JP4293637B2 - コバラミンを製造し得る生合成方法 - Google Patents

Description

本発明は、コバラミンを製造し得る生合成方法に関する。より詳細には本発明は、組換えＤＮＡ技術及び／または新規なコバラミン前駆物質の添加によってコバラミンの産生を増加させる方法、特にＢ１２補酵素の産生を増加させる方法に関する。最後に本発明は、本発明のコバラミンの製造方法に有用な組換え菌株の作製方法に関する。
ビタミンＢ１２はコバラミンと呼ばれる分子のクラスに属しており、その構造は特に国際特許ＷＯ９１／１１５１８に開示されている。
コバラミンはほぼ例外なく、同じく国際特許ＷＯ９１／１１５１８に記載された複合プロセスによって細菌から合成されている。生合成メカニズムが極めて複雑であるため、工業的レベルのコバラミンの産生、特にビタミンＢ１２の産生は主として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ及びＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉのような細菌の大量培養によって行われている。
また、いくつかの微生物が、アミノレブリン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、コバルト、グルタミン、Ｒ１−アミノ−２−プロパノール及び５，６−ジメチルベンズイミダゾールの基質からコバラミンを合成することも公知である。
上記に挙げた前駆物質のうちで、５，６−ジメチルベンズイミダゾールは、コバラミン産生性微生物によって合成される。５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成には２つの経路が存在すると考えられる。一方の経路は、分子酸素を利用する好気性微生物に特有の経路である。他方の経路は、嫌気性微生物によって使用される経路である。嫌気性経路に関与する遺伝子だけが単離されている。この遺伝子は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｃｏｂＴ遺伝子である（Ｔｒｚｅｂｉａｔｏｗｓｋｉら，１９９４）。５，６−ジメチルベンズイミダゾールを合成する好気性微生物の遺伝子は現在まで全く同定されていない。多くの場合、微生物によって合成される５，６−ジメチルベンズイミダゾールの量には限界がある。
このため、５，６−ジメチルベンズイミダゾールを化学的に製造して産生用培地に添加している。従って、培地に対するこのような添加の必要をなくすことができれば有利になることは確かである。
従来のどのようなコバラミンの工業的製造方法も、コバルト及び５，６−ジメチルベンズイミダゾール以外の前駆物質の添加に言及したことはない。最近になって、培地がＲ１−アミノ−２−プロパノールを含有するときにだけコバラミンを産生するいくつかの菌株が記載された（Ｃｒｏｕｚｅｔら，１９９０、Ｇｒａｂａｕら，１９９２）。従って、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールもコバラミンの産生を増進するために使用し得るであろう。しかしながら、この物質は、工業的発酵に使用できるとしても、その使用が難しく費用も高い。その理由の１つは、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールが刺激性及び揮発性の物質であるからであり、いま１つの理由は、この物質が微生物の増殖を阻害するからである。従って、Ｒ１−アミノ−２−プロパノール残基以外の、上記の欠点を有していないコバラミンの前駆物質を見つけることが特に有益であると考えられる。この観点から、幾つかの微生物ではＬ−トレオニンからアミノアセトンを経由してＲ１−アミノ−２−プロパノールを生合成する経路が存在することは開示されている。しかしながら、Ｌ−トレオニンは上記に引用した菌株を補完することができない。
より一般的に、コバラミンの産生を増進するためには、培地中のコバラミンの前駆物質の量を増加させるのが有利であろう。コバラミンの前駆物質が制限的である場合には特にこのような増加が有利である。この方法は、制限的前駆物質またはその誘導体もしくはその類似体の１つを培地に直接添加することによって、あるいは、遺伝子技術、特に組換えＤＮＡ技術を使用して産生性菌株中でこの前駆物質のｉｎ ｓｉｔｕ合成を増進することによって行う。
従って、コバラミンの産生を増進するために重要な段階は、コバラミン及びその前駆物質の生合成経路を明らかにすることである。
最近には、ビタミンＢ１２の生合成経路の大部分の段階がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓで解明された（Ｂｌａｎｃｈｅら，１９９５）。コバラミンの生合成に関与する２２個以上のｃｏｂ遺伝子が単離され、これらの遺伝子によってコードされたポリペプチドの殆どについてその機能が同定された。
別の微生物においても、コバラミンまたはその前駆物質の生合成に関与すると推測される別の遺伝子が単離された。これらの遺伝子の殆どについてその機能は未だ解明されていない。これらの遺伝子の機能またはその効果を正確に決定することさえできれば、これらの遺伝子の応用が可能になるであろう。例えば、通性光合成細菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ中で、光合成器官の形成に必要な少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが最近になって配列決定された（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９３、Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ）。単離された８個の遺伝子のうちの５個の遺伝子が、前述のＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの２２個のｃｏｂ遺伝子のうちの５個の遺伝子に高度な相同性を有するという理由でコバラミンの生合成遺伝子であると示唆された。逆に、残りの３つの遺伝子、即ちｂｌｕＢ遺伝子、ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子に関しては、これらの遺伝子が直接に担当する正確な機能を明らかにすることができなかった。それらのプロモーター配列を含むｂｌｕＢ遺伝子、ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子は、Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａによってその配列が決定され開示された。
