CN117004541A - 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用，通过敲除控制菌株胁迫应激响应途径的压力响应调节因子(rssB)、阻遏碳储存调控因子(csrB)以及过表达细胞碳储存调控因子(csrA)；过表达影响电子传递链途径的σS(或σ38)因子(rpoS)和低氧诱导因子(arcA)的基因降低菌株体内活性氧(ROS)的含量；过表达RNA分子伴侣(hfQ)促进并调节RNA(sRNA)和mRNA之间的相互作用以及RNA的稳定性，有效的提升菌株的CellGrowth(OD600)，DPA产量从底盘菌株的3.83g/L提升至4.35g/L，D‑泛酸产量提升了13.58％，具有很大的应用潜力。

Description

一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程技术领域，尤其涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
D-泛酸(DPA)，又称维生素B5，是一种水溶性维生素，是用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白的关键前体。作一种重要的维生素常被用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等行业，具有很高的商业价值。
目前，用于工业应用的D-泛酸主要利用D-泛内酯和β-丙氨酸在甲醇或乙醇中缩合的化学方法进行生产。然而，使用化学分离或D-泛内酯的酶催化产生的D-泛内酯涉及到有毒的化学试剂和昂贵的分离手段。随着基因工程和合成生物学的不断发展，利用环保、廉价和简单等特点的生物合成手段生产D-泛酸引起了学者们的广泛关注。D-泛酸的微生物合成法利用的是D-泛内酯和β-丙氨酸在生物体中的缩合反应产生的。其中，β-丙氨酸作为天冬氨酸家族氨基酸的衍生物由panD编码天冬氨酸1-脱羧酶直接从天冬氨酸合成。D-泛内酯由丙酮酸开始经过乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、α-酮异戊酸羟甲基转移酶和泛酸还原酶反应催化产生。
大肠杆菌作为一种工业微生物具有遗传背景清晰、操作简单等优势是生产D-泛酸的理想底盘。细胞衰老是微生物细胞随着年龄增长而发生的退行性功能变化的总和，会降低细胞维持稳态的能力并增加细胞死亡的风险，是大肠杆菌和酿酒酵母等单细胞微生物的最基本生理特征之一，可分为复制型衰老和时序型衰老。根据这两种类型的衰老衍生出两种改善微生物寿命的策略即改善微生物复制寿命与时序寿命。江南大学刘立明团队成功的改善了大肠杆菌的寿命，并且运用于赖氨酸的实际生产中。经过长期的实验研究发现，在实际生产D-泛酸的过程中会也会面临着发酵过程中前期菌体生长(OD600)增长过慢，达到一定的OD时间过长，导致发酵周期延长，不利于工业化生产；菌体的活力不够，随着对生产菌株的基因型改造，造成菌株提前衰老，生产性能严重下降的问题。目前，还未有使用改善大肠杆菌寿命的策略解决以上问题并提高D-泛酸产量的资料与研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产D-泛酸，以克服现有技术中因D-泛酸生产菌株发酵周期长，容易提前衰老，导致菌株的D-泛酸生产性能较低的问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的在于，提供一种高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
以菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*作为出发菌株，敲除其基因组中的葡萄糖特异性酶编码基因ptsG、压力响应调节因子编码基因rssB、硫辛酸合酶编码基因lipA、甲基转移酶编码基因ubiG、阻遏碳储存调控因子编码基因csrB、假基因yghX和假基因ompT，过表达碳储存调控因子编码基因csrA、影响电子传递链的σS或σ38因子编码基因rpoS、低氧诱导因子编码基因arcA、RNA分子伴侣编码基因hfQ、半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK，即得到所述高产D-泛酸的基因工程菌。
