CN105849083B - ［s,s］-edds生物合成基因和蛋白和用于生物合成[s,s]-edds的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生物合成[S,S]‑乙二胺二琥珀酸（[S,S]‑EDDS）的分离的核酸和蛋白或肽、表达载体和缺失载体、宿主细胞和缺失突变体、用于生物合成[S,S]‑EDDS的方法和试剂盒。

Description

［S,S］-EDDS生物合成基因和蛋白和用于生物合成[S,S]-EDDS 的方法
说明书
应用领域和现有技术
本发明涉及用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸（[S,S]-EDDS）的分离的核酸和蛋白或肽、表达载体和缺失载体、日本拟无枝酸菌（Amycolatopsis japonicum）属的宿主细胞和缺失突变体和用于生物合成[S,S]-EDDS的方法和试剂盒。
乙二胺二琥珀酸（EDDS，也被称为乙二胺二琥珀酸）是六齿的螯合剂。EDDS具有两个立体中心且因此存在三个不同的立体异构体，即[R,R]-EDDS、[S,S]-EDDS和[R,S]-(内消旋)-EDDS。已证实仅有[S,S]-EDDS立体异构体可完全生物降解（Schowanek 等人,Chemosphere (1997), 34(11): 2375-91）。
此外，EDDS是乙二胺四乙酸（EDTA）（广泛使用且也是六齿的螯合剂）的结构异构体。这两种化合物在其化学特征上，特别是在其与金属离子形成络合物的能力方面非常相似。因此，EDDS和EDTA对一整系列的金属离子展示出相当的络合物形成常数。
由于其显著的形成络合物的能力，数十年来EDTA已在各种不同领域中用于去除金属离子，且目前是最常用的络合剂。其与铜(II)、镍(II)、铁(III)和钴(II)离子，且也与重金属离子和与钙离子和镁离子形成特别稳定的络合物。
因此，EDTA特别作为软水剂添加至洗涤剂中，在造纸和纺织工业领域中用于稳定化漂白浴（Bleichbad），且以铁、铜和锌络合物的形式用作肥料。此外，EDTA在医疗领域中用于治疗重金属中毒。
缺点是EDTA不可生物降解，同时可因此在无处不在的水中检测到。因此，其特别被认为是生态有害的，这是因为其可从沉积物中溶解出重金属并因此使它们具有生物可用性。
在该背景下期望的是，根据可持续材料政策，通过等效的但生物可降解的化合物取代EDTA。
由于与EDTA相当的络合物形成常数，以生物可降解的立体异构体[S,S]-EDDS形式的EDDS通常是合适的替代物。
[S,S]-EDDS在三价钴存在下由L-天冬氨酸和1,2-二溴甲烷的化学合成是熟知的（Neal和Rose, Inorganic Chemistry (1968), 7(11): 2405-12）。缺点是在此作为毒性副产物产生的溴化氢，其必须复杂地去除。此外，所述合成使用化石反应物完成。
此外，非对映选择性的化学方法是熟知的，其中使马来酸或马来酸酐与乙二胺反应，由此除 50 %的内消旋-EDDS外还产生[R,R]-EDDS和[S,S]-EDDS作为外消旋混合物。然而，由于只有[S,S]-EDDS的低产率和基本上非常复杂的外消旋物分离，该方法通常不适合用于工业应用。
用于制备[S,S]-EDDS的生物催化的方法公开于EP 0 731 171 A2。使用该文所述的方法，可由富马酸和乙二胺在具有裂解酶活性的微生物的作用下以高达97%的光学纯度获得[S,S]-EDDS。另一种用于制备[S,S]-EDDS的生物催化的方法在EP 1 043 400 A1中公开，其中可由马来酸和乙二胺在具有马来酸异构酶活性的微生物和金属离子的存在下以高达98%的光学纯度获得[S,S]-EDDS。然而，以上两种生物催化的方法基于使用不能由所用微生物自身提供的合成前体。
另外熟知的是借助细菌物种日本拟无枝酸菌生物合成[S,S]-EDDS（Zwicker 等人, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1997); 19(4): 280-285）。 然而，在此的缺点是该生物合成依赖于锌，且在培养基中2 µM的锌浓度就可导致[S,S]-EDDS的合成几乎完全中断（Cebulla I., 论文(1995), Tübingen大学）。
在无锌反应条件下借助日本拟无枝酸菌通过使用优化的培养基来制备[S,S]-EDDS的方法在WO 96/36725 A1中描述。
对于[S,S]-EDDS的一般生物合成方法而言的问题特别是如下事实，即由于锌依赖性和与其相关的低产率，更大规模的合成应用被证明是困难和不经济的。因此，在培养基和发酵器中产生无锌环境涉及巨大的费用且几乎不可行。
目的和实现方式
基于该背景，本发明的目的因此是提供用于生物合成[S,S]-EDDS的蛋白或肽、核酸、基因簇、载体、宿主细胞、细菌细胞以及方法和试剂盒。
该目的通过根据权利要求1、4、6和9 的蛋白或肽、通过根据权利要求2、3、7和8的核酸、通过具有权利要求5的特征的基因簇、通过根据权利要求10和13的特征的载体、通过具有权利要求11的特征的宿主细胞、通过具有权利要求12的特征的细菌细胞、通过具有权利要求15的特征的方法以及通过具有权利要求16的特征的试剂盒实现。如权利要求13定义的载体的优选实施方案描述在从属权利要求14中。全部权利要求的条文在此通过明确引用并入本说明书的内容。
本发明人首先成功地以日本拟无枝酸菌为例鉴定和提供能用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸（在下文称为[S,S]-EDDS）的基因和蛋白。
此外，本发明人首先成功地解释基于所述生物合成的锌依赖性的机理。
由此，特别有利的是相比于一般方法更经济且更高效地制备[S,S]-EDDS，特别是以更高产率和更大纯度。对此，下文描述的本发明主题是基础。
在第一个方面中，本发明涉及分离的蛋白或肽，其优选对于生物合成[S,S]-EDDS的部分合成步骤具有功能性，即使得能够进行这样的部分合成步骤。
在本发明的范围中，术语“生物合成”限定的不仅是[S,S]-EDDS的胞内合成，还包括摄取进入细胞和从细胞排出（经由细胞膜的运输）。
所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 1、SEQ ID No.3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ IDNo. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 35、SEQ IDNo. 37、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 57和SEQ IDNo. 59。
在本发明范围中，术语“蛋白”可以不仅是指单个本发明的蛋白或肽，还可以是指多种不同的本发明的蛋白或肽的组合。
本发明的蛋白或肽可以通过化学或重组，即生物技术的方式来制备。
可选地，本发明的蛋白或肽可以源自细菌，特别是革兰氏阳性菌，优选源自拟无枝酸菌属的细菌，特别优选源自日本拟无枝酸菌物种的细菌，或从这样的细菌提取。
在一个优选的实施方案中，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ IDNo. 49、SEQ ID No. 51和SEQ ID No. 53。
优选地，包含或由下文给出的氨基酸序列构成的本发明的蛋白或肽具有分别注释的活性：
- SEQ ID No. 1 2-异丙基苹果酸-合酶-活性，
- SEQ ID No. 3 富马酰乙酰乙酸-水解酶-活性，
- SEQ ID No. 5 tRNA尿苷-5-羧甲基氨甲基-修饰酶-活性，
- SEQ ID No. 7 磷酸乙醇酸-磷酸酶-活性，
- SEQ ID No. 13 醇-脱氢酶-/L-苏氨酸-脱氢酶-活性，
- SEQ ID No. 17 转录调节因子（PadR-样）-活性，
- SEQ ID No. 21 主要易化子超家族（MFS）-活性，
- SEQ ID No. 23 主要易化子超家族（MFS）-活性，
- SEQ ID No. 25 转录调节因子（HTH, ArsR）-活性，
- SEQ ID No. 27 双丙氨磷-生物合成途径-调节因子-活性，
- SEQ ID No. 29 弗林蛋白酶-活性，
- SEQ ID No. 33 DNA-结合活性（螺旋-翻转-螺旋, HTH），
- SEQ ID No. 37 双组分-转录调节因子（LuxR）-活性，
- SEQ ID No. 39 N-乙酰转移酶活性，
- SEQ ID No. 41 半胱氨酸加双氧酶（EC 1.13.11.20）-活性，
- SEQ ID No. 43 HTH型转录调节因子-活性，
- SEQ ID No. 45 酰胺酶（EC 3.5.1.4）-活性，
- SEQ ID No. 47 鸟氨酸环化脱氨酶（Cycloamidase）（EC 1.4.1.12）-活性，
- SEQ ID No. 49 二氨基庚二酸-脱羧酶（EC 4.1.1.20）-活性，
- SEQ ID No. 51 胱硫醚-ß-合酶（EC 4.2.1.22）-活性，
- SEQ ID No. 53 转运蛋白-活性，
- SEQ ID No. 55 芽胞形成-活性，
