TWI510621B - 具有增加之腐胺生產力之重組微生物及使用該微生物之製造腐胺之方法 - Google Patents

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具有增加之腐胺生產力之重組微生物及使用該微生物之製造腐胺之方法

本發明係有關一種具有增加之腐胺生產力的重組微生物，其係藉由修飾微生物以減弱分解腐胺能力，及使用該微生物製造腐胺之方法。

腐胺(或1,4-丁烷二胺)係一種多元胺，如：亞精胺(spermidine)與精四胺(spermine)，且其係在革蘭陰性細菌與真菌中發現。由於腐胺在各種不同物種中以廣濃度範圍存在，因此認為其在微生物代謝作用中扮演重要角色。腐胺主要係由丙烯經過丙烯腈與琥珀腈之化學合成而產生。該化學合成法利用衍生自石油化學物之物質作為起始物，且使用毒性化學物，因此不利於環境，且會有石油消耗問題。

為了解決此等問題，已有許多研究致力發展生物合成腐胺之方法，其係藉由利用對環境較友善並可 減少能源消耗的微生物。目前已知，腐胺透過兩種微生物途徑生物合成。於一種途徑中，由麩胺酸產生鳥胺酸，且鳥胺酸脫除羧基以合成腐胺。於另一種途徑中，由鳥胺酸合成精胺酸，由精胺酸產生精胺(agmatine)，然後由精胺合成腐胺。此外，還有另一種合成腐胺之方法，其中係將已知涉及腐胺合成途徑之酵素轉形至目標微生物中。例如：WO09/125924揭示一種製造高產量腐胺之方法，其係使存在於大腸桿菌(E.coli )中與腐胺分解及利用相關之途徑失活、使其中鳥胺酸(係腐胺之前體)轉化成精胺酸之途徑失活、及加強鳥胺酸之生物合成途徑。一份2009年出版之文獻揭示一種製造高濃度腐胺之方法，其係將轉化鳥胺酸成腐胺之蛋白質導入至無法製造腐胺之棒狀桿菌(Corynebacterium )菌株中，且加強其活性(Qian等人，Biotechnol Bioeng,104：4,651-662,2009)。

所製造之腐胺會被微生物分解或用於其他代謝作用。例如：在大腸桿菌與麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum )中表現之亞精胺合成酶(EC：2.5.1.16，speE)從腐胺合成亞精胺，且博伊丁念珠菌(Candida boidinii )中表現之乙醯基轉移酶(N-乙醯基轉移酶)讓腐胺乙醯化成N-乙醯基腐胺。已知在大腸桿菌菌株中可產生高濃度腐胺，該大腸桿菌菌株係經過修飾以具有減弱之亞精胺乙醯基轉移酶(EC：2.3.1.57，speG)(其與上述乙醯基轉移酶具有高度同源性)活性(韓國專利案第1188432號)。

雖然棒狀桿菌屬微生物中讓腐胺乙醯化成 N-乙醯基腐胺之酵素尚未經鑑定，但已知當刪除已知編碼NCgl1469(其係組蛋白乙醯基轉移酶HPA2與相關乙醯基轉移酶)之基因時，可特定降低屍胺(cadaverine)(一種二胺)之N-乙醯化作用(Kind等人，Appl Environ Microbiol,76：15,5175-5180,2010)。然而，有報告指出，NCgl1469不會利用腐胺與1,3-二胺基丙胺作為受質。換言之，咸認為NCgl1469在不同二胺類中，僅針對屍胺具有專一活性。另一方面，已知NCgl1469在麩胺酸棒狀桿菌中展現乙醯基麩胺酸合成酶與鳥胺酸乙醯基轉移酶之活性，以製造高濃度鳥胺酸與精胺酸，且當NCgl1469在麩胺酸棒狀桿菌中過度表現時，可製造高產量鳥胺酸與精胺酸(韓國專利案第1174267號)。同樣地，NCgl1469之活性係專一針對麩胺酸與屍胺，且已知NCgl1469在提高鳥胺酸生產力上之效果，但卻仍無法判斷NCgl1469是否與腐胺之製造有關。

本發明者發現，藉由在經修飾以製造腐胺之棒狀桿菌屬微生物中減弱NCgl1469活性，可以製造高產量腐胺，因而完成本發明。

本發明之一目的係提供一種經修飾之棒狀桿菌屬微生物，其藉由減弱NCgl1469活性(與其內生性活性相比)，而具有增強之製造腐胺之能力。

本發明另一目的係提供一種使用棒狀桿菌 屬微生物來製造高產量腐胺之方法。

本發明中，具有增強之製造腐胺能力之麩胺酸棒狀桿菌菌株係藉由減弱NCgl1469活性(與其內生性活性相比)而製備，並使用該微生物可製造高濃度之工業上廣泛使用之腐胺。

第1圖為說明在麩胺酸棒狀桿菌中腐胺生物合成途徑與相關基因的概要圖。

為了達成上述目的，本發明提供一種具有增強之製造腐胺能力之經修飾棒狀桿菌屬微生物，其中具有如序列編號：18或序列編號：20所示之胺基酸序列之NCgl1469蛋白質活性與其內生性活性相比為減弱或經移除。

本文所採用術語「NCgl1469蛋白質」係指在麩胺酸棒狀桿菌中定義為組蛋白乙醯基轉移酶HPA2與相關乙醯基轉移酶之蛋白質，且在未判別其特定功能下，已有報告指出其乙醯化麩胺酸與屍胺(韓國專利案第10-1174267號，Hwang等人，J Ind Microbiol Biotechnol,37：11,1131-1136,2010,Kind等人，Appl Environ Microbiol,76：15,5175-5180,2010)。

