CN117551595A - 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。本发明通过质粒表达全局转录调控因子筛选出发酵效果较好的IhfAB和cra；对IhfAB和cra第二密码子进行优化，并使用质粒表达进一步的验证优化结果，分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)改造后的发酵菌株在摇瓶发酵中生产D‑泛酸的水平相比于出发菌Dpan16S携带未改造质粒摇瓶发酵水平从2.49g/L提高到3.17g/L，整合宿主因子(ihfAB)经过优化的质粒摇瓶发酵较于未经过改造的质粒摇瓶发酵水平从3.46g/L提高至3.78g/L；随后将优化后cra和IhfAB导入到Dpan16S基因组中，经过摇瓶发酵验证后进一步的将D‑泛酸产量由3.82g/L提升至4.13g/L和4.05g/L，证明本发明提供的重组大肠杆菌具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
D-泛酸(D-PA)是一种广泛存在植物和微生物中的水溶性的维生素。由于其作为酰基载体蛋白和辅酶A的重要前体物质被广泛使用在化妆品、食品和饲料领域等。随着相关产业的不断发展，对于D-泛酸的需求也在不断扩大，这使得D-泛酸越来越受到关注。
D-泛酸目前的生产方法主要有三种：酶催化法、生物合成法以及化学合成法。化学合成法目前依然是生产D-泛酸最主要的方法，但是该方法在合成过程中利用D-泛内酯和β-丙氨酸缩合而成，但是D-泛内酯的合成需要使用到剧毒物质氢氰酸和氰化钠。D-泛酸的微生物合成法利用的是D-泛内酯和β-丙氨酸在生物体中的缩合反应产生的。其中，β-丙氨酸作为天冬氨酸家族氨基酸的衍生物由panD编码天冬氨酸1-脱羧酶直接从天冬氨酸合成。D-泛内酯由丙酮酸开始经过乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、α-酮异戊酸羟甲基转移酶和泛酸还原酶反应催化产生。相对于酶催化法和化学合成法，生物合成法合成简单、环保等优点已经越来越受到重视，发展的规模呈逐年上升趋势。
大肠杆菌作为一种工业微生物具有遗传背景清晰、操作简单等优势是生产D-泛酸的理想底盘。尽管目前已经进行了各种努力来增加微生物中D-泛酸生物合成途径的代谢通量。然而，由于D-泛酸生物合成途径的复杂性和严格的控制，较低的产量和生产率仍然是D-泛酸微生物发酵生产的缺陷，这直接降低了微生物发酵合成D-泛酸的市场竞争力。因此，寻找一种提高D-泛酸产量的方法、构建一株高产的D-泛酸菌株仍是一大挑战。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中微生物发酵生产D-泛酸存在较低的产量的问题，提供了一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产D-泛酸中，以克服上述问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种高产D-泛酸的基因工程菌的构建方法，其构建方法包括以下步骤：
(1)以菌株E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavcA/ilvE*/CoaA*/ΔpoxB/Δpta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI为底盘菌，敲除其基因组中的基因ptsG，并在此基因位点过表达基因galP和glK，得到工程菌E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavcA/ilvE*/CoaA*/ΔpoxB/Δpta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI/ΔptsG::Trc-glk-galP，记为Dpan16S；
(2)将由Trc启动子控制的基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)或/和基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)整合至工程菌Dpan16S基因组上，从而得到所述高产D-泛酸的基因工程菌。
近年来，转录工程方法已被应用于菌株优化，这使得工程过程在全球范围内和系统水平上进行，通过多种转录因子(TFs)对代谢网络进行全局调控是原核生物通过改变相关基因表达来响应细胞内扰动的复杂机制之一。作为基因表达调控的重要组成部分，TFs的修饰可引起相关代谢途径中碳通量的变化、改善转录后mRNA的稳定性、调节菌株应激反应、改善菌株生物膜的稳定性等功能。菌株在转录翻译的过程中存在密码子的偏好性，在翻译的过程中每一种氨基酸都会有出现频率最高的密码子，例如编码分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)的第二密码子的Lys(AAA)出现的频率低于Lys(AAG)。并且在基因翻译的过程中一位置上表现为某一氨基酸的频率也是有其相应概率，这种现象尤其出现在起始密码子后的第二密码子的位置上。例如出现在第二密码子的位置上的Ser(AGT)和Ala(GCC)在编码蛋白质的20种氨基酸中为最高频率。研究表明第二密码会影响翻译的效率，具体文献参考：靳艳婷.密码子第二位核苷酸与蛋白质功能及翻译的关联研究[D].Liang G,Mengya Q,Cong G,et al.Engineering microbial cell viability for enhancing chemical productionby second codon engineering[J].Metabolic Engineering,2022,73.。因此对第二密码子的位置更换可以有效改善翻译的效率并且会影响酶的表达。
目前，还未有利用全局转录因子(TFs)策略和第二密码子工程策略相结合的方式来改善D-泛酸的生产的资料与研究，因此，通过这两种策略相结合的方式改善D-泛酸菌株的生产性能，将会具有很大的应用价值。
