CN114729012B - L-苏氨酸输出蛋白变体和使用其生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents
L-苏氨酸输出蛋白变体和使用其生产l-苏氨酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及L‑苏氨酸输出蛋白变体、包含该变体的微生物以及使用其生产L‑苏氨酸的方法。
Description
[技术领域]
本公开内容涉及L-苏氨酸输出蛋白变体和通过使用其生产L-苏氨酸的方法。
[背景技术]
L-苏氨酸(L-Thr)是一种必需氨基酸，已广泛用作饲料添加剂等，并且也已广泛用作例如输液等医药产品的原料，以及作为保健食品的材料。
目前，使用微生物的直接发酵主要用于生产L-苏氨酸。至于用于生产L-苏氨酸的微生物，最初主要使用通过化学或物理突变表现出类似物抗性的选择菌株，但由于二十世纪九十年代基因重组技术的快速发展和分子水平调控机制的建立，主要使用利用基因工程技术的重组菌株。
同时，能够输出具体氨基酸的基因的表达有助于提高微生物中相应氨基酸的生产力。棒状杆菌属某种微生物中L-赖氨酸输出基因(lysE)的增强提高了赖氨酸的生产力(WO9723597A2)。专利(EP1016710B1)公开了通过增强yahN、yeaS、yfiK和yggA基因，提高了L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产力，这些基因的功能尚未在大肠杆菌中鉴定。
[发明内容]
[技术问题]
本发明人选择突变体rhtC用于提高由rhtC编码的L-苏氨酸输出蛋白(RhtC)的L-苏氨酸输出能力，并验证了通过突变体显著提高了L-苏氨酸产量，从而完成了本公开内容。
[技术方案]
本公开内容的目的是提供L-苏氨酸输出蛋白变体，其包括在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第53或62位的位置处用另一种氨基酸的取代，具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不少于80％且少于100％的序列同源性，和具有L-苏氨酸输出活性。
本公开内容的另一个目的是提供编码L-苏氨酸输出蛋白变体的多核苷酸。
本公开内容的仍另一目的是提供包含该多核苷酸的载体。
本公开内容的另一方面是提供生产L-苏氨酸的微生物，该微生物包括L-苏氨酸输出蛋白变体、编码该变体的多核苷酸和包括该多核苷酸的载体中的任何一个或多个。
本公开内容的仍另一方面是提供用于生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养微生物。
[有益效果]
与具有现有未修饰蛋白质的微生物相比，通过使用L-苏氨酸输出蛋白变体培养生产L-苏氨酸的微生物可以生产高产率的L-苏氨酸。
[具体实施方式]
本公开内容将具体描述如下。本公开内容中公开的每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。即，本公开内容中公开的多种要素的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不受以下具体描述的限制。
根据用于实现目的的本公开内容的一个方面，提供了L-苏氨酸输出蛋白变体，其在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括至少一种氨基酸取代。
具体地，本公开内容提供了蛋白质变体，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中i)第53位氨基酸被另一种氨基酸取代和/或ii)第62位氨基酸被另一种氨基酸取代。氨基酸取代可包括i)第53位氨基酸被苏氨酸置换，或ii)第62位氨基酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸。
如本文所用，术语“苏氨酸(Thr)”是指体内不能合成并且只能通过食物供给的必需氨基酸之一，其中苏氨酸构成粘蛋白作为肠上皮保护物质，缺乏苏氨酸可能会损害生长并导致体重减轻。苏氨酸被广泛用作饲料添加剂、医药产品(例如输液)的原料、保健食品的材料等。与其他氨基酸一样，苏氨酸也有D型和L型立体异构体，大多数天然存在的苏氨酸形式以其为L型立体异构体的L-苏氨酸(L-Thr)存在。在本文中，苏氨酸(Thr)可与L-苏氨酸(L-Thr)互换使用。
如本文所用，术语“L-苏氨酸输出蛋白”或“L-苏氨酸外排蛋白”是指介导L-苏氨酸输出到细胞外的蛋白质，其中该蛋白质被称为具有五个跨膜结构域的内膜蛋白。实验拓扑学分析表明L-苏氨酸的C端存在于细胞质中(Daley DO等人，Global topology analysisof the Escherichia coli inner membrane proteome,Science.2005May 27；308(5726):1321–3)。L-苏氨酸输出蛋白可以是，例如，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的蛋白质。包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的蛋白质可与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的蛋白质或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列组成的蛋白质互换使用。本文中，L-苏氨酸输出蛋白可与RhtC蛋白或RhtC互换使用。
在本文中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115是指具有L-苏氨酸输出能力的氨基酸序列。具体地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115是具有rhtC基因编码的L-苏氨酸输出能力的蛋白质的序列。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列可经由已知数据库NCBI GenBank获得。例如，SEQ ID NO:1可能衍生自大肠杆菌(E.coli)，SEQ ID NO:113可能衍生自福氏志贺氏菌(Shegella flexneri)，而SEQID NO:115可能衍生自弗格森埃希菌(Escherichia fergusonii)，但这些序列不限于此，并且可以包括但不限于具有与包含这些氨基酸序列的蛋白质相同活性的蛋白质的任何氨基酸序列。SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115可以与SEQ ID NO:1具有99％的同源性，但不限于此。
尽管在本公开内容中将具有L-苏氨酸输出能力的蛋白质定义为包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的蛋白质，但对本领域普通技术人员来说是显而易见是，此类蛋白质不排除可能由于在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列上游或下游无意义的序列添加而发生的突变，或天然存在的突变，或其中的沉默突变，并且此类蛋白质对应于具有本公开内容的L-苏氨酸输出能力的蛋白质，只要该蛋白质具有与包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸的蛋白质的等效其相应的活性。具体地，本公开内容的具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质可以是由SEQID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，显然，具有在其部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可落入本发明内容的待突变蛋白质的范围内，只要该蛋白质具有拥有此类同源性或同一性的氨基酸序列，并且显示出与上述蛋白质相应的效果。
即，虽然在本公开内容中描述为“具有具体序列号中叙述的氨基酸序列的蛋白质或多肽”或“包括具体序列号中叙述的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但具有在其部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也可用于本公开内容，只要该蛋白质具有与由相应的序列号的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性。例如，显然对于“由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的多肽”，任何多肽也可以落入“由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽”，只要该多肽具有对应于SEQ ID NO:1的序列或具有与其相同或相应活性的序列。
如本文所用，术语“变体”是指其中保守取代和/或修饰中的至少一种氨基酸与所述序列的氨基酸不同但其功能或性质保持不变的蛋白质。变体通过数个氨基酸取代、缺失或添加而与已鉴定的序列不同。此类变体通常可以通过修饰蛋白质的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸并评估已修饰的蛋白质性质进行鉴定。也就是说，与其天然蛋白质的能力相比，变体的能力可以增加、不变或降低。此外，一些变体可以包括其中至少一部分(例如，N-末端前导序列或跨膜结构域)被去除的那些变体。其他变体可以包括其中成熟蛋白质的N-末端和/或C-末端的一部分被去除的变体。术语“变体”还可以与“修饰”、“修饰的蛋白质”、“修饰的多肽”、“突变体”、“突变蛋白质”、“发散的”等以及可以使用在被突变的意义上使用的任何术语互换使用，但不限于此。出于本公开内容的目的，变体可以指其中突变蛋白质的活性与天然野生型或未修饰蛋白质的活性相比增加的那些，但变体不限于此。
如本文所用，术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一种氨基酸。变体可具有例如一个或多个保守取代同时仍保留一种或多种生物活性。此类氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。例如，在带电荷的氨基酸中，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；在不带电荷的氨基酸中，非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸；极性或亲水性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；在极性氨基酸中，芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
此外，变体可以包括具有对多肽的特征和二级结构影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以与蛋白质N末端的信号(或前导)序列缀合，该序列参与蛋白质的共翻译或翻译后转移。此外，多肽也可以与另一个序列或接头缀合以进行鉴定、纯化或合成。
“用另一种氨基酸取代”不受限制，只要氨基酸与取代前的氨基酸不同。即，当SEQID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中第53位氨基酸的丙氨酸被除丙氨酸以外的氨基酸取代时，或第62位氨基酸的亮氨酸被亮氨酸以外的氨基酸取代时，此类取代不受限制。对于本公开内容中的“具体氨基酸被取代”的表达，即使没有具体说明氨基酸被另一种氨基酸取代，氨基酸被与取代前的氨基酸不同的氨基酸也取代也是显而易见的。
变体可以是其中第53位或第62位氨基酸的至少一种氨基酸被与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代的变体。可选地，变体可以是具有不带电荷的氨基酸的变体，其中取代的氨基酸与取代前的氨基酸不同，但不限于此。
具体地，变体可以这样的变体，其中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中i)第53位氨基酸被另一种氨基酸取代或ii)第62位氨基酸被另一种氨基酸取代。用另一种氨基酸取代可以包括i)第53位氨基酸被苏氨酸取代，或ii)第62位氨基酸被选自如下的氨基酸取代：丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸。更具体地，变体可以是这样的变体，其中在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中i)第53位氨基酸被苏氨酸取代，或ii)第62位氨基酸被选自如下的氨基酸取代：丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸。
本发明内容提供的L-苏氨酸输出蛋白变体可以是指上述具有L-苏氨酸输出能力的蛋白质中，通过具体位置的氨基酸取代，其L-苏氨酸输出能力比突变前蛋白质的输出能力增加的变体。
在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中具有i)第53位氨基酸被苏氨酸取代和ii)第62位氨基酸被另一种氨基酸取代的变体可以是包括SEQ IDNO:93至112、114和116的任一氨基酸序列的变体，具体地基本上由SEQ ID NO:93至112、114和116的任一氨基酸序列组成，并且更具体地，由SEQ ID NO:93至112、114和116的任一氨基酸序列组成。
变体可以是这样的变体，其包括在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ IDNO:115的氨基酸序列中的第53位或第62位的位置处用另一种氨基酸取代，具有与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或少于100％的序列同源性，并具有L-苏氨酸输出活性。
此外，变体可包括SEQ ID NO:93至112、114和116的任一氨基酸序列，或其中选自氨基酸序列中的第53或第62位氨基酸的至少一种氨基酸是固定的并且与氨基酸序列具有至少80％的同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开内容的变体可以包括与SEQ ID NO:93至112、114和116的任一氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多肽。同样明显的是，任何具有在第53或62位氨基酸位置以外的序列部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也可以落入本公开内容的范围内，只要氨基酸序列具有此类同源性或同一性并且表现出与蛋白质相应的作用。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，其可以用百分比表示。术语同源性和同一性经常可以互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以使用标准比对算法来确定，并且可以一起使用待要使用的程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或同一序列通常可以在中等或高度严格条件下沿着序列的全部或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％彼此杂交。在杂交中，还考虑了含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
可以使用已知的计算机算法确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，例如使用默认参数的“FASTA”程序，例如，Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444。可选地，这可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)来确定，该算法在欧洲分子生物学开放软件套件(European Molecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS)包的Needleman程序中执行(Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(版本5.0.0或更新)(GCG程序包(包括GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人，JMOLEC BIOL 215:403(1990)；Guideto Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994，和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可以使用来自国家生物技术信息中心数据库(National Center for Biotechnology Information database)或ClustalW的BLAST来确定同源性、相似性或同一性。
可以通过GAP计算机程序(例如，Needleman等人，(1970),J Mol Biol.48:443)通过比较序列信息来确定多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性，如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的。简而言之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将类似对齐的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可能包括：(1)二元比较矩阵(包含值1用于同一性，值0用于非同一性)和Gribskov等人Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编辑中公开的，Atlas Of Protein Sequence And Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个空位罚分3.0，每个空位中每个符号另外0.10罚分(或空位开放罚分为10和空位扩展罚分为0.5)；和(3)端空位无罚分。
另外，可以通过在限定的严格条件下进行的Southern杂交实验，通过比较这些序列来确认任何两条多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，并且可以在本领域的范围内并且通过本领域技术人员熟知的方法确定待限定的适当的杂交条件(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
如本文所用，术语“L-苏氨酸输出蛋白变体”可与具有L-苏氨酸生产能力的修饰多肽、L-苏氨酸生产修饰多肽、生产L-苏氨酸的修饰多肽、具有L-苏氨酸输出活性的修饰多肽、L-苏氨酸输出活性变体、L-苏氨酸输出变体、突变体RhtC和RhtC变体、突变体L-苏氨酸输出蛋白等互换使用。蛋白质可源自大肠杆菌(E.coli)，但不限于此。
L-苏氨酸输出蛋白变体可包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中第53和/或第62位的突变，或具有在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ IDNO:115的氨基酸序列中添加或缺失氨基酸的氨基酸序列的任何变体也可落入本公开内容的范围内，只要变体包括在对应于来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的N端的第53和/或第62位氨基酸的位置处的氨基酸取代。L-苏氨酸输出蛋白变体可以是其中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中第53和/或第62位氨基酸被另一种氨基酸取代的变体，或者可以是突变体L-苏氨酸输出蛋白，其包括SEQ ID NO:1、SEQID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与突变前的衍生自野生型微生物的L-苏氨酸输出蛋白相比具有增强的活性。此类L-苏氨酸输出蛋白变体是指这样的变体，其中在SEQID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的氨基酸序列，在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的第53或第62位的位置处的氨基酸被突变。
第53或第62位氨基酸的突变可以是i)第53位氨基酸被苏氨酸取代，或ii)第62位氨基酸被选自如下的氨基酸取代：丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸。
具体地，L-苏氨酸输出蛋白变体可以是其中在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQID NO:115的氨基酸序列中，i)第53位氨基酸被苏氨酸取代，或ii)第62位氨基酸被选自以下的氨基酸取代的变体：丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸，和可能是与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列或突变前的衍生自野生型微生物的L-苏氨酸输出蛋白相比具有增强活性的变体。
出于本公开内容的目的，包含L-苏氨酸输出蛋白变体的微生物表现出L-苏氨酸产量的增加。这很重要，因为本公开内容的L-苏氨酸输出蛋白变体可以增加L-苏氨酸产量，而野生型微生物不能产生L-苏氨酸，或者即使可以，它也只能产生极少量的L-苏氨酸。
根据本公开内容的另一个方面，提供了编码L-苏氨酸输出蛋白变体的多核苷酸。
L-苏氨酸、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列并具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质及其变体如上所述。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指通过共价键以链类型连接的核苷酸单元的聚合物，并且指具有预定长度或更长的DNA或RNA链。更具体地，该术语是指编码变体的多核苷酸片段。
编码本公开内容的L-苏氨酸输出蛋白变体的多核苷酸可以包括但不限于编码本公开内容的具有L-苏氨酸输出活性的修饰多肽的任何多核苷酸序列。在本公开内容中，编码L-苏氨酸输出蛋白的氨基酸序列的基因为rhtC基因，其可以衍生自大肠杆菌、福氏志贺氏菌或弗格森埃希菌，但不限于此。此外，基因可以是编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的核苷酸序列，更具体地，编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列可以是包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列的序列，但不限于此。
具体地，考虑到密码子简并性或多肽将在其中表达的生物体优选的密码子，本公开内容的多核苷酸可以在其编码区中在不改变多肽的氨基酸序列的范围内进行多种修饰。具体地，可以包括但不限于任何多核苷酸序列，只要多核苷酸序列编码L-苏氨酸输出蛋白变体，其中在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中第53或第62位氨基酸被另一种氨基酸序列取代。
此外，可以包括但不限于任何序列，只要序列编码具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质，其中通过在严格条件下与可由已知基因序列(例如，与核苷酸序列的全部或部分的互补序列)制备的探针杂交，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中第53或第62位氨基酸被另一种氨基酸取代。“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51、11.7-11.8)。例如，条件可以如此条件，在所述条件下具有高度同源性或同一性的基因，例如具有至少40％，具体地至少90％，更具体地至少95％，仍更具体地至少97％，和仍更具体地至少99％的同源性或同一性的基因，相互杂交，但具有较低同源性或同一性的基因不相互杂交；或用于Southern杂交的典型洗涤条件，即在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS，具体地60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤一次，具体地两次或三次。
杂交要求两个核酸具有互补序列，但是取决于杂交严格性，碱基之间的错配可以是可能的。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容不仅可以包括基本上相似的核酸序列，还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件并使用上述条件在55℃的Tm值下检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，本领域技术人员可以根据目的适当调整。
杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度及其互补程度，并且其变量是本领域公知的(例如，Sambrook等人，同上)。
根据本公开内容的另一个方面，提供了包含编码L-苏氨酸输出蛋白变体的多核苷酸的载体。
L-苏氨酸、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列并具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质及其变体如上所述。
如本文所用，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接到合适的控制序列，使得靶蛋白可以在合适的宿主中表达。控制序列可以包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体在转化到合适的宿主中后，可以复制或发挥功能而与宿主的基因组无关，或者可以整合到基因组本身中。
本公开内容中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域中已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或粘粒载体，和基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的载体可用作质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。
例如，可以通过用于细胞内染色体插入的载体将编码靶多肽的多核苷酸插入染色体中。可以使用本领域中已知的任何方法将多核苷酸插入到染色体中，例如同源重组，但不限于此。载体可进一步包括用于鉴定染色体插入的选择标记。选择标记用于选择载体转化的细胞，即确认靶核酸分子是否已成功插入，以及可以使用赋予可选择表型的标记，例如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒药物的耐药性和表达表面蛋白。在处理选择剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达其他表型性状，从而可以选择转化的细胞。
根据本公开内容的另一个方面，提供了通过包含L-苏氨酸输出变体或编码该变体的多核苷酸来生产L-苏氨酸的微生物。
如本文所用，术语“包括修饰的多肽的微生物”或“包括L-苏氨酸输出蛋白变体的微生物”是指通过将L-苏氨酸生产能力赋予具有天然减弱的L-苏氨酸生产能力的微生物或没有L-苏氨酸生产能力的亲本菌株而获得的微生物。具体地，微生物可以是表达L-苏氨酸输出蛋白变体的微生物，该变体包括在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中的至少一种氨基酸突变，其中该氨基酸突变可以包括用另一种氨基酸取代自N端的第53或第62位氨基酸。具体地，微生物可以是表达修饰多肽的微生物，在所述修饰多肽中，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的氨基酸序列中的第53或第62位氨基酸被另一种氨基酸取代并且所述修饰多肽具有L-苏氨酸输出活性，但不限于此。
L-苏氨酸、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列并具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质及其变体如上所述。
如本文所用，关于蛋白质的术语“待表达/表达”是指其中将靶蛋白引入微生物或修饰靶蛋白以在微生物中表达的状态。当靶蛋白是存在于微生物中的蛋白质时，该术语是指其中与内源活性或蛋白质修饰前的活性相比，蛋白质活性增强的状态。出于本公开内容的目的，“靶蛋白”可以是具有L-苏氨酸输出能力的前述蛋白变体。
