TW201712117A - 用於製造腐胺或鳥胺酸之微生物及使用該微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於用於製造腐胺或鳥胺酸之重組微生物，及使用該重組微生物製造腐胺或鳥胺酸的方法。具體地，本發明關於能夠製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中糖代謝的轉錄調節子(SugR)之活性減弱，檸檬酸合成酶(GltA)的活性增強，或兩者均適用；及使用該重組微生物製造腐胺或鳥胺酸的方法。

Description

用於製造腐胺或鳥胺酸之微生物及使用該微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法
本發明關於用於製造腐胺或鳥胺酸之重組微生物，及使用該重組微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法。
在革蘭氏陰性細菌或真菌中發現腐胺且在不同種類中以高濃度存在。因此預期腐胺在微生物的代謝中扮演重要角色。一般而言，腐胺是合成聚胺尼龍-4,6的非常重要基礎材料且主要經由化學合成方法製造。該化學合成方法由3步驟的製程所組成，該製程包含催化氧化反應、使用氰化物的步驟及使用高壓氫氣的氫化反應。在這方面，需要發展一種使用能降低能量消耗的生質之更環保的方法進行腐胺的製造。
在這些情況下，揭露經由大腸桿菌(E.coli)及棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物的轉形而高產量製造腐胺以作為使用微生物製造腐胺的方法(國際專利公開案號WO 2006/005603；國際專利公開案號WO 2009/125924； Qian ZD et al.,Biotechnol.Bioeng.104(4)：651-662,2009；Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.88(4)：859-868,2010；Schneider et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.95：169-178,2012)。
鳥胺酸是廣泛存在於植物、動物及微生物的物質且被使用作為精胺酸、脯胺酸及聚胺的生合成先驅物。鳥胺酸在高等動物活體內代謝中經由鳥胺酸循環從胺基酸或氨產生的尿素排泄之途徑中扮演重要的角色。工業上亦使用鳥胺酸作為營養補充劑或藥品而用於改善肝硬化和肝功能障礙。製造鳥胺酸的已知方法包含用消化酶處理牛奶酪蛋白及使用轉形的大腸桿菌或棒狀桿菌屬微生物(Korean Patent No.10-1372635；T.Gotoh et al.,Bioprocess Biosyst.Eng.,33：773-777,2010)。
SugR，為糖代謝的轉錄調節子(以下稱為SugR)，已知為棒狀桿菌轉錄調節子，且先前報導SugR抑制編碼PTS系統的PEP-蛋白磷酸轉移酶的基因及糖酵解相關的基因(VF Wendisch,et al.,J.Bacteriol.190：24,8033-8044,2008)。檸檬酸合成酶為最先作用在TCA循環的酵素及可調節其速率。有報導一株經修飾而降低GltA活性的棒狀桿菌菌株增加天門冬胺酸和離胺酸的製造(Shiio et al.,Agric Biol Chem.46；101-107,1982)。
本發明者等人已確認操作sugR，編碼SugR 的基因，及gltA，編碼檸檬酸合成酶的基因，而改善腐胺或鳥胺酸生產力，因此完成本發明。
本發明的目的為提供可高產量製造腐胺或鳥胺酸的重組微生物。
本發明的另一個目的為提供使用上述微生物而製造腐胺或鳥胺酸的方法。
本發明者等人已確認在製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物中同時增強檸檬酸合成酶(以下稱為GltA)活性而減弱SugR活性則增加腐胺或鳥胺酸的產量。據此，可將本發明之微生物廣泛地使用於工業製造腐胺或鳥胺酸，可在經濟及環保方面廣泛地使用該微生物作為有效及理想的方式而提供使用腐胺或鳥胺酸作為原料之各種聚合物產品製造的基礎材料。
本公開的一方面為提供製造腐胺或鳥胺酸之棒狀桿菌屬的經修飾微生物，其中相較於其內源活性，糖代謝轉錄調節子(SugR)的活性減弱，ii)相較於其內源活性，檸檬酸合成酶(GltA)的活性增強，或iii)相較於其內源活性之SugR活性減弱及相較於其內源活性之GltA活性增強。
本公開例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸之棒狀桿菌屬的經修飾微生物，其中相較於其內源活性之SugR活性減弱及相較於其內源活性之GltA活性增強。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中SugR由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中GltA由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中棒狀桿菌屬微生物係選自麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、熱產胺棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)及乳酸醱酵短桿菌(Brevibacterium lacrofermenrum)所成群組。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中進一步引入鳥胺酸脫羧酶(ODC)活性。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中ODC由SEQ ID NO：17的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，i) 鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)、ii)麩胺酸輸出蛋白或iii)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶及麩胺酸輸出蛋白的活性進一步減弱。
本公開另一個例示的具體例進一步提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中鳥胺酸甲胺醯基轉移酶由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的胺基酸序列所組成，及麩胺酸輸出蛋白由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，由乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(ArgC)、乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯麩胺酸激酶(ArgE)及乙醯鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成群組選出之至少一者的活性進一步增強。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的胺基酸序列所組成，乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的胺基酸序列所組成，乙醯麩胺酸激酶由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29的胺基酸序列所組成，及乙醯鳥胺酸胺基轉移酶由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例進一步提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活 性，乙醯基轉移酶的活性進一步減弱。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中乙醯基轉移酶由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的胺基酸序列所組成。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，由SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41所組成之蛋白質的活性進一步增強。
本公開的另一方面提供製造腐胺或鳥胺酸的方法，包含：(i)在培養基中培養製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物；及(ii)從步驟(i)中培養的微生物或培養基中回收腐胺或鳥胺酸。
