ES2586979B1 - Vacunas vivas atenuadas de staphylococcus aureus - Google Patents

Vacunas vivas atenuadas de staphylococcus aureus Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona cepas bacterianas de S. aureus auxótrofas para D-alanina, útiles como vacunas en mamíferos, suficientemente avirulentas (atenuadas) como para evitar efectos patológicos inaceptables, sin sustancialmente ninguna probabilidad de revertir a una cepa de tipo salvaje virulenta y capaces de inducir un nivel suficiente de inmunidad en el huésped como para inducir una protección aceptable frente a una infección por S. aureus en un mamífero.

Description

VACUNAS VIVAS ATENUADAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
CAMPO DE LA INVENCiÓN Se proporcionan vacunas de bacterias vivas atenuadas de Staphylococcus aureus. También se proporcionan los métodos por los que tales vacunas se pueden obtener.
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN Staphylococcus aureus (S. aureus) es un agente patogénico ubicuo que se considera parte de la microbiota normal del ser humano, de hecho se encuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las defensas de la piel disminuyen puede causar enfermedad. El principal grupo de riesgo son pacientes hospitalizados o inmunocomprometidos. A día de hoy, cerca de 2 mil millones de personas en el mundo han sido colonizadas por este microorganismo.
Los seres humanos son un reservaría natural de S. aureus. Entre el 30 y el 50% de los adultos sanos están colonizados, y entre el 10 y el 20% se mantienen colonizados persistentemente. Dicha colonización acontece de forma selectiva en los orificios nasales o narinas (20-40%, en adultos), pliegues intertriginosos, perineo, axilas y vagina. La colonización por S. aureus ocurre con tasas más elevadas en:
1.
Personas con diabetes tipo 1;
2.
usuarios de drogas intravenosas;
3.
pacientes con hemodiálisis;
4.
pacientes quirúrgicos; yen
5.
personas con SIDA.
Los estafilococos se diseminan, normalmente, por la realización de actividades domésticas y comunitarias comunes tales como hacer la cama, vestirse o desvestirse y por determinados grupos humanos que constituyen verdaderos vectores biológicos. En este sentido, el personal sanitario resulta uno de los principales vectores biológicos de diseminación de este tipo de bacteria. Los manipuladores de alimentos también favorecen la diseminación de S. aureus enterotoxigénicos, contribuyendo al desarrollo de intoxicaciones alimentarias.
Desde 1970 se ha detectado un incremento paulatino en la incidencia de infecciones nosocomiales por S. aureus. Así, durante el periodo de 1990 a 1992, S. aureus fue considerado uno de los principales agentes etiológicos de neumonía adquirida en hospitales.
Hoy en día se ha detectado un incremento considerable, probablemente debido a la presión antibiótica, de cepas de S. aureus con resistencia a diferentes fármacos antimicrobianos. Entre ellos el estafilococo resistente a meticilina y el estafilococo resistente a vancomicina. Por esta razón existe la necesidad de incrementar el arsenalprofiláctico y/o terapéutico existente frente a esta bacteria.
BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN La presente invención proporciona cepas bacterianas de S. aureus auxotrófas para 0alanina, útiles como vacunas en sujetos humanos, suficientemente avirulenlas (atenuadas) como para evitar efectos patológicos inaceptables, sin sustancialmente ninguna probabilidad de revertir a una cepa de tipo salvaje virulenta y capaces de inducir un nivel suficiente de inmunidad en el huésped como para inducir una protección aceptable frente a una infección por S. aureus en un sujeto humano.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para la producción de cepas vivas atenuadas de Staphylococcus aureus que comprende las siguientes etapas:
a.
Proporcionar una cepa bacteriana de Staphylococcus aureus capaz de expresar alanina racemasa y O-aminoácido transaminasa, e
b.
Inactivar al menos uno de los genes que codifican las enzimas alanina racemasas y los genes que codifican para la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que dicha inactivación resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxotrófa para 0-alanina.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el método comprende la inactivación del gen alr1 que codifica la enzima alanina racemasa 1 y del gen dat que codifica la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional y la O-aminoácido transaminasa funcional Oat.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el método comprende la inactivación de los genes alr1 y alr2 que codifican las enzimas alanina racemasas y el gen dat que codifica la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional, la alanina racemasa Alr2 funcional y la O-aminoácido transaminasa funcional Oal.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus obtenida u obtenible mediante el método del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus, caracterizada porque dicha cepa comprende ¡nactivados uno o mas genes que codifican la enzima alanina racemasa y los genes que codifican la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar una alanina racemasa funcional y una O-aminoácido transaminasa funcional, y en el que la ¡nactivación de dichos genes resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxotrófa para 0alanina.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, dicha cepa se caracteriza por la inactivación de los loci alr1 y dat, preferiblemente de los loci alr1, alr2 y dat.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en el segundo o tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dicha composición es una composición farmacéutica que opcionalmente comprende vehículos farmacéuticamente aceptables así como excipientes y/o otros principios activos, más preferiblemente dicha composición es una vacuna que opcionalmente comprende vehículos farmacéutica mente aceptables así como excipientes, adyuvantes y/o otros principios activos. Los adyuvantes, excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son portadores conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones proporcionadas por esta invención se pueden facilitar a través de cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma de dosificación adecuada y con los excipientes que son farmacológicamente aceptables para la vía de administración elegida.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a la composición del cuarto aspecto de la invención, para su uso en terapia .
Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en el segundo o tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento profiláctico frente a una infección por Staphylococcus aureus en un mamífero.
Alternativamente, el sexto aspecto de la invención se refiere a la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en el segundo o tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas, para su uso en el tratamiento profiláctico frente a una infección por
Staphylococcus aureus en un mamífero, preferiblemente en un humano.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en F(ab')2, Fab', Fab, Fv, quot;r IgGquot; y Fe, obtenido u obtenible tras la inmunización de un mamífero con la bacteria viva atenuada auxótrofa para D-alanina lal y como se ha definido ésta en el segundo o tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos del séptimo aspecto de la invención, para la elaboración de un medicamento para su uso en una terapia de inmunización pasiva frente a Staphylococcus aureus en un mamífero, preferiblemente en un sujeto humano. Alternativamente, el octavo aspecto de la invención se refiere a los anticuerpos o fragmentos de los mismos del séptimo aspecto de la invención, para su uso en una terapia de inmunización pasiva frente a Staphylococcus aureus en un mamífero, preferiblemente en un sujeto humano.
Un noveno aspecto de la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos del séptimo aspecto de la invención, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento terapéutico (tras la manifestación clínica de la infección) de una infección de Staphylococcus aureus en un mamífero, preferiblemente en un sujeto humano. Alternativamente, el noveno aspecto de la invención se refiere a los anticuerpos o fragmentos de los mismos del séptimo aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento terapéutico (tras la manifestación clínica de la infección) de una infección de Staphylococcus aureus en un mamífero, preferiblemente en un sujeto humano.
Un décimo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para la producción de una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, que comprenda cepas vivas atenuadas de Staphylococcus aureus, que comprende las siguientes etapas:
a.
Proporcionar una cepa bacteriana de Staphylococcus aureus capaz de expresar alanina racemasa y O-aminoácido transaminasa;
b.
Inactivar al menos uno de los genes que codifican las enzimas alanina racemasa y los genes que codifican para la O-aminoácido transaminasa, de
tal manera que dicha ¡nactivación resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxótrofa para 0-alanina; y
c. Generar una composición farmacéuticamente aceptable, preferiblemente una vacuna, que comprenda dicha bacteria viva atenuada donde dicha composición preferiblemente comprende un vehículo y excipientes farmacéuticamente aceptables así como adyuvantes en el supuesto que dicha composición sea una vacuna.
En una realización preferida del décimo aspecto de la invención, el método comprende la ¡nactivación del gen alr1 que codifica la enzima alanina racemasa y del gen dat que codifica la D-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional y la D-aminoácido transaminasa funcional Oat.
En otra realización preferida del décimo aspecto de la invención, el método comprende la inactivación de los genes alr1 y alr2 que codifican las enzimas alanina racemasas y el gen dat que codifica la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional, la alanina racemasa Alr2 funcional y la D-aminoácido Iransaminasa funcional Dat.
BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra de forma esquemática la estructura general de la pared bacteriana de las bacterias Gram-positivas (ácidos teicoicos y lipoteicoicos no representados). PG, peptidoglicano. M, membrana plasmática.
La figura 2 muestra de forma esquemática las rutas metabólicas implicadas en la formación de la D-alanina. Los genes alr1 , alr2 y dat codifican las proteínas Alr1 , Alr2 y Dat, respectivamente.
La figura 3 muestra el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos de las alaninas racemasas de Staphylococcus aureus 132 (ALR1_STAPH132 y ALR2_STAPH132), Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 (ALR_MYCTU ), Streptocuccus pneumoniae serotipo 4 (ALR_STRPN), Listeria monocytogenes serotipo 4b (ALR_LlSMC) y Bacillus subtilis 168 (ALR1_BACSU y ALR2_BACSU) utilizando el programa Cluslal Omega (1.2.1). Los aminoácidos conservados en todas las alaninas racemasas se muestran sombreados
en negro y los aminoácidos con propiedades fisicoquímicas similares se indican con fondo gris.
La figura 4 muestra el cribado de las colonias resultantes del segundo evento de recombinación durante la construcción del triple mutante IJ.datll::.alrlll1alr2 de S. aureus 132. Las colonias individuales fueron seleccionadas desde agar TSB con 5 mM de D-alanina e inoculadas en la misma posición en placas de agar TSB con y sin 5 mM D-alanina y en presencia o no de eritromicina (Ery, 10 I-Ig/mL) y X-Gal (150 I-Ig/mL). Las colonias con el genotipo lldatlb.alr1 /b.alr2 son sensibles a eritromicina y crecen exclusivamente en placas con D-alanina.
