CN112522171A - 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒。所述工程菌包括编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列。所述含鸟氨酸溶液的处理方法包括步骤，获得含鸟氨酸溶液，所述溶液包括D‑鸟氨酸、L‑鸟氨酸；培养能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌，获得鸟氨酸脱羧酶粗酶液；酶处理，向含鸟氨酸溶液中加入鸟氨酸脱羧酶粗酶液、磷酸吡哆醛，反应生成终产物，所述终产物中包含D‑鸟氨酸和/或丁二胺。所述试剂盒包含鸟氨酸脱羧酶粗酶液。本发明提供的含鸟氨酸溶液的处理方法，将DL‑鸟氨酸转化为丁二胺、D‑鸟氨酸，二者易于分离，有助于提高产品纯度、光学纯度和收率，降低分离成本。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒。
背景技术：
鸟氨酸广泛应用于医药、食品和农药等领域。光学纯鸟氨酸衍生物发展目标是作为药物或医药中间体。L-鸟氨酸是一种重要氨基酸，在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛用途。D-鸟氨酸属于非天然氨基酸，但具有独特的生物学特性，在多肽合成中具有重要作用。将多肽中某些L-氨基酸以D-鸟氨酸取代，可以使该多肽产生特殊生物学性质，如：D-鸟氨酸可以取代脑啡肽的第二位氨基酸形成Tyr-D-Orn-Gly-PheNH2这一类似物，其生理作用是脑啡肽的数十倍。一些氨基酸类抗生素中杂入D-鸟氨酸时，难以被细菌酶降解而不至或减少抗药性产生。D-鸟氨酸及其衍生物还可用于无公害新型氨基酸农药合成，应用前景十分广阔。
随着医药工业、食品工业及多肽合成科学发展，对光学纯D型氨基酸的需求量急剧增加。其中的D-鸟氨酸，因其生产方法较少，导致生产成本较高。通过发酵法较难获得D-鸟氨酸，而化学合成法合成得到的氨基酸多为外消旋体(DL型)，必须进行拆分。通过化学方法来消旋制备D-鸟氨酸的操作流程较为复杂，通常需要强酸、强碱或者高温的环境，然而，化学拆分DL-鸟氨酸的效率并不高，产品的光学纯度较低。
因此，本领域亟需一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种工程菌、L-鸟氨酸的处理方法及试剂盒，以解决现有技术中的至少一项技术问题。
具体的，本发明的第一方面，提供了一种能够表达鸟氨酸消旋酶的工程菌，所述工程菌包括编码鸟氨酸消旋酶的核苷酸序列。
优选地，所述核苷酸序列包括如SEQ ID:NO.1所示的序列。
优选地，所述工程菌的构建方法包括步骤，
构建载体，将编码鸟氨酸消旋酶的核苷酸序列亚克隆到载体上；
载体转化，将构建好的载体转化进入表达宿主，获得工程菌菌种。
优选地，所述表达宿主为大肠杆菌，更优选地，所述表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选地，所述工程菌的构建方法包括步骤，
密码子优化，将NCBI登录号为CBH21408.1的鸟氨酸消旋酶orr的氨基酸序列进行密码子优化，获得包括SEQ ID:NO.1所示的序列。
优选地，所述编码鸟氨酸消旋酶的核苷酸序列采用全基因合成方法制备。
优选地，所述构建载体还包括步骤，
将编码鸟氨酸消旋酶的核苷酸两端设计酶切位点，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒。
优选地，所述酶切位点为NcoI和XhoI。
优选地，所述构建载体还包括步骤，
将重组质粒用氯化钙法转化进入表达宿主。
本发明的第二方面，提供了一种能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌，所述工程菌包括编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列。
优选地，所述核苷酸序列包括如SEQ ID:NO.2所示的序列。
优选地，所述工程菌的构建方法包括步骤，
构建载体，将编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列亚克隆到载体上；
载体转化，将构建好的载体转化进入表达宿主，获得工程菌菌种。
优选地，所述表达宿主为大肠杆菌，更优选地，所述表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选地，所述构建载体还包括步骤，
选取引物，所述引物序列包括如SEQ ID:NO.3，SEQ ID:NO.4所述的核苷酸序列，
复制鸟氨酸脱羧酶，通过PCR方法复制大肠杆菌MG1655上的鸟氨酸脱羧酶序列。
优选地，所述构建载体还包括步骤，
将重组质粒用氯化钙法转化进入表达宿主。
本发明的第三方面，提供了一种含鸟氨酸溶液的处理方法，所述处理方法包括步骤，
获得含鸟氨酸溶液，所述溶液包括D-鸟氨酸、L-鸟氨酸，
培养如本发明第二方面提供的工程菌，获得鸟氨酸脱羧酶粗酶液，
酶处理，向含鸟氨酸溶液中加入鸟氨酸脱羧酶粗酶液、磷酸吡哆醛(PLP)，反应生成终产物，所述终产物中包含D-鸟氨酸和/或丁二胺。
优选地，所述酶处理步骤中，PLP的添加量为0-2mM。
优选地，所述酶处理步骤中，反应条件为pH为6-8，温度25-35℃，反应时间为2-4h。更优选地，反应条件为pH7.0，温度30℃。
优选地，所述培养如本发明第二方面提供的工程菌步骤包括，
