ES2222152T3

ES2222152T3 - Vacuna con las salmonellas que no inducen anticuerpos que reaccionan con la flagelina o los flagelos.

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Publication number: ES2222152T3
Application number: ES00204630T
Authority: ES
Inventors: Petrus Johannes Maria Nuijten; Maarten Hendrik Witvliet
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 2000-12-19
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2020-12-19
Also published as: JP5745731B2; EP1112747A1; HU226192B1; JP2001186874A; HUP0005010A3; US20010021386A1; HU0005010D0; AU783508B2; TR200401569T4; PT1112747E; MXPA00012796A; DK1112747T3; AU7245300A; EP1112747B1; ATE269104T1; PL206377B1; CA2329676A1; BR0006291A; PL344851A1; DE60011560D1

Abstract

Uso de una bacteria del género Salmonella que en su forma salvaje lleva flagelos, no siendo capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos, y un adyuvante para la fabricación de una vacuna inactivada para la protección de seres humanos o animales contra infección por bacteria Salmonella o los efectos patógenos de la infección.

Description

Vacuna con las Salmonellas que no inducen anticuerpos que reaccionan con la flagelina o los flagelos.

La presente invención se refiere a la bacteria Salmonella para su uso en una vacuna, a vacunas basadas en estas bacterias, al uso de dichas bacterias para la fabricación de una vacuna y a métodos de preparación de dichas vacunas.

Las bacterias del género Salmonella son muy conocidas por su patogenicidad tanto en el ser humano como en animales. Tan sólo en EE.UU., anualmente, el número de seres humanos que sufren de infecciones por Salmonella sobrepasa los dos millones de casos. En la mayoría de los casos, la infección es causada por alimentos contaminados. Entre las fuentes de infección conocidas se pueden mencionar los huevos (tanto de pato como de gallina), productos que contienen huevos y carne de cerdo y pollo no suficientemente hecha. Sobre todo en los niños pequeños, las personas mayores y los enfermos inmunocomprometidos, la capacidad de superar estas infecciones es baja. Especialmente en estos grupos, el índice de mortalidad anual como consecuencia de las infecciones por Salmonella es alto. Durante las últimas décadas, la cría de ganado a gran escala más eficiente ha conducido a un enorme aumento de la densidad animal. Como resultado, se observa un aumento del número de infecciones animales y las consiguientes infecciones en seres humanos causadas por alimentos infectados. Está claro que los animales son la fuente principal de la infección por Salmonella. Se trata de una fuente muy difícil de controlar. En primer lugar, las infecciones por Salmonella en la mayoría de los casos provocan enfermedades que no son graves en animales maduros y sanos; dichos animales pueden se portadores de la bacteria durante un período de tiempo prolongado. Durante ese tiempo, vierten la bacteria en sus excrementos, lo que hace prácticamente imposible evitar la infección en los animales jóvenes más vulnerables. En segundo lugar, muchas especies de Salmonella colonizan diferentes especies animales huésped. Algunas especies de Salmonella causan infecciones primarias en huéspedes específicos, mientras que otras especies de Salmonella no son restrictivas en absoluto. Como agentes de infección primarios, S. typhi y paratyphi están asociados frecuentemente con infección en el hombre. S. typhi causa diarrea y, en consecuencia, deshidratación. Dicha infección se encuentra con mucha frecuencia en zonas tropicales. S. dublin está relacionado con el ganado, específicamente animales jóvenes, en los que provoca infecciones letales en más de un 50% de los casos. S. abortus-equi provoca abortos en caballos. S. abortus-ovi provoca abortos en ovejas. S. choleraesuis es la causa de diarrea letal en cerdos jóvenes. S. typhimurium y S. enteritidis provoca salmonelosis en pollos, cerdos, ganado vacuno y roedores. S. arizonae también provoca enfermedades en pavos. Hay otros animales que no se utilizan en la industria de la alimentación, como los reptiles, que sufren infecciones por Salmonella, como por ejemplo S. arizonae.

Existe pues una clara necesidad de contar con vacunas para la Salmonella eficaces. Dichas vacunas han de proteger a los seres humanos frente a infecciones por Salmonella transmitidas de hombre a hombre. Asimismo, se necesitan vacunas para proteger al ser humano frente a las infecciones por Salmonella soportada en los alimentos. Finalmente, es necesario que dichas vacunas protejan a los animales frente a infecciones por Salmonella.

Actualmente, existen en el comercio diversas vacunas contra diversas especies de Salmonella. Dichas vacunas, si bien a veces son eficaces desde el punto de vista de la vacuna, presentan sin embargo un grave inconveniente. Por lo general, inducen una población de anticuerpos que equivale a la de una infección con bacterias de tipo salvaje ya que poseen la misma carga de antigénico que la bacteria de tipo salvaje. Por consiguiente, un análisis de los anticuerpos en el suero de un animal Salmonella positivo no revela por qué el animal es positivo. Esto puede deberse a la vacunación, pero también puede venir dado igualmente por la infección con una cepa de campo virulenta. Por lo tanto, si un animal es Salmonella positivo, se considera que está infectado. Por consiguiente, sería deseable contar con lo que se llama vacuna marcador. Una vacuna marcador es una vacuna que puede discriminarse de la infección de tipo salvaje, v.g., en función de un panel de anticuerpos característico, diferente del panel de anticuerpo inducido por infección de tipo salvaje. Se induce un panel de anticuerpos diferente, v.g., cuando una proteína inmunogénica presente en una bacteria de tipo salvaje no está presente en un mutante que se utiliza para vacunación: entonces el huésped no fabricará anticuerpos contra la proteína tras la vacunación.

Un antígeno marcador presenta al menos las siguientes características:

\Rightarrow puede suprimirse sin deteriorar gravemente la viabilidad de la bacteria.

\Rightarrow induce anticuerpos cuando está presente.

\Rightarrow cuando está presente, no contribuye a la inmunogenicidad de la bacteria.