La figura 5 muestra el crecimiento de los rnutantes l:J.dat, b.datlllalr1, lldatll:J.alr2 y lldatlllalrllb.alr2 de S. aureus 132 en medio líquido TSB en presencia (panel A) o no (panel B) de 5 mM de D-alanina, tras 24 h de incubación a 3rC con agitación. Las cepas doble l::.datlllalr1 y triple l::.datlb.alrllb.alr2 mutante muestran un crecimiento normal en TSB suplementado con 5 mM de D-alanina, pero no se observa ningún crecimiento visible en ausencia de este compuesto. Sin embargo, las cepas S. aureus 132 salvaje y el doble mutante lldatlllalr2 crecen normalmente en presencia o ausencia de D-alanina
La figura 6 muestra la confirmación por PCR de las deleciones génicas en los mutantes l::.dat, I1datll1alrl , MaMalr2 y Matll1alrlll1alr2 de S. aureus 132 (cepa salvaje). A. Los oligonucleótidos alr1EXT-F y alr1EXT-R se utilizaron para originar fragmentos alr1-EXT con 1600 pb a partir de las cepas portadoras dellocus salvaje alr1 o un fragmento de 451 pb a partir de cepas portadoras del locus mutante llalr1 . Los oligonucleótidos alr1-F y alr1-R se utilizaron para generar un fragmento interno del gen alr1 (alr1-INT) con 491 pb solo a partir de las cepas portadoras dellocus salvaje alr1. B. Los oligonucleótidos alr2EXT-F yalr2EXTR se utilizaron para originar fragmentos alr2-EXT con 1521 pb a partir de las cepas portadoras dellocus salvaje alr2 o un fragmento de 469 pb a partir de cepas portadoras del locus mutantel::.alr2. Los oligonucleótidos alr2-F y alr2-R se utilizaron para generar un fragmento interno del gen alr2 (alr2-INT) con 519 pb solo a partir de las cepas portadoras del locus salvaje alr2. C. Los oligonucleótidos datEXT-F y datEXT-R se utilizaron para originar fragmentos dat-EXT con 1892 pb a partir de las cepas portadoras dellocus salvaje dat o un fragmento de 1049 pb a partir de cepas portadoras del locus mutante I1dat. D. Los oligonucleótidos dat-F y dat-R se utilizaron para generar un fragmento interno del gen dat (dat-INT) con 540 pb solo a partir de las cepas portadoras dellocus salvaje dato M, patrón de pesos moleculares.
La figura 7 muestra los ensayos de crecimiento y viabilidad de las cepas S. aureus 132 salvaje y triple mutante l1datllJ.alrlllJ.alr2. La cepa mutante l1datllJ.alr1flJ.alr2 presenta un crecimiento normal en medio de cultivo TSB suplementado con 5 mM de O-alanina, pero no
es capaz de crecer sin el aporte exógeno de este compuesto. Sin embargo, la cepa salvaje crece de forma normal en medio TSB con y sin la adición de O-alanina. A. Turbidez del cultivo. B. Viabilidad del cultivo.
La figura 8 muestra la determinación de la concentración mínima de D-alanina necesaria para el crecimiento del mutante b.datlllalr1l11alr2 de S. aureus 132 sobre medio TSB agar. Cultivos de la cepa salvaje y el triple mutante crecidos en medio TSB suplementado con 10 mM de D-alanina hasta una OD6OOnm de 0,2 se sembraron (100 I-IL) en TSB agar sin Dalanina (O mM) o con D-alanina a concentraciones desde 0,005 mM hasta 10 mM como se indica en la figura. A. Cepa salvaje S. aureus 132. B. Triple mutante lldatlllalr1!llalr2 de S. aureus 132.
La figura 9 muestra alteraciones a nivel morfológico en el triple mutante S. aureus 132 I1dat/l1a/r1/l1a/r2 (panel B) con respecto a su homólogo salvaje (panel A) en presencia de diferentes concentraciones de D-alanina. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio electrónico de barrido a dos escalas diferentes (5 o 20 I-Im).
La figura 10 muestra diferentes morfologías atípicas, degeneración progresiva de la pared celular y la lisis de la cepa mutante S. aureus 13211datlllalr1l11alr2 cuando se mantiene en ausencia de D-alanina. Como control se muestra la cepa salvaje con su pared celular intacta. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio electrónico de transmisión a escalas diferentes según lo especificado por barras horizontales. Las flechas negras indican las células bacterianas intactas con morfología normal; las flechas discontinuas indican células fragmentadas y sin pared celular bacteriana, las células lisadas y el material genético disperso.
La figura 11 muestra la evaluación de la estabilidad del fenotipo auxótrofo en la cepa de S. aureus 132 lldatlllalr1l11alr2. En la gráfica se representa el número de colonias de la cepa mutante recuperadas en TSB agar (símbolos abiertos) y TSB suplementado con 5 mM de Dalanina (símbolos cerrados) a lo largo del tiempo, cuando esta cepa se cultivó en medio líquido TSB suplementado con 5 mM de D-alanina a 3rC con agitación (210 rpm) durante 11 días. A. UFC/mL. B. Log UFC/mL. *Plt;0.0001 , según la prueba t de Student.
La figura 12 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones BALB/c infectados por vía intraperitoneal con S. aureus 132 de tipo salvaje (A) y la cepa triple mutante l1datllJ.alrlllJ.alr2 (B), llevada a cabo en un modelo de sepsis aguda para determinar las dosis letales (DL). A. DL100 para la cepa salvaje igual a 5X, siendo 1X aproximadamente igual a 1 x 107 UFC. B. DL100 para la cepa rnutante igual a 250X en comparación con la cepa de tipo salvaje. La supervivencia se controló durante 14 días.
La figura 13 muestra el LOQ 10 de los títulos a punto final de anticuerpos IgG producidos frente a la cepa isogénica f1spa de S. aureus 132 en ratones BALB/c (n=5) al día 14 (una toma) y 21 (dos tomas) post-vacunación con diferentes dosis de la cepa mutante lldatlllalr1l11alr2 de S. aureus 132, y en los ratones control, no vacunados. Dosis de vacunación: (A) 1 x 106 UFC, (B) 1,5 x 107 UFC, (C) 5 x 107 UFC. Los títulos de anticuerpos fueron determinados por un ELlSA indirecto. Valor P, según la prueba U de Mann-Whitney. *Plt;0,05 y **Plt;0,005 comparado con el grupo de ratones sin inmunizar.
La figura 14 muestra el porcentaje de pérdida de peso a lo largo del tiempo (panel A) y la carga bacteriana en el bazo e hígado de ratones BALB/c (n=5) (panel B) a las 43 horas tras la infección con un inóculo de 2 x 107 UFC de la cepa de tipo salvaje S. aureus 132. Los ratones fueron pre-inmunizados a los días °y 14 con la cepa mutante lldatlllalr1l11alr2
(suministrando una dosis de aproximadamente 1,5 x CFU), o no vacunados (grupo control administrados con suero salino los mismos días). Valor P de acuerdo con la prueba U de Mann-Whitney. En el panel B cada punto representa la carga bacteriana individual del bazo o hígado de un ratón. El valor medio de cada grupo está representado por una línea horizontal.
La figura 15 muestra el porcentaje de la supervivencia de ratones BALB/c (n=5) tras la infección intraperitoneal con una dosis de 2 x 107 UFC de la cepa de tipo salvaje S. aureus
132. Los ratones vacunados se inmunizaron en los días O y 14 con la cepa de S. aureus lldatlllalr1l11alr2 (dosis de aproximadamente 1,5 x 107 UFC) y se desafiaron el día 21 con la cepa salvaje. En los ratones no vacunados se administró una solución salina igualmente a los días O y 14, Y se infectaron con la cepa salvaje el día 21 . **P=0,0046 supervivencia del grupo de ratones vacunados en comparación con el grupo no vacunados. Valor P, según la prueba de Mantel-Cox (Log-rank test). La supervivencia de los ratones se siguió durante 15 días.
La figura 16 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones BALB/c (n=6) tras ser desafiados con una dosis de aproximada de 6 x 107 UFC de la cepa de tipo salvaje S. aureus 132. Los ratones fueron inmunizados pasivamente con suero de ratones vacunados con la cepa S. aureus l1datl!J.alrlll::.alr2 o bien con suero de ratones no inmunizados, en el grupo control. *P=O,0008 supervivencia de los ratones inmunizados pasivamente con el suero de ratones vacunados en comparación con la de ratones no inmunizados. Valor P, según la prueba de Mantel-Cox (Log-rank test). La supervivencia de los ratones se siguió durante 7 días.
La figura 17 muestra la reactividad cruzada (L0910) de los anticuerpos IgG producidos producidos por los ratones BALBlc (n=6) al 7° día después de la segunda toma de la vacuna (dosis aproximada de 1,5 x 107 CFU) y en ratones control (no vacunados) frente a 2 cepas cepas de S. aureus de diferente origen: USA300LAC (origen humano) y RF122 (origen bovino). Los títulos de anticuerpos se determinaron mediante un EUSA indirecto. *P=0.0179 y P=O.0357, respectivamente, en comparación con el grupo de ratones no inmunizados. Valor P de acuerdo con la prueba U de Mann-Whitney.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
DEFINICIONES
En el contexto de la presente invención el término quot;O-alaninaquot; se entiende como el compuesto o molécula con fórmula molecular C3H7N02, peso molecular 89,09 (g/mol) y que se presenta en la forma de O-enantiómero de la alanina. Su nombre sistemático es quot;0alanina~, pero también puede designarse (sin limitarse a) quot;O-Alaquot;, quot;338-69-2quot; quot;(R)-Alaninaquot;, quot;ácido 0-2-amino propanoicoquot;, quot;(2R)-2-aminopropanoicoquot;, quot;forma O-alfa de la alaninaquot;, quot;ácido (R)-2-amino propanoicoquot; y H-O-Ala-OH. Su nomenclatura en el sistema IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) es ácido (2R)-2-amino propanoico y su identificador en la base de datos quot;Pub Che m Compound~ es el 71080.
En el contexto de la presente invención el término quot;alanina racemasaquot; se entiende como la proteína que cataliza la reacción de interconversión de L-alanina a O-alanina, necesaria para la síntesis de la pared bacteriana. Su identificador EC (Enzyme Comission number) es el
5.1.1.1. Esta proteína se identifica fácilmente y de forma invariable en las bases de datos de secuencias nucleotídicas o aminoacídicas por su código EC, que se refiere a una enzima cuya actividad catalítica es L-alanina = O-alanina, ya que su designación puede ser variable.
En el contexto de la presente invención el término quot;D-aminoácido transaminasaquot; se entiende como la proteína que cataliza la reacción de interconversión de D-alanina y 2-oxoglutarato a piruvato y D-glutamato. Su identificador EC (Enzyme Comission number) es el 2.6.1.21. Esta proteína se identifica fácilmente y de forma invariable en las bases de datos de secuencias
5 nucleotídicas u aminoacídicas por su código EC, que se refiere a una enzima cuya actividad catalítica es D-alanina + 2-oxoglutarato = piruvato + D-glutamato, ya que su designación puede ser variable.
En el contexto de la presente invención el término quot;auxótrofa para D-alaninaquot; se entiende como la carencia de una ruta metabólica funcional que genere la sustancia O-alanina, de la 10 que depende para su crecimiento la bacteria así denominada, debido a la incapacidad de sintetizar este compuesto.
En el contexto de la presente invención el término quot;Alr1 quot; se entiende como sinónimo del término quot;alanina racemasa 1quot;.
En el contexto de la presente invención el término quot;Alr2quot; se entiende como sinónimo del término quot;alanina racemasa 2quot;.
En el contexto de la presente invención el término quot;Oa1quot; se entiende como sinónimo del 20 término quot;O-aminoácido transaminasaquot;.
En el contexto de la presente invención el término quot;alr1~ se entiende como un gen o secuencia de nucleótidos que codifica una proteína alanina racemasa. Dependiendo de la cepa de Staphylococcus aureus, los genes cromosómicos codificantes de la proteína alanina
25 racemasa se pueden denominar (sin limitarse a) alr1 o alr, o estar identificados únicamente por su locus cromosómico.