单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，25℃过夜培养；
收集粗酶液，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
优选地，所述诱导表达步骤中，37℃培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L。
优选地，所述获得含鸟氨酸溶液包括步骤，
L-鸟氨酸转化，培养如本发明第一方面提供的工程菌，利用菌体将L-鸟氨酸转化为DL- 鸟氨酸。
优选地，所述培养如本发明第一方面提供的工程菌步骤包括，
单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养2-3小时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，30℃过夜培养；
收集菌体，离心收集表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌。
优选地，所述诱导表达步骤中，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L。
优选地，所述利用菌体将L-鸟氨酸转化为DL-鸟氨酸的步骤包括，
向pH为6-8的25-100mM磷酸钾缓冲溶液中加入OD600＝7-9的菌体细胞、以及L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、100-500r/min振荡反应，
在5000-20000rpm条件下，离心1-10min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶。
优选地，所述利用菌体将L-鸟氨酸转化为DL-鸟氨酸的步骤为，
向pH为7的50mM磷酸钾缓冲溶液中加入OD600＝8的菌体细胞、以及L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、200r/min振荡反应，
在12000rpm条件下，离心5min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶。
本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含鸟氨酸脱羧酶粗酶液，
所述鸟氨酸脱羧酶粗酶液的制备方法包括步骤，
对如本发明第二方面提供的工程菌进行单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，25℃过夜培养；
收集粗酶液，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
优选地，所述诱导表达步骤中，37℃培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L。
优选地，所述试剂盒还包括PLP组分。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的能够表达鸟氨酸消旋酶的工程菌，经过密码子的优化，能再宿主菌中得到更好的表达。
2、本发明提供的能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌，能够在表达后处理获得鸟氨酸脱羧酶的粗酶液，该粗酶液对L-鸟氨酸的处理效率更高。
3、本发明提供的含鸟氨酸溶液的处理方法，将DL-鸟氨酸转化为丁二胺、D-鸟氨酸，二者易于分离，有助于提高产品纯度、光学纯度和收率，降低分离成本。
4、本发明提供的含鸟氨酸溶液的处理方法，催化活性高、分离纯化简单、原料便宜、产品附加价值高，且转化速度快、转化率高，适用于大规模工业化生产。
5、本发明提供的试剂盒，含有鸟氨酸脱羧酶粗酶液，能够更高效的处理L-鸟氨酸，使 DL-鸟氨酸的分离更为容易，同时也可以用于丁二胺的生产。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为全细胞与鸟氨酸脱羧酶粗酶液催化效果的比较图；
图2示出不同诱导温度对鸟氨酸脱羧酶粗酶液酶活的影响；
图3示出不同PLP添加量对鸟氨酸脱羧酶的影响。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1鸟氨酸消旋酶工程菌的构建
构建表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌：根据已报导的Clostridium sticklandii(ATCC12662) 来源的鸟氨酸消旋酶orr的氨基酸序列(NCBI登录号：CBH21408.1)进行密码子优化后，获得如SEQ ID:NO.1的核苷酸序列。
全基因合成该序列，两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-orr。
将构建好的重组质粒pET28a-orr用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到鸟氨酸消旋酶表达菌种E.coli BL21(DE3)/pET28a-orr。
所述重组质粒的转化步骤可以为，
S1、将LB固体培养基中加入卡那霉素(50μg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存；