本發明NCgl1469蛋白質包含如序列編號：18或序列編號：20所示之胺基酸序列。然而，並不受此限 制，因為展現上述活性之蛋白質胺基酸序列隨微生物物種或菌株可能有差異。換言之，其可能為突變蛋白質或具有下述胺基酸序列的人造變異體：在序列編號：18或序列編號：20之胺基酸序列上之一個或多個位置包含取代、刪除、插入或增加一個或數個胺基酸之胺基酸序列，只要其有助於如本發明所述，藉由減弱蛋白質活性來提高腐胺生產力即可。本文中，「數個」可為不同數，依據在蛋白質胺基酸殘基之三維結構中之位置或類型而定，但具體而言係指2至20個，較佳係2至10個，且更佳係2至5個。此外，若依據個體或微生物物種之差異，胺基酸之取代、刪除、插入、增加或反向(inversion)亦包括彼等由天然突變或人工變異體所造成者。

衍生自本發明麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之NCgl1469蛋白質具有如序列編號：18所示之胺基酸序列，且衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之NCgl1469蛋白質(其與上述胺基酸序列具有99%同源性)具有如序列編號：20所示之胺基酸序列。

編碼本發明胺基酸序列之多核苷酸可包含編碼下述蛋白質之多核苷酸序列，只要其具有與本發明NCgl1469蛋白質類似之活性即可：與序列編號：18或序列編號：20之胺基酸序列為80%或更佳係90%或亦更佳係95%或以上，且特別佳係97%或以上同源性，且最佳係分別如序列編號：17或序列編號：19所示之多核苷酸序列。

術語「同源性」係指兩胺基酸序列之間的 相同性，且可採用本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知之方法測定，利用BLAST 2.0計算參數，如：得分、相同性與相似性。

此外，本發明多核苷酸序列可與序列編號：17或序列編號：19之多核苷酸雜交，或與自本發明多核苷酸序列製成之探針在「嚴苛條件」下雜交，且可為編碼功能正常之蛋白質之變異體。本文所採用「嚴苛條件」係指讓多核苷酸之間進行特定雜交之條件，其具體說明於例如：「分子選殖法」(Molecular Cloning)(A Laboratory Manual,J.Sambrook等人編輯，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989))或「最新分子生物法」(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人編輯，,John Wiley & Sons,Inc.,New York))，其說明例如：在65℃之雜交緩衝液(3.5×SSC、0.02% Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯啶酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5mM NaH₂ PO₄ (pH 7)、0.5% SDS、2mM EDTA)中雜交。SSC為0.15M氯化鈉/0.15M之pH 7檸檬酸鈉。雜交後，將DNA傳送於其上之膜於室溫以2 X SSC清洗，然後使用於68℃以0.1至0.5 X SSC/0.1 X SDS清洗。

本發明中，減弱NCgl1469活性意指與其內生性活性相比，降低或移除NCgl1469之活性。NCgl1469蛋白質之活性可藉由下述方法減弱：1)部份或完全刪除編碼蛋白質之多核苷酸、2)藉由修飾表現調節序列來降低多核苷酸表現、3)修飾染色體上之多核苷酸序列，以減弱蛋白 質活性、或4)其組合。

上述方法中，部份或完全刪除編碼蛋白質之多核苷酸可藉由下列方式進行：若針對多核苷酸時，染色體中編碼內生性目標蛋白質之多核苷酸由部份刪除之核苷酸序列替代，或者若針對標記基因時，由供染色體基因插入之載體替代。「部份」之長度係依多核苷酸之類型而異，但具體而言為2bp至300bp，較佳係2bp至100bp，且更佳係2bp至5bp。

此外，藉由修飾表現調節序列來降低多核苷酸表現可以下列方式進行：透過刪除、插入、保留性或非保留性取代核苷酸序列或其組合，誘發表現調節序列之突變，以進一步減弱表現調節序列之活性，或由具有較弱活性之序列置換表現調節序列。表現調節序列包括編碼啟動子之序列、操縱子序列、核糖體結合位置與控制轉錄與轉譯中止之序列。

此外，修飾染色體上多核苷酸序列以減弱蛋白質活性可藉由下列方式進行：透過刪除、插入、保留性或非保留性取代核苷酸序列或其組合，誘發序列突變，以進一步減弱序列之活性，或由修飾序列置換多核苷酸序列，以具有蛋白質之降低活性。

同時，本發明具有增強製造腐胺能力之棒狀桿菌屬微生物可經過進一步修飾，以減弱鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)(其與自鳥胺酸合成精胺酸有關)之活性及蛋白質(NCgl1221)(其與釋放麩胺酸有關)之活性(與其內生 性活性相比)，而在細胞內累積鳥胺酸(其係腐胺前體)。此外，棒狀桿菌屬微生物可藉由額外導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)活性而修飾。同樣，棒狀桿菌屬微生物可經進一步修飾以增強(與其內生性活性相比)乙醯基麩胺酸合成酶活性，而使麩胺酸轉化成乙醯基麩胺酸，增強鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)之活性，而使乙醯基鳥胺酸轉化成鳥胺酸，增強乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)之活性，而使乙醯基麩胺酸轉化成乙醯基麩胺醯基磷酸酯，增強乙醯基γ麩胺醯基磷酸酯還原酶(ArgC)之活性，而使乙醯基麩胺醯基磷酸酯轉化成乙醯基麩胺酸半醛，以及增強乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)之活性，而使乙醯基麩胺酸半醛轉化成乙醯基鳥胺酸，藉以增強鳥胺酸(其係腐胺前體)之生物合成途徑。

於此例中，ArgF、NCgl1221、ODC、ArgC、ArgJ、ArgB與ArgD可分別具有(但沒有特定限制)如序列編號：21、22、23、24、25、26、27之胺基酸序列，或可具有與其為80%或以上，較佳係90%或以上，更佳係95%或以上，最佳係97%或以上同源性之胺基酸序列。

本文所採用術語「鳥胺酸脫羧基酶(ODC)」係指使用鳥胺酸製造腐胺之酵素，且ODC需要磷酸吡哆醛(吡哆醛5'-磷酸，PLP)作為輔酶，其存在於大多數革蘭陰性細菌中，且可能存在於某些腸部細菌中，如：革蘭陽性細菌之乳酸桿菌(Lactobacillus)。大腸桿菌有兩種編碼ODC之基因，其中一種為speC，係在某些濃度下連續表現，另一 種為speF，需在特定條件下(高於某濃度之鳥胺酸存在與低pH)經誘發表現。依物種而定，有些物種(如：大腸桿菌)具有兩種ODC，而其他物種則僅有一種。如：埃希氏桿菌屬(Escherichia sp. )、志賀桿菌屬(Shigella sp. )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp. )、沙門氏桿菌屬(Salmonella sp. )與腸桿菌屬(Enterobacter sp. )之物種具有兩種ODC(speC、speF)，而耶爾辛氏菌屬(Yersinia sp. )、克雷白氏菌屬(Klebsiella sp.) 、歐文氏菌屬(Erwinia sp.) 等菌種則具有一種ODC(speC)。以乳酸桿菌為例，ODC僅表現在一種基因(speF)中，且已知在低pH或大量鳥胺酸與組胺酸之條件下經發表現。

可利用衍生自各種物種之編碼ODC之基因，將ODC活性導入本發明棒狀桿菌屬重組微生物中。

編碼ODC之多核苷酸可包括(但不限於)：編碼由如序列編號：23之胺基酸序列或與其具有70%或以上，較佳係80%或更佳係90%或以上同源性之胺基酸序列所組成之蛋白質的多核苷酸。

此外，採用本發明所屬技術領域所熟知之各種方法進行將鳥胺酸脫羧基酶(ODC)活性導入微生物中，並且可使用例如：將由編碼ODC之核苷酸序列所組成之多核苷酸插入至染色體中之方法、藉由導入載體系統而將多核苷酸導入至微生物中之方法、將由編碼ODC之核苷酸序列所組成之多核苷酸與具有改良活性或經過修飾之啟動子插入至編碼ODC之核苷酸序列之上游區之方法、及插 入多核苷酸(該多核苷酸經導入編碼ODC之核苷酸序列之突變)之方法，與更佳係若導入編碼ODC之核苷酸序列，則可使用已知CJ7啟動子作為控制其表現之啟動子。

此外，增強ArgC、ArgJ、ArgB與ArgD之活性可藉由下述方法達到：1)增加編碼酵素之多核苷酸之套數(copy number)、2)修飾表現調節序列以提高多核苷酸表現、3)修飾染色體上多核苷酸序列以增強酵素活性、或4)其組合。

在方法1)中，增加編碼酵素之多核苷酸的套數可藉由操作性連接多核苷酸至載體，或插入該多核苷酸至宿主細胞之染色體中。更明確言之，增加宿主細胞多核苷酸套數可藉由導入能夠複製且獨立作用之載體，其中編碼本發明之酵素之多核苷酸係經操作性連接，或藉由導入能夠插入多核苷酸至宿主細胞染色體中之載體，其中該多核苷酸係經操作性連接。

本文所採用術語「載體」係指由編碼目標蛋白質之多核苷酸之核苷酸序列所組成之DNA構築體經操作性連接至適當調節序列，以在適當宿主中表現目標蛋白質。該調節序列包括可啟動轉錄之啟動子、任何控制轉錄之操縱子序列、編碼適當mRNA核糖體結合位置之序列、及控制轉錄與轉譯中止之序列。載體可轉染至合適宿主中，之後可被複製或與宿主基因組分別獨立作用，且可被併入至基因體本身中。

本發明中，在宿主中可被複製之任何載體 均可使用，而沒有特定限制，只要其係本發明所屬技術領域中已知者即可。常用載體實例為天然狀態或重組狀態之質體、黏質體、病毒與噬菌體。可使用例如：pWE15、M13、λ MBL3、λ MBL4、λ IXII、λ ASHII、λ APII、λ t10、λ t11、Charon4A與Charon21A作為噬菌體載體或黏質體載體使用，且可使用pBR系統、pUC系統、pBluescriptII系統、pGEM系統、pTZ系統、pCL系統與pET系統作為質體載體。本發明可使用之載體沒有特別限制，且可使用已知之表現載體。較佳地，可使用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體。最佳地，可使用pACYC177、pCL、pCC1BAC載體。

此外，可藉由被轉形而將編碼目標蛋白質之多核苷酸插入至宿主細胞中之載體較佳為例如：穿梭載體(pECCG112)(韓國專利公開案第1992-0000933號)，其本身可在大腸桿菌與棒狀桿菌群(Coryneform )細菌兩種中複製，但不受此限制。