En el contexto de la presente invención el término quot;alr2quot; se entiende como un gen o secuencia de nucleótidos que codifica una proteína alanina racemasa. Dependiendo de la
30 cepa de Staphylococcus aureus, los genes cromosómicos codificantes de la proteína alanina racemasa se pueden denominar (sin limitarse a) alr2 o dal, o estar identificados únicamente por su locus cromosómico.
En el contexto de la presente invención el término quot;daf' se entiende como un gen o 35 secuencia de nucleótidos que codifica una proteína alanina racemasa. Dependiendo de la cepa de Staphylococcus aureus, los genes cromosómicos codificantes de la proteína 0aminoácido transaminasa se pueden denominar (sin limitarse a) dat, o estar identificados únicamente por su locus cromosómico.
En el contexto de la presente invención el término quot;inactivaciónquot; se entiende como el bloqueo de la expresión de un gen concreto o de una proteína, bien sea través de la modificación molecular o regulación negativa de uno o ambos. La modificación molecular incluye el uso de las técnicas convencionales de DNA recombinanle que a su vez incluyen: la sustitución de uno o varios nucleótidos, la inserción de uno o varios nucleótidos, la deleción parcial o total de un gen, la disrupción por mutagénesis inducida químicamente o inducida por radiación. La regulación negativa de la expresión de un gen o proteína incluye el silenciamento génico transcripcional y postranscricional.
En el contexto de la presente invención, el término quot;Staphylococcus aureusquot; se define como cualquier microorganismo que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo quot;Firmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;, orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S. aureus quot;. Los microorganismos así definidos se caracterizan por ser cocos Grampositivos anaerobios facultativos.
En el contexto de la presente invención, el término quot;8alr1quot; se define como la ausencia del locus alr1 en el cromosoma de la cepa S. aureus 132.
En el contexto de la presente invención, el término quot;8alr2quot; se define como la ausencia del locus alr2 en el cromosoma de la cepa S. aureus 132.
En el contexto de la presente invención, el término quot;8daf' se define como la ausencia del locus dat en el cromosoma de la cepa S. aureus 132.
En el contexto de la presente invención, el término udoble mutación 8alr1l8alr2quot; se define como la ausencia simultánea de los locus alr1 y alr2 en el cromosoma de la cepa S. aureus
132.
En el contexto de la presente invención, el término quot;doble mutación 8datl8alr1quot; se define como la ausencia simultánea de los locus dat y alr1 en el cromosoma de la cepa S. aureus
132.
En el contexto de la presente invención, el término quot;doble mutación b.datlb.alr2quot; se define como la ausencia simultánea de los locus da! y alr2 en el cromosoma de la cepa S. aureus
132.
En el contexto de la presente invención, el término quot;triple mutación l::.datll1alrlllJ.alr2quot; se define como la ausencia simultánea de los locus dat, alr1 y alr2 en el cromosoma de la cepa
S. aureus 132.
En el contexto de la presente invención el término quot;132quot; se refiere a cualquier cepa bacteriana con la misma designación y que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo quot;Firmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;, orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S. aureusquot;. Esta es una cepa clínica resistente a la meticilina (Vergara-Irigaray y col., Infection and Immunity, 2009, 77:3978-3991 ), y se utilizó en esta invención como un modelo para generar un mutante auxótrofo de Staphylococcus aureus.
En el contexto de la presente invención, el término quot;13211spaquot; se refiere a un microorganismo con la misma designación y la pertenencia al dominio quot;Bacteriasquot;, phylum quot;Firmicutesquot;, clase quot;bacilosquot;, orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S. aureusquot;. El microorganismo así definido es una cepa de S. aureus 132 con el gen spa delecionado (Vergara-Irigaray y col. , Infection and Immunity, 2009, 77:3978-3991).
En el contexto de la presente invención el término quot;USA300LACquot; se refiere a cualquier cepa bacteriana con la misma designación y que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo quot;Firmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;, orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S. aureusquot;. El microorganismo así definido es una cepa epidémica resistente a meticilina de S. aureus causante de infecciones en la comunidad (descrita en Diep y col. , Lancet, 2006, 367:731-739).
En el contexto de la presente invención el término quot;RF122quot; se refiere a cualquier cepa bacteriana con la misma designación con la secuencia tipo MLST 151 (ST151 ) y complejo clanal 151 (CC151) y que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo quot;Firmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;, orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S. aureusquot;. El microorganismo así definido es una cepa de S. aureus aislada de vaca que presentaba signos clínicos de mastitis (descrita en Herron-Olson L y col. , 2007, PloS One 2:e1120).
En el contexto de la presente invención el término ~ED133quot; se refiere a cualquier cepa
bacteriana con la misma designación con la secuencia tipo MLST 133 (8T133) Y complejo
clonal 133 (CC133 ) y que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo quot;Firmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;,
orden quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceaequot;, género quot;Staphylococcusquot; y especie quot;S.
S
aureusquot;. El microorganismo así definido es una cepa de S. aureus causante de mastitis en
oveja y recuperada en Francia (descrita en Guinane y col. , 2010, Genome Bial Evol 2:454
466).
En el contexto de la presente invención el término quot;ED98quot; se refiere a cualquier cepa
10
bacteriana con la misma designación con la secuencia tipo MLST 5 (8T5) Y complejo clonal
5 (CeS) y que pertenece al dominio UBacteriaquot;, filo uFirmicutesquot;, clase quot;Bacilliquot;, orden
quot;Bacillalesquot;, familia quot;Staphylococcaceae~, género quot;Staphylococcusquot; e especie quot;S. aureusquot;. El
microorganismo así definido es una cepa de S. aureus adaptada a aves de corral y
recuperada de un pollo enfermo (descrita en Lowder y col., 2009, PNAS 106:19545-19550).
15
En el contexto de la presente invención el término quot;DC10Bquot; se refiere a cualquier cepa
bacteriana con la misma designación y que pertenece al dominio quot;Bacteriaquot;, filo
quot;Proteobacteriaquot;, clase quot;Gammaproteobacteriaquot;, orden quot;Enterobacterialesquot;, familia
quot;Enterobacteriaceaequot;, género quot;Escherichiaquot; y especie quot;E. colf'. El microorganismo así
20
definido es una cepa de E. coN DH10B con una deleción del gen dcm y es un huésped
idóneo para la construcción de plásmidos recombinantes que posteriormente se van a
introducir directamente en S. aureus por electroporación (descrita en Monk y col., 2012,
mBio 3(2):e00277 -11).
25
En el contexto de la presente in vención, el término quot;cepas bacterianas auxotrófas para D
alaninaquot; se entiende como cualquier cepa bacteriana incapaz de producir una forma
funcional y/o activa de la enzima alanina racemasa y la enzima O-aminoácido transaminasa.
Esta deficiencia puede ser debida al: bloqueo de la expresión de sus genes codificantes,
modificaciones postranscricionales y modificaciones postraducionales que afecten tanto a la
30
actividad enzimática, a la regulación alostérica o a la localización celular de estas enzimas.
En el contexto de la presente invención el término quot;inmunización pasiva~ se usa para
referirse a la administración de anticuerpos o fragmentos de los mismos, a un individuo con
la intención de conferir inmunidad a ese individuo.
En el contexto de la presente invención, la expresión quot;cantidad terapéuticamente efectivaquot; se refiere a la cantidad de anticuerpos de la invención o de cepas bacterianas atenuadas de la invención que permitan producir el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los portadores conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones proporcionadas por esta invención se pueden facilitar por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada y con los excipientes farmacológicamente aceptables para la vía de administración elegida.
En el contexto de la presente invención, el término quot;vacunaquot; se refiere a una preparación antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Adicionalmente este término incluye las denominadas vacunas terapéuticas que tienen como objeto tratar la enfermedad una vez se hayan manifestados los primeros síntomas clínicos de la misma.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN Las vacunas vivas atenuadas se basan en microorganismos a los que previamente se les ha limitado su capacidad patogénica, pero que conservan su capacidad de inducir una respuesta inmune celular y/o humoral imitando una infección natural, pero sin causar la enfermedad. Una vez que se ha vacunado al animal o al ser humano, la entrada del patógeno microbiano en el huésped induce rápidamente a una quot;rellamadaquot; de la inmunidad anterior que puede controlar el crecimiento adicional del microorganismo antes de que la infección asuma proporciones clínicamente significativas. En este tipo de vacunas, dependiendo del nivel de atenuación, existe el peligro de que el huésped pueda contraer la enfermedad, aunque se genere una respuesta inmune protectora. Por ello, es necesario garantizar la estabilidad genética de la cepa atenuada eliminando cualquier posibilidad de que esta cepa revierta a la cepa silvestre virulenta. Además, resulta crucial que la vacuna provoque un nivel suficiente de inmunidad (protección) en el huésped.
Las cepas bacterianas auxótrofas para D-alanina (D-Ala) han perdido su capacidad para producir D-alanina, componente necesario para la síntesis del peptidoglicano de la pared bacteriana y sustituyente en los ácidos teicoicos de pared y lipoteicoicos asociados a membrana. Como ya se ha comentado, para su uso como vacunas estas cepas deben estar suficientemente atenuadas, pero también han de ser capaces de generar una repuesta inmune efectiva e inducir una protección duradera en el huésped. Esto último no es sencillo. De hecho, la solicitud de patente internacional WO 99/25376 describe una cepa atenuada de Listeria monocytogenes auxótrofa para D-alanina, que además contiene DNA codificante de un antígeno heterólogo (un antígeno HIV-1 ) y el método para su uso como vacuna. Los ejemplos experimentales que se proporcionan en esta solicitud de patente simplemente
establecen que los mutantes atenuados de L. monocytogenes auxótrofos para D-alanina inducen una respuesta inmune celular, pero no consideran una respuesta inmune mediada por anticuerpos (inmunidad humoral) que sea capaz de conferir protección cruzada y por tanto, de generar una respuesta inmune amplia para patógenos mayoritariamente extracelulares, como Staphylococcus aureus, y productores de toxinas. Además, el posible efecto protector del mutante de L. monocytogenes auxótrofa para D-Ala, se determinó a partir del recuento de bacterias en el bazo de ratones pre-inmunizados que posteriormente fueron infectados con la cepa silvestre de Listeria. Sin embargo, no se realizaron ensayos de supervivencia, que serían claves para poder medir la eficacia protectora de la vacuna frente a infecciones bacterianas agudas y letales. Asimismo, los autores reconocen que el mutante auxótrofo de Listeria proporciona una baja protección cuando se administra en ausencia de D-alanina, o lo que es lo mismo, deben suplementar con D-alanina el inóculo inicial del mutante para poder alcanzar el mismo nivel de protección que la cepa silvestre, con lo cual reducen la dosis letal del mutante, limitando seriamente la seguridad de la vacuna.