S2、分别制备两个实验组，
第一组，质粒DNA组：2μl pET28a-orr质粒DNA+20μl感受态细胞悬液
第二组，空白对照组，2ul无菌水+20μl感受态细胞悬液；
S3、将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中热激45s，然后迅速冰上冷却2min；
S4、立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约30-60min，使受体菌恢复正常生长状态；
S5、用S1制得的培养基筛选转化成功的宿主细胞。
实施例2鸟氨酸脱羧酶工程菌的构建
构建表达鸟氨酸脱羧酶的基因工程菌：选取引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的鸟氨酸脱羧酶，获得含SEQ ID:NO.2的核苷酸序列。
将含SEQ ID:NO.2的核苷酸序列再与载体pET28a连接，获得重组质粒pET28a-speC。
将构建好的重组质粒pET28a-speC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到鸟氨酸消旋酶表达菌种E.coli BL21(DE3)/pET28a-speC。
所述重组质粒的转化步骤可以为，
S1、将LB固体培养基中加入卡那霉素(50μg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存；
S2、分别制备两个实验组，
第一组，质粒DNA组：2μl pET28a-speC质粒DNA+20μl感受态细胞悬液
第二组，空白对照组，2ul无菌水+20μl感受态细胞悬液；
S3、将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中热激45s，然后迅速冰上冷却2min；
S4、立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约30-60min，使受体菌恢复正常生长状态；
S5、用S1制得的培养基筛选转化成功的宿主细胞。
实施例3培养鸟氨酸脱羧酶工程菌
培养表达鸟氨酸脱羧酶基因工程菌：挑取表达鸟氨酸脱羧酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的 1％，37℃培养至OD600为0.4时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，25℃过夜培养，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
实施例4培养鸟氨酸脱羧酶工程菌
培养表达鸟氨酸脱羧酶基因工程菌：挑取表达鸟氨酸脱羧酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的 5％，37℃培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度1.2mmol/L，25℃过夜培养，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
实施例5培养鸟氨酸脱羧酶工程菌
培养表达鸟氨酸脱羧酶基因工程菌：挑取表达鸟氨酸脱羧酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的 2.5％，37℃培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，25℃过夜培养，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
实施例6DL-鸟氨酸溶液的处理方法
向含DL-鸟氨酸溶液中加入实施例5中制备的鸟氨酸脱羧酶粗酶液，控制反应条件为 pH＝6，温度25℃，反应时间为2h。
其中，本方法并不对溶液中D-鸟氨酸、L-鸟氨酸的含量或比例做限定；鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量为6g/L，即每1L的DL-鸟氨酸溶液加入6g鸟氨酸脱羧酶粗酶液。进一步，鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量可以为1-10g/L。
L-鸟氨酸全部转化为丁二胺，溶液终产物为D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例7DL-鸟氨酸溶液的处理方法
向含DL-鸟氨酸溶液中加入2mM磷酸吡哆醛(PLP)、及实施例5中制备的鸟氨酸脱羧酶粗酶液，控制反应条件为pH＝8，温度35℃，反应时间为4h。
其中，本方法并不对溶液中D-鸟氨酸、L-鸟氨酸的含量或比例做限定；鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量为6g/L，即每1L的DL-鸟氨酸溶液加入6g鸟氨酸脱羧酶粗酶液。进一步，鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量可以为1-10g/L。
L-鸟氨酸全部转化为丁二胺，溶液终产物为D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例8DL-鸟氨酸溶液的处理方法
向含DL-鸟氨酸溶液中加入1mM磷酸吡哆醛(PLP)、及实施例5中制备的鸟氨酸脱羧酶粗酶液，控制反应条件为pH＝7，温度30℃，反应时间为3h。
