CN113774076B - 一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物改造技术领域，公开了一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法。该方法为：将质粒pMV26N导入大肠杆菌DH10B(ΔPTS)后采用含有抗生素的LB液体培养基培养，得到活化供体菌；将Nocardioidessp.菌采用LB液体培养基培养，得到活化Nocardioidessp.菌；将活化供体菌和活化Nocardioidessp.菌混合后涂布基本培养基固体平板培养，涂布加有卡那霉素的无菌超纯水上层，培养20‑30h，获得成功导入质粒的Nocardioidessp.菌。该方法无需使用抗生素杀死供体菌，便可实现接合转移，且接合转移效果好。

Description

一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法
技术领域
本发明属于微生物改造技术领域，具体涉及一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法。
背景技术
微生物的外源DNA导入是基因工程、基因组工程和基因编辑等操作的重要前置条件。微生物的DNA导入可分为转化、转导、接合转移和原生质体融合等操作方法。接合转移最初发现于物种之间的基因水平转移，由于条件温和，操作简便，是进行微生物DNA导入的重要手段。
接合转移是放线菌最常用的的DNA导入方法，借助于广宿主基因水平转移元件完成DNA操作。同时，该方法也被广泛用于常规方法难以进行DNA导入的微生物的DNA操作。常规的接合转移过程是先在液体培养基中培养供体菌(大肠杆菌)和DNA受体菌(需要进行DNA导入的微生物)，离心后进一步分别清洗供体菌和受体菌，充分去除培养过程中加入的选择性抗生素，然后将两者混合后涂布于固体培养基平板，使之在平板上完成基因的水平转移，这个过程在放线菌中持续的时间通常为16-25小时左右。随后在平板上涂布选择性抗生素，通常使用供体菌敏感而受体菌耐受的抗生素抑制或杀死供体大肠杆菌(在放线菌接合转移过程中通常使用萘啶酮酸)，使用需要转移的DNA上的抗性标记筛选成功接受DNA的受体菌。实际情况通常是：由于受体菌对抑制或杀死供体大肠杆菌的抗生素同时敏感，由于无合适选择性抗生素去除大肠杆菌，接合转移过程中将无法对供体大肠杆菌进行选择性去除，无法进行实验，大大降低了该方法在DNA导入过程中的使用范围。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法，该方法无需使用抗生素杀死供体菌，便可实现接合转移，且接合转移效果好，不仅适用于常规受体菌株，而且还能适用于同样对所选择抗生物敏感的受体菌株，应用更广泛。
本发明提供了以下技术方案：
一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将质粒pMV26N导入大肠杆菌DH10B(ΔPTS)，得到带质粒大肠杆菌DH10B(ΔPTS)，所述大肠杆菌DH10B(ΔPTS)为PTS缺陷大肠杆菌DH10B；
S2.将步骤S1得到的带有质粒的大肠杆菌DH10B(ΔPTS)采用含有抗生素的LB液体培养基培养，得到活化供体菌；
S3.将Nocardioides sp.菌采用LB液体培养基培养，得到活化Nocardioides sp.菌；
S4.将活化供体菌和活化Nocardioides sp.菌混合后涂布基本培养基固体平板，25～32℃培养20-30h后，涂布含有50mg/mL卡那霉素的无菌超纯水上层，25～32℃培养20-30h，然后在含有抗生素的基本培养基平板上划线，25～32℃培养3～5天以充分去除大肠杆菌污染，然后获得成功导入质粒的Nocardioides sp.菌纯培养菌落。
进一步的，步骤S2中，所述含有抗生素的LB液体培养基为含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基。
进一步的，步骤S2具体为：将所述带质粒DH10B(ΔPTS)接种至含有抗生素的LB液体培养基中30～37℃过夜培养后按体积比取1～5％转接至新的含有抗生素的LB液体培养基中继续培养至OD600值为0.2-0.8，离心去上清液后用Holding缓冲液洗涤以去除残漏的培养液和抗生素，然后采用Holding缓冲液重悬，得到活化供体菌。
进一步的，步骤S3具体为：将Nocardioides sp.菌接种于LB液体培养基过夜培养后按体积比取1～5％的菌液转接至LB液体培养基中培养至OD600值为0.2-1.0，离心去上清液后用Holding缓冲液洗涤，然后采用Holding缓冲液重悬，得活化Nocardioides sp.菌，其中，所述培养的温度为30℃，转速为200r/min。
进一步的，所述基本培养基中各组分含量为：葡萄糖10g/L，天冬氨酸0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，琼脂粉15g/L。
与现有技术相比，本发明中PTS缺陷的大肠杆菌供体菌无法利用葡萄糖作为碳源，所以无法在以葡萄糖为唯一碳源的固体培养基或液体培养基中生长，使用该方法可以避免使用选择性抗生素抑制大肠杆菌，也可以降低过程中供体大肠杆菌污染，方便筛选和后续成功接合转移菌的分纯、培养等操作。同时由于PTS是葡萄糖摄入的通用途径，该缺陷型的使用可以进一步拓展DNA供体菌的范围，为后续接合转移方案的进一步拓展应用范围。
附图说明
图1为大肠杆菌BL-21和大肠杆菌BL-21(ΔPTS)分别在基本培养基和LB培养基上的生长情况；
图2为大肠杆菌DH10B与DH10B(ΔPTS)介导的接合转移情况(5-6d)；
图3为Nocardioides sp.接合转移子的划线培养和PCR验证结果(Nocardioidessp.菌30℃划线培养4d)。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：
将质粒pIJ790转化到大肠杆菌BL-21和DH10B菌株，获得带有λ/RED系统的BL-21和DH10B菌株。
使用引物(Pt_S1:ATGTTCCAGCAAGAAGTTACCATTACCGCTCCGAACGGTATTCCGGGGATCCGTCGACC和Pt_c2:TTACTTCTTGATGCGGATAACCGGGGTTTC ACCCACGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)，以pHY778质粒为模板，扩增带有39bp交换臂的aadA基因。
使用终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导带有λ/RED系统的BL-21和DH10B菌株后，转入带有39bp交换臂的aadA基因(使用大肠杆菌常规电转方案转入)，然后涂布终浓度为100μg/mL的壮观霉素抗性LB固体平板，37℃培养过夜获得抗性转化子，挑取转化子抽取染色体DNA后使用验证引物(Yz_S1:TCTTCGTGCGTCGCGTCTGT和Yz_c2:GGAAGTGATGCGCTACACCCA)验证，验证结果表明，获得正确敲除PTS系统的大肠杆菌BL-21(ΔPTS)和DH10B(ΔPTS)。
将大肠杆菌BL-21和大肠杆菌BL-21(ΔPTS)划线在基本培养基上37℃生长48h，在LB固体培养基上37℃生长24h，大肠杆菌BL-21和大肠杆菌BL-21(ΔPTS)在基本培养基和LB培养基上的生长情况如图1所示，图1表明，敲除PTS系统的BL-21大肠杆菌无法在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基表明生长，大肠杆菌BL-21可以在基本培养基上生长。该结果证明缺失PTS系统的大肠杆菌不能利用葡萄糖为碳源生长。该方案为常规大肠杆菌基因组敲除方案之一，使用其他基因敲除和编辑工具(如CRISPR-Cas9等)进行大肠杆菌基因组内PTS系统的插入或缺失，将缺失菌应用于DNA的辅助导入其余微生物都属于本专利适用范畴。
实施例2
将质粒pMV26N(pMV261质粒的oriM复制起始区替换为pCG100的复制起始区，在XbaⅠ位点处克隆了来自于pIJ773的oriT和apramycin抗性基因片段)分别转化大肠杆菌DH10B和DH10B(ΔPTS)，得到带有质粒的DH10B和DH10B(ΔPTS)。
将带有质粒的DH10B和DH10B(ΔPTS)分别接种带有终浓度为50μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的50mLLB液体培养基，37℃过夜培养后按照体积比取1％-5％的接种量再次分别接种至带有终浓度为50μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的50mLLB液体培养基中，继续培养至OD600值为0.2-0.8后离心，分别加入事先灭菌后预冷的Holding缓冲液(1.7g/LKH2PO4,2.18g/L K2HPO4,120.36mg/LMgSO4，pH 7.2)20mL，充分混匀后6000r/min离心3-5min后弃上清。再次使用20mL预冷的Holding缓冲液将两个菌分别洗涤一次以充分去除培养液和抗生素，然后将两个菌分别使用5mL Holding缓冲液重悬菌体，放置冰上待用。
将Nocardioides sp.菌接种于50mL LB液体培养基，30℃，200r/min培养过夜。转接1-5mL菌液至50mL LB液体培养基中，30℃，200r/min培养至OD600值为0.2-1.0后6000r/min离心收集菌体，使用20mL预冷的Holding缓冲液洗涤一次，5mLHolding缓冲液重悬菌体。
取500μLDH10B(pMV26N)和500μLNocardioides sp.菌混合后8000r/min离心1min，去除800μL，将剩余混合菌轻柔重悬后涂布基本培养基固体平板(葡萄糖10g/L，天冬氨酸0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，琼脂粉15g/L)，30℃培养20-30h后取出，涂布加有25-30μL50mg/mL卡那霉素1mL无菌超纯水，30℃继续培养4-6天。挑取单菌落划线至终浓度为50μg/mL卡那霉素的基本培养基平板，培养3-5天，再次重复划线步骤一次以充分去除可能的大肠杆菌污染，结果如图2左所示。挑取最终的单菌落接种于50mL LB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)，过夜培养后抽提质粒，使用引物(Kan_F：TTTACTCGAGCAACAAAGCGACGTTGTGTCTCAAAATC，Kan_R：TTTACTCGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCT)进行PCR验证卡那霉素基因。
取500μLDH10B(pMV26N，ΔPTS)和500μLNocardioides sp.菌混合后8000r/min离心1min，去除800μL，将剩余混合菌轻柔重悬后涂布基本培养基固体平板(葡萄糖10g/L，天冬氨酸0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，琼脂粉15g/L)，30℃培养20-30h后取出，涂布加有25-30μL 50mg/mL卡那霉素1mL无菌超纯水，30℃继续培养4-6d。挑取单菌落划线至终浓度为50μg/mL卡那霉素的基本培养基平板，培养3-5d，再次重复划线步骤一次以充分去除可能的大肠杆菌污染，结果如图2右所示。挑取最终的单菌落接种于50mL LB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)，过夜培养后抽提质粒，使用引物(Kan_F：TTTACTCGAGCAACAAAGCGACGTTGTGTCTCAAAATC，Kan_R：TTTACTCGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCT)进行PCR验证卡那霉素基因，剩余质粒转化DH5α，抽提质粒酶切验证质粒是否正确。
比较图2中的左图和右图可知，同样条件下与DH10B介导的接合转移相比，DH10B(ΔPTS)接合转移30℃培养3d后平板上长出的大肠杆菌数量极少(数据未显示)，且菌落几乎不可见，5-6d后背景更为干净，方便后续挑选Nocardioides sp.接合转移菌。
图3为Nocardioides sp.接合转移子的划线培养(图3右图)和PCR验证(图3左图)，图3表明表明划线生长后的Nocardioides sp.菌经验证是需要获得的目标接合转移子。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法
<130> 2021.8.25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgaacggta ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacttcttg atgcggataa ccggggtttc acccacggtt gtaggctgga gctgcttc 58
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcttcgtgcg tcgcgtctgt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaagtgatg cgctacaccc a 21
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttactcgag caacaaagcg acgttgtgtc tcaaaatc 38
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttactcgag ggagccacgg ttgatgagag ct 32

Claims (3)

1.一种利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将质粒pMV26N导入PTS缺陷大肠杆菌DH10B ，得到带质粒PTS缺陷大肠杆菌DH10B；质粒pMV26N的制备方法为：pMV261质粒的oriM复制起始区替换为pCG100的复制起始区，在XbaⅠ位点处克隆了来自于pIJ773的oriT和apramycin抗性基因片段；
所述PTS缺陷大肠杆菌DH10B的制备方法为：使用终浓度为10 mM的阿拉伯糖诱导带有λ/RED系统的DH10B菌株后，转入带有39bp交换臂的aadA基因，然后涂布终浓度为100μg/mL的壮观霉素抗性LB固体平板，37℃培养过夜，获得PTS缺陷大肠杆菌DH10B；
S2. 将步骤S1得到的带有质粒的PTS缺陷大肠杆菌DH10B采用含有抗生素的LB液体培养基培养，得到活化供体菌；所述含有抗生素的LB液体培养基为含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基；
S3.将Nocardioides sp.菌采用LB液体培养基培养，得到活化Nocardioides sp.菌；
S4. 将活化供体菌和活化Nocardioides sp.菌混合后涂布基本培养基固体平板，25~32℃培养20-30h后，涂布含有50 mg/mL卡那霉素的无菌超纯水上层，25~32℃培养20-30h，然后在含有抗生素的基本培养基平板上划线，25~32℃培养3~5天以充分去除大肠杆菌污染，然后获得成功导入质粒的Nocardioides sp.菌纯培养菌落；所述基本培养基中各组分含量为：葡萄糖10 g/L，天冬氨酸0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂粉15 g/L。
2.根据权利要求1所述的利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法，其特征在于，步骤S2具体为：将所述带质粒PTS缺陷DH10B接种至含有抗生素的LB液体培养基中30~37℃过夜培养后按体积比取1~5%转接至新的含有抗生素的LB液体培养基中继续培养至OD600值为0.2-0.8，离心去上清液后用Holding 缓冲液洗涤以去除残漏的培养液和抗生素，然后采用Holding缓冲液重悬，得到活化供体菌；其中，Holding 缓冲液中各组分含量为1.7 g/LKH2PO4、 2.18 g/L K2HPO4和120.36 mg/L MgSO4，所述Holding 缓冲液的pH 为7.2。
3.根据权利要求1所述的利用葡萄糖进行辅助微生物基因操作的方法，其特征在于，步骤S3具体为：将Nocardioides sp.菌接种于LB液体培养基过夜培养后按体积比取1~5%的菌液转接至LB液体培养基中培养至OD600值为0.2-1.0，离心去上清液后用Holding缓冲液洗涤，然后采用Holding 缓冲液重悬，得活化Nocardioides sp.菌，其中，所述培养的温度为30℃，转速为200 r/min；其中，Holding 缓冲液中各组分含量为1.7 g/L KH2PO4、 2.18 g/LK2HPO4和120.36 mg/L MgSO4，所述Holding 缓冲液的pH 为7.2。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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