JP6588575B2 - プトレシンまたはオルニチン生産微生物及びそれを用いたプトレシンまたはオルニチン生産方法 - Google Patents

プトレシンまたはオルニチン生産微生物及びそれを用いたプトレシンまたはオルニチン生産方法 Download PDF

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Description

本発明はプトレシンまたはオルニチンを生産するための組換え微生物及びそれを用いてプトレシンまたはオルニチンを生産する方法に関する。
プトレシンはグラム陰性バクテリアやカビで発見され、多様な種で高濃度で存在するため微生物の代謝に重要な役割をすると予測されている。一般的に、プトレシンはポリアミンナイロン‐４，６を合成する重要な原料物質として、主に化学合成法により生産される。前記化学合成法は触媒的酸化反応段階、シアン化物（cyanide）を用いる段階と高圧水素を用いる水素化反応段階などを含む３段階工程からなる。そこで、プトレシンの生産のためにより環境親和的であり、エネルギー消費を節減しうるバイオマスを活用する方法が求められている。
このような背景下、微生物を用いてプトレシンを生産する方法としては大腸菌とコリネバクテリウム属微生物を形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開された（特許文献１、特許文献２、非特許文献１〜３）。
オルニチン（ornithine）は、植物、動物、微生物で広く発見される物質であり、アルギニン、プロリン及びポリアミンの生合成に用いられる前駆体である。また、高等動物の生体内代謝でオルニチン回路を介してアミノ酸またはアンモニアから尿素を生成し体外に排出する経路で重要な役割を果たす。オルニチンは産業的に栄養補助食品や肝硬変と肝機能の障害を改善する医薬品としても利用されている。このようなオルニチンを製造する方法としては、牛乳カゼイン（casein）を消化酵素で処理する方法及び形質転換された大腸菌またはコリネバクテリウム属微生物を用いた方法が知られている（特許文献３、非特許文献４）。
一方、糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism）のＳｕｇＲはコリネバクテリウムで転写調節因子として知られており、ＰＴＳシステムのＰＥＰタンパク質ホスホトランスフェラーゼ（PEP-protein phosphotransferase of PTS system）をコードする遺伝子及び糖の解糖過程（glycolysis）に関連する遺伝子を阻害するという報告がある（非特許文献５）。クエン酸シンターゼはＴＣＡ回路に最初に作用し、ＴＣＡ回路の速度を調節することができる酵素である。コリネバクテリウムでＧｌｔＡ活性が減少した変異株の場合、アスパラギン酸とリジン生産が増加するという報告がある（非特許文献６）。
国際特許公開ＷＯ０６/００５６０３ 国際特許公開ＷＯ０９/１２５９２４ 韓国登録特許第１０-１３７２６３５号 国際特許公開ＷＯ２００９/０９６６８９ 韓国登録特許第０６２００９２号 国際特許公開ＷＯ２００６/０６５０９５ 韓国公開特許第１０-２０１３-００８２４７８号 韓国登録特許第１０-０９２４０６５号 韓国公開特許第１０-２０１４-０１１５２４４号 国際特許公開ＷＯ２００９/１２５９９２
Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4): 651-662, 2009 Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4): 859-868, 2010 Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178., 2012) T. Gotoh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 33:773-777, 2010 VF Wendisch, et al., J.Bacteriol.190: 24, 8033-8044, 2008 Shiio et al., Agric Biol Chem. 46; 101-107, 1982
本発明者らは糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism）をコードする遺伝子であるｓｕｇＲ及びクエン酸シンターゼ（citrate synthase）をコードする遺伝子であるｇｌｔＡを操作したとき、プトレシンまたはオルニチン生産能が向上したことを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、プトレシンまたはオルニチンを高収率で生産することができる、組換え微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンまたはオルニチンを生産する方法を提供することにある。
本発明のプトレシンまたはオルニチンを生産するコリネバクテリウム属微生物に糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism、SugR）を弱化させると同時に、クエン酸シンターゼ（citrate synthase、GltA）を強化させることを通じて、プトレシン及びオルニチンの生産量が増加することを確認した。これにより、本発明の微生物は、プトレシンまたはオルニチンを産業的に生産するのに広く活用されることができ、これらが原料として用いられるいくつかのポリマー製品の生産にも経済的な側面及び環境的な側面で効果的かつ好ましい原料提供手段として広く活用されることができる。
本発明の一態様は、ｉ）糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism、SugR）の活性が内在的活性に比べて弱化されたり、ｉｉ）クエン酸シンターゼ（citrate synthase、GltA）の活性が内在的活性に比べて強化されたり、またはｉｉｉ）糖代謝転写調節因子の活性が内在的活性に比べて弱化されて、クエン酸シンターゼの活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、糖代謝転写調節因子の活性が内在的活性に比べて弱化されて、クエン酸シンターゼの活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の他の一つの具体例は、前記糖代謝転写調節因子が、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列で構成される、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記クエン酸シンターゼが、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列で構成される、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択される、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入されるように変異された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記オルニチンデカルボキシラーゼが、配列番号１７のアミノ酸配列で構成される、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーターまたはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列で構成され、前記グルタミン酸エクスポーターが、配列番号１３または配列番号１５のアミノ酸配列で構成される、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、アセチルγグルタミルリン酸レダクターゼが、配列番号１９または配列番号２１のアミノ酸配列で構成され、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼが、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列で構成され、アセチルグルタミン酸キナーゼが、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列で構成され、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼが、配列番号３１または配列番号３３のアミノ酸配列で構成される、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性に比べて弱化されるように変異された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３５または配列番号３７のアミノ酸配列で構成される、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらに配列番号３９または配列番号４１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の他の態様は、