- SEQ ID No. 57 铁摄取调节因子-活性，
- SEQ ID No. 59 过氧化氢酶/过氧化物酶-活性。
包含或由根据SEQ ID No. 53的氨基酸序列构成的蛋白或肽特别用于将[S,S]-EDDS或[S,S]-EDDS-锌-络合物从细胞运出和/或运入细胞，或至少参与该运输。
可选地，本发明的蛋白或肽可以是同源蛋白或肽，其与上述氨基酸序列之一具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性，即在氨基酸次序中的同一性。
此外，本发明涉及分离的核酸，其优选地编码对于生物合成[S,S]-EDDS的部分合成步骤具有功能性的，即使得能够进行这样的部分合成步骤的蛋白或肽。
所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码包含或由选自以下的氨基酸序列构成的蛋白或肽的核酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ IDNo. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 33、SEQ IDNo. 35、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 55、SEQ IDNo. 57和SEQ ID No. 59；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列；和
d）编码与上述氨基酸序列之一具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性的同源蛋白或肽的核酸序列。
在本发明的范围中，术语“核酸”可以不仅是指单个本发明的核酸，还可以是指多种不同的本发明核酸的组合。
此外，在本发明的范围中，术语“核酸”可以是指DNA或RNA。本发明的核酸可以特别地选自基因或开放阅读框（ORF）、cDNA和mRNA。
本发明的核酸可以通过化学或重组，即基因技术的方式来制备。
可选地，本发明的核酸可以源自细菌，特别是革兰氏阳性菌，优选源自拟无枝酸菌属的细菌，特别优选源自日本拟无枝酸菌物种的细菌，或从这样的细菌提取。
在另一个方面中，本发明涉及分离的核酸，其优选地编码对于生物合成[S,S]-EDDS的部分合成步骤具有功能性的，即使得能够进行这样的部分合成步骤的蛋白或肽，其中所述核酸包含或由选自以下的序列构成：SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ IDNo. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ IDNo. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 58和SEQ ID No. 60。
任选地，所述核酸可以是同源核酸序列，其与先前段落中提及的核酸序列之一具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性。
上述核酸序列优选如下进行编码：
- SEQ ID No. 2编码根据 SEQ ID No. 1的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 4编码根据 SEQ ID No. 3的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 6编码根据 SEQ ID No. 5的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 8编码根据 SEQ ID No. 7的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 10编码根据 SEQ ID No. 9的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 12编码根据 SEQ ID No. 11的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 14编码根据 SEQ ID No. 13的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 16编码根据 SEQ ID No. 15的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 18编码根据 SEQ ID No. 17的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 20编码根据 SEQ ID No. 19的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 22编码根据 SEQ ID No. 21的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 24编码根据 SEQ ID No. 23的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 26编码根据 SEQ ID No. 25的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 28编码根据 SEQ ID No. 27的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 30编码根据 SEQ ID No. 29的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 32编码根据 SEQ ID No. 31的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 34编码根据 SEQ ID No. 33的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 36编码根据 SEQ ID No. 35的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 38编码根据 SEQ ID No. 37的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 40编码根据 SEQ ID No. 39的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 42编码根据 SEQ ID No. 41的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 44编码根据 SEQ ID No. 43的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 46编码根据 SEQ ID No. 45的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 48编码根据 SEQ ID No. 47的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 50编码根据 SEQ ID No. 49的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 52编码根据 SEQ ID No. 51的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 54编码根据 SEQ ID No. 53的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 56编码根据 SEQ ID No. 55的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 58编码根据 SEQ ID No. 57的氨基酸序列；
- SEQ ID No. 60 编码根据SEQ ID No. 59的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ IDNo. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54。
在另一个方面中，本发明涉及分离的蛋白或肽，其优选对于生物合成[S,S]-EDDS的部分合成步骤具有功能性，即使得能够进行这样的部分合成步骤，其中所述蛋白或肽通过基因或开放阅读框的表达来制备，且所述基因或开放阅读框包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No.22、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQID No. 34、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No.44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQID No. 56、SEQ ID No. 58和SEQ ID No. 60。