研究表明大肠杆菌的寿命与胁迫应激响应途径和电子传递链有关，因此，选择与胁迫应激响应途径和电子传递链相关的靶点用于调控大肠杆菌的细胞寿命，例如，压力响应调节因子(rssB)、碳储存调控因子(csrA)、类组氨酸蛋白(hns)、蛋白酶(lon)、σS(或σ38)因子(rpoS)、低氧诱导因子(arcA)、甲基转移酶(ubiG)、硫辛酸合酶(lipA)、琥珀酸脱氢酶(sdhA)、糖原合酶(glg)和正向激活因子(rscA)等。
本发明中的出发菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/il vE*/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*已在专利CN113278569A中公开，来自浙江工业大学生物工程学院合成生物技术研究所菌种库。由于PTS途径中葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)SEQ ID NO.1在转运葡萄糖的过程中会利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)中的磷酸基团，使葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。近50％的PEP被消耗用于PEP转化为G6P，这会造成D-泛酸生产过程中由于丙酮酸(PYR)供应不足导致的代谢流减弱致D-泛酸产量的降低。因此利用CRISPR-Cas9系统敲除磷酸转移酶系统(PTS)中ptsG基因，并在此基因位点过表达不消耗PEP的半乳糖渗透酶/葡萄糖激酶(galP/gl K)系统来取代除磷酸转移酶系统(PTS)对于葡萄糖的转运，具体相关文献可参考：Fujiwa-ra R,Nakano M,Hirata Y,et al.G6P-capturing molecules inthe periplasm of Escherichi-a coli accelerate the shikimate pathway[J].Metabolic engineering,2022,72:68-81，得到菌株DPan16S并以此为底盘菌株。
以先前构建的菌株Dpan16S为基础，敲除胁迫应激响应途径中的压力响应调节因子(rssB)、硫辛酸合酶(lipA)、甲基转移酶(ubiG)、阻遏碳储存调控因子(csrB)，过表达碳储存调控因子(csrA)通过改善因胁迫应激响应来提高大肠杆菌寿命从而来提升D-泛酸产量；过表达已经进行第二密码子(起始密码子后面的密码子)优化的影响电子传递链的σS(或σ38)因子(rpoS)(SerAGT→TCA)、低氧诱导因子(arcA)通过改善电子转递链来提高大肠杆菌寿命从而来提升D-泛酸产量；过表达RNA分子伴侣(hfQ)来促进并调节RNA(sRNA)和mRNA之间的相互作用以及RNA的稳定性，提升菌株的Cell Growth(OD600)。最后，通过以上改造策略的组合，改善了D-泛酸生产菌株的时序寿命和复制寿命，成功地获得了高产D-泛酸的重组大肠杆菌菌株。
作为优选，所述基因rpoS和基因arcA整合在所述假基因yghX位点。
作为优选，所述基因csrA整合在所述基因csrB位点。
作为优选，所述基因hfQ整合在所述假基因ompT位点。
作为优选，所述基因rpoS已经进行第二密码子优化，其序列如SEQ ID NO.9所示。
基因rpoS由于其起始密码子后面的为AGT(编码丝氨酸)，此密码子非大肠杆菌编码丝氨酸频率最高的密码子，研究表明第二密码会影响翻译的效率，具体文献参考：靳艳婷.密码子第二位核苷酸与蛋白质功能及翻译的关联研究[D].电子科技大学,2022，因此把rpoS基因中编码丝氨酸的第二密码子由AGT转变为TCA。该转变通过引物突变而来，使用rpoS-F/R，在进行PCR扩增的时候引入的，由于这个突变位点只是三个碱基的改变，所以通过rpoS-F正向引物，就可以直接带入。
作为优选，所述基因csrA、基因rpoS、基因arcA、基因galP和基因glK由启动子Trc启动，所述启动子Trc的序列如SEQ ID NO.12所示。
Trc启动子SEQ ID NO.12来源于Ptrc99a质粒由Addgene公司购买所得，产品编号为VT294。
作为优选，所述基因hfQ由自身的启动子启动，该启动子的序列如SEQ ID NO.13所示。
所述的hfQ作为一种RNA结合伴侣其自身的转录水平已经很高，但是翻译水平略低，具体参考文献：Vo P,Na D.Optimized expression ofHfq protein increasesEscherichia coli growth by enhancing acidresistance[J]，因此选用hfQ自身的启动子。基因csrA、基因rpoS、基因arcA、基因galP、基因glK以及基因hfQ均由Ptrc99a质粒中的强RBS SEQ ID NO.14启动翻译，该强RBS在通过引物利用PCR扩增得到基因csrA、基因rpoS、基因arcA、基因galP、基因glK以及基因hfQ的基因片段中已经包含RBS。
作为优选，所述基因galP的序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因glK的序列如SEQID NO.3所示，所述基因csrA的序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因rpoS的序列如SEQ IDNO.9所示，所述基因arcA的序列如SEQ ID NO.10所示，所述基因hfQ的序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第二个目的在于，提供一种用于构建以上所述的高产D-泛酸的基因工程菌的方法，以菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/pox B/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)利用CRISPR-Cas9系统敲除葡萄糖特异性酶编码基因ptsG，并在此基因位点过表达半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK；
(2)敲除硫辛酸合酶编码基因lipA；
(3)敲除甲基转移酶编码基因ubiG；
(4)敲除压力响应调节因子编码基因rssB；
(5)敲除假基因yghX，并将由Trc启动的基因rpoS(SerAGT→TCA)-arcA组合表达框整合至假基因yghX位点；
(6)敲除阻遏碳储存调控因子编码基因csrB，并将由Trc启动的基因csrA整合至基因csrB位点；
(7)敲除假基因ompT，并将由基因hfQ自身启动子控制的基因hfQ整合至假基因ompT位点。
本发明的第三个目的在于，提供以上所述的高产D-泛酸的基因工程菌或者由以上所述的方法所构建的高产D-泛酸的基因工程菌在发酵生产D-泛酸中的应用。
以1％的接种量将种子培养液接种至500mL摇瓶50mL装液量发酵培养，使用10g/LCaCO3调节发酵液pH，每50mL发酵培养基外源添加0.13gβ-丙氨酸。在30℃、180-220rpm条件下发酵培养48h，将培养液利用无菌滤膜过滤进行分离纯化，获得D-泛酸。其中，发酵过程中添加到发酵培养基中的异亮氨酸浓度为40g/L，β-丙氨酸(250g/L)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用代谢工程改造提供了一种高产D-泛酸的重组大肠杆菌，经过改造后的重组大肠杆菌相比于出发菌株能够更好地以葡萄糖为碳源物质进行D-泛酸生产，并且生长能力更强，产量更高，通过生长优势和产量的优势间接体现出大肠杆菌的寿命得到了显著的改善。经过改造后获得的菌株中，性能最优的菌株在摇瓶发酵中生产D-泛酸的水平相比于底盘菌株Dpan16S从3.83g/L提高到4.35g/L，Cell growth(OD600)从底盘菌株Dpan16S的5.78提升至6.89。因此，本发明提供的重组大肠杆菌具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例中工程菌Dpan15和Dpan16S的摇瓶发酵情况。
图2为本发明实施例中工程菌Dpan16S和Dpan16S1的摇瓶发酵情况。
图3为本发明实施例中工程菌Dpan16S和Dpan16S3的摇瓶发酵情况。