本公開另一個例示的具體例提供製造腐胺或鳥胺酸的方法，其中棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
以下，詳細說明本公開。
本公開的一方面關於製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，糖代謝的轉錄調節子(SugR)之活性減弱，ii)相較於其內源活性，檸檬酸合成酶(GltA)的活性增強，或iii)相較於其內源活性之SugR的活性減弱及相較於其內源活性之GltA的活性加強。具體地，本公開關於製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，糖代謝的轉錄調節子之 活性減弱，及相較於其內源活性，檸檬酸合成酶的活性增強。
如本文所使用，術語“糖代謝的轉錄調節子(SugR)”意指廣泛作用為有關與糖代謝，諸如糖攝取及磷酸轉移酶系統、糖酵解、關於乳酸脫氫酶的發酵等各方面相關之基因的抑制劑之酵素。本公開中，SugR包含棒狀桿菌屬微生物內的內源蛋白質及外源蛋白質，及具體地，SugR衍生自棒狀桿菌屬微生物。
本公開中，糖代謝的轉錄調節子可包含，而不限於，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的胺基酸序列的任何蛋白質，或包含具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與糖代謝的轉錄調節子相同的活性。
此外，因為編碼上述活性的蛋白之胺基酸序列可能取決於微生物菌種或菌株而不同，所以本公開中SugR可不限於其起源，但是SugR可為，例如，衍生自棒狀桿菌屬微生物，及具體地，衍生自麩胺酸棒狀桿菌。顯然與上述序列具有同源性且具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的蛋白實質上相同或相對應的生物活性之任何胺基酸序列亦可屬於本公開的範圍，盡管胺基酸序列可能在部分序列中具有缺失、修飾、取代或加成。
本公開之編碼糖代謝轉錄調節子的多核苷酸，只要具有與糖代謝轉錄調節子相似的活性，可包含編碼具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的胺基酸序列之蛋白質的任何多核苷酸，或編碼具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列之蛋白質的多核苷酸。關於編碼糖代謝轉錄調節子之多核苷酸，考量基於密碼簡併性的密碼子或為生物所優選而表達調節子者，可在不改變多核苷酸之胺基酸序列的範圍內在編碼區內執行各種修飾，及具體地，多核苷酸可包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多核苷酸序列，但不限於此。
如本文所使用，術語“檸檬酸合成酶(GltA)”意指涉及各種細胞內生合成中間物之製造及降低的嘌呤核酸之製造的酶。習知GltA作用於介導製造檸檬酸之乙醯CoA及草醯乙酸間之水解縮合。本公開中，GltA包含存在於棒狀桿菌屬微生物中的內源酶及外源蛋白質，及具體地，GltA衍生自棒狀桿菌屬微生物。
本公開中，GltA可包含，而不限於，具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列的蛋白質，或包含具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列的任何蛋白質，且具有介導製造檸檬 酸之乙醯CoA及草醯乙酸間之水解縮合的實質活性。
此外，因為抑制活性的蛋白質之胺基酸序列可能取決於微生物菌種或菌株而不同，所以GltA可衍生自，例如，棒狀桿菌，及具體地，麩胺酸棒狀桿菌，但是本公開中GltA的起源不限於此。顯然與上述序列具有同源性且具有與SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列的蛋白質實質上相同或相對應的生物活性之任何胺基酸序列亦可屬於本公開的範圍，盡管胺基酸序列可能在部分序列中具有缺失、修飾、取代或加成。
本公開編碼GltA的多核苷酸可包含編碼SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列的多核苷酸，或編碼與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高同源性之蛋白質的多核苷酸。關於編碼GltA之多核苷酸，考量基於密碼簡併性的密碼子或為生物所優選而表達GltA者，可在不改變多核苷酸之胺基酸序列的範圍內在編碼區內執行各種修飾，及具體地，多核苷酸可包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多核苷酸序列，但不限於此。
如本文所使用，術語“同源性”意指與指定的胺基酸序列或多核苷酸序列比較的同一性程度及可用百分率表示。本公開中，用術語“%同源性”指示與指定的胺基酸序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序 列。例如，可使用標準軟體計算參數而確定同源性(如，參數諸如得分、同一性及相似性)，具體地BLAST 2.0，或在定義之嚴格雜合條件下經由南方墨點法而比較序列，且可經由在所屬領域範圍內為一般所屬領域熟練的技術人員熟知的方法而決定所定義的適當雜合條件(如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
此外，本公開編碼SugR及檸檬酸合成酶的多核苷酸可在嚴格條件下分別與SEQ ID NO：2或4，或SEQ ID NO：6或8的多核苷酸序列，或衍生自該等多核苷酸序列的探針雜合，及可以是編碼涉及正常功能之SugR及檸檬酸合成酶的修飾類型。如本文所使用，術語“嚴格條件”意指使能夠在多核苷酸間特定雜合的條件。例如，文獻(如，J.Sambrook et al.,ibid)中具體地說明該嚴格條件。
本公開中，試圖對製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物減弱SugR之活性，或增強GltA的活性，或同時施予減弱SugR之活性及增強GltA的活性，其結果，確認所有經修飾菌株的腐胺或鳥胺酸產量均經改善。
特別地，本公開的微生物可包含野生型及修飾型微生物，只要彼等能製造腐胺或鳥胺酸。例如，該微生物可屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、檸檬酸菌屬(Citrobacter)、沙門氏菌屬 (Salmonella)、腸內桿菌屬(Enterobacter)、耶氏桿菌屬(Yersinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、棒狀桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、反芻月形單胞菌屬(Selenomanas)、弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、溶血隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)及產鹼桿菌屬(Alcaligenes)。具體地，本公開的微生物可屬於棒狀桿菌屬，更具體地，可選自麩胺酸棒狀桿菌、產氨棒狀桿菌、熱產胺棒狀桿菌、黃色短桿菌及乳酸醱酵短桿菌所成群組，甚至更具體地，可以是麩胺酸棒狀桿菌，但不限於此。
具體地，如本文所使用，術語“製造腐胺或鳥胺酸”意指母株在自然狀態下具有腐胺或鳥胺酸或不具有腐胺或鳥胺酸生產力之具備腐胺或鳥胺酸生產力的微生物。
此外，相較於其各別的內源活性，製造腐胺或鳥胺酸的微生物可經修飾而減弱涉及精胺酸合成之鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)的活性，及/或麩胺酸輸出蛋白質(NCgl1221)的活性，其為涉及麩胺酸排出的蛋白質。
再者，相較於其內源活性，具有腐胺生產力的微生物可經修飾而減弱乙醯基轉移酶(NCgl1469)的活性，其為乙醯化腐胺的蛋白質，及/或引入ODC活性，其為轉化鳥胺酸成腐胺的蛋白質。
特別地，本公開中增強或減弱活性的修飾可經由稱為轉形的過程而發生。如本文所使用，術語“轉形” 意指將編碼特別蛋白的多核苷酸或包含強或弱活性的啟動子序列的載體等引入宿主細胞的過程，因而使能夠在宿主細胞表現多核苷酸編碼的蛋白質或誘發宿主細胞的染色體修飾。
此外，多核苷酸包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。只要能被引入宿主細胞且在其中表現，多核苷酸可以任何形式插入。例如，可以表現匣的形式將多核苷酸引入宿主細胞，表現匣為包含所有自我表現所需的必要元件之基因建構物。表現匣通常可包含可操作地連接多核苷酸的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合域及轉譯終止信號。表現匣可以是能夠自我複製的表現載體形式。此外，可照原樣將多核苷酸引入宿主細胞並可操作地連接該多核苷酸至宿主細胞中表現所需的序列，但不限於此。