底盘菌E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavcA/ilvE*/CoaA*/Δpox B/Δpta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI已在专利CN117004541A中公开，(菌株保藏在浙江工业大学生物工程学院合成生物技术研究所菌种库)，由于PTS途径中葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)在转运葡萄糖的过程中会利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)中的磷酸基团，使葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。近50％的PEP被消耗用于PEP转化为G6P参考文献：A B H,A K P L M,Arturo Sánchez b,et al.Improvement of hydrogen productionby metabolic engineering of Escherichia coli:Modification on both the PTSsystem and central carbon metabolism-ScienceDirect[J].International Journalof Hydrogen Energy,2020,45(9):5687-5696，这会造成D-泛酸生产过程中由于丙酮酸(PYR)供应不足导致的代谢流减弱致D-泛酸产量的降低。因此利用CRI SPR-Cas9系统敲除磷酸转移酶系统(PTS)中ptsG基因，并在此基因位点过表达不消耗PEP的半乳糖渗透酶/葡萄糖激酶(galP/glK)(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2/3所示)系统来取代除磷酸转移酶系统(PTS)对于葡萄糖的转运，具体相关文献可参考：Fujiwara R,Nakan o M,Hirata Y,etal.G6P-capturing molecules in the periplasm of Escherichia coli accelera tethe shikimate pathway[J].Metabolic engineering,2022,72:68-81，得到菌株DPan16S并以此为出发菌株，利用第二密码子工程对全局调控因子进行优化改造改善了一株生产D-泛酸菌株的生产性能，并提高了D-泛酸产量的基因工程菌。
通过在申请人先前构建的大肠杆菌Dpan16S中使用表达质粒Ptrc99A(Addgene公司购买所得，产品编号为VT294)过表达环状受体蛋白cAMP(crp)、分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)、亮氨酸反应性调节蛋白(lrp)、丙酮酸脱氢复合物(pdhR)、脂肪酸代谢调节蛋白(fadR)、HTH型转录抑制剂(FabR)、低氧诱导因子(arcA)、RNA聚合酶西格玛因子σS(rpoS)、家族转录调节因子(icIR)、DNA结合转录激活剂(narl)、整合宿主因子(ihfAB)。通过摇瓶发酵结果筛选出相对效果的分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)和整合宿主因子(ihfAB)(结果见实施例1)并且对其进行第二密码子优化。根据文献报道通过对基因cra的适当的点突变可以增强果糖-1，6-二磷酸(FBP)的亲和力可能有助于琥珀酸生物合成，具体参考文献：Wei,LN.,Zhu,LW.&Tang,YJ.Succinate production positively correlates with theaffinity of the global transcription factor Cra for its effector FBP inEscherichia coli.Biotechnol Biofuels 9,264(2016)。这对三羧酸循环(TCA)的加强的至关重要，D-泛酸生产过程中需要加强TCA循环使其可以增加D-泛酸前体物质β-丙氨酸的供应有利于D-泛酸的生产。最后，通过以上改造策略的组合，本发明成功地获得了高产D-泛酸的重组大肠杆菌菌株。
作为优选，所述基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)是通过对基因cra先进行第二密码子优化，然后进行Asp101Arg、Asp148Arg、Gly274Arg点突变而得到。
作为优选，所述基因cra的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为优选，所述基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)整合至工程菌Dpan16S基因组中的假基因glvG位点。
作为优选，所述基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)是通过对基因ihfAB进行第二密码子优化而得到。
作为优选，所述基因ihfAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
作为优选，所述基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)整合至工程菌Dpan16S基因组中的假基因prfH位点。
作为优选，所述Trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