\Rightarrow su ausencia contribuye preferiblemente a atenuación.

Al investigar para la búsqueda de antígenos marcadores adecuados, se han de considerar todos los antígenos de Salmonella conocidos. Un antígeno conocido que se encuentra con todas las especies de tipo Salmonella con la excepción de algunas subespecies de S. pullorum y gallinarum es el flagelo. Entre los ejemplos de especies de Salmonella que llevan flagelos cuando se encuentran en su forma de tipo salvaje se pueden mencionar S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A y B, derby, hadar, heidelberg, agona y arizonae. Los flagelos son estruturas largas que sobresalen desde la superficie celular y desempeñan un importante papel en la movilidad e invasión de determinadas células huésped. Los flagelos consisten en largos polímeros de la proteína denominada flagelina. Se sabe que dichos flagelos inducen altos niveles de anticuerpos. Se sabe asimismo que la ausencia de flagelos no deteriora significativamente la viabilidad de las bacterias fuera del huésped: se conocen mutantes con menos flagelos de prácticamente todas las especies de Salmonella, que se pueden desarrollar in vitro. No obstante, las proteínas flagelares de Salmonella nunca han sido contempladas como marcadores adecuados, ya que no satisfacen, o sólo lo hacen parcialmente, tres de los cuatro requisitos del marcador:

- aunque no es esencial para sobrevivir fuera del huésped, desempeñan un significativo papel en la supervivencia de las bacterias y la persistencia en macrófagos huésped, relacionados con la inducción de inmunidad. (Methner, U. y Barrow, P.A., Berl, Münch. Tierärtzl. Wschr. 110:391-396 (1997), Weinstein y cols., Infect. Immun. 46: 819-825 (1984)).

- contribuyen fuertemente a la inmnogenicidad de la bacteria, una razón por la que se utilizan incluso como proteínas vehículo para secuencias de aminoácido heterólogas cortas (Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991), Newton, S.M.C. y cols., Science 244: 70-72 (1989)).

- su ausencia no contribuye a atenuación (Lockman, H.A. and Curtiss, R., Infect. & Immun. 58: 137-143 (1990), Methner, U. and Barrow, P.A. Berl. Münch. Tierärtzl. Wschr. 110: 391-396 (1997).

- Las bacterias de Salmonella flageladas inhiben la unión de otras Salmonellas flageladas. Las bacterias de Salmonella con menos flagelos sin embargo presentan un menor potencial de inhibición hacia otras Salmonellas flageladas y, por lo tanto, aumentan incluso el nivel global de infección de Salmonella. (Methner, U. and Barrow, P.A., Berl. Münch, Tierärtzl. Wschr. 110: 391-396 (1997), Weinstein y cols., Infect. Immun. 46: 819-825 (1984)).

En la patente inglesa GB 1.109.179, Ephraim Saul Anderson se describen vacunas a base de Salmonella typhi o parathypi inactivada que está desprovista de flagelos. Dichas vacunas fueron administradas sin adyuvante. Tal como describió Anderson varios años después (Wandan, M. y cols., 1975, Bull. World Health Organisation), estas vacunas no proporcionaron ninguna protección. Por otra parte, en este documento se subrayó una vez más la importancia de los flagelos en las vacunas.

Por todas estas razones en su conjunto, el flagelo nunca fue considerado como un antígeno de marcador suprimible adecuado para vacunas de Salmonella.

Sorprendentemente se ha observado ahora, en contraste con la suposición general, que la ausencia de flagelos no afecta al potencial de vacunación de la Salmonella. Esto resulta especialmente sorprendente a la vista del hecho de que en los animales infectados con Salmonella de tipo salvaje se encuentran grandes cantidades de anticuerpos contra los flagelos, lo que prueba una vez más su antigenicidad. Uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar bacterias del género Salmonella que en su forma de tipo salvaje llevan flagelos pero que dejan de ser capaces de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos, cuando están en una forma inactivada en combinación con un adjuvante, para su uso en una vacuna para la protección de seres humanos y animales contra la salmonelosis.

Las flagelinas son proteínas de aproximadamente 500 aminoácidos que comprenden varios determinantes de antigénicos, es decir, existen varias regiones en las flagelinas contra las cuales se desarrollan anticuerpos en el animal huésped. Dichos determinantes antigénicos han sido identificados y localizados por T.M. Joys (Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991)). Para los fines de la presente invención, las bacterias que dejan de ser capaces de inducir anticuerpos contra el menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos se consideran como bacterias que no comprenden flagelina o flagelos que siguen poseyendo todos los determinantes antigénicos. No es necesario eliminar todos los determinantes antigénicos: es suficiente suprimir uno de los determinantes antigénicos. La detección selectiva de anticuerpos contra este determinante antigénico en el suero de animales seropositivos permitiría entonces la discriminación entre animales vacunados con marcador y los infectados con tipo salvaje. Dichos anticuerpos no se encontrarían en los animales vacunados, mientras que sí estarían presentes en animales infectados de forma natural. La detección selectiva puede realizarse de forma sencilla con herramientas de diagnóstico sencillas de forma rutinaria tal como se describe más adelante.

Actualmente, se conoce mucho sobre la síntesis de flagelina y la consiguiente maduración en flagelos (V.g., en Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt y cols., 2ª ed. ISBN 1-55581-084-5 (1996) y en Macnab, R.M.; Genetics and biogenesis of bacterial flagella (Annual Review of Genetics 26: 131-158 (1992)). El proceso de biogénesis flagelar requiere la acción concertada de un gran número de genes, no solamente el gen que codifica la flagelina sino también un gran número de genes implicados en la síntesis de flagelo y el motor flagelar. En principio, existen dos métodos para obtener bacterias con arreglo a la presente invención. En primer lugar, se pueden realizar mutaciones en el gel que codifica la proteína flagelina con el fin de mutar uno o más determinantes antigénicos. En segundo lugar, se pueden mutar uno o más genes relacionados con la biogénesis del flagelo. Esto evitará la biosíntesis de flagelina e incluso el flagelo entero y, en muchos casos, incluso el transporte de flagelina a través de la membrana bacteriana. Cuando no se producen flagelos, estarán ausentes los determinantes antigénicos determinados por doblado específico de la flagelina en flagelos. Si la propia flagelina no se transporta a través de la membrana y, de este modo, permanece dentro de la bacteria, no habrá inducción de anticuerpos contra flagelina. Todos los tipos de genes o agrupamientos de genes conocidos dentro de la especialidad como relacionados en el ensamblaje y exportación, como por ejemplo Ruta de Ensamblaje Morfológico y Ruta de Exportación específica para Flagelo, pueden ser dianas para la mutación. Todos ellos llevan a que la bacteria carezca de flagelina o al menos de flagelos. Con fines de claridad, todas las vías relacionadas con el proceso global de síntesis de los flagelos finales se denominan en adelante rutas de biogénesis flagelar.

Por lo tanto, en un modo de realización preferible, la bacteria no es capaz de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos debido a la mutación en un gen de la ruta de biogénesis flagelar.

Desde el punto de vista práctico, puede ser deseable sin embargo suprimir (parte de) el conjunto del gen flagelina de la bacteria que se va a utilizar en la vacuna, simplemente suprimiendo el gen que codifica la proteína flagelar. Se conocen los genes que codifican las proteínas flagelares de diversas especies de Salmonella. Están todos ellos íntimamente relacionados y, por lo tanto, son altamente homólogos. Los genes de flagelina han sido descritos para Salmonella enterica (Li., J. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2552-2556 (1994), Salmonella enteritidis (Selander, R.K. y cols., J. Bacteriol. 174, 3587-3592 (1992)), Salmonella dublin (Masten, B.J. and Joys, T.M. J. Bacteriol. 175, 5359-5365 (1993)), Salmonella typhimurium (de Vries, N. y cols., Appl. Environ. Microbiol. 64, 5033-5038 (1998)), Salmonella abortus-equi (Hanafusa, T. y cols., Mol. Gen. Genet. 236, 260-266 (1993)). Los genes de flagelina de especies de Salmonella nuevas se pueden encontrar fácilmente en función de su homología con todos los genes de flagelina de Salmonella existentes y conocidos: las técnicas de hibridación convencionales serán suficientes para localizar el gen de flagelina.

Existen dos genes de flagelina en bacterias de Salmonella que llevan flagelo de tipo salvaje. Únicamente uno de estos genes se conecta, es decir, produce flagelina en un momento dado. Debido a un mecanismo denominado variación de fase flagelar, en una escala de tiempo del orden de 10^{3} a 10^{5} generaciones, los genes cambian sus funciones de manera que los no expresados se convierten en expresados y viceversa. (V.g., descrito en Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt y cols., 2ª ed. ISBN 1-55581-084-5 (1996)). Con el fin de evitar que las cepas según la invención comiencen a expresar flagelina después de un determinado número de generaciones, ambos genes de flagelina han de hacerse no funcionales. Alternativamente, si el mecanismo de conexión de fase se hace no funcional es suficiente eliminar el gen de flagelina que se expresa en ese momento.

Un gen no funcional es un gen que deja de codificar una flagelina, que puede consistir en un gen del que parte de la secuencia de codificación que codifica un determinante antigénico haya sido eliminada.

Un modo posible de obtención del gen de flagelina o cualquiera de los otros genes conocidos relacionados en la biosíntesis de flagelo no funcional es a través de métodos clásicos, como por ejemplo el tratamiento de bacterias que producen flagelos de bacterias de tipo salvaje con agentes mutagénicos tales como análogos de base, tratamiento con luz ultravioleta o tratamiento de temperatura (Anderson, P. 1995. Mutagénesis, p. 31-58 en Methods in Cell Biology 48. H.F. Epstein and D.C. Shakes (Eds.)). Otros métodos para obtener mutantes con menos flagelos de diversas bacterias de las que el tipo salvaje tiene flagelos, han sido descritos por Liu, S.L. y cols., (Infect. Immun. 1988 Aug; 56(8): 1967-73), Haas, R. y cols. (Mol. Microbiol. mayo de 1993; 8(4): 753-60) y Graf. J. y cols., (J. Bacteriol. 1994 Nov; 176(22): 6986-91).

La selección de bacterias con menos flagelos se realiza de forma muy sencilla por análisis con microscopio óptico para determinar la ausencia o presencia de flagelos. La selección de bacterias que carecen de al menos un determinante antígeno de flagelina o flagelos se puede realizar por medio de ensayos de unión con anticuerpos monoclonales contra flagelina o flagelos. Dichos anticuerpos monoclonales anti-flagelares o anti-flagelina se pueden obtener con arreglo a las técnicas convencionales, es decir por inmunización (con flagelos) de ratones consanguíneos a través de técnicas conocidas dentro de la especialidad (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Los monoclonales así obtenidos se pueden utilizar en ensayos de unión con las bacterias mutadas, y las bacterias que no se unen a un monoclonal específico son bacterias que carecen de al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos.

Se desconoce la naturaleza de la mutación causada a través de técnicas de mutación clásicas. Puede tratarse de una mutación puntual que puede, si bien es improbable que ocurra, revertir finalmente en el tipo salvaje. Por consiguiente, la mutagénesis de transposón constituye una buena alternativa. La mutación por mutagénesis de transposón, también es una técnica de mutagénesis muy conocida dentro de la especialidad. Se trata de una mutación realizada en una sitio localizado en el cromosoma.

