L-leucina en la cepa de sustitución de la variante de IPMS
Para producir L-leucina a partir de Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) y 14067::leuA (R558H, G561D), que se prepararon en el Ejemplo 3, se llevó a cabo el cultivo de la siguiente manera. Se inoculó un asa de platino de cada una de las cepas parentales, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, y las cepas preparadas de Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) y 14067::leuA (R558H, G561D) en un matraz con deflectores de esquina (250 ml) que contiene un medio de producción (25 ml). Posteriormente, se produjo L-leucina mediante incubación en un baño de agua con agitación a 30 °C a una velocidad de 200 rpm durante 60 horas.
Una vez completada la incubación, se midió la cantidad de L-leucina producida mediante cromatografía líquida de alta resolución. La concentración de L-leucina en el medio de cultivo para cada cepa experimental se muestra en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1 Producción de L-leucina en la cepa de sustitución de la variante de IPMS
Como se muestra en la Tabla 1 anterior, se confirmó que la productividad de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::leuA (R558H), 14067::leuA (G561D) y 14067::leuA (R558H), G561D), que tienen la variación R558H, G561D o R558H/G561D en el gen leuA, aumentó aproximadamente de 12 a 25 veces en comparación con la de la cepa parental, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.
Ejemplo 5: Producción del vector que sobreexpresa la variante de IPMS
Para producir un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos modificada confirmada en el Ejemplo 1, se llevó a cabo la PCR mediante el uso de ATCC14067 y el ADN cromosómico de las 3 variantes preparadas en el Ejemplo 3 como moldes y mediante el uso de cebadores de las SEQ ID NO: 11 y 12 bajo la siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 1 minuto mediante el uso de la ADN polimerasa de Pfu. Dicha PCR se repitió un total de 25 veces para amplificar un fragmento de aproximadamente 2050 pares de bases con sitios de enzimas de restricción NdeI y XbaI. El fragmento amplificado se trató con enzimas de restricción, NdeI y XbaI, y después se prepararon por ligación los vectores de expresión p117_PCJ7-leuA (WT), p117_PCJ7-leuA (R558H), p117_PCJ7-leuA (G561D) y p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D) mediante el uso de p117_PCJ7 en la que se insertó un promotor PCJ7 en el vector pECCG117 (Biotechnology letters Vol. 13, núm. 10, pág. 721-726 (1991)) tratados con las mismas enzimas.
El promotor PCJ7 es un promotor que aumenta la expresión génica y es de conocimiento público en patente coreana núm. 10-0620092 y publicación de patente internacional núm. 2006-065095.
Ejemplo 6: Producción de cepa transformada con el vector que sobreexpresa la variante de IPMS
Para producir una cepa transformada con un vector de sobreexpresión que contiene la secuencia de nucleótidos modificada con leuA preparada en el Ejemplo 5, se usaron la cepa parental, que es Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo salvaje, y las cepas productoras de leucina KCCM11661P y KCCM11662P.
Cada uno de los vectores p117_PCJ7-leuA (WT), p117_PCJ7-leuA (R558H), p117 _PCJ7-leuA (G561D) y p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), preparados en el Ejemplo 5, se transformó con Corynebacterium glutamicum ATCC14067, kCc M11661P y KCCM11662P por electroporación. Como resultado, se produjeron 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067: p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H,G561D); KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D); y KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D).
Ejemplo 7: Producción de L-leucina en una cepa transformada con el vector que sobreexpresa la variante de IPMS Para producir L-leucina a partir de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D); KCCM11661P:: p117 PCJ7-leuA (WT), KCCM11661P::117PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D); y KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (WT), KCCM11662P::p117PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), que se produjeron en el Ejemplo 6, el cultivo se llevó a cabo de la siguiente manera.
Se inoculó un asa de platino de cada una de las cepas parentales, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, KCCM11661P y KCCM11662P, y las cepas producidas en el Ejemplo 6 en un matraz con deflectores de esquina (250 ml) que contenía un medio de producción (25 ml). Posteriormente, se produjo L-leucina mediante incubación en un baño de agua con agitación a 30 °C a una velocidad de 200 rpm durante 60 horas.