其中，本方法并不对溶液中D-鸟氨酸、L-鸟氨酸的含量或比例做限定；鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量为6g/L，即每1L的DL-鸟氨酸溶液加入6g鸟氨酸脱羧酶粗酶液。进一步，鸟氨酸脱羧酶粗酶液的加入量可以为1-10g/L。
L-鸟氨酸全部转化为丁二胺，溶液终产物为D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例9L-鸟氨酸溶液的处理方法
当起始原料为L-鸟氨酸溶液时，先将L-鸟氨酸消旋，获得DL-鸟氨酸。
用鸟氨酸消旋酶工程菌对L-鸟氨酸进行消旋处理，步骤为：挑取鸟氨酸消旋酶单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1％；37℃培养2小时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，30℃过夜培养；收集菌体，离心收集表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌。
向体积为14mL pH为6的25mM磷酸钾缓冲溶液中加入6mL OD600＝7的菌体细胞、以及 0.5g L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、100r/min振荡反应，在5000rpm条件下，离心1min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶，获得DL- 鸟氨酸。
按实施例6的方法处理DL-鸟氨酸，获得终产物D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例10L-鸟氨酸溶液的处理方法
当起始原料为L-鸟氨酸溶液时，先将L-鸟氨酸消旋，获得DL-鸟氨酸。
用鸟氨酸消旋酶工程菌对L-鸟氨酸进行消旋处理，步骤为：挑取鸟氨酸消旋酶单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的5％；37℃培养3小时，加入IPTG至终浓度1.2mmol/L，30℃过夜培养；收集菌体，离心收集表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌。
向体积为14mL pH为8的100mM磷酸钾缓冲溶液中加入6mL OD600＝9的菌体细胞、以及0.5g L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、500r/min振荡反应，在20000rpm条件下，离心10min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶，获得DL-鸟氨酸。
按实施例7的方法处理DL-鸟氨酸，获得终产物D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例11L-鸟氨酸溶液的处理方法
当起始原料为L-鸟氨酸溶液时，先将L-鸟氨酸消旋，获得DL-鸟氨酸。
用鸟氨酸消旋酶工程菌对L-鸟氨酸进行消旋处理，步骤为：挑取鸟氨酸消旋酶单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的2.5％；37℃培养2.5小时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃过夜培养；收集菌体，离心收集表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌。
向体积为14mL pH为7的50mM磷酸钾缓冲溶液中加入6mL OD600＝8的菌体细胞、以及0.5g L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、200r/min振荡反应，在12000rpm条件下，离心5min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶，获得 DL-鸟氨酸。
按实施例8的方法处理DL-鸟氨酸，获得终产物D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例12L-鸟氨酸溶液的处理方法
当起始原料为L-鸟氨酸溶液时，先将L-鸟氨酸消旋，获得DL-鸟氨酸。
用鸟氨酸消旋酶对L-鸟氨酸进行消旋处理，获得DL-鸟氨酸。
按实施例8的方法处理DL-鸟氨酸，获得终产物D-鸟氨酸、丁二胺。
实施例13丁二胺的制备方法
制备试剂盒，所述试剂盒包含鸟氨酸脱羧酶粗酶液、磷酸吡哆醛，所述鸟氨酸脱羧酶粗酶液按实施例5的方法制备获得。
向含L-鸟氨酸溶液中加入1mM磷酸吡哆醛、及鸟氨酸脱羧酶粗酶液，控制反应条件为 pH＝7，温度30℃，反应时间为3h，获得产物丁二胺。
鸟氨酸脱羧基生成丁二胺(也称腐胺)，后者可经处理获得精脒和精胺，这些统称为多胺类化合物。多胺是生物体内重要的代谢调控物质，是一种内源活性物质，在生理pH下，多胺呈高密度的阳性电荷，参与核酸和蛋白质合成。丁二胺也能有效地保持植物愈伤组织的胚胎发生能力，并减少愈伤组织的褐化。因此，丁二胺、亚精胺和精胺等多胺在调节生长发育、细胞的增殖及分化等各个方面具有重要的意义。同时，丁二胺也可用于生产工程塑料。
实验例1鸟氨酸脱羧酶粗酶液与全细胞拆分结果对比