Una posibilidad de introducir una mutación en una sitio determinado previamente, más bien deliberadamente que al azar, es la que ofrece la tecnología de ADN recombinante. Dicha mutación puede ser una inserción, una supresión, un reemplazamiento de un nucleótido por otro o una combinación de ellos, siempre y cuando el gen mutado deje de codificar flagelina funcional. Dicha mutación se puede realizar por ejemplo por supresión de un número de pares de base. Hasta las supresiones muy pequeñas, tales como extensiones de 10 pares de base, pueden hacer que la flagelina deje de ser funcional. Incluso la supresión de un solo par de base puede conducir a una flagelina no funcional, ya que como resultado de dicha mutación, los otros pares de base dejan de estar en el marco de lectura correcto. Cada supresión o inserción de una serie de pares de base indivisibles por tres causa dicho desplazamiento de marco. Más preferiblemente, se elimina una extensión más larga, v.g., 100 pares de base. Es incluso más preferible, que se suprima el gen de flagelina en su totalidad. Se puede deducir fácilmente, que en especial las mutaciones que introducen un codon de parada en el marco de lectura abierto, o mutaciones que causan un desplazamiento de marco en el marco de lectura abierto son más adecuadas para obtener una cepa que deja de codificar flagelina. La mutagénesis dirigida a sitio es el método seleccionado para obtener un gen de flagelina que carece de uno o más determinantes antigénicos específicos. En función del mapa de determinantes antigénicos realizado por Joys (Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech 4: 56-59 (1991)), se pueden obtener genes de flagelina mutantes de los cuales se han eliminado uno o más determinantes antigénicos específicos. Todas las técnicas de ADN recombinantes para la construcción de mutantes flagelina negativos son técnicas convencionales muy conocidas. Se refieren a la clonación del gen flagelina, la modificación de la secuencia de gen por mutagénesis dirigida a sitio, digestión de enzima de restricción seguido de re-ligamiento o métodos de PCR y reemplazamiento posterior del gen flagelina de tipo salvaje con el gen mutante (cambio alélico o reemplazamiento alélico). Las técnicas de ADN recombinante convencionales tales como la clonación del gen de flagelina en un plásmido, digestión del gen con una enzima de restricción, seguido de tratamiento con endonucleasa, re-ligamiento y recombinación homóloga en la cepa huésped. Todas ellas son conocidas dentro de la especialidad y se describen en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. y cols., Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Las mutaciones dirigidas a sitio pueden realizarse por ejemplo por medio de mutagénesis dirigida a sitio in vitro utilizando el equipo Transformer® distribuido en el comercio por Clontech. Las técnicas de PCR se describen extensamente en Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995).

Por lo tanto, en una forma más preferible, este modo de realización de la invención se refiere a una bacteria que no es capaz de expresar una flagelina como consecuencia de una mutación en el gen flagelina.

Es sobre todo preferible que las bacterias se seleccionen del grupo que consiste en S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A y B, derby, hadar, heidelbert, agona y arizonae.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar vacunas marcador adecuadas para la protección de seres humanos y animales contra la salmonelosis. Las vacunas según la invención presentan como rasgo característico el comprender una bacteria tal como se ha definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La ventaja principal de las vacunas de acuerdo con la presente invención es que los seres humanos y animales vacunados con ellas pueden discriminarse tanto de seres humanos y animales no vacunados como de seres humanos y animales infectados con Salmonella de tipo salvaje en función de su panel de anticuerpos.

Las vacunas según la presente invención pueden presentarse en forma atenuada viva o en forma inactivada. En ambos casos, la ausencia de al menos un determinante antigénico de flagelos o flagelina tendrá como resultado un panel de anticuerpos tras la vacunación que se puede discriminar fácilmente del inducido tras la infección de tipo salvaje.

Las vacunas inactivadas presentan la ventaja con respecto a las vacunas vivas de ser inherentemente seguras. Por lo tanto, una forma preferible de la invención se refiere a vacunas en las que las bacterias se encuentran en forma inactivada.

Las vacunas según la invención que se basan en bacterias de Salmonella vivas, sin embargo, presentan una ventaja con respecto a las vacunas que comprenden bacterias inactivadas ya que imitan mejor la infección natural y, por consiguiente, estimulan el sistema inmune de un modo mejor. Asimismo, presentan otra importante ventaja tal como se explica más adelante. El desarrollo de vacunas atenuadas vivas en general resulta difícil y requiere tiempo. Por otra parte, el afinado preciso del grado de atenuación es complejo: una alta virulencia causa enfermedad y una baja virulencia no induce a una protección insuficiente. Sorprendentemente, las vacunas según la invención no presentan diferencias significativas en la virulencia cuando se comparan con las vacunas que llevan flagelos. Es decir, la eliminación del gen flagelina no cambia significativamente el nivel de atenuación. Esto presenta la inesperada ventaja de que se pueden utilizar cepas de Salmonella atenuadas vivas tanto futuras como existentes aprobadas adecuadas para su uso en vacunas en la presente invención siempre y cuando se las haga no capaces de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos. Por lo tanto, en una forma preferible, las vacunas según la invención comprenden bacterias atenuadas vivas.

Dada la gran cantidad de vacunas que se les administra hoy en día a los animales de compañía y de granja, está claro que sería deseable la administración combinada de varias vacunas, aunque sólo sea por razones de economizar los costes. Por consiguiente, resulta muy atractivo el uso de bacterias atenuadas vivas como vehículo recombinante para genes heterólogos, que codifican antígenos seleccionados entre otros virus o microorganismos patógenos. La administración de dicho vehículo recombinante presenta la ventaja de que se induce inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Las bacterias atenuadas vivas para su uso en una vacuna con arreglo a la presente invención proporciona vehículos muy adecuados para genes heterólogos. En principio, dichos genes heterólogos se pueden insertar en el genoma bacteriano en cualquier sitio no esencial.

Por consiguiente, otro modo de realización de la invención se refiere a bacterias con arreglo a la invención en las que se inserta un gen heterólogo. Dicho gen heterólogo puede ser, tal como se ha mencionado antes, v.g., un gen que codifica un antígeno seleccionado entre otros virus o microorganismos patógenos. Dichos genes pueden derivarse por ejemplo de herpesvirus patógenos (v.g., genes que codifican las proteínas estructurales de herpesvirus), Retrovirus (v.g., la proteína de envoltura gp160), adenovirus y similares.