具体地，术语“蛋白质的引入”是指微生物表现出其原本不具有的具体蛋白质的活性，或与内源活性或相应蛋白质修饰前的活性相比表现出增强的活性。例如，该术语可以表示将编码具体蛋白质的多核苷酸引入微生物的染色体或将包含编码具体蛋白质的多核苷酸的载体引入微生物，从而表现出具体蛋白质的活性。术语“活性增强”是指与微生物中的内源活性或具体蛋白质修饰前的活性相比，增强了具体蛋白质的活性。“内源活性”是指在自然或人为因素引起的基因突变转化微生物时，亲本菌株在其转化前原来具有的具体蛋白质的活性。
具体地，本公开内容中活性增强可以通过选自以下中的任何一种或多种方法实现：增加编码蛋白质变体的基因的细胞内拷贝数的方法；将突变引入编码蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法；用具有强活性的序列替换编码具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法；用编码蛋白质变体的基因替换在染色体上编码具有L-苏氨酸输出活性的天然蛋白质的基因的方法；进一步将突变引入编码具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质的基因以增强蛋白质变体的活性的方法；以及将蛋白质变体引入微生物的方法，但不限于此。
在上文中，基因拷贝数的增加可以以将基因可操作地连接到载体的方式或通过将基因插入宿主细胞的染色体来进行，但不具体限于此。具体地，可以将编码本公开内容的蛋白质的多核苷酸可操作地连接到其上并且可以与宿主细胞无关的复制和发挥功能的载体引入宿主细胞中。可选地，可以将多核苷酸可操作地连接到其上并且可以将多核苷酸插入宿主细胞染色体中的载体引入宿主细胞的染色体中。可以通过本领域已知的任何方法，例如同源重组，实现将多核苷酸插入染色体中。
接下来，可以通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导核酸序列的突变以进一步增强表达调控序列的活性或者用具有更强活性的核酸序列替换表达调控序列来进行表达控制序列的修饰以增加多核苷酸的表达，但不具体限于此。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等，但不具体限于此。
代替天然启动子，强启动子可以连接到多核苷酸表达单元的上游区域，但不限于此。强启动子的已知实例可包括cj1至cj7启动子(韩国专利号10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(韩国专利号10-1783170)、O2启动子(韩国专利号10-1632642)、tkt启动子、yccA启动子等，但不限于此。
此外，可以通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在表达控制序列上引入突变以进一步增强多核苷酸序列的活性，或通过用修饰以具有更强活性的多核苷酸序列替换多核苷酸序列来进行染色体上多核苷酸序列的修饰，但不具体限于此。
此类蛋白质活性的引入和增强通常可以使相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型或未修饰的微生物菌株中蛋白质的活性或浓度增加至少1％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％，以及多达1,000％或2,000％，但不限于此。
如本文所用，术语“未修饰的微生物”是指天然菌株本身、不含L-苏氨酸输出蛋白变体的微生物、或未用包括编码L-苏氨酸输出蛋白变体的多核苷酸的载体转化的微生物，并且不排除含有可能在微生物中自然发生的突变的菌株。
在本公开内容中，含有L-苏氨酸输出变体或编码该变体的多核苷酸的微生物可以是通过用包含多核苷酸的载体转化而制备的重组微生物，但不限于此。
如本文所用，术语“转化”是指将含有编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞以在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白质。转化的多核苷酸可以是任何多肽，只要该多肽可以在宿主细胞内表达，无论多核苷酸是否插入并位于宿主细胞的染色体上或位于染色体外。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形状引入，只要多核苷酸可以引入宿主细胞中并表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入，该表达盒是含有自我表达所需的所有因子的基因构建体。表达盒可以包括启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号，它们可以与多核苷酸可操作地连接。表达盒可以是能够自我复制的表达载体。此外，多核苷酸可以以与其在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接进入宿主细胞的形式引入，但不限于此。
此外，术语“可操作地连接”是指基因序列和启动子序列之间的功能连接，其启动和介导编码本公开内容的所期望多肽的多核苷酸的转录。
如本文所用，术语“生产L-苏氨酸的微生物”包括具有天然或人工发生的遗传修饰的所有微生物，并且指其中具体机制由于外源基因的插入或内源基因活性的增强或失活而减弱或增强，其中微生物具有基因突变或增强的生产所期望的L-苏氨酸的活性。出于本公开内容的目的，生产L-苏氨酸的微生物可以指这样的微生物，与野生型或未修饰的微生物相比，其可以通过含有L-苏氨酸输出蛋白变体，从培养基中的碳源生产过量的所期望的L-苏氨酸。在本公开内容中，“生产L-苏氨酸的微生物”可以与“具有L-苏氨酸生产能力的微生物”或“L-苏氨酸生产微生物”互换使用。
生产L-苏氨酸的微生物可以是重组微生物。重组微生物如上所述。
生产L-苏氨酸的微生物对其种类没有具体限制，只要该微生物可以生产L-苏氨酸即可。具体地，生产L-苏氨酸的微生物可包括属于棒状杆菌属某种、埃希氏菌属某种、肠杆菌属某种、欧文氏菌属某种、沙雷氏菌属某种、普罗威登斯菌属某种和短杆菌属某种的微生物，和更具体地，属于棒状杆菌属某种或埃希氏菌属某种的微生物。
更具体地说，埃希氏菌属某种的微生物可能是大肠杆菌；和棒状杆菌属某种的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、Corynebacterium singulare、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹状体棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒杆菌(Cxorynebacterium imitans)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、微黄棒杆菌(Corynebacteriumflavescens)等或具体的谷氨酸棒状杆菌。然而，可以包括但不限于属于埃希氏菌属某种或棒状杆菌属某种的任何微生物，只要该微生物可以通过引入或增强具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质来增加L-苏氨酸产量。
在本发明内容中，对经修饰以表达具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质或蛋白质变体的生产L-苏氨酸的微生物的亲本菌株没有具体限制，只要该亲本菌株是生产L-苏氨酸的微生物。生产L-苏氨酸的微生物可以是这样的微生物，其中为了增加L-苏氨酸产量，增强了L-苏氨酸的生物合成途径，消除了对L-苏氨酸的反馈抑制，失活了减弱L-苏氨酸的生物合成途径的基因，增加了L-苏氨酸操纵子的活性，和/或赋予了对L-苏氨酸类似物的抗性。
具体地，为了增强L-苏氨酸的生物合成途径，例如编码苏氨酸合酶的thrC基因、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因、涉及葡萄糖摄取的galP基因、编码赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3的lysC基因、编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或诱导草酰乙酸库(pool)增加的pyc基因在微生物中可能增强或增加。
为了消除对L-苏氨酸的反馈抑制，例如可以将对于lysC基因、hom基因、具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的thrA基因等的基因突变等引入微生物中。
为了使减弱L-苏氨酸生物合成途径的基因失活，例如，在微生物中减弱或失活以下基因的表达：涉及将草酰乙酸(OAA)(L-苏氨酸生物合成中的中间体)转化为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的pckA基因；抑制lysC基因的tyrR基因；抑制涉及葡萄糖摄取的galP基因表达的galR基因或作为DNA结合转录双重调节子的mcbR基因。
为了增加L-苏氨酸操纵子的活性，质粒——包括由编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的基因组成的苏氨酸操纵子(日本专利公开号2005-227977)、大肠杆菌衍生的苏氨酸操纵子等，可以被引入微生物(TURBA E.等人,Agric.Biol.Chem.53:2269–2271,1989)，从而增加微生物中苏氨酸操纵子的表达。
此外，微生物可能对为苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基戊酸或D,L-苏氨酸异羟肟酸酯具有抗性。
然而，不限于此，可以通过本领域已知的基因表达控制方法来增强L-苏氨酸生产能力。
如本文所用，术语“增强/增加”包括涵盖与内源活性相比增加活性的所有类型作用的概念。
这种基因活性的增强或增加可以通过应用本领域熟知的多种方法来实现。增强或增加可以通过选自由以下的任何一种或多种方法实现：增加基因的细胞内拷贝数的方法；将突变引入基因的表达调控序列的方法；用具有强活性的序列替换基因的表达控制序列的方法；进一步在基因中引入突变以增强相应基因活性的方法；以及将外源基因引入微生物的方法，并且可以通过它们的组合来实现，但不具体限于此。
如本文所用，术语“失活”包括涵盖与内源活性相比所有的活性减弱或活性缺乏的概念。
此类基因活性的失活可以通过应用本领域公知的多种方法来实现。方法的实例可以包括：缺失染色体上全部或部分基因的方法(包括消除基因的活性)；用突变以降低蛋白质活性的基因替换染色体上编码蛋白质的基因的方法；将突变引入编码蛋白质的染色体上的基因的表达控制序列中的方法；用具有活性减弱或缺乏的序列替换编码蛋白质的基因的表达控制序列的方法(例如，用弱于内源启动子的启动子替换基因启动子的方法)；缺失编码蛋白质的染色体上的全部或部分基因的方法；引入反义寡核苷酸(例如反义RNA)的方法，该寡核苷酸与染色体上基因的转录组互补结合并抑制从mRNA到蛋白质的翻译；通过在编码蛋白质的基因的SD序列上游人工添加与SD序列互补的序列以形成二级结构来使核糖体无法附着的方法；以及在待逆转录的相应序列的开放阅读框(ORF)的3'端加入启动子的逆转录工程(RTE)方法。基因活性的失活可以通过多种方法的组合来实现，但不具体限于此。
根据本公开内容的另一个方面，提供了一种用于生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养生产L-苏氨酸的微生物的步骤。
L-苏氨酸、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列并具有L-苏氨酸输出活性的蛋白质、其变体、蛋白质的表达和微生物如上所述。
如本文所用，术语“培养”是指在适当调整的环境条件下生长微生物。本公开内容的培养程序可以根据本领域已知的合适的培养基或培养条件进行。本领域技术人员可以根据所选择的菌株容易地调整这样的培养程序。具体地，培养的实例可包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但是不限于此。
如本文所用，“培养基”是指含有微生物培养所需的营养物质作为主要成分的混合物，其中培养基供应营养物质、生长因子等，其包括对生存和生长必不可少的水。具体地，对于用于培养本公开内容的微生物的培养基和其他培养条件，可以使用用于典型的微生物培养的任何培养基，而没有具体限制。然而，本公开内容的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中在需氧条件下培养，同时调整温度、pH等。
在本公开内容中，碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；糖醇，如甘露醇和山梨糖醇；有机酸，例如丙酮酸、乳酸和柠檬酸；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸；等等。此外，可以使用天然有机营养源，例如淀粉水解物、糖蜜、黑带糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，和具体地，可以使用碳水化合物，例如葡萄糖和无菌预处理糖蜜(即转化为还原糖的蜜糖)，并且可以不受限制地使用适量的其他碳源。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。
对于氮源，可以使用无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源，例如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼类或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等等。这些氮源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。
磷酸盐源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。对于无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，此外还可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些来源或前体可以以分批或连续方式添加到培养基中。然而，本公开内容的培养基不限于此。
在本公开内容中，可以通过在微生物培养期间以适当的方式向培养基中加入例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调整培养基的pH值。此外，可以添加消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制泡沫形成。此外，可以向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的有氧状态，也可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体或不注入气体以维持培养基的厌氧或非有氧状态，但培养基不限于此。
培养基的温度可为20℃至50℃，和具体为30℃至37℃，但不限于此。培养期可以持续直到可以获得所期望量的有用生产物质为止，并且具体可以是10至100小时，但不限于此。
由培养物产生的L-苏氨酸可能会被释放到培养基中，或者可保留在细胞中而不被释放。
生产L-苏氨酸的方法可以包括从培养的微生物或培养基中回收L-苏氨酸的步骤。
培养步骤中产生的L-苏氨酸的回收可以是通过根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养物中收集所期望的L-苏氨酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收所期望的L-苏氨酸。
此外，回收步骤可以包括纯化工艺，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收的L-苏氨酸可以是纯化的形式或含有L-苏氨酸的微生物发酵液的形式(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering，A.J.Nair,2008)。
[实施本发明的模式]
在下文中，将参照示例性实施方式详细描述本公开内容。然而，这些示例性实施方式是针对具体地说明本公开内容给出的，并且本公开的范围不限于此。
实施例1：L-苏氨酸输出蛋白突变体文库和质粒的构建
为了制备用于易错PCR的模板，通过使用SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44进行PCR，从大肠杆菌W3110基因组DNA中获得核苷酸序列片段。
SEQ ID NO:43(rhtC F)
GTCGACTCTAGAGGATCCCCGCTGATTCGTGCGCATGTTG
SEQ ID NO:44(rhtC R)
TGAATTCGAGCTCGGTACCCTCACCGCGAAATAATCAAAT
用Smal限制性内切酶消化pCL1920(Nucleic Acids Research,18,(1990)4631)，并通过Gibson组装方法克隆所获得的DNA片段以获得pCL1920-Pn_rhtC作为重组质粒。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。
对用于随机诱变系统的编码L-苏氨酸输出蛋白的野生型rhtC进行易错PCR，在易错PCR中，使用Diversify PCR随机诱变试剂盒(Takara)。对于突变率条件的选择，根据以下两种条件下的MnSO4浓度进行易错PCR。将上述pCL1920-Pn_rhtC用作待引入突变的DNA模板。易错PCR组合物组成如表1所示。PCR的条件如下：95℃变性30分钟，95℃变性30分钟、55℃退火30秒和68℃聚合30秒的25个循环，和68℃聚合60秒。将SEQ ID NO:43和44用于引物。
表格1
| 实例# | 1(μL) | 2(μL) |
| 10X钛taq缓冲液 | 5 | 5 |
| MnSO4(8mM) | 1 | 2 |
| dGTP(2mM) | 1 | 1 |
| 50X dNTP混合 | 1 | 1 |
| 钛Taq聚合酶 | 1 | 1 |
| 正向引物(5pmol) | 2 | 2 |
| 反向引物(5pmol) | 2 | 2 |
| 模版DNA | 1 | 1 |
| dH2O | 36 | 35 |
| 总计 | 50 | 50 |
使用DNA经由Gibson组装方法获得重组突变体质粒文库，通过对表1条件下进行的易错PCR产物进行Dpnl处理，并用Smal限制性内切酶消化pCL1920，从中移出模板质粒。将经由上述方法获得的突变体文库pCL1920-Pn_rhtC和pCL1920转化入大肠杆菌K12细胞中，将细胞平板接种于含有50μg/L壮观霉素的LB平板培养基上。从突变文库转化的K12中选出50个菌落，进行测序以确定突变率和多个位置突变的发生或不发生。作为测序的结果，突变率在实例#1条件下为1.2kb-1，在实例#2条件下为2.0kb-1。确定实例#1和#2都满足适合确保突变体文库的突变率，和因此使用在上述条件下制备的文库进行有效的突变选择。在96深孔板中分配300μL含有60g/L的L-苏氨酸的M9基本培养基后，接种先前转化的K12/pCL1920-Pn_rhtC、K12/pCL1920和K12/突变体文库菌落。细胞在1200rpm/15小时/37℃的条件下培养，然后在600nm波长下进行OD测量。认为具有显著提高的苏氨酸输出能力的菌株可以在60g/L的L-苏氨酸浓度下生长，因为野生型大肠杆菌K12菌株在M9培养基中通常在30g/L左右时受到生长抑制，30g/L是L-苏氨酸最小抑制浓度(MIC)。大多数突变体菌株文库在深孔板中几乎没有生长，如对照菌株(K12/pCL1920和K12/pCL1920-Pn_rhtC)，但选择了与对照菌株的生长相比观察到其生长的四种菌株，并记录每种的OD。
表2
| 菌株名称 | OD |
| K12/pCL1920 | 0.15 |
| K12/pCL1920-Pn_rhtC | 0.16 |
| K12/pCL1920-Pn_rhtC突变体文库(3-1C5) | 1.41 |
| K12/pCL1920-Pn_rhtC突变体文库(3-2D11) | 2.60 |
| K12/pCL1920-Pn_rhtC突变体文库(3-4E3) | 2.46 |
| K12/pCL1920-Pn_rhtC突变体文库(3-4G2) | 2.57 |
从4种选择的突变体菌株中提取pCL1920-Pn_rhtC突变体质粒后，进行测序以检测突变，确认编码序列(CDS)中发生突变，而非启动子区中发生突变。表2中提到的突变体质粒从上命名为pCL1920-Pn_rhtC(m1)、pCL1920-Pn_rhtC(m2)、pCL1920-Pn_rhtC(m3)和pCL1920-Pn_rhtC(m4)。
为了比较和评价棒状杆菌菌株中突变体rhtC的活性，经由以下方法制备用于插入的质粒。
对于同源重组，分别使用SEQ ID NO:45和46以及SEQ ID NO:51和52扩增Ncgl2533的上游和下游区域。为了利用gapA启动子作为突变体rhtC的启动子，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48进行PCR。为了确保表2中所选择的突变体rhtC的片段，rhtC、rhtC(m1)、rhtC(m2)、rhtC(m3)和rhtC(m4)片段分别使用引物SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48获得。
SEQ ID NO:45(Ncgl2533上F)
TCGAGCTCGGTACCCCAGCAAGATCTAGTCATCAA
SEQ ID NO:46(Ncgl2533上R)
GTCGTTTTTAGGCTTCCGCTGGAAAACATTTTGCA
SEQ ID NO:47(PgapA F)
AATGTTTTCCAGCGGAAGCCTAAAAACGACCGAGC
SEQ ID NO:48(PgapA R)
AAATAACATCAACATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
SEQ ID NO:49(rhtC_m F)
TAGAGGAGACACAACATGTTGATGTTATTTCTCAC
SEQ ID NO:50(rhtC_m R)
TAAGCAGGTTGATTTTCACCGCGAAATAATCAAAT
SEQ ID NO:51(Ncgl2533 dn F)
ATTATTTCGCGGTGAAAATCAACCTGCTTAGGCGT
SEQ ID NO:52(Ncgl2533 dn R)
CTCTAGAGGATCCCCTATAGCTACCATCTGGGTGG
将经由上述程序获得的PCR片段和Smal限制性内切酶消化的用于染色体转化的pDZ载体使用Gibson组装方法进行克隆，以因此得到野生型质粒和5个突变体rhtC重组质粒。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。制备的质粒分别命名为pDZ-PgapA_rhtC、pDZ-PgapA_rhtC(m1)、pDZ-PgapA_rhtC(m2)、pDZ-PgapA_rhtC(m3)和pDZ-PgapA_rhtC(m4)。
实施例2：L-苏氨酸生产菌株的制备
2-1：突变体赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3(LysC)转化
与赖氨酸敏感性天冬氨酸激酶3对应的lysC基因表达的增强和用于消除对L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制的突变(L377K)性状(韩国专利公开号10-2019-0003019)被引入。具体地，获得染色体上同源重组的lysC启动子上游区域和lysC第377位突变的下游区域，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板，经由PCR，通过引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4获得lysC启动子的上游区域的基因片段，通过引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10获得lysC的第377位突变的下游区域的基因片段。
SEQ ID NO:3(lysC启动子上1)
TCGAGCTCGGTACCCGACAGGACAAGCACTGGTTG
SEQ ID NO:4(lysC启动子上2)
AGTAGCGCTGGGATGTTTCTCTTTGTGCACCTTTC
SEQ ID NO:9(lysC下1)
GAACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGAT
SEQ ID NO:10(lysC下2)
CTCTAGAGGATCCCCGTTCACCTCAGAGACGATTA
此外，使用pECCG117-Pcj7-GFP质粒(韩国专利号10-0620092)作为模板连同引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，经由PCR获得Pcj7启动子片段。
SEQ ID NO:5(Pcj7 1)
GAAAGGTGCACAAAGAGAAACATCCCAGCGCTACT
SEQ ID NO:6(Pcj7 2)
TACGACCAGGGCCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，经由PCR获得lysC L377K突变的上游区域的基因片段。
SEQ ID NO:7(lysC 1)
CGAAAGGAAACACTCATGGCCCTGGTCGTACAGAA
SEQ ID NO:8(lysC 2)
GGTGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGAC
使用以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶和如下条件进行PCR：95℃变性5分钟；95℃变性30秒、60℃退火30秒和72℃聚合60秒的30个循环；和72℃聚合5分钟。
使用Gibson组装方法(DG Gibson等人，NATURE METHODS,Vol.6No.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)克隆经由以上程序获得的四个PCR片段和用Smal限制性内切酶消化的染色体转化的载体pDZ(韩国专利号10-1126041)，从而获得重组质粒，其命名为pDZ-Pcj7_lysC L377K。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。
将构建的pDZ-Pcj7_lysC L377K载体通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541–545)转化到野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中，然后进行二次杂交，以获得其中染色体上的野生型lysC基因被突变体Pcj7_lysC L377K基因替换的菌株。使用能够分别扩增插入对应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:11(证实lysC1)
ACATTCCACCCATTACTGCA
SEQ ID NO:12(证实lysC 2)
TCTTCATCGGTTTCGAAGGT
得到的转化的菌株被命名为Cgl-TH-1。
2-2：突变体高丝氨酸脱氢酶(Hom)转化
为了消除为DNA结合转录双重调节子的mcbR的调控，并提高对应于高丝氨酸脱氢酶的hom的表达水平，将hom启动子替换为Pcj7启动子。此外，通过将突变(G378E、R398Q)应用于Cgl-TH-1消除hom对L-苏氨酸的反馈抑制，L-苏氨酸生产将增加。为了转化突变体hom，构建了pDZ-Pcj7_hom(G378E、R398Q)。为了将Pcj7启动子替换为hom启动子，获得了用于同源重组的hom启动子的上游区域。具体地，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:55，经由PCR获得hom启动子上游区域的片段。
SEQ ID NO:14(上F)
TCGAGCTCGGTACCCTGTCTCCGTATGCAGTGAGC
SEQ ID NO:55(上R)
GGATGTTTCTTTGGAGCTTCGCTCAATCAT
使用pECCG117-Pcj7-GFP质粒(韩国专利号10-0620092)作为模板连同引物SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:56，经由PCR获得Pcj7启动子的片段。
SEQ ID NO:13(cj7 F)
GAAGCTCCAAAGAAACATCCCAGCGCTACT
SEQ ID NO:56(cj7 R)
AGATGCTGAGGTCATGATTGTTCTCCTATAATCGC
为了应用hom突变(G378E、R398Q)，获得了第1至第378个氨基酸hom编码序列的上游区域、包括G378E/R398Q突变的序列和R398Q的下游序列。
具体地，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，经由PCR获得第1至378位氨基酸hom编码序列的片段。经由同样的方法，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:20，和包含hom G378E/R398Q突变的序列片段进行PCR。另外，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21进行PCR，并且获得了同源重组的homR398Q的下游序列片段。
SEQ ID NO:17(hom F)
TATAGGAGAACAATCATGACCTCAGCATCTGCCCC
SEQ ID NO:18(G378E R)
GCCAAAACCTCCACGCGATCTT
SEQ ID NO:15(G378E F)
AAGATCGCGTGGAGGTTTTGGC
SEQ ID NO:20(R398Q R)
GCGCTCTTCCTGTTGGATTGTACGC
SEQ ID NO:19(R398Q F)
GCGTACAATCCAACAGGAAGAGCGC
SEQ ID NO:21(hom R)
CTCTAGAGGATCCCCGACTGCGGAATGTTGTTGTG
用Gibson组装方法克隆经由以上程序获得的5个PCR片段和用Smal限制性内切酶消化的染色体转化的载体pDZ，从而获得重组质粒，其命名为pDZ-Pcj7_hom(G378E、R398Q)。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。
将制备的pDZ-Pcj7_hom(G378E,R398Q)载体通过电穿孔转化到Cgl-TH-1菌株中，然后进行二次杂交，以得到其中染色体上的野生型hom基因被突变体Pcj7_hom(G378E、R398Q)替换的菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:22(hom证实F)
TGGGTAGGTCGAGTTGTTAA
SEQ ID NO:23(hom证实R)
CAGCGCAGTCGCACGAATAT
将获得的转化的菌株命名为Cgl-TH-2。
2-3：用于丙酮酸羧化酶(Pyc)表达增强的突变的应用
为了通过草酰乙酸库增加来提高L-苏氨酸生产，增加对应于丙酮酸羧化酶的pyc基因的表达。为了增强pyc表达，将pyc基因的启动子替换为Pcj7启动子。使用pECCG117-Pcj7-GFP质粒(韩国专利号10-0620092)作为模板连同引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:16，经由PCR获得Pcj7启动子的片段。
SEQ ID NO:24(CJ7 F)
CAACCTTTGCAAGGTGAAAAAGAAACATCCCAGCGCTACT
SEQ ID NO:16(CJ7 R)
TGTGTGAGTCGACATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
得到pyc启动子的上游区域以进行用Pcj7启动子替换pyc启动子的同源重组。具体地，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，经由PCR获得pyc启动子的上游区域的片段。
SEQ ID NO:25(上游F)
TCGAGCTCGGTACCCTGACAGTTGCTGATCTGGCT
SEQ ID NO:26(上游R)
AGTAGCGCTGGGATGTTTCTTTTTCACCTTGCAAAGGTTG
为了获得pyc编码序列的N端，将其用作Pcj7启动子下游的同源区域，使用谷氨酸棒状杆菌13032的基因组DNA作为模板连同引物SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26进行PCR，并且获得pyc启动子下游的片段。
SEQ ID NO:27(pyc F)
GGAATAATTACTCTAATGTCGACTCACACATCTTC
SEQ ID NO:28(pyc R)
CTCTAGAGGATCCCCGGCATTTTCAGACAGGAAGC
使用Gibson组装方法克隆经由以上程序获得的三个PCR片段和用Smal限制性内切酶消化的染色体转化的载体pDZ，从而获得重组质粒，其命名为pDZ-Pcj7_pyc。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。
将构建的pDZ-Pcj7_pyc载体通过电穿孔转化到Cgl-TH-2菌株中，然后进行二次杂交，以获得其中染色体上的野生型pyc基因被突变体Pcj7_pyc基因替换的菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:29(pyc conf F)
ACGCACTCGGTGAAGGCGTG
SEQ ID NO:30(pyc conf R)
CGCTTCAGCTTCACGAGATG
将获得的转化的菌株命名为Cgl-TH-3。
2-4：具有突变体L-苏氨酸操纵子、Ncgl0179缺失和双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的一个拷贝的蛋白质(ThrA(S352P)BC)的插入
为了增强L-苏氨酸生物合成，将应用大肠杆菌衍生的L-苏氨酸操纵子。具体地，在具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶1的thrA基因中，应用了thrA(S352P)(JBacteriol.1993Feb；175(4):959–65)突变以消除对L-苏氨酸的反馈抑制。此外，通过使用SPL7启动子(韩国专利号10-1783170)将增加L-苏氨酸操纵子的表达。
为了在Ncgl0179位置插入SPL7_thrA(S352P)BC，通过使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板连同分别SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，将Ncgl0179上游和下游的同源区域的片段进行核苷酸序列扩增。此外，通过使用合成的SPL7启动子作为模板连同SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34扩增SPL7。
分别使用SEQ ID NO:35和36以及SEQ ID NO:39和40对thrA(S352P)的第352位氨基酸的上游和下游区域进行核苷酸序列扩增。
SEQ ID NO:31(Ncgl0179上F)
TCGAGCTCGGTACCCTTTTGAGTAATTGGTAATAC
SEQ ID NO:32(Ncgl0179上R)
TGAAGCGCCGGTACCCGCTTAAACGGGCGATTAT
SEQ ID NO:37(Ncgl0179下F)
ATGAATCATCAGTAATTAATGGCCCTCGATTTGGC
SEQ ID NO:38(Ncgl0179下R)
TCTAGAGGATCCCCTGGAATAATCAGACTCTGGA
SEQ ID NO:33(SPL7 F)
ATCGCCCGTTTAAGCGGGTACCGGCGCTTCATGT
SEQ ID NO:34(SPL7 R)
CTTCAACACTCGCATGATATCTGTTTTGATCTCCT
SEQ ID NO:35(S352P上F)
ATCAAAACAGATATCATGCGAGTGTTGAAGTTCGG
SEQ ID NO:36(S352P上R)
TACTGTATTCGGAAGATGGTTGCGTAATCAGCACCAC
SEQ ID NO:39(S352P下F)
GTGGTGCTGATTACGCAACCATCTTCCGAATACAGTA
SEQ ID NO:40(S352P下R)
AAATCGAGGGCCATTAATTACTGATGATTCATCATC
用Gibson组装方法克隆经由以上程序获得的5个PCR片段和用Smal限制性内切酶消化的染色体转化的载体pDZ，从而获得重组质粒，其命名为pDZ-SPL7_thrA(S352P)BC。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下保存1小时来进行克隆。
将制备的pDZ-SPL7_thrA(S352P)BC载体通过电穿孔转化到Cgl-TH-3菌株中，然后进行二次杂交，以获得其中染色体上插入SPL7_thrA(S352P)BC操纵子的菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQ ID NO:41和SEQID NO:42，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:41(thr conf F)
GATTCACATCACCAATGTC
SEQ ID NO:42(thr conf R)
GACACCATCGCAGCCCGAC
将获得的转化的菌株命名为Cgl-TH-4。
菌株Cgl-TH-4被命名为CJ09-5010。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，该菌株于2019年5月31日在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)进行国际保藏，并分配了登录号KCCM12537P。
2-5：通过引入突变体L-苏氨酸输出蛋白(RhtC)的棒状杆菌菌株的L-苏氨酸生产
将实施例1中构建的pDZ-PgapA_rhtC、pDZ-PgapA_rhtC(m1)、pDZ-PgapA_rhtC(m2)、pDZ-PgapA_rhtC(m3)和pDZ-PgapA_rhtC(m4)载体通过电穿孔转化到Cgl-TH-4菌株中，然后进行二次杂交，以获得其中在染色体上分别插入野生型rhtC和四种rhtC基因的菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQID NO:53和SEQ ID NO:54，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:53(HR外侧F)
AAGGAATATCCCGGAGAACC
SEQ ID NO:54(HR外侧R)
TTGCGTTTGAAAAGCCCTCG
获得的转化的菌株分别命名为Cgl-TH-5、Cgl-TH-5(m1)、Cgl-TH-5(m2)、Cgl-TH-5(m3)和Cgl-TH-5(m4)。
此外，为了研究在棒状杆菌菌株中引入突变体rhtC的效果，制备的Cgl-TH-5、Cgl-TH-5(m1)、Cgl-TH-5(m2)、Cgl-TH-5(m3)和Cgl-TH-5(m4)菌株经由以下方法培养以比较L-苏氨酸产量。将每种菌株接种在含有25mL接种培养基(葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺素1,000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg，pH 7.0(基于1L蒸馏水)的250mL角挡板烧瓶(corner-baffleflask)中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL接种培养物接种到含有25mL生产培养基(葡萄糖30g、(NH4)2SO4 15g、MgSO4 7H2O 1.2g、KH2PO41g、酵母提取物5g、生物素900μg、盐酸硫胺素4500μg、泛酸钙4500μg、CaCO3 30g和pH 7.0(基于1L蒸馏水))的50mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养24小时。培养完成后，经由HPLC测量L-苏氨酸产量，结果如表3所示。
表3
如表3所示，通过实施例2-4的方法制备的Cgl-TH-4的L-苏氨酸生产结果为11.1g/L，而其中插入了野生型PgapA_rhtC性状的Cgl-TH-5的生产了14.0g/L的L-苏氨酸。此外，其中插入突变体PgapA_rhtC(m)性状的Cgl-TH-5(m1)、Cgl-TH-5(m2)、Cgl-TH-5(m3)和Cgl-TH-5(m4)分别生产了17.9g/L、24.0g/L、21.8g/L和17.9g/L的L-苏氨酸。关于L-苏氨酸发酵产率，Cgl-TH-5比Cgl-TH-4增加4.1％p，而应用突变体的Cgl-TH-5(m1)、Cgl-TH-5(m2)、Cgl-TH-5(m3)和Cgl-TH-5(m4)菌株，与Cgl-TH-4相比，分别增加了9.7％p、18.4％p、15.3％p和9.7％p。特别地，Cgl-TH-5(m2)和Cgl-TH-5(m3)的产率增加比Cgl-TH-5大约4倍。应用于Cgl-TH-5(m2)的突变体RhtC具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列，具体地包括其中在第62位氨基酸位置处亮氨酸(Leu)被修饰为丝氨酸(Ser)的突变(L62S)。应用于Cgl-TH-5(m3)的突变体RhtC具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列，具体包括其中在第53位氨基酸位置处丙氨酸(Ala)被修饰为苏氨酸(Thr)的突变(A53T)。
两个菌株Cgl-TH-5(m2)和Cgl-TH-5(m3)分别被命名为CA09-5012和CA09-5036。根据布达佩斯条约的规定，这些菌株于2019年5月31日在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)进行国际保藏，并分别分配了登录号KCCM12538P和KCCM12539P。
实施例3：通过引入突变体L-苏氨酸输出蛋白的大肠杆菌菌株的L-苏氨酸生产
将准备的空载体pCL1920和pCL1920-Pn_rhtC以及实施例1中选择的4种突变体质粒转化到大肠杆菌菌株TF4076(KFCC10718，韩国专利申请号90-22965)中，以分别制备TF4076/pCL1920、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC(m1)、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC(m2)、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC(m3)和TF4076/pCL1920-Pn_rhtC(m4)。为了比较制备的菌株之间的L-苏氨酸产量，进行了烧瓶评估。至于烧瓶试验，将每个菌株在含有50μg/mL氯霉素的LB平板上划线培养，并在33℃的温育箱中培养16小时。此后，将单个菌落接种到2mL LB培养基中，然后在200rpm/33℃的温育箱中培养12小时。此外，将具有下表4所示组合物的25mL的苏氨酸生产烧瓶培养基置于250mL烧瓶中，将500μL经由先前培养获得的培养物加入其中。此后，将烧瓶在200rpm/33℃的温育箱中温育48小时，然后通过HPLC比较从各菌株中获得的苏氨酸的量，结果如下表5所示。
表4
| 组合物 | 含量(每升) |
| 葡萄糖 | 70g |
| 硫酸铵 | 25g |
| KH2PO4 | 1g |
| MgSO4·7H2O | 0.5g |
| FeSO4·7H2O | 5mg |
| MnSO4·8H2O | 5mg |
| ZnSO4 | 5mg |
| 碳酸钙 | 30g |
| 酵母提取物 | 2g |
| 甲硫氨酸 | 0.15g |
| pH | 6.8 |
表5
如表5所示，将突变体rhtC质粒引入具有L-苏氨酸生产能力的大肠杆菌菌株中导致L-苏氨酸产率的大幅增加。具体地，应用pCL1920-Pn_rhtC(m2)和pCL1920-Pn_rhtC(m3)显示出L-苏氨酸产率的大幅增加。
实施例4：L-苏氨酸输出蛋白的第62位氨基酸亮氨酸的饱和诱变
由于如表3和表5中所描述的，突变体rhtC(L62S)与野生型相比显示出高的产率增加效果，因此通过将RhtC中第62位氨基酸亮氨酸突变为另一种氨基酸来验证第62位位置的L-苏氨酸输出的提高有效性。为了将亮氨酸突变为亮氨酸以外的19种氨基酸，使用实施例1中制备的pDZ-PgapA-rhtC作为模板，经由以下方法进行定点诱变。
表6
| 组合物 | 含量(μL) |
| 10X pfu-X缓冲液 | 5 |
| 10mM dNTP混合物 | 1 |
| pfu-X聚合酶 | 1 |
| 诱变正向引物(5pmol) | 2 |
| 诱变反向引物(5pmol) | 2 |
| pDZ-PgapA_rhtC(模版DNA，200ng/μL) | 1 |
| dH2O | 38 |
| 总计 | 50 |
表7
将RhtC中第62位氨基酸亮氨酸(L)取代为另一种氨基酸，制备如表6中所示的组合物，根据表7的条件进行PCR。在PCR中，使用了表8中每个诱变引物组。PCR完成后，加入1μLDpnl限制性内切酶，然后37℃温育1小时。将3μL经Dpnl处理的DNA转化到DH5a感受态细胞中获得突变体pDZ-PgapA_rhtC质粒，通过测序证实表8中所示的每个突变。
表8
/>
/>
将表8中所示的构建的pDZ-PgapA_rhtC L62R、pDZ-PgapA_rhtC L62A、pDZ-PgapA_rhtC L62D、pDZ-PgapA_rhtC L62K、pDZ-PgapA_rhtC L62P、pDZ-PgapA_rhtC L62C、pDZ-PgapA_rhtC L62G、pDZ-PgapA_rhtC L62T、pDZ-PgapA_rhtC L62I、pDZ-PgapA_rhtC L62Y、pDZ-PgapA_rhtC L62V、pDZ-PgapA_rhtC L62H、pDZ-PgapA_rhtC L62F、pDZ-PgapA_rhtCL62M、pDZ-PgapA_rhtC L62Q、pDZ-PgapA_rhtC L62N、pDZ-PgapA_rhtC L62E和pDZ-PgapA_rhtC L62W载体通过电穿孔以实施例2-5中的方法转化到Cgl-TH-4菌株中，然后进行二次杂交，以分别获得其中染色体上插入了突变体rhtC基因的19种菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:53(HR外侧F)
AAGGAATATCCCGGAGAACC
SEQ ID NO:54(HR外侧R)
TTGCGTTTGAAAAGCCCTCG
获得的转化的菌株分别命名为Cgl-TH-5(L62R)、Cgl-TH-5(L62A)、Cgl-TH-5(L62D)、Cgl-TH-5(L62K)、Cgl-TH-5(L62P)、Cgl-TH-5(L62C)、Cgl-TH-5(L62G)、Cgl-TH-5(L62T)、Cgl-TH-5(L62I)、Cgl-TH-5(L62Y)、Cgl-TH-5(L62V)、Cgl-TH-5(L62H)、Cgl-TH-5(L62F)、Cgl-TH-5(L62M)、Cgl-TH-5(L62Q)、Cgl-TH-5(L62N)、Cgl-TH-5(L62E)和Cgl-TH-5(L62W)。
通过上述方法制备的18种菌株和先前制备的Cgl-TH-4、Cgl-TH-5和Cgl-TH-5(m2)菌株使用实施例2-5中的L-苏氨酸生产烧瓶培养基和培养方法进行培养。培养完成后，经由HPLC测量L-苏氨酸产量，结果如表9所示。
表9
如表9中所示，应用RhtC蛋白质中第62位氨基酸突变的所有19种突变体均表现出相对于插入野生型rhtC的Cgl-TH-5发酵产率提高了3.4-16.9％p。
实施例5：通过人工突变筛选的AHV抗性菌株
对作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881(韩国专利号0159812)赋予2-氨基-3-羟基-戊酸酯(AHV)(L-苏氨酸类似物)的抗性。
使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)通过人工突变引入突变。将在实施例2-5的接种培养基中培养18小时的KFCC10881菌株再次接种到4mL的接种培养基中，然后培养直至OD660达到大约1.0。离心培养物以回收细胞，然后将细胞用50mM Tris-苹果酸盐缓冲液(pH 6.5)洗涤两次并悬浮在最终4mL的相同缓冲液中。将NTG溶液(0.05M Tris-苹果酸盐缓冲液(pH6.5)中的2mg/mL)加入细胞悬液中，使其终浓度为150mg/L，然后在室温下静置20分钟。此后，通过离心回收细胞并用相同的缓冲液洗涤两次以去除NTG。最终洗涤的细胞悬浮在4mL20％甘油溶液中，然后在使用前储存在-70℃。将经NTG处理的菌株平板接种在含3g/LAHV的基本培养基上，通过上述程序获得155株具有AHV抗性的突变体KFCC10881菌株。
实施例6：从AHV抗性KFCC10881菌株中选择L-苏氨酸生产菌株
对实施例5中获得的155株AHV抗性菌株进行L-苏氨酸生产能力试验。将155株中的每株接种于含有25mL实施例2-5中的接种培养基的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养20小时。将1mL接种培养物接种到含有24mL L-苏氨酸生产培养基(葡萄糖30g、KH2PO4 2g、尿素3g、(NH4)2SO4 40g、蛋白胨2.5g、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO4 7H2O0.5g、亮氨酸400mg、CaCO3 20g，pH 7.2(基于1L蒸馏水))的250mL角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养48小时。
培养完成后，使用HPLC测量生产的几种氨基酸的量。实验的155株菌株中表现出具有优异L-苏氨酸生产能力的前22株菌株的培养物中的氨基酸浓度在表10中示出。通过上述程序确认的22株候选菌株被命名为KFCC10881-1至KFCC10881-22。
表10
/>
如表10所示，具有AHV抗性的22种菌株显示出L-苏氨酸生产结果，这在对照组(KFCC10881)中未观察到。在AHV抗性菌株中，KFCC10881-10被选为最佳的L-苏氨酸生产菌株。
实施例7：由引入突变体L-苏氨酸输出蛋白的KFCC10881-10菌株的L-苏氨酸生产
将实施例1中构建的pDZ-PgapA_rhtC、pDZ-PgapA_rhtC(m2)和pDZ-PgapA_rhtC(m3)载体和将实施例4中如表8所示构建的pDZ-PgapA_rhtC L62R、pDZ-PgapA_rhtC L62A、pDZ-PgapA_rhtC L62D、pDZ-PgapA_rhtC L62K、pDZ-PgapA_rhtC L62P、pDZ-PgapA_rhtCL62C、pDZ-PgapA_rhtC L62G、pDZ-PgapA_rhtC L62T、pDZ-PgapA_rhtC L62I、pDZ-PgapA_rhtC L62Y、pDZ-PgapA_rhtC L62V、pDZ-PgapA_rhtC L62H、pDZ-PgapA_rhtC L62F、pDZ-PgapA_rhtC L62M、pDZ-PgapA_rhtC L62Q、pDZ-PgapA_rhtC L62N、pDZ-PgapA_rhtC L62E、pDZ-PgapA_rhtC L62W载体通过电穿孔转化到KFCC10881-10菌株中，然后进行二次杂交，以获得其中分别在染色体上插入突变体rhtC基因的22种菌株。使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
SEQ ID NO:53(HR外侧F)
AAGGAATATCCCGGAGAACC
SEQ ID NO:54(HR外侧R)
TTGCGTTTGAAAAGCCCTCG
所获得的转化的菌株分别命名为KFCC10881-10(rhtC WT)、KFCC10881-10(rhtCL62S)、KFCC10881-10(rhtC A53T)、KFCC10881-10(rhtC L62R)、KFCC10881-10(rhtCL62A)、KFCC10881-10(rhtC L62D)、KFCC10881-10(rhtC L62K)、KFCC10881-10(rhtCL62P)、KFCC10881-10(rhtC L62C)、KFCC10881-10(rhtC L62G)、KFCC10881-10(rhtCL62T)、KFCC10881-10(rhtC L62I)、KFCC10881-10(rhtC L62Y)、KFCC10881-10(rhtCL62V)、KFCC10881-10(rhtC L62H)、KFCC10881-10(rhtC L62F)、KFCC10881-10(rhtCL62M)、KFCC10881-10(rhtC L62Q)、KFCC10881-10(rhtC L62N)、KFCC10881-10(rhtC L62E)和KFCC10881-10(rhtC L62W)。
使用能够分别扩增插入相应基因的同源重组的上游和下游区域的外侧位点的引物SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，通过基因组测序和PCR证实了相应的基因操作。
使用实施例6中的L-苏氨酸生产培养基和培养方法培养通过上述方法制备的22种菌株。培养完成后，经由HPLC测量L-苏氨酸产量，结果如表11中所示。
表11
如表11所示，与野生型RhtC相比，在将突变体RhtC引入KFCC10881-10中，可以观察到高水平的产率增加，如实施例3和4中所示的结果。
实施例8：通过引入突变体L-苏氨酸输出蛋白的TF4076菌株的L-苏氨酸生产
将本公开内容的突变引入具有与大肠杆菌W3110衍生的rhtC蛋白质(SEQ ID NO:1)高度同源性的其他菌株衍生的rhtC，以研究L-苏氨酸的生产结果。
具体地，分别通过进行PCR从大肠杆菌W3110、福氏志贺氏菌和弗格森埃希菌的基因组DNA中获得核苷酸序列片段(eco rhtC、sfe rhtC、efe rhtC)，并且根据实施例1的方法制备其中引入了L62S突变的每个突变体rhtC。将制备的每个菌株的突变体rhtC或野生型rhtC克隆到pCL1920中以获得重组质粒pCL1920-Pn_rhtC.eco、pCL1920-Pn_rhtC.ecoL62S、pCL1920-Pn_rhtC.sfe、pCL1920-Pn_rhtC.sfe L62S、pCL1920-Pn_rhtC.efe和pCL1920-Pn_rhtC.efe L62S。
将如上构建的重组质粒转化到具有L-苏氨酸生产能力的大肠杆菌菌株TF4076中，从而制备TF4076/pCL1920、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.eco、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.ecoL62S、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.sfe、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.sfe L62S、TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.efe和TF4076/pCL1920-Pn_rhtC.efe L62S菌株。为了比较制备的菌株之间的L-苏氨酸产量，进行了烧瓶评估，结果如表12所示。
表12
当将通过将L62S突变引入衍生自大肠杆菌W3110、福氏志贺氏菌和弗格森埃希菌的RhtC中获得的突变体RhtC引入TF4076时，与野生型RhtC相比，具有更高水平的产率增加，如实施例3、4和7中所示的结果。
因此可以看出，即使参考序列发生变化，在对应于本公开内容的第53或第62位的位置处被另一种氨基酸取代可以提高L-苏氨酸输出能力。
根据以上描述，本公开内容所属领域的技术人员将能够理解，在不脱离其技术精神或本质特征的情况下，本公开内容可以以其他具体形式来体现。因此，上述实施方式应被解释为示例性的而非限制本公开内容。本公开内容的范围应当被理解为包括从权利要求及其等同物的定义和范围衍生的所有变化或修改。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
原始保藏接收证明
由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出
至：CJ第一制糖株式会社
大韩民国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心邮政编号100-400
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
2019年9月9日
专利代理人Son Min印
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2019年9月9日
专利代理人Son Min印。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> L-苏氨酸输出蛋白变体和使用其生产L-苏氨酸的方法
<130> OPA20085-PCT
<150> KR 10/2019/0111509
<151> 2019-09-09
<160> 116
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> rhtC 野生型
<400> 1
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 2
<211> 621
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> rhtC 野生型
<400> 2
atgttgatgt tatttctcac cgtcgccatg gtgcacattg tggcgcttat gagccccggt 60
cccgatttct tttttgtctc tcagaccgct gtcagtcgtt cccgtaaaga agcgatgatg 120
ggcgtgctgg gcattacctg cggcgtaatg gtttgggctg ggattgcgct gcttggcctg 180
catttgatta tcgaaaaaat ggcctggctg catacgctga ttatggtggg cggtggcctg 240
tatctctgct ggatgggtta ccagatgcta cgtggtgcac tgaaaaaaga ggcggtttct 300
gcacctgcgc cacaggtcga gctggcgaaa agtgggcgca gtttcctgaa aggtttactg 360
accaatctcg ctaatccgaa agcgattatc tactttggct cggtgttctc attgtttgtc 420
ggtgataacg ttggcactac cgcgcgctgg ggcatttttg cgctgatcat tgtcgaaacg 480
ctggcgtggt ttaccgtcgt tgccagcctg tttgccctgc cgcaaatgcg ccgtggttat 540
caacgtctgg cgaagtggat tgatggtttt gccggggcgt tatttgccgg atttggcatt 600
catttgatta tttcgcggtg a 621
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 启动子 上 1
<400> 3
tcgagctcgg tacccgacag gacaagcact ggttg 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 启动子 上 2
<400> 4
agtagcgctg ggatgtttct ctttgtgcac ctttc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7 1
<400> 5
gaaaggtgca caaagagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7 2
<400> 6
tacgaccagg gccatgagtg tttcctttcg ttggg 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 1
<400> 7
cgaaaggaaa cactcatggc cctggtcgta cagaa 35
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 2
<400> 8
ggtggaaatc ttttcgatgt tcacgttgac 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 下 1
<400> 9
gaacatcgaa aagatttcca cctctgagat 30
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC 下 2
<400> 10
ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatta 35
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 证实 lysC 1
<400> 11
acattccacc cattactgca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 证实 lysC 2
<400> 12
tcttcatcgg tttcgaaggt 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cj7 F
<400> 13
gaagctccaa agaaacatcc cagcgctact 30
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上 F
<400> 14
tcgagctcgg taccctgtct ccgtatgcag tgagc 35
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G378E F
<400> 15
aagatcgcgt ggaggttttg gc 22
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7 R
<400> 16
tgtgtgagtc gacatgagtg tttcctttcg ttggg 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom F
<400> 17
tataggagaa caatcatgac ctcagcatct gcccc 35
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G378E R
<400> 18
gccaaaacct ccacgcgatc tt 22
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R398Q F
<400> 19
gcgtacaatc caacaggaag agcgc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R398Q F
<400> 20
gcgctcttcc tgttggattg tacgc 25
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom R
<400> 21
ctctagagga tccccgactg cggaatgttg ttgtg 35
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom conf F
<400> 22
tgggtaggtc gagttgttaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hom conf R
<400> 23
cagcgcagtc gcacgaatat 20
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7 F
<400> 24
caacctttgc aaggtgaaaa agaaacatcc cagcgctact 40
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游 F
<400> 25
tcgagctcgg taccctgaca gttgctgatc tggct 35
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游 R
<400> 26
agtagcgctg ggatgtttct ttttcacctt gcaaaggttg 40
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pyc F
<400> 27
ggaataatta ctctaatgtc gactcacaca tcttc 35
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pyc R
<400> 28
ctctagagga tccccggcat tttcagacag gaagc 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pyc conf F
<400> 29
acgcactcgg tgaaggcgtg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pyc conf R
<400> 30
cgcttcagct tcacgagatg 20
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl0179 上 F
<400> 31
tcgagctcgg tacccttttg agtaattggt aatac 35
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl0179 上 R
<400> 32
tgaagcgccg gtacccgctt aaacgggcga ttat 34
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL7 F
<400> 33
atcgcccgtt taagcgggta ccggcgcttc atgt 34
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL7 R
<400> 34
cttcaacact cgcatgatat ctgttttgat ctcct 35
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S352P 上 F
<400> 35
atcaaaacag atatcatgcg agtgttgaag ttcgg 35
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S352P 上 R
<400> 36
tactgtattc ggaagatggt tgcgtaatca gcaccac 37
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl0179 下 F
<400> 37
atgaatcatc agtaattaat ggccctcgat ttggc 35
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl0179 下 R
<400> 38
tctagaggat cccctggaat aatcagactc tgga 34
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S352P 下 F
<400> 39
gtggtgctga ttacgcaacc atcttccgaa tacagta 37
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S352P 下 R
<400> 40
aaatcgaggg ccattaatta ctgatgattc atcatc 36
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> thr conf F
<400> 41
gattcacatc accaatgtc 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> thr conf R
<400> 42
gacaccatcg cagcccgac 19
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC F
<400> 43
gtcgactcta gaggatcccc gctgattcgt gcgcatgttg 40
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC R
<400> 44
tgaattcgag ctcggtaccc tcaccgcgaa ataatcaaat 40
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2533 上 F
<400> 45
tcgagctcgg taccccagca agatctagtc atcaa 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2533 上 R
<400> 46
gtcgttttta ggcttccgct ggaaaacatt ttgca 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PgapA F
<400> 47
aatgttttcc agcggaagcc taaaaacgac cgagc 35
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PgapA R
<400> 48
aaataacatc aacatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC_m F
<400> 49
tagaggagac acaacatgtt gatgttattt ctcac 35
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC_m R
<400> 50
taagcaggtt gattttcacc gcgaaataat caaat 35
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2533 dn F
<400> 51
attatttcgc ggtgaaaatc aacctgctta ggcgt 35
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2533 dn R
<400> 52
ctctagagga tcccctatag ctaccatctg ggtgg 35
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HR 外侧 F
<400> 53
aaggaatatc ccggagaacc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HR 外侧 R
<400> 54
ttgcgtttga aaagccctcg 20
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上 R
<400> 55
ggatgtttct ttggagcttc gctcaatcat 30
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cj7 R
<400> 56
agatgctgag gtcatgattg ttctcctata atcgc 35
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62R F
<400> 57
gcgctgcttg gcctgcatcg tattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62R R
<400> 58
ggccattttt tcgataatac gatgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62A F
<400> 59
gcgctgcttg gcctgcatgc gattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 60
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62A R
<400> 60
ggccattttt tcgataatcg catgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62D F
<400> 61
gcgctgcttg gcctgcatga cattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62D R
<400> 62
ggccattttt tcgataatgt catgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62K F
<400> 63
gcgctgcttg gcctgcataa aattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62K R
<400> 64
ggccattttt tcgataattt tatgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 65
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62P F
<400> 65
gcgctgcttg gcctgcatcc gattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62P R
<400> 66
ggccattttt tcgataatcg gatgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62C F
<400> 67
gcgctgcttg gcctgcattg cattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 68
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62C R
<400> 68
ggccattttt tcgataatgc aatgcaggcc aagcagcgc 39
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62G F
<400> 69
gcgctgcttg gcctgcatgg cattatcgaa aaaatggcc 39
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDZ-PgapA_rhtC L62G R
<400> 70
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<210> 71
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<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62I
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<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62Y
<400> 104
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<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62V
<400> 105
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Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 106
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62H
<400> 106
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His His Ile Ile
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
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<211> 206
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<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
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<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62M
<400> 108
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
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Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62Q
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100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 110
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62N
<400> 110
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1 5 10 15
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Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
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130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
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Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 111
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62E
<400> 111
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Glu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 112
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rhtC L62W
<400> 112
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Trp Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 113
<211> 206
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 福氏志贺氏菌 rhtC(sfe rhtC)
<400> 113
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Glu Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 114
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sfe rhtC L62S
<400> 114
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Ser Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Glu Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 115
<211> 206
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 弗格森埃希菌 rhtC(efe rhtC)
<400> 115
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Glu Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Cys Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
<210> 116
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> efe rhtC L62S
<400> 116
Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly
35 40 45
Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Ser Ile Ile
50 55 60
Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys
85 90 95
Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly
100 105 110
Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala
115 120 125
Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val
130 135 140
Gly Thr Thr Glu Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met
165 170 175
Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Cys Ala Gly
180 185 190
Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg
195 200 205
Claims (9)
1.一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的L-苏氨酸输出蛋白质变体，其中在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第53位的位置处的氨基酸用苏氨酸取代，或在对应于SEQID NO:1的氨基酸序列中的第62位的位置处的氨基酸用另一种天然氨基酸取代，并且具有L-苏氨酸输出活性。
2.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其中所述另一种天然氨基酸选自丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或色氨酸。
3.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体包含选自SEQ ID NO:93至112中任一项的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质变体。
5.一种载体，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种生产L-苏氨酸的微生物，所述微生物包含L-苏氨酸输出蛋白变体、编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体的任何一种或多种，其中所述L-苏氨酸输出蛋白变体由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽组成，其中在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第53位的位置处的氨基酸用苏氨酸取代，或在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第62位的位置处的氨基酸用另一种天然氨基酸取代。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述微生物是棒状杆菌属某种或埃希氏菌属某种的微生物。
8.一种生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物，所述微生物包含L-苏氨酸输出蛋白变体、编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体的任何一种或多种，其中所述L-苏氨酸输出蛋白变体由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽组成，其中在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第53位的位置处的氨基酸用苏氨酸取代，或在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第62位的位置处的氨基酸用另一种天然氨基酸取代。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括从培养的培养基或微生物中回收L-苏氨酸。
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