此外，如本文所使用，術語“可操作地連接”意指啟動子序列與上述基因序列的功能性連接，而該啟動子序列起始並介導編碼本公開目標蛋白質之多核苷酸的轉錄。
如本文所使用，術語“載體”意指任何DNA建構物，其包含編碼目標蛋白質的多核苷酸序列，其係可操作地連接能夠在合適的宿主細胞中表現目標蛋白質的合適調控序列。調控序列包含能夠起始轉錄的啟動子、能夠調控轉錄的任何操縱子序列、編碼合適之mRNA核糖體結合域的序列及能夠調控終止轉錄及轉譯的序列。轉形到合適的宿主細胞後，載體可不管宿主基因組而複製或作用， 或可整合入宿主基因組本身。
本公開中使用的載體沒有特別限制只要載體可在宿主細胞中複製，且可使用所屬領域已知的任何載體。通常使用之載體的實例可包含天然或重組質體、黏質體、病毒及噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體；及可使用基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等作為質體載體。本公開中使用的載體可沒有特別限制，但是可使用任何已知的表現載體。具體地，可使用pDZ、pDZTn、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體等。
因此，編碼外源目標蛋白質的多核苷酸可藉由用以插入至細菌染色體的載體於染色體中以經修飾的多核苷酸置換。可使用所屬領域已知的任何方法進行多核苷酸插入染色體，例如，經由同源重組，但不限於此。因為本公開載體可經由同源重組而插入染色體中，可進一步包含確定插入染色體的篩選標記。使用篩選標記篩選經轉形的細胞，即，確認目標多核苷酸是否已插入，可使用能提供可選擇的表現型的標記諸如抗藥性、營養需求、細胞毒劑抗性及表面蛋白質的表現。用篩選劑處理的情況下，只有能夠表現篩選標記的細胞可存活或表現其他表現型性狀，因此可篩選經轉形的細胞。
如本文所使用，術語“活性增強”不但包含 由於新引入的活性或蛋白質本身活性的增加所造成比原來功能較高的效應，而且包含經由增加內源基因的活性、從內部或外部因子而擴增內源基因、調控因子的缺失而抑制基因表現、基因套數增加、從外面引入基因、修飾表現調控序列，及具體地，由於置換或修飾啟動子及基因內突變的酶活性增加，而增加其活性等。
具體地，本公開中，可經由下列者而進行活性的增強或增加：1)增加編碼酶之多核苷酸的套數，2)修飾表現調控序列用以增加多核苷酸之表現，3)修飾染色體上的多核苷酸序列用以加強酶的活性，及4)經由其組合而修飾，但方法不限於此。
可以其中多核苷酸係可操作地連接載體的形式，或將多核苷酸插入宿主細胞染色體而進行多核苷酸套數之增加(方法1)，然而方法非特別限制於此。具體地，可經由引入可不管宿主細胞而複製及作用的載體且編碼本公開蛋白質之多核苷酸係可操作地連接該載體而進行宿主細胞染色體內多核苷酸套數的增加；或可經由將可將多核苷酸插入宿主細胞染色體及多核苷酸係可操作地連接的載體引入宿主細胞而進行套數的增加。
然後，可經由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合而誘發多核苷酸序列的修 飾以進行用於增加多核苷酸表現之表現調控序列之修飾(方法2)以進一步增強表現調控序列的活性，或以具有較強活性的多核苷酸序列置換多核苷酸序列，然而方法非特別限制於此。表現調控序列包含啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點的序列及調節轉錄及轉譯之終止的序列。
取代原啟動子的強外源啟動子可連接多核苷酸表現單元的上游區域。強啟動子的實例可以是CJ7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等，及更具體地，可經由可操作地連接棒狀桿菌衍生之lysCP1啟動子(WO 2009/096689)或CJ7啟動子(Korean Patent No.0620092及WO 2006/065095)而改善表現速率，但強啟動子不限於此。
再者，可經由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合而誘發表現調控序列的修飾以進行染色體上之多核苷酸序列修飾(方法3)，而進一步增強多核苷酸序列的活性，或以具有較強活性的經改善多核苷酸序列置換多核苷酸序列，然而方法不特別限於此。
如本文所使用，可經由刪除編碼蛋白質的多核苷酸的部分或全部而減弱蛋白質活性、修飾表現調控序列而降低多核苷酸的表現、修飾染色體上的多核苷酸序列而減弱蛋白質活性及由其組合而選擇的方法，而達到“減弱活性”。
具體地，本公開中，可經由下列操作而達到減弱活性： 1)刪除編碼蛋白質的多核苷酸的部分或全部，2)修飾表現調控序列以降低多核苷酸的表現，3)修飾染色體上的多核苷酸序列以減弱蛋白質活性，及4)由其組合而選擇的方法，但方法不限於此。
具體地，可使用細菌內染色體插入用載體，以具有多核苷酸序列部分缺失的多核苷酸或標記基因置換編碼染色體內內源目標蛋白質的多核苷酸而進行刪除編碼蛋白質之多核苷酸的部分或全部的方法。如本文所使用，術語“部分”可取決於多核苷酸種類而變化，其可具體地指1至300，更具體地1至100，及甚至更具體地1至50。
此外，可經由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合以誘發表現調控序列的修飾而進行表現調控序列之修飾的方法，以進一步減弱表現調控序列的活性，或以具有較弱活性的多核苷酸序列置換多核苷酸序列。表現調控序列包含啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點的序列及調控轉錄及轉譯之終止的序列。
此外，可經由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合以誘發多核苷酸序列的修飾而進行修飾染色體上之多核苷酸序列的方法，以進一步減弱蛋白質活性，或以具有較強活性的經改善多核苷酸序列置換多核苷酸序列。
此外，可以具有多核苷酸序列部分缺失的多核苷酸或標記基因，置換抑制表現之因子的多核苷酸而進行刪除抑制蛋白質之多核苷酸表現之調節因子的方法。如本文所使用，術語“部分”可取決於多核苷酸種類而變化，其可具體地指1至300，更具體地1至100，及甚至更具體地1至50。
如本文所使用，術語“內源活性”意指在非修飾狀態下之酶的活性狀態，如，在微生物原本擁有的天然狀態，及術語“相較其內源活性的增強”意指經操作後微生物所擁有的蛋白質活性的增加狀態，諸如引入抑制相應基因之活性或套數之增加的基因、刪除基因表現之抑制調控因子或表現調控序列的修飾，如，使用相較於操作前微生物擁有的活性之改善的啟動子。
本公開的棒狀桿菌屬微生物可以是具有腐胺生產力的棒狀桿菌屬微生物，其中進一步引入鳥胺酸脫羧酶(ODC)活性。
如本文所使用，術語“鳥胺酸脫羧酶(ODC)”意指經由介導鳥胺酸的脫羧化而具有腐胺生產力的酶。雖然棒狀桿菌屬微生物不具有腐胺生合成途徑，但是從外面引入ODC時，則合成腐胺且釋放到細胞外。本公開中，ODC可由SEQ ID NO：17的胺基酸序列所組成，或可包含，而不限於，具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較 高之同源性的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與ODC相同的活性。
此外，因為呈現活性的蛋白質之胺基酸序列可能取決於微生物菌種或菌株而不同，所以本公開中不限制ODC的起源，及具體地，可以是衍生自大腸桿菌的ODC。顯然與上述序列具有同源性且具有與SEQ ID NO：17的蛋白質實質上相同或相對應的生物活性之任何胺基酸序列亦可屬於本公開的範圍，盡管該胺基酸序列可能在部分序列中具有缺失、修飾、取代或加成。
編碼本公開ODC的多核苷酸可包含編碼SEQ ID NO：17的胺基酸的多核苷酸，或編碼具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之同源性的蛋白質之多核苷酸。關於編碼ODC的多核苷酸，考量基於密碼簡併性的密碼子或為生物所優選而表達蛋白質者，可在不改變多核苷酸之胺基酸序列的範圍內在編碼區內執行各種修飾。
棒狀桿菌屬微生物可以是製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，i)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)活性、ii)麩胺酸輸出蛋白(NCgl1221)活性或iii)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶活性及麩胺酸輸出蛋白活性進一步減弱。
