CN117467588A - 一种基于转录调控因子TrpR2调节L-色氨酸合成的方法 - Google Patents
一种基于转录调控因子TrpR2调节L-色氨酸合成的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于转录调控因子TrpR2调节L‑色氨酸合成的方法，属于生物工程技术领域。本发明在L‑色氨酸生产菌株TRP10中对转录调控因子TrpR2进行敲除发现，构建得到的工程菌株TRP11能够显著提高L‑色氨酸的产量，于5L发酵罐中培养48h后测定发现L‑色氨酸产量提高至23.33g/L，比对照菌株的L‑色氨酸产量提高18.20％。同时，TrpR2的敲除不会影响发酵过程中菌株的生长。通过敲除转录因子TrpR2间接影响了L‑色氨酸合成的关键基因，从而影响了L‑色氨酸的合成。综上，采用转录因子工程策略在增强目标产物的合成中具有极大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于转录调控因子TrpR2调节L-色氨酸合成的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，许多高附加值化合物包括众多化学品、化妆品、食品添加剂、药物等，都在微生物细胞工厂中实现了异源合成。为提高微生物细胞工厂中目标化合物的合成效率，传统的调控策略主要是通过直接上调、下调或是敲除代谢途径关键基因。但由于代谢途径的高度复杂性往往导致代谢工程后的表型不符合现实需求。并且有时基因的过表达可能导致毒性中间代谢物的积累，而基因下调及敲除可能导致细胞缺乏生长所需的代谢物。与此同时，单个基因的修饰可能破坏细胞同源性稳态，对细胞应激、生长及分裂都造成破坏性影响，使得产物合成效率降低。因此，只有同时修饰多个控制基因或及时对代谢途径关键基因进行动态调控，才能获得理想的微生物细胞工厂。随着后基因组研究的进展，转录调控因子能改变微生物代谢途径，在转录水平上的基因调控具有独特的优势，并能弥补单一基因作用的不足以及降低代谢改造过程中多个关键基因组成型致死表达的可能性。根据不同的代谢调控目的，不同的转录因子被用于构建不同的转录调控工具。目前，以转录因子为基础的微生物细胞代谢调控方法已成功用于代谢调控中，显著提升了目标化合物的产量和宿主细胞的耐受性。
L-色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸，在机体生长及内分泌调节中起着至关重要的作用。人体和动物体内不能合成L-色氨酸，需从食物及饲料中吸收。因此，L-色氨酸在食品添加剂及饲料中的应用越来越受到人们的关注。L-色氨酸及其衍生物在治疗抑郁及肿瘤中的潜在活性最近已得到证实，刺激其作为生物活性前体在抗抑郁药物及抗肿瘤分子中发挥重要作用。随着对L-色氨酸需求量的显著增加，通过改造微生物使其从头合成L-色氨酸已成为一种具有经济可行性和低环境影响性的方法。L-色氨酸的合成途径包括莽草酸途径和L-色氨酸分支途径，受到多种调控机制的严格调控，如反馈抑制，反馈阻遏等。目前通过代谢工程策略，L-色氨酸的产量已得到大幅度提升。因此，通过改造与L-色氨酸代谢途径相关的转录调控因子，对代谢调控网络重新编程，最终改变胞内的转录效率及关键基因的表达水平，从而实现L-色氨酸产量的提高。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是进一步优化L-色氨酸的合成，提高L-色氨酸的产量。
技术方案：
为解决上述技术问题，本发明通过基因编辑技术构建了一株能高效合成L-色氨酸的工程菌株。
本发明的第一个目的是提供一株生产L-色氨酸的工程菌株，所述工程菌株为抑制或降低基因组转录调控因子TrpR2表达的大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，通过基因编辑技术实现抑制或降低基因组转录调控因子TrpR2表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas 9技术、无义突变或RNAi技术。
在本发明的一种实施方法中，所述转录调控因子TrpR2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方法中，以大肠杆菌工程菌TRP10为宿主。
在本发明的一种实施方法中，所述大肠杆菌工程菌TRP10为通过常压室温等离子体诱变及系统代谢工程改造得到的，5L发酵罐发酵产L-色氨酸产量为19.74g/L，记载于文献：Multidimensional engineering of Escherichia coli for efficient synthesisof L-tryptophan，doi:10.1016/j.biortech.2023.129475。
本发明的第二个目的是提供一种提高L-色氨酸产量的方法，所述方法为抑制或降低大肠杆菌基因组上的转录调控因子TrpR2的表达。
在本发明的一种实施方法中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌工程菌TRP10。
