CN111944857B - 一种提高l-异亮氨酸产率的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高L‑异亮氨酸产率的发酵方法，将异亮氨酸生产菌种接种至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中控制溶氧、分步补料，得到L‑异亮氨酸。本发明通过发酵提高异亮氨酸生产菌L‑异亮氨酸发酵产率及糖酸转化率，其中L‑异亮氨酸产率在50g/L以上，糖酸转化率为20％以上，与现有技术相比，L‑异亮氨酸产率和糖酸转化率得到极大的提高。通过流加葡萄糖使发酵液中残糖含量控制在1‑2.5％，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥；同时通过分段供氧控制发酵液中的溶氧，既不会影响发酵前期菌种扩增，也不会在后期影响发酵，L‑异亮氨酸得以大量积累。

Description

一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法。
背景技术
异亮氨酸（Isoleucine，Ile），又称“异白氨酸”，系统命名为“α-氨基-β-甲基戊酸”，化学式C6H13NO2，属脂肪族中性氨基酸的一种。是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八种必须氨基酸之一，具有多种生理功能，被广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等领域。特别是在医药领域，异亮氨酸可用于与其他必需氨基酸配制成复合氨基酸输液，尤其是高支链氨基酸输液及口服液，不仅可以提高人体免疫力，还能促进病人康复及手术后复原。此外，其还应用于血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，肿瘤患者的营养支持治疗等。
L-异亮氨酸生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法，其中，提取法和化学合成法由于存在原料来源受限制、生产成本高、污染环境等缺陷而难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。微生物发酵法生产L-异亮氨酸包括微生物转化和直接发酵两种方式，其中前者使用葡萄糖作为碳源，在添加特异性前体的基础上通过微生物作用将其转化为异亮氨酸，而后者是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过选育营养缺陷型突变株以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到积累异亮氨酸的目的。
随着对L-异亮氨酸发酵法的深入研究，微生物发酵法已成为生产L-异亮氨酸最主要的方法。但是，现有的L-异亮氨酸发酵法仍存在产酸率低、糖酸转化率低的问题。因此，如何对L-异亮氨酸的发酵工艺进行优化仍是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法。本发明方法工艺简单、生产成本低、L-异亮氨酸的产量及糖酸转化率有较大提高，特别适合用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法，包括以下步骤：
将L-异亮氨酸生产菌种的种子液接种至发酵培养基中，进行发酵，得到L-异亮氨酸；
所述发酵包括：
初始条件为：发酵温度29-30℃，风量6-8L/min，搅拌转速400-450rpm，罐压0.02-0.04MPa；
当溶氧低于15%时，将搅拌转速提高至500rpm；当溶氧低于13%时，将搅拌转速提高至550rpm；当溶氧降至5%时，将搅拌转速降至450rpm，继续发酵；
当发酵液中的残糖降至1-3%时，开始低溶氧发酵，所述低溶氧发酵的条件为：温度32-33℃，pH=7.5，搅拌转速150-200rpm，通风，控制溶氧在7-12%，流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在1-2.5%，流加葡萄糖的总量为发酵液重量的8-10%；当发酵液中的残糖含量降至1%以下时，结束发酵。
优选的，所述发酵培养基的成分为：KH2PO4 1.35g/L、K2HPO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O0.75g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 7.5mg/L、MnSO4·H2O 7.5mg/L、VB10.15mg/L、葡萄糖90g/L、酵母浸出粉3g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸0.75g/L、蛋氨酸0.225g/L、消泡剂0.25mL/L；pH 7.5±0.1。
优选的，所述L-异亮氨酸生产菌种由如下方法构建而成：
以 L–异亮氨酸生产菌 C. glutamicum YILW 基因组为模板克隆 hom 基因，将hom 基因与表达载体 pBR322 连接构建得到重组质粒 pBR322-hom，再转入受体C.glutamicum YILW，构建得到重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)；