本公開中，鳥胺酸甲胺醯基轉移酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的胺基酸序列 所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與鳥胺酸甲胺醯基轉移酶相同的活性。
此外，本公開中麩胺酸輸出蛋白質可包含，而不限於，由胺基酸序列SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或包含具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與麩胺酸鹽輸出蛋白相同的活性。
此外，本公開的棒狀桿菌屬微生物可以是製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，選自乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(ArgC)、乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基轉移酶(ArgB)及乙醯鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成群組之至少一者的活性進一步增強。
本公開中，乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶可包含，而不限於，由胺基酸序列SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體 地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白具有實質上與乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶相同的活性。
此外，乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶相同的活性。
本公開中，乙醯麩胺酸激酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與乙醯麩胺酸激酶相同的活性。
此外，本公開中，乙醯鳥胺酸胺基轉移酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較 高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與乙醯鳥胺酸胺基轉移酶相同的活性。
再者，本公開的棒狀桿菌屬微生物可以是具有腐胺生產力的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，乙醯基轉移酶(NCgl1469)的活性進一步減弱。
本公開中，乙醯基轉移酶可包含可將乙醯基轉化成腐胺的任何蛋白質。乙醯基轉移酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與乙醯基轉移酶相同的活性。
最後，本公開的棒狀桿菌屬微生物可以是具有腐胺生產力的棒狀桿菌屬微生物，其中相較於其內源活性，NCgl2522的活性進一步加強。
本公開中，NCgl2522為扮演釋放腐胺之角色的蛋白質，可包含可轉化乙醯基成腐胺的任何蛋白質。乙醯基轉移酶可包含，而不限於，由SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的胺基酸序列所組成的任何蛋白質，或由具有與上述胺基酸序列有70%或較高、具體地80%或較高、更具體 地90%或較高、甚至更具體地95%或較高、再甚至更具體地98%或較高、及最具體地99%或較高之序列同源性之胺基酸序列所組成的任何蛋白質，只要該蛋白質具有實質上與NCgl2522相同的活性。
另一方面，本公開提供製造腐胺或鳥胺酸的方法，包含：(i)在培養基中培養製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物；及(ii)從步驟(i)之培養的微生物或培養基中回收腐胺或鳥胺酸。
本公開中，棒狀桿菌屬微生物可以是麩胺酸棒狀桿菌。
本公開中製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬微生物與上述者相同。
上述方法中，可用所屬領域習知的批次培養、連續培養及加料批次培養而培養微生物，然而非特別限制於此。特別地，關於培養條件，可以使用鹼性化學藥品(如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化學藥品(如，磷酸或硫酸)而維持適當pH(即，最佳pH5至9，具體地pH6至8，及最具體地pH 6.8)，然而非特別限制於此。此外，可藉由添加氧或含氧氣體混合物至細胞培養中而維持有氧條件。可將培養溫度維持在20℃至45℃，及具體地25℃至40℃，及可將微生物培養約10小時至160小時。上述培養所製造的腐胺或鳥胺酸可分泌到培養基中或留在細胞 內。
此外，在培養基中，可單獨地或組合地使用碳源，諸如糖類及碳水化合物(如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油類及脂肪類(如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸類(如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)、醇類(如，甘油及乙醇)及有機酸類(如，乙酸)，但不限於此；可單獨地或組合地使用氮源，諸如含氮有機化合物(如，蛋白腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉及尿素)或無機化合物(如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)，但不限於此；及可單獨地或組合地使用鉀源，諸如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，或與其對應的含鈉鹽，但不限於此。此外，培養基中亦可含有其他必需的生長刺激物質包含金屬鹽類(如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素。
可經由所屬領域習知的合適培養方法，例如，批次培養、連續培養或加料批次培養，而進行在本公開的培養期間所製造之腐胺或鳥胺酸的回收方法，而因此能從培養中回收目標物質。
[實施例]
下文中，將用所附示例性具體例而詳細說明本發明。然而，本文所公開之示例性具體例只作為說明性的目的而不應當解釋為限制本發明的範圍。
實施例1：從具有腐胺生產力的菌株製備sugR基因減弱菌株
本發明者等人已確認減弱sugR的效應，sugR為具有腐胺生產力的菌株中編碼SugR的基因。
1-1. 從具有腐胺生產力之ATCC13032系菌株製備sugR基因減弱
製備sugR減弱菌株，用以確認減弱sugR基因是否關於具有腐胺生產力的麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032系菌株之腐胺生產力(韓國專利公開系統No.10-2013-0082478)。具體地，經由改變sugR基因的起始密碼子及以B6減弱啟動子置換啟動子而製備sugR減弱菌株(PatekM(2005)Regulation of gene expression.In：Eggeling L,Bott M(eds)Handbook of Corynebacterium glutamicum.CRC,BocaRaton)。
首先，製備改變sugR基因之起始密碼子的載體。關於編碼SEQ ID NO：2所述之sugR的基因之多核苷酸序列附近，製備用來得到sugR基因起始密碼子上游同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：43及44及用來得到sugR基因起始密碼子下游同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：45、46及47。表1中總結改變起始密碼子所使用的引子如下。
使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組DNA作為模板分別連同2對引子，分別擴增sugR基因起始密碼子的上游區域及下游區域，而進行PCR，並使所得物進行電泳而得到所需片段。特別地，經由30個循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒及72℃延伸30秒而進行PCR。由此得到的片段在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，沖提並純化所需大小的條帶。
用BamHI及SalI處理pDZ載體(韓國專利號10-0924065)，然後使ATCC13032菌株的PCR產物進行融合選殖。使用In-Fusion® HD選殖試劑盒(Clontech)進行融合選殖。因此，製備pDZ-1'sugR(GTG)及pDZ-1'sugR(TTG)質 體。