Asimismo, se puede obtener un gen heterólogo de bacterias patógenas. Como ejemplo, son muy adecuados como genes heterólogos bacterianos genes que codifican toxinas bacterianas tales como toxinas Actinobacillus pleuropneumoniae, toxinas Clostridium, proteínas de membrana exterior y similares.

Otra posibilidad consiste en insertar un gen que codifica una proteína relacionada con la estimulación del sistema inmune, como por ejemplo una interleucina, factor de necrosis de tumor o un interferón, u otro gen relacionado con la inmunorregulación.

El uso del gen flagelina como sitio de inserción presenta la ventaja de que no es necesario encontrar un sitio de inserción nuevo para el gen heterólogo y, al mismo tiempo, se inactiva el gen de flagelina y se puede expresar el gen heterólogo recién introducido (en concierto con los genes bacterianos homólogos). La construcción de dichos vehículos recombinantes se puede realizar de forma rutinaria aplicando técnicas de biología molecular convencionales como por ejemplo intercambio alélilo.

Por consiguiente, en una forma preferible de este modo de realización, se inserta el gen heterólogo en el gen flagelina. Se puede insertar el gen heterólogo en alguna parte del gen flagelina o se puede insertar en el sitio del gen flagelina al tiempo que este gen ha sido parcial o completamente suprimido.

Una vacuna según la invención contiene también, además de la bacteria antes descrita, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser simplemente agua, si bien también puede consistir en el fluido de cultivo en el que se cultivaron las bacterias. Otro vehículo adecuado es por ejemplo una solución de concentración salina fisiológica.

La dosis útil que se administre variará dependiendo de la edad, el peso y el animal vacunado, el modo y la ruta de administración, así como el tipo de patógeno contra el que se prevé la vacuna. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacterias, suficiente para evocar una respuesta inmune. Las dosis comprendidas entre 10^{3} y 10^{10} bacterias, por ejemplo, son dosis muy adecuadas.

Si la vacuna según la invención incluye bacterias inactivadas, se deben añadir uno o más compuestos que tienen actividad adyuvante para la vacuna. Si la vacuna según la invención comprende bacterias atenuadas vivas, el uso de un adyuvante es opcional. Los adyuvantes son estimuladores no específicos del sistema inmune. Potencian la respuesta inmune del huésped a la vacuna. Entre los ejemplos de adyuvantes conocidos en la especialidad se incluyen adyuvante Incompleto y Completo de Freunds, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos, muramildipéptidos, ISCOM (complejos de estimulación inmune, consultar por ejemplo la patente europea EP 109942), Saponinas, aceite mineral, aceite vegetal y Carbopol. Los adyuvantes especialmente adecuados para aplicación mucosal son por ejemplo la toxina termo sensible E. Coli (LT) o toxina Cholera (CT). Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsiones en aceite (v.g., de Bayol F® o Marcol 52®, saponinas o solubilizato de vitamina E.

Otros ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles para la presente invención incluyen estabilizantes como SPGA, hidratos de carbono (v.g., sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas como albúmina o caseína, agentes que contienen proteína como suero bovino o leche desnatada y tampones (v.g., tampón de fosfato). Especialmente, cuando se añaden dichos estabilizantes a la vacuna, la vacuna es muy adecuada para el liofilizado o deshidratado por aspersión.

Por consiguiente, en una forma más preferible, la vacuna se encuentra en forma liofilizada o deshidratada por aspersión.

Para la administración a animales o seres humanos, la vacuna según la presente invención se puede administrar por ejemplo por vía intranasal, por aspersión, por vía intradérmica, subcutánea, oral, por aerosol o por vía intramuscular. Para la aplicación a pollos, la administración por red de ala o gotas oculares son también adecuadas.

Otro de los modos de realización de la invención se refiere al uso de bacterias con arreglo a la invención para la fabricación de una vacuna para la protección de seres humanos y animales contra la infección de una bacteria de Salmonella o los efectos patógenos de la infección.

La invención se refiere asimismo a métodos para la preparación de una vacuna con arreglo a la invención. Dichos métodos comprenden el mezclado de bacterias según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un ensayo de diagnóstico para la detección selectiva de la ausencia/presencia de anticuerpos anti-flagelina o anti-flagelos de Salmonella en el suero puede consistir por ejemplo en un ensayo ELISA simple en el que los flagelos o flagelina purificada o un polipéptido corto que comprende un fragmento antigénico del mismo recubren la pared de los pocillos de una placa ELISA. La incubación con suero de los seres humanos o animales que se van a someter a ensayo, seguido por ejemplo de incubación con un anticuerpo etiquetado contra el anticuerpo humano o animal correspondiente puede revelar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la flagelina.

Otro ejemplo de un sistema de ensayo de diagnóstico consiste por ejemplo en la incubación de una mancha de Western que incluye flagelina con suero de los seres humanos o animales que se van a someter a ensayo, seguido del análisis de la mancha.

Los ensayos de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra flagelina de Salmonella se presentan preferiblemente en forma de un equipo que incluye flagelina en forma purificada. La flagelina se puede purificar por ejemplo a través de técnicas de separación de proteína convencionales sobre una columna adecuada. Otra posibilidad es la separación de un gel PAGE seguido del manchado de Western. En la mancha de Western, la flagelina formará una banda específica, separada de otras bandas de proteína de Salmonella, y por consiguiente también se considera como purificada. Asimismo, se puede obtener una forma pura de la proteína expresando secuencias de ácido nucleico que codifican flagelina.

En principio, la forma más sencilla para obtener dicho sistema de ensayo de diagnóstico consiste en utilizar flagelina completa purificada tal como se ha explicado anteriormente. Sin embargo, es muy posible el uso de únicamente una parte de flagelina, siempre y cuando el fragmento utilizado siga incluyendo un determinante antigénico de la proteína. Todos los determinantes antigénicos de la flagelina inducirán anticuerpos por definición. Por consiguiente, el uso de un fragmento de flagelina que comprende incluso un solo determinante antigénico de la flagelina será capaz de unirse a anticuerpos antiflagelina.