此外，可藉由使用供染色體基因插入用之載體，由新的多核苷酸置換染色體中編碼目標蛋白質之多核苷酸。可採用本發明所屬技術領域中已知之任何方法達到將多核苷酸插入至染色體中，例如：藉由同源重組。由於本發明之載體可藉由誘發同源重組而插入至染色體中，因此可額外包括篩選標記物，以確認是否成功插入基因至染色體中。篩選標記係供篩選已經載體轉形之細胞，換言之，供決定是否插入目標多核苷酸。可使用可提供可選擇 之表現型的標記，如：抗藥性、營養缺陷型、對毒性劑之抗性或表面蛋白質之表現。在以篩選劑處理之環境中，僅有表現篩選標記之細胞可以存活，或將出現具有不同表現型之細胞，因此可透過此方法篩選成功轉形之細胞。

本文所採用術語「轉染」係指將包含編碼目標蛋白質之多核苷酸之載體導入宿主細胞中，因此即可表現多核苷酸所編碼之蛋白質。經轉染之多核苷酸包括所有可在宿主細胞中表現者，而不受位置影響，及不論其是否被插入至宿主細胞之染色體中或係位於染色體外面。此外，多核苷酸包括編碼目標蛋白質之DNA與RNA。多核苷酸可以任何形式被導入，只要其可被導入至宿主細胞中並表現即可。例如：多核苷酸可以表現卡匣(expression cassette)形式導入至宿主細胞中，該表現卡匣係包含自行表現時所需之所有元素之基因構築體。表現卡匣典型包括操作性連接至多核苷酸之啟動子、轉錄中止訊號、核糖體結合位置、與轉譯中止訊號。表現卡匣可為能夠自行複製之表現載體形式。此外，多核苷酸可以其本身形式被導入至宿主細胞中，並以操作性連接至宿主細胞表現時所需之序列。

本文所採用術語「操作性連接」係指啟動或媒介編碼目標蛋白質之多核苷酸轉錄的啟動子序列與多核苷酸之間之功能性連接。

此外，方法2)修飾表現調節序列以提高本發明多核苷酸表現可透過刪除、插入、保留性或非保留性取 代核苷酸序列或其組合以誘發序列突變來進行，或藉由以具有增強活性之核苷酸序列取代來進行。表現調節序列包括啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位置之序列、與控制轉錄與轉譯中止之序列。

強力之異源性啟動子可取代原始啟動子而連接至多核苷酸表現單位之上游，且強力啟動子實例為pcj7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等等，以及更佳地係操作性連接衍生自棒狀桿菌屬之lysCP1啟動子或pcj7啟動子，以增強編碼酵素之多核苷酸表現。本文中，lysCP1啟動子(其係透過編碼天冬胺酸激酶與天冬胺酸半醛脫氫酶之多核苷酸的啟動子區之核苷酸序列之取代而改良之啟動子)透過增強天冬胺酸激酶基因表現，而使其強度足使相應酵素之活性比野生型提高5倍(國際專利公開案第2009-096689號)。此外，在搜尋具有產胺棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes )之強力啟動子序列之範圍中，已辨識出pcj7啟動子表現在產胺棒狀桿菌與埃希氏桿菌屬(Escherichia )中，並具有強力啟動子活性，且亦可在麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum )中高強度表現(韓國專利案第0620092號)。

此外，方法3)修飾編碼本發明酵素之染色體上之多核苷酸序列可透過刪除、插入、保留性或非保留性取代核苷酸序列或其組合，以誘發序列突變，而增強序列活性來進行，或由具有增強活性之核苷酸序列取代來進行。

本發明微生物(其係具有增強製造腐胺能力 之微生物)包括原核生物微生物，其中表現具有如序列編號：18或序列編號：20所示之胺基酸序列之蛋白質，且可為例如：埃希氏桿菌屬(Escherichia sp. )、志賀桿菌屬(Shigella sp. )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp. )、沙門氏桿菌屬(Salmonella sp.) 、腸桿菌屬(Enterobacter sp) 、耶爾辛氏菌屬(Yersinia sp.) 、克雷白氏菌屬(Klebsiella sp.) 、歐文氏菌屬(Erwinia sp.) 、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp) 、短桿菌屬(Brevibacterium sp.) 、乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp.) 、新月形單胞菌屬(Selenomanas sp.) 與弧菌屬(Vibrio sp.) 的微生物。

本發明微生物較佳係棒狀桿菌屬微生物，且更佳可為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum )。

本發明一項實例中，突變寄存編號為KCCM11138P之棒狀桿菌屬微生物，其透過增強之腐胺產生途徑而具有製造高濃度腐胺之能力(韓國專利公開案第2012-0064046號)。具體而言，腐胺製造菌株KCCM11138P為過度製造腐胺之菌株，其中刪除ATCC13032菌株中編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶之基因(用以累積鳥胺酸)與編碼麩胺酸輸出子(NCgl1221)之基因(用以增加細胞內轉移酶激酶(ArgF))，導入編碼鳥胺酸脫羧基酶(SpeC)之基因，以及提高鳥胺酸生物合成基因(argCJBD)之表現量。

本發明另一實例中，基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之腐胺製造菌株DAB12-a係基於與KCCM11138P相同之基因型進行突變。具體而言，腐胺製造菌株DAB12-a 包含ATCC13869菌株(來自美國菌種中心(American Type Culture Collection(ATCC))，其中刪除編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)之基因與編碼蛋白質NCgl1221以釋出麩胺酸之基因，導入衍生自大腸桿菌之編碼鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之基因(speC)，及以經改良之啟動子置換操縱組之啟動子(argCJBD)(其係鳥胺酸生物合成基因)。

於本發明實例中，具有增強之製造腐胺能力之麩胺酸棒狀桿菌菌株係藉由下述方法製備：減弱或移除麩胺酸棒狀桿菌微生物KCCM1138P中如序列編號：18所示之NCgl1469蛋白質活性(韓國專利公開案第2012-0064046號)，藉由刪除argF與NCgl1221，導入speC與增強argCJBD，而有製造高濃度腐胺之能力(參見第1圖)。