在載體用於置換成B6減弱啟動子的情況，如下列表2所示製備用於載體製備的SEQ ID NO：48。
使用用來得到sugR基因起始密碼子上游同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：43及44及用來得到sugR基因起始密碼子下游同源重組片段的引子對SEQ ID NOS：48及47而進行PCR，其係關於編碼SEQ ID NO：2所述的SugR之基因的多核苷酸序列附近而製備，並分別擴增sugR基因之起始密碼子的上游區域及下游區域，並使所得物進行電泳而得到所需片段。由此得到的片段在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，沖提並純化所需大小的條帶。用BamHI及SalI處理pDZ載體，然後使ATCC13032菌株的PCR產物進行融合選殖。使用In-Fusion® HD選殖試劑盒(Clontech)進行融合選殖。因此，製備質體pDZ-1'sugR(B6)。
經由電穿孔將質體pDZ-1'sugR(GTG)、pDZ-1'sugR(TTG)及pDZ-1'sugR(B6)引入棒狀桿菌屬KCCM11240P微生物(韓國專利申請公開號10-2013-0082478)而得到轉形體，將轉形體平板培養在含有 康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的BHIS平板培養基上(腦心浸液37g/L、山梨醇91g/L及瓊脂2%)並培養至得到菌落。從菌落中，選出藍色菌落從而選出經引入質體pDZ-1'sugR(GTG)、pDZ-1'sugR(TTG)及pDZ-1'sugR(B6)的菌株。
將選擇的菌株在CM培養基(葡萄糖10g/L、多蛋白腖10g/L、酵母抽出物5g/L、牛肉抽出粉5g/L、NaCl 2.5g/L、尿素2g/L，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)及從10-4至10-10依序稀釋，平板培養在含有X-gal的固體培養基上，並培養至形成菌落。
在如此形成的菌落中，選擇以相對低比率出現的白色菌落及最後選擇其中經由二次交換而將sugR基因的起始密碼子改變成GTG或TTG的菌株或其中啟動子經改變成B6的菌株。關於最終選擇的菌株，使用引子對SEQ ID NOS：43及47進行PCR而確認sugR基因的起始密碼子改變成GTG或TTG，或啟動子轉化成B6減弱啟動子，並將修飾的麩胺酸棒狀桿菌菌株命名為KCCM11240P sugR(GTG)、KCCM11240P sugR(TTG)、KCCM11240P sugR(B6)。
1-2. 從具有腐胺生產力之ATCC13869系菌株製備sugR基因減弱菌株
將具有腐胺生產力之麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869系的菌株DAB12-a △ NCgl1469(韓國專利申請公開號10-2014-0115244)，命名為DAB12-b，並基於DAB12-b菌株而製備sugR減弱菌株。
具體地，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板連同引子對SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49而進行PCR，用以確認編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之SugR的基因序列及由其表現的蛋白質。
特別地，經由30個循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒及72℃延伸1分鐘及30秒而進行PCR。
經由電泳分離由此得到的PCR產物並進行序列分析，結果，確認編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之SugR的基因包含SEQ ID NO：4所述之多核苷酸序列。比較由其編碼的蛋白序列與衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(SEQ ID NO：1)之SugR的胺基酸序列顯示其同源性為99%。
使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板連同以上表1及2所述的引子對，如實施例1-1而進行PCR，用以改變衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的sugR基因的起始密碼子及置換B6減弱啟動子，並分別擴增sugR基因起始密碼子的上游區域及下游區域的PCR片段，然後進行電泳而得到所需片段。特別地，經由30個循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒及 72℃延伸30秒而進行PCR。由此得到的片段在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，沖提並純化所需大小的條帶。
用BamHI及SalI處理pDZ載體，然後使ATCC13032菌株的PCR產物進行融合選殖。使用In-Fusion® HD選殖試劑盒(Clontech)進行融合選殖。因此，製備質體pDZ-2'sugR(GTG)、pDZ-2'sugR(TTG)及pDZ-2'sugR(B6)。
如實施例1-1的方式，將質體pDZ-2'sugR(GTG)、pDZ-2'sugR(TTG)及pDZ-2'sugR(B6)轉形入麩胺酸棒狀桿菌DAB12-b，並選擇其中sugR的起始密碼子改變及/或啟動子轉化成B6減弱啟動子的菌株。將所選出的麩胺酸棒狀桿菌的修飾菌株分別命名為DAB12-b sugR(GTG)、DAB12-b sugR(TTG)及DAB12-b sugR(B6)。
實施例2：從具有腐胺生產力的菌株製備gltA增強菌株
將gltA基因引入具有腐胺生產力菌株之染色體內的轉位子基因中而製備經修飾的菌株，用以確認增強具有腐胺生產力菌株之檸檬酸合成酶gltA活性的效應。轉形用的pDZTn載體(WO 2009/125992)，可將基因引入染色體，並使用棒狀桿菌屬微生物之轉位子基因的區域。
2-1. 從具有腐胺生產力的ATCC13032系菌株製備gltA加強菌株
使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組DNA作為模板連同引子SEQ ID NOS：50及51而擴增gltA基因片段(表4)。特別地，經由30個循環之95℃變性30 秒、55℃降溫黏合30秒及72℃延伸30秒或延伸1分鐘及30秒而進行PCR。所得到的片段在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，沖提並純化所需大小的條帶。
用SpeI處理pDZTn載體，然後分別使PCR產物進行融合選殖。使用In-Fusion® HD選殖試劑盒(Clontech)進行融合選殖。所得到的質體命名為pDZTn1'-gltA。
將所製備的質體經由電穿孔引入KCCM11240P菌株中而得到轉形體，將轉形體在CM培養基(葡萄糖10g/L、多蛋白腖10g/L、酵母抽出物5g/L、牛肉抽出物5g/L、NaCl 2.5g/L、尿素2g/L，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，從10-4至10-10依序稀釋，平板培養在含有X-gal的固體培養基上，並培養至形成菌落。
在所形成的菌落中，選擇以相對低比率出現的白色菌落及最後選擇其中經由二次交換而引入編碼gltA之基因的菌株。關於最終選擇的菌株，確認使用引子對SEQ ID NOS：50及51進行PCR並將編碼gltA的基因引 入其中，將麩胺酸棒狀桿菌的修飾菌株命名為KCCM11240P Tn：：gltA。
2-2. 從具有腐胺生產力的ATCC13869系菌株製備gltA增強菌株
關於實施例1-2中使用的DAB12-b菌株，製備gltA增強菌株。
具體地，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板連同引子對SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51而進行PCR，用以確認編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之gltA的基因及由此表現的蛋白質之序列。
特別地，經由30個循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒及72℃延伸1分鐘及30秒而進行PCR。經由電泳而分離所得到的PCR產物並進行序列分析，結果，確認編碼衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之gltA的基因包含SEQ ID NO：8所述之多核苷酸序列。比較由此編碼的蛋白質及衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(SEQ ID NO：5)之gltA的胺基酸序列顯現其同源性為99%。
使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA作為模板連同引子SEQ ID NOS：50及51，如實施例2-1而進行PCR而擴增基因片段，用以增強衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之gltA。特別地，經由30個循環之95℃變性30秒、55℃降溫黏合30秒及72℃延伸30秒或延伸1分鐘及30秒而進行PCR。所得到的PCR片段在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，沖提並純化所需大小的條帶。
用SpeI處理pDZTn載體，然後分別使PCR產物進行融合選殖。使用In-Fusion® HD選殖試劑盒(Clontech)進行融合選殖。所得到的質體命名為pDZTn2’-gltA。以與實施例2-1相同的方式將質體pDZTn2’-gltA轉形至麩胺酸棒狀桿菌DAB12-b菌株並由此選出其中gltA加強的菌株。將所選出的麩胺酸棒狀桿菌修飾菌株命名為DAB12-b Tn：gltA。
實施例3：製備整合sugR減弱及gltA增強之具有腐胺生產力的菌株並確認該菌株之腐胺生產力
將gltA基因引入轉位子基因中，用以確認實施例1-1及1-2中經由插入gltA基因而製備的sugR減弱菌株之腐胺生產力的改進。特別地，使用實施例2-1及2-2中製備的載體pDZTn1'-gltA及pDZTn2'-gltA。
具體地，以與實施例2-1相同之方式將質體pDZTn1'-gltA轉形至麩胺酸棒狀桿菌KCCM11240P sugR(GTG)、-KCCM11240P sugR(TTG)及-KCCM11240P sugR(B6)而製備gltA增強菌株。並將所製備的麩胺酸棒狀桿菌修飾菌株分別命名為KCCM11240P sugR(GTG)Tn：：gltA、KCCM11240P sugR(TTG)Tn：：gltA及KCCM11240P sugR(B6)Tn：：gltA，其中，KCCM11240P sugR(TTG)Tn：：gltA(麩胺酸棒狀桿菌CC01-1147)於2014年11月28日存放於韓國微生物菌種中心，登錄號為KCCM11615P。
此外，以與實施例2-2相同之方式將質體pDZTn2'-gltA轉形至麩胺酸棒狀桿菌DAB12-b sugR(GTG)、-DAB12-b sugR(TTG)及-DAB12-b sugR(B6)而製備gltA增強菌株。將所製備的麩胺酸棒狀桿菌修飾菌株分別命名為DAB12-b sugR(GTG)Tn：：gltA、DAB12-b sugR(TTG)Tn：：gltA及DAB12-b sugR(B6)Tn：：gltA。
實施例4：評估整合sugR減弱及gltA增強之具有腐胺生產力之菌株的腐胺生產力
比較實施例1、2及3中所製備具有腐胺生產力的麩胺酸棒狀桿菌修飾菌株的腐胺生產力，用以確認在具有腐胺生產力的菌株中sugR減弱及gltA增強對腐胺製造的效應。
具體地，分別將6株不同的麩胺酸棒狀桿菌的經修飾菌株(即，KCCM11240P sugR(GTG)Tn：：gltA/KCCM11240P sugR(TTG)Tn：：gltA/ KCCM11240P sugR(B6)Tn：：gltA/DAB12-b sugR(GTG)Tn：：gltA/DAB12-b sugR(TTG)Tn：：gltA及DAB12-b sugR(B6)Tn：：gltA))，及2株不同的母菌株(即，KCCM11240P及DAB12-b)平板培養在含有1mM精胺酸的CM平板培養基(1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母抽出物、0.5%牛肉抽出物、0.25%NaClL、0.2%尿素、100μl的50% NaOH、2%瓊脂，pH 6.8，基於1L)，並於30℃培養24小時。
將由此培養之各菌株以約1白金環的量接種到25mL效價培養基(titer medium)(8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸粉、4%(NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素100g、鹽酸硫胺素3mg、 鈣-泛酸3mg、菸鹼醯胺3mg、5%CaCO3，基於1L)，並於30℃在200rpm轉速下振盪培養50小時。
在所有菌株培養中，於培養基中添加1mM精胺酸。培養完成後，測量各培養中製造的腐胺濃度，其結果示於以下表5。
如以上表5所示，相較於未經修飾的菌株KCCM11240P，有減弱的sugR或增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加腐胺生產力3%至9%，而且同時有減弱的sugR及增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加腐胺生產力9%至17%。
此外，相較於未經修飾的菌株，有減弱的sugR或增強的gltA之DAB12-b菌株的經修飾菌株顯示增加腐胺生產力4%至9%，而且同時有減弱的sugR及增強的gltA之DAB12-b菌株的經修飾菌株顯示增加腐胺生產力10%至13%。
實施例5：基於整合sugR減弱及gltA增強之具有腐胺生產力之菌株而製備增加腐胺分泌能力的菌株並確認該菌株的腐胺生產力
5-1. 基於整合sugR減弱及gltA增強之菌株而製備增加腐胺分泌能力的菌株
製備經修飾菌株，用以確認腐胺分泌能力 增加的KCCM11401P菌株(韓國專利申請公開號10-2014-0115244)是否能經由減弱sugR基因的活性或增強gltA基因的活性而改善腐胺生產力。
具體地，首先，將實施例1-1中製備的質體pDZ-1'sugR(GTG)、pDZ-1'sugR(TTG)及pDZ-1'sugR(B6)轉形至麩胺酸棒狀桿菌KCCM 11401P，並由此選出其中sugR的起始密碼子經轉化成TTG而如此造成sugR減弱之菌株。將所選擇之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株分別命名為KCCM11401P sugR(GTG)、KCCM11401P sugR(TTG)及KCCM11401P sugR(B6)。
然後，將gltA基因引入以上所製備之減弱sugR基因之菌株的轉位子基因中，用以確認增強gltA基因活性是否改進腐胺生產力。特別地，使用實施例2-1中製備的載體pDZTn1'-gltA。
具體地，將實施例2-1中製備的質體pDZTn1'-gltA轉形至KCCM11401P sugR(GTG)、KCCM11401P sugR(TTG)及KCCM11401P sugR(B6)，並選擇gltA加強菌株。將所選擇之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株命名為KCCM11401P sugR(GTG)Tn：：gltA、KCCM11401P sugR(TTG)Tn：：gltA及KCCM11401P sugR(B6)Tn：：gltA。
5-2. 基於整合sugR減弱及gltA增強之具有腐胺生產力之菌株而評估腐胺分泌能力增加之菌株的腐胺生產力
比較在實施例5-1中製備的麩胺酸棒狀桿 菌之經修飾菌株間的腐胺生產力，用以確認具有腐胺生產力的菌株中sugR減弱及gltA增強關於其腐胺製造的效應。
具體地，分別將7株不同的麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(即，KCCM11401P sugR(GTG)、KCCM11401P sugR(TTG)、KCCM11401P sugR(B6)、KCCM11401P Tn：：gltA、KCCM11401P sugR(GTG)Tn：：gltA、KCCM11401P sugR(TTG)Tn：：gltA及KCCM11401P sugR(B6)Tn：：gltA)及單一母菌株(KCCM11401P)平板培養在含有1mM精胺酸的CM平板培養基(1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母抽出物、0.5%牛肉抽出物、0.25%NaCl、0.2%尿素、100μl的50% NaOH、2%瓊脂，pH 6.8，基於1L)，並於30℃培養24小時。
將由此培養之各菌株以約1白金環的量接種到25mL效價培養基(8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸粉、4%(NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素100g、鹽酸硫胺素3mg、鈣-泛酸3mg、菸鹼醯胺3mg、5%CaCO3，基於1L)，並於30℃在200rpm轉速下振盪培養50小時。
如以上表6所示，相較於未經修飾的菌株KCCM11401P，有減弱的sugR或增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加腐胺生產力2%至6%，而且同時有減弱的sugR及增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加腐胺生產力9%至15%。確認該結果與表5之結果的解釋一致。
實施例6. 從具有鳥胺酸生產力的菌株製備sugR減弱菌株
使用實施例1-1中製備的載體製備之經修 飾菌株，用以確認減弱衍生自麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032的sugR是否對鳥胺酸生產力具有效應。
將實施例1-1中製備的質體，即，pDZ-1'sugR(GTG)、pDZ-1'sugR(TTG)及pDZ-1'sugR(B6)引入KCCM11137P菌株(韓國專利號10-1372635)中，其係使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032作為母菌株而製備，經由電穿孔術而得到轉形體，將轉形體平板培養在含有康黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的BHIS平板培養基上(腦心浸液37g/L、山梨醇91g/L及瓊脂2%)並培養至得到菌落。從菌落中，選出藍色菌落從而選出經引入質體pDZ-1'sugR(GTG)、pDZ-1'sugR(TTG)及pDZ-1'sugR(B6)的菌株。
將選擇的菌株在CM培養基(葡萄糖10g/L、多蛋白腖10g/L、酵母抽出物5g/L、牛肉抽出物5g/L、NaCl 2.5g/L、尿素2g/L，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)並從10-4至10-10依序稀釋，平板培養在含有X-gal的固體培養基上，並培養至形成菌落。在所形成的菌落中，選擇以相對低比率出現的白色菌落及最後選擇其中經由二次交換而將sugR基因的起始密碼子改變成GTG或TTG的菌株或其中啟動子經改變成B6的菌株。關於最終選擇的菌株，使用引子對SEQ ID NOS：43及47進行PCR，然後確認sugR基因的起始密碼子經改變成GTG或TTG。將所得麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株分別命名為KCCM11137P sugR(GTG)、KCCM11137P sugR(TTG)及KCCM11137P sugR(B6)。
實施例7. 從具有鳥胺酸生產力的菌株製備gltA增強菌株
使用實施例2-1中製備的載體將gltA基因插入具有鳥胺酸生產力之菌株的染色體中而製備之經修飾菌株，用以確認加強具有鳥胺酸生產力之菌株的gltA基因對其鳥胺酸製造的效應。
具體地，經由電穿孔術將實施例2-1中製備的載體引入KCCM11137P菌株(韓國專利號10-1372635)中而得到轉形體，將轉形體在CM培養基(葡萄糖10g/L、多蛋白腖10g/L、酵母抽出物5g/L、牛肉抽出物5g/L、NaCl 2.5g/L、尿素2g/L，pH 6.8)中振盪培養(30℃，8小時)，並從10-4至10-10依序稀釋，平板培養在含有X-gal的固體培養基上，並培養至形成菌落。
在所形成的菌落中，選擇以相對低比率出現的白色菌落及最後選擇其中經由二次交換而引入編碼gltA的基因之菌株。關於最後選擇的菌株，使用引子對SEQ ID NOS：50及51進行PCR並確認將編碼gltA的基因引入其中，並將麩胺酸棒狀桿菌的修飾菌株命名為KCCM11137P Tn：：gltA。
實施例8. 製備整合sugR減弱及gltA增強的菌株並確認該菌株之腐胺生產力
8-1. 製備整合sugR減弱及gltA增強之具有鳥胺酸生產力的ATCC13032系菌株
將gltA基因引入轉位子基因，用以確認在實施例6中經由將gltA基因插入染色體而製備的sugR減弱的KCCM11137P sugR(GTG)、KCCM11137P sugR(TTG)及KCCM11137P sugR(B6)之鳥胺酸製造活性的增強效應。特別地，使用實施例2-1中製備的載體pDZTn1'-gltA。
如實施例2-1的相同方式，將質體pDZTn1'-gltA轉形入麩胺酸棒狀桿菌KCCM11137P sugR(TTG)，並選擇gltA增強的菌株。將所選出的麩胺酸棒狀桿菌的經修飾菌株分別命名為KCCM11137P sugR(GTG)Tn：：gltA、KCCM11137P sugR(TTG)Tn：：gltA及KCCM11137P sugR(B6)Tn：：gltA。
8-2. 評估整合sugR減弱及gltA增強之菌株的鳥胺酸生產力
比較在實施例8-1中製備的麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株間的鳥胺酸生產力，用以確認在具有鳥胺酸生產力的菌株中sugR減弱及gltA增強關於其鳥胺酸製造的效應。
具體地，分別將7株不同的麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株(即，KCCM11137P sugR(GTG)、KCCM11137P sugR(TTG)、KCCM11137P sugR(B6)、KCCM11137P Tn：：gltA、KCCM11137P sugR(GTG)Tn：：gltA、KCCM11137P sugR(TTG)Tn：：gltA及KCCM11137P sugR(B6)Tn：：gltA)及單一母菌株(KCCM11137P)平板培養在含有1mM精胺酸的CM平板培養基(1%葡萄糖、1%多蛋白腖、 0.5%酵母抽出物、0.5%牛肉抽出物、0.25%NaCl、0.2%尿素、100μl的50% NaOH、2%瓊脂，pH 6.8，基於1L)，並於30℃培養24小時。
將由此培養之各菌株以約1白金環的量接種到25mL效價培養基(8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸粉、4%(NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4．7H2O、0.15%尿素、生物素100g、鹽酸硫胺素3mg、鈣-泛酸3mg、菸鹼醯胺3mg、5%CaCO3，基於1L)，並於30℃在200rpm轉速下振盪培養50小時。在所有菌株培養中，於培養基中添加1mM精胺酸。培養完成後，測量各培養中製造的鳥胺酸濃度，其結果示於以下表7。
如以上表7所示，相較於未經修飾的菌株KCCM11137P，有減弱的sugR或增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加鳥胺酸生產力7%至9%，而且同時有減弱的sugR及增強的gltA之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾菌株顯示增加鳥胺酸生產力12%至17%。
結論，在製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌菌株中，確認經由減弱sugR或增強gltA可增加腐胺及鳥胺酸產量，及當增強gltA而同時減弱sugR時，腐胺及鳥胺酸產量的增加更明顯。
由上述，本發明有關之領域的熟練技術人員將能瞭解本發明可用不改變本發明之技術構思或主要特徵之其他具體形式來實現。在這方面，本文揭露之示例性具體例僅用於說明之目的而非意圖限制本發明之範圍。相反地，本發明旨在不但涵蓋示例性具體例而且涵蓋可包含於所附權利要求所定義的本發明的精神和範圍內的各種選擇形式、修改形式、等效形式及其他具體例。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、2016年09月29日、BCRC 910748
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.大韓民國、韓國微生物保存中心、2014年11月28日、KCCM11615P
寄存證明書(中譯本)
布達佩斯條約締約國所承認之專利手續上的微生物寄存的國際寄存機構根據布達佩斯條約第7.1條出具此證明
寄存者：CJ第一製糖股份有限公司
地址：大韓民國100-400首爾市 中區 東湖路330CJ第一製糖中心
1.微生物之標示：：Corynebacterium glutamicum CC01-1147
受託編號：KCCM11615P
2.科學的性質及分類學上的位置
第1項的微生物檢附記載下述事項的文件
分類學上的位置
3.受領及受託
本局於2014年11月28日(原寄存日)受領第1項的微生物的受託。
4.國際寄託局：大韓民國微生物保存中心
中心長
地址：大韓民國120-861首爾市 西大門區 弘濟洞-2-145儒林大樓
2014年11月28日
<110> CJ第一製糖股份有限公司
<120> 用於製造腐胺或鳥胺酸之微生物及使用該微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法
<130> OPA16044-TW
<150> KR10-2015-0090021
<151> 2015-06-24
<160> 51
<170> KopatentIn 2.0
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<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 NCgl1469
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<210> 37
<211> 203
<212> PRT
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869 NCgl1469
<400> 37
<210> 38
<211> 612
<212> DNA
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869 NCgl1469
<400> 38
<210> 39
<211> 494
<212> PRT
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 NCgl2522
<400> 39
<210> 40
<211> 1485
<212> DNA
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 NCgl2522
<400> 40
<210> 41
<211> 494
<212> PRT
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869 NCgl2522
<400> 41
<210> 42
<211> 1485
<212> DNA
<213> 麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869 NCgl2522
<400> 42
<210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR F1_SalI引子
<400> 43
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR-R1引子
<400> 44
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR-F2_GTG引子
<400> 45
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR-F2_TTG引子
<400> 46
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR-R2_BamHI引子
<400> 47
<210> 48
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR F3引子
<400> 48
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sugR R引子
<400> 49
<210> 50
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA F_speI引子
<400> 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gltA R_speI引子
<400> 51

Claims (15)

  1. 一種製造腐胺或鳥胺酸的棒狀桿菌屬的經修飾微生物，其中相較於其內源活性，糖代謝轉錄調節子(SugR)的活性減弱及相較於其內源活性，檸檬酸合成酶(GltA)的活性增強。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中該糖代謝轉錄調節子由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的胺基酸序列所組成。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中該檸檬酸合成酶由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的胺基酸序列所組成。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物係選自由麩胺酸棒狀桿菌、產氨棒狀桿菌、熱產胺棒狀桿菌、黃色短桿菌及乳酸醱酵短桿菌所成群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中進一步引入鳥胺酸脫羧酶(ODC)活性。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之微生物，其中該鳥胺酸脫羧酶由SEQ ID NO：17的胺基酸序列所組成。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中相較於其內源活性，i)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶(ArgF)的活性、ii)麩胺酸輸出蛋白的活性或iii)鳥胺酸甲胺醯基轉移酶的活性及麩胺酸輸出蛋白的活性進一步減弱。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之微生物，其中該鳥胺酸甲 胺醯基轉移酶由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的胺基酸序列所組成，及麩胺酸鹽輸出蛋白由SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的胺基酸序列所組成。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中相較於其內源活性，選自由乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(ArgC)、乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯麩胺酸激酶(ArgB)及乙醯鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)所成群組的至少一者的活性進一步增強。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之微生物，其中該乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的胺基酸序列所組成，該乙醯麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25的胺基酸序列所組成，該乙醯麩胺酸激酶由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29的胺基酸序列所組成及該乙醯鳥胺酸胺基轉移酶由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33的胺基酸序列所組成。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中相較於其內源活性之乙醯基轉移酶的活性進一步減弱。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之微生物，其中該乙醯基轉移酶由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的胺基酸序列所組成。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中相較於其內源活性，由SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的胺基酸序列所組成之蛋白質的活性進一步加強。
  14. 一種製造腐胺或鳥胺酸的方法，包括：(i)在培養基中培養申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述之棒狀桿菌屬微生物；及(ii)從培養的微生物或培養基中回收腐胺或鳥胺酸。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
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