Además, la dosis de la cepa atenuada de Listería monocytogenes auxótrofa para de D107
alanina necesaria para conseguir un nivel de protección aceptable (2 x CFU), y determinada mediante recuento de la carga bacteriana presente en bazo, es muy cercana a la DLso cuando se inyecta en presencia de D-Ala (7 x 107 CFU), lo cual limita seriamente su uso como vacuna. Un nivel de protección equiparable ya se consigue inoculando la cepa parental en una dosis 100 veces inferior a la DLso (1 x 104 CFU). La administración de una
dosis 100 veces inferior (2 x CFU), que estaría dentro unos límites de seguridad aceptables, reduce al 50% la eficacia de la vacuna en términos de protección (Thompson y col., Infect Immun, 1998, 66:3552-3561). Todos estos datos ponen de relieve que la suplementación de D-alanina en el inóculo de la cepa atenuada condiciona seriamente que la administración de la vacuna sea segura y aumentaría el riesgo de efectos patológicos indeseables en el huésped.
En contra, los datos recogidos en la presente solicitud de patente, muestran que la cepa Staphylococcus aureus auxótrofa para D-alanina está altamente atenuada en un modelo murino de infección sistémica, presentando una dosis letal 100 (DL100; dosis mínima necesaria para reducir la supervivencia de los ratones al 0%) significativamente más alta que la DL100 que presenta la cepa silvestre y además, es capaz de proporcionar un nivel
significativo de protección en los ratones frente a la muerte en ensayos de supervivencia sin que exista la necesidad de añadir un suplemento de D-alanina en el ¡nácula inicial. Igualmente, se demostró que este candidato vacunal es capaz de inducir significativamente una respuesta inmune mediada por anticuerpos en ratones inmunizados con dos tomas de la vacuna y que dichos anticuerpos son capaces de reconocer cepas heterólogas de S. aureus, o lo que es lo mismo, se pone de manifiesto que la vacuna tiene la capacidad de generar una respuesta inmune amplia en el huésped. Estos anticuerpos pueden, a su vez, usarse para inmunizar pasivamente a los ratones, conferiéndoles una protección frente a la muerte por una enfermedad letal aguda causada por S. aureus, como también se recoje en la presente solicitud de patente Por ejemplo, la inmunización pasiva con anticuerpos dirigidos contra la toxina tetánica , es un tratamiento que podría salvar la vida del paciente en una infección aguda por Clostridium tetani (también una bacteria gram-positiva). Además, se ha demostrado que la cepa bacteriana auxótrofa para D-Ala no tiene sustancialmente ninguna probabilidad de revertir a la cepa silvestre virulenta.
Asimismo, los autores de la presente invención han demostrado que la pre-inmunización de los ratones con un mutante auxótrofo para D-alanina de la especie S. aureus produce una reducción significativa en la carga bacteriana en bazo e hígado de los ratones infectados con una dosis letal de S. aureus.
La inmunidad humoral (mediada por anticuerpos) es la principal respuesta específica protectora contra las bacterias extracelulares, como S. aureus. Los polisacáridos de las paredes celulares y de las cápsulas de estos microorganismos (tanto Gram-positivos como Gram-negativos) constituyen unos de los componentes más inmunogénicos de las mismas y son el prototipo de antígeno T independiente. Dichos antígenos estimulan a las células B que generan una respuesta de inmunoglobulina (Ig) M Y G específica contra los antígenos de superficie (polisacarídicos o proteicos) y las toxinas bacterianas, que estimulan los mecanismos efectores para favorecer su fagocitosis por via celular (monocitos, macrófagos y neutrófilos). Por otra parte, las Ig producidas neutralizan las toxinas bacterianas impidiendo que se unan a sus células blanco, promoviendo su fagocitosis. Algunas toxinas bacterianas (superantígenos) pueden también estimular inespecíficamente a las células T, y en consecuencia se liberan grandes cantidades de citoquinas y mediadores inflamatorios que finalizan con la producción del síndrome del shock tóxico. La toxina del síndrome del chock tóxico de S. aureus (T88T) es un ejemplo de estos superantígenos.
A su vez, las bacterias intracelulares como Mycobacterium y Usteria monocytogenes, son capaces de sobrevivir y replicar dentro de células del huésped y aún dentro de fagocitos, y como están en un nicho inaccesible a los anticuerpos circulantes, su eliminación require
mecanismos inmunes distintos a los ya vistos para las bacterias extracelulares.
Por lo tanto, resulta claro que el tipo de respuesta inmune generado por una vacuna -que puede ser mediado por células o anticuerpos u ambos, puede afectar el nivel de protección frente a un determinado microorganismo, si éste se trata de un patógeno extracelular o intracelular. No se puede prever así que una vacuna compuesta por una cepa de Listeria monocytogenes auxótrofa para D-alanina pueda generar una respuesta que proteja frente a una infección de origen extracelular.
Otra de las diferencias significativas entre S. aureus y Listeria monocytogenes que puede afectar al tipo de respuesta inmune es la constitución de su pared.
La pared celular bacteriana es una estructura altamente organizada y compleja que permite a las bacterias interaccionar con el medio que les rodea, les da su forma característica y les proporciona protección mecánica. El peptidoglicano, que constituye la estructura básica de la pared celular de las eubacterias, es un copolímero formado por una secuencia alterna de N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico unidos mediante enlaces [3-1,4. La capa de peptidoglicano es sustancialmente más gruesa en las bacterias Gram-positivas (20 a 80 nm) que en las bacterias Gram-negativas (7-8 nm) y constituye alrededor del 90% del peso seco de las bacterias Gram-positivas frente al 10% en bacterias Gram-negativas. Además del peptidoglicano, la pared celular de bacterias Gram-positivas se encuentra compuesta de ácidos teicoicos, que están presentes en pequeñas cantidades y embebidos en la pared de la bacteria como polisacáridos ácidos. El término de ácidos teicoicos se refiere a los polímeros de la pared que contienen unidades de glicerolfosfato o de ribitolfosfato. Estos polialcoholes están unidos por ésteres fosfato y a menudo presentan unidos otros azúcares y D-alanina. Algunos de estos ácidos que contienen glicerol están unidos a lípidos de la membrana de las bacterias Gram-positivas y debido a esta íntima asociación con lípidos, estos ácidos teicoicos se denominan también ácidos lipoteicoicos.
Como se ilustra en la figura 1, la D-alanina es uno de los principales componentes de la pared celular de peptidoglicano y por lo tanto la D-alanina es necesaria para la síntesis de la pared celular. Dos tipos de enzimas catalizan la formación de D-alanina (véase la figura 2):
1.
La alanina racemasa, Alr (EC 5.1 .1.1), una enzima que calaliza la racemización reversible entre enantiómeros de alanina (L-alanina y D-alan¡na); y
2.
O-aminoácido transaminasa, Dat (EC 2.6.1.21 ), una enzima que cataliza la reacción reversible de transaminación entre el piruvato y el D-glutamato para dar D-alanina y 2-oxoglutarato.
La O-alanina, una vez sintetizada, se incorpora inicialmente en la cadena peptídica unida a los residuos del ácido N-acetilmurámico del peptidoglicano como dipéptido D-alanil-Dalanina.
En el peptidoglicano de la pared celular de S. aureus se encuentra una L-lisina en la tercera posición de la cadena peptídica que está unida el ácido N-acetilmurámico, y existe un puente de entrecruzamiento de pentaglicinas entre la D-alanina y la L-lisina de las cadenas peptídicas de dos capas glicánicas adyacentes. En Listeria existe un residuo de diaminopimélico en lugar de la L-lisina y no están presentes las 5 glicinas que sirven de puente de entrecruzamiento entre las cadenas glicánicas adyacentes. Adicionalmente, S. aureus presenta dos tipos de ácidos teicoicos (TAs): ácidos teicoicos de pared (WTAs) y ácidos lipoteicoicos (LTAs) que contienen residuos de D-alanina como sustituyentes. En Listeria, estos sustituyentes de ésteres de D-alanina sólo se han descrito en los LTAs. Los WTAs asociados al peptidoglicano son altamente variables en su estructura ya menudo son característicos de especie e incluso existen variaciones específicas de cepa. En general, los LTAs asociados a membrana presentan menos diversidad estructural y en su composición que los WT As.
Por tanto, en S. aureus la D-alanina no solo participa en los entrecruzamientos del peptidoglicano sino que también forma parte de los WTA y LTA. Inicialmente los residuos de D-alanina se incorporan a los L TAs y desde aquí se van transfiriendo a los WT As de S. aureus; por tanto, la composición de la pared entre ambos patógenos es diferente. La presencia de estos ésteres de D-alanina en los TAs parecen tener algún papel en la regulación de actividad autolítica, unión del Mg2 + en la pared celular, susceptibilidad de la bacteria a nisina, defensinas, etc, muerte por fagocitos, formación de biofilmes, adherencia a células epiteliales, etc. En S. aureus los TAs esterificados con D-alanina protegen contra péptidos antimicrobianos catiónicos producidos por el huésped.
Por lo tanto, no es posible concluir a raíz de los datos sobre L. monocytogenes expuestos arriba , que las cepas bacterianas auxótrofas para D-alanina de S. aureus sean
suficientemente avirulentas (atenuadas) para evitar efectos patológicos inaceptables, y que a su vez puedan inducir un nivel suficiente de inmunidad en el huésped sin presentar sustancialmente ninguna probabilidad de revertir a una cepa de tipo salvaje virulenta.
Por lo tanto, una realización de la invención se refiere a bacterias atenuadas vivas de la especie S. aureus adecuadas como candidatos de vacunas que ya no son capaces de producir D-alanina.
Las bacterias atenuadas vivas para su uso de acuerdo con la invención como candidatos de vacunas se pueden obtener de varias maneras, algunas de estas maneras quedan claramente evidenciadas en el ejemplo 2 de la presente invención titulado quot;Construcción y caracterización de cepas mutantes simples, dobles y triples de S. aureus sin alanina racemasa y/o D-aminoácido transaminasa~ .
En consecuencia, un primer aspecto de la invención se refiere a una nueva tecnología de plataforma para el diseño y la producción de vacunas basadas en cepas bacterianas vivas atenuadas auxótrofas para O-alanina pertenecientes a la especie S. aureus. Esta nueva tecnología de plataforma tiene potencial en una amplia variedad de cepas bacterianas pertenecientes a dicha especie.
Por lo tanto, una forma de realización del primer aspecto de las presentes invenciones se refiere a un método in vi/ro para la producción de cepas vivas atenuadas de Staphylococcus aureus que comprende las siguientes etapas:
a.
Proporcionar una cepa bacteriana de Staphylococcus aureus capaz de expresar alanina racemasa y O-aminoácido transaminasa, e
b.