刪除NCgl1469蛋白質活性之菌株稱為麩胺酸棒狀桿菌CC01-0163，於2011年12月26日寄存於韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(下文中稱為“KCCM”)，管理編號為KCCM11240P。該菌株之培養結果顯示沒有製造N-乙醯基腐胺，經改良之腐胺生產力具有類似未產生N-乙醯基腐胺程度的改良程度，因此NCgl1469具有乙醯化腐胺之活性。

此外，具有增強製造腐胺能力之麩胺酸棒狀桿菌菌株DAB12-a△NCgl1469係藉由下述方法製備：消除腐胺製造菌株DAB12-a中如序列編號：20所示之NCgl1469蛋白質活性，且該菌株之培養結果顯示沒有產生N-乙醯基腐胺，且腐胺之生產力提高。

同時，本發明係有關一種製造腐胺之方法，其包括培養具有增強之製造腐胺能力之棒狀桿菌屬微生物，其中減弱由如序列編號：18或序列編號：20之胺基酸序列所組成之NCgl1469蛋白質活性；及自所得培養物中分離腐胺。

本發明之培養法可由適當培養基與本發明所屬技術領域中已知之培養條件所組成。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可容易依據所選擇菌株調整及使用培養法。培養法實例包括批式、連續與饋料批式培養法，但不受此限制。所使用之培養基必需適當符合特定菌株之需求。

所使用之培養基必需適當符合特定菌株之需求。已知針對各種微生物之培養基(例如：美國細菌學會(American Society for Bacteriology)之"一般細菌學方法手冊(Manual of Methods for General Bacteriology)"(Washington D.C.,USA,1981))。作為培養基中之碳源，可使用糖與碳水化合物(例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉與纖維素)、乳脂與脂肪(例如：大豆油、葵花籽油、花生油與椰子油)、脂肪酸(例如：棕櫚酸、硬脂酸與亞麻油酸)、醇類(例如：甘油與乙醇)與有機酸類(例如：乙酸)等等。可個別使用此等物質或以混合物使用。作為氮源，可使用含氮有機化合物(例如：蛋白腖、酵母抽出物、牛肉抽出物、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉與尿素)或無機化合物(例如：硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨與硝酸銨)， 可個別使用此等物質或以混合物使用。作為磷源，可使用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應之含鈉鹽。此外，培養基可包含生長所必需之金屬鹽(例如：硫酸鎂或硫酸鐵)，且最後除了上述物質外，亦可使用必要之促進生長物質，如：胺基酸與維生素。除了培養基之外，亦可添加適當前體。進料物質可以一次全部加至培養物中或在培養期間適當提供。

培養物之pH可適當使用鹼性化合物(例如：氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如：磷酸或硫酸)調整。可使用發泡劑(如：脂肪酸聚乙二醇酯)調整發泡性。可在培養物中藉由導入氧氣或含氧氣體混合物(例如：空氣)來維持好氧條件。培養溫度典型為20至45℃，較佳係25至40℃。持續培養直到所需腐胺的產生達到最高量為止。此目標通常在10至160小時內達成。腐胺可以釋放到培養基中或含在細胞內。

對於收集及集合本發明培養法中所製得之腐胺的方法，可採用本發明所屬技術領域中已知適當方法，依培養法而定，例如：批式、連續或饋料批式培養法，從培養基中收集目標物質。

[本發明模式]

下文中，參考實施例更詳細說明本發明。然而，此等實施例僅供說明，未以任何方式限制所主張發明。

實施例1. 移除NCgl1469活性之菌株

實施例1-1. 基於腐胺製造菌株ATCC13032 製備NCgl1469經刪除之菌株

為了阻斷細胞中由腐胺至N-乙醯基腐胺之合成途徑，以本發明者之專利申請案(專利公開案第2012-0064046號)所揭示之具有製造腐胺能力之棒狀桿菌屬微生物(KCCM11138P(ATCC13032△argF△NCgl1221P(CJ7)-argCJBDbioAD：：P(CJ7)-speC(Ec))為基礎，製備其中刪除編碼NCgl1469之基因的突變菌株，其係藉由下述方法而製備：在野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13032中，刪除編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)之內生性基因與編碼麩胺酸輸出子(NCgl1221)之內生性基因(其與釋出麩胺酸有關)，導入衍生自野生型大腸桿菌W3110之編碼鳥胺酸脫羧基酶(SpeC)之基因至染色體中，及取代編碼與從麩胺酸合成鳥胺酸有關酵素之argCJBD基因群之啟動子。

具體而言，基於ATCC13032菌株之基因NCgl1469之核苷酸序列(序列編號：17)，製備NCgl1469-del-F1_BamHI與NCgl1469-del-R1_SalI作為引子，以獲得NCgl1469之N端結構域之同源性重組片段，並製備NCgl1469-del-F2_SalI與NCgl1469-del-R2_XbaI作為引子，以獲得NCgl1469之C端結構域之同源性重組片段(表1)。

為了獲得NCgl1469基因之N端片段與C端片段，使用一組引子(NCgl1469-del-F1_BamHI & NCgl1469-del-R1_SalI，及NCgl1469-del-F2_SalI & NCgl1469-del-R2_XbaI)與ATCC13032菌株之染色體作為模板，進行PCR。PCR反應係進行30個循環：於95℃變性30秒，於53℃退火30秒，及於72℃延長30秒。

PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳後，單離出目標大小之DNA條帶並純化。然後，N端結構域之PCR產物與C端結構域之PCR產物分別經過BamHI&SalI與SalI&XbaI處理，然後選殖至經過BamHI&XbaI處理之pDZ載體中。欲用於刪除NCgl1469的所得質體稱為pDZ-NCgl1469(K/O)。

為了產生KCCM11138P△NCgl1469菌株， 將上述製備之pDZ-NCgl1469(K/O)載體，透過電穿孔法導入至KCCM11138P菌株中，並塗佈在含卡那黴素(kanamycin)(25μ g/ml )之BHIS培養基板上(每1升有腦心浸液(Brain heart infusion)37g/L、山梨糖醇91g/L與2%洋菜)。

在含5-溴-4-氯-3-吲哚基-ß-D-半乳糖苷(X-gal)之固體培養基中觀察藍色，來確認是否成功插入載體至染色體中。震盪培養具有單一交叉之菌株於營養培養基中(30℃，8小時)，且將其分別從10^-4 連續稀釋至10^-10 ，並塗佈在含X-gal之固體培養基中。當大多數群落呈藍色群落，少數群落呈白色群落，且藉由篩選白色群落，最後篩選具有雙重交叉之NCgl1469基因經刪除之菌株。採用PCR，利用引子NCgl1469-del-F1_BamHI與NCgl1469-del-R2_XbaI，確認成功剔除菌株中之基因。由PCR確認之菌株稱為KCCM11138P△NCgl1469。

實施例1-2. 基於腐胺製造菌株ATCC13869製備NCgl1469經刪除之菌株

於本實施例採用基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032用於製造腐胺製造菌株KCCM11138P之相同方法，以麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869為基礎，製備另一種腐胺製造菌株，其係藉由刪除編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)之內生性基因與編碼麩胺酸輸出子(NCgl1221)之內生性基因(其與麩胺酸之釋出有關)，藉由導入衍生自野生型大腸桿菌W3110之編碼鳥胺酸脫羧基酶(SpeC)之基因至染色體中，並取代編碼與麩胺酸合成鳥胺酸有關之酵素之 argCJBD基因群之啟動子。所製備之腐胺製造菌株稱為DAB12-a(刪除argF，刪除NCgl1221，導入大腸桿菌speC及取代arg操縱組啟動子之菌株)，並依據此菌株製備NCgl1469經刪除之菌株。

具體而言，為了鑑定編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之NCgl1469之基因及由其表現之蛋白質之胺基酸序列，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之基因組DNA作為模板及一組引子序列編號：5與6(NCgl1469-F與NCgl1469-R)進行PCR(表2)。此時，PCR反應係進行30個循環：於95℃變性30秒，於53℃退火30秒，及於72°延長30秒。採用電泳法分離PCR產物，並分析其序列。透過序列分析，鑑定出編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之NCgl1469之基因包含如序列編號：19所示之核苷酸序列，且所編碼之蛋白質包含如序列編號：20所示之胺基酸序列。當比對衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之NCgl1469之胺基酸序列與衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之NCgl1469之胺基酸序列時，其顯示99%序列同源性。

為了刪除編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13869之NCgl1469之基因，製備稱為pDZ-2'NCgl1469(K/O)之質體。首先，如實施例<1-1>所述，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之基因組DNA作為模板及兩對表3所示之引子，以PCR擴增NCgl1469基因之N端結構域與C端結構域。然後，分別使用BamHI&SalI與SalI&XbaI限制分解N端與C端結構域之PCR產物，然後選殖至經BamHI&XbaI分解之pDZ載體，藉以產生質體pDZ-2'NCgl1469(K/O)。

採用實施例<1-1>之相同方式，將質體pDZ-2'NCgl1469(K/O)轉染至麩胺酸棒狀桿菌DAB12-a，也且篩選其中刪除編碼NCgl1469之基因之菌株。所篩選之麩胺酸棒狀桿菌突變菌株稱為DAB12-a△NCgl1469。

實施例2. 具減弱之NCgl1469活性之菌株

為了減弱能夠製造腐胺之棒狀桿菌屬微生 物KCCM11138P(韓國專利公開案第2012-0064046案)中由腐胺成為N-乙醯基腐胺之合成途徑，製備具有取代NCgl1469之起始密碼子之菌株。

具體而言，基於衍生自ATCC13032菌株之NCgl1469之核苷酸序列，製備一組引子：NCgl1469-gtg-F1與NCgl1469-gtg-R1，以得到NCgl1469之N端結構域之同源性重組片段，並製備一組引子：NCgl1469-gtg-F2與NCgl1469-gtg-R2，以得到NCgl1469之C端結構域之同源性重組片段(表4)。組合N端片段與C端片段之位置係經過設計，使NCgl1469之起始密碼子ATG被GTG取代。

為了得到ATCC13032菌株之NCgl1469基因之N端片段與C端片段，使用兩組引子(NCgl1469-gtg-F1 & NCgl1469-gtg-R1及NCgl1469-gtg-F2 & NCgl1469-gtg-R2)，及使用ATCC13032菌株之染色體作為模板進行PCR。PCR反應使用pfu聚合酶(Stratagene)進行30個循環：於95℃變性40秒，於52℃退火40秒，及於72℃延長30秒。

PCR產物於0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳後，單離目標大小之DNA條帶並純化。然後，將ATCC13032菌株之NCgl1469基因之N端結構域與C端結構域之PCR產物分別經過融合選殖至以BamHI&XbaI分解之pDZ載體。進行融合選殖時，採用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)。欲用於取代NCgl1469起始密碼子所製備之質體稱為pDZ-NCgl1469(gtg)。