此外，编码环状受体蛋白cAMP基因crp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码亮氨酸反应性调节蛋白基因lrp的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码丙酮酸脱氢复合物基因pdhR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码脂肪酸代谢调节蛋白基因fadR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码HTH型转录抑制剂基因fabR的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码低氧诱导因子基因arcA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码RNA聚合酶西格玛因子σS基因rpoS的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码家族转录调节因子基因icIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码DNA结合转录激活剂基因narl的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，假基因glvG的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，假基因prfH的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
第二方面，本发明提供了一种高产D-泛酸的基因工程菌，由所述的构建方法所构建得到。
第三方面，本发明提供了所述的构建方法所构建得到的工程菌或者所述的工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
以1％的接种量将种子培养液接种至500mL摇瓶50mL装液量发酵培养，使用10g/LCaCO3调节发酵液pH，每50mL发酵培养基外源添加0.13gβ-丙氨酸。在30℃、180-220rpm条件下发酵培养48h，将培养液利用无菌滤膜过滤进行分离纯化，获得D-泛酸。其中，发酵过程中添加到发酵培养基中的异亮氨酸浓度为40g/L,β-丙氨酸(250g/L)。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种利用代谢工程改造得到的高产D-泛酸的重组大肠杆菌，经过改造后的重组大肠杆菌相比于出发菌株能够更好的利用以葡萄糖为碳源物质进行D-泛酸生产，并且生长能力更好，产量更高。经过对分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)改造后的质粒发酵菌株在摇瓶发酵中生产D-泛酸的水平相比于出发菌Dpan16S携带未改造质粒摇瓶发酵水平从2.49g/L提高到3.17g/L，整合宿主因子(ihfAB)经过优化的质粒摇瓶发酵较于未经过改造的质粒摇瓶发酵水平从3.46g/L提高至3.78g/L。随后分别将经过第二密码子优化后的转录调控因子代谢阻遏剂/活化剂(cra)的第二密码子由2Lys(AAA)替换2Ser(AGT)并在和整合宿主因子(ihfAB)的ihfA的第二密码子由2Ala(GCG)分别替换为2Ser(AGT)导入到Dpan16S基因组中，经过摇瓶发酵验证后进一步的将D-泛酸产量由3.82g/L提升至4.13g/L和4.05g/L，证明本发明提供的重组大肠杆菌具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为实施例1中全局转录因子(TFS)摇瓶发酵情况。
图2为实施例2中基因cra第二密码子优化摇瓶发酵情况。
图3为实施例3中基因cra点突变摇床发酵情况。
图4为实施例4中基因IhfAB的IhfA亚基第二密码子优化摇床发酵情况。
图5为实施例4中基因IhfAB的IhfB亚基第二密码子优化摇床发酵情况。
图6为实施例5中的摇床发酵情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
LB培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCL10 g/L、LB固体培养基添加琼脂粉为20g/L。
摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖、16g/L(NH4)2SO4、1g/L KH2PO4、2g/L酵母粉、0.5g/LMgSO4、1mL/L盐溶液、10g/L CaCO3，115℃灭菌30分钟，其中CaCO3需要单独灭菌。
盐溶液：0.02g/LNiCl2·7H2O、10g/L CuCl2、10g/LFeSO4·7H2O、10g/L CuSO4、10g/LZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4。
抗生素：卡那霉素工作浓度(50mg/L)、大观霉素(50mg/L)。
D-泛酸摇瓶发酵方法：
(1)发酵菌株种子液培养
将重组菌株划线于LB固体培养基，37℃培养12-16h。平板单菌落接种于LB液体培养基，于37℃、200r/min培养12-14h，获得种子液。
(2)摇瓶发酵培养
向50ml发酵培养基中加入2％种子液接种量(1ml),并加入β-丙氨酸(250g/L)，VB12(0.2mg/L)，VB1(0.5mg/L)，根据需要加入异亮氨酸(0.04g/L)，30℃，180rpm培养48h。
(3)D-泛酸检测方法
利用高效液相色谱(HPLC)检测D-泛酸。检测条件：色谱柱J&K C 18-H(250×4.6mm,5μm)，流动相50mL乙腈、950uL磷酸用超纯水定容到1L(无梯度)，流速0.9mL/min，进样量10μL，柱温30℃，检测波长200nm，检测时长18min。
PCR扩增体系：
| Components | Volumes |
| 2×Phanta Max Buffer | 25μL |
| dNTP Mix | 1μL |
| Primer 1 | 1μL |
| Primer 2 | 1μL |