Inactivar al menos uno de los genes que codifican las enzimas alanina racemasa y los genes que codifican para la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que dicha inactivación resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxótrofa para 0alanina.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el método comprende la inactivación del gen alr1 que codifica la enzima alanina racemasa y del gen dat que codifica la O-aminoácido transaminasa, de lal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional y la O-aminoácido Iransaminasa funcional Oal.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el método comprende la ¡nactivación de los genes alr1 y alr2 que codifican las enzimas alanina racemasas y el gen dat que codifica la D-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional, la alanina racemasa Alr2 funcional y la D-aminoácido transaminasa funcional Dat.
Tal ¡nactivación puede ser una inserción, una deleción, una sustitución o una combinación de los mismos, a condición de que la ¡nactivación conduzca a la ausencia de expresión de al menos una alanina racemasa y una D-aminoácido transaminasa funcionales. Una alanina racemasa y/o una D-aminoácido transaminasa funcionales se entienden como proteínas que tienen las características de regulación de las proteínas de tipo salvaje. Por lo tanto, una alanina racemasa y/o una O-aminoácido transaminasa que son defectuosas son por lo tanto incapaces de participar en la síntesis de O-alanina y se consideran proteínas no funcionales.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus obtenida u obtenible mediante el método del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus, caracterizada porque dicha cepa comprende inactiva dos uno o más genes que codifican la enzima alanina racemasa y los genes que codifican la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar una alanina racemasa funcional y una O-aminoácido transaminasa funcional, y en el que la inactivación de dichos genes resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxótrofa para 0alanina.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, dicha cepa se caracteriza por la inactivación de los loci alr1 y dat, preferiblemente de los loci alr1, alr2 y dat.
Tal inactivación puede ser una inserción, una deleción, una sustitución o una combinación de los mismos, a condición de que la inactivación conduzca a la ausencia de expresión de al menos una alanina racemasa y una O-aminoácido transaminasa funcionales. Una alanina racemasa y/o una D-aminoácido transaminasa funcionales se entienden como proteínas que tienen las características de regulación de las proteínas de tipo salvaje. Por lo tanto, una alanina racemasa y/o una O-aminoácido transaminasa que son defectuosas son por lo tanto incapaces de participar en la síntesis de D-alanina y se consideran proteínas no funcionales.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en el segundo o tercer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas.
Además y como ya se ha dicho en todo el texto, debido a su carácter atenuado pero inmunogénico in vivo, las cepas bacterianas, como se define en cualquiera de los aspectos segundos o terceros en cualquiera de sus formas de realización preferibles, son muy adecuadas como base para vacunas vivas atenuadas. En consecuencia, preferiblemente, dicha composición es una composición farmacéutica que opcionalmente comprende vehículos farmacéuticamente aceptables así como excipientes y/o otros principios activos.
Además, y en relación con el uso como vacuna de las cepas bacterianas de la invención mencionada en el párrafo precedente, la presente invención se refiere, además, como un quinto aspecto de la invención, a dichas composiciones, en particular, a composiciones de vacunas vivas atenuadas que comprenden las cepas bacterianas mutantes auxótrofas como se define en cualquiera de los segundos o terceros aspectos de la invención o en cualquiera de sus formas de realización preferibles.
Estas composiciones son especialmente adecuadas para la protección de los animales y los seres humanos contra la infección con la forma de tipo salvaje de la cepa bacteriana mutante auxótrofa. Tales animales pueden ser seleccionados del grupo que consiste de placentarios (incluyendo seres humanos), marsupiales y monotremas. Tales composiciones farmacéuticas, en composiciones de vacuna en particular, comprenden una cantidad inmunogénicamente efectiva de la bacteria viva atenuada como se define en cualquiera de los segundos o terceros aspectos de la invención o en cualquiera de sus correspondientes formas de realización preferibles.
Además de una cantidad inmunogénicamente efectiva de la bacteria viva atenuada descrita anteriormente, una composición farmacéutica, en particular, una vacuna, de acuerdo con la presente invención también contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo puede ser tan simple como agua, pero puede, por ejemplo, también comprender medio de cultivo en el que las bacterias se cultivaron. Otro vehículo adecuado es, por ejemplo, una solución de concentración salina fisiológica.
La dosificación útil a administrar variará dependiendo de la edad, el peso del animal vacunado y del modo de administración.
La composición farmacéutica, en particular la vacuna, puede comprender cualquier dosis de bacterias, suficientes para provocar una respuesta inmune. Las dosis que oscilan entre 103 y 1010 bacterias son, por ejemplo, dosis muy adecuadas.
Opcionalmente, se pueden añadir uno o más compuestos que tienen actividad adyuvante para la vacuna. Los adyuvantes son estimuladores no específicos del sistema inmune. Mejoran la respuesta inmune del huésped a la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes conocidos en la técnica son de Freund completo e incompleto de adyuvante, vitamina E, polímeros de bloque no jónicos, muramildipéptidos, ISCOM (complejos estimulantes inmunes, d. por ejemplo la patente europea EP 109.942), saponina, aceite mineral, aceite vegetal y Carbopol. Los adyuvantes, especialmente adecuados para la aplicación en la mucosa son, por ejemplo, la toxina E. coli lábil al calor (L T) o toxina del cólera (CT). Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsiones oleosas (por ejemplo de Bayol F® o Marcol 52®), saponinas o solubilizado de vitamina E.
Por lo tanto, en forma preferible, las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un adyuvante.
Otros ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéutica mente aceptables útiles en la presente invención incluyen estabilizantes tales como SPGA, hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo tampón fosfato). Especialmente cuando se añaden tales estabilizantes a la vacuna, la vacuna es muy adecuada para secado por congelación. Por lo tanto, en forma preferible, la vacuna está en una forma liofilizada.
Para la administración a animales o seres humanos, la vacuna de acuerdo con la presente invención puede darse de forma intranasal, intradérmica, subcutánea, oral, por aerosol o por vía intramuscular. Para aplicación a aves de corral, la membrana del ala y administración de gotas para ojos son muy adecuados. El medicamento, composición farmacéutica o vacuna de la invención se pueden usar tanto en pacientes asintomáticos como en los que ya han mostrado síntomas de la enfermedad.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consta en fragmentos quot;Fabquot;, quot;F( ab')2 , fragmentos quot;Fvquot;, fragmentos Fv de cadena única o quot;scFvquot;, quot;diacuerposquot; y quot;anticuerpos biespecíficosquot; (Bab), (en lo sucesivo, a partir del anticuerpo o fragmento del mismo de la invención) o que puede obtenerse después de la inmunización de un mamífero con la bacteria viva atenuada
auxótrofa para D-alanina que se define en cualquiera de los segundo o terceros aspectos de la invención o en cualquiera de sus formas de realización preferidas correspondientes.
En una forma de realización preferible de este aspecto de la invención, el mamífero utilizado para la inmunización se selecciona del grupo que consiste de placentarios (incluyendo seres humanos), marsupiales y monotremas.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere a los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención para su uso en terapia, en particular para uso en la inmunización pasiva.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica, en particular, una composición de vacuna, que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención.
En una forma de realización preferible de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende además un adyuvante y/o un veh ículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Como en el caso anterior, para la administración a animales o seres humanos del anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, la composición farmacéutica, en particular la vacuna, puede darse, entre otras formas, via intranasal, intradérmica, subcutánea, oral, por aerosol o por vía intramuscular. Para aplicación a aves de corral, la membrana del ala y administración de gotas para ojos son muy adecuados. El medicamento, composición farmacéutica o vacuna se puede usar tanto en pacientes asintomáticos como en los que ya han mostrado síntomas de la enfermedad.
El propósito de los siguientes ejemplos es simplemente para ilustrar la invención y no sirven para limitar la misma. EJEMPLOS
Ejemplo 1. Análisis e identificación de los nucleótidos y de las secuencias de aminoácidos de los genes que codifican la enzima alanina racemasa de S. aureus 132
Los autores de la presente invención llevaron a cabo una búsqueda de genes que codifican las enzimas alanina racemasa y D-aminoácido transaminasa en genomas completos de S. aureus utilizando la Base de datos de proteínas (UniProtKB) y la Herramienta de búsqueda de base de datos. Dos secuencias de aminoácidos correspondientes a las proteínas Alr1 y AIr2 fueron identificadas. Estas secuencias se compararon entre sí, y con otras secuencias de proteínas alanina racemasas presentes en otras especies bacterianas, por medio de la herramienta de alineación de Clustal Omega.
Como resultado del análisis anterior se encontraron en el genoma de S. aureus 132 dos genes candidatos para posibles alanina racemasas: el gen que denominamos alr1 que codifica una proteína de 382 aminoácidos llamada Alr1 y el gen alr2 que codifica una proteína de 361 aminoácidos llamada AIr2. Igualmente se identificó el gen dat que codifica una O-aminoácido transaminasa, Dat de 282 aminoácidos.
La Figura 3 muestra el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos de las alaninas racemasas de S. aureus 132 (ALR1_STAPH132 y ALR2_STAPH132) y las alaninas racemasas de M. tuberculosis ATCC 25618 (ALR_MYCTU), S. pneumoniae serotipo 4 (ALR_STRPN), Listeria monocytogenes serotipo 4b (ALR_LlSMC) y B. subtilis 168 (ALR1_BACSU y ALR2_BACSU). Las proteínas Alr1 y Alr2 de S. aureus 132 presentan entre sí un 28,5% de identidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Las proteínas Alr1 y Alr2 poseen una identidad de 39,3% y 23,9% con las alanina racemasas Alr1 y Alr2 de B. subtilis 168, respectivamente.
Ejemplo 2. Construcción y caracterización de cepas mutantes simples, dobles y triples de S. aureus sin alanina racemasas ylo O-aminoácido transaminasa
Con el fin de generar los mutan tes de deleción, se llevó a cabo una recombinación doble homóloga utilizando el vector pMAD termosensible. En primer lugar, se realizó la supresión de la O-aminoácido transaminasa (Dat) y este mutante llamado lldat se utilizó como base para generar los mutantes dobles y el triple mutante, independientemente.
Para la construcción de estos mutantes, se amplificaron por PCR y se clonaron por separado en el plásmido pMAD fragmentos de aproximadamente 1000 pb que corresponden a las regiones de AON situadas delante (upstream) y detrás (downstream) de los genes dat, alr1 y alr2. Los plásmidos recombinantes resultantes se utilizan para eliminar los genes
cromosómicos dat, alr1 y alr2, respectivamente, localizados en el cromosoma de la cepa S. aureus 132 de tipo salvaje.
s. aureus 132 se utiliza en la presente invención como un organismo modelo de la especie quot;Staphylococcus aureusquot; para generar mutantes auxotrófos para D-alanina. Esta es una cepa clínica resistentes a la meticilina (MRSA) (Vergara-Irigaray el al., 2009, Infeetion and Immunity, 77: 3978-3991).
El fragmento upstream del gen alr1 se obtuvo mediante amplificación por PCR utilizando la combinación de oligonucleótidos alr1 UP-F(Mlul) y alr1 UP-R(Notl), y posteriormente fue digerido por las enzimas de restricción Mlul y Not!. El fragmento downstream del gen aJr1 se obtuvo mediante amplificación por PCR usando los oligonucleótidos alr1 DN-F(Notl) y alr1 DN-R(BgllI), seguida por digestión con enzimas Notl y 8gll l. Los fragmentos upstream y downstream digeridos se clonaron en el vector pMAD previamente linealizado con las enzimas Mlul y BgllI, generando la construcción llamada pMAD_UPIDOWN_alr1.