图4为本发明实施例中工程菌Dpan16S3和Dpan16S4的摇瓶发酵情况。
图5为本发明实施例中工程菌Dpan16S4和Dpan16S5的摇瓶发酵情况。
图6为本发明实施例中工程菌Dpan16S5和Dpan16S6的摇瓶发酵情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中涉及到核苷酸序列具体为：基因ptsG的序列如SEQ ID NO.1所示，基因galP的序列如SEQ ID NO.2所示，基因glK的序列如SEQ ID NO.3所示，基因rssB的序列如SEQ ID NO.4所示，基因lipA的序列如SEQ ID NO.5所示，基因ubiG的序列如SEQ ID NO.6所示，基因csrB的序列如SEQ ID NO.7所示，基因csrA的序列如SEQ ID NO.8所示，基因rpoS的序列如SEQ ID NO.9所示，基因arcA的序列如SEQ ID NO.10所示，基因hfQ的序列如SEQ IDNO.11所示，启动子Trc的序列如SEQ ID NO.12所示，基因hfQ自身的启动子的序列如SEQ IDNO.13所示，强RBS的序列如SEQ ID NO.14所示，假基因yghX的序列如SEQ ID NO.15所示，假基因ompT的序列如SEQ ID NO.16所示。
出发菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*已在专利CN113278569A中公开，来自浙江工业大学生物工程学院合成生物技术研究所菌种库。
LB培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCL10 g/L、LB固体培养基添加琼脂粉为20g/L。
摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖、16g/L(NH4)2SO4、1g/L KH2PO4、2g/L酵母粉、0.5g/LMgSO4、1mL/L盐溶液、10g/L CaCO3，115℃灭菌30分钟，其中CaCO3需要单独灭菌。
盐溶液：0.02g/LNiCl2·7H2O、10g/L CuCl2、10g/LFeSO4·7H2O、10g/L CuSO4、10g/LZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4。
抗生素：卡那霉素工作浓度(50mg/L)、大观霉素(50mg/L)。
D-泛酸摇瓶发酵方法：
(1)发酵菌株种子液培养
将重组菌株划线于LB固体培养基，37℃培养12-16h。平板单菌落接种于LB液体培养基，于37℃、200r/min培养12-14h，获得种子液。
(2)摇瓶发酵培养
向50ml发酵培养基中加入2％种子液接种量(1ml)，并加入β-丙氨酸(250g/L)，VB12(0.2mg/L)，VB1(0.5mg/L)，根据需要加入异亮氨酸(0.04g/L)，30℃，180rpm培养48h。
(3)D-泛酸检测方法
利用高效液相色谱(HPLC)检测D-泛酸。检测条件：色谱柱J&K C 18-H(250×4.6mm，5μm)，流动相50mL乙腈、950uL磷酸用超纯水定容到1L(无梯度)，流速0.9mL/min，进样量10μL，柱温30℃，检测波长200nm，检测时长18min。
PCR扩增体系见表1：
表1 PCR扩增体系
Components Volumes
2×Phanta Max Buffer 25μL
dNTP Min 1μL
Primer 1 1μL
Primer 2 1μL
Phanta Max 1μL
Template(pTarget gene) 1μL
ddH2O Up to50μL
。
融合PCR体系见表2：
表2融合PCR体系
菌落PCR体系见表3：
表3菌落PCR体系
Components Volumes
T5 Super PCR Mix 5μL
Template(single clone) 1μL
Primer VFNR 各1μL
dd H2O Up to 10μL
。
一步克隆的体系见表4：
表4一步克隆的体系
Components Volumes
5×Exase I Buffer 2μL
Exase I 1μL
Linearized plasmid X μL