将重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因和高丝氨酸乙酰基转移酶编码基因敲除，即制备得到L-异亮氨酸生产菌种。
优选的，所述L-异亮氨酸生产菌种的种子液是由L-异亮氨酸生产菌种经一级种子瓶培养和二级种子罐培养得到。
更优选的，一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；一级种子瓶中菌种培养至对数期后，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养。
更优选的，二级种子罐培养的培养基成分为：KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、(NH4) 2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、VB1 0.3mg/L、葡萄糖50g/L、酵母浸出粉5g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸1g/L、蛋氨酸1g/L；pH 7.5±0.1。
更优选的，二级种子罐培养的条件为：温度32℃，pH6.8-7.0，溶解氧20-30%，罐压0.03MPa，风量15L/min，搅拌转速400rpm；接种量为5-15%（体积分数）。
进一步的，所述低溶氧发酵还包括：补小料的步骤，所述补小料具体为：在低溶氧发酵的过程中进行两次补小料；第一次补小料KH2PO4 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L 、烟酰胺（VB3）10mg/L；第二次补小料KH2PO4 0.2g/L 、KH2PO4 0. 2g/L。
进一步的，所述低溶氧发酵还包括：流加质量浓度为20-30%的氨水，使发酵液的pH维持在7.5±0.1的步骤。
更优选的，所述氨水的质量浓度为25%。
本发明的有益效果：
（1）本发明通过低溶氧发酵提高异亮氨酸生产菌L-异亮氨酸发酵产率及糖酸转化率，其中L-异亮氨酸产率高达50g/L以上，糖酸转化率在20%以上，与现有技术相比，L-异亮氨酸产率和糖酸转化率得到极大的提高。
（2）本发明进一步优化了L-异亮氨酸的发酵工艺，通过流加葡萄糖使发酵液中残糖含量控制在1-2.5%，既不会构成底物限制，又不会引起“葡萄糖效应”，菌种的生产能力得到最大限度的发挥；同时通过分段供氧控制发酵液中的溶氧，既不会影响发酵前期菌种扩增，也不会在后期影响发酵，L-异亮氨酸得以大量积累。
（3）本发明发酵方法可以通过发酵罐进行自动控制，工艺操作简便、设备要求低、发酵时间短、生产成本低、经济效益显著，特别适合工业化大规模生产。
附图说明
图1：重组质粒pBR322-hom的构建示意图。
图2：重组质粒的酶切电泳图；图中，M：Marker，1：重组质粒pBR322-hom经XbaI单酶切后得到特异性条带，2：重组质粒pBR322-hom经XbaI和SacI双酶切后得到特异性条带，3：hom基因条带。
图3：SDS-PAGE；图中，M：Marker，1：C.glutamicum YILW（pBR322-hom），2：C.glutamicum ATCC13032，3：C.glutamicum YILW（pBR322）。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，现有的L-异亮氨酸发酵法仍存在产酸率低、糖酸转化率低的问题。根据报道，目前国内L-异亮氨酸的发酵水平在25-32g/L左右，国际水平在50g/L左右。因此，仍需进一步技术攻关，以提高L-异亮氨酸的发酵产率。
基于此，本发明提供了一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法，将异亮氨酸生产菌种接种至含有发酵培养基中进行发酵，得到L-异亮氨酸。
对于L-异亮氨酸发酵而言，选择高产菌种是关键，工业发酵若想获得高产的菌种，必须突破或解除微生物细胞自我调节控制机制。L-异亮氨酸发酵生产的代谢调控育种的基本途径有：切断或改变平行的代谢途径，解除菌体自身的反馈抑制，增加前提物质的合成，切断进一步代谢途径和利用基因工程技术构建L-异亮氨酸工程菌。
高丝氨酸脱水酶（homoserine dehydrogenase，EC1.1.1.3）是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glu-tamicum）中L-异亮氨酸的合成途径中的关键酶之一，由hom基因编码，受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏.在L-异亮氨酸生物合成过程中，天冬氨酸半醛是合成赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的共同代谢中间体，在谷氨酸棒杆菌中L-蛋氨酸和L异亮氨酸均不同程度地阻遏hom-thrB操纵子的转录，阻断天冬氨酸半醛进入L-异亮氨酸生物合成途径，从而在一定程度上促进了赖氨酸的生物合成。通过过表达关键酶解除其反馈抑制可以提高目的产物的代谢流量，减少中间产物的积累及副产物形成。以L–异亮氨酸生产菌C.glutamicumYILW基因组DNA为模板克隆hom基因片段，将纯化后的PCR产物双酶切后连接到表达载体pBR322上，构建出重组质粒pBR322-hom(图1)。分别进行XbaI单酶切及XbaI和SacI双酶切验证，结果如图2所示。
重组质粒pBR322-hom单酶切后得到一条大小约为8,000bp的特异性条带；双酶切后在约6,600bp和1,400bp处观察到目的条带，分别为酶切后的pBR322载体与hom基因。结合测序结果表明重组质粒构建成功。
以C.glutamicumATCC13032为对照，比较重组菌C.glutamicum YILW（pBR322-hom）及C.glutamicum YILW（pBR322）的蛋白表达情况。超声破碎菌体后，收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白电泳，结果如图3所示。
高丝氨酸脱水酶的相对分子质量为4.63×104；可以看出3种菌株在相对分子质量约为4.63×104处均有特异性条带，但蛋白表达量有一定差异（蛋白上样量一致），C.glutamicum YILW（pBR322）与C.glutamicum ATCC13032的蛋白表达量差别不大，这可能是由于ATCC标准菌株和宿主菌中高丝氨酸脱水酶的表达量本身就比较少；但重组菌C.glutamicum YILW（pBR322-hom）蛋白表达量明显较前两者增多，证明表达载体pBR322-hom构建成功，并且高丝氨酸脱水酶得到过量表达。
将此质粒扩增后导入受体C.glutamicumYILW，培养，然后用氨苄西林进行筛选，鉴定阳性转化子，构建得到重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)；
重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)中过表达高丝氨酸脱水酶可以明显降低副产物赖氨酸的积累量。
为了进一步的提高菌株生产L-异亮氨酸的能力，本发明通过RNAi技术敲除了重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)中的两个基因，分别为：编码天冬氨酸-β-半醛生成赖氨酸的关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶（dihydrodipicolinate synthase，DHDPS）和高丝氨酸生成蛋氨酸的高丝氨酸转乙酰基酶（homoserine transacetylase，HT）的基因，即构建得到用于L-异亮氨酸生产的工程菌。
天冬氨酸-β-半醛在DHDPS的催化下生成L-Lys，敲除掉DHDPS基因后，天冬氨酸-β-半醛只剩高丝氨酸一个流向，增加了Glc的利用率。在L-Ile合成过程中，高丝氨酸优先合成蛋氨酸，当蛋氨酸过剩时回反馈阻遏高丝氨酸转乙酰酶的合成，转而合成苏氨酸，苏氨酸→α-酮基丁酸→α-乙酰基-α-羟基丁酸→L-Ile，敲除掉HT基因后，高丝氨酸会转而合成苏氨酸，从而有效提高了L-异亮氨酸产量。
需要说明的是，本发明的用于L-异亮氨酸生产的工程菌的构建方法中，所用到的重组质粒构建、基因敲除等技术均为现有常规的基因工程方法，构建过程具有再现性和可重复性。
在获得高产菌株之后，培养条件的优化与否直接影响到代谢方式及代谢流量的变化，从而影响目的产物的产量。其中：
发酵培养基的组成和配比对菌种的生长、L-异亮氨酸的形成，以及提取工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响。本发明对发酵培养基的组成进行了优化，优化后的发酵培养基的组成如下：
KH2PO4 1.35g/L、K2HPO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 7.5mg/L、MnSO4·H2O 7.5mg/L、VB10.15mg/L、葡萄糖90g/L、酵母浸出粉3g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸0.75g/L、蛋氨酸0.225g/L、消泡剂 0.25mL/L；pH 7.5±0.1。
本发明的发酵培养基中，选择KH2PO4和K2HPO4作为酸碱缓冲对，其作用相当重要，低pH下，菌种受负反馈调节的抑制，即产物过多抑制代谢活动，所以添加KH2PO4和K2HPO4使发酵培养基的pH维持稳定状态，有助于提高菌种的利用率；酵母浸出粉、赖氨酸、蛋氨酸是必须有的组分，菌种为营养缺陷型工程菌，若无酵母浸出粉、Lys、Met菌种不生长；与现有研究不同的是，本发明发现Fe2+是影响本发明所构建的工程菌菌体生长的重要离子，用吸收光谱和薄层层析相结合的方法
研究了Fe2+对工程菌生长及氨基酸合成的影响，发现适量浓度的Fe2+可促进菌体生物量增加，总氨基酸合成量也增加。
本发明通过对发酵培养基组成和用量的优化，使之更有利于菌种的生长、L-异亮氨酸的形成。
在本发明的一种实施方案中，给出了溶氧控制发酵的关键工艺控制，包括：
第一，采用分段供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度。发酵初始阶段（发酵初始阶段是指菌种在生长曲线上处于延滞期和对数期前中期的阶段，当菌种处于延滞期末期时，菌体数量增长不明显，此时即可定义为发酵初始阶段结束），维持初始条件：发酵温度29-30℃，风量6-8L/min，搅拌转速400-450rpm，罐压0.02-0.04MPa；
当溶氧低于15%时，将搅拌转速提高至500rpm；当溶氧低于13%时，将搅拌转速提高至550rpm；当溶氧降至5%时，将搅拌转速降至450rpm，继续发酵。
第二，当发酵罐中的残糖含量降至1-3%时，进行发酵转换，开始低溶氧发酵，所述低溶氧发酵的条件为：温度32-33℃，pH=7.5，搅拌转速150-200rpm，通风，控制溶氧在7-12%，流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在1-2.5%，流加葡萄糖的总量为发酵液重量的8-10%；当发酵液中的残糖含量降至1%以下时，结束发酵。
在上述发酵过程中，通风采用的是专利ZL201920927501.2中公开的“空气过滤系统”。
另外，在低溶氧发酵过程中，为保证反应的顺利进行，还包括：补小料、补氨水和补消泡剂的步骤。小料是通过补料罐，在蠕动泵控制流速的情况下补入发酵罐的，一般是在发酵至22h时进行第一次补小料K2HPO40.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、烟酰胺（VB3） 10mg/L，发酵至43h时进行第二次补小料K2HPO40.2g/L、KH2PO40.2g/L，补充的小料中K2HPO4、KH2PO4其实质是酸碱缓冲对；补小料中各物质的浓度表示缓冲对在大发酵罐中的浓度，均按照补糖后总发酵液的体积进行计算。
补氨水是将一定浓度的氨水，例如质量浓度为20-30%的氨水通过蠕动泵控制流速流加到发酵罐中，使发酵液的pH维持在7.5。
消泡剂则是根据发酵罐中的泡沫情况进行流加。
综上，本发明通过对L-异亮氨酸生产菌株的优化、发酵培养基组成的优化以及发酵工艺条件的优化，从而有效提高了大罐生产中L-异亮氨酸产率和糖酸转化率，达到甚至优于国际先进的水平。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，pBR322购买自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心-NTCC典型培养物保藏中心。
本发明的发酵过程中相关指标的检测方法：
1.OD值测定：发酵液用蒸馏水稀释至1/20后，用分光光度计于610nm处测定OD值。
2.pH：酸度计测定。
3.溶氧：利用电极在线测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100%，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。
4.残糖含量：分别通过M100葡萄糖检测仪和滴定法进行测定。
5. L-异亮氨酸含量：采用纸上层析法
实施例1：用于L-异亮氨酸生产的工程菌种的构建
以L–异亮氨酸生产菌C.glutamicumYILW基因组染色体DNA为模板，使用P1（5'-CGGCTAGTCGACGTTCAATTGCCATGTCAGT-3'，划线处为Sal I酶切位点；SEQ ID NO.1）和P2（5'-GCGCCGAGGATCCGTAATAGGACAACAACGC TC-3'，划线处为BamH I酶切位点；SEQ ID NO.2）为引物，PCR扩增出高丝氨酸脱水酶编码基因 hom。使用BamH I和Sal I对PCR产物及质粒pBR322进行双酶切，连接产物化学转化法转入E.coli DH5a，在终浓度为25ug/mL氨苄西林的LB平板上37℃培养。用引物P3（5'-GACAATTAATCATCGGCTCG-3'；SEQ ID NO.3）、P4（5'-CAGGCTGAAA ATCTTCTCTC-3'；SEQ ID NO.4）鉴定长出的转化子，挑选阳性克隆，双酶切验证，测序。以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组DNA为模板克隆hom基因片段，将纯化后的PCR产物双酶切后连接到表达载体pBR322上，构建出重组质粒pBR322-hom（图1）。对构建的重组质粒pBR322-hom分别进行SacI单酶切及BamHI和SacI双酶切验证，结果如图2所示。重组质粒pBR322-hom单酶切后得到一条大小约为5490bp的特异性条带；双酶切后在约4100bp和1390bp处观察到目的条带，分别为酶切后的pBR322载体与hom基因。结合测序结果表明重组质粒构建成功。
将此质粒扩增后导入受体C.glutamicum YILW，培养，然后用氨苄西林和四环素通过影印法进行筛选（工程菌有氨苄抗性，无四环素抗性），最终确定目的基因在工程菌内表达，即构建得到重组菌C.glutamicum YILW（pBR322-hom）。
通过RNAi技术敲除了重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)中的两个基因，分别为：编码天冬氨酸-β-半醛生成赖氨酸的关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶（dihydrodipicolinate synthase，DHDPS）基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；以及高丝氨酸生成蛋氨酸的高丝氨酸转乙酰基酶（homoserine transacetylase，HT）的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；即构建得到用于L-异亮氨酸生产的工程菌。
实施例2：L-异亮氨酸的生产
1.菌种的扩大培养：
将实施例1构建的用于L-异亮氨酸生产的工程菌菌种分别经一级种子瓶培养和二级种子罐培养进行扩大培养，得到种子液。其中：
一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；一级种子瓶中菌种培养至对数期后，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养。
二级种子罐培养的培养基配方为：KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、VB1 0.3mg/L、葡萄糖50g/L、酵母浸出粉5g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸1g/L、蛋氨酸1g/L；pH 7.5±0.1。
二级种子罐培养的条件为：温度32℃，pH6.8-7.0，溶解氧20-30%，罐压0.03MPa，风量15L/min，搅拌转速400rpm；接种量为10%（体积分数），培养10-12h。
2.发酵：
将扩大培养得到的种子液按体积比为8%接种至发酵培养基中，发酵培养基的成分为：KH2PO4 1.35g/L、K2HPO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 7.5mg/L、MnSO4·H2O 7.5mg/L、VB10.15mg/L、葡萄糖90g/L、酵母浸出粉3g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸0.75g/L、蛋氨酸0.225g/L、消泡剂 0.25mL/L；pH 7.5±0.1。在发酵罐（30L）中进行大罐发酵。
初始条件为：发酵温度30℃，风量7L/min，搅拌转速450rpm，罐压0.02-0.04MPa；
当溶氧低于15%时，将搅拌转速提高至500rpm；当溶氧低于13%时，将搅拌转速提高至550rpm；当溶氧降至5%时，将搅拌转速降至450rpm，继续发酵；
当发酵液中的残糖降至1-3%时，开始低溶氧发酵，低溶氧发酵的条件为：温度32℃，pH=7.5，搅拌转速200rpm，通风，控制溶氧在7-12%，将葡萄糖配制成质量浓度为70%的葡萄糖溶液，并进行灭菌处理，然后采用蠕动泵向发酵罐中流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在1-2.5%，流加葡萄糖的总量为发酵液重量的9%。
在发酵过程中，通过蠕动泵流加质量浓度为25%的氨水，使发酵液的pH维持在7.5左右。并根据发酵罐中的泡沫情况，流加消泡剂进行消泡处理。
当发酵液中的残糖含量降至1%以下时，结束发酵。
经检测发现，采用本实施例的发酵工艺，产异亮氨酸1009.8g，异亮氨酸产率50.49g/L，耗糖3886g，糖酸转化率25.98%，相较国内常见发酵工艺，本发明发酵工艺的异亮氨酸产率糖酸转化率有了大幅的提升。
实施例3：L-异亮氨酸的生产
1.菌种的扩大培养：
将实施例1构建的菌种分别经一级种子瓶培养和二级种子罐培养进行扩大培养，得到种子液。其中：
一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；一级种子瓶中菌种培养至对数期后，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养。
二级种子罐培养的培养基配方为：KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、VB1 0.3mg/L、葡萄糖50g/L、酵母浸出粉5g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸1g/L、蛋氨酸1g/L；pH 7.5±0.1。
二级种子罐培养的条件为：温度32℃，pH6.8-7.0，溶解氧20-30%，罐压0.03MPa，风量15L/min，搅拌转速400rpm；接种量为10%（体积分数），培养10-12h。
2.发酵：
将扩大培养得到的种子液按体积比为8%接种至发酵培养基中，发酵培养基的成分为：KH2PO4 1.35g/L、K2HPO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 7.5mg/L、MnSO4·H2O 7.5mg/L、VB10.15mg/L、葡萄糖90g/L、酵母浸出粉3g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸0.75g/L、蛋氨酸0.225g/L、消泡剂 0.25mL/L；pH 7.5±0.1。在发酵罐（30L）中进行大罐发酵。
初始条件为：发酵温度30℃，风量7L/min，搅拌转速450rpm，罐压0.02-0.04MPa；
当溶氧低于15%时，将搅拌转速提高至500rpm；当溶氧低于13%时，将搅拌转速提高至550rpm；当溶氧降至5%时，将搅拌转速降至450rpm，继续发酵；
当发酵液中的残糖降至1-3%时，开始低溶氧发酵，低溶氧发酵的条件为：温度33℃，pH=7.5，搅拌转速200rpm，通风，控制溶氧在7-12%，将葡萄糖配制成质量浓度为70%的葡萄糖溶液，并进行灭菌处理，然后采用蠕动泵向发酵罐中流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在1-2.5%，流加葡萄糖的总量为发酵液重量的9%。
在发酵至22h补小料K2HPO4 0.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L 、烟酰胺（VB3） 10mg/L；发酵至43h补小料K2HPO4 0.2g/L、KH2PO4 0.2g/L，小料配比均按补糖后的体积计算。
在催化发酵过程中，通过蠕动泵流加质量浓度为25%的氨水，使发酵液的pH维持在7.5左右。并根据发酵罐中的泡沫情况，流加消泡剂进行消泡处理。
当发酵液中的残糖含量降至1%以下时，结束发酵。
经检测发现，采用本实施例的发酵工艺，产异亮氨酸1102.5g，异亮氨酸产率52.5g/L，耗糖5300g，糖酸转化率20.8%，相较国内常见发酵工艺，本发明发酵工艺的异亮氨酸产率和糖酸转化率有了大幅的提升。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司，汕头市佳禾生物科技有限公司
<120> 一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggctagtcg acgttcaatt gccatgtcag t 31
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atctttacaa aaccgattac ttttgtcgga atctgacgtc agcatacctg ctaccacttc 60
cagagttcaa tcgatcttcg cctcgttgaa acgttttccc tcttcgatta tcaacagtgt 120
ctccactcgt atcatcaccg cctccaacta attttgccat ctctctcgtt gttccaattt 180
gattctacta gtgagctccg atttaattta gggttttgaa agatgtcagc tttgaaaaat 240
tacggcttga tctccattga ttctgccctc cattttcctc gatcaaatca attgcagagc 300
tataagagaa ggaatgcaaa atgggtctct ccaatagcag ctgttgtacc taacttccat 360
cttcctatgc gcagtctcga ggataaaaac aggacaaaca cagacgacat aaggtccctt 420
agagtgatca cagccattaa gacaccgtat ttacctgatg gaagattcga cctccaagca 480
tacgatgact tagtcaacac gcagatagaa aacggtgctg aaggtgtgat tgttggtggt 540
acaactggtg aaggccaatt gatgagctgg gatgagcaca taatgcttat cggccatact 600
gtaaattgtt ttgggggaag gatcaaagtc attggaaaca ctggaagtaa ctcgactagg 660
gaagctattc atgccactga gcaaggattc gccatgggaa tgcacggggc actgcacatt 720
aacccttact atggaaaaac atccattgaa ggcatgaatg cgcattttca aaccgttctt 780
catatgggac cgactattat atacaacgtg ccaggtcgaa cgtgccagga tatacctccc 840
caggttatct ttaaactctc tcagaaccct aatatggctg gggttaagga atgcgttggt 900
aataaccgag ttgaagagta tactgagaag ggaattgtcg tttggagtgg aaatgatgat 960
cagtgccatg attctagatg ggatcacggt gccactggag tgatatcggt tactagcaat 1020
ttagttccgg gtttgatgag gaagttgatg tttgaaggta gaaactcagc gttgaacgca 1080
aagcttcttc ctttaatgga ttggctattc caagaaccga atcccattgg tgtaaacact 1140
gctttggctc agttaggagt tgcgaggccg gtttttcggt taccttatgt gccattgcct 1200
ctgtccaaaa ggattgagtt cgttaaactg gtgaaggaaa tcggaaggga gcattttgta 1260
ggagacagag atgttcaggt acttgatgat gatgacttca tcttaatcgg tcgatattag 1320
agtctcttcc ctgaagattg gttgtgttta tactttcttc gttcagttgt tagttattta 1380
gctgatgaga aactcacaga tggatcaaga cttctacttg ttgtaatgtt tggtctgtta 1440
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ggcgaattga tccgccagac actgggattg gctgatcgtg aaggcgcgtg tcggcggtga 1140

Claims (2)

1.一种提高L-异亮氨酸产率的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
将L-异亮氨酸生产菌种的种子液接种至发酵培养基中，进行发酵，得到L-异亮氨酸；
所述发酵包括：
初始条件为：发酵温度29-30℃，风量6-8L/min，搅拌转速400-450rpm，罐压0.02-0.04MPa；
当溶氧低于15%时，将搅拌转速提高至500rpm；当溶氧低于13%时，将搅拌转速提高至550rpm；当溶氧降至5%时，将搅拌转速降至450rpm，继续发酵；
当发酵液中的残糖降至1-3%时，开始低溶氧发酵，所述低溶氧发酵的条件为：温度32-33℃，pH=7.5，搅拌转速150-200rpm，通风，控制溶氧在7-12%，流加葡萄糖，使发酵液中的残糖含量控制在1-2.5%，流加葡萄糖的总量为发酵液重量的8-10%；当发酵液中的残糖含量降至1%以下时，结束发酵；
所述发酵培养基的成分为：
KH2PO4 1.35g/L、K2HPO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、(NH4)2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 7.5mg/L、MnSO4·H2O 7.5mg/L、VB10.15mg/L、葡萄糖90g/L、酵母浸出粉3g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸0.75g/L、蛋氨酸0.225g/L、消泡剂 0.25mL/L；pH 7.5±0.1；
所述L-异亮氨酸生产菌种由如下方法构建而成：
以 L–异亮氨酸生产菌 C. glutamicum YILW 基因组为模板克隆 hom 基因，将 hom基因与表达载体 pBR322 连接构建得到重组质粒 pBR322-hom，再转入受体C. glutamicumYILW，构建得到重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)；
将重组菌C. glutamicum YILW(pBR322-hom)的二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因和高丝氨酸乙酰基转移酶编码基因敲除，即制备得到L-异亮氨酸生产菌种；
所述低溶氧发酵还包括：补小料的步骤，所述补小料具体为：在低溶氧发酵的过程中进行两次补小料；第一次补小料K2HPO4 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L 、烟酰胺（VB3）10mg/L；第二次补小料K2HPO4 0.2g/L 、KH2PO4 0. 2g/L；
所述L-异亮氨酸生产菌种的种子液是由L-异亮氨酸生产菌种经一级种子瓶培养和二级种子罐培养得到；
一级种子瓶培养的培养基为LB液体培养基；一级种子瓶中菌种培养至对数期后，将一级种子瓶中的菌液接种至二级种子罐进行培养；
二级种子罐培养的培养基成分为：
KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、(NH4) 2SO4 2.25g/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、VB1 0.3mg/L、葡萄糖50g/L、酵母浸出粉5g/L、甜菜碱0.225g/L、赖氨酸1g/L、蛋氨酸1g/L；pH 7.5±0.1；
二级种子罐培养的条件为：温度32℃，pH6.8-7.0，溶解氧20-30%，罐压0.03MPa，风量15L/min，搅拌转速400rpm；接种量为5-15%；
所述低溶氧发酵还包括：流加质量浓度为20-30%的氨水，使发酵液的pH维持在7.5±0.1的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨水的质量浓度为25%。
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