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記（ｉ）段階で培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを分離する段階を含む、プトレシンまたはオルニチン生産方法を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、プトレシンまたはオルニチン生産方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様は、ｉ）糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism、SugR）の活性が内在的活性に比べて弱化されたり、ｉｉ）クエン酸シンターゼ（citrate synthase、GltA）の活性が内在的活性に比べて強化されたり、またはｉｉｉ）糖代謝転写調節因子の活性が内在的活性に比べて弱化されて、クエン酸シンターゼの活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物に関する。具体的には、糖代謝転写調節因子の活性が内在的活性に比べて弱化されて、クエン酸シンターゼの活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物に関する。
本発明で使用される用語、「糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism、SugR）」は、糖の流入（sugar uptake）とホスホトランスフェラーゼシステム、糖分解（glycolysis）及び乳酸脱水素酵素関連発酵などの様々な糖代謝に関連する遺伝子について幅広く抑制因子の機能をする酵素である。本発明で糖代謝転写調節因子はコリネバクテリウム属微生物内の内在タンパク質または外来タンパク質の両方を含み、具体的にはコリネバクテリウム属微生物由来のＳｕｇＲであってもよい。
本発明で糖代謝転写調節因子は、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的に８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的に糖代謝転写調節因子の活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明で糖代謝転写調節因子は由来に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム属微生物由来、具体的に、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号１または配列番号３のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明の糖代謝転写調節因子をコードするポリヌクレオチドは、前記糖代謝転写調節因子のタンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。前記糖代謝転写調節因子をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮重（degeneracy）によって、または前記調節因子を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよく、具体的には、配列番号２または配列番号４のポリヌクレオチド配列を含んでもよいが、これに限定されることではない。
本発明で使用される用語、「クエン酸シンターゼ（citrate synthase、GltA）」は、様々な細胞内の生合成中間体の生成と還元されたプリン核酸の生成に関与する酵素である。アセチルＣｏＡとオキサロアセテートの加水縮合反応を媒介してクエン酸を生成するのに作用することが知られている。本発明ではクエン酸シンターゼはコリネバクテリウム属微生物内の内在タンパク質または外来タンパク質の両方を含み、具体的には、コリネバクテリウム属微生物由来のＧｌｔＡであってもよい。
本発明でクエン酸シンターゼは、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルＣｏＡとオキサロアセテートの加水縮合反応を媒介してクエン酸を生成する活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でクエン酸シンターゼは由来に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム属微生物由来、具体的に、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号５または配列番号７のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のクエン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、前記クエン酸シンターゼタンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。前記クエン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮重（degeneracy）によって、または前記酵素を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよく、具体的には、配列番号６または配列番号８のポリヌクレオチド配列を含んでもよいが、これに限定されることではない。
前記で用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と同一であるか、または同様の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ ２．０を用いたり、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義されている適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）で決定されてもよい。
また、本発明の糖代謝転写調節因子とクエン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２または４と配列番号６または８のポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチド配列から由来するプローブ（probe）とストリンジェントな条件（stringent conditions）でハイブリダイズされてもよく、正常に機能する糖代謝転写調節因子とクエン酸シンターゼをコードする変異型であってもよい。前記で用語、「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このようなストリンジェントな条件は文献（例えば、J. Sambrook et al.,同上）に具体的に記載されている。
本発明では、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物の糖代謝転写調節因子であるＳｕｇＲの活性を弱化させたり、クエン酸シンターゼであるＧｌｔＡの活性を強化させたり、前記ＳｕｇＲ活性の弱化とＧｌｔＡ活性の強化を同時に適用し、その結果、すべての変異菌株でプトレシンまたはオルニチン生産量が向上することを確認した。
一方、本発明の微生物は、プトレシンまたはオルニチンを生産することができれば、天然型または変異型微生物の両方を含んでもよい。例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、赤痢菌属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノマナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）などに属する微生物であってもよい。具体的には、本発明の微生物はコリネバクテリウム属に属する微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択されるものであってもよく、さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
特に、本発明の用語、「プトレシンまたはオルニチン生産能を有する」とは、プトレシンまたはオルニチンの生産能が天然的にあるか、プトレシンまたはオルニチンの生産能のない親菌株にプトレシンまたはオルニチンの生産能が付与された微生物を意味する。
また、前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有する微生物は、オルニチンでアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransfrase、ArgF）及び/またはグルタミン酸の排出に関与するタンパク質であるグルタミン酸エクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）の活性を内在的活性に比べて弱化させるように変異されたものであってもよい。