Un ensayo con el que se puede discriminar entre suero de seres humanos o animales vacunados, infectados y no infectados consiste por ejemplo en un pocillo A recubierto con flagelina y un pocillo B recubierto con otro inmunógeno de Salmonella, o posiblemente células de Salmonella completas. El suero que reacciona con los pocillos A y B indica una infección de campo o vacunación con una vacuna clásica, mientras que el suero que reacciona solamente con el pocillo B indica que el animal de ensayo está vacunado con la vacuna marcador.

Ejemplo 1

Se utilizó la cepa Salmonella typhimurium STMP, una cepa atenuada que ha sido sometida a ensayo como una vacuna viva en pollos y cerdos y que proporciona buenos niveles de protección como material de partida para mutagénesis química.

Mutagénesis química

Se cultivo S. typhimurium STMP en un medio agar sanguíneo y se comprobó la presencia de aglutinación de grupo B antígeno O positiva y aglutinación tipo 2 de antígeno H. Se inoculó una colonia en medio LB y se incubó durante 20 horas a 37ºC con ventilación. Se diluyeron 10 \mul de cultivo de toda la noche en 10 ml de LB (3 cultivos) y se incubó a 37ºC durante 6 horas con ventilación hasta que el cultivo alcanzó un diámetro exterior a 600 nm de 0,5. Se tomó una muestra para determinar el número de bacterias viables. Se añadió a cada uno de los tres cultivos de 10 ml 100 \mul de trioxalen (forma de mutágenos químicos Sigma; 3 mg/ml en DMSO) y se vertió la suspensión en una placa petri de 10 cm \diameter. Se irradió la suspensión con U.V. (Transluminador UVP; longitud de onda 365 nm) durante 5, 10, ó 15 minutos a una distancia de 20 cm. Se transfirieron 10 \mul a 10 ml de NaCl al 0,9%, se realizaron diluciones 1/10 y se colocaron en placa 100 \mul sobre placas de agar sanguíneo con el fin de determinar el índice de supervivencia de bacterias en cultivos mutagenizados. Se desarrollaron cultivos con índices de supervivencia de aproximadamente 3% y 20% en 100 mL LB hasta que se recogieron bacterias de 0,5 de diámetro exterior a 600 nm por centrifugado, se volvieron a suspender en 5 ml de LB y se almacenaron en glicerol al 30% a 70ºC.

Selección de un mutante sin flagelos no móvil

Se inocularon las bacterias mutagenizadas (3% de supervivencia; entre 5.000 y 10.000 mutantes independientes) desde la reserva de glicerol en 3 placas de agar sanguíneo. Se recogieron bacterias en LB y se ajustó el diámetro exterior a 600 nm a 2,17. Se realizaron 6 diluciones de diez veces en LB y a continuación, se añadieron 50 \mul de antisuero H2 (Difco) a una suspensión bacteriana de 450 \mul. Se incluyó esta etapa de selección con antisuero H con el fin de enriquecer la suspensión de mutantes para bacterias sin flagelos. Se incubó esta suspensión a 37ºC durante 6 horas mientras se agitaba (250 rpm) y a continuación se centrifugó durante 1 minuto a 1000 rpm en una mini centrífuga Eppendorf con el fin de eliminar la aglutinación-complejo. A partir del sobrenadante, se colocaron en placa 1, 10, y 100 \mul en placas de agar sanguíneo y se incubaron 20 h a 27ºC.

Resultados Identificación de un mutante no móvil de S. Typhimurium STMP

La selección de bacterias no flageladas por incubación con anticuerpo H2 tuvo como resultado el crecimiento de aproximadamente 40 colonias sobre placas (dilución 10^{6}) inoculadas con suspensión de mutante tratado con suero (3% de supervivencia), en cambio no creció ninguna colonia sobre placas (10^{6} dilución) inoculadas con suspensión STMP tratada con suero. Este resultado indicó que estaban presentes mutantes que no se aglutinaron con el antisuero H2, que posiblemente no tenían flagelos. Se sometieron a ensayo las 40 colonias para determinar la aglutinación H2 y para determinar la movilidad utilizando un microscopio óptico. Todos los mutantes resultaron negativos para la aglutinación H2, pero solamente apareció un mutante no móvil tal como se observó con el microscopio óptico. Este mutante no móvil resultó positivo para la aglutinación de antígeno O de grupo B. Se denominó al mutante STM2000.

Estabilidad in vitro de STM 2000, un mutante no móvil de S. typhimurium STMP

Se sometió a ensayo la estabilidad fenotípica de STM2000 por 12 pasos in vitro sobre placas de agar sanguíneo. En el mismo experimento, se pasó la cepa progenitora, STMP 12 veces. Se observó estos cultivos con un microscopio óptico y todas las bacterias en el mutante-cultivo resultaron aún no móviles. Las bacterias de STMP eran móviles, si bien no todas las células presentaron el mismo nivel de movilidad. La comparación con microscopio de electrones de STMP y STM2000 confirmó que no estaban presentes flagelos en las bacterias mutantes.

Estabilidad in vitro de STM2001, un mutante no móvil de S. typhimurium STMP

En un experimento diferente se mutagenizó químicamente S. typhimurium SL3261 (número de depósito SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, University of Calgary, Alberta, Canadá) con NTG y se seleccionaron mutantes no móviles tal como se ha descrito anteriormente. Uno de los mutantes, STM2001 no mostró reacción con un anticuerpo monoclonal específico de flagelina. Tras la electroforesis de gel de proteína 2D se demostró que STM2001 carecía del punto de flagelina de 51 kDa y pI 4,7 en comparación con su cepa progenitora.

Se sometió a ensayo la estabilidad genética cultivando durante al menos 50 generaciones. Una vez transcurrido este período, no se encontraron inversiones: todas las bacterias seguían siendo no móviles.

La cepa STM2001 había sido depositada en el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, PO box 273,3740 AG Baarn, Países Bajos, bajo el número de acceso CBS 108955.

Ejemplo 2 Diseño experimental

Se prepararon vacunas a partir de la cepa tipo 4 de fago de S. enteritidis (S.e.) flagelada y no flagelada. Se cultivaron las bacterias en caldo de cultivo de triptosa fosfato, se inactivaron por adición de formalina a una concentración final de 0,5% seguido de la recogida de las células bacterianas por centrifugado. Se volvieron a suspender las células en solución salina tamponada con fosfato y se formularon en agua para formar vacunas de emulsión oleosa a 5 x 10^{9} bacterias /ml. Se inyectaron por vía intramuscular cinco pollos con la vacuna S.e fla^{+}y 5 pollos recibieron la vacuna S.e. fla^{-}. Se vacunó a los animales con 0,5 ml de vacuna a los 14 y 18 semanas de vida. A las 22 semanas de vida, se desangró a los pollos y se sometió a ensayo el suero en un sistema ELISA de bloqueo de sándwich de anticuerpo doble específico para anticuerpos para la flagelina g,m de S.e (Zijderveld, F.G. van y cols. (1993) Vet. Quart. 15, 135-137).

Animales

Se obtuvieron pollos de tipo ponedor comerciales, de aproximadamente 14 semanas de vida de un grupo sin Salmonella.

Resultados

Los 5 pollos que recibieron la vacuna S.e. fla^{+} se seroconviertieron en el ensayo ELISA específico g,m (porcentaje de bloqueo >60%) mientras que los 5 pollos vacunados con la vacuna fla^{-} permanecieron seronegativos.

Ejemplo 3

Experimento 1

Diseño experimental

Para valorar la seguridad, se inculó a pollos tomateros por vía oral (1 ml), subcutánea (0,5) e intramuscular (0,5 ml) cepa STMP de typhimurium de Salmonella flagelo positiva, cepa STM2000 de typhimurium Salmonella flagelo negativa o S. typhimurium de tipo salvaje (Salmonella typhimurium). Se observó a los animales durante una semana tras la inoculación seguido del examen post-mortem de los pollos que sobrevivieron.

Animales

Se obtuvieron pollos de corral comerciales, de tres semanas de vida obtenidos de un grupo que no tenía Salmonella.

Resultados

Después de la inoculación, 8 de cada 10 animales que recibieron Salmonella typhimurium de tipo salvaje murieron (tabla 1). En la necropsia, los 2 pollos que sobrevivieron inoculados con la cepa de tipo salvaje tenían los hígados hinchados con focos necróticos, bazos hinchados y edema pericárdico. Uno de los pollos inoculados con STMP tenía un hígado ligeramente hinchado y uno de los pollos a los que se le inoculó STM200 tenía un bazo ligeramente hinchado. No se observó ninguna otra anormalidad en los dos grupos.

TABLA 1

Grupo	STMP	STM2000	Tipo salvaje
Dosis (CFU/ml)	10^{8,0}	10^{7,7}	10^{8,0}
Mortalidad	0/10^{a}	0/10^{a}	8/10^{b}
Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher).

Experimento 2

Diseño experimental

Para ensayar tanto la seguridad como la eficacia, se inocularon los pollos tomateros por vía oral a los 3 y 15 días de vida tanto con STMP como STM2000 seguido de una infección de estimulación con una cepa de Salmonella typhimurium de tipo salvaje resistente a la tetraciclina a los 22 días de vida.

Se valoró la seguridad por observación clínica tras la vacunación y determinación de la ganancia de peso. Asimismo, se tomaron escobillones cloacales a los 10 y 22 días para determinar la presencia de cepas de vacuna en el tracto intestinal. Se utilizaron los escobillones para inocular Agares Verde Brillante (BGA) directamente y tras el enriquecimiento en caldo de cultivo Rappaport Vassiliades (RVB). Se observó a los animales durante una semana tras la infección de estímulo seguido del examen post-mortem de los pollos supervivientes. Se cultivaron los hígados, bazos, escobillones cloacales y escobillones del contenido del ciego de los pollos vacunados supervivientes para determinar la cepa de estímulo por inoculación directa de tetraciclina con contenido en BGA (BGAtet). Por otra parte, se incubaron los escobillones en un medio de enriquecimiento (agua con peptona tamponada que contenía tetraciclina) seguido de placa sobre BGAtet.

Animales

Se obtuvieron pollos tomateros comerciales, de tres días de vida de un grupo que no tenía Salmonella.

Resultados

No se observaron anomalías clínicas después de las vacunas orales a los 3 y 15 días de vida. Asimismo, las ganancias de peso medio en los grupos vacunados no fueron diferentes del grupo de control (tabla 3). Estuvieron presentes ambas cepas en los escobillones cloacales de los animales vacunados tomados 7 días después de la vacunación (Tabla 2). El hecho de que una mayor proporción de los pollos en el grupo al que se inoculó STMP fue positivo al cultivo tras la colocación en placa directa indica que esta cepa coloniza el tracto intestinal en números más altos que la cepa STM2000.

TABLA 2

	Escobillones STMP positivos	Escobillones STM2000 positivos
Reaislamiento	Directo	Enriquecimiento	Directo	Enriquecimiento
Día 10	15/15^{a}	Sin realizar	7/15^{b}	14/15
Día 22	1015^{a}	15/15^{A}	4/15^{a}	14/15^{A}
Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher).

Murió un pollo en el grupo STMP tras la infección de estímulo (7%) en comparación con la ausencia de mortalidad en el grupo STM2000 y el 80% de mortalidad en los controles sin vacunar (Tabla 3). Los pollos supervivientes en el grupo de control también ganaron mucho menos peso que los vacunados. La ganancia de peso del grupo vacunado con STM2000 tras la infección de estimulación fue significativamente más alta que la ganancia de peso del grupo vacunado STMP.