本発明によって、コバラミンの新規な前駆物質が知見された。その結果として本発明は、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを含有する培地によってコバラミンの産生を増進することに成功した。これまでに記載されたことのないこのコバラミンの前駆物質は、既に公知であった別の前駆物質Ｒ１−アミノ−２−プロパノールと同等の機能を有している。しかしながら、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンは、無毒の物質である、及び、取り扱い容易な物質である、という点でＲ１−アミノ−２−プロパノールよりも有利である。更に、コバラミンの産生増進に対してＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンが示す効率は、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールが示す効率の１，０００倍以上である。
本発明の目的はまた、コバラミンの産生増進を達成するためまたは所与の細胞のＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンもしくは５，６−ジメチルベンズイミダゾールのｉｎ ｓｉｔｕ合成もしくはこのような合成の増進を達成するために、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＤＮＡフラグメントを使用することである。
本発明によれば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの、特にｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを使用することによって、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールまたはＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを含有しない培地においてコバラミンの産生を増進することが可能であった。
最後に、本発明によれば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの、特にｂｌｕＢ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを導入することによって、５，６−ジメチルベンズイミダゾールを含有しない培地においてコバラミンの産生を増進することが可能であった。
本発明の１つの目的は、コバラミン産生性原核細胞微生物の発酵によるコバラミンの生合成方法を提供することである。本発明によるこの方法の特徴は、
−Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物を使用し、前記酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記微生物を培養する段階、及び／または、
−前記微生物の培養培地にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを添加する段階、または、
−５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された好気性微生物を使用し、前記酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記好気性微生物を培養する段階、
を含むことである。
微生物は、上記に特定した遺伝子を内在的に含んでいてもよい。この場合には、本発明方法によって酵素が超発現し得る。しかしながらまた、微生物がこの種の遺伝子を内在的に含んでいなくてもよい。
“Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメント”なる表現は、このＤＮＡフラグメントの発現によってＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたは５，６−ジメチルベンズイミダゾールが細胞内で合成され、場合によってはその後に培養培地中に遊離されることを意味する。
培養は、バッチ培養でもよく、または、連続培養でもよい。また、コバラミンの精製は既存の工業的方法によって行うことができる（Ｆｌｏｒｅｎｔ，１９８６）。
１つの実施態様においては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含みＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントによって形質転換されたか、または、相同フラグメント、即ち、これらのｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子とハイブリダイズし且つこれらの遺伝子と同様にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする機能を有しているフラグメントによって形質転換された微生物が使用される。
別の実施態様においては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＢ遺伝子を含み５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメントによって形質転換されたか、または、相同フラグメント、即ち、このｂｌｕＢ遺伝子とハイブリダイズし且つこの遺伝子と同様に５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードする機能を有しているフラグメントによって形質転換された微生物が使用される。