| Phanta Max | 1μL |
| Template(pTarget gene) | 1μL |
| ddH2O | Up to50μL |
融合PCR体系：
| Components | Volumes |
| 2×Phanta Max Buffer | 25μL |
| dNTP Mix | 1μL |
| Primer F1 | 1μL |
| Primer R2 | 1μL |
| Phanta Max | 1μL |
| Template1(Target gene) | 1μL |
| Template2(Donor DNA) | 各1μL |
| ddH2O | Up to50μL |
菌落PCR体系：
| Components | Volumes |
| T5 Super PCR Mix | 5μL |
| Template(single clone) | 1μL |
| Primer VF/VR | 各1μL |
| dd H2O | Up to10μL |
一步克隆的体系：
| Components | Volumes |
| 5×Exase Ⅰ Buffer | 2μL |
| Exase Ⅰ | 1μL |
| Linearized plasmid | XμL |
| DNA fragments | YμL |
| ddH2O | Up to10μL |
DNA的纯化：
取PCR扩增产物，加入3倍体积的Buffer PCRA(不足100μL，补足100μL)，混匀。将混匀溶液转移至制备管中，室温12000rpm离心1min，弃滤液。加入700μL的Buffer W2，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复此步骤一次。室温12000rpm空甩离心2min，取出制备管，打开制备管盖，室温放置2～5min。加入40μL预热(50-65℃)的超纯水，室温放置2～5min，12000rpm离心1min。收集液用核酸微量测定仪测定DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。
质粒提取：
取2mL过夜培养12-14h的菌液至EP管中(可根据菌体浓度调整取样量)，室温12000rpm离心1min，弃上清，于沉淀中加入250μL的Buffer S1悬浮细胞，再加入250μL的Buffer S2，温和充分翻转4～6次，使菌体充分裂解(此步不宜超过5min)；然后加入350μL的Buffer S3，温和充分翻转6～8次，室温12000rpm离心10min。吸取上清液至制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500μL的Buffer W1，室温12000rpm离心1min，弃滤液；加入600μL的Buffer W2，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复该步骤1次；室温12000rpm空甩离心2min，打开制备管管盖，室温放置2～5min。将制备管放入1.5mL离心管中，加入40μL预热(50-65℃)的超纯水，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，使用核酸微量测定仪测定质粒浓度和纯度，-20℃保存备用。
感受态细胞制备：
(1)化学转化感受态细胞制备
取划线平板，从中挑取单菌落，接种到10mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。然后取过夜培养菌液转接(1％接种量)于50mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD6000.4～0.6。于超净台中将菌液转移至50mL的无菌离心管中，4℃，5500rpm离心8min，于超净台中弃上清。然后加入适量预冷的无菌CaCl2溶液(0.1M)，小心轻柔地吹打管壁上的菌体使其悬浮，立即至于冰上冰浴30min；然后，4℃，5500rpm离心5min收集菌体，超净台中弃上清。根据菌体量加入适量的预冷的无菌CaCl2甘油溶液(0.1M CaCl2，15％甘油)重悬细胞，于冰上每管100μL分装，立即使用或-80℃保存备用。
(2)高压电穿孔法感受态细胞制备
取划线平板，从中挑取单菌落(含pCas质粒)，接种到10mL的LB培养基中，并加入10μL的Kan和100μL的阿拉伯糖，30℃，180rpm过夜培养。取过夜培养菌液转接于10mL的LB培养基中，并加入10μL的Kan和100μL的阿拉伯糖，30℃，180rpm培养至OD6000.8～1.0。将菌液转移至2mL的无菌离心管中，4℃，5500rpm离心2min，超净台中弃上清。然后加入预冷的无菌水，轻柔地吹打管壁上的菌体使其悬浮，4℃，5500rpm离心2min，弃上清，重复此步骤2次。加入适量的预冷的10％的无菌甘油溶液重悬细胞，4℃，5500rpm离心2min，于超净台中弃上清。根据菌体量加入适量的10％的无菌甘油溶液重悬细胞，于冰上每管100μL分装，-80℃保存备用。
质粒的转化：
(1)化学转化法
取感受态细胞至于冰上，自然融化后，加入3～4μL的质粒，轻柔混匀，至于冰上冰浴30min。然后，取冰浴后的混合物，于42℃水浴中，热激90s，并立即至于冰上冰浴2～5min。再加入700μL LB培养基，于37℃，180rpm摇床中培养45～60min。取适量的培养物涂布于LB平板上(抗性与质粒抗性相同)，将平板置于37℃培养箱，倒置培养过夜。
(2)高压电穿孔法感受态转化法
制备带pCas质粒(图2-4)菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL的pTarget-X-dg(敲除载体)或2μL的pTarget-Y(敲除表达载体)，轻柔混匀，冰浴1min；将混合液移至预冷的2mm的电击杯中，冰浴45s。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，放入电转仪，使用Eco 2档电击(此步骤需迅速完成)。在超净台中向电击杯凹槽中加入0.5mL预冷的LB液体培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中(此步骤需迅速完成)。30℃，180rpm复苏2.5h以上；然后取200μL涂布于LB固体培养基(SD+Kan抗性)，30℃培养过夜。