在初始pH7.0的50mM磷酸钾缓冲溶液中，鸟氨酸消旋酶全细胞OD600＝8，1.5g L-鸟氨酸盐酸盐，37℃、200r/min振荡反应2h，反应结束后得到L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混旋物，然后12000rpm，离心5min，去除鸟氨酸消旋酶。
方案1：去除鸟氨酸消旋酶后，向反应体系中补加鸟氨酸脱羧酶OD600＝8的细胞，1mM PLP调节PH至7.0，继续37℃震荡反应2h，停止反应。所述鸟氨酸脱羧酶OD600＝8的细胞为实施例5中25℃过夜培养后待OD600达到8时收集的细胞。
方案2：去除鸟氨酸消旋酶后，向体系中补加鸟氨酸脱羧酶粗酶液和1mM PLP调节pH 至7.0，继续37℃震荡反应2h，停止反应。所述鸟氨酸脱羧酶粗酶液为采用实施例5的制备方法获得。
实验结果如图1所示，申请人意外的发现，采用全细胞催化的反应液内，L-鸟氨酸有较多的剩余导致D-鸟氨酸的光学纯度不高，而采用鸟氨酸脱羧酶粗酶液催化的反应液内，L- 鸟氨酸能够全部转化为丁二胺。证明鸟氨酸脱羧酶粗酶液在催化L-鸟氨酸向丁二胺的反应时，比全细胞催化的效率更高。
进一步的实验表明，市售鸟氨酸脱羧酶在与上述方案相同的条件下剩余的L-鸟氨酸为 0.6-0.9g/L，效果同样不及鸟氨酸脱羧酶粗酶液。
实验例2不同诱导温度对鸟氨酸脱羧酶粗酶液酶活的影响
挑取实施例2制备的鸟氨酸脱羧酶工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的2.5％，37℃培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，20-35℃过夜培养，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液，检测粗酶液中的鸟氨酸脱羧酶浓度。
实验结果如图2所示，在温度25-30℃范围内，鸟氨酸脱羧酶的酶活相对稳定，诱导温度为25℃时，它的酶活最高。因此，鸟氨酸脱羧酶的诱导表达最适诱导温度为25℃。
实验例3不同PLP添加量对鸟氨酸脱羧酶的影响
在体积为20mL 50mM磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中，加入4mg鸟氨酸脱羧酶粗酶液，0.5g L-鸟氨酸盐酸盐，加入终浓度分别在0-2mM设置5个PLP浓度梯度，30℃、200r/min 振荡反应0.5h，反应结束后，煮沸5min，使蛋白变性，检测丁二胺生成量。
实验结果如图3所示，在不添加PLP的情况下，鸟氨酸脱羧酶的酶活很低。然而申请人意外的发现，鸟氨酸脱羧酶的酶活并非与PLP的添加量正相关，在PLP的添加量为1mM的时候，鸟氨酸脱羧酶的酶活达到最大值，添加量过高反而会对鸟氨酸脱羧酶的酶活有不利影响。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 浙江中山化工集团股份有限公司
<120> 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒
<130> 2020
<141> 2020-12-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
atgtacccga aaatcaccat cgacatcaac aaactgcgtg acaacgctac cttcatcaaa 60
aacctgtgcg aaaaaggtgg ttgcaaaacc gctctggttg ttaaatctat gtgcgctaac 120
cacgacatcg ttaaagaact ggactctgtt gaagttgact acttcgctga ctctcgtatc 180
cagaacctga aaaaactgaa agacctgaaa accaaaaaaa tgctgctgcg tatcccgatg 240
ctgtgcgaag ttgaagacgt tgttaaatac gctgacatct ctatgaactc tgaactggac 300
accctgaaag ctctgaacaa agctgctaaa accctgaaca aagttcactc tgttatcatc 360
atggttgacc tgggtgacct gcgtgaaggt tacttcgaag ctgaagacct gaaagaaaac 420
atcaaagaaa tcatcaaact ggaaaacatc gaaatcaaag gtatcggtgt taacctgacc 480
tgctacggtg ctgttatccc gaaaaacgac aacctgtctc gtctgtgcga catcgctgac 540
gaactgcgta ccgaattcaa cctggaactg ccgatcgttt ctggtggtaa ctcttcttct 600
atctacctga tcgacaaagg tgaactgccg gaaggtatca ccaacctgcg tgttggtgaa 660
tctatgctgc tgggtcgtga aaccgcttac ggtgaagaca tcatcggtat gaacaacgac 720
gttttcgaac tgaaatgcca gatcgttgaa ctgaaagaaa aaccgtctct gccgatcggt 780
gaaatcggtg ttgacgcttt cggtaacaaa ccgtactacg aagacaaagg tatccgtaaa 840