DNA fragments YμL
ddH2O Up to10μL
。
DNA的纯化：
取PCR扩增产物，加入3倍体积的Buffer PCRA(不足100μL，补足100μL)，混匀。将混匀溶液转移至制备管中，室温12000rpm离心1min，弃滤液。加入700μL的Buffer W2，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复此步骤一次。室温12000rpm空甩离心2min，取出制备管，打开制备管盖，室温放置2～5min。加入40μL预热(50-65℃)的超纯水，室温放置2～5min，12000rpm离心1min。收集液用核酸微量测定仪测定DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。
质粒提取：
取2mL过夜培养12-14h的菌液至EP管中(可根据菌体浓度调整取样量)，室温12000rpm离心1min，弃上清，于沉淀中加入250μL的Buffer S1悬浮细胞，再加入250μL的Buffer S2，温和充分翻转4～6次，使菌体充分裂解(此步不宜超过5min)；然后加入350μL的Buffer S3，温和充分翻转6～8次，室温12000rpm离心10min。吸取上清液至制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500μL的Buffer W1，室温12000rpm离心1min，弃滤液；加入600μL的Buffer W2，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复该步骤1次；室温12000rpm空甩离心2min，打开制备管管盖，室温放置2～5min。将制备管放入1.5mL离心管中，加入40μL预热(50-65℃)的超纯水，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，使用核酸微量测定仪测定质粒浓度和纯度，-20℃保存备用。
感受态细胞制备：
(1)化学转化感受态细胞制备
取划线平板，从中挑取单菌落，接种到10mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。然后取过夜培养菌液转接(1％接种量)于50mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD6000.4～0.6。于超净台中将菌液转移至50mL的无菌离心管中，4℃，5500rpm离心8min，于超净台中弃上清。然后加入适量预冷的无菌CaCl2溶液(0.1M)，小心轻柔地吹打管壁上的菌体使其悬浮，立即至于冰上冰浴30min；然后，4℃，5500rpm离心5min收集菌体，超净台中弃上清。根据菌体量加入适量的预冷的无菌CaCl2甘油溶液(0.1M CaCl2，15％甘油)重悬细胞，于冰上每管100μL分装，立即使用或-80℃保存备用。
(2)高压电穿孔法感受态细胞制备
取划线平板，从中挑取单菌落(含pCas质粒)，接种到10mL的LB培养基中，并加入10μL的Kan和100μL的阿拉伯糖，30℃，180rpm过夜培养。取过夜培养菌液转接于10mL的LB培养基中，并加入10μL的Kan和100μL的阿拉伯糖，30℃，180rpm培养至OD6000.8～1.0。将菌液转移至2mL的无菌离心管中，4℃，5500rpm离心2min，超净台中弃上清。然后加入预冷的无菌水，轻柔地吹打管壁上的菌体使其悬浮，4℃，5500rpm离心2min，弃上清，重复此步骤2次。加入适量的预冷的10％的无菌甘油溶液重悬细胞，4℃，5500rpm离心2min，于超净台中弃上清。根据菌体量加入适量的10％的无菌甘油溶液重悬细胞，于冰上每管100μL分装，-80℃保存备用。
质粒的转化：
(1)化学转化法
取感受态细胞至于冰上，自然融化后，加入3～4μL的质粒，轻柔混匀，至于冰上冰浴30min。然后，取冰浴后的混合物，于42℃水浴中，热激90s，并立即至于冰上冰浴2～5min。再加入700μL LB培养基，于37℃，180rpm摇床中培养45～60min。取适量的培养物涂布于LB平板上(抗性与质粒抗性相同)，将平板置于37℃培养箱，倒置培养过夜.