さらに、前記プトレシン生産能を有する微生物は、プトレシンをアセチル化させるタンパク質であるアセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）の活性を内在的活性に比べて弱化させるように変異されて/変異されるか、オルニチンをプトレシンに転換させるタンパク質であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性を導入するように変形されたものであってもよい。
一方、本発明で活性が導入されたり、活性が強化されたり、活性が弱化されるなどの変化は、形質転換という過程を介して起ってもよい。本発明で用語、「形質転換」は、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドや活性が強いか弱いプロモーター配列などを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するようにしたり、または宿主細胞の染色体の変異を誘導することを意味する。
また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡとＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現または変異を誘導することができるものであれば、どのような形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されて、必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
また、前記の用語、「作動可能に連結」されたというのは、本発明の特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本発明で用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させられるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムに関係なく複製または機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＺＴｎ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
このように、細菌内染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されない。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体に挿入されるので、前記染色体に導入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換した細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いてもよい。選択剤（selective agent）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換した細胞を選別することができる。
本発明の用語、「活性が強化」されるのは、タンパク質自体の活性が新たに導入されたり増大され、本来の機能以上の効果を導出することを含むことだけではなく、内在的遺伝子活性の増加、内部または外部の要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子の導入、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替または変形及び遺伝子内の突然変異による酵素活性の増加などにより、その活性が増加されることを含む。
具体的には、本発明で活性強化または増加は、
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行ってもよいが、これに限定されない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行われてもよい。具体的には、本発明の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることで前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせで配列上の変異を誘導して行うことができ、さらに強い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することによって行うことができる。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などを含んでもよい。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよく、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ-Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあり、より具体的には、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）、あるいはＣＪ７プロモーター（特許文献５及び特許文献６）と作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良したポリヌクレオチド配列に交替することによって行うことができる。
本発明の用語「活性が弱化」は、活性を弱化させようとしたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、前記タンパク質の活性が弱化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及びこれらの組合せから選択された方法によって達成することができる。
具体的には、本発明の活性弱化は、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が弱化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及び
４）これらの組合わせから選択された方法によって達成することができ、これに限定されない。
具体的には、タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部ポリヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異するが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０個である。
また、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することにより、行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列を含む。
さらに、染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することにより、行うことができる。
それだけではなく、前記タンパク質のポリヌクレオチドの発現を抑制する調節因子を欠失する方法は、発現抑制因子のポリヌクレオチドを一部のポリヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異するが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０個である。
本発明で使用される用語、「内在的活性」とは、本来微生物が変形されてない状態、例えば、天然の状態などで有している酵素の活性状態を意味し、「内在的活性に比べて強化」されたとは、活性を示す遺伝子が導入されたり、または当該遺伝子のコピー数の増加、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失または発現調節配列の変形、例えば、改良されたプロモーターの使用などのような操作が行われる前の微生物が有する活性に比べて、操作が行われた以降の微生物が有する活性が増加した状態を意味する。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入されるものである、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明では、「オルニチンデカルボキシラーゼ」は、オルニチンのデカルボキシル化（decarboxylation）を媒介してプトレシン生産する酵素を意味する。コリネバクテリウム属微生物には、プトレシン生合成経路がないが外部からオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）を導入するとプトレシン合成され、細胞外にプトレシンが排出される。