Una vez completada la incubación, se midió la cantidad de L-leucina producida mediante cromatografía líquida de alta resolución. La concentración de L-leucina en el medio de cultivo para cada cepa experimental se muestra en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2 Producción de L-leucina en cepa que sobreexpresa la variante de IPMS
Como se muestra en la Tabla 2 anterior, se confirmó que la producción de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina, 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) y 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), que se transformaron con el vector de sobreexpresión que contenía la variación del gen leuA en la cepa ATCC14067, aumentó de 45 a 98 veces en comparación con la de la cepa parental ATCC14067; la producción de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (G561D) y KCCM11661P::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), que se transformaron con el vector de sobreexpresión que contiene la variación del gen leuA en la cepa KCCM11661P, aumentó de 2,3 a 4,5 veces en comparación con la de la cepa parental KCCM11661P; y que la producción de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina, KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H), KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (G561D) y KCCM11662P::p117_PCJ7-leuA (R558H,G561D), que se transformaron con el vector de sobreexpresión que contenía la variación del gen leuA en la cepa KCKCM11662P, aumentó de 2 a 4,2 veces en comparación con la de la cepa parental KCCM11662P.
Ejemplo 8: Medición de la actividad de isopropilmalato sintasa en una cepa transformada con el vector que sobreexpresa leuA
Para medir la actividad de isopropilmalato sintasa en las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) y 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), producidas en el Ejemplo 6, se llevaron a cabo experimentos de la siguiente manera.
Se inoculó un asa de platino de cada una de las 4 cepas anteriores en un matraz con deflectores de esquina (250 ml) que contenía el medio de siembra (25 ml). Posteriormente, los resultantes se incubaron en un baño de agua con agitación a 30 °C a una velocidad de 200 rpm durante 16 horas. Una vez completada la incubación, el medio de cultivo se centrifugó para descartar el sobrenadante, el sedimento se lavó y mezcló con un tampón de lisis y las células se pulverizaron con un homogeneizador de perlas. Las proteínas presentes en el lisado se cuantificaron de acuerdo con el ensayo de Bradford, y se midió la actividad de isopropilmalato sintasa tras medir la CoA producida cuando se usó el lisado que contenía proteínas (100 pg/ml). Los resultados de la medición de la actividad de isopropilmalato sintasa en cada cepa se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Para confirmar el grado de supresión de la inhibición por retroalimentación de leucina en la enzima, se midió la actividad de isopropilmalato sintasa tras medir la CoA producida cuando se usó el lisado que contenía proteínas (100 pg/ml) en la condición en la que se adicionó leucina (3 g/l). Los resultados de la medición de la actividad de isopropilmalato sintasa en cada cepa se muestran en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Como se muestra en las Tablas 3 y 4 anteriores, se confirmó que la actividad de isopropilmalato sintasa de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561D) y 14067::p117_PCJ7-leuA (R558H, G561D), que se transformaron con el vector que expresa la variante de IPMS, aumentó 1,05, 1,3 y 3,2 veces, respectivamente, en comparación con la del control, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (WT). Además, las cepas productoras de L-leucina mantuvieron su actividad de IPMS al 61 %, 70 % y 89 %, respectivamente, incluso cuando se adicionó leucina (2 g/l), lo que confirma que se suprimió la inhibición por retroalimentación de leucina.
Ejemplo 9: Producción de vector para mejorar la variante de isopropilmalato sintasa (IPMS)
En los Ejemplos 4, 7 y 8, ya que se confirmó que los aminoácidos 558° y 561o en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la isopropilmalato sintasa eran sitios importantes para la actividad de la enzima variante de IPMS, se intentó confirmar si aumentaba la actividad enzimática o se suprimía más la inhibición por retroalimentación cuando se sustituía por un aminoácido distinto de los aminoácidos de la variante. Por tanto, se intentó preparar una variante sustituida con un aminoácido de otros grupos de aminoácidos capaces de provocar variaciones estructurales.
Se preparó una variante en la que el aminoácido 558°, arginina, se sustituyó por alanina (Ala) o glutamina (Gln). El vector p117_PCJ7-leuA (R558A), en el que el aminoácido 558 está sustituido con alanina (Ala), y el vector p117_PCJ7-leuA (R558Q), en el que el aminoácido 558 está sustituido con glutamina (Gln), se prepararon mediante el uso de un método de mutagénesis dirigida al sitio y mediante el uso del vector p117_PCJ7-leuA (R558H) como molde, el cebador de las SEQ ID NO: 13 y 14 y el par de cebadores de las SEQ ID NO: 15 y 16.
Se preparó una variante en la que el aminoácido 561o, glicina, se sustituyó por arginina (Arg) o tirosina (Tyr). El vector p117_PCJ7-leuA (G561R), en el que el aminoácido 561 está sustituido con arginina (Arg), y el vector p117_PCJ7-leuA (G561Y), en el que el aminoácido 561 está sustituido con tirosina (Tyr), se obtuvieron mediante el uso de un método de mutagénesis dirigida al sitio y mediante el uso de p117_PCJ7-leuA (G561D) como molde, el cebador de las SEQ ID NO: 17 y 18 y el par de cebadores de las SEQ ID No : 19 y 20.