cgtgctatcc tggctatcgg tcagcaggac accgacatct cttctctgat gccgatcgac 900
gacaaactgg aaatcctggg tgcttcttct gaccacctga tcgttgacgt ttctgactct 960
aacacctctt acaaagttgg tgacatcatc accttccgta tgggttacgg tgctctgctg 1020
aaaggtttca cctctgaata catcgaaaaa gaactgctg 1059
<210> 2
<211> 2136
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
atgaaatcaa tgaatattgc cgccagtagt gaactggtat cccgactttc ttctcatcgt 60
cgcgtggtgg cgttgggaga tactgatttt acggacgtcg cggcagtcgt cattaccgct 120
gcggatagtc gcagtggcat tcttgcgttg cttaagcgca ccggttttca tctaccggtg 180
tttttgtatt ccgaacatgc tgttgaatta cctgcgggcg ttacggcggt aatcaacggc 240
aacgagcagc agtggctgga gctggaatcc gcagcctgtc agtatgaaga gaatttgctg 300
ccaccgtttt atgacacgct gacgcagtac gttgagatgg gcaacagcac ctttgcttgc 360
cctggacatc aacatggtgc gttttttaaa aagcatcctg ccggacgcca tttttacgat 420
ttctttggtg agaacgtctt tcgcgccgat atgtgtaacg ctgacgtaaa attgggcgat 480
ctgcttattc atgaaggatc ggcgaaagat gcgcagaaat tcgcagccaa agtctttcat 540
gccgataaaa cctattttgt gctgaacggc acatcggcag cgaataaagt ggtgacgaat 600
gcgctgttaa cgcgtggcga tctggtgctc ttcgaccgta acaaccataa gtcgaatcat 660
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tttggtttca ttggcggtat tgatgcgcac tgttttaatg aagagtatct gcgccagcaa 780
attcgcgacg ttgcgccaga aaaagccgac ctgccgcgcc cgtatcgcct ggcgattatt 840
cagctgggaa cctatgacgg cactgtctat aacgcccgtc aggtgatcga taccgttggg 900
catctgtgtg attacattct gtttgattcc gcgtgggtcg gttatgaaca atttatcccg 960
atgatggcgg atagctcgcc gctgctgtta gaacttaacg aaaacgatcc ggggatcttt 1020
gtgactcagt cggtgcacaa acagcaggcg ggattctcac agacgtcgca gatccataaa 1080
aaagataacc atatccgcgg acaggcgcgt ttttgcccgc ataagcggtt gaataacgcc 1140
tttatgctcc atgcttctac cagccctttc tatccgctgt ttgctgcact ggatgttaac 1200
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attgaagcgc gcaaggctat tcttgcgcgc tgtaagctgt tccgcccgtt tatcccgccc 1320
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tattttgttg atccgtgcaa gctgttactc actacaccag gtatcgatgc cgaaaccggc 1500
gaatatagcg actttggcgt tccggcgacg attctggcgc actatctgcg tgagaacggc 1560
attgtgccgg agaagtgcga tctcaactcc attctgtttt tattaactcc ggcggaaagc 1620
cacgagaagc tggcacaact ggtggcgatg ctggcgcaat ttgaacagca tattgaggat 1680
gactcgccgc tggttgaggt gttgccgagc gtttataaca agtatccggt gcgctatcgc 1740
gactacaccc tgcgccagtt gtgtcaggag atgcacgatc tgtatgtcag tttcgacgtc 1800