可选地，所述蛋白或肽可通过同源基因或开放阅读框的表达来制备，所述同源基因或开放阅读框与先前段落中提及的核酸序列之一具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性。
优选的是，所述蛋白或肽通过包含或由选自以下的核酸序列构成的基因或开放阅读框的表达来制备：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54。
此外，本发明包括分离的基因簇或操纵子，其优选对于[S,S]-EDDS的生物合成具有功能性，即使得能够进行这样的生物合成。
上文提及的操纵子通常进一步包含启动子，特别是一个或任选多个操纵基因。
所述基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No.2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ IDNo. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 34、SEQ IDNo. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 56、SEQ IDNo. 58、SEQ ID No. 60及其组合。
所述基因簇或操纵子可特别地包含先前段落提及的全部氨酸序列或由其构成。
代替上文提及的核酸序列，所述基因簇或操纵子还可以包含或由同源核酸序列构成，所述同源核酸序列与先前段落中提及的核酸序列之一具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性。
优选地，所述基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No.50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其组合。
名称基因簇来源于如下发现，即细菌和多种真核生物通常使用协调机制来调节其产物（蛋白或肽）参与相关联的过程例如生物合成的基因。这种基因共同存在于被称为基因簇的结构中的单个染色体上，并可以在单个调节序列或多个调节序列的控制下经历共转录。基因簇原则上还可以包含多个启动子且也可受多个调节因子控制。基因簇、启动子和在调节时协同作用的任选另外的序列也可以被称为操纵子。
在另一个方面中，本发明涉及分离的蛋白或肽，其优选对于抑制或压制[S,S]-EDDS的生物合成具有功能性，即实现这样的抑制或压制。优选地，所述蛋白或肽是用于生物合成[S,S]-EDDS的转录抑制因子或阻抑物。
所述蛋白或肽包含或由根据 SEQ ID No. 61的氨基酸序列构成。
可选地，所述蛋白或肽可以包含或由同源氨基酸序列构成，所述同源氨基酸序列与先前段落中提及的氨基酸序列具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性。
所述蛋白优选是锌摄取调节因子蛋白，所谓的Zur（锌摄取调节因子）-蛋白，即是对锌的细胞摄取具有调节活性的蛋白。通常，Zur蛋白能够结合特定浓度以上的锌离子，且通过锌依赖性基因抑制或基因表达调节细菌细胞中的锌平衡（Zinkhaushalt）。在很多细菌中介导基因的这种锌依赖性调节，其中锌饱和的Zur蛋白，所谓的holoZur蛋白结合到相应靶基因上游的特定核酸序列，以使得对靶基因的转录必要的酶RNA聚合酶被阻止接近靶基因。由此，防止靶基因的转录。用作Zur结合位点的特定核酸序列通常为启动子/启动子区域或操纵基因。
因为基因抑制或基因表达的锌依赖性调节取决于细胞内部和细胞外部的锌离子浓度，这种系统还特别适合作为确定锌离子浓度的报告系统。
如将在下文实施例部分更详细解释那样以日本拟无枝酸菌为例，本发明人令人惊讶地已发现，在锌存在下由于包含或由根据SEQ ID No. 61的氨基酸序列构成的本发明的蛋白或肽被抑制的靶基因，特别是用于制备[S,S]-EDDS的生物合成基因。关于所述生物合成基因的核酸序列，参考上文说明书中所述的序列。
在另一个方面中，本发明涉及分离的核酸，其优选地编码对于抑制或压制[S,S]-EDDS的生物合成具有功能性的，即实现这样的抑制或压制的蛋白或肽。
所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码包含或由根据SEQ ID No. 61的氨基酸序列构成的本发明的蛋白或肽的核酸序列；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列；和
d）编码与根据SEQ ID No. 61的氨基酸序列具有至少55%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性的同源蛋白或肽的核酸序列。
此外，本发明涉及分离的核酸，其优选地编码对于抑制或压制[S,S]-EDDS的生物合成具有功能性的，即实现这样的抑制或压制的蛋白或肽，且包含或由根据SEQ ID No. 62的核酸序列构成。
可选地，所述核酸可以是同源核酸，其与先前段落提及的核酸序列具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性。
此外，本发明包括分离的蛋白或肽，其优选对于抑制或压制[S,S]-EDDS的生物合成具有功能性，即实现这样的抑制或压制，且通过包含或由根据SEQ ID No. 62的核酸序列的基因或开放阅读框的表达来制备。
可选地，所述蛋白或肽可通过与先前段落提及的核酸序列具有至少65%，特别是至少75%，优选至少85%，特别优选至少95%，最优选至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性的同源基因或开放阅读框的表达来制备。
在另一个方面中，本发明涉及人工或重组的，即通过基因技术制备的表达载体，即用于将至少一种核酸转移到受体或宿主细胞中的媒介物，其在基因表达的范围内表达由所述至少一种核酸编码的至少一种蛋白或肽。
所述表达载体包含至少一种本发明的核酸。然而，可优选的是，该表达载体不含有包含或由根据SEQ ID No. 62的序列构成或包含其同源序列的本发明核酸。
可选地，所述表达载体可以包含本发明的基因簇或操纵子或整合元件。
所述表达载体基本上可以是质粒或粘粒。优选的是如下质粒或粘粒，其可被整合到放线菌的染色体中或以可复制的质粒或粘粒的形式存在于细胞中并包含相应的组成型或诱导型（可调节）启动子。
在一个优选的实施方案中，所述表达载体是pRM家族的质粒，特别是pRM4型质粒，其中插入了至少一种本发明的核酸或本发明的基因簇。
根据一个特别优选的实施方案，所述表达载体包含不具有锌抑制的启动子（无锌抑制的启动子），即不经历锌调节的启动子。
所述启动子基本上可以是组成型或诱导型（可调节）启动子。优选地，所述启动子是强大组成型表达或诱导型的启动子，其替代存在于细胞内的Zur靶向启动子。在该情况中，本发明的核酸或基因簇的表达在非锌依赖性启动子的控制下是特别有利的。所述启动子特别不具有对于根据 SEQ ID No. 61的本发明蛋白的结合位点。不具有锌抑制的优选启动子是例如启动子ermE（红霉素抗性基因启动子，PermE）。
在一个优选的实施方案中，表达载体包含本发明的核酸，其中该核酸包括或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其组合。
特别优选的核酸序列可选自SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQID No. 54及其组合。
本发明的表达载体适合于进行同源表达且也适合于进行异源表达。
关于所述表达载体，特别是本发明的核酸以及本发明的基因簇和操纵子的其它特征和优点，完全引用上文说明书。
在另一个方面中，本发明涉及人工或重组的，即通过生物技术制备的宿主细胞。
所述宿主细胞优选是产生[S,S]-EDDS的宿主细胞。
所述宿主细胞的特征在于其包含至少一种本发明的核酸。可选或组合地，所述宿主细胞的特征还在于其包含至少一种本发明的蛋白或肽。
可选或组合地，所述宿主细胞特征还在于其包含本发明的基因簇或操纵子。
可选或组合地，所述宿主细胞的特征还在于其包含根据本发明的表达载体。可选或组合地，所述宿主细胞可包含由于所述载体（或载体基因组）的至少部分，特别是完全插入而以修饰形式存在的基因组。
就[S,S]-EDDS的生物合成而言优选的是，在宿主细胞中不允许锌抑制。
特别优选地，所述宿主细胞不包含编码Zur蛋白的核酸，特别是不包含根据核酸序列SEQ ID No. 62的核酸或其同源核酸，和/或不包含Zur蛋白，特别是不包含根据氨基酸序列SEQ ID No. 61的蛋白或肽或其同源蛋白或肽。
所述宿主细胞基本上是真核细胞或原核细胞。
此外，所述宿主细胞可以是同源或异源宿主细胞。
所述宿主细胞可特别选自：细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。
在一个进一步的实施方案中，所述宿主细胞是格兰仕阳性菌，优选是拟无枝酸菌属或链霉菌属的细菌，特别优选是日本拟无枝酸菌或天蓝色链霉菌物种的细菌。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞可以借助转化、转导、转染或接合特别通过使用本发明的表达载体来制备或可制备。
如先前段落提及的用于将特别是DNA和RNA的（外源）核酸引入真核和原核细胞的技术是本领域技术人员基本熟知的。它们是分子遗传学的基本程序。关于详细描述，因此参考相关技术文献（例如，Mülhardt C., Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics (2008); Spektrum Verlag, 第6版；或Kieser T.等人, PracticalStreptomyces Genetics (2000)；John Innes Foundation;或Green和Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2012)；Cold Spring Harbor Laboratory,第4版）。
关于所述宿主细胞，特别是本发明的核酸，本发明的基因簇和操纵子，本发明的蛋白或肽和本发明的表达载体的其它特征和优点，完全引用上文说明书。
本发明的另一个方面涉及人工或重组的，即通过生物技术制备和优选产生[S,S]-EDDS的细菌细胞，优选是拟无枝酸菌属，特别是日本拟无枝酸菌物种的细菌细胞。
所述细菌细胞的特征在于，其不表达包含或由根据氨基酸序列SEQ ID No. 61构成的蛋白或肽和/或不含有包含由根据核酸序列SEQ ID No. 62构成的核酸。
本发明的细菌细胞可特别地通过将包含或由根据核酸序列SEQ ID No. 62构成的核酸从该细菌细胞的基因组，特别是野生型基因组中至少部分，优选完全地缺失来制备或可制备。在此，所述缺失可由转化、转导、转染或接合产生。也就是说，本发明的细菌细胞可优选是缺失突变体。替代本段落中提及的缺失，还可考虑碱基对的交换、点突变和/或通过插入的失活。
此外，本发明的细菌细胞还可通过将包含或由根据核酸序列SEQ ID No. 62构成的核酸以例如质粒或基因盒的形式插入细菌细胞的基因组，特别是野生型基因组来制备或可制备。
关于所述细菌细胞，特别是先前段落中提及的核酸和先前段落中提及的蛋白或肽的其它特征和优点，全部引用上文说明书。
本发明的另一个方面设计人工或重组的，即通过基因技术制备的载体，其用于从拟无枝酸菌属，优选日本拟无枝酸菌的细菌细胞的基因组，特别是野生型基因组中产生核酸的缺失（缺失载体），其中被缺失的核酸包含或由根据核酸序列SEQ ID No. 62构成。
所述载体的特征在于，其包含至少一种在细菌细胞基因组中相对于根据SEQ IDNo. 62的核酸序列而言设置在上游的核酸序列，和/或至少一种在细菌细胞基因组中相对于根据SEQ ID No. 62的核酸序列而言设置在下游的核酸序列，但不包含根据SEQ ID No.62的核酸序列。
根据一个优选的实施方案，所述至少一种设置在上游的核酸序列和/或至少一种设置在下游的核酸序列（分别）是与要被缺失的根据SEQ ID No. 62的核酸序列直接相邻的序列。优选地，所述至少一种设置在下游的核酸序列是根据SEQ ID No. 63的序列，而至少一种设置在上游的序列是根据SEQ ID No. 64的序列。
关于所述至少一种设置在上游的核酸序列和/或至少一种设置在下游的核酸序列，进一步优选的是它们（分别）包含至少300个，优选至少500个，特别是至少1000个，最优选至少1500个核苷酸。
根据SEQ ID No. 62的核酸序列的缺失特别有利地导致[S,S]-EDDS的生物合成不依赖于锌，因为能结合锌的抑制蛋白Zur不再能被表达。
缺失载体的进一步的特征和优点全部引用上文说明书。
在另一个方面中，本发明涉及生物合成[S,S]-EDDS的方法，其包括以下步骤：
a）培养本发明的产生[S,S]-EDDS的宿主细胞和/或细菌细胞，和
b）从该细胞和/或用于该细胞的培养基中提纯[S,S]-EDDS。
在一个优选的实施方案中，通过将本发明的缺失载体引入细菌细胞，特别是野生型细菌细胞来制备所述细菌细胞。所述载体的引入可通过转化、转导、转染或接合进行。
根据另一个实施方案，所述宿主细胞通过将本发明的表达载体引入该细胞来制备。
优选地，通过将本发明的表达载体引入拟无枝酸菌属，特别地日本拟无枝酸菌物种的细菌细胞，制备所述宿主细胞。
在一个可选实施方案中，通过将本发明的表达载体引入链霉菌属，特别是天蓝色链霉菌物种的细菌细胞，制备所述宿主细胞。
在本发明方法的范围内所用细胞的培养可以使用本领域技术人员本身熟知的标准方案进行。
取决于所用宿主细胞或细菌细胞，可有利的是，在无锌，特别是无锌盐的条件下培养所述宿主细胞或细菌细胞。
根据本发明可设定，向用于培养的培养基添加至少一种用于生物合成[S,S]-EDDS的前体化合物。合适的前体化合物的实例基本上可为蛋白原和/或非蛋白原氨基酸。合适的前体化合物可特别选自L-鸟氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、2,3-二氨基丙酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸及其组合。
根据本发明还可设定，在提纯[S,S]-EDDS前首先对产生的[S,S]-EDDS进行浓度确定。这例如可通过HPLC（高效液相层析）、UV/VIS光谱或两种技术的组合进行。
对于[S,S]-EDDS的进一步提纯，可进行分离固体（细胞）成分的分离步骤。在此之后，可借助离子交换剂吸附与随后的沉淀结晶进行[S,S]-EDDS的分离。
这种方法是现有技术熟知的。是否[S,S]-EDDS存在于胞内并例如还必须通过细胞裂解才可得或是否其从输出系统分泌到上清液，这对于提纯基本不重要。
关于本方法，特别是本发明的核酸，本发明的基因簇和操纵子，本发明的蛋白或肽以及本发明的载体，特别是本发明的缺失载体和表达载体的其它特征和优点全部引用上文说明书。
在另一个方面中，本发明涉及用于生物合成[S,S]-EDDS的试剂盒，其包含至少一种选自以下的组分：至少一种本发明的蛋白或肽、至少一种本发明的核酸、本发明的基因簇或操纵子、本发明的载体（表达载体和/或缺失载体）、本发明的宿主细胞、本发明的细菌细胞及其组合。
任选地，所述试剂盒可包含选自以下的附加组分：培养基、缓冲液及其组合。
关于所述试剂盒，特别是本发明的核酸，本发明的基因簇和操纵子，本发明的蛋白或肽以及本发明的载体，特别是本发明的缺失载体和表达载体的其它特征和优点，同样全部引用上文说明书。
本发明的其它特征和优点通过下文给出的实例连同附图和从属权利要求变得显而易见。特别地，通过对[S,S]-EDDS生物合成基因簇的鉴定和注释的描述更详细地描述本发明。在实施方案中，本发明的单个特征可单独或与多个其它特征组合着实现。
附图描述
图1显示了推定的[S,S]-EDDS生物合成途径的示意图。(A) [S,S]-EDDS生物合成途径。(I) 提供Dap前体；将L-丝氨酸与作为氨基供体的L-鸟氨酸和作为辅因子的PLP进行转化，并释放L-脯氨酸。Dap与草酰乙酸反应生成IM1。（II）使L-天冬氨酸和L-丝氨酸在作为辅因子的PLP的存在下反应生成IM1。(B) 双效菌素（Zwittermycin） A的化学结构（左）。虚线框表示Dap基本单元。Dap的生物合成途径（右）通过双效菌素A5A（ZWA5A，半胱氨酸合成酶的同系物）和双效菌素A5B（ZWA5B，鸟氨酸环化脱氨酶的同系物）的一致协同作用来催化。
图2 显示了具有相应生物合成基因和所属基因簇的[S,S]-EDDS生物合成途径。(A) [S,S]-EDDS生物合成基因簇的基因组成。N-乙酰转移酶（SEQ ID No. 40 (orf1658)）、半胱氨酸加双氧酶（SEQ ID No. 42 (orf1659)）、HTH-型转录调节因子（SEQ ID No. 44(orf1660)）、酰胺酶（SEQ ID No. 46 (orf1661)）、鸟氨酸环化脱氨酶（SEQ ID No. 48(orf1662)）、二氨基庚二酸脱羧酶（SEQ ID No. 50 (orf1663)）、Dap合酶（SEQ ID No. 52(orf1664)）和多药运出转运蛋白（SEQ ID No. 54 (orf1665)）。(B) 通过将L-丝氨酸与作为氨基供体的L-鸟氨酸和作为辅因子的PLP进行转化，通过鸟氨酸环化脱氨酶和Dap合酶的协同作用催化，提供Dap的前体。(C) 将Dap前体化合物和两个草酰乙酸装配成为[S,S]-EDDS。箭头标记了基因簇(A)的相应基因。
图3 显示了使用RT-PCR获得的日本拟无枝酸菌中[S,S]-EDDS生物合成基因簇的痕量金属依赖型转录模式。使用sigB作为管家基因以将RNA规范化。由在不存在任何痕量元素（-）或添加有25 µM Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+或Mn2+溶液的特定培养基中培养的培养物获得RNA。在10 h和70 h温育后提取样品。
图4 显示了日本拟无枝酸菌WT（野生型）和日本拟无枝酸菌突变体Δorf1662-64在M7培养基中培养72 h后的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S,S]-EDDS标准品[350 mg/L]。（中）日本拟无枝酸菌WT。（下）日本拟无枝酸菌Δorf1662-64。（右）[S,S]-EDDS的特异性UV/VIS光谱。
图5 显示了天蓝色链霉菌WT和天蓝色链霉菌pTWPL1-EDDS在M7培养基中培养72 h后的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S,S]-EDDS标准品[350 mg/L]。（中）天蓝色链霉菌WT。（下）天蓝色链霉菌pTWPL1-EDDS。（右）[S,S]-EDDS的特异性UV/VIS光谱。
图6 显示了天蓝色链霉菌Zur（ZurSC）和日本拟无枝酸菌ORF5768（SEQ ID No. 62）的氨基酸序列比对。（上）ZurSC单体：DNA 结合结构域N（残基1-77）无下划线；铰链环（残基78-85）实线下划线；二聚结构域C（残基86-139）虚线下划线。通过星号（*）标记相同的氨基酸；通过圆圈（°）标记相似的残基。锌结合位点：箭头：ZurSC：D65、C79、H85、H87和ORF5768：D70、C84、H89和H91。M位点中的相对aa距离的偏差（标记为M）。D-位点（标记为D）：ZurSC：H84、H86、E105、H122和ORF5768：H88、H90、E109、H126。C-位点（标记为C）：ZurSC：C90、C93、C130、C133和ORF5768：C94、C97、C134、H137。
图7 显示了天蓝色链霉菌和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）MntABC与日本拟无枝酸菌同系物的BLAST比对。(A) 天蓝色链霉菌znuABC，日本拟无枝酸菌的操纵子样结构orf3699、orf3700、orf3702和orf6504、orf6505、orf6506的基因组织。(B) 氨基酸序列比对，（上）ORF3699、ORF3700和ORF3702；（下）ORF6504、ORF6505和ORF6506；对比天蓝色链霉菌ZnuABC（左）；对比枯草芽孢杆菌MntABC（右）。X/X = % 同一性/相似性。
图8 显示了使用RT-PCR获得的日本拟无枝酸菌的金属摄取系统的痕量金属依赖型转录模式。使用sigB作为管家基因以将RNA规范化。由在不存在任何痕量元素（-）或添加有25 µM Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+或Mn2+溶液的特定M7培养基中培养的培养物获得RNA。在温育10 h和70 h后提取样品。选择orf3700和orf6504作为探针以代表整个操纵子样结构。
图9 显示了所用EMSA-DNA探针的示意图。（上）日本拟无枝酸菌（orf3699 –orf3702）的znuABC基因座。（下）[S,S]-EDDS生物合成基因簇orf1658 – orf1665（对应于SEQ ID No. 40、42、44、46、48、50、52、54）。使用开放圆圈标记具有ZurAJ结合位点的启动子区域，且用于测试His-ORF5768结合的EMSA探针通过黑线说明。
图10 显示了EMS测定的结果（根据溴化乙锭染色的聚丙烯酰胺凝胶）：提纯的His6-ORF5768与启动子区域的锌依赖性结合。具有不同移动性的两个明确的结合情况被称为CF（快速移动复合体）和CS（缓慢移动复合体）。将sigB-RT片段添加到结合混合物以确认结合复合体的特异性。将不同浓度的提纯的His6-ORF5768与大约35 nM DNA探针在存在或不存在锌（ZnSO4）下温育。(A) 使用znuCB探针的结合测定（参见图9）。由CF带表示的结合情况。(B) 使用基因间orf1661/62探针的结合测定（参见图9）。由CF和CS带表示的两个结合情况。(C) 使用orf1658启动子探针和提升的His-ORF5768浓度的结合测定（cf图9）。(D) 使用基因间orf1659/60启动子探针的结合测定（参见图9）。由CS带表示的结合情况。
图11 显示了缺失载体pGusA21Δorf5768的示意图。（上）orf5768（对应于SEQ IDNo. 62）和周围基因。（下）pGusA21Δorf5768。左侧条：orf5768的5'侧区域；右侧条：orf5768的3'侧区域。
图12 显示了在直接转化后将pGusA21Δorf5768整合到日本拟无枝酸菌基因组中的证实。(A) pGusA21Δorf5768整合的基于PCR的证实。期望的WT概况：1677 bp（orf5768-SCO-wt-Frag）；期望的整合的pGusA21Δorf5768概况：1263 bp（orf5768-SCO-单-Frag）。wt：野生型gDNA模板；P：分离的pGusA21Δorf5768模板。(B) 借助Gus报告系统搜索具有丢失的pGusA21Δorf5768的日本拟无枝酸菌克隆。蓝色菌落的基因组具有整合的pGusA21Δorf5768质粒，而未染色的菌落丢失了它。
图13 显示了在M7培养基中培养72 h后添加和不添加6 µM ZnSO4的日本拟无枝酸菌WT和日本拟无枝酸菌Δzur（对应于ΔSEQ ID No. 62）的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S,S]-EDDS标准品[350 mg/L]。（自上而下第2和第3）日本拟无枝酸菌WT -/+ 6 µMZnSO4。（下）日本拟无枝酸菌Δzur -/+ 6 µM ZnSO4。（右）[S,S]-EDDS的特异性UV/VIS光谱。
图14 显示了载体pRM4-PermE*orf1662-65的结构示意图。（上）[S,S]-EDDS基因簇orf1658-1665（对应于SEQ ID No. 40、42、44、46、48、50、52和54）。（下）在质粒图中的同系物表达载体pRM4-PermE*orf1662-65的说明（在PermE*控制下的orf1662至orf1665）。灰色条：操纵子orf1662至orf1665。
图15 显示了在添加有6 µM ZnSO4的M7培养基中培养72 h后日本拟无枝酸菌WT和日本拟无枝酸菌 + pRM4-PermE*orf1662-65的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S,S]-EDDS标准品[350 mg/L]。（中）日本拟无枝酸菌WT + 6 µM ZnSO4。（下）日本拟无枝酸菌pRM4-PermE*orf1662-65+ 6 µM ZnSO4。（右）[S,S]-EDDS的特异性UV/VIS光谱。
图16 显示了在添加有6 µM ZnSO4的M7培养基中培养72 h后天蓝色链霉菌+pTWPL1-EDDS的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S,S]-EDDS标准品[350 mg/L]。（中）天蓝色链霉菌+ pTWPL1-EDDS - 6 µM ZnSO4。（下）天蓝色链霉菌+ pTWPL1-EDDS + 6 µM ZnSO4。（右）[S,S]-EDDS的特异性UV/VIS光谱。
实施例部分
1. [S,S]-EDDS生物合成的说明
产生[S,S]-EDDS的细菌物种日本拟无枝酸菌的基因组在本发明的范围中被测序。日本拟无枝酸菌的基因组包含大约9.18 MB且包含8674个预测的开放阅读框（orf）。根据用于快速鉴定、注释和分析用于次生代谢物的生物合成基因簇的Webtool Antibiotics andSecondary Metabolite Analysis Shell（antiSMASH）（(Medema 等人, 2011, NucleicAcids Res (2011); 39:14；和Blin 等人, Nucleic Acids Res (2013); 1-9），日本拟无枝酸菌的基因组包含26个用于次生代谢物的单独基因簇。所述簇含有用于产生源自6个NRPS（非核糖肽合成酶）、6个I型PKS（聚酮合酶）、2个I型PKS/NRPS杂交体和1个III型PKS/NRPS杂交体（用于产生糖肽）连同4个萜烯、依克多因、氨基糖苷类和L-抗生素的次生代谢产物的生物合成潜力。
首先假设[S,S]-EDDS的假设的生物合成途径（图1），其中非蛋白质氨基酸2,3-L-二氨基丙酸（Dap）可以是假设的[S,S]-EDDS前体化合物。Dap尤其是在通过酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）生物合成紫霉素和在通过苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）生物合成双效菌素A时的次生代谢物。两种合成途径均被说明（Thomas 等人, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830 和Zhao 等人, FEBS Lett (2008); 528(20): 3125-3131）。
对于苏云金芽孢杆菌和酒红链霉菌表明，特异性地提供Dap用于双效菌素A和紫霉素的生物合成。Dap在双效菌素和紫霉素的生物合成期间通过L-丝氨酸与作为氨基供体的L-鸟氨酸的转化来形成（图1）。该反应通过Dap合酶（VioB/ZWA5A）和鸟氨酸环化脱氨酶（VioK/ZWA5B）的协同作用来催化，其中需要磷酸吡哆醛（PLP）作为辅因子（Thomas 等人,Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830; 和Zhao 等人,FEBS Lett (2008); 528(20): 3125-3131）。
使用BLAST（局部序列排比检索基本工具，申请提交日期时可用的版本）和VioB/ZWA5A和VioK/ZWA5B的氨基酸序列进行日本拟无枝酸菌基因组的扫描，表明了相互直接邻近的基因所编码的同系物蛋白的存在。因此，根据 SEQ ID No. 52的核酸编码352个aa大小的蛋白且与VioK和ZWA5B展示出32/45 %、26/44 %的aa同一性/相似性。SEQ ID No. 48编码327个aa大小的蛋白且与VioK和ZWA5B展示出25/39 %、21/40 %的aa同一性/相似性。位于中间的SEQ ID No. 50被称为二氨基庚二酸脱羧酶且SEQ ID No. 54被称为多药运出转运蛋白。SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54展示了重叠的基因排列且推测被编码为转录单元（图2）。
根据SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43和SEQ ID No. 45的蛋白或肽在上文提及的操纵子样组织的基因的5'-端上游被编码且称为N-乙酰转移酶、半胱氨酸加双氧酶、HTH型转录调节因子和酰胺酶（图2）。
基于上文确定的同系物做出以下假设：
- 作为[S,S]-EDDS生物合成的第一个步骤，根据SEQ ID No. 47和SEQ ID No. 51的蛋白或肽协同地催化Dap前体的合成（图2）。
- Dap与草酰乙酸缩合成为中间体化合物IM 1是由根据SEQ ID No. 39的蛋白或肽（根据SEQ ID No. 40的核酸：被称为N-乙酰转移酶）催化的。
- 随后的脱羧化是由根据SEQ ID No. 49的蛋白或肽（SEQ ID No. 48：被称为二氨基庚二酸脱羧酶）催化的。
- 使用草酰乙酸的重新乙酰化又是由根据SEQ ID No. 39的蛋白或肽进行。
- 最终还原是由根据SEQ ID No. 41的蛋白或肽（SEQ ID No. 42：被称为半胱氨酸双加氧酶）催化的。
- 为了分泌的目的，[S,S]-EDDS必须进一步通过细胞膜被转位。 该输出是由假设的根据SEQ ID No. 53的多药运出转运蛋白介导的（图2）。
为了证实所鉴定的区域确实负责[S,S]-EDDS的生物合成，利用[S,S]-EDDS生物合成的锌抑制。因为[S,S]-EDDS仅在基本无锌条件下形成（2 µM的锌浓度就已导致[S,S]-EDDS合成的完全中断（Cebulla I., 论文(1995), Tübingen大学），假设的生物合成基因的转录模式在存在锌和不存在锌的情况下通过RT-PCR（实时聚合酶链式反应）确定（图3）。
包含根据SEQ ID No. 48和SEQ ID No. 52的核酸序列的假设的Dap合成基因、根据SEQ ID No. 50的中间序列和根据SEQ ID No. 54的序列仅在不存在锌的培养期间被表达（[S,S]-EDDS形成），然而在存在锌的情况下不被表达。没有发现通过其它二价金属离子对这些基因的抑制。根据SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44和SEQ ID No. 46的核酸显示了相同的转录模式，其不受锌影响（图3）。
如此鉴定的假设的[S,S]-EDDS生物合成的操纵子（SEQ ID No. 48、50、52和54）展示了锌依赖性转录。
为了证明受锌严重影响的根据SEQ ID No. 48、50和52的基因在合成[S,S]-EDDS中的参与，进一步产生具有SEQ ID No. 48、50和52编码区的框架内缺失的突变体。
产生了总共12个具有SEQ ID No. 48、50和52编码区的框架内缺失的日本拟无枝酸菌突变体（日本拟无枝酸菌ΔSEQ ID No. 48、50和52）。日本拟无枝酸菌野生型（日本拟无枝酸菌WT）和产生的全部突变体在EDDS生产培养基中培养（表1）。
表1：培养基，缓冲液。
在日本拟无枝酸菌WT菌株在所选条件下形成[S,S]-EDDS时，12个突变体中没有一个还能合成[S,S]-EDDS（图4）。
还能证明的是，包含或由根据SEQ ID No. 48、50和52的核酸序列构成的操纵子结构对于在日本拟无枝酸菌中生物合成[S,S]-EDDS是必需的。
为了证明所鉴定的基因簇含有生物合成[S,S]-EDDS的全部所需遗传信息，将包含全部基因簇的粘粒在天蓝色链霉菌中异源表达。该粘粒（pTWPL1-EDDS）包含根据SEQ IDNo. 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58的基因和根据SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 60的部分（表2）。
表2：先前未描述的日本拟无枝酸菌的30个基因。
天蓝色链霉菌野生型菌株（天蓝色链霉菌WT）和具有整合到基因组的粘粒pTWPL1-EDDS的天蓝色链霉菌菌株（天蓝色链霉菌-pTWPL1-EDDS）在EDDS 生产培养基中培养。天蓝色链霉菌WT菌株不能在所选条件下产生[S,S]-EDDS，而天蓝色链霉菌-pTWPL1-EDDS在无锌的EDDS 生产培养基中产生了可检测量的[S,S]-EDDS（图5）。
通过天蓝色链霉菌-pTWPL1-EDDS形成[S,S]-EDDS，表明了对于[S,S]-EDDS生物合成所需的全部酶在基因区域orf1640-1667或SEQ ID No. 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58中被编码。
2. [S,S]-EDDS生物合成的锌抑制的说明
总（global）金属调节蛋白家族的Fur（铁摄取调节因子）家族是以大肠杆菌（E. coli ）的铁摄取调节因子命名的（Hantke K., Mol Gen Genet (1981); 182(2): 288-292和Bagg & Neilands, Biochemistry (1987); 26: 5471-5477）。除铁选择性的Fur外，在Fur家族具有多种多样的金属选择性和生物学功能。其中例如包括锌（Zur）、镁（Mur）和镍（Nur）传感因子。
Fur蛋白通常是转录抑制因子，当与其同源金属离子效应物（例如，铁结合的Fur被称为holoFur）结合时，它们结合相应的操纵基因-DNA-序列，从而阻止RNA聚合酶的接近，这导致抑制下游基因的表达（Lee & Helmann, Nature (2006); 440(7082):363-367）。无金属的蛋白（例如，apoFur）基本上对相关的操纵基因序列具有低或可忽略的亲和性，这导致靶基因的脱抑制。
Fur家族成员在生理上用作Zn(II)离子的传感因子的能力在低GC含量的革兰氏阳性枯草芽孢杆菌（ZurBS）中和在γ-变形菌门大肠杆菌（ZurEC）中同时被发现（Gaballa &Helmann, J. Bacteriol. (1998); 180:5815-21和Patzer & Hantke, Mol Microbiol(1998); 28:1199-1210）。随后，基因组分析实现了在多种其它细菌中可能的Zur调节子的暂时性分配（Zuordnung），这展示出由Zur介导的锌摄取调节在细菌界的扩展（Panina 等人, Proc Natl Acad Sci USA (2003 Aug 19); 100(17):9912-7）。与此同时，除ZurBS和ZurEC外，Zur蛋白的多重性已在被生化表征，诸如从革兰氏阴性鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）（ZurYP）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）（ZurSE）和野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）（ZurXC）、低GC含量的革兰氏阳性厚壁菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ZurSA）、猪链球菌（Streptococcus suis）（ZurSS）和李斯特单核细胞增生菌（Listeria monocytogenes）（ZurLM）和高GC含量的革兰氏阳性放线菌结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）（ZurMT）、白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）（ZurCD）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）（ZurCG）和天蓝色链霉菌（ZurSC）（Li 等人, BMC Microbiol. (2009 Jun 25); 9:128；Feng 等人, JBacteriol. (2008); 190(22): 7567-78；Lindsay & Foster, Microbiology (2001),147, 1259-66；Campoy 等人, Infect. Immun. (2002); 70: 4721-5；Garrido等人,FEMSMicrobiol. Lett. (2003); 221:31-37；Tang 等人, Mol. Plant-MicrobeInteract. (2005); 18: 652-8；Maciag 等人, J Bacteriol. (2007): 189(3): 730-40；Shin 等人, Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7；Dalet 等人., FEMSMicrobiol. Lett (1999); 174:111-6；Schröder 等人, BMC Genomics (2010); 11: 12和Smith 等人, J Bacteriol. (2009); 191(5): 1595-603）。
其活性由相同调节因子控制的一组基因被称为调节子。在受Zur蛋白控制下的调节子包含编码锌获取功能的基因，例如具有高亲和性的锌摄取系统（znuABC）、核糖体蛋白的假设的Zinkophor和无锌的旁系同源。这些基因通过锌结合的holoZur蛋白在富锌条件下的结合被抑制，且通过DNA的无锌的apoZur蛋白的分解而脱抑制。
天蓝色链霉菌，高GC含量放线菌的模式生物体，尤其使用Fur家族的四种生化表征的蛋白（FurASC、CatRSC、NurSC和ZurSC）调节金属体内平衡和过氧化物压力应答（Hahn 等人, J Bacteriol. (2000); 182(13): 3767-74；Ahn 等人, Mol. Microbiol. (2006);59:1848-58和Shin 等人, Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7）。
具有天蓝色链霉菌的四种不同Fur家族蛋白的aa序列的日本拟无枝酸菌的BLAST分析展示了日本拟无枝酸菌基因组编码三种Fur家族蛋白同系物，其根据核酸序列orf1667（对应于SEQ ID No. 58）、orf3462和orf5768（对应于SEQ ID No. 62）被编码。
Fur家族同系物ORF1667（对应于SEQ ID No. 57）和ORF3462与天蓝色链霉菌FurASC非常相似（62/75%和67/79%的aa同一性/相似性）。天蓝色链霉菌FurASC参与对过氧化物压力的适应性应答和进行对具有furASC基因自身和catC的操纵子的负调节，其编码过氧化氢酶-过氧化物酶（Hahn 等人, J Biol Chem. (2000); 275(49): 38254-60）。
具有根据SEQ ID No. 61的氨基酸序列的第三个Fur家族同系物蛋白与天蓝色链霉菌ZurSC非常相似，且与其展示出67/85%的aa同一性/相似性（图6）。
生化表征的天蓝色链霉菌的ZurSC和由根据SEQ ID No. 62（或orf5768）的核酸序列编码的日本拟无枝酸菌同系物（ZurAJ）的高度相似性暗示了根据SEQ ID No. 61的蛋白或肽是日本拟无枝酸菌的锌敏感性（zinksensitiv）Fur家族蛋白，其介导相应靶基因的锌依赖性抑制。
ZurSC是天蓝色链霉菌中具有高度亲和性的锌摄取系统（ZnuABC）的负调节因子（Shin 等人, Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7）。具有天蓝色链霉菌ZnuABC的氨基酸序列的日本拟无枝酸菌基因组的BLAST分析展示了由orf3699、orf3700和orf3701与orf6504、orf6505和orf6506编码的两个同系物系统（图7）。
熟知的是天蓝色链霉菌的znuABC操纵子的表达被ZurSC严重抑制，其中锌是辅因子（Shin 等人, Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7）。因此，为了确认这两个假设的锌摄取系统中哪一个在日本拟无枝酸菌中介导了高亲和性的锌摄取，根据锌以及各种其它金属的存在来检验作为整个系统的代表的orf3700和orf6504的转录（图8）。
在金属不足以及在铁、镍、钴的存在下（但无锌的存在下）表达DNA区域orf3700（图8）。该转录模式清楚地显示在日本拟无枝酸菌中orf3700被严重且仅由锌介导的抑制。由此可得出结论，即由rf3699、orf3700和orf3702编码的摄取系统是日本拟无枝酸菌的具有高亲和性的锌摄取系统（ZnuABC）。
为了证明根据SEQ ID No. 61的ZurSC同系物蛋白（由SEQ ID No. 62编码）是日本拟无枝酸菌的对锌反应性Fur家族蛋白，且介导锌摄取系统（znuABC）和假设的[S,S]-EDD生物合成基因的锌依赖性抑制，进行亲和电泳法研究（EMS测定，电泳迁移率变动分析）。
使用锌抑制基因orf3700和orf1662（对应于SEQ ID No. 46）位于5'-端上游的启动子区域和还使用在假设的[S,S]-EDDS生物合成基因簇（orf1658上游区域，orf1659和orf1660基因间区、orf1661和orf1662基因间区）中所预测的全部其它启动子区域（依赖于作为辅因子的锌），分析根据SEQ ID No. 61的蛋白或肽的结合。
为了研究同系物锌摄取调节因子ORF5768（ZurAJ，对应于SEQ ID No. 61）通过结合相应启动子区域（开放圆圈，图9）是否介导orf3700、orf1662和[S,S]-EDDS生物合成基因簇内其它基因的锌依赖性抑制，进行EMS测定（电泳迁移率变动分析）或还有条带移位分析。对此，为同系物锌摄取调节因子ORF5768标记组氨酸6-标签，将其提纯并分离。同样提供应被作为假定的受锌调节的启动子而研究（开放圆圈，图9）的相应DNA序列（启动子序列）。
通过将启动子序列（约35 nM）使用不同量的His6-ORF5768在10 µl 结合缓冲剂（表1）中在添加或不添加锌的情况下在29 ℃下温育20分钟，进行所述结合反应。为了排除His6-ORF5768的非特异性结合，添加的sigB-RT片段（258 bp）作为阴性对照（图10）。
因此，可使用EMSA确认His6-ORF5768与代表znuABC-启动子区域以及orf1659-60和orf1661-62启动子区域的EMSA探针的锌依赖性结合（即在锌的存在下）。没有检测到与orf1658启动子区域的结合（图10）。
3. 锌脱抑制的[S,S]-EDDS生产菌株的产生
为了产生日本拟无枝酸菌的锌脱抑制的[S,S]-EDDS生产菌株，遵循三个不同的策略：
（1）将锌摄取调节因子基因 （并因此是抑制蛋白Zur）SEQ ID No. 62缺失。
（2）在无锌抑制的启动子的控制下表达[S,S]-EDDS生物合成基因。交换Zur靶向启动子。
（3）[S,S]-EDDS生物合成基因在不再存在锌抑制的宿主细胞中的异源表达。
3.1锌摄取调节因子基因SEQ ID No. 62的缺失
在假定[S,S]-EDDS生物合成基因受使用锌作为辅因子的ZurAJ（ORF5768和根据SEQID No. 61的蛋白或肽）抑制的情况下，进行根据SEQ ID No. 62的编码区的缺失，以产生锌脱抑制的[S,S]-EDDS生产菌株。
为了通过同源重组实现根据SEQ ID No. 62（对应于orf5768）的编码区的框架内缺失，构建了含有orf5768的上游和下游区域的缺失载体pGusA21Δorf5768，其与pGusA21-us1662+ds1664（AG Stegmann）相似。从大肠杆菌ET12567中获得非甲基化的阴性pGusA21Δorf5768，且用于日本拟无枝酸菌的直接转化（图11）。
将在使用非甲基化的pGusA21Δorf5768转化后获得的日本拟无枝酸菌的阿泊拉霉素抗性菌落转移至HA平板。使用X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基-ß-D-葡糖苷酸）溶液覆盖生长菌落，且选择蓝色菌落（图12，对报告基因gusA：克隆1、6、7、8和12为阳性）以通过PCR进一步检验单交换的情况。
分离所述克隆的基因组DNA，并且通过PCR检验质粒单交换至日本拟无枝酸菌基因组的情况中的阿泊拉霉素抗性盒的存在并使用引物特异性地导出，以证明pGusA21Δorf5768整合至基因组。使用orf5768-SCO-FP和orf5768-SCO-RP的引物对将具有1677 bp的片段（orf5768-SCO-wt-Frag）和/或具有1293 bp的片段（orf5768-SCO-单Frag）扩增，这些片段代表野生型基因组和具有整合的pGusA21Δorf5768的基因组（图12）。
将具有整合至基因组的pGusA21Δorf5768的日本拟无枝酸菌的克隆（克隆1、6、7和8）联合，并用于诱导双交换（同源重组），其中这些细胞在温度负荷下培养。
在编码区SEQ ID No. 62的框架内缺失下总共产生日本拟无枝酸菌（日本拟无枝酸菌Δzur）的三种突变体。日本拟无枝酸菌WT和产生的全部突变体在EDDS生产培养基中培养（参见表1）。在富锌条件下日本拟无枝酸菌WT菌株不形成[S,S]-EDDS，而三种突变体不再表现出锌抑制（图13）。
还可证实，日本拟无枝酸菌的对锌应答性抑制因子（ZurAJ或根据SEQ ID No. 62的核酸）的缺失导致不依赖于锌的[S,S]-EDDS生产。
3.2 [S,S]-EDDS生物合成基因在无锌抑制的启动子控制下的表达
用于产生锌脱抑制的[S,S]-EDDS生产菌株的第二个策略设定，通过用相对强大组成型表达或诱导型的启动子交换Zur靶向启动子，避免由Zur（根据SEQ ID No. 61的蛋白或肽）介导的锌抑制。为此选择已知的组成型表达的启动子PermE*，以在其控制下表达[S,S]-EDDS-操纵子（SEQ ID No. 48、50、52和54，对应于orf1662-65）。将产生的质粒pRM4-PermE*orf1662-65转移至日本拟无枝酸菌WT，且由此获得日本拟无枝酸菌+ pRM4-PermE*orf1662-65（图14）。
日本拟无枝酸菌WT和日本拟无枝酸菌+ pRM4-PermE*orf1662-65随后在添加有6µM ZnSO4溶液的EDDS生产培养基（参见表1）中培养。根据图15的数据显示，在所选条件下在日本拟无枝酸菌WT中未产生[S,S]-EDDS。相反，通过在非Zur靶向启动子ermE*的控制下表达[S,S]-EDDS操纵子orf1662-65的日本拟无枝酸菌菌株，在锌存在下就已检测到[S,S]-EDDS产生（图15）。
这些数据证实，显著不依赖于锌的[S,S]-EDDS生产可通过交换控制[S,S]-EDDS生物合成基因的ZurAJ（SEQ ID No. 61）靶向启动子来实现。
3.3 [S,S]-EDDS生物合成基因在异源宿主细胞中的异源表达
所述[S,S]-EDDS生物合成簇应在已用于生物技术的细菌菌株，例如天蓝色链霉菌中表达。
因此，具有整合至基因组的粘粒pTWPL1-EDDS的天蓝色链霉菌在EDDS-生产培养基中培养并研究[S,S]-EDDS生产（图16）。
这些数据证实，[S,S]-EDDS可在无锌的EDDS生产培养基中在宿主天蓝色链霉菌中通过异源表达来合成（图16，中）。这些数据还证实，在本发明范围中鉴定的基因是[S,S]-EDDS生物合成基因。
4.日本拟无枝酸菌的培养和储存
为了制备日本拟无枝酸菌的培养物，将冻干物在HA平板上铺板并在27℃下温育4-5天。随后，使用菌丝体接种100 ml M3培养基（参见表1）且在27 ℃下温育48 h。使用盐溶液（0.9 % NaCl）洗涤培养物两次。将沉淀物悬浮在50 ml M2培养基（参见表1）中，分为2ml的试样并在-20 ℃下储存高达6个月。
5.用于DNA分离的日本拟无枝酸菌培养
将20 mlTSB 培养基（参见表1）用菌丝体接种并在27℃下温育2天。在具有挡板（Schikane）和金属线圈的100 ml锥形瓶中实现分散生长和优化的氧气供应。
6.在[S,S]-EDDS生物合成条件下的日本拟无枝酸菌培养
将日本拟无枝酸菌在HA平板上铺板且在27 ℃下温育3-5天。随后，将约1 cm2的日本拟无枝酸菌丝从板上刮去，并用于接种100 ml M3培养基（参见表1）。在振动机中在27 ℃和180 rpm下温育48 h后，将5 ml 用于接种100 ml M7 培养基（参见表1）。M7是合成的贫锌培养基，其中日本拟无枝酸菌产生[S,S]-EDDS。为了避免[S,S]-EDDS的生物合成，添加ZnSO4直至6 µM的最终浓度。对于RT-PCR，添加ZnSO4、FeSO4、MnSO4、NiSO4和CoCl2分别至25 µM的最终浓度（例如参见图3）。
本说明书中提及的核酸序列和氨基酸序列对应于所附序列表中所列的序列。

Claims (9)

1.分离的蛋白或肽用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述分离的蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No.51及其组合。
2.分离的核酸用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述分离的核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码蛋白或肽的核酸序列，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列，及其组合。
3.分离的核酸用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述分离的核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合。
4.分离的蛋白或肽用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述分离的蛋白或肽通过包含或由选自以下的核酸序列构成的基因的表达来制备：SEQ ID No. 48、SEQ IDNo. 50、SEQ ID No. 52及其组合。
5.分离的基因簇或操纵子用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述分离的基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ IDNo. 50、SEQ ID No. 52及其组合。
6.表达载体用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中所述表达载体包含：
至少一种核酸，
所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码蛋白或肽的核酸序列，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列，及其组合；
或者，所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
或基因簇或操纵子，所述基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合。
7.宿主细胞用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中该宿主细胞包含：
至少一种蛋白或肽，
所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
或者所述蛋白或肽通过包含或由选自以下的核酸序列构成的基因的表达来制备：SEQID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
至少一种核酸，
所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码蛋白或肽的核酸序列，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列，及其组合；
或者，所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
基因簇或操纵子，所述基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
和/或如权利要求6限定的表达载体。
8.用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的方法，其包括以下步骤：
a）培养如权利要求7限定的产生[S,S]-乙二胺二琥珀酸的宿主细胞，和
b）从所述细胞和/或从用于所述细胞的培养基中提纯[S,S]-乙二胺二琥珀酸。
9.试剂盒用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的用途，其中该试剂盒包含选自以下的组分：
至少一种蛋白或肽，
所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
或者所述蛋白或肽通过包含或由选自以下的核酸序列构成的基因的表达来制备：SEQID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
至少一种核酸，
所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：
a）编码蛋白或肽的核酸序列，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51及其组合；
b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；
c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列，及其组合；
或者，所述核酸包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
基因簇或操纵子，所述基因簇或操纵子包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52及其组合；
和/或如权利要求6限定的表达载体、如权利要求7限定的宿主细胞及其组合。
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