CN109852572B - 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L‑苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明通过敲除菌株的PTS系统，使菌株不用过表达其他糖转运基因就能快速摄取葡萄糖，提高葡萄糖的利用率。应用本发明的方法构建的突变菌WMZ016/pFW01‑thrA*BC‑rhtC发酵24h葡萄糖即可利用完全，发酵12h的苏氨酸产量可达4.40g/L；发酵24h苏氨酸产量可达7.48g/L；发酵36h苏氨酸产量可达7.14g/L，比出发菌株提高了7～12.35倍，具有很大的应用潜力。

Description

一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L-苏氨酸产量的方法

技术领域

本发明涉及一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L-苏氨酸产量的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

背景技术

L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。

L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。

在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。

目前大部分产苏氨酸的改造菌都是通过诱变筛选和基因工程代谢改造而来的，通过诱变得到高产菌的工作量巨大，太过盲目；现有通过目的明确的基因工程改造苏氨酸生产菌大部分都是过表达苏氨酸合成关键基因thrA、thrB、thrC、rhtA、rhtB、rhtC；敲除lysA和metAJ基因以及过表达aspC、ppc增加苏氨酸合成前体；敲除tdh、ilvA基因降低苏氨酸分解代谢。这些经典策略是建立在对具有相关代谢途径的菌株进行的改造。

发明内容

本发明旨在通过基因工程改造，实现野生大肠杆菌苏氨酸产量从无到有的积累。

本发明以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌株，构建了PTS缺陷、乙醛酸循环加强、TCA循环加强的宿主菌株，并转入了表达载体pFW01-thrA*BC-rhtC，通过代谢改造，把一株不产苏氨酸的野生大肠杆菌，改造成PTS系统缺陷但能快速利用葡萄糖，并能提高苏氨酸产量的基因工程菌。

本发明的第一个目的是提供一株产L-苏氨酸基因工程菌，所述工程菌是以野生型大肠杆菌为基础，共表达了thrA*BC和rhtC基因，敲除了iclR基因，敲除了crr、ptsG、ptsH、ptsI中的任一基因、并用强启动子trc替换了gltA基因原始启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是以野生型大肠杆菌为基础，共表达了thrA*BC和rhtC基因，敲除了iclR和crr基因、并用强启动子trc替换了gltA基因原始启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌是以野生型大肠杆菌E.coli MG1655为基础。

在本发明的一种实施方式中，所述thrA*BC的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述rhtC基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建所述的重组菌的方法：运用CRISPR基因编辑技术，敲除了大肠杆菌基因组上的crr、iclR基因，以及用强启动子trc替换掉gltA基因原始启动子，再转入连接有thrA*BC和rhtC基因的质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述thrA*BC的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述rhtC基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述连接有thrA*BC和rhtC基因的质粒是质粒pFW01-thrA*BC-rhtC。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒pFW01-thrA*BC-rhtC公开于2018年的论文《Increasing L-threonine production in Escherichia coli by engineering theglyoxylate shunt and the L-threonine biosynthesis pathway》中。

本发明的第三个目的是提供一种产L-苏氨酸的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，于35～37℃发酵12～36h。

本发明还要求保护所述重组菌在制备含L-苏氨酸的产品中的应用。

本发明的有益效果：

(1)该菌是以野生大肠改造过来的，遗传背景清晰，而且最终的苏氨酸产量也比较高。

(2)该菌株的葡萄糖运输方式不以PTS系统为主，而且该PTS葡萄糖转运缺失的菌株不用另外过表达其他糖转运基因就能快速摄取葡萄糖，这是之前研究PTS系统尚未被发现的，且能大幅度提高苏氨酸的产量，突变菌WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC发酵24h葡萄糖即可利用完全，发酵12h的苏氨酸产量可达4.40g/L；发酵24h苏氨酸产量可达7.48g/L；发酵36h苏氨酸产量可达7.14g/L，比出发菌株提高了7～12.35倍，具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为携带合成苏氨酸关键基因的质粒pFW01-thrA*BC-rhtC的质粒图谱。

图2为苏氨酸工程菌WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC与对照菌的摇瓶发酵生长图。

图3为苏氨酸工程菌WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC与对照菌的摇瓶发酵苏氨酸产量图。

具体实施方式

LB培养基：酵母粉5g L^–1，蛋白胨10g L^–1，NaCI 10g L^–1，LB固体培养基添加15g L^–1琼脂粉。

摇瓶发酵培养基：30g L^–1葡萄糖，25g L^–1(NH₄)₂SO₄,2g L^–1酵母粉，2g L^–1柠檬酸，7.46g L^–1KH₂PO₄,2g L^–1MgSO₄·7H₂O,5g L^–1FeSO₄·7H₂O,5g L^–1MnSO₄·4H₂O,20g L^–1CaCO₃,pH 6.8。灭菌条件为115℃，15min。

所有用到的引物如下：

crr U(+)：TGCTGAAGGCAAATGGAC

crr U(-)：ATAACAACCGGAGTCAGGGTTCTTGTCGTCGGAAACC

crr D(+)：GGTTTCCGACGACAAGAACCCTGACTCCGGTTGTTAT

crr D(-)：GGGACTGGCGACCTGTTT

crr-sgRNA-F：ACCGTTGAACTGAAAGGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

sgRNA-R：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC

crr-sgRNA-Y：ACCGTTGAACTGAAAGGCGA

ptsH U(+)：CATCATCGGGTGAGCGTTAT

ptsH U(-)：CGAGTTCCGCCATCAGTTTCGTTCGGAGCGGTAATGGT

ptsH D(+)：ACCATTACCGCTCCGAACGAAACTGATGGCGGAACTCG

ptsH D(-)：TACGGCATCCAGAATCAGATAGTC

ptsH-sgRNA-F：AGGCGAAGACGAGCAGAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

ptsH-sgRNA-Y：AGGCGAAGACGAGCAGAAAG

ptsG U(+)：TGCTGAAGGCAAATGGAC

ptsG U(-)：ATAACAACCGGAGTCAGGGTTCTTGTCGTCGGAAACC

ptsG D(+)：GGTCGGTAAATCGCTGATGAGCGGGCGTAGTGGTT

ptsG D(-)：TAAAGCGGTGGATGGGAC

ptsG-sgRNA-F：CATAACATGCGATACAACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

ptsG-sgRNA-Y：CATAACATGCGATACAACGG

ptsI U(+)：AAGTTACCATTACCGCTCC

ptsI U(-)：CATCCCCAGCAACAGAAGTCACGACCGCTCAGAAAA

ptsI D(+)：TTTTCTGAGCGGTCGTGACTTCTGTTGCTGGGGATG

ptsI D(-)：CCAATGGTGCCGTCTACT

ptsI-sgRNA-F：GCTGGGTTTCATCACCGACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

ptsI-sgRNA-Y：GCTGGGTTTCATCACCGACG

iclR U(+)：CTTGTTGCTAAAGATATGACG

iclR U(-)：CAAACCATACTGGCATAAACGCAGAGGCAATATTCTGCCCATC

iclR D(+)：GATGGGCAGAATATTGCCTCTGCGTTTATGCCAGTATGGTTTG

iclR D(-)：GATCAGATCCGCGCCACCTTC

iclR-sgRNA-F：ACGATGAGGAACATGCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

iclR-sgRNA-Y：ACGATGAGGAACATGCACTG

gltA U(+)：AGCGTCCTTTCTATAACTGC

gltA U(-)：GCCGGATGATTAATTGTCAAGTCTACCACTAATAACTGTCCC

gltA D(+)：TTTCACACAGGAAACAGACCATAAGGCGCTAAGGAGACC

gltA D(-)：AAAGCATGGAACAGACGG

gltA-sgRNA-F：AGGGTGTTCCGGAGACCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

gltA-sgRNA-Y：AGGGTGTTCCGGAGACCTGG

Trc-F：TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC

Trc-R：GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAA。

实施例1：苏氨酸生产菌株的构建

在MG1655中crr、iclR基因的敲除，以及用trc启动子替换gltA原始启动子，其构建方法，主要步骤为：

(1)制作MG1655的电转感受态，转入CRISPR敲除系统里的pCas质粒。

(2)以E.coli MG1655基因组为模板，分别以crr U(+)/U(-)及crr D(+)/D(-)为引物扩增337bp和314bp的crr基因上下游片段crr-U及crr-D，再通过重叠PCR技术，把上下游同源臂重叠成一个片段crr-UD；以pTargetF质粒为模板，crr-sgRNA-F/sgRNA-R为引物扩增crr-sgRNA基因片段。crr-sgRNA基因片段通过DpnI酶消化，再用T4PNK磷酸化，最后用T4连接酶连接，化转入JM109，用引物crr-sgRNA-Y/sgRNA-R进行验证，筛选正确转化子，提质粒，得到敲除质粒PTFB-crr。

(3)把构建好的敲除载体PTFB-crr 100ng和敲除片段crr-UD 500ng电转入感受态菌体MG1655/pCas中，涂含50mg/L的卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB平板，用引物crr U(+)/D(-)进行PCR验证，得到正确敲除基因crr的突变菌，突变菌在含0.5mM的IPTG的LB液体培养基中生长24h，诱导去除PTFB-crr质粒，在含50mg/L的卡那霉素的LB平板上划单菌落，单菌落即为MG1655△crr/pCas，单菌落继续接到LB试管中42℃培养24小时，去除pCas质粒，在LB平板上划单菌落得到突变菌MG1655△crr，被命名为WMZ004。

(4)按照构建敲除crr基因突变株中的方法和步骤，在野生型大肠杆菌MG1655中分别敲除ptsG、ptsH和ptsI基因，分别命名为WMZ002、WMZ003和WMZ005并电转入质粒pFW01-thrA*BC-rhtC，构建得到突变菌WMZ002/pFW01-thrA*BC-rhtC、WMZ003/pFW01-thrA*BC-rhtC和WMZ005/pFW01-thrA*BC-rhtC。

实施例2：构建敲除gltA并替换trc启动子的突变菌

按照实施例1构建敲除crr基因突变株中的方法和步骤，以菌MG1655△crr/pCas做电转感受态，进一步构建敲除载体PTFB-iclR、敲除片段iclR-UD，在MG1655△crr/pCas中敲除iclR基因。以菌MG1655△crr△iclR/pCas做电转感受态，构建敲除载体PTFB-gltA，以E.coliMG1655基因组为模板，分别以gltA U(+)/U(-)及gltA D(+)/D(-)为引物扩增gltA基因上下游片段gltA-U及gltA-D，用引物Trc-F/Trc-R进行变性及退火获得trc启动子片段，把这三个片段用引物gltA U(+)/D(-)进行重叠PCR，获得敲除片段gltA-UD，用在MG1655△crr△iclR/pCas中强启动子trc替换掉gltA原始启动子，最后去除pCas质粒，得到突变菌MG1655△crr△iclR,PgltA::Ptrc，命名为WMZ016。

将质粒pFW01-thrA*BC-rhtC转化到大肠杆菌细胞中，使重组菌能专一产苏氨酸，主要步骤为：

(1)电转入质粒pFW01-thrA*BC-rhtC到突变菌MG1655△crr△iclR,PgltA::Ptrc中，得到苏氨酸工程菌MG1655△crr△iclR,PgltA::Ptrc/pFW01-thrA*BC-rhtC，命名为WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC。

(2)电转质粒pFW01-thrA*BC-rhtC到野生大肠杆菌MG1655中，得到野生型苏氨酸生产菌MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC，作为发酵对照菌株。

实施例3：摇瓶水平发酵生产苏氨酸

将甘油管的WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC菌液接种到LBT(LB培养基含三氯生抗生素)的固体平板上，过夜培养。将平板上的菌落接种到5ml的LBT(LB培养基含三氯生抗生素)液体培养基含三氯生的试管，200转37℃培养4小时作为一级种子液；测一级种子液OD₆₀₀，接到250ml三角瓶含30ml LBT液体培养基中，接初始OD₆₀₀为0.3，200转37℃培养4小时作为二级种子液；测二级种子液OD₆₀₀，接到500ml带挡板的三角瓶含30ml的发酵培养基中，接初始OD₆₀₀为0.3，每个菌接三个平行，200转37℃培养。分别在培养12、24、36h后取发酵样，测OD₆₀₀、残糖和制测发酵液苏氨酸样；用HPLC测每个样三个时间点的苏氨酸含量。结果显示(表1～2)，突变菌WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC发酵24h葡萄糖即可利用完全，发酵12h的苏氨酸产量可达4.40g/L；发酵24h苏氨酸产量可达7.48g/L；发酵36h苏氨酸产量可达7.14g/L，比出发菌株提高了7～12.35倍。

表1 WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC L-苏氨酸产量

表2 WMZ016/pFW01-thrA*BC-rhtC葡萄糖消耗速度(葡萄糖剩余量)

对比例1：

分别按照构建敲除crr基因突变株的方法构建了ptsG、ptsH和ptsI单敲的突变菌株，转入质粒/pFW01-thrA*BC-rhtC，并按照实施例2相同的方式进行发酵，发酵结果如下表。通过比对，发现敲除PTS系统中的crr基因用来构建苏氨酸生产菌的L-苏氨酸产量比其他突变菌提高了5～50倍，发酵24h葡萄糖即可消耗完全，具有比较大的优势的。

表3不同PTS基因单敲菌株的L-苏氨酸的产量

表4不同PTS基因单敲菌株的葡萄糖消耗速度(葡萄糖剩余量)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种敲除大肠杆菌PTS系统提高L-苏氨酸产量的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60

gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120

gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180

ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240

gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300

ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360

gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420

cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480

ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540

gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600

gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660

gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720

cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780

ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840

ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900

gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960

tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020

cgcgcccgta ttttcgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080

tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140

gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200

gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260

gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320

gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380

aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440

ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500

tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560

tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620

gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680

gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740

gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800

cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860

aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920

tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980

cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040

cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100

attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160

aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220

aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280

gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340

tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400

gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460

tgacatggtt aaagtttatg ccccggcttc cagtgccaat atgagcgtcg ggtttgatgt 2520

gctcggggcg gcggtgacac ctgttgatgg tgcattgctc ggagatgtag tcacggttga 2580

ggcggcagag acattcagtc tcaacaacct cggacgcttt gccgataagc tgccgtcaga 2640

accacgggaa aatatcgttt atcagtgctg ggagcgtttt tgccaggaac tgggtaagca 2700

aattccagtg gcgatgaccc tggaaaagaa tatgccgatc ggttcgggct taggctccag 2760

tgcctgttcg gtggtcgcgg cgctgatggc gatgaatgaa cactgcggca agccgcttaa 2820

tgacactcgt ttgctggctt tgatgggcga gctggaaggc cgtatctccg gcagcattca 2880

ttacgacaac gtggcaccgt gttttctcgg tggtatgcag ttgatgatcg aagaaaacga 2940

catcatcagc cagcaagtgc cagggtttga tgagtggctg tgggtgctgg cgtatccggg 3000

gattaaagtc tcgacggcag aagccagggc tattttaccg gcgcagtatc gccgccagga 3060

ttgcattgcg cacgggcgac atctggcagg cttcattcac gcctgctatt cccgtcagcc 3120

tgagcttgcc gcgaagctga tgaaagatgt tatcgctgaa ccctaccgtg aacggttact 3180

gccaggcttc cggcaggcgc ggcaggcggt cgcggaaatc ggcgcggtag cgagcggtat 3240

ctccggctcc ggcccgacct tgttcgctct gtgtgacaag ccggaaaccg cccagcgcgt 3300

tgccgactgg ttgggtaaga actacctgca aaatcaggaa ggttttgttc atatttgccg 3360

gctggatacg gcgggcgcac gagtactgga aaactaaatg aaactctaca atctgaaaga 3420

tcacaacgag caggtcagct ttgcgcaagc cgtaacccag gggttgggca aaaatcaggg 3480

gctgtttttt ccgcacgacc tgccggaatt cagcctgact gaaattgatg agatgctgaa 3540

gctggatttt gtcacccgca gtgcgaagat cctctcggcg tttattggtg atgaaatccc 3600

acaggaaatc ctggaagagc gcgtgcgcgc ggcgtttgcc ttcccggctc cggtcgccaa 3660

tgttgaaagc gatgtcggtt gtctggaatt gttccacggg ccaacgctgg catttaaaga 3720

tttcggcggt cgctttatgg cacaaatgct gacccatatt gcgggtgata agccagtgac 3780

cattctgacc gcgacctccg gtgataccgg agcggcagtg gctcatgctt tctacggttt 3840

accgaatgtg aaagtggtta tcctctatcc acgaggcaaa atcagtccac tgcaagaaaa 3900

actgttctgt acattgggcg gcaatatcga aactgttgcc atcgacggcg atttcgatgc 3960

ctgtcaggcg ctggtgaagc aggcgtttga tgatgaagaa ctgaaagtgg cgctagggtt 4020

aaactcggct aactcgatta acatcagccg tttgctggcg cagatttgct actactttga 4080

agctgttgcg cagctgccgc aggagacgcg caaccagctg gttgtctcgg tgccaagcgg 4140

aaacttcggc gatttgacgg cgggtctgct ggcgaagtca ctcggtctgc cggtgaaacg 4200

ttttattgct gcgaccaacg tgaacgatac cgtgccacgt ttcctgcacg acggtcagtg 4260

gtcacccaaa gcgactcagg cgacgttatc caacgcgatg gacgtgagtc agccgaacaa 4320

ctggccgcgt gtggaagagt tgttccgccg caaaatctgg caactgaaag agctgggtta 4380

tgcagccgtg gatgatgaaa ccacgcaaca gacaatgcgt gagttaaaag aactgggcta 4440

cacttcggag ccgcacgctg ccgtagctta tcgtgcgctg cgtgatcagt tgaatccagg 4500

cgaatatggc ttgttcctcg gcaccgcgca tccggcgaaa tttaaagaga gcgtggaagc 4560

gattctcggt gaaacgttgg atctgccaaa agagctggca gaacgtgctg atttaccctt 4620

gctttcacat aatctgcccg ccgattttgc tgcgttgcgt aaattgatga tgaatcatca 4680

gtaa 4684

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttgatgt tatttctcac cgtcgccatg gtgcacattg tggcgcttat gagccccggt 60

cccgatttct tttttgtctc tcagaccgct gtcagtcgtt cccgtaaaga agcgatgatg 120

ggcgtgctgg gcattacctg cggcgtaatg gtttgggctg ggattgcgct gcttggcctg 180

catttgatta tcgaaaaaat ggcctggctg catacgctga ttatggtggg cggtggcctg 240

tatctctgct ggatgggtta ccagatgcta cgtggtgcac tgaaaaaaga ggcggtttct 300

gcacctgcgc cacaggtcga gctggcgaaa agtgggcgca gtttcctgaa aggtttactg 360

accaatctcg ctaatccgaa agcgattatc tactttggct cggtgttctc attgtttgtc 420

ggtgataacg ttggcactac cgcgcgctgg ggcatttttg cgctgatcat tgtcgaaacg 480

ctggcgtggt ttaccgtcgt tgccagcctg tttgccctgc cgcaaatgcg ccgtggttat 540

caacgtctgg cgaagtggat tgatggtttt gccggggcgt tatttgccgg atttggcatt 600

catttgatta tttcgcggtg a 621

Claims (5)

1.一株产L-苏氨酸基因工程菌，其特征在于，以野生型大肠杆菌（Escherichia coli）为基础，共表达了thrA*BC和rhtC基因，敲除了iclR和crr基因、并用强启动子trc替换了gltA基因原始启动子；所述thrA*BC的序列如SEQ ID NO.1所示；所述rhtC基因的序列如SEQID NO.2所示；所述野生大肠杆菌为E. coli MG1655。

2.一种构建权利要求1所述的重组菌的方法：运用CRISPR基因编辑技术，敲除了大肠杆菌基因组上的crr和i clR基因，用强启动子trc替换掉gltA基因原始启动子，再转入连接有thrA*BC和rhtC基因的质粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连接有thrA*BC和rhtC基因的质粒是质粒pFW01-thrA*BC-rhtC。

4.一种产L-苏氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因工程菌接种至LB培养基中，于35~37℃发酵12~36 h。

5.权利要求1所述的基因工程菌在制备含L-苏氨酸的产品中的应用。

Images