CN106029869A - 具有l-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过引入源自棒状杆菌的通透酶而L‑苏氨酸生产力得到提高的大肠杆菌突变株及利用该大肠杆菌突变株生产L‑苏氨酸的方法。

Description

具有L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微 生物生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种通过变形以表达源自棒状杆菌的通透酶而具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，其广泛地用作饲料及食品添加剂，并且用作医药用水化溶液、医药品的合成原料。
L-苏氨酸主要通过利用以下细菌或其人工突变株的发酵方法来生产，所述细菌为通过人工突变方法或基因重组方法来开发的埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属或棒状杆菌(Corynebacterium)。已开发了与苏氨酸的生物合成有关的基因和用于增加这些基因表达的各种方法，但仍然需要能够以更廉价的方式生产高收率的L-苏氨酸的方法。
已知大肠杆菌中由galP基因编码的GalP蛋白质是将包括半乳糖及葡萄糖的各种糖输送到细胞内部的半乳糖通透酶(galactose permease)(V.Hernandez-MontalvoF.Valle F.Bolivar G.Gosset,Appl Microbiol Biotechnol(2001)57:186-191)，并且GalP蛋白质还起到葡萄糖通透酶(glucose permease)的作用(Venter,Henrietta et al.,Biochemical Journal(2002)363:243-252)。据报告，大肠杆菌中通过增加拷贝数量等来增加galP基因的表达时，苏氨酸的生产力会增强(WO 2004/087937)。
据报告，谷氨酸棒状杆菌中由iolT1及iolT2基因编码的肌醇通透酶也起到葡萄糖通透酶的作用(Ikeda et al.,Appl Microbiol Biotechnol(2011)90:1443-1451)；所述基因与大肠杆菌的galP基因同源性高，然而，尚没有关于显示所述肌醇通透酶与苏氨酸生产的关系的报告。
本发明人发现，当将棒状杆菌属微生物中编码肌醇通透酶的iolT1基因和/或iolT2基因引入到大肠杆菌中时，埃希氏杆菌属微生物具有提高的L-苏氨酸生产力，从而完成了本发明。
发明内容
要解决的技术问题
因此，本发明的目的在于，提供一种通过变形以表达源自棒状杆菌的通透酶而L-苏氨酸生产力得到提高的重组埃希氏杆菌属微生物。
并且，本发明的目的在于，提供一种利用所述重组微生物以高收率生产L-苏氨酸的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种重组埃希氏杆菌属微生物，所述微生物通过转化以使其表达源自谷氨酸棒状杆菌的通透酶而获得。
并且，本发明还提供了一种利用所述重组微生物以高收率生产L-苏氨酸的方法。
有益效果
根据本发明，菌株的生长速度比现有菌株大幅提高，从而能够以高收率生产L-苏氨酸。由此，产业上具有重大意义的L-苏氨酸生产性会大大提高。
附图说明
图1示出源自大肠杆菌的galP和源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1及iolT2的氨基酸序列的同源性比对。
图2示出包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1基因的重组载体pCC1BAC-iolT1的酶切图。
图3示出包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT2基因的重组载体pCC1BAC-iolT2的酶切图。
图4示出包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1及iolT2基因的重组载体pCC1BAC-iolT1-iolT2的酶切图。
具体实施方式
本发明的特征在于，提供一种具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，所述微生物通过转化以使其表达源自棒状杆菌的通透酶而获得。
本发明中，所述源自棒状杆菌的通透酶可以源自谷氨酸棒状杆菌，优选源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，但并不限定于此。
最优选地，所述源自棒状杆菌的通透酶可以具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的源自棒状杆菌的通透酶由具有SEQID NO:3所示的碱基序列的iolT1基因编码，所述具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的源自棒状杆菌的通透酶由具有SEQ ID NO:4所示的碱基序列的iolT2基因编码。
并且，只要是本发明中提出的具有通透酶活性的蛋白质，则所述蛋白质的氨基酸序列上具有部分突变的突变体或与所述蛋白质的氨基酸序列具有80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，最优选为97％以上的同源性的通透酶也包含在本发明中。
本文中，所述术语“同源性”是指，显示两条氨基酸序列之间的同一性，其可由本领域技术人员熟知的方法确定，所述方法利用计算分数(score)、同一性(identity)、相似性(similarity)等的参数(parameter)的BLAST2.0进行。
本发明的一个实施方案中，从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中探索了与大肠杆菌中编码葡萄糖通透酶的galP基因具有同源性的基因，其结果为，由大肠杆菌的galP编码的氨基酸序列和由源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的iolT1(美国国家生物技术信息中心参考序列(NCBI Reference Sequence):NC_006958.1，cg0223)编码的氨基酸序列的同源性显示为34％，与由iolT2(美国国家生物技术信息中心参考序列:NC_006958.1，cg3387)编码的氨基酸序列的同源性显示为31％(参照图1)。
所述大肠杆菌的galP基因是公知的，其可以从由布拉特纳(Blattner)等(Science277：1453-1462(1997))公开的大肠杆菌的基因组序列获得(登记号AAC75876)，也可以从诸如美国国家生物技术信息中心(NCBI)及日本DNA数据库(DDBJ)的数据库获得。
本发明的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属微生物可以是大肠杆菌及L-苏氨酸生产用大肠杆菌突变株。更优选地，具有L-苏氨酸生产力的所述埃希氏杆菌属微生物为源自大肠杆菌KFCC10718(韩国专利授权号第10-0058286号)的大肠杆菌KCCM10541(韩国专利授权号第10-0576342号)，大肠杆菌KCCM10541为生产L-苏氨酸的菌株，其特征为具有蛋氨酸营养缺陷表型、对苏氨酸类似物的耐性、对赖氨酸类似物的耐性、对异亮氨酸类似物的耐性及对蛋氨酸类似物的耐性，且2-拷贝以上的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(phosphoenol pyruvate carboxylase gene，ppc基因)和苏氨酸操纵子引入到染色体内。
在本发明的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属微生物中用于表达编码通透酶的基因的方法不受特别限制。例如，可以将包含编码通透酶的基因的重组载体转化到微生物中、或增加编码通透酶的基因的拷贝数、或调节编码通透酶的基因的表达调控序列，也可以同时使用两种以上的方法。通常使用的提高苏氨酸生物合成相关基因的表达量的方法包括增加单个微生物所具有的基因拷贝数的方法，为此，通常使用维持高拷贝数的质粒(Sambrook et al，Molecular cloning，2版，1989，1.3～1.5)。即，在维持高拷贝数的质粒中插入所需的基因，并将这种重组质粒再次转化到微生物中，从而能够获得每个微生物中的基因的拷贝数增加至与其质粒的拷贝数相当的量的效果。并且，还可以利用将苏氨酸生物合成相关基因插入染色体DNA中的方法。
本发明的一个实施方案中，本发明提供了包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1基因及/或iolT2基因的重组载体，以及用所述重组载体转化的、具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物。
本文中，所述术语“载体”是指包含编码靶蛋白的多核苷酸的碱基序列的DNA制备物,该碱基序列被可操作地连接到适当的调控序列，以能够在适当的宿主中表达靶蛋白。所述调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任意操纵序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，及调控转录及翻译的终止的序列。载体转化到适当的宿主中后，其可以与宿主基因组无关地实施复制或功能，或可以整合于基因组本身。
本发明中所使用的载体，只要在宿主中可进行复制，则不受特别限制，可以利用本领域已知的任意载体。通常使用的载体可以例举如，天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒及噬菌体。
本发明提供了包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1基因的重组载体。其特征为，所述重组载体优选为pCC1BAC-iolT1，更优选具有图2的酶切图。
本发明还提供了包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT2基因的重组载体。其特征为，所述重组载体优选为pCC1BAC-iolT2，更优选具有图3的酶切图。
本发明还提供了用于同时表达源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1及iolT2基因的重组载体。其特征为，所述重组载体优选为pCC1BAC-iolT1-iolT2，更优选具有图4的酶切图。
本文中，所述术语“转化”是指，将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，从而使所述多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。就转化的多核苷酸而言，只要能够在宿主细胞中表达，不管是插入宿主细胞的染色体中还是位于染色体外，这些均包括在转化的多核苷酸中。并且，所述多核苷酸包含编码靶蛋白的DNA及RNA。就所述多核苷酸而言，只要是可引入宿主细胞中并表达的，则可以使用以任何形式引入的多核苷酸。例如，所述多核苷酸可以以表达盒(expression cassette)的形式引入到宿主细胞中，所述表达盒为包含自行表达所需的所有因素的多核苷酸构建体。所述表达盒包含通常可操作地连接至所述基因的启动子(promoter)、转录终止信号、核糖体结合位点及翻译终止信号。所述表达盒可以是可自主复制的表达载体形式。并且，所述多核苷酸可以是以自身的形状引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中可操作地连接于表达所需的序列的。
一方面，本发明提供了具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，其中所述微生物是用包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1基因或iolT2基因的重组载体转化而获得。
另一方面，本发明提供了具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，其中所述微生物是用包含源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1基因及iolT2基因的重组载体转化而获得。
本发明的所述转化的重组埃希氏杆菌属微生物优选为大肠杆菌，所述微生物优选为大肠杆菌CA03-0230(KCCM11370P)、大肠杆菌CA03-0260(KCCM11369P)或大肠杆菌CA03-0231(KCCM11371P)。
就如上所述的本发明的生产苏氨酸的重组菌株而言，将源自棒状杆菌的iolT1和/或iolT2基因引入到大肠杆菌中，从而增加通透酶在大肠杆菌中的表达，从而大幅提高菌株的糖消耗速度及生长速度，因此可以生产高浓度的L-苏氨酸。
本发明还提供了L-苏氨酸的制备方法，其特征为包括以下步骤：培养所述转化的重组埃希氏杆菌属微生物；以及从所述微生物培养液分离L-苏氨酸。
本发明的重组埃希氏杆菌属微生物的培养，可以通过常规的方法实施。具体而言，可以在完全或部分含有原糖或葡萄糖作为碳源的培养基中接种所述微生物并培养。所述培养过程可以在本领域已知的适当的培养基和培养条件下进行。就这种培养过程而言，本领域技术人员可以根据所选择的菌株容易地调整并使用。所述培养方法的例子包括分批式培养，连续式培养及流加式培养，但并不限定于此。培养中使用的培养基应当适当地满足特定菌株的要求条件。
具体而言，本发明中所使用的培养基使用原糖或葡萄糖作为主要碳源，并且包含大量的原糖的糖蜜也可以用作碳源。另外，适量的碳源可以通过各种形式被利用，优选使用精制葡萄糖。可使用的氮源的例子包括诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸渍液及大豆豆粕的有机氮源，及诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵的无机氮源，优选使用蛋白胨。这些氮源可以单独使用或组合使用。所述培养基可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及对应的含钠盐作为磷源。并且，所述培养基可以包含诸如硫酸镁或硫酸铁的金属盐。另外，所述培养基还可以包含氨基酸、维生素及适当的前体等。这些培养基或前体可以以分批或连续的方式添加到培养物中。
具体而言，培养的温度通常为27℃～37℃，优选为30℃～37℃。培养期间可以持续到表达所需有用物质，优选为10～100小时。
下文中，将通过实施例对本发明进行更详细地说明。这些实施例仅仅是为了例示本发明而提出的，本发明的范围并不限于这些实施例。
[实施例]
比较例：用包含源自大肠杆菌的galP基因的重组载体转化的重组菌株的制备及L- 苏氨酸生产性的比较
据报告(WO2004/087937)，大肠杆菌中半乳糖通透酶起到葡萄糖通透酶的作用，并且通过半乳糖通透酶拷贝数的增加等来增加半乳糖通透酶的表达时，苏氨酸的生产力得到提高，为了确认所述报告，在作为L-苏氨酸生产菌株的大肠杆菌KCCM10541中通过增加galP基因的拷贝数来制备重组菌株，并评价了L-苏氨酸生产性。
(1)包含源自大肠杆菌的galP基因的重组载体的制作
为了获得包含源自大肠杆菌的galP基因的开放阅读框(open reading frame)的1.4kb片段，使用了凯杰公司(Qiagen)的基因组尖端系统(Genomic-tip system)提取了大肠杆菌野生型菌株W3110的基因组DNA。
使用基因组DNA(gDNA)作为模板，实施了连锁综合反应(聚合酶链反应(polymerase chain reaction)，以下简称为“PCR”)。这里使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，PCR反应条件为，在94℃下变性(denaturation)30秒，在56℃下退火(annealing)30秒，在72℃下延伸(elongation)50秒，并且此过程重复实施30次。在0.8％琼脂糖凝胶上对所述PCR结果物(下文中称命名为“galP片段”)进行电泳，然后洗脱而获得具有所需大小的条带。
将所述收集的galP片段用限制酶HindIII处理后，将其与用相同的限制酶HindIII处理的线性pCC1BAC载体(EPICENTRE公司产品，以下相同)连接，使得与载体上的lac启动子方向一致。
用所述制备的载体转化大肠杆菌DH5a细胞后，将其涂布于含有氯霉素的LB固体培养基中，并在37℃下培养过夜。将一白金耳的所述培养菌落接种于3ml的含有氯霉素的LB液体培养基中并培养过夜，然后利用质粒小量提取试剂盒(凯杰公司产品，以下相同)回收质粒DNA。通过用限制酶HindIII处理来确定重组载体的大小(未示出数据)，并且用SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的引物，在以下反应条件下实施PCR并确认了克隆，所述反应条件为，在94℃下变形30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸60秒。将所述重组载体命名为pCC1BAC-galP(未示出数据)。
并且，将上述galP片段与用相同的限制酶HindIII处理的线性pCL1920载体连接，使得与载体上的lac启动子方向一致。用所述所制备的载体转化大肠杆菌DH5a细胞后，将其涂布于含有奇霉素(spectinomycin)的LB固体培养基中，并在37℃下培养过夜。将一白金耳的所述培养菌落接种于3ml的含有奇霉素的LB液体培养基中并培养过夜，然后利用质粒小量提取试剂盒回收质粒DNA。通过用限制酶HindIII处理来确定重组载体的大小(未示出数据)，并且通过用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物在以下反应条件下实施PCR并确认了克隆，所述反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸60秒。将所述重组载体命名为pCL1920-galP(未示出数据)。
(2)用所述重组载体转化的重组菌株的制备
用电穿孔法将所述重组载体pCC1BAC-galP引入到作为亲本菌株的L-苏氨酸生产菌株即大肠杆菌KCCM10541中，将大肠杆菌菌株涂布于含有15μg/ml的氯霉素的固体培养基，然后挑选单菌落。通过与上述方法相同的方法，用电穿孔法将重组载体pCL1920-galP引入到L-苏氨酸生产菌株即大肠杆菌KCCM10541中，将大肠杆菌菌株涂抹于包含50μg/ml奇霉素的固体培养基，然后挑选单菌落。
将挑选的菌株分别命名为KCCM10541/pCC1BAC-galP及KCCM10541/pCL1920-galP。
(3)重组菌株的L-苏氨酸生产性比较
利用下述表1的苏氨酸滴度培养基，通过如下所述的方法在锥形瓶中培养在上述(2)中制备的重组菌株，并确认了L-苏氨酸生产性。
表1
组成 浓度(每L)
葡萄糖 70g
KH2PO4 2g
(NH4)2SO4 27.5g
MgSO4·H2O 1g
FeSO4·H2O 5mg
MnSO4·H2O 5mg
DL-甲硫氨酸 0.15g
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
使用作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM10541、KCCM10541/pCC1BA C-galP及KCCM10541/pCL1920-galP菌株，进行了滴度评价。当引入到各菌株时，所述重组载体pCC1BAC-galP表达为1个拷贝载体，pCL1920-galP表达为5个拷贝载体，从而确认拷贝数增加带来的效果。
将具有不同遗传特性的各个重组菌株在33℃培养箱中的LB固体培养基中培养过夜，将一白金耳的各个重组菌株接种到25ml具有上表1中组成的含有葡萄糖的滴度培养基后，在33℃，200rpm的培养箱中培养48小时，其结果显示于表2中。
表2
其结果如上表2所示，当将作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM10541菌株培养48小时时，生产了32.0g/L L-苏氨酸，然而在本比较例中获取的作为重组菌株的大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-galP生产了31.1g/L L-苏氨酸，KCCM10541/pCL1920-galP生产了30.8g/L L-苏氨酸，这与亲本菌株相比，L-苏氨酸生产分别下降了0.9g/L、1.2g/L。
如表2所示，作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM10541菌株的糖消耗速度显示为0.753g/L/hr，KCCM10541/pCC1BAC-galP的糖消耗速度显示为0.793g/L/hr，KCCM10541/pCL1920-galP的糖消耗速度显示为0.816g/L/hr，这与亲本菌株相比，糖消耗速度分别提高了5.3％、8.4％。
实施例1：包含源自棒状杆菌的iolT1、iolT2基因的重组载体的制作
(1)与大肠杆菌葡萄糖通透酶(galP)的同源性比较
据报告，在谷氨酸棒状杆菌中编码肌醇通透酶的iolT1、iolT2基因与大肠杆菌中编码葡萄糖通透酶的galP基因的同源性相似。从野生型谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)的基因组中找出与源自大肠杆菌的galP基因具有同源性的基因并进行比较，其结果显示在图1中。
源自大肠杆菌的galP编码的氨基酸序列与源自谷氨酸棒状杆菌的iolT1编码的氨基酸序列显示出34％的同源性，与iolT2编码的氨基酸序列显示出31％的同源性。
(2)iolT1基因片段的制作
为了获得包含SEQ ID NO：3的iolT1基因的开放阅读框的1.5kb片段，使用了凯杰公司的基因组尖端系统(Genomic-tip system,Qiagen)提取了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)的基因组DNA。
使用所述gDNA作为模板，实施PCR。这里使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物，PCR反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸60秒，并且此过程重复实施30次。在0.8％的琼脂糖凝胶上对所述PCR结果物(下文中，命名为“iolT1片段”)进行电泳，然后洗脱而获得所需大小的条带。
(3)重组载体pCC1BAC-iolT1的制作
对在上述(2)中准备的iolT1片段用限制酶HindIII处理后，将其与用相同的限制酶HindIII处理的线性pCC1BAC载体连接，使得与载体上的lac启动子方向一致。
用所述制备的重组载体转化大肠杆菌DH5a细胞，并将其涂布于含有氯霉素的LB固体培养基，并在37℃下培养过夜。将一白金耳的所述培养菌落接种于3ml的含有氯霉素的LB液体培养基中并培养过夜，利用质粒小量提取试剂盒回收质粒DNA。通过用限制酶HindIII处理来确定重组载体的大小(未示出数据)，并且通过用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物在以下反应条件下实施PCR并确认了克隆，所述反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸90秒。将所述重组载体命名为pCC1BAC-iolT1。
(4)iolT2基因片段的制作
为了获得包含SEQ ID NO：4的iolT2基因的开放阅读框的1.6kb片段，使用凯杰公司的基因组尖端系统提取谷氨酸棒状杆菌(Corynebacter ium glutamicum ATCC 13032)的基因组DNA。
使用所述gDNA作为模板，实施PCR。这里使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物，PCR反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸60秒，并且此过程重复实施30次。在0.8％的琼脂糖凝胶上对所述PCR结果物(下文中称，命名为“iolT2片段”)进行电泳，然后洗脱并获得具有所需大小的条带。
(5)重组载体pCC1BAC-iolT2的制作
将在上述(4)中准备的iolT2片段用限制酶EcoRI处理后，将其与用相同的限制酶EcoRI处理的线性pCC1BAC载体连接，使得与载体的lac启动子方向一致。
用所述制备的重组载体转化大肠杆菌DH5a细胞，并将其涂布于含有氯霉素的LB固体培养基，并在37℃下培养过夜。将一白金耳的所述培养菌落接种于3ml的含有氯霉素的LB液体培养基中并培养过夜，然后利用质粒小量提取试剂盒回收质粒DNA。通过用限制酶EcoRI处理后来确定重组载体的大小(未示出数据)，并且通过用SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12的引物在以下反应条件下实施PCR并确认了克隆，所述反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸90秒。将所述重组载体命名为pCC1BAC-iolT2。
(6)重组载体pCC1BAC-iolT1-iolT2的制作
将在上述(5)中制备的pCC1BAC-iolT2载体用限制酶HindIII处理后，将其与在上述(2)中准备的iolT1片段连接，使得与载体上的lac启动子方向一致。
用所述制备的载体转化大肠杆菌DH5a细胞，并将其涂布于含有氯霉素的LB固体培养基，并在37℃下培养过夜。将一白金耳的所述培养菌落接种于3ml的含有氯霉素的LB液体培养基中并培养过夜，然后利用质粒小量提取试剂盒回收质粒DNA。通过用限制酶HindIII处理来确定重组载体的大小(未示出数据)，并且通过用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物在以下反应条件下实施PCR并确认了克隆，所述反应条件为，在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸90秒。将所述重组载体命名为pCC1BAC-iolT1-iolT2。
实验例2：转化的重组菌株的制备及L-苏氨酸生产性比较
(1)利用野生型大肠杆菌的重组菌株的制备
通过电穿孔法将在所述实施例1中制备的重组载体pCC1BAC-iolT1、pCC1BAC-iolT2及pCC1BAC-iolT1-iolT2分别引入到包含苏氨酸操纵子过表达载体pBRThrABCR3(LeeKH et al.,Molecular Systems Biology(2007)3:149)的野生型大肠杆菌MG1655中，将该大肠杆菌涂布于包含100μg/ml氨苄西林和15μg/ml氯霉素的固体培养基，并挑选单菌落。
将挑选的菌株分别命名为MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1、MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2及MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1-iolT2。
使用按照上表1的组成制得的苏氨酸滴度培养基，并通过与比较例1的(3)相同的方法确认了这些菌株的L-苏氨酸生产性，其结果显示于下表3中。
表3
菌株 L-苏氨酸(g/L) 糖消耗速度(g/L/hr)
MG1655/pBRThrABCR3 3.86 0.877
MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1 3.88 1.109
MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2 3.92 1.035
MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1-iolT2 3.85 1.123
其结果如上表3所示，当将作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM1655菌株培养48小时时，生产了3.86g/L L-苏氨酸，在本实施例中获取的重组菌株MG1655/pCC1BAC-iolT1生产了3.88g/L L-苏氨酸，MG1655/pCC1BAC-iolT2和MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2分别生产了3.92g/L、3.85g/L L-苏氨酸。即，生产了与母株相似水平的L-苏氨酸。
如上表3所示，作为野生型亲本菌株的大肠杆菌MG1655菌株的糖消耗速度显示为0.877g/L/hr，然而MG1655/pCC1BAC-iolT2的糖消耗速度显示为1.035g/L/hr，MG1655/pCC1BAC-iolT1的糖消耗速度显示为1.109g/L/hr，MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2的糖消耗速度显示为1.123g/L/hr。这与亲本菌株相比，糖消耗速度分别提高了18.0％、26.5％以及28.1％。
(2)利用大肠杆菌KCCM10541的重组菌株的制备
通过电穿孔法将在所述实施例1中制备的重组载体pCC1BAC-iolT1、pCC1BAC-iolT2及pCC1BAC-iolT1-iolT2分别引入到作为亲本菌株的L-苏氨酸生产菌株即大肠杆菌KCCM10541中，将该大肠杆菌涂布于包含15μg/ml的氯霉素的固体培养基，并挑选单菌落。
将所述挑选的菌株分别命名为KCCM10541/pCC1BAC-iolT1、KCCM10541/pCC1BAC-iolT2及KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2。
使用按照上述表1的组成制得的苏氨酸滴度培养基，通过与比较例1-(3)相同的方法确认了这些菌株和在上述比较例1-(2)中获得的重组微生物的L-苏氨酸生产性，其结果显示于下表4中。
表4
菌株 L-苏氨酸(g/L) 糖消耗速度(g/L/hr)
KCCM 10541 30.3 0.823
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1 29.5 1.213
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2 32.5 1.093
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2 29.9 1.200
KCCM 10541/pCC1BAC-galP 29.8 0.862
KCCM 10541/pCL1920-galP 29.3 0.884
其结果如表4所示，当将作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM10541菌株培养48小时时，生产了30.3g/L L-苏氨酸，本发明的上述实施例2-(2)中获取的重组菌株KCCM10541/pCC1BAC-iolT2与亲本菌株相比显示出L-苏氨酸生产力提高了2.2g/L，KCCM10541/pCC1BAC-iolT1和KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2分别生产了29.5g/L、29.9g/L L-苏氨酸。即，这些重组菌株生产了与亲本菌株相似水平的L-苏氨酸。
源自大肠杆菌的galP基因表达提高的菌株KCCM 10541/pCC1BAC-galP和KCCM10541/pCL1920-galP分别生产了29.8g/L和29.3g/L L-苏氨酸。
如表4所示，作为亲本菌株的大肠杆菌KCCM10541菌株的糖消耗速度显示为0.823g/L/hr，然而KCCM10541/pCC1BAC-iolT2的糖消耗速度显示为1.093g/L/hr，KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2的糖消耗速度显示为1.200g/L/hr，KCCM10541/pCC1BAC-iolT1的糖消耗速度显示为1.213g/L/hr，这与亲本菌株相比，糖消耗速度分别提高了32.8％、45.8％以及47.4％。并且，KCCM10541/pCC1BAC-galP和KCCM10541/pCL1920-galP的糖消耗速度与亲本菌株相比分别提高了4.7％、7.4％，由此可以确认引入棒状杆菌属iolT1、iolT2基因的菌株的糖消耗速度明显大幅提高。
将所述转化的大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-iolT1命名为CA03-0230，将KCCM10541/pCC1BAC-iolT2命名为CA03-0260，将KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2命名为CA03-0231，并于2013年02月05日分别以保藏登记号KCCM11370P、KCCM11369P及KCCM11371P保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，下文中简称“KCCM”)。
上述结果支持以下事实，即在具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌中，当源自棒状杆菌微生物的通透酶的表达提高时，即当引入1个以上的iol T1、iolT2基因时，与具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌的葡萄糖通透酶表达提高时相比，糖消耗速度提高，生产相同浓度的苏氨酸所需的时间缩短，即苏氨酸生产性得到增加。
通过以上说明，本发明所属技术领域的技术人员可以理解，本发明在对其技术思想或必要特征不进行变更的情况下，可以以其他具体形式实施。对此，应理解为，上述实施例在所有方面均为例示，并不限定于此。本发明的范围应解释为，后述的专利权利要求的含义及范围、以及由其等价概念所导出的所有变更或变形的形状均包含在本发明的范围内。
登记号
保藏机构：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏登记号：KCCM11370P
保藏日期：20130205
保藏机构：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏登记号：KCCM11369P
保藏日期：20130205
保藏机构：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏登记号：KCCM11371P
保藏日期：20130205
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2款)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2款)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2款)
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Claims (5)

1.一种具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，其中所述微生物是通过转化以使其包含源自棒状杆菌的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的通透酶(permease)而获得。
2.如权利要求1所述的具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，其特征在于，所述埃希氏杆菌属微生物为大肠杆菌。
3.如权利要求1所述的具有提高的L-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物，其中所述微生物是通过转化以使其同时包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的源自棒状杆菌的通透酶。
4.如权利要求1所述的重组埃希氏杆菌属微生物，其中所述微生物为大肠杆菌。
5.一种生产L-苏氨酸的方法，其中包括下述步骤：
接种权利要求1～3中任一项所述的微生物并培养；以及
从所述培养物分离L-氨基酸。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
CN115348969A (zh) * 2021-04-07 2022-11-15 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020009840A (es) 2018-03-23 2020-10-14 Cj Cheiljedang Corp Granulos que comprenden l-aminoacido y procedimiento de preparacion de los mismos.
KR102603624B1 (ko) 2020-11-05 2023-11-17 주식회사 엘지화학 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도
KR20230108789A (ko) * 2022-01-11 2023-07-19 대상 주식회사 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768147A (zh) * 2003-04-01 2006-05-03 底古萨股份公司 利用肠杆菌科的菌株生产L－氨基酸的方法,该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因
US20060257979A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-16 Degussa Ag. Process for preparing L-amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
KR101145943B1 (ko) * 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
KR101058894B1 (ko) * 2009-03-03 2011-08-23 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768147A (zh) * 2003-04-01 2006-05-03 底古萨股份公司 利用肠杆菌科的菌株生产L－氨基酸的方法,该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因
US20060257979A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-16 Degussa Ag. Process for preparing L-amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
KR101145943B1 (ko) * 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARSTEN B AUMCHEN等: "Myo -inositol facilitators IolT1andIolT2 enhance D-mannitol formationfromD-fructose inCorynebacteriumglutamicum", 《FEMS MICROBIOL LETT》 *
STEFFEN N.等: "Impact of a new glucose utilization pathway in amino acid-producing Corynebacterium glutamicum", 《BIOENGINEERED BUGS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
CN115348969A (zh) * 2021-04-07 2022-11-15 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN115348969B (zh) * 2021-04-07 2023-09-12 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法

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