(2)高压电穿孔法感受态转化法
制备带pCas质粒(图2-4)菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL的pTarget-X-dg(敲除载体)或2μL的pTarget-Y(敲除表达载体)，轻柔混匀，冰浴1min；将混合液移至预冷的2mm的电击杯中，冰浴45s。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，放入电转仪，使用Eco 2档电击(此步骤需迅速完成)。在超净台中向电击杯凹槽中加入0.5mL预冷的LB液体培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中(此步骤需迅速完成)。30℃，180rpm复苏2.5h以上；然后取200μL涂布于LB固体培养基(SD+Kan抗性)，30℃培养过夜。
实施例1采用代谢工程改造构建菌株Dpan16S
菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/poxB/pta/Δldh AΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*记为菌株Dpan15，为了减少对PEP的消耗需要敲除菌株Dpan15基因组PTS途径中葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)，并使用Tr c控制的过表达galP-glK系统来取代PTS途径对于葡萄糖的转运。
(1)表达质粒Ptrc99a-galP-glK的构建
以空质粒Ptrc99a为模板，使用引物PtrcF/R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物galp-F/R、glK-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-galP-glK质粒。使用引物Trc-F/R，模板为Ptrc99a-galP-glK质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的galp-glK表达框目的片段。
(2)ptsG敲除载的构建
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-ptsG-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ptsG基因上下游序列，使用引物ptsG-up-F/R、ptsG-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因ptsG的sgRNA的pTarget-ΔptsG突变载体。
(3)ptsG基因组的敲除
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan15菌株基因组中ptsG基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan15制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔptsG载体和Trc控制下的galp-glK表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan15菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物ptsG-out-F/R进行菌落PCR验证确认ptsG基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔptsG载体。然后将已经去除pTarget-ΔptsG载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S。CRISPR/Cas9系统其构建过程与原理可参考文献：Zhao,D.,Yuan,S.,Xiong,B.et al.Development of a fast and easy methodfor Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact 15,205(2016)。
实施例1所用引物序列见表5
表5实施例1所用引物序列
实施例2大肠杆菌菌株合成D-泛酸的代谢途径强化改造
(1)lipA基因的敲除
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-lipA-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的lipA基因上下游序列，使用引物lipA-up-F/R、lipA-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因lipA的sgRNA的pTarget-ΔlipA突变载体。通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S菌株基因组中lipA基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔlipA载体使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑取单菌落为模板，使用敲除验证引物lipA-out-F/R进行菌落PCR验证确认lipA基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔlipA载体。然后将已经去除pTarget-ΔlipA载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S1。
(2)ubiG基因的敲除
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-rssB-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ubiG基因上下游序列，使用引物rssB-up-F/R、ubiG-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因ubiG的sgRNA的pTarget-ΔubiG突变载体。通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S1菌株基因组中ubiG基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S1制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔubiG载体使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S1菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物ubiG-out-F/R进行菌落PCR验证确认ubiG基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔubiG载体。然后将已经去除pTarget-ΔubiG载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S2。但是在LB中消除pTarget-ΔubiG载体的过程中，菌体发生死亡，推测可能ubiG基因在D-泛酸菌株生产过程总充当必须基因，不宜被敲除。因此后续发酵没有对Dpan16S2进行发酵验证。
(3)rssB基因的敲除
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-rssB-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ubiG基因上下游序列，使用引物rssB-up-F/R、rssB-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因rssB的sgRNA的pTarget-ΔrssB突变载体。通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S菌株基因组中rssB基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔrssB载体使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物rssB-out-F/R进行菌落PCR验证确认rssB基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔrssB载体。然后将已经去除pTarget-ΔrssB载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S3。
(4)yghX基因的敲除和Trc控制下的arcA-rpoS(SerAGT→TCA)基因的过表达以空质粒Ptrc99a为模板，使用引物PtrcF/R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物arcA-F/R、rpoS-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-arcA-rpoS(SerAGT→TCA)质粒。使用引物Trc-F/R，模板为Ptrc99a-arcA-rpoS(SerAGT→TCA)质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的arcA-rpoS(SerAGT→TCA)表达框目的片段。
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-yghX-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ptsG基因上下游序列，使用引物yghX-up-F/R、yghX-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因yghX的sgRNA的pTarget-ΔyghX突变载体。
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S3菌株基因组中yghX基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S3制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔyghX载体和Trc控制下的arcA-rpoS(SerAGT→TCA)表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S3菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物yghX-out-F/R进行菌落PCR验证确认yghX基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔyghX载体。然后将已经去除pTarget-ΔyghX载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S4。
(5)csrB基因的敲除和Trc控制下的csrA基因的过表达
以空质粒Ptrc99a为模板，使用引物PtrcF/R按照PCR扩增体系进行扩增；同理使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物csrA-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段。按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于卡那霉素(Kan)平板，挑取单菌落使用Ptrc99a通用引物99a-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功的Ptrc99a-csrA质粒。使用引物Trc-F/R，模板为Ptrc99a-csrA质粒按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的Trc控制下的csrA表达框目的片段。
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-csrB-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ptsG基因上下游序列，使用引物csrB-up-F/R、csrB-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因csrB的sgRNA的pTarget-ΔcsrB突变载体。
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S4菌株基因组中csrB基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S4制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔcsrB载体和Trc控制下的csrB表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S4菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物csrB-out-F/R进行菌落PCR验证确认csrB基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔcsrB载体。然后将已经去除pTarget-ΔcsrB载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S5。
(6)ompT基因的敲除和hfQ自身启动子控制下的hfQ基因的过表达使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板，分别使用引物T-hfQ-F/R，hfQ-F/R按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段T-hfQ和hfQ。按照融合PCR体系使用模板T-hfQ和hfQ，引物T-hfQ-F/hfQ-R进行扩增,经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到由hfQ自身启动子控制下的hfQ基因表达框。
以pTargetF载体为模板，使用引物P1k-ompT-F/R；根据NCBI上公布的大肠杆菌Escherichia coli W3110的ompT基因上下游序列，使用引物ompT-up-F/R、ompT-down-F/R，使用野生型大肠杆菌菌株W3110基因组为模板按照PCR扩增体系进行扩增，经过琼脂糖核酸电泳的验证正确后，进行DNA片段纯化得到相应的DNA目的片段，按照一部克隆体系反应、进一步转化到DH5α中，涂布于大观霉素(SD)平板，挑取单菌落使用pTarget通用引物Target-F/R进行菌落PCR验证，测序验证筛选克隆成功构建得到能够表达靶定目的基因ompT的sgRNA的pTarget-ΔompT突变载体。
通过CRISPR-Cas9系统敲除Dpan16S5菌株基因组中ompT基因。利用化学感受态制作原理把菌株Dpan16S5制作成含有Pcas9质粒的菌株，将pTarget-ΔompT载体和hfQ自身启动子控制下的hfQ基因表达框一同使用高压电穿孔法至含有pcas9载体的Dpan16S5菌株中。随后将菌液涂至含有SD+Kan的抗性的固体LB平板上，30℃培养过夜培养24h。挑去单菌落为模板，使用敲除验证引物ompT-out-F/R进行菌落PCR验证确认ompT基因的敲除。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔompT载体。然后将已经去除pTarget-ΔompT载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体。构建的菌株记为大肠杆菌Dpan16S6。
实施例2所用引物序列见表6
表6实施例2所用引物序列
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实施例3摇瓶发酵实验
对上述实施例中的工程菌菌株在摇瓶中进行发酵实验测试，以比较各基因型菌株之间生产D-泛酸的能力。摇瓶发酵实验、D-泛酸检测实验按如上具体实施方案进行。其中上述实施例中的各工程菌株的基因型见表7，摇瓶发酵实验结果如图1～6所示。
表7工程菌株基因型
结合图1～6中摇瓶发酵实验的结果可得：针对Dpan15敲除ptsG后并且过表达glk和galP得到Dpan16S后，D-泛酸产量从2.35g/L提升到3.82g/L表明敲除PTS途径中的葡萄糖特异性酶IIBC(ptsG)可以显著改善对于PEP的消耗，间接的加强了D-泛酸代谢途径。继续对Dpan16S敲除lipA得到的菌株Dpan16S1发酵结果表明敲除该基因后无论是D-泛酸产量还是Cell growth(OD600)都造成明显的下降，表明lipA编码的硫辛酸合酶是大肠杆菌生长必需的酶，缺少该酶的大肠杆菌生长会发生严重缺陷。接着对Dpan16S菌株敲除rssB基因得到Dpan16S3摇瓶发酵结果表明破坏菌株压力响应调节因子后的Dpan16S菌株的D-泛酸产量和Cell growth(OD600)提升至3.97g/L和5.78提升效果不显著，接着对Dpan16S3迭代基因编辑过表达arcA-rpoS(SerAGT→TCA)后得到菌株Dpan16S4 D-泛酸产量最高达到4.35g/L，表明σS(或σ38)因子(rpoS)(SerAGT→TCA)和低氧诱导因子(arcA)的过表达可以通过改善电子转递链来提高大肠杆菌寿命从而来提升D-泛酸产量。对Dpan16S4过表达碳储存调控因子(csrA)并且敲除其阻遏因子(csrB)得到Dpan16S5，通过改善因胁迫应激响应摇瓶发酵结果表明Cell growth(OD600)进一步的改善了大肠杆菌寿命。接着对Dpan16S5过表达RNA分子伴侣(hfQ)得到的菌株Dpan16S6，摇瓶发酵结果显示达到本批次发酵最高的Cell growth(OD600)为6.98，证明了过表达RNA分子伴侣可以促进并调节RNA(sRNA)和mRNA之间的相互作用以及RNA的稳定性改善了菌株的生长状况。通过以上摇瓶发酵结果表明本专利通过改善D-泛酸生产出发菌株Dpan16S的菌株的寿命和生长可以有效提高D-泛酸生产产量和Cellgrowth(OD600)，具有较大的应用价值。

Claims (10)

1.一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：
以菌株E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*作为出发菌株，敲除其基因组中的葡萄糖特异性酶编码基因ptsG、压力响应调节因子编码基因rssB、硫辛酸合酶编码基因lipA、甲基转移酶编码基因ubiG、阻遏碳储存调控因子编码基因csrB、假基因yghX和假基因ompT，过表达碳储存调控因子编码基因csrA、影响电子传递链的σS或σ38因子编码基因rpoS、低氧诱导因子编码基因arcA、RNA分子伴侣编码基因hfQ、半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK，即得到所述高产D-泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因rpoS和基因arcA整合在所述假基因yghX位点。
3.如权利要求1或2所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因csrA整合在所述基因csrB位点。
4.如权利要求1或2所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因hfQ整合在所述假基因ompT位点。
5.如权利要求1或2所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因rpoS已经进行第二密码子优化，其序列如SEQ ID NO.9所示。
6.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因csrA、基因rpoS、基因arcA、基因galP和基因glK由启动子Trc启动，所述启动子Trc的序列如SEQ IDNO.12所示。
7.如权利要求1或6所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因hfQ由自身的启动子启动，该启动子的序列如SEQ ID NO.13所示。
8.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因galP的序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因glK的序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因csrA的序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因rpoS的序列如SEQ ID NO.9所示，所述基因arcA的序列如SEQID NO.10所示，所述基因hfQ的序列如SEQ ID NO.11所示。
9.一种用于构建权利要求1～8中任意一项所述的高产D-泛酸的基因工程菌的方法，其特征在于，以菌株E.coliW3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG/ΔavcA/ilvE*/CoaA/poxB/pta/ΔldhAΔplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/ΔlacI*作为出发菌株，包括以下步骤：
(1)利用CRISPR-Cas9系统敲除葡萄糖特异性酶编码基因ptsG，并在此基因位点过表达半乳糖渗透酶编码基因galP和葡萄糖激酶编码基因glK；
(2)敲除硫辛酸合酶编码基因lipA；
(3)敲除甲基转移酶编码基因ubiG；
(4)敲除压力响应调节因子编码基因rssB；
(5)敲除假基因yghX，并将由Trc启动的基因rpoS(SerAGT→TCA)-arcA组合表达框整合至假基因yghX位点；
(6)敲除阻遏碳储存调控因子编码基因csrB，并将由Trc启动的基因csrA整合至基因csrB位点；
(7)敲除假基因ompT，并将由基因hfQ自身启动子控制的基因hfQ整合至假基因ompT位点。
10.权利要求1～8中任意一项所述的高产D-泛酸的基因工程菌或者由权利要求9所述的方法所构建的高产D-泛酸的基因工程菌在发酵生产D-泛酸中的应用。
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