本発明で、前記オルニチンデカルボキシラーゼは、配列番号１７のアミノ酸配列で構成されるものであってもよく、または前記配列と７０％以上、具体的に８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にオルニチンデカルボキシラーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でオルニチンデカルボキシラーゼは由来に限定されず、具体的に、大腸菌由来のオルニチンデカルボキシラーゼであってもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号１７のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のオルニチンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、前記オルニチンデカルボキシラーゼタンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号１７のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。前記オルニチンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮重（degeneracy）によって、または前記酵素を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形を行うことができる。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーター（ ＮＣｇｌ１２２１）またはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明でオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼは、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、
具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、本発明でグルタミン酸エクスポーターは、配列番号１３または配列番号１５のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にグルタミン酸エクスポーターの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明でアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼは、配列番号１９または配列番号２１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、 本発明でアセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼは、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
本発明では、アセチルグルタミン酸キナーゼは、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルグルタミン酸キナーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
さらに、本発明でアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼは、 配列番号３１または配列番号３３のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにアセチルトランスフェラーゼ（ＮＣｇｌ１４６９）の活性が内在的活性より弱化された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明でアセチルトランスフェラーゼはプトレシンにアセチル基を転移する役割をするタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。前記アセチルトランスフェラーゼは配列番号３５または配列番号３７のアミノ酸配列で構成されるタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
最後に、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性よりも強化された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明のＮＣｇｌ２５２２はプトレシンを排出する機能をするタンパク質であって、配列番号３９または配列番号４１のアミノ酸配列で構成されているタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的に同様の活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
もう一つの様態として、本発明は、
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記（ｉ）段階で培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを分離する段階を含む、プトレシンまたはオルニチン生産方法を提供する。
本発明で前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。
前記本発明のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、先に説明した通りである。
前記の方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行ってもよい。ここで、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができ、培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することができる。前記培養によって生産されたプトレシンまたはオルニチンは培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
さらに、用いられる培養用培地で炭素共給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール、及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊粉と尿素）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに対応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。また、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
本発明の前記培養段階で生産されたプトレシンまたはオルニチンを回収する方法は培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野に公知された適切な方法を用いて培養液から目的物質を収集してもよい。
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：プトレシン生産菌株におけるｓｕｇＲ弱化菌株の製作
本発明者らはプトレシン生産菌株で糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism）をコードする遺伝子であるｓｕｇＲの弱化がプトレシン生産に与える影響を確認した。
１−１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のSｕｇＲ遺伝子弱化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献７）で糖代謝転写調節因子の遺伝子の弱化がプトレシン生産能に関連するかを確認するために、ｓｕｇＲ弱化菌株を製作した。具体的には、ｓｕｇＲ遺伝子弱化菌株はｓｕｇＲ遺伝子の開始コドンを変更して、プロモーターをＢ６弱化プロモーター（Patek M (2005) Regulation of gene expression. In: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC, BocaRaton）に交替する方法で製作した。
まず、ｓｕｇＲ開始コドンの変更のためのベクターを製造した。前記ｓｕｇＲをコードする遺伝子の配列番号２で記載されるポリヌクレオチド配列の付近を対象に、ｓｕｇＲ開始コドンの上流の相同組換え断片を得るための配列番号４３及び４４のプライマー対と、ｓｕｇＲ開始コドンの下流の相同組換え断片を得るための配列番号４５または４６及び４７のプライマー対を製作した。前記開始コドン変更に用いられたプライマーは、下記表１にまとめた。
Figure 0006588575