為了得到KCCM11138P NCgl1469(gtg)菌株，將所製備之pDZ-NCgl1469(gtg)載體透過電穿孔法導入至KCCM11138P菌株中，取所轉形之細胞塗佈在含卡那黴素(kanamycin)(25μ g/ml )之BHIS培養基板上(腦心浸液37g/L，山梨糖醇91g/L，每升2%洋菜)上。在含5-溴-4-氯-3-吲哚基-ß-D-半乳糖苷(X-gal)之固體培養基中觀察藍色菌落，來確認是否成功插入載體至菌株之染色體中。震盪培養具單一交叉之菌株於營養培養基中(30℃，8小時)，且將其分別從10^-4 連續稀釋至10^-10 ，並塗佈在含X-gal之固體培養基上。當大多數群落呈藍色群落，少數群落呈白色群落，且藉由篩選白色群落，最後篩選到透過雙重交叉而具有取代NCgl1469起始密碼子之菌株。此外，使用一組引子：NCgl1469-del-F1_BamHI與NCgl1469-del-R2_XbaI，以PCR確 認所篩選菌株之序列。經確認之菌株稱為KCCM11138P NCgl1469(gtg)。

實施例3. 增強之NCgl1469活性之菌株

由於已知在具有增強之NCgl1469活性之製造鳥胺酸之麩胺酸棒狀桿菌菌株之突變菌株中，鳥胺酸生產力提高(Hwang等人，J Ind Microbiol Biotechnol,37：11,1131-1136,2010)，因此將編碼NCgl1469之多核苷酸以質體形式或以可插入至染色體之形式導入，供提高鳥胺酸生產力，並分析其效果。

實施例3-1. 選殖編碼NCgl1469之基因及由其製備轉形體

為了確認NCgl1469基因(包括啟動子區)套數增加對鳥胺酸與腐胺之高產量之效果，將呈質體形式之NCgl1469導入實施例1所述之KCCM11138P菌株而產生突變菌株。

具體而言，使用ATCC13032菌株之NCgl1469基因作為模板及使用引子(NCgl1469-300-F_KpnI與NCgl1469-R_XbaI)，在實施例1之相同條件下以PCR擴增編碼NCgl1469之多核苷酸。透過PCR，得到具有大小約900bp之基因片段(表5)。

所得基因片段經過KpnI與XbaI限制切割，並選殖至經相同限制酶處理之pHC139T-gfp載體中(韓國專利案第620092號)，藉以產生表現載體pHC139T-NCgl1469。

將所製備pHC139T-NCgl1469載體導入至具有製造腐胺能力之菌株KCCM11138P中，以提高該菌株之鳥胺酸與腐胺生產力。透過電穿孔法，將載體導入至菌株中，將所轉形之細胞塗佈在含25μ g/ml 卡那黴素之BHIS培養基板上，且篩選成功的轉形體。所篩選之菌株稱為KCCM11138P/pHC139T-NCgl1469。

實施例3-2：具有染色體中插入編碼NCgl1469之基因的突變菌株

為了確認額外在染色體中插入NCgl1469基因(包括啟動子區)對鳥胺酸與腐胺高產量之效果，將NCgl1469導入至實施例1所述之KCCM11138P之染色體中而產生突變菌株。

本發明者發展一種供轉形用之載體pDZTn(韓國公開案第2008-0033054號)，其使用棒狀桿菌屬微生物之轉位子基因位置，而使得進行基因之染色體插入，並可依使用載體pDZ導入基因之相同方式使用之。

採用ATCC13032菌株之NCgl1469基因作為模板及使用一組引子：NCgl1469-300-F_Spel與NCgl1469-R_Xhol引子，以PCR得到具有大小約900bp之NCgl1469之基因片段(表6)。

PCR反應係使用pfu聚合酶(Stratagene)進行30個循環：於95℃變性40秒，於52℃退火40秒，及於72℃延長60秒。PCR產物於0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳後，單離目標大小之DNA條帶並純化。將純化之NCgl1469基因片段經過融合選殖至經過Spel&Xhol限制分解之pDZTn載體中。進行融合選殖時，採用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)。所製備之質體稱為pDZTn-NCgl1469。

為了獲得KCCM11138P Tn：：NCgl1469菌株，將所製備之pDZ-NCgl1469載體透過電穿孔法導入至KCCM11138P菌株中，並將經轉形之細胞塗佈在含卡那黴素(kanamycin)(25μ g/ml )之BHIS培養基板上。依實施例1所述之方法確認成功插入載體至染色體中，並透過此方法篩選在轉位子基因位置中插入NCgl1469基因之菌株。此外，使用一組引子：NCgl1469-300-F_SpeI_Tn與NCgl1469-R_XhoI-Tn，以PCR確認突變菌株之序列。所確 認之菌株稱為KCCM11138P Tn：：NCgl1469。

實施例4. 比較製造腐胺之能力

為了探討刪除NCgl1469基因、取代起始密碼子、增強表現量、及染色體插入基因所引起之效果，評估上述所製備之菌株製造腐胺之能力。

具體而言，將所製備之菌株於含1mM精胺酸之CM培養基板(每1升有葡萄糖1%、聚蛋白腖1%、酵母抽出物0.5%、牛肉抽出物0.5%、NaCl 0.25%、尿素0.2%、50% NaOH 100μl 、2%洋菜，pH 6.8)中，於30℃培養16小時。然後，接種一圈環之細胞培養物至25ml 之表7之滴定培養基中，並在200rpm與30℃震盪培養96小時。所有製備之菌株均在發酵期間添加1mM精胺酸至培養基中培養。