La misma estrategia se siguió para la construcción de los plásmidos pMAD_UPIDOWN_alr2 y pMAD_UP/DOWN_dat. Los fragmentos upstream y downstream del gen arl2 fueron amplificados utilizando los pares de oligonucleótidos alr2UP-F(Mlul) I alr2UP-R(Notl) y arl2bDN-F (Notl) I alr2DN-R(8glll), respectivamente. De la misma forma, los fragmentos upstream y downstream del gen dat fueron amplificados utilizando los pares de oligonucleótidos datUP(Mlul)F I datUP(Notl)R y datDOWN(Notl)F I datDOWN(8glll)R, respectivamente.
Las tres construcciones y pMAD_UP/DOWN_dat se introdujeron en E. coli DC10B por electroporación. Las colonias transformantes se seleccionaron en agar LB suplementado con ampicilina (100 j.Jg/mL) y XGal (150 j.Jg/mL). Después de la incubación a 3rC durante 18 h, las colonias azules resistentes a la ampicilina fueron sometidas a PCR para comprobar la presencia de pMAD_UP/DOWN_alr1 , pMAD_UP/DOWN_alr2 o pMAD_UP/DOWN_dat con las combinaciones de oligonucleótidos alr1 Ext-F/alr1 Ext-R, alr2Ext-F/alr2Ext-R o datExtF/datExtR, respectivamente.
La construcción pMAD_UPIDOWN_dat se extrajo a partir de E. coli DC10B y se transformó directamente por electroporación en la cepa específica de S. aureus 132. La selección de colonias de S. aureus 132 que contenían el plásmido recombinante se realizó en agar TSB
suplementado con eritromicina (10 I-Ig/mL) y X-Gal (150 I-Ig/mL) tras 24-48 h de incubación a 30°C.
Para eliminar el gen cromosómico dat de la cepa S. aureus 132, una colonia azul de S. aureus 132 conteniendo pMAD_UPIDOWN_dat fue inoculada a 3 mi de TSB con 10 I-Ig/mL de eritromicina y cultivada a 30°C durante 2 h. Después, el cultivo se incubó a 43,5°C, una temperatura no permisiva para la replicación del plásmido pMAD, lo que lleva a la integración de pMAD_UP/DOWN_dat en el cromosoma bacteriano por medio de una sola recombinación . Después de 6 horas, se sembraron diluciones seriadas del cultivo sobre placas de agar TSB suplementadas con eritromicina (10 ~g/mL) y X-Gal (150 ~g/mL) y se incubaron posteriormente a 43,5°C durante 18 h. Varias de las colonias resultantes se transfirieron a 2 mi de TSB sin antibiótico y se incubaron durante 24 h a 30°C con el fin de inducir un segundo evento de recombinación que conduce a la escisión del plásmido pMAD_UPIDOWN_dat a partir del cromosoma. La selección de colonias de color blanco, que ya no contienen pMAD_UP I DOWN_dat, se llevó a cabo mediante siembra de diluciones seriadas en placas de agar TSB con X-Gal (150 IJg/mL) y sin antibiótico. Cada colonia blanca seleccionada se inoculó sobre agar TSB suplementado o no con eritromicina (10 IJg/mL) y X-Gal (150 IJg/mL). Se comprobó la supresión del gen dat (lldat) en las colonias blancas sensibles a eritromicina mediante PCR utilizando los pares de oligonucleótidos datExtF/datExtR, datseqF/datseqR y datF/datR.
Para generar los dobles mutantes ó.alr1ló.dat o llalr2111dat. los plásmidos pMAD_UPIDOWN_alr1 o pMAD_UPIDOWN_alr2 se introdujeron por electroporación en la cepa mutante S. aureus lldat y se llevó a cabo el mismo protocolo descrito anteriormente. En este caso, la recuperación del doble mutante puede requerir la adición exógena de 0alanina (5 o 10 mM) al medio TSB o agar TSB. La ausencia de los loci alr1 (o al(2) y dat en el genoma de S. aureus 132 tipo salvaje fue confirmada por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: alr1 Ext-F/alr1 Ext-R, alr1 UP-Fseq/alr1 DN-Rseq, alr1-F/alr1-R (o alr2ExtF/alr2Ext-R, alr2UP-Fseq/alr2DN-Rseq, alr2-F/alr2-R), y datExtF/datExtR, datseqF/datseqR y datF IdatR.
El triple mutante llalrll11alr2llldat se generó introduciendo por electroporación el plásmido pMAD_UP/DOWN_alr2 en la cepa mutante S. aureus lldatlllalr1 y siguiendo el protocolo para el sistema de intercambio alélico descrito anteriormente. También en este caso, la recuperación del triple mutante &alr1/llalr2/&dat requirió la adición exógena de D-alanina (5
o 10 mM) al medio TSB. La figura 4 representa el método de cribado de colonias realizado
para las colonias blancas sensibles a eritromicina seleccionadas como resultado del segundo evento de recombinación para el triple mutante ó'alr1l11alr2/l1dat.
El cultivo de los diferentes mutantes en medio con y sin D-alanina reveló que la deleción simple del gen dat o la deleción doble de los genes dat y alr2 no afecta al crecimiento bacteriano. Sin embargo, el doble mutante l1alr1!l1dat y el triple mutante l1alr1ll1alr2/l1dat requieren la presencia de D-alanina en el medio para su crecimiento (figura 5).
La Figura 6 muestra la confirmación por PCR de las diferentes deleciones en los cuatro mutantes de S. aureus 132. Los resultados obtenidos demuestran que la supresión simultánea de los genes alf1 , alr2 y dat genera en esta cepa una incapacidad para crecer sin la presencia de D-alanina. Asimismo, el doble mutante b.alr1 /b.dat no crece de forma visible en ausencia de D-alanina.
Por lo tanto, vale la pena señalar que la inactivación de las proteínas alanina racemasas y O-aminoácido transaminasa producen una auxotrofía para O-alanina y que el método para la obtención de mutantes auxótrofos que pertenecen a especies de S. aureus es independiente de la cepa seleccionada.
Ejemplo 3. Efecto de la D-alanina en el crecimiento y la viabilidad del triple mutante
(!J.datl!J.a/r1/!J.a/r2)
Para evaluar la curva de crecimiento y la viabilidad del triple mutante de S. aureus 132 b.alr1 /b.alr2/b.dat en comparación con el tipo salvaje, ambas cepas se inocularon en fase de crecimiento exponencial (dilución 1:200) en 100 mL de TSB suplementado o no con 5 mM de D-alanina, y se incubaron a 3rC con agitación constante (210 rpm). la densidad óptica de cada cultivo y su concentración bacteriana se determinaron en el momento inicial de la inoculación y después cada hora hasta un total de 8 h de incubación. La densidad ópti ca se evaluó mediante la medición de alícuotas de cada matraz a D0600nm mientras que la concentración de bacterias (UFC/mL) se calculó mediante la siembra de diluciones 1:10 en placas de agar TSB. Todos los cultivos se realizaron por triplicado.
las curvas de crecimiento y viabilidad se realizaron para evaluar el efecto de la ausencia de O-alanina en el medio a lo largo del tiempo para las cepas de S. aureus 132 salvaje y triple mutan!e !J.a/r1l!J.a/r2/!J.dat.
La cepa lldatlb.alr1!/lalr2 presenta un crecimiento normal en medio de cultivo TSB suplementado con 5 mM de D-alanina, pero no es capaz de crecer sin el aporte exógeno de este compuesto (figura 7A). Sin embargo, la cepa de tipo salvaje crece de forma normal en medio TSB con y sin la adicción de D-alanina. Se observó que la viabilidad del triple mutante en medio TSB disminuyó aproximadamente 2 unidades logarítmicas a las 8 h de incubación debido a la limitación de D-alanina en el medio de cultivo (figura 7B).
Ejemplo 4. Determinación de la concentración mínima de D-alanina necesaria para el crecimiento del rnutante lldatlllalr1111alr2 de S. aureus 132 sobre medio TSB agar
Para determinar la concentración mínima de D-alanina necesaria para el crecimiento del triple mutante (l:J.datll:J.alr11l:J.alr2) se tomaron muestras de cultivos en fase exponencial de la cepa salvaje S. aureus 132 y del triple mutante crecidos en medio TSB suplementado con 10 mM de D-alanina hasta una ODsoonm de 0,2. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se lavaron con medio TSB, resuspendiéndolas en el volumen original con medio TSB y posteriormente se sembraron (100 IJL) en agar TSB sin D-alanina (O mM) o con concentraciones crecientes de D-alanina desde 0,005 mM a10 mM, como se indica en la figura 8. Las placas se incubaron a 3rC durante 24 h Y se observó el crecimiento bacteriano. La cepa parental de tipo salvaje mostró un crecimiento confluente en agar TSB sin D-alanina (figura 8A). Con respecto al triple mutante (l:J.datll:J.alrlll:J.alr2) se observó una ausencia de colonias a concentraciones inferiores a 0,05 mM de D-alanina, colonias dispersas a 0,1 mM de D-alanina y un crecimiento confluente sobre las placas a concentraciones superiores a 0,5 mM de D-alanina.
Ejemplo 5. Análisis morfológico de las cepas S. aureus 132 salvaje y triple mutante lldatl/l.a/r1/11a/r2 mediante microscopía electrónica
Para la toma de microfotografías mediante microscopia electrónica de barrido (MEB), las cepas S. aureus 132 salvaje y el triple mutante se cultivaron durante 16 h a 3rC en TSB suplementado con 10 mM D-alanina. Las bacterias se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con NaCI 0,9% y finalmente se resuspendieron en 1 mL de medio de cultivo TSB. Se inocularon 50 IJL de cada cultivo en 5 mL de TSB suplementado con concentraciones crecientes de D-alanina: O; 0,01; 0,1; 1 Y 10 mM y se incubó a 3rC durante 3 h con agitación constante (180 rpm ). Los cultivos bacterianos obtenidos se centrifugaron y los sedimentos se lavaron dos veces con PBS. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehído a14% en PBS 0,1 M pH 7,4 durante 30 min a temperatura ambiente y con agitación. Tras la fijación , las muestras se lavaron nuevamente 2 veces con PBS, y se deshidrataron con una serie de concentraciones crecientes de alcohol (50%, 70%, 90%, 100%) durante 15 min cada una. Finalmente, las muestras se secaron en el punto crítico con CO2 (Bal-lec CPD 030). Una gota de cada muestra se colocó en una tapa deslizante y fija sobre un soporte de aluminio para el revestimiento de oro (Bal -lec SeD 004 Sputter). Las muestras se observaron y fotografiaron en un microscopio electrónico de barrido Jeal JSM 6400.