本発明は、天然、合成または組換えによって得られたＤＮＡフラグメント及び相同フラグメントの使用を含む。フラグメントなる用語は、遺伝コードの縮重性に由来するフラグメント、または、少なくとも２５％の配列相同性を有しており同じ機能のポリペプチドをコードするフラグメントを意味する。
好気性条件下で培養される微生物を使用し、５，６−ジメチルベンズイミダゾールの好気性条件下の生合成経路に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメントを使用するのが好ましい。
本発明の目的はまた、遺伝子工学技術を用い、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたは５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの上記のようなＤＮＡフラグメントによって微生物を形質転換させることを特徴とするコバラミン産生性原核細胞微生物の組換え菌株の製造方法を提供することである。
また、本発明の菌株の製造方法によって得られた組換え菌株を提供することも本発明の目的の１つである。
ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含み、１つまたは複数のこれらの配列が発現シグナルのコントロール下に配置されている組換えＤＮＡを本発明方法に使用することも本発明に包含される。
この観点から、特に、ＤＮＡ配置の５′にプロモーター領域を配置し得る。このような領域は、ＤＮＡ配列に同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の領域でもよくまたは異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の領域でもよい。特に、強い細菌プロモーター、例えば、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーターＰｔｒｐもしくはラクトースオペロンのプロモーターＰｌａｃ、ラムダバクテリオファージの左もしくは右のプロモーター、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のような細菌のファージの強いプロモーター、大腸菌のプロモーターＰｔａｃのようなグラム陰性菌中で機能性のプロモーター、プラスミドＴＯＬのキシレンの異化遺伝子のプロモーターＰｘｙｌＳ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアミラーゼのプロモーターＰａｍｙを使用し得る。また、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼまたはエノラーゼをコードする遺伝子のプロモーターのような、酵母の解糖遺伝子に由来のプロモーターも例示し得る。これらのプロモーターは、組換えＤＮＡを真核細胞宿主に導入するときに使用できる。また、ＤＮＡ配列の５′端にリボソーム結合部位を配置してもよい。この部位は、同種部位でもよく、または、ラムダバクテリオファージのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位のような異種部位でもよい。
転写の終結に必要なシグナルはＤＮＡ配列の３′に配置され得る。
本発明方法で使用される組換えＤＮＡは、選択された発現シグナルに適合性の宿主細胞に直接導入されてもよく、または、問題のＤＮＡ配列を宿主細胞に安定に導入できるようにプラスミドベクターにクローニングされてもよい。
本発明方法は公知の方法と同様に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドの使用を包含する。更にこれらのプラスミドは公知のプラスミドと同様に、機能性複製系と選択マーカーとを含む。
多様な種類のベクターを使用し得る。本発明の範囲内では、ＲＫ２型のベクター、即ち、ＲＫ２複製起点を有するベクターを使用するのが好ましい。特定例としては、ベクターＲＫ２（Ｓａｕｒｕｇｇｅｒら，１９８６）、ベクターｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９）、ベクターｐＲＫ２９０（米国特許第４，５９０，１６３号、Ｄｉｔｔａら，１９８５）、及び、ベクターｐＸＬ１６３５（国際特許ＷＯ９１／１６４３９）を挙げることができる。特に有利なベクターはベクターｐＸＬ１６３５である。その他のベクターは国際特許出願ＷＯ９１／１６４３９に記載されている。
変形実施態様においては、後出の実施例に記載したように、２種類の前駆物質、即ち、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及び５，６−ジメチルベンズイミダゾールの合成をコードするプラスミドｐＥＲ１（図１）の６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントから成るＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物が使用される。
Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの合成に関与するポリペプチドの発現に特に好適な実施態様では、後出の実施例に記載したようなプラスミドｐＥＲ２（図２）の２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントから成るＤＮＡフラグメントが使用される。
Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの合成に関与するポリペプチドの発現に特に好適な実施態様では、後出の実施例に記載したようなプラスミドｐＥＲ２（図２）の１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから成るＤＮＡフラグメントが使用される。
５，６−ジメチルベンズイミダゾールの合成に関与するポリペプチドの発現に特に好適な別の実施態様では、後出の実施例に記載したようなプラスミドｐＥＲ１の６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントから成るＤＮＡフラグメントが使用される。