結果，如表8所示，當刪除腐胺製造菌株KCCM11138P中之NCgl1469基因使其功能失活時，即不會產生N-乙醯基腐胺。此外，腐胺產量為2.6g/L，高於對照組，證實藉由刪除NCgl1469基因而提高菌株之腐胺生產力。

此外，當取代NCgl1469基因之起始密碼子而減弱其功能時，有能力製造腐胺之KCCM11138P菌株微生物中正常製造之N-乙醯基腐胺產量下降多至約3g/L。證實N-乙醯基腐胺之生產力降低一半。

類似於KCCM11138P，當衍生自ATCC13869之腐胺-製造菌株DAB12-a中刪除NCgl1469基因而使其功能失活時，不會產生N-乙醯基腐胺，但會改良腐胺生產力。

此等結果顯示，由腐胺形成N-乙醯基腐胺之途徑已藉由減弱或刪除NCgl1469基因而減弱或阻斷，且由NCgl1469基因表現之蛋白質作用為乙醯化腐胺。

同時，當提高NCgl1469之活性時，細胞培養物中N-乙醯基腐胺之比例高於對照組，且質體之基因表現與額外在染色體插入基因在提高NCgl1469活性上沒有差異。

當在一般鳥胺酸製造菌株中增強NCgl1469基因活性時，會增強麩胺酸形成乙醯基麩胺酸之轉化途徑，並增加製造鳥胺酸(韓國專利公開案第2011-0080475號)。然而，本發明中，大多數鳥胺酸轉化成腐胺，因此不會累積鳥胺酸。

其結果與傳統方法之差異可能歸因於 NCgl1469基因所表現之蛋白質辨識腐胺比辨識麩胺酸更容易，因此更增強對N-乙醯基腐胺之製造，高於對乙醯基麩胺酸之製造。

本發明者已如實施例1-1所述藉由下述方法製備具有增加之腐胺生產力且未製造N-乙醯基腐胺的麩胺酸棒狀桿菌菌株：藉由在有能力製造腐胺之經轉形之棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.) 微生物KCCM11138P(韓國專利公告案案號2012-0064046)中刪除NCgl1469基因，此菌株稱為麩胺酸棒狀桿菌CC01-0163，且依據布達佩斯條約，於 2011年12月26日寄存在國際寄存機構：韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(下文稱為“KCCM”)，寄存編號KCCM11240P。

依據上述說明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者將了解，本發明可在不改變技術理念或基本技術特色下，以其他方式進行。因此，上述實施例係以所有態樣說明本發明，但未限制本發明範圍。應咸了解，本發明範圍包含衍生自下列申請專利範圍(而非上述詳細說明)之定義、範圍與同等觀念之任何變化或修飾形式。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

財團法人食品工業發展研究所、中華民國102年9月18日、BCRC 910595

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

韓國、韓國微生物保存中心、2011年12月26日、KCCM11240P

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 具有增加之腐胺生產力之重組微生物及使用該微生物之製造腐胺之方法

<130> OPA12194/TW

<160> 27

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

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<223> 引子

<400> 6

<210> 7

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<212> DNA

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<220>

<223> 引子

<400> 7

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<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 引子

<400> 8

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 引子

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<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 引子

<400> 12

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<212> DNA

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<223> 引子

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<210> 14

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<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 引子

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 15

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子

<400> 16

<210> 17

<211> 612

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 17

<210> 18

<211> 203

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 18

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<211> 612

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 19

<210> 20

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<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 20

<210> 21

<211> 319

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 21

<210> 22

<211> 533

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 22

<210> 23

<211> 711

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 23

<210> 24

<211> 357

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 24

<210> 25

<211> 388

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 25

<210> 26

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<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 26

<210> 27

<211> 391

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 27

Claims (11)

1. 一種具有增強之製造腐胺能力之經修飾的棒狀桿菌(Corynebacterium )屬微生物，其中，於能製造腐胺之棒狀桿菌屬微生物中之具有如序列編號：18或序列編號：20所代表胺基酸序列之蛋白質的活性與其內生性活性相比為減弱或經移除。
2. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，進一步導入鳥胺酸脫羧基酶(ODC)之活性。
3. 如申請專利範圍第2項所述之微生物，其中，該ODC具有序列編號：23之胺基酸序列。
4. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，選自由鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)與麩胺酸輸出子(NCg11221)所組成群組中之一或多種的活性與其內生性活性相比為進一步減弱。
5. 如申請專利範圍第4項所述之微生物，其中，該ArgF具有如序列編號：21之胺基酸序列，且該NCg11221具有如序列編號：22之胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，選自由乙醯基γ磷酸麩胺醯酯還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、與乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所組成群組中之一或多種的活性係經進一步增強。
7. 如申請專利範圍第6項所述之微生物，其中，該ArgC、ArgJ、ArgB與ArgD分別具有序列編號：24、25、26與27 之胺基酸序列。
8. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，係藉由下列方式減弱蛋白質活性：1)部份或完全刪除編碼該蛋白質之多核苷酸、2)降低多核苷酸表現、3)修飾染色體上之多核苷酸序列、以減弱該蛋白質活性、或4)其組合。
9. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其係麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum )。
10. 一種製造腐胺之方法，其包括培養具有增強之製造腐胺能力之經修飾的棒狀桿菌屬微生物，其中，具有如序列編號：18或序列編號：20所代表之胺基酸序列之蛋白質活性與其內生性活性相比為減弱或經移除；以及自所得之細胞培養物中單離腐胺。
11. 如申請專利範圍第10項所述之製造腐胺之方法，其中，該棒狀桿菌屬微生物係麩胺酸棒狀桿菌。