aaagacctac aaaaagcgat gttccgccag cagagtttcc cgtcagtggt gatgaacccc 1860
caggatgcgc atagcgctta tattcgcggt gacgtggagt tggtgcggat tcgtgatgcc 1920
gaagggcgaa ttgcggcaga aggggcgttg ccttatccac ctggcgtgct ttgcgtggta 1980
cccggggaag tctggggtgg ggcggttcaa cgttatttcc ttgcactgga agaaggggtg 2040
aatttgttgc cgggattttc gccggagctg caaggtgttt atagcgaaac cgatgcggat 2100
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<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
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Claims (10)
1.一种能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列，其中，所述工程菌的构建方法包括步骤，
构建载体，将编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列亚克隆到载体上；
载体转化，将构建好的载体转化进入表达宿主，获得工程菌菌种。
2.根据权利要求1所述的能够表达鸟氨酸脱羧酶的工程菌，其特征在于，所述构建载体还包括步骤，
选取引物，所述引物序列包括如SEQ ID:NO.3，SEQ ID:NO.4所述的核苷酸序列，
复制鸟氨酸脱羧酶，通过PCR方法复制大肠杆菌MG1655上的鸟氨酸脱羧酶序列。
3.一种含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，所述处理方法包括步骤，
获得含鸟氨酸溶液，所述溶液包括D-鸟氨酸、L鸟氨酸，
培养如权利要求1或2所述的工程菌，获得鸟氨酸脱羧酶粗酶液，
酶处理，向含鸟氨酸溶液中加入鸟氨酸脱羧酶粗酶液、磷酸吡哆醛，反应生成终产物，所述终产物中包含D-鸟氨酸和/或丁二胺。
4.根据权利要求3所述的含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，培养如权利要求1或2所述工程菌的步骤包括，
单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，25℃过夜培养；
收集粗酶液，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
5.根据权利要求4所述的含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，所述诱导表达步骤中，37℃培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L。
6.根据权利要求3-5任一项所述的含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，所述获得含鸟氨酸溶液包括步骤，
构建能够表达鸟氨酸消旋酶的工程菌，所述工程菌包括SEQ ID:NO.1的核苷酸序列，
L-鸟氨酸转化，培养所述能够表达鸟氨酸消旋酶的工程菌，利用菌体将L-鸟氨酸转化为DL-鸟氨酸。
7.根据权利要求6所述的含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，所述培养能够表达鸟氨酸消旋酶的工程菌的步骤包括，
单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养2-3小时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，30℃过夜培养；
收集菌体，离心收集表达鸟氨酸消旋酶的基因工程菌。
8.根据权利要求6所述的含鸟氨酸溶液的处理方法，其特征在于，所述利用菌体将L-鸟氨酸转化为DL-鸟氨酸的步骤包括，
向pH为6-8的25-100mM磷酸钾缓冲溶液中加入OD600＝7-9的菌体细胞、以及L-鸟氨酸或其盐酸盐，反应温度为37℃、100-500r/min振荡反应，
在5000-20000rpm条件下，离心1-10min去除鸟氨酸消旋酶菌体细胞，上清液煮沸，灭活残留的鸟氨酸消旋酶。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含鸟氨酸脱羧酶粗酶液，
所述鸟氨酸脱羧酶粗酶液的制备方法包括步骤，
对如权利要求1或2所述的工程菌进行单菌落培养，挑取单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5％；
诱导表达，37℃培养至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.8-1.2mmol/L，25℃过夜培养；
收集粗酶液，离心收集菌体并破碎，得到鸟氨酸脱羧酶的粗酶液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磷酸吡哆醛组分。
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