大肠杆菌出发菌株Dpan16S的代谢改造
为了减少对PEP的消耗需要敲除Dpan15基因组PTS途径中葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)，并使用Trc控制的过表达galP-glK系统来取代PTS途径对于葡萄糖的转运。
表达质粒Ptrc99a-galP-glK的构建
以空质粒Ptrc99a为模板，使用引物PtrcF/R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物galp-F/R、glK-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-galP-glK质粒。使用引物Trc-F/R，模板为Ptrc99a-galP-glK质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的galp-glK表达框目的片段。
ptsG敲除载的构建
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-ptsG-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ptsG基因上下游序列，使用引物ptsG-up-F/R、ptsG-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因ptsG的sgRNA的pTarget-ΔptsG突变载体。
(3)ptsG基因组的敲除
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan15菌株基因组中ptsG基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan15制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔptsG载体和Trc控制下的galp-glK表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan15菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物ptsG-out-F/R进行菌落PCR验证确认ptsG基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔptsG载体。然后将已经去除pTarget-ΔptsG载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S。CRISPR/Cas9系统其构建过程与原理可参考文献：Zhao,D.,Yuan,S.,Xiong,B.et al.Development of a fast and easy methodfor Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact 15,205(2016)。其中，在出发菌株Dpan16S的代谢改造过程中所用引物序列如表1所示。
表1引物序列列表
实施例1全局转录因子(TFS)的筛选
以空质粒Ptrc99a为模板，使用引物ptr-crp-F/R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物Crp-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-Crp质粒。同理分别使用以下引物(如表2所示)按照以上构建Ptrc99a-Crp质粒的步骤得到：Ptrc99a-narL、Ptrc99a-IhfAB、Ptrc99a-IcIR、Ptrc99a-rpoS、Ptrc99a-LrP、Ptrc99a-pdhR、Ptrc99a-fabR、Ptrc99a-cra、Ptrc99a-fadR、Ptrc99a-arcA。其中，本实施例所用引物序列如表2所示。
表2实施例1所用引物序列列表
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图1所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
根据图1所示的摇床发酵结果可知，通过质粒表达11个全局转录调控因子，相对于对照组Dpan16S和在此菌株的基础上携带空载体质粒，筛选出发酵效果较好的IhfAB和cra，并以这两个转录因子为研究对象进行第二密码子优化。
实施例2分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)第二密码子优化以质粒Ptrc99a-cra为模板，使用引物pcra-Lys-R/ptr-fruR-F按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物cra-Lys-F/fruR-R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的第二密码子为Lys的Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)质粒。同理分别使用以下引物(实施例2所用引物序列列表)按照以上构建Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)质粒的步骤得到：第二密码子为Ser的Ptrc99a-cra(2SerAAA2AGT)、第二密码子为Ala的Ptrc99a-cra(2AlaAAA2GCC)。其中，本实施例所用引物序列如表3所示。