本発明によって使用され得る宿主原核細胞微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｔｏｔｉあるいはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ属の細菌である。他の細菌は国際特許ＷＯ９１／１１５１８に記載されている。
いずれにしても、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓまたはＡ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の使用が特に有利である。
本発明の別の特徴及び利点は以下の詳細な記載より明らかにされるであろう。
実施例１及び２は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓまたはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株の培養培地にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを添加することによってコバラミンを産生させるのが可能であることを示している。実施例２は、産生培養中のＲ１−アミノ−２−プロパノールをＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンで代替することがどのように有利であるかを示している。同量のコバラミンを産生するために必要なＲ１−アミノ−２−プロパノールの量はＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの１，０００倍である。
実施例２はまた、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含む染色体の領域が、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの合成に関与することを示している。実施例３は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＤＮＡフラグメントを出発材料としたｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含むプラスミドの構築を記載している。この実施例３は特に、これらのプラスミドがＲ１−アミノ−２−プロパノールまたはＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの添加に依存してコバラミンを産生する菌株中に導入されたときに、Ｒ１−アミノ−２−プラスミドまたはＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン非含有の培地でどのようにしてコバラミンを産生し得るかを示している。実施例４は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのｂｌｕＢ遺伝子を含む染色体の領域が、５，６−ジメチルベンズイミダゾールの合成に関与することを示している。
【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドｐＥＲ１の制限地図を表す。
図２はプラスミドｐＥＲ２の制限地図を表す。
図３はプラスミドｐＥＲ３の制限地図を表す。
図１から図３は夫々、プラスミドｐＥＲ１、ｐＥＲ２及びｐＥＲ３を表す。
１．菌株及びプラスミド
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ菌のＡＨ２株及びＢＢ１株（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ）を、３７ｂ４株（ＤＳＭ９３８）から構築した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０株は、ＳＢＬ ２７ Ｒｉｆｒ株を出発材料とし、トランスポゾンＴｎ５の挿入によって構築した（Ｃｒｏｕｚｅｔら，１９９０）。先ず、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むトランスポゾンＴｎ５を用いてＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を構築した。次に、Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を出発材料とし、トランスポゾンＴｎ５のテトラサイクリン耐性遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子で置換することによってＧ２６５０〔Ｓｐ〕株を構築した。ＳＢＬ ２７ Ｒｉｆｒ株はＭＢ５８０株に由来する（米国特許ＵＳ３，０１８，２２５）。
プラスミドｐＢＢＷ１（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５ａ）をＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＤＮＡフラグメントから構築した。プラスミドｐＢＢＷ１からプラスミドｐＡＨＷ２５（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９９５ａ）を構築した。
２．分子技術
ＤＮＡ操作の汎用技術に関しては実験概論書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を参考として使用する。
酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍの研究所から入手し、製作者の指示通りに使用する。
使用した技術は本質的に以下の２段階から成る。
−制限酵素による消化、及び、
−Ｔ４バクテリオファージのリガーゼによるＤＮＡ分子の結合。
３．形質転換技術
大腸菌の形質転換を電気穿孔によって行う（Ｄｏｗｅｒら，１９８８）。
４．結合技術
大腸菌Ｓ１７−１株とＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの種々の菌株との結合は、Ｓｉｍｏｎらによって記載されたプロトコル（Ｓｉｍｏｎら，１９８６）を応用して行う。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌株の形質転換は遺伝子工学の他の任意の技術によって行う。
