CN111321100B

CN111321100B - 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌

Info

Publication number: CN111321100B
Application number: CN202010129934.0A
Authority: CN
Inventors: 王小元; 张炎潮; 柳亚迪; 胡晓清
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111321100A

Abstract

本发明涉及一株产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。该菌株以L‑异亮氨酸工业生产菌WM001为基础，通过基因敲除、过表达等手段对其L‑异亮氨酸合成代谢途径进行改造，最终得到的菌株WM005/pYCW‑1‑ilvBN‑ppnK能够稳定遗传，且在制备L‑异亮氨酸过程中无需添加抗生素，减少了产生耐药性菌株的风险，制备得到的L‑异亮氨酸适合医疗、化妆品、工业等各个领域的生产，不会因为抗生素而造成产品的污染；在5L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L‑异亮氨酸，糖酸转化率达到0.181g/g，适用于L‑异亮氨酸的工业化生产。

Description

一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌

技术领域

本发明构建一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

L-异亮氨酸是人体必需的三种支链氨基酸(BCAA)之一，在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品成分。L-异亮氨酸主要通过微生物发酵生产，而大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌是主要的生产菌株。但是，大肠杆菌通常会合成内毒素，这可能会污染产品。因此，谷氨酸棒状杆菌成为生产L-异亮氨酸的理想菌株。

在谷氨酸棒状杆菌中，由于L-异亮氨酸与其他氨基酸相互交织合成：从L-天冬氨酸开始，由十个反应步骤组成的L-异亮氨酸生物合成途径是复杂的。因此，L-异亮氨酸的生产是比较困难的。L-异亮氨酸生物合成途径中有十种关键酶分别为天冬氨酸激酶(AK)，半醛脱氢酶(ASD)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)，苏氨酸合酶(TS)，苏氨酸脱水酶(TD)，乙酰羟酸合酶(AHAS)，乙酰羟酸异构酶(AHAIR)，羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)，它们分别由基因lysC，asd，hom，thrB，thrC，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD和ilvE编码。从理论上讲，TD(ilvA基因编码)和AHAS(ilvBN基因编码)在这些酶中更为重要，TD催化形成L-异亮氨酸生物合成的关键前体物质——2-酮丁酸；AHAS在平衡谷氨酸棒状杆菌细胞中L-缬氨酸和L-异亮氨酸的水平方面起着重要作用，它可以催化两个丙酮酸分子的缩合，导致L-缬氨酸的合成，或者丙酮酸和2-酮丁酸的缩合，导致L-异亮氨酸合成。

实验室早期研究，已经通过质粒载体过表达lrp，brnFE，ilvBN，ilvA和ppnK来构建生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株，但在发酵过程中必须添加抗生素如卡那霉素，维持带有这些基因的质粒。参考以下文章：

1.Yin L,Hu X,Wang X,et al.Co-xpression of feedback-resistantthreonine dehydratase and acetohydroxy acid synthase increases L-isoleucineproduction in Corynebacterium glutamicum.2012,MetabEng

2.Yin L,Shi F,Wang X et al.Increasing L-isoleucine production inCorynebacterium glutamicumbyoverexpressing global regulator Lrp and two-component export system BrnFE.2013,J Appl Microbiol

3.Yin L,Zhao J,Wang X,et aL Increasing L-isoleucine production inCorynebacterium glutamicum byenhancing the carbon flux in its biosynthesispathway and NADPH supply.2013,BioprocBiotechnol Engineer

为了构建一株不依赖抗生素且能进行过表达特定基因的菌株，本发明采用了构建营养缺陷型菌株的方法。基因alr编码丙氨酸消旋酶，丙氨酸消旋酶能将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是形成谷氨酸棒状杆菌的肽聚糖层的关键前体。因此，基因alr被用于构建谷氨酸棒状杆菌中的营养缺陷型互补表达系统。敲除alr后，菌株由于无法自身合成D-丙氨酸，需要补加D-丙氨酸才能存活，因而构建得到一株D-丙氨酸缺陷型菌株，后将alr与需要过表达的基因进行串联转入缺陷型菌株中，用于筛选得到不添加抗生素的菌株。

实验室前期通过强化碳流和提高NADPH供应，获得最优表达组合菌株IWJ001/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1-ppnK1积累了高水平的L-异亮氨酸。(Yin L,Zhao J,Wang X,et aLIncreasing L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum by enhancingthe carbon flux in its biosynthesis pathway and NADPH supply.2013,BioprocBiotechnol Engineer)在基于alr的营养缺陷型互补表达系统的基础上，过表达ilvBN可以增强碳流和过表达ppnK可以增加辅酶因子NADPH供应，从而提高L-异亮氨酸的产量。

近些年来，一些代谢工程策略用于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的研究已被报道，通过敲除基因alaT可以减少主要杂酸L-丙氨酸和增加丙酮酸前体物质供应(alaT可以将丙酮酸转换成L-丙氨酸，而L-丙氨酸是L-异亮氨酸生产的主要杂酸；减少L-丙氨酸同时增加胞内的-丙酮酸，丙酮酸也是前体物质)，通过敲除brnQ可以避免L-异亮氨酸的主动输入(brnQ基因是将L-异亮氨酸从胞外摄取到胞内的关键基因，敲除后可使胞外L-异亮氨酸含量更高)，有利于谷氨酸棒状杆菌的L-异亮氨酸生产。但是尚无报道结合多种策略于改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸。此外，通过强启动子替换过表达ilvA可以增加2-酮丁酸前体物质供应。

发明内容

本发明旨在提供一株通过启动子替换、基因敲除和基于alr的营养缺陷型互补表达系统，运用多种代谢工程策略，最终构建无需添加抗生素的高产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌工程菌。

本发明提供了一株生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK，所述工程菌是以菌株WM001为出发菌株，所述菌株WM001是一株由ATCC13869随机诱变得到的L-异亮氨酸工业生产菌，构建方法记载于Wenjian M,Jianli W,Ye L,etal.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)co-produced with l-isoleucinein Corynebacterium glutamicum WM001[J].Microbial Cell Factories,2018,17(1):93。

一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK的制备方法，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK。

在本发明的一种实施方式中，先扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，构建得到包含启动子tac的载体，再将所述载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株WM002。

在本发明的一种实施方式中，所述包含启动子tac的载体是在载体pDXW-3的基础上，将ilvA启动子替换为tac启动子的片段连接，得到载体pYCW-tacPilvA。

在本发明的一种实施方式中，所述载体pDXW-3的构建方法记载于论文《Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion inCorynebacterium glutamicum》中。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子tac核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子ilvA的上下游片段分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，按照下述步骤敲除基因alaT：先以pDTW-202为模板，扩增如SEQ ID NO.4所示的片段，再以WM001基因组为模板，分别扩增得到如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的片段，将扩增的片段经酶切后依次酶连接至线性化载体pBluescriptII SK(+)，得到alaT基因敲除载体pYCW-△alaT，将所述alaT基因敲除载体pYCW-△alaT转入WM002，再转入结合载体pDTW-109，得到alaT基因敲除菌株WM003。