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、２組のプライマーそれぞれを用いたＰＣＲを行い、ｓｕｇＲ遺伝子開始コドンの上流と下流部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このことから得られた断片を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
ｐＤＺベクター（特許文献８）は、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを処理してＡＴＣＣ１３０３２菌株のＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングはＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。このような過程によりプラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）を製作した。
Ｂ６弱化プロモーターへの交替のためのベクターの場合、ベクターを製作するための配列番号４８を下記表２に示すように製作した。
Figure 0006588575
前記ｓｕｇＲをコードする遺伝子の配列番号２で記載されるポリヌクレオチド配列の付近を対象に、ｓｕｇＲ開始コドンの上流の相同組換え断片を得るための配列番号４３及び４４のプライマー対と、ｓｕｇＲ開始コドンの下流の相同組換え断片を得るための配列番号４８及び４７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｓｕｇＲ遺伝子開始コドンの上流と下流部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。このことから得られた断片を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。ｐＤＺベクターは、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを処理して、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。このような過程によりプラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）を製作した。
前記プラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）をプトレシン生産コリネバクテリウム属微生物であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献７）に電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ-ｇａｌ（５-ｂｒｏｍｏ-４-ｃｈｌｏｒｏ-３-ｉｎｄｏｌｉｎ - Ｄ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。このことから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）が導入された菌株を選抜した。
前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０-４から１０-１０まで順次希釈した後、Ｘ-ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養してコロニーを形成させた。
形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってｓｕｇＲの開始コドンがＧＴＧあるいはＴＴＧで変更された菌株及びプロモーターがＢ６に交替された菌株を最終選抜した。最終選抜された菌株を対象に配列番号４３及び４７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｓｕｇＲの開始コドンがＧＴＧあるいはＴＴＧに変更されたり、Ｂ６弱化プロモーターに転換されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）と命名した。
１−２．ＡＴＣＣ１３８６９基盤プトレシン生産菌株のｓｕｇＲ遺伝子弱化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９基盤のプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２-ａΔＮＣｇｌ１４６９（特許文献９）をＤＡＢ１２-ｂと命名し、当該菌株を基にｓｕｇＲ弱化菌株を製作した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｓｕｇＲをコードする遺伝子及びそれから発現されるタンパク質配列を確認するためには、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３及び配列番号４９のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。
Figure 0006588575
この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。
このことから得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、配列分析を行った結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｓｕｇＲをコードする遺伝子は配列番号４で記載されるポリヌクレオチド配列を含むことを確認した。このことからコードされるタンパク質の配列とコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｓｕｇＲのアミノ酸配列（配列番号１）を比較した結果、配列相同性が９９％で至ることを確認した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｓｕｇＲ開始コドンの変更及びＢ６弱化プロモーターの交替のために、前記実施例１-１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記表１及び２で記載されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｓｕｇＲ遺伝子開始コドンの上流と下流部位のＰＣＲ断片をそれぞれ増幅した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このことから得られた断片を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
ｐＤＺベクターは、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを処理し、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）用いた。このような過程によりプラスミドｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及び ｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（Ｂ６）を製作した。
前記プラスミドｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-２’ｓｕｇＲ（Ｂ６）を実施例１-１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＤＡＢ１２-ｂに形質転換して、ｓｕｇＲ開始コドンの変更及びＢ６弱化プロモーターに転換された菌株を選抜した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及び ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（Ｂ６）と命名した。
実施例２：プトレシン生産菌株におけるｇｌｔＡ強化菌株の製作
プトレシン生産菌株でクエン酸シンターゼ（citrate synthase）であるｇｌｔＡ活性の強化がプトレシン生産に及ぼす影響を確認するために、プトレシン生産菌株の染色体内のトランスポゾン遺伝子内にｇｌｔＡ遺伝子を導入した変異菌株を製造した。コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて、染色体内へ遺伝子導入を可能にする形質転換用ベクターｐＤＺＴｎ（特許文献１０）を用いた。
２−１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株におけるｇｌｔＡ強化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５０及び５１のプライマーを用いて、ｇｌｔＡ遺伝子断片を増幅した（表４）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒または１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
ｐＤＺベクターは、ｓｐｅＩを処理して、前記で得た各ＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。結果で得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ１’ｇｌｔＡと命名した。
Figure 0006588575
前記製造したプラスミドをＫＣＣＭ１１２４０Ｐに電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得して、前記形質転換体をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０-４から１０-１０まで順次希釈した後、Ｘ-ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養してコロニーを形成させた。
形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってｇｌｔＡをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選抜した。最終選抜された菌株を対象に配列番号５０及び５１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｇｌｔＡをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ::ｇｌｔＡと命名した。
２−２．ＡＴＣＣ１３８６９基盤プトレシン生産菌株におけるｇｌｔＡ強化菌株の製作
実施例１-２で用いたＤＡＢ１２-ｂを対象にｇｌｔＡ強化菌株を製作した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｇｌｔＡをコードする遺伝子及びそれから発現されるタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号５０及び５１のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。
この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このことから得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、配列分析を行った結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｇｌｔＡをコードする遺伝子は、配列番号８で記載されるポリヌクレオチド配列を含むことを確認した。このことからコードされるタンパク質の配列とコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｇｌｔＡのアミノ酸配列（配列番号５）を比較した結果、配列相同性が９９％で至ることを確認した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｇｌｔＡ強化のために、前記実施例２-１と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５０及び５１のプライマーを用いて遺伝子断片を増幅した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒または１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
ｐＤＺベクターは、ｓｐｅＩを処理して、前記で得た各ＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ２’-ｇｌｔＡと命名した。前記プラスミドｐＤＺＴｎ２’-ｇｌｔＡ を実施例２-１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＤＡＢ１２-ｂに形質転換し、ｇｌｔＡが強化された菌株を選抜した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２-ｂ Ｔｎ：ｇｌｔＡと命名した。
実施例３：プトレシン生産ｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株の製作及びそのプトレシン生産能の確認
前記実施例１-１と１-２で製作したｓｕｇＲが弱化された菌株でｇｌｔＡ遺伝子の染色体内に挿入を通じたプトレシン生産能の向上を確認するために、ｇｌｔＡをトランスポゾン遺伝子内に導入した。この時、実施例２-１と２-２で製作したベクターｐＤＺＴｎ１’-ｇｌｔＡとｐＤＺＴｎ２’-ｇｌｔＡを用いた。
具体的には、前記プラスミドｐＤＺＴｎ１’-ｇｌｔＡを実施例２-１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）に形質転換し、ｇｌｔＡが強化された菌株を製造した。前記製造されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ及び ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）Ｔｎ::ｇｌｔＡと命名し、このうちＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ（Corynebacterium glutamicum CC01-1147）を韓国微生物保存センターに２０１４年１１月２８日ＫＣＣＭ１１６１５Ｐとして国際寄託した。
また、前記プラスミドｐＤＺＴｎ２’-ｇｌｔＡを実施例２-２と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（Ｂ６）に形質転換し、ｇｌｔＡが強化された菌株を製造した。前記製造されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ：ｇｌｔＡ、 ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ：ｇｌｔＡ 及びＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（Ｂ６）Ｔｎ：ｇｌｔＡと命名した。
実施例４：プトレシン生産ｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株におけるｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例１、実施例２及び実施例３で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的には、６種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ/ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ/ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）Ｔｎ::ｇｌｔＡ/ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ：：ｇｌｔＡ/ＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ：：ｇｌｔＡ及びＤＡＢ１２-ｂ ｓｕｇＲ（Ｂ６）Ｔｎ：：ｇｌｔＡ））と２種の親菌株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ、ＤＡＢ１２-ｂ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
このことから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００ｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５%, １Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。
すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。培養後、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表５に示した。
Figure 0006588575
前記表５で示したように、非変形菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐに比較して、ｓｕｇＲが弱化されたりｇｌｔＡが強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株の場合、プトレシン生産性が３〜９％増加し、また、ｓｕｇＲが弱化されると同時にｇｌｔＡが強化された変異株の場合は、プトレシン生産性が９〜１７％さらに増加した。
また、非変形菌株ＤＡＢ１２-ｂの場合、ｓｕｇＲが弱化されたりｇｌｔＡが強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株の場合のプトレシン生産性が４〜９％増加し、また、ｓｕｇＲが弱化されると同時にｇｌｔＡが強化された変異株の場合には、プトレシン生産性が１０〜１３％より増加したことを確認した。