５．コバラミン産生培地の調製
Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの菌株によるコバラミンの産生に使用した培地は、Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９、によって記載されたＰＳ４培地である。
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株によるコバラミンの産生に使用した培地は、Ｐｏｌｌｉｃｈ，１９９５ｂ、によって記載されたＲＡ培地である。
６．産生されたコバラミンの定量アッセイ
産生されたコバラミンの量を、微生物学的アッセイまたは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定する。
−微生物学的アッセイ
ビタミンＢ１２要求性の大腸菌指示株１１３−３（Ｄａｖｉｓ ＆ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ，１９５０）を用い、半定量的方法によってコバラミンの産生量を測定する。
この指示株は、Ｂ１２依存性のホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．１３）だけを有している大腸菌のｍｅｔＥ変異株である。この菌株が最小培地中で増殖するためにはビタミンＢ１２の存在だけが必要である。（この菌株の増殖に必要なビタミンＢ１２が欠乏した）ゲル状のＭ９最小培地（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２）の上層にこの菌株が含まれているときにビタミンＢ１２を定量することが可能である。即ち、上層の表面にビタミンＢ１２を含む溶液のサンプルを滴下し、３７℃で１６時間インキュベーション後、滴下した箇所に円形増殖斑が出現する。サンプルに含まれているビタミンＢ１２が拡散して、寒天に含まれている細菌を増殖させ得るからである。円形増殖斑の直径はサンプル中のビタミンＢ１２の濃度に比例する。
サンプルは以下のプロトコルで細胞を溶解させることによって得られる。
２４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む０．１ｍｌの溶液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ＝８、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／リットルのショ糖）を、０．５ｍｌの定量すべき細胞培養物と混合する。３７℃で３０分間インキュベーション後、３０ｇ／リットルの濃度のドデシル硫酸ナトリウムの溶液を６０μｌ添加し、混合物の渦流を数秒間維持する。得られた１０μｌの細胞溶解液、あるいはこれを任意に１／５０に希釈した液を、上層の表面に導入する。
−ＨＰＬＣアッセイ
高性能液体クロマトグラフィーによるコバラミンの定量方法としては、Ｂｌａｎｃｈｅら，１９９０、に記載された方法を使用する。
実施例１
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの菌株によるコバラミンの産生に対するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの効果
１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを用い、２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２５ｍｌのＰＳ４培地でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を培養する。撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３０℃で２４時間発酵後、１０ｇ／リットルのＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの溶液を、０．１６ｍｌ、０．３２ｍｌまたは１．５ｍｌの量で培地に添加する。これらは夫々、６６ｍｇ／リットル、１３２ｍｇ／リットル及び６００ｍｇ／リットルの最終濃度に対応する。これらの各条件下で産生されたコバラミンの量を、１４８時間発酵後にＨＰＬＣによって定量する。結果（表１）は、Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株がＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生しないことを示す。これに反して、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンが培地中に存在すると、同じこの菌株によってＢ１２が産生される。添加するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの量の増加に伴って産生されるビタミンＢ１２の量が増加する。

実施例２
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの菌株によるコバラミンの産生に対するＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及びＲ１−アミノ−２−プロパノールの効果の比較
１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを用い、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンと種々の濃度のＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニン及びＲ１−アミノ−２−プロパノールを存在させた７０ｍｌのＲＡ培地でＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ菌ＡＨ２株を培養する。撹拌下（１００ｒｐｍ）、３０℃で２４〜４８時間発酵後、種々の条件下のコバラミンの産生量を微生物学的アッセイによって測定する。
結果を表２に示す。表中の、“−”は、指示株の円形増殖斑が存在しないことを表し、“＋”は円形増殖斑が存在することを表し、“＋”の数が多いほど増殖斑の直径が大きいことを表している。これらの結果は、ＲＡ培地で培養したＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ菌ＡＨ２株がビタミンＢ１２を産生しないことを示す。これに反して、Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンまたはＲ１−アミノ−２−プロパノールの存在下では、この菌株がビタミンＢ１２を産生し得る。これらの結果はまた、Ｒ１−アミノ−２−プロパノールによってＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンと同じ結果を得るためには約６×１０３の添加量が必要であることを示している。

実施例３
コバラミン産生性でないＧ２６５０株中のプラスミドｐＢＢＷ１に由来のＤＮＡフラグメントの存在の効果
３．１．プラスミドｐＥＲ１の構築（図１）
ベクターｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９）のＢａｍＨＩ部位に、プラスミドｐＢＢＷ１（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９９５）から精製した６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって、１７．４ｋｂのプラスミドｐＥＲ１を構築した。
３．２．Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０株へのプラスミドｐＥＲ１の導入
第一段階で、大腸菌Ｓ１７−１株にプラスミドｐＥＲ１を電気穿孔によって導入し、第二段階で、プラスミドｐＥＲ１を含む大腸菌Ｓ１７−１株に結合させることによって、プラスミドｐＥＲ１をＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２５６０〔Ｔｅｔ〕株に導入した。５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び１００μｇ／ｌのリビドマイシンに耐性のトランスコンジュガントを選択した。分析した９個のクローンがプラスミドｐＥＲ１を含んでいた。
同様の手順で、ベクターｐＸＬ４３５だけを含む対照Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株を構築した。
３．３．プラスミドｐＥＲ１を含むＧ２６５０株によるコバラミンの産生
プラスミドｐＥＲ１を含むクローンＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕とプラスミドｐＸＬ４３５を含む２つのクローンとを、ＰＳ４培地中、リファンピシン、テトラサイクリン及びリビドマイシンの存在下で培養した。撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３０℃で１４０時間発酵後、微生物学的アッセイ及びＨＰＬＣによってコバラミンの産生量を測定した。結果を表３に示す。

Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株及びプラスミドｐＸＬ４３５を含む菌株の双方がＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生しないが、ｐＥＲ１を含む同じ菌株はＢ１２を約３．５ｍｇ／リットルの濃度で産生し得る。プラスミドｐＸＬ４３５を含むＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株、即ちプラスミドｐＥＲ１の構築に使用されるクローニングベクターだけを含むＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株はＢ１２を産生しない。従って、Ｂ１２が産生される理由は、プラスミドｐＢＢＷ１に由来の６．８ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在であることが判明する。
即ち、プラスミドｐＢＢＷ１から精製された６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントは、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株に、ＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生する能力を与える。
３．４．サブクローニング
ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含む６．８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントの領域を、クローニングベクターｐＬＸ４３５にサブクローニングしてプラスミドを作製し、中間構築物に基づいてプラスミドｐＥＲ２及びｐＥＲ３と命名した。
１２．９ｋｂのプラスミドｐＥＲ２（図２）は、プラスミドｐＢＢＷ１から精製されベクターｐＸＬ４３５にクローニングされた２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントを含む。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ部位に予めクローニングされ、次いでこの組換えプラスミドからＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントの形態で精製されてベクターｐＸＬ４３５にクローニングできるようにしたものである。
１１．９ｋｂのプラスミドｐＥＲ３（図３）は、プラスミドｐＢＢＷ１から精製されベクターｐＸＬ４３５にクローニングされた１．２ｋｂのＰｓｔＩフラグメントを含む。このフラグメントは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋のＰｓｔＩ部位に予めクローニングされ、次いでこの組換えプラスミドからＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限フラグメントの形態で精製されてベクターｐＸＬ４３５にクローニングできるようにしたものである。