在本发明的一种实施方式中，所述pDTW-202载体的构建方法记载于论文《Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion systemin Corynebacterium glutamicum》中。

在本发明的一种实施方式中，按照下述步骤敲除基因brnQ：先以pDTW-202为模板，扩增如SEQ ID NO.4所示的片段，再以WM001基因组为模板，分别扩增得到如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的片段，将扩增的片段经酶切后依次连接至线性化载体pBluescript IISK(+)，得到brnQ基因敲除载体pYCW-△brnQ，再将所述brnQ基因敲除载体pYCW-△brnQ转入WM003中，再转入结合载体pDTW-109，得到alaT和brnQ双基因敲除菌株WM004。

在本发明的一种实施方式中，按照下述步骤敲除基因alr：先以pDTW-202为模板，扩增如SEQ ID NO.4所示的片段，再以WM001基因组为模板，分别扩增得到如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的片段，将扩增的片段经酶切后依次连接至线性化载体pBluescript IISK(+)，得到alr基因敲除载体pYCW-△alr，再将所述alr基因敲除载体pYCW-△alr转入WM004中，再转入结合载体pDTW-109，得到营养缺陷型菌株WM005。

在本发明的一种实施方式中，利用NdeI酶切去除pJYW-4载体上原有的来自于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的alr片段，得到线性化载体；以WM001基因组为模板，扩增出如SEQID NO.11所示的片段；将如SEQ ID NO.11所示的片段与线性化载体连接，得到载体pYCW-1，将载体pYCW-1转入WM005中，得到回补菌株WM005/pYCW-1。

在本发明的一种实施方式中，pJYW-4核苷酸序列/构建方法公开于专利《一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统》公开号：CN 103834679B。

在本发明的一种实施方式中，用NotI和EcoRI酶切载体pYCW-1后，获得线性载体；以WM001基因组为模板，分别扩增出ilvBN(如SEQ ID NO.12所示)和ppnK片段(如SEQ IDNO.13所示)；将ilvBN和ppnK片段分别于线性载体连接，分别得到载体pYCW-1-ilvBN和pYCW-1-ppnK；将载体pYCW-1-ilvBN转入WM005/pYCW-1中得到菌株WM005/pYCW-1-ilvBN；将将载体pYCW-1-ppnK转入WM005/pYCW-1中得到菌株WM005/pYCW-1-ppnK。

在本发明的一种实施方式中，ilvBN和ppnK片段分别如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示。

在本发明的一种实施方式中，先用EcoRI酶切载体pYCW-1-ilvBN后，得到线性载体；再以质粒pYCW-1-ppnK为模板，扩增得到带有tac启动子的ppnK片段tac-ppnK；然后将线性载体同片段tac-ppnK连接，得到共表达载体pYCW-1-ilvBN-ppnK；最后将共表达载体pYCW-1-ilvBN-ppnK转入WM005，得到最终表达组合工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK。

在本发明的一种实施方式中，所述带有tac启动子的ppnK片段tac-ppnK如SEQ IDNO.14所示。

本发明提供了一种L-异亮氨酸的生产方法，所述方法为将工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK在固体活化平板上进行活化至形成菌苔；将菌苔放与种子培养基中25～35℃、180～220rpm培养16～20h，得到种子培养物；将培养物接入发酵培养基，使培养物在发酵培养基中的初始OD₅₆₂为1.5～2.0，在25～35℃、180～220rpm培养70～75h，即得到含有L-异亮氨酸的发酵液。

在本发明的一种实施方式中，在发酵期间控制pH为6.8～7.2，溶氧水平(DO)为18～32％，补加葡萄糖溶液以维持葡萄糖水平在20～30g/L。

在本发明的一种实施方式中，将培养物以发酵培养基的0.8～1.2％(v/v)的接种量接种至发酵培养基。

本发明提供了所述工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK在工业、医疗、化妆品领域制备L-异亮氨酸中的应用。

有益效果：

(1)本发明构建的一株L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK，遗传性能稳定，且在制备L-异亮氨酸过程中无需添加抗生素，避免了工业添加的成本问题和减少了产生耐药性菌株的风险；制备得到的L-异亮氨酸适合医疗、化妆品、等各个领域的工业生产，不会因为抗生素而造成产品的污染。

(2)在L-异亮氨酸工业生产菌WM001基础上，通过启动子tac替换ilvA和敲除alaT分别增加了2-酮丁酸和丙酮酸供应，通过敲除brnQ优化L-异亮氨酸运输系统，并且通过基于alr的营养缺陷型互补表达系统过表达ilvBN和ppnK，分别强化碳流和NADPH供应。本发明通过多种代谢工程策略的结合使得工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK在5-L发酵罐补料分批发酵中积累32.1g/L的L-异亮氨酸，糖酸转化率达到0.181g/g，是目前报道中非常有竞争力的工业生产菌。

附图说明

图1为谷氨酸棒杆菌中L-异亮氨酸的生物合成途径和本发明涉及的工程化策略。实心粗箭头表示L-异亮氨酸生物合成途径中的十个主要反应步骤。黑色虚线箭头表示几种反应。方框代表基因的靶向修饰。符号“×”表示基因缺失。

图2为相关载体与菌株构建示意图；(a)为菌株WM005构建示意图；(b)为相关表达载体示意图。

图3为WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK和WM001的5-L发酵罐补料分批发酵；(a)为L-异亮氨酸的生产；(b)为72小时后测定的氨基酸产量；(c)为细胞生长；(d)为葡萄糖消耗；Lys，L-赖氨酸；Ala，L-丙氨酸；Gly，甘氨酸；Thr，L-苏氨酸；Val，L-缬氨酸。

具体实施方式

表1引物序列

实施例1菌株WM002的构建

利用引物tac-F和tac-R以pJYW-4为模板(pJYW-4核苷酸序列/构建方法公开于专利《一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统》公开号：CN 103834679B)，扩增出启动子tac片段(如SEQ ID NO.1所示)；利用引物PilvA-U-F和PilvA-U-R以WM001基因组为模板(详细步骤参见北京天根生化科技有限公司基因组提取试剂盒)，扩增出ilvA天然启动子的上游片段(如SEQ ID NO.2所示)；利用引物PilvA-D-F和PilvA-D-R以WM001基因组为模板，扩增出ilvA天然启动子的下游片段(如SEQ ID NO.3所示)；利用引物PilvA-U-F和PilvA-D-R，通过重叠PCR获得重叠片段，并在两端添加BamHI和XhoI酶切位点；将扩增出的片段分别进行胶回收；然后，通过BamHI和XhoI酶切载体pDXW-3和重叠片段并连接，获得正确的启动子替换载体pYCW-tacPilvA。然后将载体pYCW-tacPilvA转化入WM001，经过筛选获得转化子，送公司测序验证，得到菌株WM002。(pDXW-3、载体构建详细方法、载体转化方法和后续筛选方法和步骤参照Construction of a novel sacB-based system for marker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum，PCR步骤参照TAKARA公司高保真PrimerStar HS DNA聚合酶，胶回收步骤参照上海生物工程有限公司胶回收试剂盒)。