本发明的第三个目的是提供构建所述工程菌株的方法，所述方法为以大肠杆菌工程菌TRP10为宿主，敲除或敲低基因组上核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的转录调控因子TrpR2。
本发明的第四个目的是提供一种发酵生产L-色氨酸的方法，所述方法为利用所述工程菌株为发酵微生物，进行L-色氨酸的发酵生产。
在本发明的一种实施方式中，在含有碳源的反应体系中进行L-色氨酸的发酵生产。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源包括葡萄糖、甘油、蔗糖、淀粉或玉米糖浆。
在本发明的一种实施方法中，所述发酵的条件为温度35～38℃，转速为600-700rpm，pH为7.0-7.2。
在本发明的一种实施方法中，所述反应体系包括20～40g/L葡萄糖、1～5g/L酵母膏、1～5g/L柠檬酸、1～5g/L硫酸铵、5～10g/L磷酸氢二钾、1～2g/L氯化钠、1～2g/L七水硫酸镁、20～40mg/L七水硫酸亚铁、5～15mg/L一水硫酸锰、1～5mg/L VB1、1～5mg/L VH及1～2mL/L的微量元素混合液。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素混合液包括二水氯化钙5～15g/L，二水硫酸铜0.5～1g/L，六水氯化钴1～5g/L，二水硫酸锌5～10g/L。
本发明还提供了上述大肠杆菌工程菌株或上述方法在生产L-色氨酸或含有L-色氨酸的产品中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种通过敲除转录调控因子TrpR2实现L-色氨酸产量的提高，构建得到的工程菌株TRP11能够显著提高L-色氨酸的产量，5L发酵罐中培养48h后L-色氨酸产量提高至23.33g/L，比对照菌株TRP10产量提高18.20％。
附图说明
图1：5L发酵罐发酵分析工程菌株TRP10与TRP11产L-色氨酸的能力。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的大肠杆菌W3110和JM109及质粒pREDCas9和pGRB均为实验室所保藏的菌株和质粒。
下述实施例中涉及的培养基：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。
感受态培养基：蛋白胨16g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L。
复苏培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
种子培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸2g/L、硫酸铵2.5g/L、磷酸氢二钾4g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁2.8mg/L、一水硫酸锰1.2mg/L、VB1 1mg/L、VH 1mg/L及微量元素混合液1mL/L；微量元素混合液：二水氯化钙10g/L，二水硫酸铜0.6g/L，六水氯化钴4.9g/L，二水硫酸锌6.4g/L。
发酵培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏3g/L、柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、磷酸氢二钾7g/L、氯化钠1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁30mg/L、一水硫酸锰10mg/L、VB1 1mg/L、VH1mg/L及微量元素混合液1mL/L；微量元素混合液：二水氯化钙10g/L，二水硫酸铜0.6g/L，六水氯化钴4.9g/L，二水硫酸锌6.4g/L。
下述实施例中涉及的L-色氨酸检测方法：
发酵液中L-色氨酸的检测方法：采用的是高效液相色谱HPLC法(Agilent1260series,CA,USA)。采用紫外检测器进行测定。流动相为乙腈/水(10：90v/v)，流速设定为1ml/min，以及检测波长为278nm。
下述实施例中涉及到的引物：
trpR2-sgRNA-F：
5’-AGTCCTAGGTATAATACTAGTCTGGATCGGTGGTTGAAAGAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；
trpR2-sgRNA-R：
5’-TTCTAGCTCTAAAACGTAAATCCTGACCGAATTCGACTAGTATTATACCTAGGACT-3’；
trpR2-arm-F1：5’-ACTGATCTCTAACGGTCAGGGTAAAGC-3’；
trpR2-arm-R1：
5’-TTATTGTCACCATAAAACACTGTTTAATCCTTTTGGTTTAAACCAGATGAAGCAT-3’；
trpR2-arm-F2：
5’-TAAACCAAAAGGATTAAACAGTGTTTTATGGTGACAATAAATAACGCAAGAAAGATTCTAC-3’；
trpR2-arm-R2：5’-TGCTCATTTGCATTGATCATGTTCGC-3’。
实施例1：大肠杆菌工程菌株TRP11的构建
为了在大肠杆菌工程菌株TRP10(工程菌株TRP10公开于申请日以前的非专利文献中：Multidimensional engineering of Escherichia coli for efficient synthesisof L-tryptophan)中实现基因trpR2的敲除，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术实现基因的敲除。根据基因trpR2的核苷酸序列设计靶向于基因trpR2的sgRNA，利用trpR2-sgRNA-F/trpR2-sgRNA-R扩增获得靶向于基因trpR2的sgRNA，通过同源重组的方式将其连接在质粒pGRB(Addgene#71539)上以构建质粒pGRB-trpR2-sgRNA。再以大肠杆菌工程菌株TRP10基因组为模板，利用引物trpR2-arm-F1/R1和trpR2-arm-F2/R2，扩增基因trpR2的上下游同源臂(～500bp)，随后利用引物trpR2-arm-F1和trpR2-arm-R2通过融合PCR进行融合形成完整的同源臂DNA片段。
在菌株TRP10中实现基因trpR2的敲除，首先需将质粒pREDCas9(Addgene#71541)通过电击转化的方式将其转化入菌株TRP10中。将携带有质粒pREDCas9的菌株TRP10培养在含50μg/mL壮观霉素的感受态培养基中于30℃培养至OD600约为0.1-0.2，然后添加0.1mM的IPTG诱导Cas9蛋白的表达。当OD600升高至0.6-0.7时离心收集细胞并反复洗涤三次制成感受态细胞，然后将同源臂DNA片段和质粒pGRB-trpR2-sgRNA用1.85kV的电压同时电转进感受态细胞中，电转结束后立即加入1mL复苏培养基并于30℃培养2小时。最后将转化子涂布于含有50μg/mL氨苄霉素和壮观霉素的LB固体平板上，于30℃过夜培养后，随机挑选长出的转化子进行菌落PCR验证以及DNA测序。DNA测序验证成功后即构建得到工程菌株TRP11。
实施例2：工程菌株TRP11的5L发酵罐发酵实验
将菌株TRP11于37℃在LB固体培养基上培养12小时进行活化，将活化后的菌株接种于含3L种子培养基的5L发酵罐中。通过自动添加氨水使种子培养基的pH维持在7.0，以及保持温度维持在37℃，通过改变搅拌器速度和通气速率将溶解氧维持在30％以上。当OD600达到10-12时，将多余发酵液排出只留下450mL用于分批发酵。分批发酵过程中，同样将pH维持在7.0，温度维持在37℃以及溶氧维持在30％以上。在初始糖消耗完后，控制发酵液中的葡萄糖浓度在2g/L以下，并在后续发酵过程中向发酵罐中添加浓度为80％的葡萄糖溶液以维持菌体生长及产物合成。经过48小时发酵培养后，工程菌株TRP11的产量达到23.33g/L，比对照菌株TRP10产量提高18.20％(图1)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株生产L-色氨酸的工程菌株，其特征在于，为抑制或降低基因组上转录调控因子TrpR2表达的大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述转录因子TrpR2的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌工程菌TRP10为宿主。
4.一种提高L-色氨酸的产量的方法，其特征在于，抑制或降低大肠杆菌基因组上的转录调控因子TrpR2的表达。
5.一种发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一所述工程菌株发酵生产L-色氨酸。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在含有碳源的反应体系中进行L-色氨酸的发酵生产。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度35～38℃，转速为600-700rpm。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、甘油、蔗糖、淀粉或玉米糖浆。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系包括15～25g/L葡萄糖、1～5g/L酵母膏、1～5g/L柠檬酸、2～6g/L硫酸铵、1～2g/L氯化钠、1～2g/L七水硫酸镁、15～25mg/L七水硫酸亚铁、1～2mg/L一水硫酸锰、0.1～0.5mg/L VB1、0.1～0.5mg/L VH及1～2mL/L的微量元素混合液。
10.权利要求1～3任一所述的工程菌株，或权利要求4所述方法，或权利要求5～9任一所述的方法在生产L-色氨酸或含有L-色氨酸的产品中的应用。
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