プラスミドｐＡＨＷ２５（Ｐｏｌｌｉｃｈ ＆ Ｋｌｕｇ，１９９５ａ）は、プラスミドｐＢＢＷ１から精製され、ベクターｐＲＫ４１５（Ｋｅｅｎら，１９８８）にクローニングされた１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントを含む。ｂｌｕＥ遺伝子はベクターのｌａｃプロモーターから転写される。
プラスミドｐＥＲ２またはｐＥＲ３を、これらのプラスミドを含む大腸菌Ｓ１７−１株に結合させることによってＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔Ｔｅｔ〕株に導入した。プラスミドｐＥＲ２、ｐＥＲ３またはｐＸＬ４３５を含むＧ２６５０〔Ｔｅｔ〕株のクローンを、５ｍｌのＰＳ４培地中、リファンピシン、テトラサイクリン及びリビドマイシンの存在下で培養した。プラスミドｐＡＨＷ２５及びｐＲＫ４１５を、これらのプラスミドを含む大腸菌Ｓ１７−１株に結合させることによってＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌Ｇ２６５０〔Ｓｐ〕株に導入した。プラスミドｐＡＨＷ２５またはｐＲＫ４１５を含むＧ２６５０〔Ｓｐ〕株のクローンを２５ｍｌのＰＳ４培地中、リファンピシン、リビドマイシン及びスペクチノマイシンの存在下で培養した。撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３０℃で１４０時間発酵後、コバラミンの産生量を微生物学的アッセイ及びＨＰＬＣによって測定する。
表４に示した結果は、プラスミドｐＥＲ２またはｐＡＨＷ２５を含むＧ２６５０株のクローンだけがＰＳ４培地中でビタミンＢ１２を産生し得ることを示す。

実施例４
ｂｌｕＢ遺伝子は、Ｂ１２の既知の前駆物質である５，６−ジメチルベンズイミダゾール（ＤＢＩ）の生合成に関与する。
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓは、ｂｌｕＢ遺伝子にインターポゾンを挿入することによって得られた突然変異株である。この株はｂｌｕＢ−である（Ｐｏｌｌｉｃｈら，１９９５）。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコを用い、７０ｍｌのＲＡ培地中、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び種々の濃度のＤＢＩの存在下でＢＢ１株を培養する。種々の条件下でこの菌株によって産生されるコバラミンの量を、撹拌下（１００ｒｐｍ）、３０℃で２４〜４８時間発酵後に、微生物学的アッセイによって測定する。表５にまとめた結果は、突然変異株ＢＢ１がＲＡ単独培地中ではＢ１２産生性でないが、培地中に１４ｎＭ以上のＤＢＩが存在するときにはこの分子を合成することを示す。従って、ｂｌｕＢ遺伝子は５，６−ジメチルベンズイミダゾールの生合成に関与する。

Claims (7)

1. コバラミン産生性原核細胞微生物の発酵によるコバラミンの生合成方法であって、
   Ｏ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって形質転換された微生物を使用し、但し、当該ＤＮＡフラグメントはプラスミドｐＥＲ１の６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント、プラスミドｐＥＲ２のＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩフラグメントおよびプラスミドｐＡＨＷ２５もしくはｐＥＲ２の１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから成る群より選択されるフラグメントを含み、前記酵素が発現しコバラミンが産生され得る条件下で前記微生物を培養すること、及び／または、
   前記微生物の培養培地にＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンを添加することを特徴とするコバラミンの生合成方法。
2. ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）のｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子を含みＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントによって形質転換されるか、または、相同フラグメント、及び／または、前記ｂｌｕＥ遺伝子及びｂｌｕＦ遺伝子とハイブリダイズし且つＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする機能を有しているフラグメントによって形質転換された微生物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 請求項１または２のいずれか一項に記載のビタミンＢ１２の製造方法。
4. 前記微生物がシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）またはアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）の菌株であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 遺伝子工学技術を用い、請求項１または２のいずれか一項に記載のＯ−ホスホ−Ｌ−トレオニンの生合成経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントによって微生物を形質転換させることを特徴とするコバラミン産生性原核細胞微生物の組換え菌株の製造方法。
6. 請求項５に記載の方法によって得られた組換え微生物。
7. シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）またはアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）の菌株であることを特徴とする請求項６に記載の微生物。

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