Ejemplo 10: Producción de una cepa en la que se introduce una variante modificada con isopropilmalato
Para preparar una cepa transformada con un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos modificada con leuA preparada en el Ejemplo 9, se usó Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo salvaje como cepa parental.
Cada uno de los vectores, p117_PCJ7-leuA (R558A), p117_PCJ7-leuA (R558Q), p117_PCJ7-leuA (G561R) y p117 _PCJ7-leuA (G561Y), que se prepararon en el Ejemplo 9, se transformó en Corynebacterium glutamicum ATCC14067 mediante electroporación para preparar 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R) y 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y).
Ejemplo 11: Producción de L-leucina en una cepa en la que se introduce una variante modificada de isopropilmalato sintasa
Para producir L-leucina a partir de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A), 14067::p117_PCJ7-leuA (R558Q), 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R) y 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y), que se prepararon en el Ejemplo 10, el cultivo se llevó a cabo de la siguiente manera.
Se inoculó un asa de platino de cada una de la cepa parental, Corynebacterium glutamicum ATCC14067 y las 4 cepas anteriores en un matraz con deflectores de esquina (250 ml) que contenía un medio de producción (25 ml). Posteriormente, se produjo L-leucina mediante incubación en un baño de agua con agitación a 30 °C a una velocidad de 200 rpm durante 60 horas.
Una vez completada la incubación, se midió la cantidad de L-leucina producida mediante cromatografía líquida de alta resolución. La concentración de L-leucina en el medio de cultivo para cada cepa experimental se muestra en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5 Producción de L-leucina en cepa que sobreexpresa la variante de IPMS
Como se muestra en la Tabla 5 anterior, se confirmó que la productividad de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (R558A) y 14067::p117_PCJ7-leuA (R558Q), mejoró de 32 a 38 veces en comparación con la cepa parental, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.
Además, se confirmó que la productividad de L-leucina de las cepas productoras de L-leucina, Corynebacterium glutamicum 14067::p117_PCJ7-leuA (G561R) y 14067::p117_PCJ7-leuA (G561Y), mejoró de aproximadamente 36 a 40 veces en comparación con la de la cepa parental, Corynebacterium glutamicum ATCC14067.
Sobre la base de los resultados anteriores, se confirmó que los aminoácidos 558 y 561 en la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la isopropilmalato sintasa eran sitios importantes para la actividad de la enzima variante de IPMS, y que, incluso cuando cada uno de los aminoácidos 558 y 561 de la proteína IPMS de tipo salvaje se sustituyó por histidina y ácido aspártico, respectivamente, la productividad de L-leucina se incrementó notablemente en la
Claims (7)
1. Un microorganismo modificado perteneciente al género Corynebacterium para producir L-leucina, que comprende un polipéptido modificado que tiene una actividad de isopropilmalato sintasa,
en donde la glicina en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con ácido aspártico en el polipéptido modificado, y en donde el microorganismo modificado tiene resistencia a la norleucina o a la L-leucina.
2. El microorganismo modificado de la reivindicación 1, en donde un promotor nativo de un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado se sustituye con un promotor que aumenta la expresión del polinucleótido en comparación con el promotor nativo.
3. El microorganismo modificado de la reivindicación 2, en donde el promotor que aumenta la expresión del polinucleótido en comparación con el promotor nativo es un promotor PCJ7.
4. El microorganismo modificado de la reivindicación 1, en donde el microorganismo modificado perteneciente al género Corynebacterium se deriva de un Corynebacterium glutamicum.
5. Un microorganismo del género Corynebacterium que produce L-leucina, que se transforma con un vector que comprende i) un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado que tiene actividad de isopropilmalato sintasa y ii) un promotor que aumenta la productividad de L-leucina en relación con el polinucleótido, en donde la glicina en la posición 561 de un extremo N de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con ácido aspártico en el polipéptido modificado,
en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido modificado está conectado operativamente con dicho promotor en el vector, y
en donde dicho promotor aumenta la productividad de L-leucina en comparación con un promotor nativo que expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido no modificado que tiene la actividad de isopropilmalato sintasa en el microorganismo no transformado del género Corynebacterium.
6. El microorganismo modificado de la reivindicación 5, en donde el promotor que aumenta la productividad de L-leucina es un promotor PCJ7.
7. Un método para producir L-leucina, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio para producir L-leucina; y
(b) recuperar la L-leucina del microorganismo cultivado o del medio cultivado.
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