实施例2菌株WM003的构建

利用引物alaTloxL-kan-F和alaTloxL-kan-R以pDTW-202为模板，扩增出loxL-kan-loxR(如SEQ ID NO.4所示)片段，并在两端添加BamHI和XbaI酶切位点；利用引物alaT-U-F和alaT-U-R以WM001基因组为模板，扩增出敲除基因alaT的上游片段(如SEQ ID NO.5所示)，并在两端添加BamHI和XhoI酶切位点；利用引物alaT-D-F和alaT-D-R以WM001基因组为模板，扩增出敲除基因alaT的下游片段(如SEQ ID NO.6所示)，并在两端添加XbaI和EcoRI酶切位点。然后，利用相应的限制性内切酶处理三个片段，同时用EcoRI和XhoI酶切载体pBluescript II SK(+)后，共同连接获得正确敲除载体pYCW-△alaT。然后，从菌株WM002出发，先后转化敲除载体pYCW-△alaT和用于去除基因组上kan抗性片段的载体pDTW-109，经过筛选获得转化子，利用验证引物alaT-F和alaT-R验证基因组，得到菌株WM003(pDTW-202、pDTW-109以及敲除菌株转化、筛选方法参考Construction and application of anefficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum)。

实施例3菌株WM004和WM005的构建

以WM001基因组为模板，分别扩增敲除基因brnQ的上游片段(如SEQ ID NO.7所示)和敲除基因brnQ的下游片段(如SEQ ID NO.8所示)、敲除基因alr的上游片段(如SEQ IDNO.9所示)和敲除基因alr的下游片段(如SEQ ID NO.10所示)，用于构建敲除载体pYCW-△brnQ和pYCW-△alr(构建方法同pYCW-△alaT类似，所用到的引物分别为pYCW-△brnQ：brnQloxL-kan-F和brnQloxL-kan-R、brnQ-U-F和brnQ-U-R、brnQ-D-F和brnQ-D-R；pYCW-△alr：alrloxL-kan-F和alrloxL-kan-R、alr-U-F和alr-U-R、alr-D-F和alr-D-R)。从菌株WM003出发，先后转化敲除载体pYCW-△brnQ和pDTW-109(在去除基因组kan抗性后会通过37℃温浴去除以便于后续基因的敲除，属于连续敲除系统里的一个必要环节)，筛选、并利用验证引物brnQ-F和brnQ-R进行PCR验证基因组得到WM004；从菌株WM004出发，先后转化敲除载体pYCW-△alr和pDTW-109，筛选、并利用验证引物alr-F和alr-R进行PCR验证基因组得到WM005(图2a)(WM005的筛选过程中需在培养基中需另外添加终浓度为0.4g/L的D-丙氨酸以保证菌株的正常生长)。

实施例4在WM005中回补表达alr，过量表达基因ilvBN和ppnK

首先在pJYW-4基础上，利用NdeI酶切去除该载体上原有的来自于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的alr片段，获得线性载体；利用引物OnestepalrP-F和OnestepalrP-R，以WM001基因组为模板，扩增出alr片段(如SEQ ID NO.11所示)。然后，利用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，C112-01，详细步骤参见说明书)，将线性载体同来自WM001的alr片段连接，得到载体pYCW-1(图2b)；将载体pYCW-1转入WM005中，筛选并利用引物OnestepalrP-F和OnestepalrP-R进行PCR验证基因组得到回补菌株WM005/pYCW-1。

构建ilvBN和ppnK单独表达载体：用NotI和EcoRI酶切载体pYCW-1后，获得线性载体；利用引物对OnestepRBS-ilvBN-F/OnestepilvBN-R和OnestepRBS-ppnK-F/OnestepppnK-R，以WM001基因组为模板，分别扩增出ilvBN(如SEQ ID NO.12所示)和ppnK片段(如SEQ ID NO.13所示)。然后，利用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，C112-01)，将线性载体同ilvBN和ppnK片段连接，分别命名为pYCW-1-ilvBN和pYCW-1-ppnK(图2b)；将载体pYCW-1-ilvBN和pYCW-1-ppnK转入WM005中得到菌株WM005/pYCW-1-ilvBN(利用引物OnestepRBS-ilvBN-F和OnestepilvBN-R进行PCR验证基因组)和WM005/pYCW-1-ppnK(利用引物OnestepRBS-ppnK-F和OnestepppnK-R进行PCR验证基因组)。

用EcoRI酶切载体pYCW-1-ilvBN后，获得线性载体；利用引物OnestepPtac-ppnK-F和OnestepPtac-ppnK-R，以质粒pYCW-1-ppnK为模板，扩增得到带有tac启动子的ppnK片段tac-ppnK(如SEQ ID NO.14所示)。然后，利用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，C112-01，详细步骤参见说明书)，将线性载体同片段tac-ppnK连接，得到共表达载体pYCW-1-ilvBN-ppnK(图2b)。

最后，将pYCW-1-ilvBN-ppnK转入实施例3中构建的WM005(具体转化步骤同实施例2)，得到最终表达组合工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK(利用引物OnestepPtac-ppnK-F和OnestepPtac-ppnK-R以及alr-F和alr-R同时进行PCR验证基因组)。

注：本实施例中所得到的菌株，在筛选过程中需在培养基中另外添加终浓度为0.4g/L的D-丙氨酸以保证菌株的正常生长。

实施例5 72h摇瓶发酵

将上述实施例中制备得到的菌株WM002、WM003、WM004、WM005、WM005/pYCW-1、WM005/pYCW-1-ilvBN、WM005/pYCW-1-ppnK、WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK及出发菌株WM001进行摇瓶发酵并比较L-异亮氨酸生产。

固体活化平板：酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，牛肉浸提物10g/L，琼脂粉20g/L；

种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素1.25g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，无水硫酸镁0.5g/L，玉米浆30g/L；用氢氧化钾调pH＝7.0；

发酵培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵40g/L，磷酸二氢钾1g/L，无水硫酸镁0.5g/L，玉米浆15g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨0.5g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，焦磷酸硫铵素0.001g/L，生物素0.001g/L，用氢氧化钾调pH＝7.2后加入碳酸钙20g/L。

活化菌株：将上述菌株活化于固体活化平板上，置于30℃静置培养36-48h，形成菌苔。

种子培养：用固体活化平板上的菌苔刮入50ml种子培养基/500ml带挡板摇瓶中，30℃，200rpm培养18h。

摇瓶发酵：取1ml种子培养物，测定OD₅₆₂；按照发酵培养基初始OD₅₆₂＝1.8换算，转接种子培养物至50ml发酵培养基/500-ml带挡板摇瓶中，30℃，200rpm培养72h。发酵72h后，取1ml培养物，测定其中L-异亮氨酸水平，细胞干重和葡萄糖含量。细胞干重＝0.6495×OD₅₆₂-2.7925(参考论文《Co-xpression of feedback-resistant threonine dehydrataseand acetohydroxy acid synthase increases L-isoleucine production inCorynebacterium glutamicum》)。