実施例５：プトレシン排出能が増加したプトレシン生産菌株基盤のｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株の製作及びそのプトレシン生産能の確認
５-１．プトレシン排出能が増加した菌株基盤のｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株の製作
プトレシン排出能が増加したＫＣＣＭ１１４０１Ｐ（特許文献９）菌株を基盤にｓｕｇＲ遺伝子活性の低下とｇｌｔＡ遺伝子活性の強化によってプトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、変異菌株を製作した。
具体的に、まず、前記実施例１-１で製作したｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）を、前記実施例１-１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１４０１Ｐに形質転換してｓｕｇＲ開始コドンがＴＴＧに転換されてｓｕｇＲが弱化された菌株を選抜した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）と命名した。
次に、ｇｌｔＡ遺伝子活性の強化によってプトレシン生産能が向上したかどうかを確認するために、前記製造したｓｕｇＲ遺伝子が弱化された菌株のトランスポゾン遺伝子内にｇｌｔＡ遺伝子を導入した。この時、実施例２-１で製作したベクターｐＤＺ-１’-ｇｌｔＡを用いた。
具体的には、前記実施例２-１で製作したプラスミドｐＤＺ-１’-ｇｌｔＡを実施例２-１と同様の方法で、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）に形質転換してｇｌｔＡが強化した菌株を選抜した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）Ｔｎ::ｇｌｔＡ及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）Ｔｎ::ｇｌｔＡと命名した。
５-２．プトレシン排出能が増加したプトレシン生産菌株基盤のｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株におけるｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例５-１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的には、７種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ） Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ） Ｔｎ::ｇｌｔＡ及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６） Ｔｎ::ｇｌｔＡ）と１種の親菌株（ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
このことから培養された各菌株を２５ｍＬの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００ｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５%, １Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。培養後、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表６に示した。
Figure 0006588575
前記表６で示したように、非変形菌株ＫＣＣＭ１１４０１Ｐに比較して、ｓｕｇＲが弱化されたりｇｌｔＡが強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株の場合、プトレシン生産性が２〜６％増加し、ｓｕｇＲが弱化されると同時にｇｌｔＡが強化された変異株の場合は、プトレシン生産性が９〜１５％さらに増加したことを確認した。これは前記表５の結果解釈と一致することを確認した。
実施例６．オルニチン生産菌株でｓｕｇＲ弱化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｓｕｇＲ弱化がオルニチン生産能に影響を与えるかを確認するために、実施例１-１で製作したベクターを用いて変異菌株を製作した。
実施例１-１で製作したプラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）をコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２を親菌株にして製作したＫＣＣＭ１１１３Ｐ（特許文献３）に電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を得て、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）と Ｘ-ｇａｌ（５-ｂｒｏｍｏ-４-ｃｈｌｏｒｏ-３-ｉｎｄｏｌｉｎ - Ｄ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、アガー２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。このことから形成されたコロニーの中から青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びｐＤＺ-１’ｓｕｇＲ（Ｂ６）が導入された菌株を選抜した。
前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０-４から１０-１０まで順次希釈した後、Ｘ-ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次クロス（crossover）によってｓｕｇＲの開始コドンがＧＴＧあるいはＴＴＧに変更された菌株及びプロモーターがＢ６に交替された菌株を最終選抜した。
最終選抜された菌株を対象に配列番号４３及び４７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｓｕｇＲの開始コドンがＧＴＧあるいはＴＴＧに変更されたかを確認して得られたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）と命名した。
実施例７．オルニチン生産菌株におけるｇｌｔＡ強化菌株の製作
オルニチン生産菌株でｇｌｔＡ遺伝子活性の強化がオルニチン生産能に与える影響を確認するために、前記実施例２-１で製作したベクターを用いてオルニチン生産菌株の染色体内にｇｌｔＡ遺伝子を挿入して変異菌株を製作した。
具体的には、オルニチン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３７Ｐ（特許文献３）に前記実施例２-１で製作したベクターを電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を得て、前記形質転換体をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０-４から１０-１０まで順次希釈した後、Ｘ-ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養してコロニーを形成させた。
形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次クロス（crossover）によってｇｌｔＡをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選抜した。最終選抜された菌株を対象に配列番号５０及び５１プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ｇｌｔＡをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、このように収得したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ::ｇｌｔＡと命名した。
実施例８．ｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株の製作及びそのオルニチン生産能の確認
８-１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産ｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株の製作
実施例６で製作したｓｕｇＲが弱化したＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、 ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）でｇｌｔＡ遺伝子の染色体内への挿入を通じたオルニチン生産能の向上を確認するために、ｇｌｔＡをトランスポゾン遺伝子内に導入した。この時、実施例２-１で製作したベクター ｐＤＺ-１’-ｇｌｔＡを用いた。