表3实施例2所用引物序列列表
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对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图2所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
对cra第二密码子分别替换为Lys、Ser、Ala替换，并与未进行替换的cra菌株摇床发酵对比，发酵结果表明相对于对照组cra第二密码子同义替换为Lys的D-泛酸产量提升最高，较于对照组2.01g/L提升到3.18g/L，结果表明替换第二密码子可以有效提升D-泛酸的生产。并在此基础上进行cra点突变进一步提升菌株生产D-泛酸能力。
实施例3Ptrc99a-cra(Lys)质粒的(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)点突变由于分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)第二密码子优化得到的摇瓶发酵结果可知Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)较于其他的优化结果更好,因此在此基础上进行点突变进一步改善分解代谢阻遏剂/活化剂(cra)的性能。具体参考文献：Wei,LN.,Zhu,LW.&Tang,YJ.Succinateproduction positively correlates with the affinity of the globaltranscription factor Cra for its effector FBP in Escherichia coli.BiotechnolBiofuels 9,264(2016)。
以质粒Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)为模板，使用引物T-cra-F1/Tcra-R1按照PCR扩增体系进行扩增得到线性化的质粒；进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。由于得到的DNA为线性化质粒，可以进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的第二密码子为Lys的Ptrc99a-cra(Asp101Arg)质粒；以质粒Ptrc99a-cra(Asp101Arg)为模板，使用引物T-cra-F2/Tcra-R2按照PCR扩增体系进行扩增得到线性化的质粒；进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。由于得到的DNA为线性化质粒，可以进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-cra(Asp101Arg,Asp148Arg)；以质粒Ptrc99a-cra(Asp101Arg,Asp148Arg)为模板，使用引物T-cra-F3/Tcra-R3按照PCR扩增体系进行扩增得到线性化的质粒；进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。由于得到的DNA为线性化质粒，可以进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)。其中，本实施例所用引物序列如表4所示。
表4实施例3所用引物序列列表
| 名称 | 引物序列(5'→3') |
| T-cra-F1 | TCAGAAAGGCAGCCAGACAA |
| Tcra-R1 | TGTCTGGCTGCCTTTCTGAGCAGGCAATCAGCAGTTGATA |
| Tcra-F2 | CGCGCTGAGGCGCGCCCTCGATCGTGAACACTTCACCAGC |
| Tcra-R2 | GAGGGCGCGCCTCAGCGCGACAATCGGGAACGGGTCGTTA |
| Tcra-F3 | CACCTTTAGGGATAACGAACTGCTCGACTTCTTACAGTGT |
| Tcra-R3 | GTTCGTTATCCCTAAAGGTG |
| 99A-F | TTGCGCCGACATCATAAC |
| 99A-R | CTGCGTTCTGATTTAATCTG |
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图3所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
对于对cra第二密码子分别替换为Lys同义的质粒基础上，进一步进行三点突变cra(Asp101ArgAsp148ArgGly274Arg)得到三株菌株，来进一步改善大肠杆菌三羧酸循环(TCA)，摇床发酵结果表明逐步进行三点的突变，发酵结果表明cra(Asp101ArgAsp148ArgGly274Arg)＞cra(Asp101ArgA)＞cra(Asp101ArgAsp148Arg)。
实施例4整合宿主因子(ihfAB)第二密码子优化
(1)ihfA第二密码子的优化
以质粒Ptrc99a-ihfAB为模板，使用引物ihfA-ala-F/ihfA-R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使为模板Ptrc99a-ihfAB，分别使用引物ihfB-F/pihfA-ala-R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的第二密码子为Ala的Ptrc99a-InfAB(InfA2AlaGCG2GCC)质粒。同理分别使用以下引物(如表5所示)按照以上构建Ptrc99a-ihfA(Ala)质粒的步骤得到：第二密码子为Ser的Ptrc99a-InfAB(InfA2SerGCG2AGT)。
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图4所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
由于IhfAB含有IhfA和IhfB两种亚基，对IhfA的第二密码子替换为Ser和Ala并于与未进行替换的IhfAB菌株摇床发酵对比，结果表明对IhfA的第二密码子替换为的摇床发酵结果较好，较于对照组的3.46g/L提升为3.78g/L。并在IhfA的第2密码子替换为Ser的基础上进行IhfB第二密码子的优化。
(2)ihfB第二密码子的优化
由于对由于整合宿主因子(ihfAB)的ihfA进行第二密码子优化得到的摇瓶发酵结果可知Ptrc99a-InfAB(InfA2SerACC2AGT)较于其他的优化结果更好,因此在此基础上进行整合宿主因子(ihfAB)的ihfB进行第二密码子优化。
以质粒以质粒Ptrc99a-InfAB(InfA2SerGCG2AGT)为模板，使用引物ihfA-R/ptr-ihfAB-F按照PCR扩增体系进行扩增；同理使为模板Ptrc99a-ihfAB，分别使用引物ihfB-ser-F/ihfB-R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的第二密码子为Ser的Ptrc99a-InfAB(InfB2SerGCG2AGT)质粒。同理分别使用以下引物(实施例4所用引物序列列表)使用引物infB-ala-F/ihfB-R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使为模板Ptrc99a-InfAB(InfA2SerGCG2AGT)，分别使用引物ptr-ihfAB-F/ptr-ihfAB-F按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的第二密码子为Ala的Ptrc99a-InfAB(InfB2AlaACC2GCC)质粒。其中，本实施例所用引物序列如表5所示。
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图5所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
对IhfB的第二密码子替换为Ser和Ala并于与IhfA的第二密码子替换为Ser对比，结果表明对IhfB的第二密码子替换为Ser和Ala的摇床发酵结果较于对照组的3.78g/L，效果并不显著，表明对其进行优化并未改善大肠杆菌D-泛酸的生产。
表5实施例4所用引物序列列表
实施例5Dpan16S基因组编辑
glvG基因的敲除载体的构建及Trc控制下的优化后的分解代谢(阻遏剂/活化剂)cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)。以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-glvG-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的glvG基因上下游序列，使用引物glvG-up-F/R、glvG-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因glvG的sgRNA的pTarget-ΔglvG突变载体。使用引物Trc-F/R使用模板Ptrc99a-cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)表达框目的片段。
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S菌株基因组中glvG基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔglvG载体和Trc控制下的cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物glvG-out-F/R进行菌落PCR验证确认glvG基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔglvG载体。然后将已经去除pTarget-ΔglvG载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体，得到DPAS2-25。
prfH基因的敲除载体的构建使用引物P1k-prfH-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的prfH基因上下游序列，使用引物prfH-up-F/R、prfH-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因prfH的sgRNA的pTarget-ΔprfH突变载体。使用引物Trc-F/R，使用模板为Ptrc99a-InfAB(InfA2SerGCG2AGT)质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的InfAB(InfA2SerGCG2AGT)。
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S菌株基因组中prfH基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔprfH载体和Trc控制下的Trc-ihfA(Ala)表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物prfH-out-F/R进行菌落PCR验证确认prfH基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔprfH载体。然后将已经去除pTarget-ΔprfH载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。其中，本实施例所使用引物如表6和表7所示。
表6实施例5所用引物序列列表
表7实施例5所用引物序列列表
| 名称 | 引物序列(5'→3') |
| P1k-prfH-F | GTAGTCAGCATGCTAACAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| P1k-prfH-R | CTTGTTAGCATGCTGACTACACTAGTATTATACCTAGGAC |
| prfH-up-F | CCTGGATTCGTCTGCCATTT |
| prfH-up-R | GCCGGATGATTAATTGTCAACGTTACCGCGACGTCTTG |
| prfH-down-F | TGAAGGATGAAACTGCCGGA |
| prfH-down-R | AAGACTACGTGGTGAGCATG |
| P2k-prfH-F | CATGCTCACCACGTAGTCTTCTGCAGAAGCTTAGATCTAT |
| P2k-prfH-R | AAATGGCAGACGAATCCAGGTCTAGAGAATTCAAAAAAAGCA |
| Trc-F | TTGACAATTAATCATCCGGC |
| Trc-R | ATTTGTCCTACTCAGGAGAG |
| prfH-out-F | AATGAAAATAACGCCCGCCT |
| prfH-out-R | CTCGCGATACCTTTATTCGT |
| Target-F | GGCCTTTTGCTCACATGTTC |
| Target-R | TATCACTGTGTGGCTTCAGG |
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，发酵结果如图6所示，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。
分别对DPan16S、DPAS2-25和DPAS2-26经过摇瓶发酵D-泛酸产量从3.82g/L分别提升到4.13g/L和4.05g/L，结果表明对对全局转录调控因子进行第二密码子优化可以提高大肠杆菌对于D-泛酸的生产，对于工业化D-泛酸生产菌株的改造具有一定的参考价值。
以上实施例中各改造得到的菌株及其对应的基因型如下表8所示：
表8菌株基因型附表
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Claims (10)
1.一种高产D-泛酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：
(1)以菌株E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavcA/ilvE*/CoaA*/ΔpoxB/Δpta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI为底盘菌，敲除其基因组中的基因ptsG，并在此基因位点过表达基因galP和glK，得到工程菌E.coliW3110Trc-pan C/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavcA/ilvE*/CoaA*/ΔpoxB/Δpta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI/ΔptsG::Trc-glk-galP，记为Dpan16S；
(2)将由Trc启动子控制的基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)或/和基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)整合至工程菌Dpan16S基因组上，从而得到所述高产D-泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)是通过对基因cra先进行第二密码子优化，然后进行Asp101Arg、Asp148Arg、Gly274Arg点突变而得到。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因cra的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
4.如权利要求1或2或3所述的构建方法，其特征在于，所述基因cra(2LysAAA2AAG)(Asp101Arg,Asp148Arg,Gly274Arg)整合至工程菌Dpan16S基因组中的假基因glvG位点。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)是通过对基因ihfAB进行第二密码子优化而得到。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基因ihfAB的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
7.如权利要求1或5或6所述的构建方法，其特征在于，所述基因InfAB(InfA2SerGCG2AGT)整合至工程菌Dpan16S基因组中的假基因prfH位点。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Trc启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示。
9.一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，由权利要求1～8中任意一项所述的构建方法所构建得到。
10.权利要求1～8中任意一项所述的构建方法所构建得到的工程菌或者权利要求9所述的工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
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