TABLA 3

Grupo	STMP	STM2000	Control
Dosis d3	10^{8,8}	10^{8,5}	-
Dosis d15	10^{8,5}	10^{8,5}	-
Ganancia peso d3-d22	636\pm98^{a}	594\pm72^{a}	624\pm82^{a}
Dosis estimulación S.t. d22	10^{8,0}	10^{8,0}	10^{8,0}
Ganancia peso d22-d29	299\pm45^{a}	339\pm42^{b}	31\pm39^{c}
Mortalidad	1/15^{a}	0/15^{a}	8/10^{b}
Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher (mortalidad) o ensayo t
de dos muestras (ganancia de peso).

Tal como se muestra en la tabla 4, no hubo diferencia en los índices de reaislamiento del organismo de estimulación entre el bazo y el hígado. La colonización del tracto intestinal, tal como se valora por reaislamiento de los escobillones cloacales y el contenido del ciego, fue significativamente más bajo en el grupo vacunado con STM2000.

TABLA 4

	Salmonella typhimurium(tet^{r}) positivo
Grupo	Vacunado con STMP	Vacunado con STM2000
Reaislamiento	Directo	Enriquecimiento	Directo	Enriquecimiento
Bazo	2/14^{a}	Sin realizar	1/14^{a}	Sin realizar
Hígado	1/14^{a}	Sin realizar	0/15^{a}	Sin realizar
Cloaca	7/14^{a}	14/14^{A}	3/15^{a}	7/15^{B}
Ciego	13/14^{a}	14/14^{A}	5/15^{b}	9/15^{B}
Grupos con diferentes superíndices en una fila diferente (p<0,5 ensayo exacto de Fisher).

Ejemplo 4 Diseño experimental

Para ensayar la eficacia, se inoculó a cerdos por vía oral STMP (10^{0,9} CFU) o STM2000 (10^{9,3} CFU) seguido de una infección de estímulo oral con una cepa de Salmonella typhimurium de tipo salvaje resistente a estreptomicina (10^{11,0} CFU) 2 semanas después.

Se midió el desprendimiento de la cepa de estímulo cultivando muestras fecales en los días 5 y 8 tras la estimulación. Se colocaron en placa aproximadamente 5 gramos de heces en agua con peptona y se incubaron durante 2 horas. A continuación, se realizaron diluciones de diez veces en serie en medio RVB que contenía estreptomicina, se incubó durante toda la noche y se colocó en placa sobre Caldo de cultivo de triptosa fosfato que contenía estreptomicina. Se utilizó la dilución máxima que contenía la cepa de estímulo para calcular la puntuación de reaislamiento (recíproco de la dilución positiva máxima).

Se utilizaron ocho cerdos vacunados con STMP y 8 controles sin vacunar en un primer experimento. En un segundo experimento se utilizaron 9 cerdos vacunados con STM2000 y 9 controles sin vacunar.

Animales

Se utilizaron cerdos SPF de seis semanas de vida en ambos experimentos.

Resultados

Tal como se muestra en la tabla 5, ambas cepas de vacuna fueron capaces de reducir el desprendimiento fecal de la cepa de estímulo significativamente.

TABLA 5

	Puntuación de reaislamiento media
	Día 5	Día 8
STMP (n=8)	10^{0,9a}	10^{10a}
Control (n=8)	10^{6,4a}	10^{3,8b}

STM2000 (n=9)	10^{1,0A}	10^{1,3A}
Control (n=9)	10^{5,0B}	10^{4,9B}
Grupos con diferentes superíndices difieren (p<0,5 ensayo U Mann-Whitney).

Leyendas a las figuras

Figura 1: análisis de perfil de proteína de STM2000 y su cepa parenteral S. typhimurium STMP. línea 1, 11 y 12 marcadores de peso molecular tal como se indica; línea 2, 5 y 8, S. typhimurium STMP 12x pasado sobre medio de agar sanguíneo; líneas 3,6 y 9, STM2000 12 x pasado sobre medio de agar sanguíneo; líneas 4, 7 y 10, STM2000 2 x pasado sobre medio de agar sanguíneo. Líneas 2, 3 y 4, perfil de proteína total; líneas 5, 6 y 7, pelet tras la sonicación y el centrifugado; líneas 8, 9 y 10, sobrenadante tras la sonicación y el centrifugado. Se mancharon proteínas con Azul Brillante de Coomassie.

Figura 2: Fotografías del examen por microscopio electrónico de S. typhimurium STMP (A) y su mutante no móvil STM2000 (B).

Claims

1. Uso de una bacteria del género Salmonella que en su forma salvaje lleva flagelos, no siendo capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos, y un adyuvante para la fabricación de una vacuna inactivada para la protección de seres humanos o animales contra infección por bacteria Salmonella o los efectos patógenos de la infección.

2. Uso de una bacteria del género Salmonella que en su forma tipo salvaje lleva flagelos, no siendo capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagela, para la fabricación de una vacuna atenuada viva para la protección de seres humanos o animales contra la infección con una bacteria Salmonella o los efectos patógenos de la infección.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha bacteria no es capaz de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos debido a una mutación en un gen o la ruta de biogénesis flagelar.

4. Uso según la reivindicación 3, en la que dicha mutación está localizada en el gen flagelina.

5. Uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A y B, derby, hadar, heidelberg, agona y arizonae.

6. Uso según la reivindicación 1-5 en la que dicha bacteria lleva además un gen heterólogo, insertándose dicho gen heterólogo preferiblemente en el gen flagelina.

7. Vacuna para la protección de animales contra salmonelosis, caracterizada porque la vacuna comprende bacteria inactivada tal como se ha descrito en las reivindicaciones 1 ó 3-5, un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Vacuna para la protección de animales contra salmonelosis, caracterizada porque la vacuna comprende bacterias atenuadas vivas tal como se ha descrito en las reivindicaciones 2-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Vacuna según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque está en forma liofilizada o deshidratada por aspersión.