OD₅₆₂测定：用1M稀盐酸稀释一定倍数，在562波长处测定吸光度。

葡萄糖含量测定：取1ml种子培养物12000rpm离心10min后，取上清液，用超纯水稀释上清液200或100倍，利用葡萄糖传感器分析仪测定(山东省科学院，SBA40)。

L-异亮氨酸水平测定：取1ml种子培养物12000rpm离心10min后取上清液，用10％三氯乙酸将上清液稀释20或50倍。4℃过夜处理去除蛋白后，将样品12000rpm离心20min取上清液，再通过0.22μm滤头过滤制样，用于高效液相色谱法分析，具体方法参考论文《Simultaneous analysis ofamino acids and amines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives in cheese by highperformanceliquid chromatography》；发酵结果见表2。

由表2可知，在72h摇瓶发酵结束后，菌株WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK较出发菌株WM001的L-异亮氨酸产量、L-异亮氨酸生产率及糖酸转化率均有显著提高，分别提高了40.9％、44.3％和42.9％。

表2在72h时摇瓶发酵和5L发酵罐补料分批发酵结果

实施例65L发酵罐补料分批发酵

将对照菌WM001和工程菌WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK在5-L BIOSTAT B发酵罐上进行补料分批发酵。

固体活化平板和种子培养基同实施例5，发酵培养基调整如下：葡萄糖100g/L，硫酸铵40g/L，磷酸二氢钾1g/L，无水硫酸镁0.5g/L，玉米浆15g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨0.5g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，焦磷酸硫铵素0.001g/L，生物素0.001g/L，用氢氧化钾调pH＝7.2。

参照实施例5，同时活化4个固体活化平板，30℃静置培养36-48h；菌苔转接入4个50ml种子培养基/500-ml带挡板摇瓶中，30℃，200rpm培养18h；通过300ml无菌注射器，按照发酵培养基初始OD₅₆₂＝1.8换算，以体积分数1％的接种量，转接200ml种子培养物至2L发酵培养基/5-L BIOSTAT B发酵罐；

在培养过程中，通过夹套水热交换控制温度为30℃，通过50％氨水自动调节pH＝7.00，通过1.5vvm通气量和偶联转速控制溶氧水平(DO)为20-30％；每4h取3-5mL培养物，测定氨基酸水平，细胞干重和葡萄糖含量；为了保持葡萄糖水平在25g/L，补加一定量的高浓度葡萄糖溶液(400g葡萄糖溶解于180ml蒸馏水)；发酵72h后结束。结果见表2和图3。

由结果可知，在5L发酵罐补料分批发酵结束后，菌株WM005/pYCW-1-ilvBN-ppnK较出发菌株WM001的L-异亮氨酸产量提高了34.3％、L-异亮氨酸生产率提高了34.3％、糖酸转化率提高了48.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌

<160> 52

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggacgtttga gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 60

ataacaatta gaaggagatc agagta 86

<210> 2

<211> 854

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

atggatccag atcgcatggg caaagctgga gtccctagta gagggcgctc gcattgcatc 60

aaaggaactg ttctaagcta gacaacgagg gttgctagtc taagcagcaa aatgagcggc 120

tgttgttcct tcaggaaaat tatctgaagg aacaacagcc gctcatttta tgtcagtgtg 180

cttttaagcg tcgacgttga tgccaaactg ggtgagcatg tcacgcagag tctgcttgaa 240

cgatgggtcg acggtcacca tgaaggatgc tgcggtggaa gcaagagtgg tgattgcgag 300

caatccctgc agtaccgcaa aaggaatggc aagccattct ggtggggaga caatggaacc 360

aatcactggc atttcggaca accgatcgat cagtgcttgc tgctcttcgc tgatttcatc 420

gtcatcatcg ctggtgtctt tgccggagga gctcaagctc ggggccgcag gaatgtcgcc 480

actgctgagc attgagctgc cttcagagct gcctggccag gtttcgtttc catcgactgg 540

ttttccatca tcatcaagga tctgtgatga ggtgatgttg tctgagagct gtgtcagtgc 600

gtcagaggac tgagcctggg caactggagt gaacacggac aatgccacag cgcttgctgt 660

aacaagggtc aaagtacttc gacgcaaaga caaaactttt ctcctggcaa taaatatgcg 720

gatttactat ggaaacaaga tagaagattg gatagcgaaa gctatcctca actcgtggaa 780

agtgtaatgc cacaaccaca gtattggcta gaaaacaatc tatagcattg ttctggacgt 840

ttgagctgtt gaca 854

<210> 3

<211> 982

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

gagcggataa caattagaag gagatcagag taatgagtga aacatacgtg tctgagaaaa 60

gtccaggagt gatggctagc ggagcggagc tgattcgtgc cgccgacatt caaacggcgc 120

aggcacgaat ttcctccgtc attgcaccaa ctccattgca gtattgccct cgtctttctg 180

aggaaaccgg agcggaaatc taccttaagc gtgaggatct gcaggatgtt cgttcctaca 240

agatccgcgg tgcgctgaac tctggagcgc agctcactca ggagcagcgc gatgcaggta 300

tcgttgccgc atctgcaggt aaccatgccc agggcgtggc ctatgtgtgc aagtccttgg 360

gcgttcaggg acgcatctat gttcctgtgc agactccaaa gcaaaagcgt gaccgcatca 420

tggttcacgg cggagagttt gtctccttgg tggtcactgg caataacttc gacgaagcat 480

cggctgcagc gcatgaagat gcagagcgca ccggcgcaac gctgatcgag cctttcgatg 540

ctcgcaacac cgtcatcggt cagggtacag tggctgctga gatcttgtcg cagctgactt 600

ccatgggcaa gagtgcagat cacgtgatgg ttccagtcgg cggtggcgga cttcttgcag 660

gtgtggtcag ctacatggct gatatggcac ctcgcactgc gatcgttggt atcgaaccag 720

cgggagcagc atccatgcag gctgcattgc acaatggtgg accaatcact ttggagactg 780

ttgatccctt tgtggacggc gcagcagtca aacgtgtcgg agatctcaac tacaccatcg 840

tggagaagaa ccagggtcgc gtgcacatga tgagcgcgac cgagggcgct gtgtgtactg 900

agatgctcga tctttaccaa aacgaaggca tcatcgcgga gcctgctggc gcgctgtcta 960

tcgctgggtt gaactcgagt aa 982

<210> 4

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ataaggatcc aatacgactc actatagggc gaattgggta ccgggcctta ccgttcgtat 60

aatgtatgct atacgaagtt atatcgagat tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag 120

ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg 180

atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag 240

gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc 300

gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 360

tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag 420

acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 480

gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 540

gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 600

tccggtgccc tgaatgaact ccaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 660

ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 720

ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 780

tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 840

gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 900

gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 960

ctcaaggcgc ggatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 1020

ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 1080

gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 1140

ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 1200

atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgtctagt 1260

ataacttcgt ataatgatgc tatacgaacg gtatagcggt ggagctccag cttttgttcc 1320

ctttagtgag ggttaattgc gctctagacg tc 1352

<210> 5

<211> 1009

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 5

tgcgctcgag atttcttagg attccaggct ttcgccattg gtggcgatga cgtcgcggca 60

ccaatcaaag gacttcttct tgtagcgctt caagattcct gagccgccgt cgtcgaggta 120

tttgatgcgg tagtcatcgt ttactgttgg gccggagggt ccgtcgataa gcacgtcctt 180

tgctcctagt ccgttttcga cgatgaacag tggcttctgc cagcgctccc agtagttgtt 240

caggacgatg cgcaaaccga ggggatcaac ttgccaaccc cattcggaag ccgcgagagt 300

ggggctgacc actccgccga tgatgttacc gccaccggtt gagtagtttt cggggttgtg 360

ggcttcacat acggacatgt aataggagaa ggaaatgaaa tcgacggtgt ttttttaaaa 420

tctcacggtc ttcatctgtg atgtcgatgg tgataccctt tcgcggaatt tgcgcagcaa 480

gtagcctggg tattcgccac ggacgtgaat atcgccgaag gcatagtcct cgtgggactt 540

ttgctgggcg gtaagttgat cgcgtgggtc cggggtaatg ccataacgag gaacggcaat 600

aatcatgcaa ccgatctggt tttgtgggtc gatctcatga gcaatcttag ttgccaaagc 660

acttgctact caatcatggt aaacagcctg gtcgcagtcc ttcacgattc aaactttgcc 720

ttccgctacg ccttccacct gatcatcata gaagacggtg aagtaacagc agccggagat 780

cccacagaga tcgtcactgc gggactgatc gaagaagtct acaacgtcaa agcctgtgca 840

tcccagaccc cgtgaacagc aaaccgatga tcgtgccact ggaaagatct taggcagccg 900

tgggattaca cccttttaga gttagaacag taaaaattcg cccaatagct ttcaactacg 960

cacacaaagt ggcaacattg agcgggtgac tacagacaag gatccttat 1009

<210> 6

<211> 880

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

actatctaga ttcaactggc cacatcacga tcacttccga gtggtcaccc tgccatgggc 60

atcccagttg gaaaacgcaa ttgagcgcct gggtaacttc ctgtccactt acaagcagta 120

gtagttgtta ggattcacca cgaatctcag gatttttgag attcgtggtg aatttttgcg 180

ttttccagtc aggctcttgc aactttcgga ccgatttcag aggggcggag ctggtttgtg 240

gtggatcctt gcaatggaac cgcttaggaa taccaagttg gaggccaggg tgttgggatt 300

gcaaaaatcc gtccccagtt cgttgtaaaa tatcgatctt gatcgaatat tagagctaat 360

attggactat tatgcaaaaa ctcgttcgat tcaaggatct cctagcgatc tgagacgaga 420

agttggacag ctaacctgca gaaaccttgc aagaatcaca acagccccaa tggcctcaaa 480

agtcacgccc tcagaatcgc tgccaagcgt ctaaatcccc taaaacggga caataggtca 540

ctgggcgatc ccaagccctt aaaacgtgat ccttaaatac ccactgtcct ctattctggg 600

ttaggcttca ctgggtaaaa gtgcctgcct atgcctgaaa cttgagcatg gcaacagcaa 660

ggagacaccg tgggaaaaca tgcagctgaa acatcggaac cgaagaaaaa ttcaccgtgg 720

cgcattggtt tgttgacgtt tttgatttct tcagttgtcg tgacgctggt gggcatggtg 780

atgctgtggc cggattctga tgatgtggtg ttggcggata acttttcgca gacgtttgcg 840

ggaaatcatg agcaggtgga tggaacgaga attcagatgc 880

<210> 7

<211> 980

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 7

tgcactcgag atttcactaa gcctggttcg gcgatcattg tgccgttgcc tgcttatcct 60

cctttcatcg agttgcctaa ggtgactggt cgtcaggcga tctacattga tgcgcatgag 120

tacgatttga aggaaattga gaaggccttc gctgacggtg ctggatcgct gttgttctgt 180

aatcctcaca acccactggg cacggtcttt tctgaagagt acatccgtga actcaccgat 240

attgcagcga agtacgatgc ccgcatcatc gtcgatgaga tccacgctcc cctggttttt 300

gaaggtaccc atgtagttgc tgctggtgtt tctgagaacg cagcaaatac ctgcatcacc 360

atcactgcaa cttcaaaggc gtggaacact gctggtttga agtgtgctca gatcttcttc 420

actaatgaag ctgatgtaaa agcatggaag aacctatcgg atattactcg tgacggtgtg 480

tccatccttg gattgatcgc tgcggagacg gtgtacaacg agggcgaaga attccttgat 540

gagtcaattc agattctcaa ggacaaccgt gactttgcgg ctgctgaact ggaaaagctt 600

ggcgtgaagg tctacgcacc ggactctact tatttgatgt ggctggactt cgctggcacc 660

aagattgaag aggcgccttc taaaattctt cgtgaggagg gtaaggtcat gctgaatgat 720

ggcgcagctt ttggtggttt caccacctgc gctcgtctta attttgcgtg ttccagagag 780

acccttgagg aggggctgcg ccgtatcgcc agcgtgttgt aaataatgag taaaaagtct 840

gtcctgatta cttctttgat gctgttttcc atgttcttcg gagctggaaa cctcatcttc 900

ccgccgatgc ttggattgtc ggcaggaacc aactatctac cagctatctt aggatttcta 960

gcaacgagtg ggatccttat 980

<210> 8

<211> 838

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

actatctaga ctatccctgc gctgaatcca ttcatcgaat gggcgccgct gcacagcatg 60

tctttgggtt gggttgtccc agttctcgtg gcctctgcca tcggtttggc tattgattgg 120

aacaagaaag gtgcccagtc tgttgcagag aaggaatcca tttccgtcta atcgctaatt 180

gcgaggagtc tttgcatgtc tatcccactt tcactgattg attttgccac catttttgag 240

ggcgaaaggc ctggtgacag cttcaaacga tcagtggcat tggcgcaaaa agctgaaggt 300

ttaggcttca agcgcatttg gtacgcagag catcacaaca tggagagtat ttcttcagct 360

gcgcctgcag tgcttatttc tcacatcggt gcgaacacca agactattcg tctgggtgcc 420

ggcggcgtca tgctgcccaa ccactcccca tatgtcatcg ctgagcagtt cggcaccttg 480

gcggagttgt acccagaccg catcgacctc ggcctgggcc gtgcccctgg cacggacatg 540

aataccttgc gcgctttacg acgcgaccct cagtccgccg agaacttccc gtccgacgtt 600

gtcgagctga actcttacct caccggccgt tcccgtctcc caggggttaa cgcaattcca 660

ggcaagggca ccaacgtacc gctgtacatc ttgggttcat ccctctttgg tgcacaattg 720

gcagcacagt tgggtatgcc ttattccttc gcatcccact tcgcaccaac tcaccttgag 780

cacgcggtgc aaacctaccg ggataactac cagccttcag agcagcgaat tcagatcg 838

<210> 9

<211> 1011

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 9

atattctaga gtagcagaca tcgccggccc agttggctgc gagttttgct ggttcgccgg 60

attcaaagag accgaggttg gaggatccga tgactaggcc tggggctttg accgcgaagg 120

cggcgtcgat tgctgagggg gaggttttcg ctgggtagat tgctccgact gcgcgcacga 180

ggtcgcggtt tgctgcggat agtactgcag ccccagcacc catgccgtgg cctactacac 240

cgaggcaggc tgggttgacg gtgacgtttc cggagccgag ttttactccg ccgagaatct 300

gaatggagga ttcgaggtca gaggcgaaac ctttgtggtc tggcatgaag ccattttcgg 360

tgtctggggc ggcaacagcg atgccccagg acgcgaggtg tcgcaaagtt tggtggtagt 420

acttgatgga tttcatccag tcgtggccga aagctacacc tgggatgccg tcgccttctg 480

ctggggtgta gattttgccc gggatgccgg cgtagttcat atcgcctacc agcacgcggt 540

gcggtccgcg cttggacagt ttggacaggt gtttgttcag attctcagcc acgtgtttaa 600

ggatagttga aagcgtgggg caatactggc actaaccccg gcaccaatcg tatttctgtc 660

cgccgttggt ggcacaatag gtcaacatga acttgctgac caccaaaatt gacctggatg 720

ccatcgccca taacacgagg gtgcttaaac aaatggcggg tccggcgaag ctgatggcgg 780

tggtgaaggc gaatgcatat aaccatggcg tggagaaggt cgctccggtt attgctgctc 840

atggtgcgga tgcgtttggt gtggcaactc ttgcggaggc tatgcagttg cgtgatatcg 900

gcatcagcca agaggttttg tgttggattt ggacaccgga acaggatttc cgcgccgcca 960

ttgatcgcaa tattgatttg gctgttattt ctcccgcgca tggaattcta t 1011

<210> 10

<211> 1022

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 10

atatggatcc tggacaaggc acctcttatg gcctgacctg gcgcgctgag gatcgcggct 60

ttgtggctgt ggtgcctgcg ggctatgccg atggcatgcc gcggcatgcc caggggaaat 120

tctccgtcac gattgatggc gtggactatc cgcaggttgg gcgcgtgtgc atggatcagt 180

tcgttatttc tttgggcgac aatccacacg gcgtggaagc tggggcgaag gccgtgatat 240

tcggtgagaa tgggcatgac gcaactgatt ttgcggagcg tttagacacc attaactatg 300

aggtagtgtg ccgaccaacc ggccgaactg tccgcgcata tgtttaagtg aatacgttta 360

aggagcagca atgaaatctg agtttccggt atccggcacg aggcgttttg agcatgccgc 420

agatacccaa aattttgggg aagaattagg caggcatcta gaagctggcg atgtggtgat 480

tttggacggc ccgctgggtg ctggaaaaac cacatttact caaggtatcg ctcgtggatt 540

gcaggtgaag gggcgggtga catcgccgac gtttgtgatc gcgagggaac accgctcgga 600

aatcggtggg ccagatctga tccacatgga tgcctaccga ttgctgggcg aagacagcga 660

ggatgctgat ccgatcggtg cgctggactc tttggatttg gataccgatt tggacttggc 720

tgtggttgtt gcggaatggg gcggtggctt ggtggagcag atcgctgact cgtatctttt 780

gattactatt gatcgagaga ccgctgtgca ggaagacccg gaatctgagg ctcgaatttt 840

ccattgggaa tggcgcgaag gccgctgaga aagttttcca cactaaaata gtgtgattct 900

gtccgaatct gttgttttag ttttgaaact gcgggatcat ggaaagtagt gaaaagtgaa 960

ttttagttct gtgctttctc tgccctttaa gtgaaccttt tgttggatct tgctcgagta 1020

cc 1022

<210> 11

<211> 1211

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 11

cggtatttca caccgcatat ggtgtttaag gatagttgaa agcgtggggc aatactggca 60

ctaaccccgg caccaatcgt atttctgtcc gccgttggtg gcacaatagg tcaacatgaa 120

cttgctgacc accaaaattg acctggatgc catcgcccat aacacgaggg tgcttaaaca 180

aatggcgggt ccggcgaagc tgatggcggt ggtgaaggcg aatgcatata accatggcgt 240

ggagaaggtc gctccggtta ttgctgctca tggtgcggat gcgtttggtg tggcaactct 300

tgcggaggct atgcagttgc gtgatatcgg catcagccaa gaggttttgt gttggatttg 360

gacaccggaa caggatttcc gcgccgccat tgatcgcaat attgatttgg ctgttatttc 420

tcccgcgcat gccaaagccg tgatcgacac tgatgcggag catattcggg tgtccatcaa 480

gattgattct gggttgcatc gttcgggtgt ggatgagcag gagtgggagg gcgtgttcag 540

cgcgttggct gctgccccgc acattgaggt cacgggcatg ttcacgcact tggcgtgcgc 600

ggatgagcca gagaatccgg aaactgatcg ccaaattatt gcttttcgac gcgcccttgc 660

gctcgcccgc aagcacgggc ttgagtgccc ggtcaaccac gtatgcaact cacctgcatt 720

tttgactcga tctgatttac acatggagat ggtccgaccg ggtttggcct tttatgggtt 780

ggaacccgta gcgggactgg agcatggttt gaagccggcg atgacgtggg aggcgaaggt 840

gagcgtcgta aagcaaattg aagctggaca aggcacctct tatggcctga cctggcgcgc 900

tgaggatcgc ggctttgtgg ctgtggtgcc tgcgggctat gccgatggca tgccgcggca 960

tgcccagggg aaattctccg tcacgattga tggcgtggac tatccgcagg ttgggcgcgt 1020

gtgcatggat cagttcgtta tttctttggg cgacaatcca cacggcgtgg aagctggggc 1080

gaaggccgtg atattcggtg agaatgggca tgacgcaact gattttgcgg agcgtttaga 1140

caccattaac tatgaggtag tgtgccgacc aaccggccga actgtccgcg catatgttta 1200

agtgaatacg t 1211

<210> 12

<211> 2472

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 12

gagcggataa caattgcggc cgcagaagga gtaaatcggt gaatgtggca gcttctcaac 60

agcccactcc cgccacggtt gcaagccgtg gtcgatccgc cgcccctgag cggatgacag 120

gtgcacaggc aattgttcga tcgctcgagg agcttaacgc cgacatcgtg ttcggttacc 180

ctggtggtgc ggtgctaccg gtgtatgacc cgctctattc ctccacaaag gtgcgccacg 240

tcctagtgcg ccacgagcag ggcgcaggcc acgcagcaac cggctacgcg caggttactg 300

gacgcgttgg cgtctgcatt gcaacctctg gcccaggcgc aaccaacttg gttaccccaa 360

tcgctgatgc aaacttggac tccgttccca tggttgccat caccggccag gtcggaagta 420

gcctgctggg taccgatgct ttccaggaag ccgatatccg cggcatcacc atgccagtga 480

ccaagcacaa cttcatggtc accaacccca acgacattcc acaggcattg gctgaggcat 540

tccacctcgc gattactggt cgccctggtc ctgttctagt ggatatcccc aaggatgttc 600

agaacgctga attggatttc gtctggccac caaagatcga cctgccaggc taccgcccag 660

tttcaacacc gcatgctcga cagattgagc aggctgtcaa actgatcggt gagtctaaga 720

agcctgtcct ttacgttggc ggcggcgtta tcaaggctga tgcccacgaa gagcttcgtg 780

cgttcgctga gcacaccggc attccagttg tcaccacatt gatggcgctg ggaaccttcc 840

cagagtccca cgagctgcac atgggtatgc caggcatgca tggcactgtg tccgctgttg 900

gtgcactgca gcgcagcgac ctgctgattg ctatcggctc ccgctttgat gaccgcgtca 960

ccggtgacgt tgacactttc gcacctgatg ccaagatcat tcacgccgac attgatcctg 1020

ccgaaatcgg caagatcaag caggttgagg ttccaatcgt gggcgatgcc cgcgaggttc 1080

ttgctcgtct gctcgaaacc accaaggcaa gcaaggcaga gtctgaggac atctccgagt 1140

gggttgacta cctcaagggc ctcaaggcac gtttcccacg tggctacgac gagcagccag 1200

gcgatctgct ggcaccacag tttgtcattg aaaccctgtc caaggaagtt ggccccgacg 1260

caatttactg cgccggcgtt ggccagcacc agatgtgggc agctcagttc gttgacttcg 1320

aaaagccacg cacctggctc aactccggtg gactgggcac catgggctac gcagttcctg 1380

cggctcttgg agcaaaggct ggcgcacctg acaaggaagt ctgggctatc gacggcgacg 1440

gctgtttcca gatgaccaac caggaactca ccaccgccgc agttgaaggt ttccccatta 1500

agatcgcact aatcaacaac ggaaacctgg gtatggttcg ccaatggcag accctattct 1560

atgaaggacg gtactcaaat actaaacttc gtaaccaggg cgagtacatg cccgactttg 1620

ttaccctttc tgagggactt ggctgtgttg ccatccgcgt caccaaagcg gaggaagtac 1680

tgccagccat ccaaaaggct cgagagatca acgaccgccc agtagtcatc gacttcatcg 1740

tcggtgaaga cgcacaggta tggccaatgg tgtctgctgg atcatccaac tccgatatcc 1800

agtacgcact cggattgcgc ccattctttg atggtgatga atctgcagca gaagatcctg 1860

ccgacattca cgaagccgtc agcgacattg atgccgccgt tgaatcgacc gaggcataag 1920

gagagaccca agatggctaa ttctgacgtc acccgccaca tcctgtccgt actcgttcag 1980

gacgtagacg gaatcatttc ccgcgtatca ggtatgttca cccgacgcgc attcaacctc 2040

gtgtccctcg tgtctgcaaa gaccgaaaca ctcggcatca accgcatcac ggttgttgtc 2100

gacgccgacg agctcaacat tgagcagatc accaagcagc tcaacaagct gatccccgtg 2160

ctcaaagtcg tgcgacttga tgaagagacc actatcgccc gcgcaatcat gctggttaag 2220

gtttctgcgg acagcaccaa ccgtccgcag atcgtcgacg ccgcgaacat cttccgcgcc 2280

cgagtcgtcg acgtggctcc agactctgtg gttattgaat ccacaggcac cccaggcaag 2340

ctccgcgcac tgcttgacgt gatggaacca ttcggaatcc gcgaactgat ccaatccgga 2400

cagattgcac tcaaccgcgg tccgaagacc atggctccgg ccaagatcta agaattcgag 2460

ctctctagag ta 2472

<210> 13

<211> 1022

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 13

gagcggataa caattgcggc cgcagaagga gtaaatcgat gactgcaccc acgaacgctg 60

gggaactcag gcgagttttg ctggttccac acaccgggcg ttcttccaat attgaatccg 120

ccatcttggc agccaagctg ctcgacgatg ctggaatcga tgtgagggtg ctgatcaatg 180

atgcagatga tccaattgca gagcaccccg ttttaggccg tttcacccat gtcaggcacg 240

ctgccgacgc tgctgacggc gcagaactag ttctggtgct gggtggagat ggcaccttcc 300

tccgcgcagc agatatggcc cacgctgttg atttgcctgt tctgggcatc aacctaggcc 360

atgtgggatt cttggctgaa tgggagtctg actcacttga agaggcactc aaacgtgtga 420

tcgaccgcga ttaccgtatt gaagatcgca tgaccttaac tgtcgttgtc ctagacggcg 480

gtggagaaga aatcggccga ggctgggctc tcaatgaggt cagtattgaa aacttaaacc 540

gcaggggagt gctcgatgca accctcgagg tagatgcacg accagttgct tcctttggtt 600

gcgatggcgt gctgatttcc accccaaccg gctccaccgc ttatgcattt tccgccggtg 660

gtcctgtact gtggccagaa ctcgatgcca tcttggtggt tcctaataac gcccacgcgc 720

tgtttaccaa accgctggtt gtgagcccaa aatccaccgt agctgtggaa tccaattcag 780

atacttcagc agcgatggcc gtcatggatg gtttccgtcc cattcctatg cctccaggat 840

cccgtgttga ggtcaccagg ggtgagcgtc ccgtgcgttg ggtgaggctt gattcttcac 900

cgtttaccga ccgacttgtg agcaaattaa ggctccccgt taccggttgg cggggtccgc 960

aaaaacaggc ggaaaataaa gatcccaggt cagcggggta agaattcgag ctctctagag 1020

ta 1022

<210> 14

<211> 1091

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccggccaaga tctaaggacg tttgagctgt tgacaattaa tcatcgtgtg gtaccatgtg 60

tggaattgtg agcggataac aattgcggcc gcagaaggag taaatcgatg actgcaccca 120

cgaacgctgg ggaactcagg cgagttttgc tggttccaca caccgggcgt tcttccaata 180

ttgaatccgc catcttggca gccaagctgc tcgacgatgc tggaatcgat gtgagggtgc 240

tgatcaatga tgcagatgat ccaattgcag agcaccccgt tttaggccgt ttcacccatg 300

tcaggcacgc tgccgacgct gctgacggcg cagaactagt tctggtgctg ggtggagatg 360

gcaccttcct ccgcgcagca gatatggccc acgctgttga tttgcctgtt ctgggcatca 420

acctaggcca tgtgggattc ttggctgaat gggagtctga ctcacttgaa gaggcactca 480

aacgtgtgat cgaccgcgat taccgtattg aagatcgcat gaccttaact gtcgttgtcc 540

tagacggcgg tggagaagaa atcggccgag gctgggctct caatgaggtc agtattgaaa 600

acttaaaccg caggggagtg ctcgatgcaa ccctcgaggt agatgcacga ccagttgctt 660

cctttggttg cgatggcgtg ctgatttcca ccccaaccgg ctccaccgct tatgcatttt 720

ccgccggtgg tcctgtactg tggccagaac tcgatgccat cttggtggtt cctaataacg 780

cccacgcgct gtttaccaaa ccgctggttg tgagcccaaa atccaccgta gctgtggaat 840

ccaattcaga tacttcagca gcgatggccg tcatggatgg tttccgtccc attcctatgc 900

ctccaggatc ccgtgttgag gtcaccaggg gtgagcgtcc cgtgcgttgg gtgaggcttg 960

attcttcacc gtttaccgac cgacttgtga gcaaattaag gctccccgtt accggttggc 1020

ggggtccgca aaaacaggcg gaaaataaag atcccaggtc agcggggtaa gaattcgtat 1080

acctgcaggc a 1091

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atggatccag atcgcatggg caaagctg 28

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgtcaacagc tcaaacgtcc agaacaatgc tataga 36

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggacgtttga gctgttgaca 20

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tactctgatc tccttctaat tgttatccgc tc 32

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagcggataa caattagaag gagatcagag taatgagtga aacatacgtg tc 52

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttactcgagt tcaacccagc gatagaca 28

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgcgctcgag atttcttagg attccaggct ttcg 34

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ataaggatcc ttgtctgtag tcacccgctc aat 33

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ataaggatcc aatacgactc actatagggc g 31

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacgtctaga gcgcaattaa ccctcactaa ag 32

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

actatctaga ttcaactggc cacatcacga tca 33

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcatctgaat tctcgttcca tccacctgct 30

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gcactctcaa ccctttcac 19

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gttttctgcc cctcattgg 19

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgcactcgag atttcactaa gcctggttcg g 31

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ataaggatcc cactcgttgc tagaaatcct 30

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ataaggatcc aatacgactc actatagggc g 31

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gacgtctaga gcgcaattaa ccctcactaa ag 32

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

actatctaga ctatccctgc gctgaatcca 30

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgatctgaat tcgctgctct gaaggctggt ag 32

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cggataccca ccagatgct 19

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggcttgttc agtggaat 18

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atattctaga gtagcagaca tcgccggccc ag 32

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

atagaattcc atgcgcggga gaaataacag c 31

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggcggaattc aatacgactc actatagggc g 31

<210> 40

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ggtcggatcc gcgcaattaa ccctcactaa ag 32

<210> 41

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

atatggatcc tggacaaggc acctcttatg g 31

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggtactcgag caagatccaa caaaaggttc act 33

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

cctttgtggt ctggcatgaa g 21

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

caaaatcacc acatcgccag cttc 24

<210> 45

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cggtatttca caccgcatat ggtgtttaag gatagttgaa agcgtgg 47

<210> 46

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

acgtattcac ttaaacatat gcgcggacag ttcggccgg 39

<210> 47

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gagcggataa caattgcggc cgcagaagga gtaaatcggt gaatgtggca gcttctcaac 60

a 61

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tactctagag agctcgaatt cttagatctt ggccggagcc 40

<210> 49

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gagcggataa caattgcggc cgcagaagga gtaaatcgat gactgcaccc acgaacgc 58

<210> 50

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tactctagag agctcgaatt cttaccccgc tgacctggg 39

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ccggccaaga tctaaggacg tttgagctgt tgacaatt 38

<210> 52

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tgcctgcagg tatacgaatt cttaccccgc tgacctggg 39

Claims

1.一种生产L-异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法是将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac，敲除基因alaT、brnQ，在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统，在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK；所述启动子tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子ilvA的上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子ilvA的下游片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述回补alr基因为通过外源过表达载体补入alr基因；

所述回补alr基因具体为将质粒pJYW-4上原有的来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的alr片段去除得到线性化载体，将核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的alr片段连接至所述线性化载体，构建得到pYCW-1，将核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的ilvBN和核苷酸序列如SEQID NO.13所示的ppnK片段分别连接至pYCW-1进行表达；

所述将L-异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac具体步骤为：扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段，将启动子ilvA的上游片段、tac启动子片段、启动子ilvA的下游片段依次连接构建获得启动子替换载体，再将所述替换载体转入WM001中，得到含启动子tac的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

(1)按照下述步骤敲除基因alaT：扩增如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的片段，分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体，得到alaT基因敲除载体，将所述alaT基因敲除载体转入权利要求1所述含启动子tac的菌株，得到alaT基因敲除菌株；

(2)按照下述步骤敲除基因brnQ：扩增出如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的片段，分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体得到brnQ基因敲除载体，再将所述brnQ基因敲除载体转入步骤(1)中得到的alaT基因敲除菌株中，得到alaT和brnQ双基因敲除菌株。

(3)按照下述步骤敲除基因alr：扩增出如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的片段，分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体得到alr基因敲除载体，再将所述alr基因敲除载体转入步骤(2)得到的alaT和brnQ双基因敲除菌株中，得到营养缺陷型菌株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，分别扩增得到基因alr、基因ilvBN和基因ppnK的片段，将扩增得到的3个片段整合至同一表达载体，得到共表达载体；将得到的共表达载体转入权利要求2构建得到的营养缺陷型菌株中，得到回补表达alr并过表达ilvBN和ppnK的菌株。

4.权利要求1～3任一所述方法制备得到的工程菌。

5.一种L-异亮氨酸的生产方法，其特征在于，所述方法是以权利要求4所述工程菌为发酵菌株发酵生产L-异亮氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求4所述工程菌进行活化至形成菌苔，将菌苔放于种子培养基中25～35℃、180～220rpm培养16～20h，得到种子培养物；将培养物接入发酵培养基，使培养物在发酵培养基中的初始OD₅₆₂为1.5～2.0，于25～35℃、180～220rpm培养70～75h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将培养物以发酵培养基体积的0.5～1.5％的接种量接种至发酵培养基。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵期间控制pH为6.5～7.5，溶氧水平为18～32％，补加葡萄糖溶液以维持培养体系中葡萄糖浓度为18～32g/L。

9.权利要求4所述工程菌或权利要求5～8任一所述的L-异亮氨酸的生产方法在工业、医疗、化妆品领域制备L-异亮氨酸中的应用。