前記プラスミドｐＤＺ-１’-ｇｌｔＡ を実施例２-１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）に形質転換してｇｌｔＡが強化された菌株を選抜した。このことから選抜されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）Ｔｎ：：ｇｌｔＡ、 ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ） Ｔｎ：：ｇｌｔＡ 及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６） Ｔｎ：：ｇｌｔＡと命名した。
８-２．ｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化統合菌株のオルニチン生産能の評価
オルニチン生産菌株でｓｕｇＲ弱化及びｇｌｔＡ強化がオルニチン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例８-１で製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異菌株を対象にオルニチン生産能を比較した。
具体的に、７種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ）、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ）及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６）、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＧＴＧ） Ｔｎ::ｇｌｔＡ、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（ＴＴＧ） Ｔｎ::ｇｌｔＡ及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｓｕｇＲ（Ｂ６） Ｔｎ::ｇｌｔＡ）と１種の親菌株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
このことから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００ｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５%, １Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。培養後、各培養物から生産されたオルニチン濃度を測定し、その結果を下記表７に示した。
Figure 0006588575
前記表７で示したように、非変形菌株ＫＣＣＭ１１１３７Ｐに比較して、ｓｕｇＲが弱化されたりｇｌｔＡが強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株の場合、オルニチン生産性が７〜９％増加し、また、ｓｕｇＲが弱化されると同時にｇｌｔＡが強化された変異株の場合は、オルニチンの生産性が１２〜１７％さらに増加したことを確認した。
前記内容を総合すると、プトレシンまたはオルニチンを生産するコリネバクテリウム菌株において、ｓｕｇＲを弱化したり、ｇｌｔＡを強化することを介してプトレシンとオルニチンの生産量が増加することを確認しており、ｓｕｇＲを弱化すると同時にｇｌｔＡを強化する場合は、プトレシンとオルニチンの生産量がさらに増加することを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施することができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Figure 0006588575

Claims (15)

  1. 糖代謝転写調節因子（transcriptional regulator of sugar metabolism、ＳｕｇＲ）活性が内在的活性に比べて弱化され、クエン酸シンターゼ（citrate synthase、ＧｌｔＡ）活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  2. 前記糖代謝転写調節因子が、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  3. 前記クエン酸シンターゼが、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  4. 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択される、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  5. 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入されるように変異された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  6. 前記オルニチンデカルボキシラーゼが、配列番号１７のアミノ酸配列で構成される、請求項５に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  7. 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーターまたはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化されるように変異された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  8. 前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列で構成され、前記グルタミン酸エクスポーターが、配列番号１３または配列番号１５のアミノ酸配列で構成される、請求項７に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  9. 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  10. 前記アセチルγグルタミルリン酸レダクターゼが、配列番号１９または配列番号２１のアミノ酸配列で構成され、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチントランスフェラーゼが、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列で構成され、アセチルグルタミン酸キナーゼが、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列で構成され、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼが、配列番号３１または配列番号３３のアミノ酸配列で構成される、請求項９に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  11. 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性に比べて弱化されるように変異された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  12. 前記アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３５または配列番号３７のアミノ酸配列で構成される、請求項１１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  13. 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらに配列番号３９または配列番号４１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されるように変異された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
  14. （ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
    （ｉｉ）前記（ｉ）段階で培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを分離する段階を含む、プトレシンまたはオルニチン生産方法。
  15. 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１４に記載のプトレシンまたはオルニチン生産方法。
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