A nivel microscópico, se observaron cambios morfológicos y estructurales significativos en la cepa mutante (l1datll::.alrlll::.alr2) debidos a la disminución progresiva en el aporte exógeno de D-alanina. La figura 9 muestra las microfotografías obtenidas que permiten la comparación visual entre el triple mutante y su homólogo salvaje después de crecer en medio TSB suplementado con concentraciones crecientes de D-alanina. El panel B de la figura 9 muestra que la cepa S. aureus l1datll1alrlll1alr2 no es capaz de dividirse sin adición externa de D-alanina. De acuerdo con ello, las células bacterianas detectadas a °mM de Dalanina corresponden en su mayoría al inóculo inicial que se cultiva previamente en la presencia de este compuesto y como posible consecuencia de la división celular incompleta se observaron también células deformadas y protoplastos. En presencia de D-alanina 0,1 mM se observa una densidad bacteriana ligeramente mayor, pero los protoplastos y algunas formas alargadas todavía están presentes. Finalmente, cuando se suplementa el medio con D-alanina 10 mM se puede observar que tanto la densidad como la morfología celular del triple mutante es comparable a la que presentan las células bacterianas esféricas de la cepa de tipo salvaje (panel A), volviéndose indistinguible de éste.
Para la toma de microfotografías mediante microscopía electrónica de transmisión (MET), la cepa salvaje y el triple mutante l1datll1alrlll1alr2 se cultivaron en agar TSB suplementado con 10 mM de D-alanina durante 18 h a 3r C. A continuación se subcultivaron en placas de agar Mueller-Hinton y se incubaron a 3r C durante 18 h. Después de la incubación, varias colonias se resuspendieron en tampón PBS. Tras recoger las células por centrifugación, el sedimento resultante se lavó primero con tampón de cacodilato, e inmediatamente después las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5% frío preparado en 0,2 M tampón de cacodilato de sodio pH 7,4 durante 4 h a temperatura ambiente. Los sedimentos se lavaron con tampón de cacodilato, se deshidrataron en acetona y fueron embebidos en Spurr (Spurr epoxi medio de inclusión). Se obtuvieron cortes ultrafinos (70 nm) de estas muestras y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para la observación bajo un microscopio de transmisión de electrones JEOL JEM 1010 (80 kV).
Los estudios de microscopía electrónica de transmisión muestran que la pared celular del triple mutante l1datllJ.alrlllJ.alr2, cuando se mantiene en ausencia de D-alanina, experimenta una destrucción progresiva como resultado de la ¡nactivación de la alanina racemasa y de la O-aminoácido transaminasa, produciéndose la lisis celular y muerte bacteriana. La Figura 10 muestra diferentes etapas de la degeneración de la pared celular, que van desde la disminución de la capa de mureína y en consecuencia un aumento en el tamaño celular (protoplastos) a células que muestran varias rupturas, la lisis y la extrusión del contenido intracelular (especialmente material genético). Sin embargo, las células bacterianas de la cepa salvaje presentan una morfología normal con la pared celular intacta.
Ejemplo 6. Evaluación de la estabilidad del fenotipo auxótrofo en la cepa de S. aureus
lJ.daUlJ.a/rl/lJ.a/r2
Para probar la irreversibilidad de la auxotrofía nutricional de S. aureus IJ.datllJ.alrlll::.alr2 para el compuesto D-alanina, la cepa triple mutante se cultivó en 100 mL de TSB suplementado con 5 mM de D-alanina en condiciones óptimas durante 11 dias a 3rC bajo agitación (180 rpm). Se tomaron muestras de este cultivo al inicio de la incubación y en los días 1, 3, 5, 7 Y 11 para la determinación de UFC en agar TSB y agar TSB suplementado con 5 mM de Dalanina. Todos los cultivos se realizaron por triplicado. En el caso hipotético de una reversión del fenotipo, los recuentos bacterianos recuperados a lo largo del tiempo deberían ser similares en placas de agar, independientemente de la presencia o ausencia del compuesto en el medio de cultivo. En contraste, se observaron diferencias significativas entre los recuentos bacterianos obtenidos cuando el cultivo se sembró en placas sobre medio de agar con y sin D-alanina.
Los recuentos bacterianos resultantes fueron significativamente mayores en el primer caso (placas de agar suplementado con D-alanina) en la etapa inicial de la incubación (día O) y en los días 1, 3, 5, 7 Y 11 (véase la figura 11 ) (Plt;0,0001 , según la prueba t de Student). Aunque significativamente muy inferior, la recuperación de un número bajo de colonias en las placas de agar sin D-alanina puede ser debido a un crecimiento residual derivado de la acumulación de este compuesto en el citoplasma de las células bacterianas durante el crecimiento en medio suplementado. Esta diferencia indica que la cepa IJ.datllJ.alr1flJ.alr2 permanece auxótrofa para D-alanina a través del tiempo, sin la posibilidad de reversión al fenotipo salvaje.
Ejemplo 7. Determinación de la dosis letal (DL) de S. aureus de tipo salvaje 132 y triple
mutantel:..datlllalr1/llalr2 en ratones BALB/c en un modelo de infección aguda
Los autores de la presente invención producen una infección sistémica en ratones BALB/c
5 mediante la administración intraperitoneal de un ¡nócula de la cepa salvaje S. aureus 132 y del triple mutante lldatll1alr1!l1alr2 en solución salina con 3% de mucina gástrica porcina. Para la preparación del ¡nácula, las bacterias se cultivaron en medio TSB (tipo salvaje) o TSB suplementado con 10 mM de D-alanina (triple mutante) a 3r C con agitación (180 rpm) hasta alcanzar una D0600nm de 0.7. Los cultivos se centrifugaron y se lavaron con suero
10 salino, y finalmente se resuspendieron en suero salino con 3% de mucina gástrica. Al inóculo bacteriano correspondiente de aproximadamente 1 x 107 UFC se le denominó 1X. Las suspensiones bacterianas se ajustaron desde el inócula antes mencionado a diferentes dosis según fue necesario y se inocularon (250 IJI ) en ratones BALB/c (n=5) por vía intraperitoneal. La supelVivencia de los ratones se controló durante 14 días. Las dosis
15 letales (DL) se determinaron de acuerdo a la supelVivencia obselVada en ambos casos. DL 100 se define como la dosis letal mínima para conseguir el 100% de mortalidad de los ratones.
La figura 12A muestra diferentes grados de supelVivencia en ratones infectados con dosis crecientes de la cepa S. aureus 132 de tipo salvaje. Se obselVó una disminución gradual en
20 la supervivencia de los ratones con respecto a la dosis 1X, determinándose la DL 100 cuando la dosis administrada es igualo mayor que 5X para la cepa salvaje.
La figura 128 muestra diferentes grados de supervivencia en ratones infectados con dosis crecientes del triple mutante lldatlllalr1!llalr2. La DL100 que se determinó para esta cepa fue 25 de 250X, una dosis muy alta de inóculo bacteriano, lo que indica que esta cepa es menos virulenta y se encuentra altamente atenuada respecto a su homólogo salvaje. Además, como se ilustra en la figura, con un inóculo de la cepa triple mutante equivalente a la DL 100 de la cepa parental virulenta ninguno de los ratones sucumbió a la infección, o lo que es lo mismo, se obtuvo una supelVivencia del 100%. Por lo tanto, la DL100 del triple mutante es
30 50X superior a la DL100 de su homólogo salvaje. Esto demuestra que el triple mutante es una cepa altamente atenuada con respecto a la cepa parental de tipo salvaje.
Ejemplo 8. Cuantificación de los anticuerpos IgG contra S. aureus 132 ll.spa por ELlSA indirecto en sueros de ratones BALB/c sometidos a la vacunación con el triple
35 mutante S. aureus Il.datlll.alr111l.alr2
Para evaluar la respuesta inmune a la vacunación mediada por anticuerpos, grupos de ratones BALB/c (n=5) fueron inmunizados los días O y 14 mediante inyección intraperitoneal (250 ~L) con dosis crecientes del triple mutantel::.datll::.alr1/l::.alr2 en solución salina. Dosis de vacunación: (A) 1 x 10' UFe, (8) 1,5 x 107 UFe, (e) 5 x 107 UFe. En los dias 14 y 21 (7 días después de la primera y segunda toma de la vacuna, respectivamente) se obtuvieron muestras de suero de la totalidad de los ratones, junto con muestras de suero de los ratones control, inyectados con solución salina. Para obtener el suero, los ratones fueron anestesiados con sevofluorano y la sangre se les extrajo mediante punción de la vena submandibular. Los sueros se separaron de las células mediante centrifugación y se almacenaron a -80oe hasta su análisis.
La cuantificación de IgG se realizó por medio de un inmunoensayo ligado a enzimas indirecto (ELlSA). Se recubrieron placas de ELlSA de 96 pocillos con la cepa S. aureus 132 t::.spa (cepa deficiente en la proteína del gen spa de S. aureus 132). Por lo tanto, los antígenos-bacterias se fijan a la parte inferior de los pocillos después de 18 h de incubación a 4°e en tampón carbonato-bicarbonato 100 mM, pH 9.6. Se realizaron cinco lavados con solución salina tamponada con tampón fosfato (PBS) para eliminar las bacterias no fijadas. El bloqueo de sitios residuales se realizó en dos pasos para reducir las interacciones no específicas con los sueros de ratón. En primer lugar, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con 100 IJL por pocillo de solución de bloqueo (5% de leche desnatada en PBS) y en segundo lugar, a 3r e durante 1 h con 100 IJL de suero de conejo (diluido 1 :1000 en PBS). Después de 5 etapas de lavado con tampón de lavado (0,005% de Tween 20 en PBS), las placas se incubaron durante la noche a 4°e con 100 IJL de una serie de sueros diluidos en tampón de dilución (medio DMEM con 5-10% de FeS). Al día siguiente, se realizaron 5 lavados con tampón de lavado para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado y se añadió 100 IJL de anticuerpo secundario por pocillo (lgG anti-ratón marcado con peroxidasa -HRP) diluido 1 :5000 en tampón de dilución. La incubación se realizó durante 1 h a temperatura ambiente en oscuridad. Las placas se lavaron 5 veces con tampón de lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no reaccionan. Para llevar a cabo el proceso de revelado, las placas se incubaron durante 3 min con 100 IJL de TMB (sustrato de HRP -peroxidasa). La reacción se detuvo con 50 IJL de H2S04 1 M por pocillo. La medida calorimétrica se realizó a 450 nm. Para determinar los títulos de IgG en cada caso, el título a punto final se evaluó como la máxima dilución de suero que tiene un valor que excede la absorbancia del blanco de lectura (absorbancia del tampón de dilución) por 0.1 valores.
Por lo tanto, se utilizaron las muestras de sangre recogidas de cada ratón para determinar el título de anticuerpos (lgG) contra S. aureus 132 l1spa por ELlSA, y medir así la capacidad de la vacuna para generar una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Con las tres dosis ensayadas se detectaron títulos significativos de IgG en los sueros obtenidos siete días tras la segunda toma de la vacuna (día 21) de los ratones inmunizados con respecto a los ratones no vacunados (figura 13), lo cual demuestra la capacidad inmunogénica de esta cepa como vacuna.
Ejemplo 9. Determinación de pérdida de peso corporal y de la carga bacteriana en bazo e hígado en un modelo de infección sistémica con la cepa salvaje S. aureus 132 en ratones BALB/c preinmunizados con el triple mutante Il.datlll.a/r1//l.a/r2
Para evaluar la eficacia (nivel de protección) de la cepa lldatlllalrll11alr2 como vacuna, ratones BALB/c (n=6) fueron inmunizados vía intraperitoneal (250 IJL) con la cepa lldatll::.alr11l1alr2 en suero salino a la dosis de aproximadamente 1,5 x 107 CFU en los días O y 14. A un grupo de ratones control (n=6) se les administró 250 IJL de suero salino de forma idéntica a los O y 14 días. El día 21, los ratones fueron infectados con un inóculo de de la cepa salvaje S. aureus 132 (2 x 107 UFC en suero salino con 3% mucina gástrica porcina) por inyección intraperitoneal. En el momento previo al desafío con la cepa salvaje y a las 5, 21, 29 Y 43 horas post-desafío, se evaluó el peso corporal de cada ratón de forma individual. A las 43 horas post-infección los ratones fueron sacrificados con tiopental sódico, se extrajeron y pesaron los bazos e hígados asépticamente, y después de ser homogeneizados en suero salino, se determinaron las UFC por gramo de órgano en TSB agar.
Se confirmó así el efecto protector de la vacunación con el tripe mutante l1datll1alr1fl::.alr2 cuando se observó que la preinmunización con esta cepa protege a los ratones de una disminución de peso corporal abrupta. De hecho en la figura 15A se muestra cómo la pérdida de peso corporal en el grupo de ratones vacunados (aproximadamente un 5% respecto al momento anterior a la infección) es inferior a la experimentada por ratones pertenecientes al grupo salino (10-12%). Igualmente, a partir del recuento de bacterias en el bazo e hígado, los autores de la presente invención demostraron que la administración de la cepa triple mutante l1datll1alr11l1alr2 como vacuna provoca una disminución significativa de casi 4 unidades logarítmicas (Log10 ) (P=0,0087 y P=0.0152, respectivamente, prueba U de Mann-Whitney) en la carga bacteriana de ratones infectados con una dosis sub-letal de S. aUfeus 132 (figura 15B y 15C).
Ejemplo 10. Protección de los ratones BALB/c contra el desafío con S. aureus 132 por inmunización con el mutante Ildatll:..alr1/llalr2
Para evaluar la eficacia del mutantel::.datll1alrlll::.alr2 de S. aureus como vacuna, a los ratones BALB/c (n=5) se le administraron 2501-11 de la cepa l::.datll1alrlll1alr2 (dosis de 1,5 x 107 UFC en solución salina) en los días O y 14. A los ratones control se les administró solo solución salina de forma idéntica en los mismos días. Siete días después de la segunda inyección, los ratones fueron inoculados con la cepa S. aureus 132 de tipo salvaje (dosis de 2 x 107 UFC en solución salina con 3% de mucina gástrica porcina) con el fin de establecer una infección sistémica letal en ambos casos. Después de la infección, los ratones fueron monitorizados durante 15 días para determinar la supervivencia de los ratones vacunados en comparación con los ratones control (no vacunados). Como se muestra en la figura 15 todos los ratones del grupo vacunados sobrevivieron al desafío, superando la infección con una supelVivencia del 100%, mientras que todos los ratones en el grupo de no vacunados sucumbieron a la infección en menos de 72 h. Las diferencias en la supelVivencia entre los dos grupos fueron estadísticamente significativas (Plt;O.0046, de acuerdo con la prueba Log-rank de Mantel-Cax).
Estos resultados demuestran que la vacunación con la cepa l1datll1alr1/l1alr2 proporciona inmunidad protectora contra la infección aguda por la cepa S. aureus 132 .
Ejemplo 11. Protección de los ratones BALBJc mediante la inmunización pasiva con ancuerpos generados con la vacuna lldatlllalr1111alr2
En situaciones en las que no existan vacunas autorizadas, o se detecten fallos vacunales en esquemas de inmunización en vigor, el uso de inmunización pasiva con anticuerpos puede ser beneficioso cuando se sospeche de la exposición o contacto con patógenos bacterianos.
A continuación se determinó si el suero de ratones inmunizados con la cepa lldat/lJ.alrlll1alr2 con un elevado título de anticuerpos de tipo IgG, podría usarse para inmunizar pasivamente ratones no vacunados previamente. Estos sueros se obtuvieron de ratones BALBtc inmunizados (n=5) con tres dosis de aproximadamente 2 x 108 UFC de la cepa triple mutante (administradas en los días 0, 14 Y 28). Para obtener el suero (día 35), los ratones fueron anestesiados con tiopental sódico y se extrajo sangre por punción del plexo retro-orbital. Igualmente, se obtuvieron sueros de ratones control (n=5), inyectados con solución salina. Los sueros fueron separados de las células de la sangre por centrifugación y se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Los sueros de ratones inmunizados o sueros de ratones control se administraron por inyección intraperitoneal (250 IJL) a ratones BALB/c (n=6) 3,5 h antes de la infección con una dosis letal de la cepa S. aureus 132 salvaje (6 x 107 UFC) y se monitorizó la supervivencia de los ratones durante 7 días.
Como se muestra en la figura 16, el 85% de los ratones inmunizados pasivamente con suero de ratones vacunados sobrevivieron al desafío, mientras que el 100% de los ratones que recibieron suero control sucumbió a la infección (P=O.0008; prueba Log-rank de Mantel-Cox).
Estos resultados demuestran que la inmunización pasiva con suero de ratones vacunados con la cepa lldatlllalr1!llalr2 es capaz de conferir un nivel significativo de protección contra la infección y que los anticuerpos por sí solos son suficientes para proporcionar inmunidad protectora frente a una infección por sepsis aguda causada por S. aureus 132 (inmunidad humoral).
Ejemplo 12. Ensayo de reactividad cruzada con los anticuerpos IgG de ratones BAlB/c irnrnunizados con la cepa l:r.datll:r.alr11l:r.alr2 frente cepas heterólogas de S. aureus
Con el fin de evaluar si los anticuerpos generados en ratones BAlB/c en respuesta al triple mutante lldatlllalr1Jllalr2 son capaces de reconocer cepas de S. aureus no relacionadas se realizó un ElISA indirecto con los sueros indicados en el ejemplo 8 frente a las cepas de S. aureus USA300LAC y RF122, Y con el pool de sueros administrados pasivamente descrito en el ejemplo 12 frente a las cepas ED133 y ED98. De esta forma, los autores de la presente invención valoran la capacidad de la cepa vacunal para generar una respuesta inmunológica humoral amplia. Cabe resaltar que la cepa S. aureus USA300LAC es una cepa MRSA (resistente a meticilina) de gran importancia clínica actual debido a su amplia distribución y por ser causa predominante de infecciones adquiridas en la comunidad en adultos sanos. Por otro lado, las cepas RF122 (origen bovino), ED133 (ovino) y ED98 (aves de corral) constituyen representantes de clones específicamente adaptados a hospedadores animales y causan infecciones en ganado destinado al consumo humano. Para valorar la reactividad cruzada, se realizó el quot;tapizadoquot; de placas de forma independiente con las cepas mencionadas y se realizaron los pasos de lavado, detección y revelado tal y como se ha descrito en el ejemplo 8.
Frente a las cepas S. aureus USA300LAC y RF122 se obtuvieron resultados similares a los observados frente a la cepa isogénica S. aureus 132 l1spa (figura 17). Igualmente, se obtuvieron títulos elevados, (L09101/título a punto final =3,8854) frente a las cepas ED133 y
5 ED98. En conjunto, se observó una alta capacidad de estos anticuerpos para reconocer determinantes antigénicos de cepas heterólogas de S. aureus, lo que demuestra que la inmunización con la cepa b.datlllalr1lb.alr2 no solo genera anticuerpos frente a la cepa isogénica salvaje, sino que también genera anticuerpos de tipo IgG que reconocen a otras cepas con diferentes patrones de resistencia y virulencia, e incluso de diferentes orígenes.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método in vitre para la producción de cepas vivas atenuadas de Staphylococcus aureus que comprende las siguientes etapas:
  2. 8. Proporcionar una cepa bacteriana de Staphylococcus aureus capaz de expresar alanina racemasa y O-aminoácido transaminasa, e
    b. Inactivar al menos uno de los genes que codifican la enzimas alanina racemasa y los genes que codifican para la D-aminoácido transaminasa, de tal manera que dicha ¡nactivación resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxótrofa para D-alanina.
  3. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende la ¡nactivación del gen alr1 que codifica para la enzima alanina racemasa y el gen dat que codifica para la D-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional y la O-aminoácido transaminasa funcional Oat.
  4. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende la ¡nactivación de los genes alr1 y alr2 que codifican las enzimas alanina racemasas y el gen dat que codifica la O-aminoácido transaminasa , de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar la alanina racemasa Alr1 funcional, la alanina racemasa AIr2 funcional y la O-aminoácido transaminasa funcional Oat.
  5. 4.
    Una cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus, caracterizada porque dicha cepa comprende inactivados uno o más genes que codifican la enzima alanina racemasa y los genes que codifican la O-aminoácido transaminasa, de tal manera que la cepa bacteriana ya no sea capaz de expresar una alanina racemasa funcional y una 0aminoácido transaminasa funcional, y en el que la inactivación de dichos genes resulte en que dicha cepa bacteriana sea auxótrofa para D-alanina.
  6. 5.
    La cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus de la reividicación 4, en el que dicha cepa se caracteriza por la inactivación de los loci alr1 y dat.
  7. 6.
    La cepa viva atenuada de Staphylococcus aureus de la reividicación 4, en el que dicha cepa se caracteriza por la inactivación de los loci alr1, alr2 y dat.
  8. 7.
    Una composición que comprende la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
  9. 8.
    Una composición farmacéutica que comprende la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
  10. 9.
    Uso de la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones 7 o 8, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento profiláctico frente a una infección por Staphylococcus aureus en un mamífero.
  11. 10.
    Uso de la cepa bacteriana tal y como se ha definido ésta en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones 7 o 8, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento profiláctico frente a una infección por Staphylococcus aureus en un sujeto humano.
  12. 11 . Un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en F(ab')2, Fab', Fab, Fv, quot;r IgGquot;, Fe, obtenido u obtenible tras la inmunización de un mamífero con la bacteria viva atenuada auxótrofa para D-alanina tal y como se ha definido ésta en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
  13. 12. Uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la reivindicación 11 , para la elaboración de un medicamento para su uso en una terapia de inmunización pasiva frente a Staphylococcus aureus.
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