CN113046282A - 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113046282A CN113046282A CN201911368632.2A CN201911368632A CN113046282A CN 113046282 A CN113046282 A CN 113046282A CN 201911368632 A CN201911368632 A CN 201911368632A CN 113046282 A CN113046282 A CN 113046282A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ptsg
- iolt
- threonine
- sequence
- iolt1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 123
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 title claims abstract description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims abstract description 12
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 claims description 14
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 7
- 101150067967 iclR gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 5
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 5
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 abstract description 6
- 101100508895 Bacillus subtilis (strain 168) iolT gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 23
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 23
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 23
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 23
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 9
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 101150036260 iolT gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014075 nitrogen utilization Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种高转化率的L‑苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用。本发明所述高转化率的L‑苏氨酸的生产菌株，具有L‑苏氨酸生产能力并且其细胞内在ptsG位点过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2。本发明所述高转化率的L‑苏氨酸的生产菌株在ptsG处插入谷氨酸棒杆菌来源的iolT，失活PTS系统的同时引入谷氨酸棒杆菌中编码肌醇转移酶的iolT1/iolT2基因，提高L‑苏氨酸菌株的转化率。实验表明本发明所述高转化率的L‑苏氨酸的生产菌株进行发酵生产，L‑苏氨酸产量以及转化率明显提高，为L‑苏氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
苏氨酸(Threonine)是w.C.Ro在在1935年发现于纤维蛋白水解物之中，并证明它是最后被发现的必需氨基酸，其化学名称是α-氨基-β-羟基丁酸，分子式为NH2-CH(COOH)-CHOH-CH3，有四种立体异构，具有生物学活性的只有L-型。L-苏氨酸白色晶体或结晶性粉末，含1/2结晶水。无臭，味微甜。是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加剂及药物辅助材料制备等。
L-苏氨酸是畜禽的第二或第三限制性氨基酸，它在动物体内具有极其重要的生理作用。如促进生长、提高免疫机能等；平衡日粮氨基酸，使氨基酸比例更接近于理想蛋白质，从而降低畜禽对饲料中蛋白含量的要求。缺乏苏氨酸，可导致动物采食量降低、生长受阻、饲料利用率下降、免疫机能抑制等症状。近几年来，苏氨酸、蛋氨酸合成品在饲料中得到了广泛应用，苏氨酸逐渐成为影响动物生产性能的限制性因素，对苏氨酸的进一步研究，有助于有效地指导畜禽生产。苏氨酸(L-苏氨酸)是动物本身不能合成，但又十分需要的氨基酸，能用来精确平衡饲料的氨基酸组成，满足动物生长维持需要，提高增重和瘦肉率，降低料肉比；可改善氨基酸消化率低的饲料原料的营养价值，提高低能量饲料生产性能；可降低饲料粗蛋白水平，提高饲料氮利用率，降低饲料成本；可用于猪、鸡、鸭和高级水产的饲养和养殖。
L-苏氨酸的工业生产方法主要有：①合成法；②发酵法；③蛋白质水解法三种，目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产。多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产苏氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株，具有L-苏氨酸生产能力并且其细胞内在ptsG位点过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2。
本发明通过在基因组上进行相关改造，使更多的前体物流向L-苏氨酸合成代谢通路，如：在ptsG处插入谷氨酸棒杆菌来源的iolT，失活PTS系统的同时引入谷氨酸棒杆菌中编码肌醇转移酶的iolT1/iolT2基因。菌株PTS系统失活使得更多的磷酸烯醇式丙酮酸用于合成L-苏氨酸，肌醇转移酶可以向胞内运输葡萄糖，过表达iolT基因以恢复或增强菌株对葡萄糖的利用能力，从而获得高转化率的L-苏氨酸的基因工程菌。
在本发明中，所述过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2为启动子的替换或核糖体结合位点(ribosomalbinding site，RBS)序列的强化；
在本发明中，所述生产菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一些实施方案中，所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株其基因型为W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT1)。
在一些实施方案中，所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株其基因型为W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT2)。
本发明还提供了所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株的构建方法，制备失活ptsG同时强化iolT1基因重组载体的质粒，转化大肠杆菌获得生产菌株。
在一些实施方案中，所述高产苏氨酸的大肠杆菌的构建方法中所述载体为pTargetT载体。
在一些实施方案中，所述高产苏氨酸的大肠杆菌的构建方法中所述大肠杆菌为大肠杆菌MHZ-0214-2菌株。本领域技术人员预先将pCas质粒电转入MHZ-0214-2感受态细胞中，转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》。
在一些实施方案中，所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株的构建方法中所述制备失活ptsG同时强化iolT1基因的重组载体质粒的方法具体为：以pTargetT质粒为模板，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA-ptsG片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-2f/iolT1-R扩增获得iolT1片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT1-R进行扩增得到Ptac-iolT1片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT1与pTargetT载体连接获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒。
在一些实施方案中，所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株的构建方法中所述制备失活ptsG同时强化iolT2基因的重组载体质粒的方法具体为：以pTargetT质粒为模板，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-3f/iolT2-R扩增获得iolT2片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT2-R进行扩增得到Ptac-iolT2片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT2，与pTargetT载体连接获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒。
其中，所述gRNAiolT-f的序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNAiolT-r的序列如SEQ ID No.2所示；
所述iolT-1f的序列如SEQ ID No.3所示；
所述iolT-1r的序列如SEQ ID No.4所示；
所述tac-1f的序列如SEQ ID No.5所示；
所述tac-2f的序列如SEQ ID No.6所示；
所述tac-3f的序列如SEQ ID No.7所示；
所述iolT1-R的序列如SEQ ID No.8所示；
所述iolT2-R的序列如SEQ ID No.9所示；
所述iolT-2f的序列如SEQ ID No.10所示；
所述iolT-2r的序列如SEQ ID No.11所示；
所述ptsG-up的序列如SEQ ID No.12所示；
所述ptsG-dn的序列如SEQ ID No.13所示。
在一些实施方案中，重组载体质粒电转入MHZ-0214-2(pCas)感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上30℃静置培养至单菌落可见。
进一步的，通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，构建相关质粒丢失获得改造的菌株命名为MHZ-0214-3(ptsG::Ptac-iolT1)菌株和MHZ-0214-4(ptsG::Ptac-iolT2)菌株。
本发明还提供了所述构建方法获得的高转化率的L-苏氨酸的生产菌株。
利用本发明获得的上述改造的菌株进行发酵生产，L-苏氨酸产量以及转化率明显提高，为L-苏氨酸的工业化生产奠定基础。因此本发明还提供了所述菌株在发酵生产L-苏氨酸中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种L-苏氨酸的生产方法，将上述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
在本发明中，所述种子培养基为玉米浆25g/L，葡萄糖25g/L，豆粕水解液7.7g/L，酵母膏2.5g/L，KH2PO41.4g/L，硫酸镁0.5g/L，FeSO4、MnSO4 20mg/L，pH7.0。
进一步的，在本发明中，所述种子培养为37℃、90rpm培养5h。
在本发明中，所述发酵培养基为葡萄糖50g/L\玉米浆5g/L，豆粕水解液7.7g/L，KH2PO41.0g/L，硫酸镁0.5g/L，天冬氨酸10g/L，FeSO4、MnSO4 30mg/L，生物素50μg/L，硫胺素500μg/L，pH7.2。
进一步的，在本发明中，所述发酵培养为37℃、100rpm培养至残糖耗尽。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用。本发明所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株，具有L-苏氨酸生产能力并且其细胞内在ptsG位点过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2。本发明所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株在ptsG处插入谷氨酸棒杆菌来源的iolT，失活PTS系统的同时引入谷氨酸棒杆菌中编码肌醇转移酶的iolT1/iolT2基因，提高L-苏氨酸菌株的转化率。实验表明本发明所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株进行发酵生产，L-苏氨酸产量以及转化率明显提高，为L-苏氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
具体实施方式
本发明公开了一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验出发菌株MHZ-0214-2为公开号为CN106591209A中国专利中的公开菌株。
大肠杆菌的基因组编辑，主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)
以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。
以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0214-2，属于W3110(埃希氏菌属(Escherichia))。
实施例中所使用引物序列见下表。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
iolT1：肌醇转移酶；
iolT2：肌醇转移酶；
ptsG：PTS系统EIIBCGlc；
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：制备失活ptsG同时强化iolT1基因的菌株MHZ-0214-3(ptsG::Ptac-iolT1)
(1)构建pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒
以pTargetT质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA-ptsG片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-2f/iolT1-R扩增获得iolT1片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT1-R进行扩增得到Ptac-iolT1片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT1；
使用SpeI/PstI对获得的gRNA-Ptac-iolT1片段和pTargetT载体进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将目的片段与载体进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用以扩增和筛选，最终获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒。
(2)感受态细胞制备及电转化pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒
将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coli Genomevia the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)电转入MHZ-0214-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
挑取MHZ-0214-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
将pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒电转入MHZ-0214-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
(3)重组验证
使用引物对ptsG-up/ptsG-dn对上述单菌落进行菌落PCR验证(阳性片段约0.9kb)；菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。
(4)构建相关质粒丢失
挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒已丢失；挑取pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0214-3(ptsG::Ptac-iolT1)菌株。
实施例2：制备失活ptsG同时强化iolT2基因的菌株MHZ-0214-4(ptsG::Ptac-iolT2)
(1)构建pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒
以pTargetT质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-3f/iolT2-R扩增获得iolT2片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT2-R进行扩增得到Ptac-iolT2片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT2；
使用SpeI/PstI对获得的gRNA-ptsG::Ptac-iolT2片段和pTargetT载体进行双酶切，利用T4DNA连接酶将目的片段与载体进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用以扩增和筛选，最终获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒。
(2)感受态细胞制备及电转化pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒
将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coli Genomevia the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)电转入MHZ-0214-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
挑取MHZ-0214-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
将pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒电转入MHZ-0214-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
(3)重组验证
使用引物对ptsG-up/ptsG-dn对上述单菌落进行菌落PCR验证(阳性片段约0.9kb)；菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。
(4)构建相关质粒丢失
挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒已丢失；挑取pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0214-4(ptsG::Ptac-iolT2)菌株。
实施例1-2所获得的产苏氨酸基因改造菌株如表1所示。
表1本发明构建的基因工程菌
| 菌株编号 | 基因型 |
| MHZ-0214-2 | W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR) |
| MHZ-0214-3 | W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT1) |
| MHZ-0214-4 | W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT2) |
实施例3、产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证
从冻存管中取MHZ-0214-2、MHZ-0214-3、MHZ-0214-4共3株，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；
将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表2)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD650控制在2以内；
将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表3)的摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD650，并用使用HPLC测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定残糖量。产酸及转化率结果见表4。
表2种子培养基(g/L)
| 成分 | 浓度 |
| 葡萄糖 | 25 |
| 玉米浆 | 25 |
| 豆粕水解液 | 7.7 |
| 酵母膏 | 2.5 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 1.4 |
| 七水硫酸镁 | 0.5 |
| FeSO<sub>4</sub>、MnSO<sub>4</sub> | 20mg/L |
| pH | 7.0 |
表3发酵培养基(g/L)
表4产苏氨酸基因工程菌生产力比较
| 菌株编号 | 产酸(g/L) | 转化率(％) |
| MHZ-0214-2 | 13.2 | 26.4 |
| MHZ-0214-3 | 17.5 | 35 |
| MHZ-0214-4 | 15.3 | 30.6 |
由表4可知，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于对照菌株，其中MHZ-0214-3菌株L-苏氨酸产量最高达到17.5g/L、转化率35％，较出发菌提高了8.6个百分点；MHZ-0214-4菌株L-苏氨酸的产量为15.3g/l、转化率为30.6略次于MHZ-0214-4，但其转化率比出发菌高4.2个百分点。由此可见，改造菌株的产酸以及转化率均优于出发菌，其中ptsG失活得同时过表达iolT1对于提高菌株的转化率的效果优于iolT2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 新疆梅花氨基酸有限责任公司
<120> 一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
<130> MP1721859
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
aatactagtt ttgctaacct gcaaaaggtg ttttagagct agaaatagc 49
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
tctcttttcc tcgatgcggt accggcgcat tcaaaaaaag caccgactcg gtgccac 57
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
tgcgccggta ccgcatcgag 20
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
cgagccgatg attaattgtc aacagctccc ttttgcaggt tagcaaatgc attctt 56
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg tcacacagga aacagcg 57
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
gtataatgtg tggtcacaca ggaaacagcg atggctagta ccttcattca ggccgacag 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
gtataatgtg tggtcacaca ggaaacagcg atgacggaca tcaaggccac atcaagtac 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
ctcggttttc aggcatcagc gatttaccga ttagtgcacc tttccttttc ggatgtcct 59
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
ctcggttttc aggcatcagc gatttaccga ttaagccttc ttgaagatct ggccggtg 58
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 10
tcggtaaatc gctgatgcct g 21
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 11
aactgcagaa ctggcagctg acatttggc 29
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 12
caactgcgcg atgctgcgcg ttat 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 13
tacacctatc cccggcagca a 21
Claims (11)
1.一种高转化率的L-苏氨酸的生产菌株，其特征在于，具有L-苏氨酸生产能力并且其细胞内在ptsG位点过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2。
2.根据权利要求1所述的生产菌株，其特征在于，所述过表达肌醇转移酶iolT1或iolT2为启动子的替换或核糖体结合位点序列的强化；所述生产菌株为大肠杆菌。
3.权利要求1或2所述的生产菌株，其特征在于，其基因型为W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT1)或W3110(thrA*(S345P),tdh::thrA*BC,Ptac-pntAB,△iclR，ptsG::Ptac-iolT2)。
4.权利要求1-3任一项所述的生产菌株的构建方法，其特征在于，制备失活ptsG同时强化iolT1基因的重组载体质粒，转化大肠杆菌获得生产菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，所述载体为pTargetT载体；所述大肠杆菌为大肠杆菌MHZ-0214-2菌株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述制备失活ptsG同时强化iolT1基因的重组载体质粒的方法具体为：
(1)以pTargetT质粒为模板，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA-ptsG片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-2f/iolT1-R扩增获得iolT1片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT1-R进行扩增得到Ptac-iolT1片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT1，；与pTargetT载体连接获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT1质粒；或
(2)以pTargetT质粒为模板，利用引物对gRNAiolT-f/gRNAiolT-r扩增得到ptsG的sgRNA片段①；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-1f/iolT-1r扩增得到ptsG左半段②；以ATCC13032基因组为模板，利用引物对tac-3f/iolT2-R扩增获得iolT2片段③；以③为模版，利用引物对tac-1f/iolT2-R进行扩增得到Ptac-iolT2片段④；以W3110基因组为模板，利用引物对iolT-2f/iolT-2r扩增得到ptsG右半段⑤；以①②④⑤为模板，利用引物对gRNAiolT-f/iolT-2r进行OE-PCR获得全长片段gRNA-ptsG::Ptac-iolT2，与pTargetT载体连接获得pTargetT-ptsG::Ptac-iolT2质粒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
所述gRNAiolT-f的序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNAiolT-r的序列如SEQ ID No.2所示；
所述iolT-1f的序列如SEQ ID No.3所示；
所述iolT-1r的序列如SEQ ID No.4所示；
所述tac-1f的序列如SEQ ID No.5所示；
所述tac-2f的序列如SEQ ID No.6所示；
所述tac-3f的序列如SEQ ID No.7所示；
所述iolT1-R的序列如SEQ ID No.8所示；
所述iolT2-R的序列如SEQ ID No.9所示；
所述iolT-2f的序列如SEQ ID No.10所示；
所述iolT-2r的序列如SEQ ID No.11所示；
所述ptsG-up的序列如SEQ ID No.12所示；
所述ptsG-dn的序列如SEQ ID No.13所示。
8.权利要求5-7任一项所述构建方法获得的生产菌株。
9.权利要求1-3或8任一项所述生产菌株在发酵生产L-苏氨酸中的应用。
10.一种L-苏氨酸的生产方法，其特征在于，权利要求1-3或8任一项所述高转化率的L-苏氨酸的生产菌株接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
11.根据权利要求10所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基为玉米浆25g/L，葡萄糖25g/L，豆粕水解液7.7g/L，酵母膏2.5g/L，KH2PO4 1.4g/L，硫酸镁0.5g/L，FeSO4、MnSO420mg/L，pH 7.0；所述发酵培养基为葡萄糖50g/L\玉米浆5g/L，豆粕水解液7.7g/L，KH2PO41.0g/L，硫酸镁0.5g/L，天冬氨酸10g/L，FeSO4、MnSO4 30mg/L，生物素50μg/L，硫胺素500μg/L，pH 7.2；所述种子培养为37℃、90rpm培养5h；所述发酵培养为37℃、100rpm培养至残糖耗尽。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911368632.2A CN113046282A (zh) | 2019-12-26 | 2019-12-26 | 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911368632.2A CN113046282A (zh) | 2019-12-26 | 2019-12-26 | 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113046282A true CN113046282A (zh) | 2021-06-29 |
Family
ID=76505501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911368632.2A Pending CN113046282A (zh) | 2019-12-26 | 2019-12-26 | 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113046282A (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560852A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 |
| WO2016027870A1 (ja) * | 2014-08-21 | 2016-02-25 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法 |
| CN105543156A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-05-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其制备方法、用途 |
| CN105734002A (zh) * | 2014-12-10 | 2016-07-06 | 中粮集团有限公司 | 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用 |
| CN106029869A (zh) * | 2014-02-12 | 2016-10-12 | Cj第制糖株式会社 | 具有l-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产l-苏氨酸的方法 |
| CN106591209A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-04-26 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 |
| US20170152535A1 (en) * | 2014-02-20 | 2017-06-01 | Covestro Deutschland Ag | Recombinant strain producing o-aminobenzoate and fermentative production of aniline from renewable resources via 2-aminobenzoic acid |
| CN106967159A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-21 | 莲花健康产业集团股份有限公司 | iolT1和iolT2蛋白在木糖转运中的应用 |
| CN109852572A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-06-07 | 江南大学 | 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法 |
-
2019
- 2019-12-26 CN CN201911368632.2A patent/CN113046282A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106029869A (zh) * | 2014-02-12 | 2016-10-12 | Cj第制糖株式会社 | 具有l-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产l-苏氨酸的方法 |
| US20170152535A1 (en) * | 2014-02-20 | 2017-06-01 | Covestro Deutschland Ag | Recombinant strain producing o-aminobenzoate and fermentative production of aniline from renewable resources via 2-aminobenzoic acid |
| WO2016027870A1 (ja) * | 2014-08-21 | 2016-02-25 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法 |
| CN104560852A (zh) * | 2014-09-22 | 2015-04-29 | 江南大学 | 一种l-苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌 |
| CN105734002A (zh) * | 2014-12-10 | 2016-07-06 | 中粮集团有限公司 | 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用 |
| CN105543156A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-05-04 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其制备方法、用途 |
| CN106591209A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-04-26 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 |
| CN106967159A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-21 | 莲花健康产业集团股份有限公司 | iolT1和iolT2蛋白在木糖转运中的应用 |
| CN109852572A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-06-07 | 江南大学 | 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZHIHUI ZHOU 等: "Increasing succinic acid production using the PTS-independent glucose transport system in a Corynebacterium glutamicum PTS-defective mutant", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY》 * |
| 梁媛 等: "大肠杆菌ptsG敲除及其对苏氨酸合成的影响", 《 氨基酸、有机酸产业发展论文集》 * |
| 韩聪等: "大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究", 《生物工程学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113322218B (zh) | 重组谷氨酸棒杆菌及生产l-苏氨酸的方法 | |
| CN110951662B (zh) | 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 | |
| EP1792976B1 (en) | Microorganism of corynebacterium genus having enhanced L-lysine production ability and method of producing L-lysine using the same | |
| CN103497979B (zh) | 用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路 | |
| TWI746953B (zh) | 具有增強的甘胺酸生產力的微生物及使用該微生物製造醱酵組成物的方法 | |
| CN110982772B (zh) | 一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN111321100B (zh) | 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌 | |
| US20200362374A1 (en) | A microorganism of the genus corynebacterium producing l-amino acids and a method for producing l-amino acids using the same | |
| CN112481179A (zh) | 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| TW201712117A (zh) | 用於製造腐胺或鳥胺酸之微生物及使用該微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法 | |
| JP4309223B2 (ja) | 染色体上のｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニン生成変異微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法 | |
| JP4931320B2 (ja) | 新規なグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ | |
| KR101689451B1 (ko) | L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법 | |
| CN106635945B (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l-苏氨酸的方法 | |
| CN113846132B (zh) | 苏氨酸生产菌种的构建及生产苏氨酸的方法 | |
| WO2012108493A1 (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
| EP3119875B1 (en) | Microorganisms producing l-amino acids and process for producing l-amino acids using the same | |
| KR20140102393A (ko) | L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법 | |
| CN114426983B (zh) | 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法 | |
| CN113046282A (zh) | 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用 | |
| CN110804617B (zh) | 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN115678817A (zh) | 一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用 | |
| CN115960801B (zh) | 一种高产l-苏氨酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN115029289B (zh) | 高产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN115404224B (zh) | 产l-苏氨酸基因工程菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210629 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |