KR20200106171A - 스타필로코쿠스 박테리아의 영양 요구성 균주 - Google Patents
스타필로코쿠스 박테리아의 영양 요구성 균주 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200106171A KR20200106171A KR1020207022209A KR20207022209A KR20200106171A KR 20200106171 A KR20200106171 A KR 20200106171A KR 1020207022209 A KR1020207022209 A KR 1020207022209A KR 20207022209 A KR20207022209 A KR 20207022209A KR 20200106171 A KR20200106171 A KR 20200106171A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- alanine
- staphylococcus
- bacteria
- gene
- plasmid
- Prior art date
Links
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 title claims abstract description 61
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 73
- 108010041525 Alanine racemase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108010078895 D-Alanine Transaminase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000008541 D-alanines Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 64
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 claims description 18
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 claims description 13
- 101150003265 alr2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 101150063729 alr1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 73
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 16
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 16
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 6
- 241000243142 Porifera Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 5
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108700016167 Glutamate racemases Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 4
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 101150047269 murI gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 101150012893 dat gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- UJKDYMOBUGTJLZ-OASOTCBPSA-N (2r)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O UJKDYMOBUGTJLZ-OASOTCBPSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101100078797 Bacillus subtilis (strain 168) racE gene Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000191965 Staphylococcus carnosus Species 0.000 description 2
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 2
- 241001134656 Staphylococcus lugdunensis Species 0.000 description 2
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 B-1-B-12) Chemical compound 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108030001081 D-amino-acid transaminases Proteins 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000966334 Simias Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000458595 Staphylococcus agnetis Species 0.000 description 1
- 241000461232 Staphylococcus argenteus Species 0.000 description 1
- 241001147686 Staphylococcus arlettae Species 0.000 description 1
- 241001147687 Staphylococcus auricularis Species 0.000 description 1
- 241001147736 Staphylococcus capitis Species 0.000 description 1
- 241001147695 Staphylococcus caprae Species 0.000 description 1
- 241000201854 Staphylococcus chromogenes Species 0.000 description 1
- 241001147698 Staphylococcus cohnii Species 0.000 description 1
- 241001220267 Staphylococcus condimenti Species 0.000 description 1
- 241000520126 Staphylococcus delphini Species 0.000 description 1
- 241001629554 Staphylococcus devriesei Species 0.000 description 1
- 241001033898 Staphylococcus equorum Species 0.000 description 1
- 241000201871 Staphylococcus felis Species 0.000 description 1
- 241001617353 Staphylococcus fleurettii Species 0.000 description 1
- 241000192085 Staphylococcus gallinarum Species 0.000 description 1
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 1
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 1
- 241000191980 Staphylococcus intermedius Species 0.000 description 1
- 241001147689 Staphylococcus kloosii Species 0.000 description 1
- 241001379473 Staphylococcus leei Species 0.000 description 1
- 241000147121 Staphylococcus lentus Species 0.000 description 1
- 241000010986 Staphylococcus lutrae Species 0.000 description 1
- 241000507187 Staphylococcus massiliensis Species 0.000 description 1
- 241000937219 Staphylococcus microti Species 0.000 description 1
- 241000192101 Staphylococcus muscae Species 0.000 description 1
- 241001582999 Staphylococcus nepalensis Species 0.000 description 1
- 241000193817 Staphylococcus pasteuri Species 0.000 description 1
- 241001220301 Staphylococcus piscifermentans Species 0.000 description 1
- 241000794282 Staphylococcus pseudintermedius Species 0.000 description 1
- 241001044486 Staphylococcus rostri Species 0.000 description 1
- 241001464905 Staphylococcus saccharolyticus Species 0.000 description 1
- 241000192099 Staphylococcus schleiferi Species 0.000 description 1
- 241001642616 Staphylococcus schweitzeri Species 0.000 description 1
- 241000192097 Staphylococcus sciuri Species 0.000 description 1
- 241000967959 Staphylococcus simiae Species 0.000 description 1
- 241001503679 Staphylococcus stepanovicii Species 0.000 description 1
- 241000861996 Staphylococcus succinus Species 0.000 description 1
- 241001234013 Staphylococcus vitulinus Species 0.000 description 1
- 241000192086 Staphylococcus warneri Species 0.000 description 1
- 241000191973 Staphylococcus xylosus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 101150070828 alr gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001948 isotopic labelling Methods 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
- C12Y206/01021—D-Amino-acid transaminase (2.6.1.21), i.e. D-alanine aminotransferase/transaminase or D-aspartic aminotransferase/transaminase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/01—Racemaces and epimerases (5.1) acting on amino acids and derivatives (5.1.1)
- C12Y501/01001—Alanine racemase (5.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/44—Staphylococcus
- C12R2001/45—Staphylococcus epidermidis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 개시 내용은 성장을 위해 D-알라닌에 의존적인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어, 에스. 에피데르미디스)를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 2 개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(Δalr1Δalr2); 및 불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 유전자를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2018 년 1 월 5 일에 출원된 미국 가출원 제62/614,096 호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 모든 목적을 위해 전부 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
다수의 박테리아는 펩티도글리칸 층의 생합성에서 2 개의 아미노산 D-알라닌 및 D-글루탐산을 이용하고, 이는 이러한 박테리아에서 기능적 세포벽의 구축에 필수적이다. 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 종을 비롯한 그람 양성 박테리아(Gram positive bacteria)는 그의 세포벽 내 펩티도글리칸 층의 합성을 위해 D-알라닌 및 D-글루탐산을 이용한다.
유전자 코드는 20 개의 단백질 생성 아미노산에 대한 코돈을 제공하며, 이 중 19 개는 키랄성을 가지며 L-이성질체이다. 이들은 "천연" 또는 "표준" 아미노산으로 간주된다. 반대 키랄성을 갖는 아미노산, 즉 D-이성질체는 비-천연으로 간주되고, 일반적으로 환경에 존재하지 않는다. 유기체, 예컨대 박테리아가 D-아미노산을 필요로 하는 경우, 이러한 비-천연 아미노산을 생산하기 위한 효소 또는 효소들이 박테리아에 존재하거나 박테리아에 의도적으로 제공되어야 하며, 그렇지 않은 경우 생존할 수 없다.
알라닌 라세마제는 박테리아 세포벽 내 펩티도글리칸 층의 생합성에서 핵심 구성 요소인 D-알라닌으로의 L-알라닌의 전환을 촉매하는 효소이다. 알라닌 라세마제는 전형적으로 진핵생물에서는 부재하지만 원핵생물 사이에서는 편재한다.
D-알라닌은 박테리아 세포벽 형성 및 이에 따라 박테리아의 생존을 위해 필수적이므로, 박테리아는 D-알라닌의 생산을 촉매할 수 있는 효소를 갖는다. D-알라닌이 박테리아의 존재에 매우 중요하기 때문에, D-알라닌 생합성을 위한 불필요한 또는 복수의 효소를 가질 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 복수의 알라닌 라세마제 유전자를 함유할 수 있다. 2 개의 유전자를 갖는 종에서, 하나는 구성적으로 발현되고 동화성일 수 있지만, 다른 하나는 유도성 및 이화성이다 (Strych, U. et al. 2007. BMC Microbiol. 7:40; Strych U. et al., Curr. Microbiol. 41:290-294; Strych U. et al., FEMS Microbiol. Lett. 196:93-98). 이들 유전자는 세포벽 생합성에 필요한 D-알라닌을 공급하고, 이들 박테리아 중 몇몇을 사용한 녹아웃(knockout) 연구는 알라닌 라세마제 효소가 외인성 D-알라닌의 부재 하에 성장에 필수적이라는 것을 확립하였다 (Franklin, F. C., and W. A. Venables. 1976. Mol. Gen. Genet. 149:229-237; Hols, P., et al. J. Bacteriol. 179:3804-3807; Palumbo, E.,et al. FEMS Microbiol. Lett. 233:131-138; Steen, A., et al. J. Bacteriol. 187:114-124; Wijsman, H. J. 1972. Genet. Res. 20:269-277).
성장에 필수적인 아미노산을 생산하는 미생물의 능력을 제거하는 것은 영양 요구체로 공지된 미생물을 생산한다. 성장에 필수적인 아미노산은 미생물의 생존 및 성장을 원하는 경우에 외인성으로 제공되어야 한다. 영양 요구성 미생물의 생성은 특히 이. 콜라이(E.coli)에 대해 널리 공지되어 있다 (월드 와이드 웹 cgsc2.biology.yale.edu/Auxotrophs.php에서 공개적으로 입수가능함; Methods Enzymol. 2015;565:45-66. doi: 10.1016/bs.mie.2015.05.012. Epub 2015 Jun 10. "Escherichia coli auxotroph host strains for amino acid-selective isotope labeling of recombinant proteins." Lin MT, Fukazawa R, Miyajima-Nakano Y, Matsushita S, Choi SK, Iwasaki T, Gennis RB; Nicola Casali, Methods in Molecular Biology, Vol 235. www.springer.com/gp/book/9781588291516, 각각의 내용이 전부 본원에 참조로 포함된다).
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 D-알라닌 영양 요구체는 스타필로코쿠스 아우레우스의 메티실린 내성 균주에 대한 백신을 생산하기 위한 목적으로 생산되었다 (Moscoso M, et al. 27th ECCMID 22-25 April 2017, The Congress of ESCMID (P0473); Moscoso et al., Virulence (2018) Vol. 9(1): 604-620, 각각의 내용이 전부 본원에 참조로 포함된다). 이 경우, 2 개의 알라닌 라세마제 alr1 및 alr2, 뿐만 아니라 제3 효소를 녹아웃시키는 것이 필수적인 것으로 밝혀졌다.
박테리아가 표적 환경에 도입되는 경우, 도입된 박테리아를 표적 환경 내로의 도입 이후에 제어할 수 있는 것, 예를 들어 표적 환경에 이미 존재하는 박테리아 집단의 성장에 비해 도입된 박테리아의 성장을 제어할 수 있는 것이 바람직하다.
이러한 제어는, 도입되는 박테리아에게 선택적으로 독성이지만 표적 환경에 존재하는 박테리아 집단에게는 독성이 아닌 항생제의 사용에 의해 부과될 수 있다. 그러나, 이러한 선택성을 갖는 항생제를 발견하는 것은 자주 가능하지 않다. 또한, 바람직하지 않은 방식으로, 예를 들어, 기존 박테리아 집단의 구성원에서의 항생제 내성의 유도, 또는 장내 세균 불균형 또는 바람직하지 않은 상황, 예를 들어 설사를 초래하는 표적 환경의 교란으로 표적 환경을 교란할 수 있기 때문에, 항생제를 사용하는 것은 자주 바람직하지 않다.
따라서, 항생제의 사용에 의존하지 않으면서, 표적 환경에 도입되는 박테리아의 성장을 선택적으로 제어하는 방법을 사용하는 것이 유리하다. 표적 환경 내로 도입되는 박테리아 내로 영양 요구를 도입하는 것은 이러한 원하는 제어를 허용할 것이다. 이는 표적 환경의 미생물 군집을 증대시키거나 다르게는 변경시키기 위한 목적으로 박테리아를 표적 환경으로 도입하기 위한 목적에서, 가장 특히 표적 환경이 인간 미생물 군집(microbiome)인 경우 특히 유리하다.
그람-양성 박테리아 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)는 인간 미생물 군집의 공지된 구성원이다 (Zhang et al, Molecular Microbiology (2003) 49(6), 1577-1593, "Genome-based analysis of virulence genes in a non-biofilm-forming Staphylococcus epidermidis strain (ATCC 12228)", 전부 본원에 참조로 포함된다). 에스. 에피데르미디스(S. epidermidis)는 통성혐기성(facultative anaerobic) 박테리아이고, 정상적인 인간 균총의 일부이다. 에스. 에피데르미디스는 보통 병원성이 아니지만, 면역계가 손상된 환자는 감염이 발병할 위험이 있다. 이들 감염은 일반적으로 원내감염이다 (Levinson, W. (2010). Review of Medical Microbiology and Immunology (11th ed.). pp. 94-99, 전부 본원에 참조로 포함된다). 에스. 에피데르미디스는 카테터 또는 다른 수술용 이식물을 갖는 사람들에게 특히 우려되는데, 그가 이러한 장치 상에서 성장하는 바이오필름을 형성하는 것으로 공지되어 있기 때문이다.
따라서, 본 개시 내용은 생존 및 성장을 위해 영양 요구성이고 외인성으로 공급된 영양소, 예컨대 D-알라닌 또는 D-글루탐산에 의존적인 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어, 에스. 에피데르미디스)에 대한 필요성을 다룬다.
발명의 요약
본 개시 내용은 일반적으로 성장을 위해 D-알라닌에 의존적인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어, 에스. 에피데르미디스)에 관한 것이다. 본 개시 내용의 발견은 표적 환경에서 박테리아(예를 들어, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어 에스. 에피데르미디스))의 성장이 항생제의 사용 없이 선택적으로 제어될 수 있다는 것이다. 본 개시 내용의 일부 실시양태에 따르면, 영양 요구의 특징은 항생제 내성에 대한 유전자의 존재를 필요로 하지 않는 플라스미드의 존재를 유지하는데 유용하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 항생제 내성에 대한 유전자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외인성 영양소를 대사적으로 생산할 수 있는 능력을 되돌리는 효소 또는 다른 성분의 발현을 허용하는 폴리뉴클레오티드는 미생물에서 유지되기를 원하는 플라스미드에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 pUBTR114-기반 벡터로 형질전환된다. 추가의 실시양태에서, pUBTR114-기반 벡터는 pUBTR119*-Sal-GFP이다.
한 측면에서, 본 개시 내용은 2 개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(Δalr1Δalr2); 및 불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 유전자를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 성장을 위해 D-알라닌에 의존적이다. 또 다른 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피데르미디스(에스. 에피데르미디스), 및 그의 아종이다. 한 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 돌연변이는 불활성화된 글루탐산 라세마제 유전자, MurI를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 치료 특성이 있는 단백질(예를 들어, 가용성 치료 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 특성을 갖는 단백질은 효소적 또는 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단백질은 성장 인자이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 호르몬이다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 (i) 스타필로코쿠스 균주의 적격 세포(SEΔalr1Δalr2) 내로 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 형질전환시키는 단계; (ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 방법은 D-알라닌 영양 요구에 대해 단리된 콜로니를 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형질전환체 내의 녹아웃 플라스미드의 존재는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피데르미디스(에스. 에피데르미디스), 및 그의 아종이다. 일부 실시양태에서, 방법은 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 pUBTR114-기반 벡터로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, pUBTR114-기반 벡터는 pUBTR119*-Sal-GFP이다. 일부 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 상기 방법에 의해 생산된다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 키트는 pUBTR114-기반 벡터를 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 삼중 유전자 녹아웃을 갖는 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)에서 D-알라닌 영양 요구의 관찰을 나타낸다. SE1423 녹아웃 플라스미드로의 형질전환, 플라스미드 통합 및 플라스미드 백본의 제거 이후, 세포를 콜로니에 대해 플레이팅하였다. 25 개의 콜로니를 2 개의 상이한 플레이트 상에 패치시키고, 플레이트를 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 좌측: TSA 플레이트; 우측: TSA + 무수테트라시클린(2 μg/mL) + D-알라닌(40 μg/mL). 3 개의 클론(적색 원으로 강조된 #7, #12 및 #18)은 D-알라닌이 보충된 TSA 상에서만 성장할 수 있었다.
도 2A 및 도 2B는 삼중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)의 PCR 시험의 결과를 나타낸다. TSA + 무수테트라시클린(2 μg/mL) + D-알라닌(40 μg/mL)의 플레이트 상의 패치로부터의 세포를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다: 클론 #7; KO 클론 #12; KO 클론 #18; 야생형 SE; SE1423KO 플라스미드 DNA(벡터, 대조군). 도 2A에서, 야생형 SE1423 유전자좌(2.3 Kb의 PCR 생성물) 및 SE1423 녹아웃(1.5 Kb의 PCR 생성물)을 구별하기 위해 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용하는 PCR을 수행하였다. 도 2B에서, 야생형 SE1423 유전자좌에 특이적인, 0.7 Kb의 PCR 생성물을 검출하기 위해 프라이머 1423-F 및 1423-R을 사용하는 PCR을 수행하였다. 예상된 바와 같이, PCR 생성물은 SE1423 녹아웃 플라스미드 및 추정 SE1423 녹아웃 SE 클론으로부터 생성되지 않았다. 결과는 클론 #7, #12 및 #18에서의 성공적인 SE1423 결실을 확인하였다.
도 3은 pUBTR119*-Sal-GFP로 형질전환된 에스. 에피데르미디스 NRRL B-4268의 클론의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 결과를 나타낸다. 11 개의 클론의 세포(1 내지 11로 표지됨)를 프라이머 Sar-sGFP-F 및 Sar-sGFP-R을 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 1.1 Kb PCR 생성물을 검출하였다. SE NRRL B-4268의 세포 및 SCK6으로부터 단리된 pUBTR119*-Sal-sGFP의 플라스미드 DNA는 음성 (-) 및 양성 (+) 대조군으로서 사용되었다. 모든 형질전환체 클론을 확인하였다.
도 4는 항생제 선별 또는 D-알라닌 영양 요구체 상보성에 의해 pUBTR119*-Sal-GFP로 형질전환된 에스. 에피데르미디스 삼중 유전자 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)의 클론의 PCR의 결과를 나타낸다. 세포를 프라이머 Sar-sGFP-F 및 Sar-sGFP-R을 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 1.1 Kb PCR 생성물을 검출하였다. SE NRRL B-4268의 세포 및 SCK6으로부터 단리된 pUBTR119*-Sal-sGFP의 플라스미드 DNA는 음성 (-) 및 양성 (+) 대조군으로서 사용되었다. 클론 1 내지 3을 항생제 선별로부터, 클론 4 내지 26을 D-알라닌 영양 요구체 상보성으로부터 생성하였다. 모든 클론을 확인하였다.
도 5는 His-태깅된 단백질의 검출을 위한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 레인 1 내지 6: 표 2에 열거된 에스. 에피데르미디스 배양 브로쓰 샘플; 레인 7 내지 10: 각각 1/20, 1/10, 1/5 및 1/1의 희석도로 로딩된 His 태깅된 TP 단백질(~52 kDa)을 함유하는 샘플. His-태깅된 GFP 단백질(29 kDa)에 대한 신호는 검출가능하지 않았다.
발명의 상세한 설명
I.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
하기 참고문헌은 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적 정의를 통상의 기술자에게 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에서 사용되는 바와 같이 하기 용어들은, 달리 특정하지 않는 한, 하기에서 이들에게 주어진 의미를 갖는다.
표현 "한" 및 "하나"는 본원에서 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)인 표현의 문법적 대상을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "한 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "비롯한"은 본원에서 구문 "포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미하는데 사용되고, 그와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 본원에서 용어 "및/또는"을 의미하는데 사용되고, 그와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "예컨대"는 본원에서 구문 "예컨대 그러나 이에 제한되지 않는"을 의미하는데 사용되고, 그와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "영양 요구성" 또는 "영양 요구"는 유기체가 그의 성장에 필요한 특정 화합물을 합성할 수 없는 것을 지칭한다. 영양 요구체는 이러한 특징을 나타내는 유기체이다.
본원에 사용된 용어 "alrA" 및 "alr"은 alrA 유전자의 정상 대립 유전자를 비롯한, D-알라닌 라세마제 유전자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 에스. 에피데르미디스(UniProtKB - Q8CNK7 (ALR_STAES))로부터의 alr 유전자는 D-알라닌 라세마제 단백질(EC 5.1.1.1)을 코딩한다. 일부 실시양태에서 유전자좌 식별자 SE1674(alr1) 및 SE1079(alr2)는 특정 에스. 에피데르미디스 D-알라닌 라세마제 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "dat"는 dat 유전자의 정상 대립 유전자를 비롯한, D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 에스. 에피데르미디스(UniProtKB - Q8CS41 (DAAA_STAES))로부터의 dat 유전자는 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 단백질(EC:2.6.1.21)을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자좌 식별자 SE1423(dat)는 특정 에스. 에피데르미디스 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "murI"는 murI 유전자의 정상 대립 유전자를 비롯한, 글루타메이트 라세마제 유전자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 에스. 에피데르미디스(UniProtKB - Q8CPL0 (MURI_STAES))로부터의 murI 유전자는 글루타메이트 라세마제 단백질(EC:5.1.1.3)을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 유전자좌 식별자 SE0843(murI)는 특정 에스. 에피데르미디스 글루타메이트 라세마제 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유전 요소"는 폴리펩티드를 코딩하는 영역 또는 복제, 전사 또는 번역 또는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현에 중요한 다른 과정을 조절하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 영역 및 발현을 조절하는 그에 작동가능하게 연결된 영역을 둘 다 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하도록 의도된다. 유전 요소는 에피솜 요소로서; 즉, 숙주 세포 게놈과 물리적으로 독립적인 분자로서 복제되는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이들은 플라스미드 내에 포함될 수 있다. 유전 요소는 또한, 그의 천연 상태가 아니라, 조작, 예컨대 단리, 클로닝 및 정제된 DNA 또는 벡터의 형태로 숙주 세포 내로의 도입 이후에 숙주 세포 게놈 내에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환 또는 형질감염되거나 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 세포를 지칭하도록 의도된다.
본 발명의 목적상 용어 "단리된"은 그의 원래 환경(그가 천연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)을 나타낸다. 예를 들어, 식물 또는 동물에서 천연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이 아니지만, 천연적으로 존재하는 인접 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다.
"단리된 핵산 분자"(예컨대, 예를 들어, 단리된 프로모터)는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 예를 들어, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "단리된"은 게놈 DNA가 천연적으로 회합된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자가 유래되는 유기체의 게놈 DNA 내 핵산 분자에 천연적으로 플랭킹되는 서열을 갖지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "녹아웃"은 유전자의 전체 또는 부분 제거, 유전자 생성물의 유용한 발현에 필수적인 비-코딩 제어 영역의 부분 또는 전체 제거, 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내로의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 유전자 생성물의 유용한 발현의 방지를 위한 다른 방법에 의한 유전자 생성물(예를 들어, 및 효소)의 유용한 발현의 무력화를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 사슬 형태로 함께 결합하는 아미노산 잔기로 구성된 생물학적 분자 또는 거대분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 폴리펩티드의 정의는 하나 이상의 아미노산 잔기의 장쇄로 구성된 단백질(일반적으로 더 높은 분자량) 및 소수의 아미노산의 작은 펩티드(일반적으로 보다 낮은 분자량)을 포함하도록 의도된다. 다른 실시양태에서, 기술적으로는 폴리펩티드가 아니지만, 단일 아미노산이 또한 본 발명의 범위 내로 간주된다.
본원에서 사용된 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열을 지칭하도록 의도된다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 근접한 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우에는, 전사 속도가 유도제에 반응하여 증가한다. 예를 들어, 프로모터는 특정 조직 유형 (들)에서만 회합된 코딩 영역을 전사하는 것에 활성이도록 조직-특이적 방식으로 조절될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 특히 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역 또는 단일-, 이중- 및 삼중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역, DNA를 포함하는 하이브리드 분자 및 단일-가닥 또는, 보다 전형적으로, 이중-가닥 또는 삼중-가닥일 수 있는 RNA의 혼합물, 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA를 지칭한다. 또한, 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역 내 가닥들은 동일한 분자로부터 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 상기 영역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 더욱 전형적으로는 분자 중 일부의 한 영역만을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 1개는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 사용된, 용어 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 상기 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유에서 백본이 변형된 DNA 또는 RNA는 상기 용어가 본원에서 의도되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 단지 두 가지 예를 들자면, 이상(unusual) 염기, 예컨대 이노신, 또는 변형된 염기, 예컨대 트리틸화(tritylated) 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 유용한 목적에 기여하는 다종다양한 변형이 DNA 및 RNA에 행해진다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때의 용어 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 특히 단순 및 복합체 세포를 비롯한 바이러스 및 세포의 특징인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 종종 올리고뉴클레오티드(들)로 지칭되는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 종종 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "치료 단백질"은 대상체의 질환 또는 기능장애를 치료하거나 건강을 개선하기 위해 대상체에게 투여되는 단백질, 펩티드, 당단백질 또는 글리코펩티드를 지칭하도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 인간 단백질이다. 본원에 개시된 방법을 사용하여, 치료 단백질은 스타필로코쿠스 박테리아, 예컨대 예를 들어, 이중 알라닌 라세마제 유전자(예를 들어 alr1 및 alr2) 녹아웃 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423) 녹아웃을 갖도록 유전적으로 변형된 스타필로코쿠스 에피데르미디스에서 생산된다.
II.
조성물
본 개시 내용은 D-알라닌 영양 요구체인 삼중 녹아웃 스타필로코쿠스 박테리아를 기재한다. 본 개시 내용은 이중 알라닌 라세마제 유전자(예를 들어 alr1 및 alr2) 녹아웃 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423) 녹아웃을 갖도록 유전적으로 변형된 조작된 스타필로코쿠스 박테리아, 예컨대 스타필로코쿠스 에피데르미디스를 제공한다. 본 개시 내용은 원하는 D-알라닌 영양 요구를 갖는 삼중 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 제공한다.
D-알라닌은 펩티도글리칸 층 구조를 갖는 박테리아를 위한 필수 성분이다. D-알라닌의 필수성은 펩티도글리칸 가닥의 가교에서 디펩티드 D-알라닐-D-알라닌의 핵심 역할로부터 유래된다. 본 개시 내용에 기재된 바와 같이, 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2)는 이전에 개발되었다. 그러나, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 일부 다른 박테리아 종과는 대조적으로, 이중 녹아웃 균주는 D-알라닌 영양 요구를 나타내지 않았다. 에스. 에피데르미디스에서 글루타메이트 라세마제(L-글루타메이트 및 D-글루타메이트 상호전환) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(D-알라닌 및 D-글루타메이트 상호전환)의 존재는 알라닌 라세마제에 대한 우회로를 제공할 수 있다고 여겨졌다. 따라서, 본 개시 내용은 D-알라닌 영양 요구를 나타내는 이중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2)에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423)의 녹아웃을 제공한다.
본 개시 내용은 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 활성이 감소되어, 세포가 D-알라닌 영양 요구체가 되도록, dat 유전자 또는 그의 상동체에 결실을 갖게 유전자 조작된 박테리아 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 활성이 감소되어, 세포가 D-알라닌 영양 요구체가 되도록, 또 다른 유전자 또는 오페론에 결실을 포함하게 유전자 조작되며, 이는 dat 오페론에 영향을 준다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 D-알라닌 영양 요구성 박테리아, 예를 들어, 조작된 스타필로코쿠스 박테리아, 예컨대 예를 들어, 삼중 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)는 또 다른 아미노산, 비타민 및/또는 뉴클레오티드에 대한 영양 요구를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 D-알라닌 영양 요구성 박테리아는 하기 아미노산 중 하나 이상에 대해 영양 요구를 추가로 포함할 수 있다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 D-알라닌 영양 요구성 박테리아는 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 B(예를 들어 B-1 - B-12), 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K에 대한 영양 요구를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 D-알라닌 영양 요구성 박테리아는 뉴클레오티드에 대한 영양 요구를 추가로 포함할 수 있다.
박테리아 균주
본 개시 내용은 유전적으로 변형된 미생물, 예를 들어 박테리아를 제공한다. 본원에 기재된 방법은 임의의 스타필로코쿠스 박테리아 세포에서, 세포에서 dat의 단백질 상동체를 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 녹아웃함으로써, 또는 다르게는 이러한 단백질의 발현 또는 활성을 불활성화시킴으로써 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 스타필로코쿠스 속에 대한 균주의 지정은 그가 클러스터를 형성하고, 카탈라제를 생산하고, 적절한 세포벽 구조(펩티도글리칸 유형 및 테이코산 존재 포함)를 갖고, DNA의 G + C 함량이 30-40 몰% 범위 내인 그람-양성 코쿠스인 것을 필요로 한다. 예는 에스. 아르겐테우스(S. argenteus), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 슈바이체리(S. schweitzeri), 에스. 시미아에(S. simiae)를 비롯한 에스. 아우레우스 군; 에스. 아우리쿨라리스(S. auricularis)를 비롯한 에스. 아우리쿨라리스 군; 에스. 카르노수스(S. carnosus), 에스. 콘디멘티(S. condimenti), 에스. 마스일리엔시스(S. massiliensis), 에스. 피스시페르멘탄스(S. piscifermentans), 에스. 시뮬란스(S. simulans)를 비롯한 에스. 카르노수스 군; 에스. 카피티스(S. capitis), 에스. 카프라에(S. caprae), 에스. 에피데르미디스, 에스. 사카롤리티쿠스(S. saccharolyticus)를 비롯한 에스. 에피데르미디스 군; 에스. 데브리에세이(S. devriesei), 에스. 헤몰리티쿠스(S. haemolyticus), 에스. 호미니스(S. hominis)를 비롯한 에스. 헤몰리티쿠스 군; 에스. 아그네티스(S. agnetis), 에스. 크로모제네스(S. chromogenes), 에스. 펠리스(S. felis), 에스. 델피니(S. delphini), 에스. 하이쿠스(S. hyicus), 에스. 인테르메디우스(S. intermedius), 에스. 루트라에(S. lutrae), 에스. 미크로티(S. microti), 에스. 무스카에(S. muscae), 에스. 슈딘테르메디우스(S. pseudintermedius), 에스. 로스트리(S. rostri), 에스. 슐라이페리(S. schleiferi)를 비롯한 에스. 하이쿠스-인테르메디우스 군; 에스. 루그두넨시스(S. lugdunensis)를 비롯한 에스. 루그두넨시스 군; 에스. 아를레타에(S. arlettae), 에스. 코흐니이(S. cohnii), 에스. 에쿠오룸(S. equorum), 에스. 갈리나룸(S. gallinarum), 에스. 클루시이(S. kloosii), 에스. 레에이(S. leei), 에스. 네팔렌시스(S. nepalensis), 에스. 사프로피티쿠스(S. saprophyticus), 에스. 숙시누스(S. succinus), 에스. 자일로수스(S. xylosus)를 비롯한 에스. 사프로피티쿠스 군; 에스. 플레우레티이(S. fleurettii), 에스. 렌투스(S. lentus), 에스. 시우리(S. sciuri), 에스. 스테파노비시이(S. stepanovicii), 에스. 비툴리누스(S. vitulinus)를 비롯한 에스. 시우리 군; 에스. 시뮬란스(S. simulans)를 비롯한 에스. 시뮬란스 군; 에스. 파스테우리(S. pasteuri), 에스. 와르네리(S. warneri)를 비롯한 에스. 와르네리 군을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피데르미디스이다.
유전자 구축
본 개시 내용은 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. 2001]에 기재된 것을 이용한다. pJB38(Boss et al., 2013)을 녹아웃 벡터의 플라스미드 백본으로서 사용하였으며, 이는 기능성을 개선시키기 위해 플라스미드에 추가의 설계 특징을 추가로 포함하는 대립 유전자 교환 이. 콜라이(E. coli)-스타필로코쿠스 셔틀 벡터인 pJB38에 기초한다 (Bose, J.L., et al. Applied and environmental microbiology. 2013;79(7):2218-2224). 특정 프라이머를 SE1423 녹아웃을 제조하기 위해 설계하였다 (하기 실시예 1에 표 1로서 기재됨).
일부 실시양태에서, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, Top10 이. 콜라이를 클로닝 숙주로서 사용하여 pJB38 내의 EcoRI-SalI 부위에 오버래핑(overlapping) PCR 생성물을 클로닝함으로써 플라스미드가 구축된다. 이어서, 프라이머 1423-5F 및 1423-3R (표 1)을 사용하는 PCR에 의해 클론을 선별하고, 스크리닝하여 PCR 생성물을 검출하였다. 정확한 SE1423 녹아웃 플라스미드(pJB-1423KO)의 클론을 dam-/dcm-이. 콜라이 균주 Gm2163 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 퀴아젠 미디 프렙 키트(Qiagen Midi Prep Kit)를 사용하여 2 개의 Gm2163 형질전환체 클론으로부터 단리하고, 상기와 같이 EcoRI 및 SalI를 사용한 제한 소화에 의해 점검하였다.
재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 용도
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어, 이중 알라닌 라세마제 유전자(예를 들어, alr1 및 alr2) 녹아웃 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423) 녹아웃을 갖도록 유전적으로 변형된 에스. 에피데르미디스)는 치료 특성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 가용성 치료 단백질이다. 가용성 치료 단백질은 수용액에 가용성인 치료 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발현된 치료 단백질 모두, 발현된 치료 단백질의 대부분 또는 발현된 치료 단백질의 일부는 본원에 기재된 스타필로코쿠스 박테리아에 가용성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가용성 치료 단백질은, 예를 들어 효소 활성, 또는 생물학적 활성, 예컨대 리간드 또는 수용체에 대한 결합 활성, 세포내 신호 전달 경로를 활성화하는 능력, 또는 포유동물, 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는 능력을 가지는 활성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 하나 이상의 글리코실트랜스퍼라제에 의해 시험관 내에서 글리코실화되거나 달리 변형되거나, 프로테아제에 대한 내성을 증가시키도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 그대로 사용되거나, 질환을 치료하기 위해 치료 폴리펩티드를 발현하도록 변형될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 피부 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 피부 질환 또는 장애를 치료하기 위해 치료 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하도록 변형될 수 있다.
제제
또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는 치료적으로 유효량의 원하는 폴리펩티드를 생성하기 위해, 임의의 약학적으로 유효량의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아, 예를 들어 적어도 약 0.01 중량%, 약 0.05 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.2 중량%, 약 0.3 중량%, 약 0.4 중량%, 약 0.5 중량%, 약 0.6 중량%, 약 0.7 중량%, 약 0.8 중량%, 약 0.9 중량%, 약 1.0 중량%, 약 1.5 중량%, 약 2.0 중량%, 약 3.0 중량%, 약 4.0 중량%, 약 5.0 중량%, 약 6.0 중량%, 약 7.0 중량%, 약 8.0 중량%, 약 9.0 중량%, 약 10.0 중량%, 약 11.0 중량%, 약 12.0 중량%, 약 13.0 중량%, 약 14.0 중량%, 약 15.0 중량%, 약 16.0 중량%, 약 17.0 중량%, 약 18.0 중량%, 약 19.0 중량%, 약 20.0 중량%, 약 25.0 중량%, 약 30.0 중량%, 약 35.0 중량%, 약 40.0 중량%, 약 45.0 중량%, 약 50.0 중량% 또는 그 초과의 유전적으로 조작된 미생물, 예를 들어 박테리아를 포함하고, 그의 상한은 약 90.0 중량%의 유전적으로 조작된 미생물, 예를 들어 박테리아임이 명백해질 것이다.
대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는 예를 들어, 적어도 약 0.01 중량% 내지 약 30 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.3 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.4 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 그 초과의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함할 수 있다.
III.
방법
본 개시 내용은 (i) 스타필로코쿠스 균주의 적격 세포(SEΔalr1Δalr2) 내로 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 형질전환시키는 단계; (ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에서, 형질전환체 내의 녹아웃 플라스미드의 존재는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출된다. 특정 실시양태에서, 방법은 D-알라닌 영양 요구에 대해 단리된 콜로니를 시험하는 단계를 추가로 포함한다.
IV.
키트
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 키트는 (a) 본 발명의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아 및 (b) 그의 사용 지침서를 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 성장을 위해 D-알라닌에 의존적인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것과 같이 모든 목적을 위해 전부 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본원에 기재된 발명자들이 선행 개시 내용에 의해 또는 임의의 다른 이유로 인해 이러한 개시 내용보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이는 추가 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원, 뿐만 아니라 도면의 내용은 명확히 전부 본원에 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위 내의 실시양태를 추가로 기재하고 입증한다. 실시예는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 그의 많은 변형이 가능하기 때문에, 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 제한으로 해석되어서는 안된다.
본 개시 내용은 일부 실시양태에서, 발현 플라스미드가 항생제의 사용 없이 유지될 수 있는 스타필로코쿠스 에피데르미디스(에스. 에피데르미디스) 발현 시스템의 생성을 제공한다. 본 실험은 D-알라닌 영양 요구체 에스. 에피데르미디스 균주를 개발하기 위한 장기간의 노력을 기록한다. 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2)는 초기에 생성되었지만, D-알라닌 영양 요구를 나타내지 않았다. 에스. 에피데르미디스에서 글루타메이트 라세마제(L-글루타메이트 및 D-글루타메이트 상호전환) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(D-알라닌 및 D-글루타메이트 상호전환)의 존재는, 에스. 아우레우스 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에서 보고된 바와 같이, 알라닌 라세마제에 대한 우회로를 제공할 수 있다고 여겨졌다. 따라서, 본 발명은 D-알라닌 영양 요구를 나타내는 삼중 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 개발하기 위한, 초기 균주에서 알라닌 라세마제 유전자의 이중 녹아웃(SEΔalr1Δalr2) 이외에, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423)의 녹아웃을 기재한다.
실시예 1: SE1423(D-알라닌 아미노트랜스퍼라제)의 결실을 위한 벡터
SE1423 녹아웃(KO)을 제조하는데 사용되는 방법은 하기와 같이 간략하게 기재된다. 먼저, pJB38(Boss et al. 2013)을 사용하여 SE1423KO 플라스미드를 제조하였다.
프라이머
에스. 에피데르미디스 균주 12228의 게놈 서열에 기초하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 설계하여 SE1423 녹아웃(KO) 벡터를 개발하였다. 프라이머 서열, 그의 특정 용도 및 PCR 생성물 크기를 하기 나타낸 바와 같이 표 1에 열거하였다.
표 1. SE1423 녹아웃을 위한 프라이머
·
프라이머 1423-5F/1423-3R을 사용한 오버래핑 PCR: 1.5 Kb
·
프라이머 1423-5F/1423-3R을 사용한 야생형으로부터의 PCR 생성물: 2.3 Kb
·
F: 정방향 프라이머
·
R: 역방향 프라이머
·
클로닝을 위한 추가 제한 부위를 강조된 볼드체 문자로 나타내었다.
5' 및 3' 플랭킹 영역의 PCR 생성물을 생성하였고, 각각 0.5 Kb 및 1.0 Kb이다. 이어서, 이들을 오버래핑 PCR에서 주형으로서 사용하여 5' 및 3' 플랭킹 영역 모두를 포함하는 큰 PCR 생성물(1.5 Kb)을 생성하였다. 오버래핑 PCR 생성물을 Top10 이. 콜라이를 클로닝 숙주로서 사용하여 pJB38 내 EcoRI-SalI 부위에 클로닝하였다. 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용하는 PCR에 의해 클론을 선별하고, 스크리닝하여 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출하였다. 플라스미드 DNA를 또한 단리하고, EcoRI 및 SalI에 의해 소화시켜 벡터 백본(7.0 Kb) 및 삽입물(1.5 Kb)의 두 단편 모두를 검출하였다. 정확한 SE1423 녹아웃 플라스미드(pJB-1423KO)의 클론을 dam-/dcm- 이. 콜라이 균주 Gm2163으로 형질전환시켰다. 퀴아젠 미디 프렙 키트를 사용하여 2 개의 Gm2163 형질전환체 클론으로부터 플라스미드 DNA를 단리하고, 상기와 같이 EcoRI 및 SalI를 사용한 제한 소화에 의해 점검하였다.
실시예 2. 삼중 녹아웃 균주(
SEΔalr1Δalr2Δdat
)의 생성
Gm2163으로부터 단리된 pJB-1423KO 플라스미드를 TAS + 클로람페니콜(10 μg/mL)의 플레이트를 사용하여 에스. 에피데르미디스 균주의 적격 세포(SEΔalr1Δalr2) 내로 형질전환시켰다. 형질전환체에서 pJB-1423KO 플라스미드의 존재는 프라이머 1423-5F(EcoRI) 및 1423-3R(SalI)을 사용하여 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출함으로써 확인하였다. 시험된 26 개의 클론 모두에서, 1.5 Kb의 PCR 생성물이 관찰된 반면, SE 숙주 세포로부터의 세포 용해물을 함유하는 반응에서는 2.3 Kb의 PCR 생성물이 관찰되었다. 2 개의 확인된 클론의 세포를 TSA + Cm(10 μg/mL)+ D-알라닌(40 μg/mL)의 새로운 플레이트 상에 스트리킹하였다. 플레이트를 상동 재조합을 통한 플라스미드 통합을 위해 43 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 단리된 콜로니를 43 ℃에서 정제를 위해 다시 스트리킹하였다. 4 개의 단리된 콜로니를 250 mL 용량 진탕 플라스크 내의 50 mL TSB + D-알라닌(40 μg/mL) 내로 접종하여, 플라스미드 백본을 2번째 상동 재조합을 통해 루프 아웃시켰다. 배양물을 30 ℃에서 24 시간 동안 진탕시켰다. 0.5 mL 배양액의 분취액을 50 mL의 새로운 배지를 함유하는 플라스크에 전달했다. 전달을 3 회 반복하였다. 플라스크로부터의 세포를 TSA + 무수테트라시클린(ATC 2 μg/mL)+ D-알라닌(DA, 40 μg/mL) 상에 플레이팅하였다. 30 ℃에서 2 일 동안 인큐베이션한 후, 10-5 배 희석도에서의 100 μL의 배양액이 플레이팅된 플레이트 상에 약 100-200 개의 콜로니가 형성되었다. 콜로니의 추가의 분석을 하기에 기재한다.
실시예 3. 삼중 녹아웃 균주(
SEΔalr1Δalr2Δdat
)에서의 D-알라닌 영양 요구 시험
TSA+ATC+DA 플레이트로부터의 총 25 개의 단리된 콜로니를 TAS 플레이트 상에 및 TAS+ATC+DA 플레이트 상에 패치시켰다. 플레이트를 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 클론은 D-알라닌 보충된 플레이트(TSA+ATC+DA) 상에서 잘 성장하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 3 개의 클론(#7, #12 및 #18)은 D-알라닌 보충 없이 TSA 상에서 성장하지 못하였고, 이는 D-알라닌 영양 요구를 나타낸다. TSA+ATC+DA 플레이트 상의 패치로부터의 세포가 TSA 플레이트 상에 다시 패치되었을 때 영양 요구성 표현형이 다시 관찰되었다. 2번째 상동 재조합이 SE1423을 녹아웃하지 않으면서 플라스미드 백본의 제거를 초래할 수 있었기 때문에, TSA+ATC+DA 플레이트로부터의 일부 클론은 야생형 SE1423 유전자좌를 보유할 것이 예상된다는 것을 주목한다.
D-알라닌 영양 요구체인 클론을 추가로 분석하였다. 이들 1423KO SE 클론이 TSA+Cm(10 μg/mL) 상에 패치되었을 때, 이들은 성장하지 않았고, 이는 클로람페니콜 선별 마커를 포함하는 플라스미드 백본의 2번째 상동 재조합 동안의 제거를 나타낸다. 프라이머 JB-Cm-F 및 JB-Cm-R을 사용하는 PCR (표 1) 또한 항생제 내성 마커의 손실을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용하는 PCR은 이들 KO 클론에서 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출한 반면, SE 숙주로부터의 PCR 생성물은 예상된 바와 같이 2.3 Kb였다 (도 2A). 야생형 SE 세포는 프라이머 1423-F 및 1423-R(둘 모두 SE1423 코딩 서열에 특이적임)을 사용하여 0.7 Kb의 PCR 생성물을 생산하였고; 이 PCR 생성물은 KO 플라스미드 DNA로부터 및 추정 KO 클론으로부터 검출되지 않았다 (도 2B).
따라서, 모든 실험 데이터에 기초하여, SE1423(dat, D-알라닌 아미노트랜스퍼라제)이 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 균주에서 성공적으로 결실되어 삼중 녹아웃 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 생성하는 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 원하는 D-알라닌 영양 요구가 삼중 녹아웃 균주에서 관찰되었다.
D-알라닌은 박테리아 세포 펩티도글리칸의 합성에 필요하다. 알라닌 라세마제 유전자(들)을 결실시키는 것은 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 이. 콜라이에서의 D-알라닌 영양 요구를 위해 충분하였다. 그러나, 에스. 에피데르미디스에서 상기 표현형을 개발하기 위해서는, 2 개의 알라닌 라세마제 유전자(alr1, alr2) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자 dat(SE1423)가 녹아웃되어야 한다. 명백하게, 에스. 아우레우스 MRSA132(Moscoso et al., 2017 및 2018) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Thompson et al., 1998)에서 보고된 바와 같이, 글루타메이트 라세마제 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 조합물은 알라닌 라세마제에 대한 실행 가능한 우회로를 제공한다. 에스. 에피데르미디스 게놈이 제3 추정 알라닌 라세마제 상동체(SE1769)를 함유하나, 본 연구에서 사용된 실험 조건하에서 D-알라닌 영양 요구를 위해 상기 유전자를 녹아웃시킬 필요는 없다.
D-알라닌 영양 요구성 에스. 에피데르미디스 균주의 성공적인 개발과 함께, 다음 단계는 선별 마커로서 알라닌 라세마제 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 균주를 형질전환시키는 것이다. 형질전환체는 D-알라닌 숙주 영양 요구의 플라스미드 상보성에 의해 선별될 것이다.
실시예 4. 비-항생제 선별 마커를 사용한
스타필로코쿠스
에피데르미디스
발현 벡터의 개발
본 실시예는 항생제의 사용 없이 발현 플라스미드가 유지될 수 있는 스타필로코쿠스 에피데르미디스 발현 시스템의 개발을 기재한다.
pJB38을 사용한 클로닝 숙주 바실루스 서브틸리스 SCK6의 형질전환
pJB38, 이. 콜라이/에스. 아우레우스 셔틀 벡터(Bose et al. 2013)를 에스. 에피데르미디스에서의 단백질 생산을 위해 사용한다. 비-ABR(항생제 내성) 단백질 발현 시스템을 개발하는 한 가지 가능한 접근법은 pJB38을 변형시키는 것이다. 이 옵션을 조사하기 위해, pJB38을 클로닝 숙주 바실루스 서브틸리스 SCK6 내로 형질전환시킬 수 있는지 시험하였다. 퀴아젠 하이스피드 플라스미드 미디 키트(Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit) 시약 및 프로토콜을 사용하여 이. 콜라이 균주 DH5α로부터 단리한 pJB38 DNA를 적격 세포 제조 및 형질전환을 위한 BTR의 프로토콜을 사용하여 SCK6ΔalrA 내로 형질전환시켰다 (하기 기재됨). 형질전환된 세포를 LB 아가 + D-알라닌(DA, 40 μg/mL) + 클로람페니콜(Cm, 10 μg/mL) 상에 플레이팅하였다. 30 ℃에서 2 일 동안 인큐베이션한 후 소형 콜로니가 나타나기 시작하였다. 30 ℃에서 인큐베이션한 3 일 후 콜로니를 계수하였다. 250 μL의 적격 세포를 0.6 μg의 pJB38 DNA(5 μL 중)로 형질전환시킨 경우, 다양한 크기의 61 개의 콜로니가 50 μL 세포로 플레이팅된 플레이트 상에서 관찰하였다. 이를 기초로, 형질전환 효율은 5.2 x 102 cfu/μg DNA이다.
형질전환체가 실재하는 것을 확인하기 위해, 40 개의 콜로니를 고르고, LB 아가+DA+Cm의 새로운 플레이트 상에 패치시키고, 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 콜로니가 잘 성장하였다. 6 개의 클론을 각각 LB+DA+Cm의 3 mL 브로쓰 내로 접종하였다. 세포를 사용하여 미니 프렙 플라스미드 DNA를 제조하였다. 플라스미드를 EcoRI + HindIII, 및 SalI+SnaBI로 소화시켰다. EcoRI+ HindIII 소화로부터의 예상된 DNA 밴드는 5 Kb 및 2 Kb였다. SalI+ SnaBI 소화의 밴드는 4.7 Kb 및 2.3 Kb였다. 예상된 소화 패턴이 3 개의 큰 콜로니 클론(#2, #3 및 #4) 및 2 개의 작은 콜로니 클론(#6 및 #7)에서 관찰되었다. 작은 콜로니 클론 #5는 아가로스 겔 상에서 보다 큰 크기 밴드를 나타낸 반면, 작은 밴드의 밀도는 매우 약하였다. 이러한 데이터로부터, pJB38이 성공적으로 비. 서브틸리스 SCK6 내로 형질전환되었다고 결론지을 수 있었다.
에스. 에피데르미디스 내로 pJB38을 형질전환시키기 위해, 플라스미드는 dam - /dcm - 이. 콜라이 숙주로부터 단리되어 숙주 제한 및 형질전환 효율의 변형의 영향을 최소화할 필요가 있다. 노력은 주로 pUBTR114 - 기반 벡터를 사용한 작업에 초점을 맞추었다.
벡터 pUBTR14-TP를 사용한 에스. 에피데르미디스의 형질전환
에스. 에피데르미디스 균주 NRRL B-4268의 형질전환 적격 세포를 제조하고 형질전환시켰다. 퀴아젠 미디 프렙 키트를 사용하여 바실루스 서브틸리스 SCK6으로부터 pUBTR114-TP(시험 단백질 유전자를 운반하는 pUBTR114벡터)를 단리하였다 (부록 II 참조). 형질전환된 에스. 에피데르미디스 세포를 10 μg/mL 카나마이신을 함유하는 트립신 대두 한천(TSA) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 약 950 ng 플라스미드 DNA를 사용한 형질전환으로부터, 5 개의 콜로니가 관찰되었다. 모든 5 개의 콜로니를 새로운 카나마이신 플레이트 상에 패치한 후 37 ℃에서 재성장시켰다. 이쑤시개를 사용하여 세포를 픽업하고, 100 μL의 트리스 완충제(100 mM, pH 8.0)에 현탁시켰다. 용해물 분취액(0.5 μL)을 Taq 폴리머라제 및 프라이머 쌍 s.p.amyQ-Nde-F2/Sbf-TP-R(표 2)을 사용하는 25 μL PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 형질전환되지 않은 에스. 에피데르미디스의 세포 용해물 및 SCK6으로부터 단리된 플라스미드 DNA를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 5 개의 클론 모두로부터의 세포 용해물은 1.5 Kb의 예상된 PCR 생성물을 생성하였다. 따라서, 이들 실험은 카나마이신 선별을 사용하여 에스. 에피데르미디스 내로 pUBTR114-기반 벡터를 형질전환하고 유지할 수 있음을 입증하였다.
표 2. 프라이머 서열
·
F: 정방향 프라이머
·
R: 역방향 프라이머
·
추가 제한 부위를 적색 강조된 볼드체 문자로 나타내었다.
pUBTR119-GFP의 구축
pJB38-sGFP로 형질전환된 에스. 에피데르미디스에서 검출가능한 GFP 발현 및 분비가 입증되었다. 따라서, 평가를 위해 pUBTR119-TP 내로 발현 카세트 "SarAP1-SsaA-His-sGFP"를 클로닝하는 것이 결정되었다. 이 플라스미드는 pUBTR114-TP와 유사하다. 2 개의 플라스미드 사이의 차이점은 제2 프로모터 서열 및 pUBTR119-TP 내의 TP 코딩 서열 상류의 보다 편리한 클로닝 부위의 존재이다.
정방향 프라이머 Sar-GFP-F 및 역방향 프라이머 Sar-GFP-R (표 2)은 플라스미드 pJB38-sGFP로부터 PCR에 의해 sGFP 발현 카세트의 1.1 Kb 단편을 증폭시키도록 설계되었다. 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 제한 부위 PaeR7I 및 SbfI를 함유한다. 애질런트(Agilent)로부터의 PfuUltra DNA 폴리머라제를 갖는 표준 PCR 조건을 사용하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔을 통해 진행시키고, 절단하고, 퀴아젠 퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 이어서, 단편을 PaeR71-SbfI로 소화시키고, 1 회 더 겔 정제하였다. pUBTR119-TP를 퀴아젠 미디 프렙 키트를 사용하여 비. 서브틸리스 SCK6으로부터 단리하고, 1.5 Kb 시험 단백질(TP) 코딩 서열을 제거하기 위해 제한 효소 PaeR7I 및 SbfI로 소화시켰다. 나머지 4.1 Kb 벡터 백본을 겔 정제하였다. sGFP 발현 카세트를 NEB의 퀵 라이게이션 키트를 사용하여 PaeR71-SbfI 부위에서 pUBT119 백본 내로 라이게이션시키고, 비. 서브틸리스 SCK6ΔalrA 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 LB 플레이트, 뿐만 아니라 LB+10 μg/mL 카나마이신+ 40 μg/mL D-알라닌 상에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 두 유형 모두의 플레이트 상에서 약 100 개의 콜로니가 관찰되었고, 이는 카나마이신 내성 또는 D-알라닌 영양 요구체 상보성에 의한 효과적인 선별을 시사한다. LB 플레이트로부터의 100 개의 콜로니 및 LB+Kan+DA 플레이트로부터의 150 개의 콜로니를 각각 LB 및 LB+Kan+DA의 플레이트 상에 패치시켰다. 모두 양호한 성장을 나타냈다. LB+Kan+DA 플레이트로부터의 각각 10 개의 콜로니의 15 개의 풀(클론 #1-150) 및 LB 플레이트로부터의 10 개의 풀(#151-250)을 프라이머 Sar-GFP-F/Sar-GFP-R을 사용하는 PCR에 의해 스크리닝하여 1.1 Kb 삽입물의 존재를 확인하였다. pJB38-sGFP의 플라스미드 DNA 및 SCK6ΔalrA 세포는 양성 및 음성 대조군으로서 사용되었다. 모든 풀은 PCR 양성이었다. 하나의 풀(풀 #5)로부터의 개별 클론을 상기와 같이 PCR에 의해 스크리닝하였고, 모두 양성이었다. LB+Kan+DA로부터의 이들 클론을 액체 LB+KAN+DA에서 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 플라스미드 미니-프렙으로 세포를 사용하였다. 10 개의 클론 모두 아가로스 겔 상에서 점검될 때 플라스미드를 함유하였다. 클론 #3 및 #4로부터의 플라스미드 DNA를 3 세트의 제한 소화: PaeR71+SbfI, EcoRV, 및 KpnI에 의해 분석하였다. 예상된 소화 패턴이 두 클론 모두에 대해 관찰되었다. 두 클론 모두로부터 미디 프렙 DNA를 제조하였다. 서열분석은 성공적인 클로닝을 확인하였고, 어떠한 돌연변이도 나타내지 않았다. 구축물을 상기 기재된 바와 같이 카나마이신 선별을 사용하여 SE NRRL B-4268 내로 형질전환시켰다. 3 일의 긴 인큐베이션 후, 9 개의 콜로니가 관찰되었다. PCR에 의해 2 개의 클론을 시험하였다. 그러나, 프라이머 Sar-GFP-F/Sar-GFP-R을 사용하는 PCR은 sGFP 발현 카세트를 검출하는데 실패하였다.
pUBTR114-TP가 에스. 에피데르미디스 내로 형질전환되고 PCR에 의해 확인될 수 있었던 반면, pUBTR119-GFP로부터의 추정 형질전환체는 확인될 수 없었는지에 대한 이유는 불명확하다. pUBTR114-TP 콜로니는 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 관찰된 반면, pUBTR119-GFP 콜로니는 37 ℃에서 2-3 일 인큐베이션한 후에만 관찰되었다. 2 개의 플라스미드 사이의 하나의 차이점은 pUBTR119-GFP에서 XhoI 제한 부위의 존재이다. 비. 서브틸리스는 XhoI 메틸화 시스템을 가진다 (Jentsch, 1983). pUBTR119-TP 내의 XhoI 부위는 제한 효소 XhoI에 의해 소화될 수 없었고, 이러한 이유 때문에, 그의 동일전달제한효소(isoschizomer) PaeR71을 GFP 발현 카세트의 클로닝에 사용하였다. 에스. 에피데르미디스에서의 제한/변형 시스템이 메틸화 XhoI 부위 때문에 pUBTR119-GFP를 어떻게든 표적으로 할 수 있었다고 의심되었다. 따라서, 벡터는 XhoI 부위를 상이한 제한 부위, SalI로 교체함으로써 변형되었다.
새로운 GFP 발현 벡터: pUBTR119*-SAL-GFP의 개발
오버래핑 PCR 전략을 사용하여 pUBTR119-GFP에서 Xho 부위를 상이한 제한 부위(SalI)로 교체하였다. 이 플라스미드에서, MluI-XhoI 단편(840 bp) 및 XhoI-KpnI 단편(251 bp)이 존재한다. 2 개의 단편의 PCR 증폭 및 오버래핑 PCR을 위해 5'-CTCGAG-3'의 5'-GTCGAC-3'로의 뉴클레오티드 변화를 함유하는 신규한 프라이머를 설계하였다. 오버래핑 PCR 생성물(1.1 Kb)을 MluI 및 KpnI로 소화시키고, MluI-KpnI로 사전 소화된 pUBTR119-GFP와 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응물을 상기와 같이 카나마이신 선별을 사용하여 SCK6 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 다수의 콜로니가 형성되었다. 콜로니를 새로운 플레이트 LB+Kan(10 μg/mL) 상에 패치시켰다. 12 개의 클론을 프라이머 Mlu-F2 및 Sal-R2 (표 2)를 사용하는 PCR에 의해 분석하였다. 프라이머 Sal-R2는 SalI 부위에 대해 특이적이다. 0.84 Kb의 예상된 PCR 생성물의 밴드는 약하였지만, 8 개의 클론에 대해 반응에서는 분명하게 존재하였다. 모든 12 개의 클론을 플라스미드 DNA 미니-프렙에 대해 액체 배지(LB+ Kan)에서 성장시켰다. 이러한 모든 클론은 정확한 크기의 플라스미드의 밴드를 나타내었고, 이들은 SalI 소화에 의해 선형화되었다. 클론 #4를 미디 프렙을 위해 성장시켰다. DNA를 제한 소화: MluI+ KpnI; 및 SalI에 의해 분석하였다. 예상된 바와 같이, MluI+ KpnI 소화로부터 2 개의 밴드(4.5 Kb 및 1.1 Kb)가 관찰되었고, SalI는 플라스미드를 선형화하였다. 새로운 플라스미드를 pUBTR119*-Sal-GFP로 명명하였다.
pUBTR119*-SAL-GFP를 사용한 에스. 에피데르미디스 균주의 형질전환
야생형 SE NRRL B-4268 적격 세포를 pUBTR119*-Sal-GFP 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, TSA+Kan(10 μg/mL)의 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 각각 약 440 ng 및 약 880 ng 플라스미드 DNA를 사용한 형질전환으로부터 2 및 9 개의 콜로니를 관찰하였다. 모든 11 개의 클론을 새로운 TSA+Kan 플레이트 상에 패치시키고, 세포를 프라이머 Sar-GFP-F 및 Sar-GFP-R을 사용하는 PCR에 의해 시험하였다. 에스. 에피데르미디스 세포 및 pUBTR119*-Sal-GFP 플라스미드 DNA를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군을 제외한 모든 반응에서 1.1 Kb의 PCR 생성물이 생성되었다 (도 3).
D-알라닌 영양 요구체 삼중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 성장시켜, TSB 배지에 D-알라닌(40 μg/mL)을 첨가하는 것을 제외하고는 NRRL B-4268에 대한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 형질전환 적격 세포를 제조하였다. pUBTR119*-Sal-GFP는 카나마이신 내성 유전자 및 알라닌 라세마제 유전자 둘 모두를 선별 마커로서 함유한다. TSA+Kan(10 μg/mL) 상에서 카나마이신 선별에 의해, 뿐만 아니라 TSA 상의 D-알라닌 영양 요구체 상보성에 의해 플라스미드를 삼중 유전자 녹아웃 돌연변이체 내로 형질전환시켰다. 플레이트를 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후 콜로니를 관찰하였다: 카나마이신 선별 플레이트 상의 880 ng 플라스미드 DNA의 형질전환으로부터의 3 개의 콜로니, 및 동일한 양의 플라스미드 DNA로부터 TSA 플레이트 상의 25 개의 콜로니. 이는 D-알라닌 영양 요구체 상보성을 사용한 에스. 에피데르미디스 형질전환이 카나마이신 선별을 사용하는 것보다 더 효율적으로 작용한다는 것을 보인다. 모든 28 개의 콜로니는 새로운 플레이트 상에 패치된 후에 성장할 수 있었다. 이들은 또한 gfp 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 모두 확인되었다 (도 4).
GFP 발현을 위한 세포 배양
진탕 플라스크 실험을 셋업하여, pUBTR119*Sal-GFP 구축물로 형질전환된 SE 삼중 녹아웃 균주에서 단백질 발현을 평가하였다. 본 실험에서 사용된 균주 및 배지를 표 3에 열거하였다. 비. 서브틸리스 및 에스. 에피데르미디스에서의 성장 및 단백질 발현을 위한 진탕 플라스크 배양 프로토콜이 하기에 제공된다. 균주를 5 mL의 열거된 배지 - 글루코스 내로 접종하고, 37 ℃, 225 rpm에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양물(0.5 mL)을 사용하여 250 mL 용량 플라스크 내의 50 mL의 열거된 배지+ 2 % 글루코스에 접종하였다. 배양물을 37 ℃, 225 rpm에서 24 시간 동안 성장시켰다. 모든 균주는 양호한 성장을 나타내었다. 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 5417C에서 13,000 rpm(17,900 x g)에서 3 분 동안 1.5 mL의 배양액을 원심분리함으로써 배양 브로쓰를 수집하였다. 도 5는 His-태깅된 단백질의 검출을 위한 웨스턴 블롯을 나타낸다.
표 3. 세포 성장 및 단백질 발현 실험에 사용된 균주 및 배양 배지
C-말단 His 태그를 가진 GFP를 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 프로토콜(하기 기재됨)이 뒤따른다. 분비된 His-태깅된 GFP 단백질은 252 개의 아미노산 잔기를 함유하고, 그의 분자량은 29 kDa이다. 4-12 % 단백질 겔을 진행하고 염색하였지만, 예상된 크기의 단백질 밴드는 관찰될 수 없었다(데이터가 나타나지 않음). 샘플을 16 % 단백질 겔 상에서 진행시키고, 항-His 항체를 사용한 검출을 위해 막 상으로 전달했다. pUBTR114-TP로 형질전환된 비. 서브틸리스 SCK6은 N-말단 His 태그를 함유하는 시험 단백질(52 kDa)을 발현 및 분비하는 것으로 이전에 나타났다. -20 ℃에서 저장된 배양 브로쓰 샘플을 다양한 희석도에서 양성 대조군으로서 로딩하였다: 다른 샘플처럼 1/1, 1/5, 1/10 및 1/20 배 희석. 관찰된 유일한 가시적인 밴드는 양성 대조군으로부터의 것이었다. 신호는 1/20 배 희석된 대조군에서 희미하였다. 신호는 블롯 상의 GFP 단백질에 대해 검출될 수 없었다. 따라서, GFP는 이들 배양물에서 활발히 발현되지 않았다. 비. 서브틸리스에서 단백질 발현에 적합한 것으로 실험적으로 시험된 배지 TSB + 2 % 글루코스는 SarAP1 프로모터에 의해 제어되는 단백질 발현, 및/또는 신호 펩티드 SsaA에 의해 구동되는 단백질 분비에 최적이 아닐 수 있다.
pUBTR114-기반 벡터를 에스. 에피데르미디스 내로 성공적으로 형질전환시켰다. GFP 발현 카세트를 클로닝하여 pUBTR119*-Sal-GFP를 구축하였다. 벡터는 선별 마커로서 카나마이신 내성 유전자 및 알라닌 라세마제 유전자 둘 모두를 함유한다. 카나마이신 유전자는 원하는 경우 용이하게 제거될 수 있다. pUBTR119*-Sal-GFP를 카나마이신 선별을 사용하여 SE NRRL B-4268 내로 성공적으로 형질전환시켰다. 이는 카나마이신 선별뿐만 아니라 D-알라닌 영양 요구체 상보성에 의해 삼중 유전자 녹아웃 D-알라닌 영양 요구체 돌연변이체 내로 또한 형질전환되었다. 모든 클론을 gfp 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인하였다.
이들 실험은 에스. 에피데르미디스에서 단백질 생산을 위한 비-항생제 발현 시스템의 개발을 기재한다. 첫째로, D-알라닌 영양 요구체 에스. 에피데르미디스 균주를 2 개의 알라닌 라세마제 유전자(alr1 및 alr2) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat)를 연속적으로 녹아웃시킴으로써 개발하였다. 이어서, BTR 그람 양성 박테리아 발현 벡터를 에스. 에피데르미디스 내로 형질전환시킬 수 있고, 숙주의 D-알라닌 영양 요구체를 보완할 수 있다는 것이 입증되었다. 발현 벡터는 비. 서브틸리스 및 에스. 에피데르미디스 둘 모두에서 기능하는 복제 원점 및 선별 마커를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 고도로 형질전환 가능한 비. 서브틸리스 SCK6ΔalrA는 벡터 구축을 용이하게 하기 위한 클로닝 숙주로서 사용된다. 일단 벡터가 구축되고 바실루스에서 확인되면, 이를 단백질 발현을 위해 D-알라닌 영양 요구체 에스. 에피데르미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat) 내로 형질전환시킨다.
상기 기재된 실험은 하기 방법을 사용하여 수행하였지만, 이에 제한되지 않는다.
바실루스 서브틸리스로부터의 플라스미드 제조
퀴아젠 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(카탈로그# 27106)를 미니 프렙에 사용하였다; 퀴아젠 하이스피드 플라스미드 미디 키트(카탈로그# 12643)를 미디 프렙에 사용하였다. 주요 포인트는 P1 완충제에 대한 리소자임의 첨가이다.
미니 프렙:
1.
단리된 콜로니를 5 mL LB + 필요한 항생제 내로 접종하고, 37 ℃, 225 rpm에서 밤새 성장시켰다.
2.
3 mL의 각각의 밤새 배양물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 제거하고, 에펜도르프 원심분리기 5417C에서 1 분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다.
3.
펠릿을 250 μL P1 완충제에 재현탁시켰다. 리소자임을 200 μg/mL의 최종 농도로 첨가하고; 5 μL의 새로운 10 mg/mL 리소자임 수용액을 첨가하였다. 샘플을 와동시키고, 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
4.
제조자의 핸드북에 지시된 바와 같은 나머지 프로토콜을 따른다.
바실루스 서브틸리스 균주 SCK6의 적격 세포의 제조 및 형질전환
SCK6 적격 세포 제조
1.
-80 ℃ 글리세롤 스톡 바이알로부터, LB 플레이트 상으로의 단리를 위해 SCK6를 스트리킹한다. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한다.
2.
18x150 mm 유리 튜브 내에 5 mL LB 내로 단리된 콜로니를 접종한다. 37 ℃에서 225 rpm으로 밤새 진탕한다.
3.
OD600을 측정하기 위해 밤새 배양물의 1:100 희석액을 제조한다.
4.
125 mL 용량 플라스크 내의 15 mL LB + 1 % 자일로스에서 출발 OD600이 1.0이도록 배양물을 희석한다. 225 rpm, 37 ℃에서 2 시간 동안 진탕한다.
5.
10 % 글리세롤 중 -80 ℃에서 배양물을 동결한다: 50 % 글리세롤 3.6 mL를 플라스크에 첨가하고, 450 μL 분취액을 -80 ℃에서 1.5 mL 에펜도르프 튜브내에서 동결한다.
SCK6은 염색체 상에 에리트로마이신 내성 마커를 갖는다. 원하는 경우, 1.0 μg/mL 에리트로마이신을 모든 단계에서 첨가할 수 있다. SCK6ΔalrA에 대해, 40 μg/mL에서 배지에 D-알라닌을 첨가하였다.
형질전환 프로토콜
1.
적격 세포를 실온에서 해동시키고, 각각의 형질전환에 대해 200 μL를 사용하였다.
2.
형질전환 DNA(플라스미드 또는 라이게이션 반응)를 200 μL 적격 세포를 함유하는 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 직접 첨가하였다.
3.
에펜도르프 튜브를 18x150 mm 유리 튜브에 넣고, 37 ℃, 225 rpm에서 90 분 동안 두었다.
4.
샘플을 1-4 LB 플레이트 + 필요한 항생제 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
단백질 발현을 위한 바실루스 서브틸리스 및 에스. 에피데르미디스의 성장 및 제조
·
성장 배지: 스타필로코쿠스 에피데르미디스 및 바실루스 서브틸리스 SCK6 야생형 숙주를 위한 TSB + 20 g/L 글루코스 및 pUBTR114 또는 pUBTR119 구축물의 형질전환체를 위한 TSB + 20 g/L 글루코스 + 10 μg/mL 카나마이신
·
-80 ℃ 글리세롤 스크래핑을 사용하여 18X150 mm 유리 튜브내의 각각의 균주에 대해 상기 열거된 5 mL 성장 배지에 접종한다. 37 ℃, 225 rpm에서 밤새 성장시킨다.
·
밤새 배양액 0.5 mL를 사용하여 각각의 균주에 대해 상기와 동일한 성장 배지 50 mL를 함유하는 250 mL 용량 플라스크에 접종한다. 24 시간 동안 37 ℃, 225 rpm에서 성장시킨다.
·
각각의 24 시간 배양물의 2 x 1.5 mL 분취액을 제거함으로써 플라스크를 샘플링한다. 에펜도르프 원심분리기 5417C에서 13,000 rpm(17,900 x g)에서 3 분 동안 원심분리한다. SDS-PAGE 분석 및 항-His 웨스턴 블롯에 사용될 수 있도록 새로운 에펜도르프 튜브로 상청액을 제거한다. 펠릿을 또한 저장한다. 모든 샘플을 -20 ℃에서 저장한다.
·
나머지 24 시간 배양물의 A600 리딩을 실행한다.
HIS 태그를 함유하는 단백질에 대한 SDS Page 및 웨스턴 전달 프로토콜
사용된 성분/시약: 엑스페데온(Expedeon)으로부터
·
20X 테오-트리신-SDS 진행 완충제 #B50500
·
런블루(RunBlue) SDS 겔 4-12 %, 12 웰, 10 cm x 10 cm #NXG41212
·
10X DTT 리듀서(Reducer) #A32001
·
4X LDS 샘플 완충제 #B31010
·
인비트로젠(Invitrogen) 노벡스(Novex) 미니 세포 엑스셀(XCELL) 셜록(Surelock) 전기영동 세포
·
전달 완충제: 20X 트리스-글리신 블롯팅 완충제 # B86500
·
바이오래드(BioRad) 플러스 단백질 웨스턴 표준 # 161-0376
·
젠스크립트(Genscript) 원-아워(One-Hour) 웨스턴 키트 # L00204T
·
젠스크립트 His-태그 항체 pAB, 토끼 #A00174; -20 ℃에서 보관된 10 μL 분취액
샘플 제조:
·
샘플 혼합물:
o
X μL 샘플
o
5 μL 4X LDS 샘플 완충제
o
2 μL 10X DTT 환원제
o
Y μL 탈이온수
o
총 부피= 20 μL
·
제조 단계:
o
샘플을 와동에 의해 혼합한다.
o
3 분 동안 끓인다.
o
잠시 원심분리하고 실온으로 냉각시킨다.
o
다시 와동시킨다.
겔의 셋업 및 진행:
·
밀리 큐(Milli Q) H2O 760 mL에 20X 진행 완충제 40 mL를 첨가한다.
·
겔을 파우치로부터 제거하고, 탈이온수로 헹군다. 이어서, 이들을 전기영동 유닛에 놓아, 플레이트의 보다 짧은 면이 대면하도록 한다. 일단 이들이 제자리에 고정되면, 진행 완충제를 내부 챔버에 첨가한다 (대략 200 mL). 계속하기 전에 누출을 점검한다. 나머지 진행 완충제를 외부 챔버에 첨가한다.
·
진행 완충제로 웰을 헹군다.
·
상기로부터 제조된 원하는 양의 샘플을 5 μL의 바이오래드 웨스턴 표준과 함께 로딩한다.
·
겔을 대략 1 시간 동안 150 볼트, 실온에서 진행한다 (염료 전방이 겔의 바닥에 도달하도록 충분히 긴 시간 진행한다).
전달 셋업:
·
1,000 mL의 전달 완충제: 50 mL 20X 트리스-글리신 블롯팅 완충제 + 200 mL 메탄올 + 770 mL MQH2O를 만든다. 전달을 냉각 상태로 유지하기 위해 완충제를 식힌다.
·
스폰지를 전달 완충제에 침지한다.
·
샌드위치를 셋업하기 전에, 겔(들)을 전달 완충제 중에서 7 분 동안 및 니트로셀룰로스(NC) 막/블롯팅 막을 전달 완충제 중에서 10 분 동안 평형화시킨다.
·
샌드위치 셋업: 파라필름 조각에 사전-침지된 와트만(Whatman)지 조각을 셋 다운(set down)한다. 사전-침지된 겔을 와트만지의 상부에 놓는다. 사전-침지된 NC 막을 겔의 상부에 놓는다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 임의의 기포를 제거하기 위해 막을 부드럽게 롤링한다. NC 막 상부에 사전-침지된 와트만지 조각을 놓는다. 다시 상부를 부드럽게 롤링하여 기포를 제거한다. 샌드위치를 픽업하고 블롯 모듈 내에 놓인 2 개의 스폰지(모든 전달 완충제를 제거하도록 압착된)의 상부에 놓는다. 오직 하나의 겔만을 진행하면, 나머지 블롯 모듈을 압착된 스폰지로 이들이 유닛 위 대략 0.5 ㎝에 점착되도록 채운다. 2 개의 겔을 진행하면, 1 개의 압착된 스폰지를 제1 샌드위치의 상부에 놓는다. 제2 샌드위치를 상기와 같이 정확하게 셋업한다. 이를 스폰지의 상부에 놓는다. 나머지 블롯 모듈을 상기와 같이 스폰지로 채운다.
·
블롯 모듈에서 겔/막 샌드위치를 덮기에 충분한 전달 완충제를 사용한다. 외부 완충제 챔버에 대략 550 mL MQH2O를 사용한다.
·
30 볼트, 실온에서 90 분 동안 진행한다.
웨스턴 블롯:
·
젠스크립트 원-아워 웨스턴 키트 프로토콜; TMB 기질을 사용한 신호 발생.
·
10 μL 항-His Ab + 100 μL WB-1; 50 μL/겔 사용.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 일상적일 뿐인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
참고문헌
문헌 [Bose JL et al., 2013. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology 79:2218-2224.]
문헌 [Jentsch S. 1983. Restriction and modification in Bacillus subtilis: Sequence specificities of restriction/modification systems BsuM, BsuE, and BsuF. Journal of Bacteriology. 156:800-808.]
문헌 [Kost C. et al., 2012. PLOS One. Vol. 7, Issue 7. E41349.]
문헌 [Moscoso M et al., 2017. Protective efficacy of a D-alanine auxotroph Staphylococcus aureus as a vaccine candidate against staphylococcal disease. 27th ECCMID, April 22, 2017, Vienna, Austria.]
문헌 [Pucci M.J. et al., 1992. J of Bacteriology. p.336-342.]
문헌 [Thompson R et al., 1998. Pathogenicity and immunogenicity of a Listeria monocytogenes strain that requires D-alanine for growth. Infection and Immunity 66:3552-3561.]
SEQUENCE LISTING
<110> AZITRA INC
<120> AUXOTROPHIC STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS BACTERIUM
<130> 129062-00320
<140> PCT/US2019/012287
<141> 2019-01-04
<150> 62/614,096
<151> 2018-01-05
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 1
atgcgaattc atgagcgata cttatttgaa tc 32
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 2
ctatgcgatt gaatatactt ttccttagca tcctcttcat taac 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 3
gttaatgaag aggatgctaa ggaaaagtat attcaatcgc atag 44
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 4
agctgtcgac agcagcatac caatgtcaat c 31
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 5
catacgaaga tcgaggctac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 6
gtaccaactt gtccgtcttg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 7
ttgatttaga caattggaag ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 8
aagtacagtc ggcattatct c 21
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
tttacatatg attcagaaac gtaagcggac agtttcg 37
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
tttttcttgg aattgtgctg cctgcaggtt agtgatggtg 40
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
acgtctcgag ctgatatttt tgactaaacc aaatg 35
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 12
ctgacctgca ggagatgatc cgctactaac gac 33
Claims (16)
- 2 개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(alr1 및 alr2); 및
불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat)
를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아. - 제1항에 있어서, 성장을 위해 D-알라닌에 의존적인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제1항에 있어서, 스타필로코쿠스 에피데르미디스(에스. 에피데르미디스), 및 그의 아종인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제4항에 있어서, 추가의 돌연변이가 불활성화된 글루탐산 라세마제 유전자, MurI를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pUBTR114-기반 벡터로 형질전환되는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제6항에 있어서, pUBTR114-기반 벡터가 pUBTR119*-Sal-GFP인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- (i) 불활성 알라닌 라세마제 유전자 alr1 및 alr2를 포함하는 스타필로코쿠스 균주의 적격 세포(SEΔalr1Δalr2) 내로 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 형질전환시키는 단계;
(ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
(iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계
를 포함하는, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법. - 제8항에 있어서, D-알라닌 영양 요구에 대해 단리된 콜로니를 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 형질전환체 내의 녹아웃 플라스미드의 존재가 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출되는 방법.
- 제8항에 있어서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아가 스타필로코쿠스 에피데르미디스(에스. 에피데르미디스), 및 그의 아종인 방법.
- 제8항에 있어서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 pUBTR114-기반 벡터로 형질전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, pUBTR114-기반 벡터가 pUBTR119*-Sal-GFP인 방법.
- 제8항의 방법에 의해 생산된 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
- 제1항 내지 제8항 및 제14항 중 어느 한 항의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함하는 키트.
- 제15항에 있어서, pUBTR114-기반 벡터를 추가로 포함하는 키트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862614096P | 2018-01-05 | 2018-01-05 | |
| US62/614,096 | 2018-01-05 | ||
| PCT/US2019/012287 WO2019136207A1 (en) | 2018-01-05 | 2019-01-04 | Auxotrophic strains of staphylococcus bacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200106171A true KR20200106171A (ko) | 2020-09-11 |
Family
ID=67143803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207022209A KR20200106171A (ko) | 2018-01-05 | 2019-01-04 | 스타필로코쿠스 박테리아의 영양 요구성 균주 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11041217B2 (ko) |
| EP (1) | EP3735268A4 (ko) |
| JP (2) | JP2021509582A (ko) |
| KR (1) | KR20200106171A (ko) |
| CN (2) | CN111788299A (ko) |
| AU (1) | AU2019205388A1 (ko) |
| BR (1) | BR112020013669A2 (ko) |
| CA (1) | CA3088851A1 (ko) |
| IL (1) | IL275843A (ko) |
| WO (1) | WO2019136207A1 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111788299A (zh) * | 2018-01-05 | 2020-10-16 | 阿兹特拉公司 | 葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株 |
| JP2022513599A (ja) * | 2018-11-16 | 2022-02-09 | アジトラ インコーポレーテッド | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の栄養要求性株 |
| WO2023150176A1 (en) * | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Azitra Inc | Expression of the human lekti gene from the chromosome of staphylococcus epidermidis |
| CN117568241B (zh) * | 2024-01-15 | 2024-05-14 | 佛山科学技术学院 | 一株具有对硝酸盐较高还原力的鱼发酵葡萄球菌 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5452794A (en) * | 1977-09-30 | 1979-04-25 | Kousaku Yoshida | Extracting of polysacchride from capusle containing epidermis staphylococus |
| US6703025B1 (en) * | 1998-08-31 | 2004-03-09 | Inhibitex, Inc. | Multicomponent vaccines |
| KR100427587B1 (ko) * | 2001-01-12 | 2004-04-27 | 주식회사 바이오리더스 | 신규 ｄ-글루탐산 합성효소 유전자 ｄｎａ 및 이를 이용한 항생제 비의존성 벡터 |
| EP2341929B1 (en) | 2008-10-06 | 2017-01-25 | University Of Chicago | Compositions and methods related to bacterial emp proteins |
| AU2012245357B2 (en) * | 2011-04-21 | 2017-06-08 | The Rockefeller University | Streptococcus bacteriophage lysins for detection and treatment of gram positive bacteria |
| US10517939B2 (en) | 2013-10-11 | 2019-12-31 | Servicio Galego De Saúde (Sergas) | Live attenuated vaccines |
| ES2586979B1 (es) * | 2015-04-15 | 2017-07-25 | Fundación Profesor Novoa Santos | Vacunas vivas atenuadas de staphylococcus aureus |
| CN111788299A (zh) * | 2018-01-05 | 2020-10-16 | 阿兹特拉公司 | 葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株 |
-
2019
- 2019-01-04 CN CN201980017381.5A patent/CN111788299A/zh active Pending
- 2019-01-04 CA CA3088851A patent/CA3088851A1/en active Pending
- 2019-01-04 EP EP19736206.4A patent/EP3735268A4/en active Pending
- 2019-01-04 KR KR1020207022209A patent/KR20200106171A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-01-04 WO PCT/US2019/012287 patent/WO2019136207A1/en unknown
- 2019-01-04 AU AU2019205388A patent/AU2019205388A1/en active Pending
- 2019-01-04 CN CN202311667426.8A patent/CN117866859A/zh active Pending
- 2019-01-04 US US16/239,871 patent/US11041217B2/en active Active
- 2019-01-04 JP JP2020537207A patent/JP2021509582A/ja active Pending
- 2019-01-04 BR BR112020013669-7A patent/BR112020013669A2/pt unknown
-
2020
- 2020-07-05 IL IL275843A patent/IL275843A/en unknown
-
2021
- 2021-05-14 US US17/320,471 patent/US20220112455A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-12-08 JP JP2023208006A patent/JP2024028933A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11041217B2 (en) | 2021-06-22 |
| US20190256935A1 (en) | 2019-08-22 |
| AU2019205388A1 (en) | 2020-07-23 |
| WO2019136207A1 (en) | 2019-07-11 |
| US20220112455A1 (en) | 2022-04-14 |
| CN111788299A (zh) | 2020-10-16 |
| CN117866859A (zh) | 2024-04-12 |
| JP2021509582A (ja) | 2021-04-01 |
| IL275843A (en) | 2020-08-31 |
| EP3735268A4 (en) | 2021-12-22 |
| BR112020013669A2 (pt) | 2020-12-01 |
| CA3088851A1 (en) | 2019-07-11 |
| JP2024028933A (ja) | 2024-03-05 |
| EP3735268A1 (en) | 2020-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220112455A1 (en) | Auxotrophic strains of staphylococcus bacterium | |
| JPH11513562A (ja) | 組換えプラスミドの生産方法 | |
| Donohue et al. | Cloning and expression of the Rhodobacter sphaeroides reaction center H gene | |
| TWI327067B (en) | Antifungal protein and usage thereof | |
| Roland et al. | Isolation and characterization of a gene, pmrD, from Salmonella typhimurium that confers resistance to polymyxin when expressed in multiple copies | |
| Kimura et al. | Characterization of zoospore type IV pili in Actinoplanes missouriensis | |
| WO2018195136A1 (en) | Compositions and methods for regulated gene expression | |
| Thomas et al. | Insertional inactivation of the flaH gene in the archaeon Methanococcus voltae results in non-flagellated cells | |
| Zhang et al. | Human-associated bacteria adopt an unusual route for synthesizing 3-acetylated tetramates for environmental adaptation | |
| Pliego et al. | Response of the biocontrol agent Pseudomonas pseudoalcaligenes AVO110 to Rosellinia necatrix exudate | |
| JP2017503528A (ja) | コリスチンシンセターゼ及び対応する遺伝子のクラスター | |
| CA2116422A1 (en) | Cloning and identification of a two component signal transducing regulatory system from bacteroides fragilis | |
| CN114891821B (zh) | 一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用 | |
| Sun-Hee et al. | Isolation of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase gene (amiB) from Vibrio anguillarum and the effect of amiB gene deletion on stress responses | |
| CN112143741B (zh) | 一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法 | |
| US20170335360A1 (en) | Bacillus megaterium recombinant protein expression system | |
| JP2003528569A (ja) | バチルス・セレアス由来のゼッターマイシンａの生合成遺伝子 | |
| JP2022150425A (ja) | 環境によって制御される生存能を有する細胞 | |
| CN105849083B (zh) | ［s,s］-edds生物合成基因和蛋白和用于生物合成[s,s]-edds的方法 | |
| CN112969781A (zh) | 葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株 | |
| RU2188233C2 (ru) | Штамм бактерий bacillus subtilis pbcole2-продуцент гибридного колицина e2, используемый для получения ветеринарного препарата | |
| FR3082208A1 (fr) | Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote | |
| JP2012165686A (ja) | ファージ由来大腸菌溶菌遺伝子の宿主細胞致死性選択マーカー | |
| JP2019187284A (ja) | 脂肪族アルコール合成細菌及び脂肪族アルコールの製造方法 | |
| KR20150145806A (ko) | 전사조절 시그마 인자 ＳｉｇＡ-ｖｍ 및 이 인자의 과발현에 의한 글라이코펩타이드 계열 화합물의 생산성 증대 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |