ES2222152T3 - Vacuna con las salmonellas que no inducen anticuerpos que reaccionan con la flagelina o los flagelos. - Google Patents
Vacuna con las salmonellas que no inducen anticuerpos que reaccionan con la flagelina o los flagelos.Info
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Abstract
Uso de una bacteria del género Salmonella que en su forma salvaje lleva flagelos, no siendo capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos, y un adyuvante para la fabricación de una vacuna inactivada para la protección de seres humanos o animales contra infección por bacteria Salmonella o los efectos patógenos de la infección.
Description
Vacuna con las Salmonellas que no inducen
anticuerpos que reaccionan con la flagelina o los flagelos.
La presente invención se refiere a la bacteria
Salmonella para su uso en una vacuna, a vacunas basadas en
estas bacterias, al uso de dichas bacterias para la fabricación de
una vacuna y a métodos de preparación de dichas vacunas.
Las bacterias del género Salmonella son
muy conocidas por su patogenicidad tanto en el ser humano como en
animales. Tan sólo en EE.UU., anualmente, el número de seres humanos
que sufren de infecciones por Salmonella sobrepasa los dos
millones de casos. En la mayoría de los casos, la infección es
causada por alimentos contaminados. Entre las fuentes de infección
conocidas se pueden mencionar los huevos (tanto de pato como de
gallina), productos que contienen huevos y carne de cerdo y pollo no
suficientemente hecha. Sobre todo en los niños pequeños, las
personas mayores y los enfermos inmunocomprometidos, la capacidad
de superar estas infecciones es baja. Especialmente en estos
grupos, el índice de mortalidad anual como consecuencia de las
infecciones por Salmonella es alto. Durante las últimas
décadas, la cría de ganado a gran escala más eficiente ha conducido
a un enorme aumento de la densidad animal. Como resultado, se
observa un aumento del número de infecciones animales y las
consiguientes infecciones en seres humanos causadas por alimentos
infectados. Está claro que los animales son la fuente principal de
la infección por Salmonella. Se trata de una fuente muy
difícil de controlar. En primer lugar, las infecciones por
Salmonella en la mayoría de los casos provocan enfermedades
que no son graves en animales maduros y sanos; dichos animales
pueden se portadores de la bacteria durante un período de tiempo
prolongado. Durante ese tiempo, vierten la bacteria en sus
excrementos, lo que hace prácticamente imposible evitar la
infección en los animales jóvenes más vulnerables. En segundo
lugar, muchas especies de Salmonella colonizan diferentes
especies animales huésped. Algunas especies de Salmonella
causan infecciones primarias en huéspedes específicos, mientras que
otras especies de Salmonella no son restrictivas en absoluto.
Como agentes de infección primarios, S. typhi y
paratyphi están asociados frecuentemente con infección en el
hombre. S. typhi causa diarrea y, en consecuencia,
deshidratación. Dicha infección se encuentra con mucha frecuencia en
zonas tropicales. S. dublin está relacionado con el ganado,
específicamente animales jóvenes, en los que provoca infecciones
letales en más de un 50% de los casos. S.
abortus-equi provoca abortos en caballos. S.
abortus-ovi provoca abortos en ovejas. S.
choleraesuis es la causa de diarrea letal en cerdos jóvenes.
S. typhimurium y S. enteritidis provoca salmonelosis
en pollos, cerdos, ganado vacuno y roedores. S. arizonae
también provoca enfermedades en pavos. Hay otros animales que no se
utilizan en la industria de la alimentación, como los reptiles, que
sufren infecciones por Salmonella, como por ejemplo S.
arizonae.
Existe pues una clara necesidad de contar con
vacunas para la Salmonella eficaces. Dichas vacunas han de
proteger a los seres humanos frente a infecciones por
Salmonella transmitidas de hombre a hombre. Asimismo, se
necesitan vacunas para proteger al ser humano frente a las
infecciones por Salmonella soportada en los alimentos.
Finalmente, es necesario que dichas vacunas protejan a los animales
frente a infecciones por Salmonella.
Actualmente, existen en el comercio diversas
vacunas contra diversas especies de Salmonella. Dichas
vacunas, si bien a veces son eficaces desde el punto de vista de la
vacuna, presentan sin embargo un grave inconveniente. Por lo
general, inducen una población de anticuerpos que equivale a la de
una infección con bacterias de tipo salvaje ya que poseen la misma
carga de antigénico que la bacteria de tipo salvaje. Por
consiguiente, un análisis de los anticuerpos en el suero de un
animal Salmonella positivo no revela por qué el animal es
positivo. Esto puede deberse a la vacunación, pero también puede
venir dado igualmente por la infección con una cepa de campo
virulenta. Por lo tanto, si un animal es Salmonella
positivo, se considera que está infectado. Por consiguiente, sería
deseable contar con lo que se llama vacuna marcador. Una vacuna
marcador es una vacuna que puede discriminarse de la infección de
tipo salvaje, v.g., en función de un panel de anticuerpos
característico, diferente del panel de anticuerpo inducido por
infección de tipo salvaje. Se induce un panel de anticuerpos
diferente, v.g., cuando una proteína inmunogénica presente en una
bacteria de tipo salvaje no está presente en un mutante que se
utiliza para vacunación: entonces el huésped no fabricará
anticuerpos contra la proteína tras la vacunación.
Un antígeno marcador presenta al menos las
siguientes características:
\Rightarrow puede suprimirse sin deteriorar
gravemente la viabilidad de la bacteria.
\Rightarrow induce anticuerpos cuando está
presente.
\Rightarrow cuando está presente, no contribuye
a la inmunogenicidad de la bacteria.
\Rightarrow su ausencia contribuye
preferiblemente a atenuación.
Al investigar para la búsqueda de antígenos
marcadores adecuados, se han de considerar todos los antígenos de
Salmonella conocidos. Un antígeno conocido que se encuentra
con todas las especies de tipo Salmonella con la excepción de
algunas subespecies de S. pullorum y gallinarum es el
flagelo. Entre los ejemplos de especies de Salmonella que
llevan flagelos cuando se encuentran en su forma de tipo salvaje se
pueden mencionar S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis,
dublin, typhi, abortus-ovi,
abortus-equi, paratyphi A y B, derby, hadar,
heidelberg, agona y arizonae. Los flagelos son
estruturas largas que sobresalen desde la superficie celular y
desempeñan un importante papel en la movilidad e invasión de
determinadas células huésped. Los flagelos consisten en largos
polímeros de la proteína denominada flagelina. Se sabe que dichos
flagelos inducen altos niveles de anticuerpos. Se sabe asimismo que
la ausencia de flagelos no deteriora significativamente la
viabilidad de las bacterias fuera del huésped: se conocen mutantes
con menos flagelos de prácticamente todas las especies de
Salmonella, que se pueden desarrollar in vitro. No
obstante, las proteínas flagelares de Salmonella nunca han
sido contempladas como marcadores adecuados, ya que no satisfacen, o
sólo lo hacen parcialmente, tres de los cuatro requisitos del
marcador:
- aunque no es esencial para sobrevivir fuera del
huésped, desempeñan un significativo papel en la supervivencia de
las bacterias y la persistencia en macrófagos huésped, relacionados
con la inducción de inmunidad. (Methner, U. y Barrow, P.A., Berl,
Münch. Tierärtzl. Wschr. 110:391-396 (1997),
Weinstein y cols., Infect. Immun. 46: 819-825
(1984)).
- contribuyen fuertemente a la inmnogenicidad de
la bacteria, una razón por la que se utilizan incluso como
proteínas vehículo para secuencias de aminoácido heterólogas cortas
(Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4:
56-59 (1991), Newton, S.M.C. y cols., Science 244:
70-72 (1989)).
- su ausencia no contribuye a atenuación
(Lockman, H.A. and Curtiss, R., Infect. & Immun. 58:
137-143 (1990), Methner, U. and Barrow, P.A. Berl.
Münch. Tierärtzl. Wschr. 110: 391-396 (1997).
- Las bacterias de Salmonella flageladas
inhiben la unión de otras Salmonellas flageladas. Las
bacterias de Salmonella con menos flagelos sin embargo
presentan un menor potencial de inhibición hacia otras
Salmonellas flageladas y, por lo tanto, aumentan incluso el
nivel global de infección de Salmonella. (Methner, U. and
Barrow, P.A., Berl. Münch, Tierärtzl. Wschr. 110:
391-396 (1997), Weinstein y cols., Infect. Immun.
46: 819-825 (1984)).
En la patente inglesa GB 1.109.179, Ephraim Saul
Anderson se describen vacunas a base de Salmonella typhi o
parathypi inactivada que está desprovista de flagelos.
Dichas vacunas fueron administradas sin adyuvante. Tal como
describió Anderson varios años después (Wandan, M. y cols., 1975,
Bull. World Health Organisation), estas vacunas no proporcionaron
ninguna protección. Por otra parte, en este documento se subrayó
una vez más la importancia de los flagelos en las vacunas.
Por todas estas razones en su conjunto, el
flagelo nunca fue considerado como un antígeno de marcador
suprimible adecuado para vacunas de Salmonella.
Sorprendentemente se ha observado ahora, en
contraste con la suposición general, que la ausencia de flagelos no
afecta al potencial de vacunación de la Salmonella. Esto
resulta especialmente sorprendente a la vista del hecho de que en
los animales infectados con Salmonella de tipo salvaje se
encuentran grandes cantidades de anticuerpos contra los flagelos,
lo que prueba una vez más su antigenicidad. Uno de los objetos de
la presente invención consiste en proporcionar bacterias del género
Salmonella que en su forma de tipo salvaje llevan flagelos
pero que dejan de ser capaces de inducir anticuerpos contra al menos
un determinante antigénico de flagelina o flagelos, cuando están en
una forma inactivada en combinación con un adjuvante, para su uso en
una vacuna para la protección de seres humanos y animales contra la
salmonelosis.
Las flagelinas son proteínas de aproximadamente
500 aminoácidos que comprenden varios determinantes de antigénicos,
es decir, existen varias regiones en las flagelinas contra las
cuales se desarrollan anticuerpos en el animal huésped. Dichos
determinantes antigénicos han sido identificados y localizados por
T.M. Joys (Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4:
56-59 (1991)). Para los fines de la presente
invención, las bacterias que dejan de ser capaces de inducir
anticuerpos contra el menos un determinante antigénico de flagelina
o flagelos se consideran como bacterias que no comprenden flagelina
o flagelos que siguen poseyendo todos los determinantes
antigénicos. No es necesario eliminar todos los determinantes
antigénicos: es suficiente suprimir uno de los determinantes
antigénicos. La detección selectiva de anticuerpos contra este
determinante antigénico en el suero de animales seropositivos
permitiría entonces la discriminación entre animales vacunados con
marcador y los infectados con tipo salvaje. Dichos anticuerpos no se
encontrarían en los animales vacunados, mientras que sí estarían
presentes en animales infectados de forma natural. La detección
selectiva puede realizarse de forma sencilla con herramientas de
diagnóstico sencillas de forma rutinaria tal como se describe más
adelante.
Actualmente, se conoce mucho sobre la síntesis de
flagelina y la consiguiente maduración en flagelos (V.g., en
Escherichia coli and Salmonella typhimurium.
Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt y
cols., 2ª ed. ISBN
1-55581-084-5 (1996)
y en Macnab, R.M.; Genetics and biogenesis of bacterial flagella
(Annual Review of Genetics 26: 131-158 (1992)). El
proceso de biogénesis flagelar requiere la acción concertada de un
gran número de genes, no solamente el gen que codifica la flagelina
sino también un gran número de genes implicados en la síntesis de
flagelo y el motor flagelar. En principio, existen dos métodos para
obtener bacterias con arreglo a la presente invención. En primer
lugar, se pueden realizar mutaciones en el gel que codifica la
proteína flagelina con el fin de mutar uno o más determinantes
antigénicos. En segundo lugar, se pueden mutar uno o más genes
relacionados con la biogénesis del flagelo. Esto evitará la
biosíntesis de flagelina e incluso el flagelo entero y, en muchos
casos, incluso el transporte de flagelina a través de la membrana
bacteriana. Cuando no se producen flagelos, estarán ausentes los
determinantes antigénicos determinados por doblado específico de la
flagelina en flagelos. Si la propia flagelina no se transporta a
través de la membrana y, de este modo, permanece dentro de la
bacteria, no habrá inducción de anticuerpos contra flagelina. Todos
los tipos de genes o agrupamientos de genes conocidos dentro de la
especialidad como relacionados en el ensamblaje y exportación, como
por ejemplo Ruta de Ensamblaje Morfológico y Ruta de Exportación
específica para Flagelo, pueden ser dianas para la mutación. Todos
ellos llevan a que la bacteria carezca de flagelina o al menos de
flagelos. Con fines de claridad, todas las vías relacionadas con el
proceso global de síntesis de los flagelos finales se denominan en
adelante rutas de biogénesis flagelar.
Por lo tanto, en un modo de realización
preferible, la bacteria no es capaz de inducir anticuerpos contra
al menos un determinante antigénico de flagelina o flagelos debido
a la mutación en un gen de la ruta de biogénesis flagelar.
Desde el punto de vista práctico, puede ser
deseable sin embargo suprimir (parte de) el conjunto del gen
flagelina de la bacteria que se va a utilizar en la vacuna,
simplemente suprimiendo el gen que codifica la proteína flagelar. Se
conocen los genes que codifican las proteínas flagelares de diversas
especies de Salmonella. Están todos ellos íntimamente
relacionados y, por lo tanto, son altamente homólogos. Los genes de
flagelina han sido descritos para Salmonella enterica (Li.,
J. y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2552-2556
(1994), Salmonella enteritidis (Selander, R.K. y cols., J.
Bacteriol. 174, 3587-3592 (1992)), Salmonella
dublin (Masten, B.J. and Joys, T.M. J. Bacteriol. 175,
5359-5365 (1993)), Salmonella typhimurium (de
Vries, N. y cols., Appl. Environ. Microbiol. 64,
5033-5038 (1998)), Salmonella
abortus-equi (Hanafusa, T. y cols., Mol. Gen.
Genet. 236, 260-266 (1993)). Los genes de flagelina
de especies de Salmonella nuevas se pueden encontrar
fácilmente en función de su homología con todos los genes de
flagelina de Salmonella existentes y conocidos: las técnicas
de hibridación convencionales serán suficientes para localizar el
gen de flagelina.
Existen dos genes de flagelina en bacterias de
Salmonella que llevan flagelo de tipo salvaje. Únicamente uno
de estos genes se conecta, es decir, produce flagelina en un momento
dado. Debido a un mecanismo denominado variación de fase flagelar,
en una escala de tiempo del orden de 10^{3} a 10^{5}
generaciones, los genes cambian sus funciones de manera que los no
expresados se convierten en expresados y viceversa. (V.g., descrito
en Escherichia coli and Salmonella typhimurium.
Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt y
cols., 2ª ed. ISBN
1-55581-084-5
(1996)). Con el fin de evitar que las cepas según la invención
comiencen a expresar flagelina después de un determinado número de
generaciones, ambos genes de flagelina han de hacerse no
funcionales. Alternativamente, si el mecanismo de conexión de fase
se hace no funcional es suficiente eliminar el gen de flagelina que
se expresa en ese momento.
Un gen no funcional es un gen que deja de
codificar una flagelina, que puede consistir en un gen del que parte
de la secuencia de codificación que codifica un determinante
antigénico haya sido eliminada.
Un modo posible de obtención del gen de flagelina
o cualquiera de los otros genes conocidos relacionados en la
biosíntesis de flagelo no funcional es a través de métodos
clásicos, como por ejemplo el tratamiento de bacterias que producen
flagelos de bacterias de tipo salvaje con agentes mutagénicos tales
como análogos de base, tratamiento con luz ultravioleta o
tratamiento de temperatura (Anderson, P. 1995. Mutagénesis, p.
31-58 en Methods in Cell Biology 48. H.F. Epstein
and D.C. Shakes (Eds.)). Otros métodos para obtener mutantes con
menos flagelos de diversas bacterias de las que el tipo salvaje
tiene flagelos, han sido descritos por Liu, S.L. y cols., (Infect.
Immun. 1988 Aug; 56(8): 1967-73), Haas, R. y
cols. (Mol. Microbiol. mayo de 1993; 8(4):
753-60) y Graf. J. y cols., (J. Bacteriol. 1994
Nov; 176(22): 6986-91).
La selección de bacterias con menos flagelos se
realiza de forma muy sencilla por análisis con microscopio óptico
para determinar la ausencia o presencia de flagelos. La selección de
bacterias que carecen de al menos un determinante antígeno de
flagelina o flagelos se puede realizar por medio de ensayos de unión
con anticuerpos monoclonales contra flagelina o flagelos. Dichos
anticuerpos monoclonales anti-flagelares o
anti-flagelina se pueden obtener con arreglo a las
técnicas convencionales, es decir por inmunización (con flagelos)
de ratones consanguíneos a través de técnicas conocidas dentro de
la especialidad (Kohler and Milstein, Nature, 256,
495-497, 1975). Los monoclonales así obtenidos se
pueden utilizar en ensayos de unión con las bacterias mutadas, y
las bacterias que no se unen a un monoclonal específico son
bacterias que carecen de al menos un determinante antigénico de
flagelina o flagelos.
Se desconoce la naturaleza de la mutación causada
a través de técnicas de mutación clásicas. Puede tratarse de una
mutación puntual que puede, si bien es improbable que ocurra,
revertir finalmente en el tipo salvaje. Por consiguiente, la
mutagénesis de transposón constituye una buena alternativa. La
mutación por mutagénesis de transposón, también es una técnica de
mutagénesis muy conocida dentro de la especialidad. Se trata de una
mutación realizada en una sitio localizado en el cromosoma.
Una posibilidad de introducir una mutación en una
sitio determinado previamente, más bien deliberadamente que al azar,
es la que ofrece la tecnología de ADN recombinante. Dicha mutación
puede ser una inserción, una supresión, un reemplazamiento de un
nucleótido por otro o una combinación de ellos, siempre y cuando el
gen mutado deje de codificar flagelina funcional. Dicha mutación se
puede realizar por ejemplo por supresión de un número de pares de
base. Hasta las supresiones muy pequeñas, tales como extensiones de
10 pares de base, pueden hacer que la flagelina deje de ser
funcional. Incluso la supresión de un solo par de base puede
conducir a una flagelina no funcional, ya que como resultado de
dicha mutación, los otros pares de base dejan de estar en el marco
de lectura correcto. Cada supresión o inserción de una serie de
pares de base indivisibles por tres causa dicho desplazamiento de
marco. Más preferiblemente, se elimina una extensión más larga,
v.g., 100 pares de base. Es incluso más preferible, que se suprima
el gen de flagelina en su totalidad. Se puede deducir fácilmente,
que en especial las mutaciones que introducen un codon de parada en
el marco de lectura abierto, o mutaciones que causan un
desplazamiento de marco en el marco de lectura abierto son más
adecuadas para obtener una cepa que deja de codificar flagelina. La
mutagénesis dirigida a sitio es el método seleccionado para obtener
un gen de flagelina que carece de uno o más determinantes
antigénicos específicos. En función del mapa de determinantes
antigénicos realizado por Joys (Joys, T.M., SAAS Bulletin: Biochem.
& Biotech 4: 56-59 (1991)), se pueden obtener
genes de flagelina mutantes de los cuales se han eliminado uno o
más determinantes antigénicos específicos. Todas las técnicas de
ADN recombinantes para la construcción de mutantes flagelina
negativos son técnicas convencionales muy conocidas. Se refieren a
la clonación del gen flagelina, la modificación de la secuencia de
gen por mutagénesis dirigida a sitio, digestión de enzima de
restricción seguido de re-ligamiento o métodos de
PCR y reemplazamiento posterior del gen flagelina de tipo salvaje
con el gen mutante (cambio alélico o reemplazamiento alélico). Las
técnicas de ADN recombinante convencionales tales como la clonación
del gen de flagelina en un plásmido, digestión del gen con una
enzima de restricción, seguido de tratamiento con endonucleasa,
re-ligamiento y recombinación homóloga en la cepa
huésped. Todas ellas son conocidas dentro de la especialidad y se
describen en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. y cols., Molecular
cloning: a laboratory manual. ISBN
0-87969-309-6). Las
mutaciones dirigidas a sitio pueden realizarse por ejemplo por
medio de mutagénesis dirigida a sitio in vitro utilizando el
equipo Transformer® distribuido en el comercio por Clontech. Las
técnicas de PCR se describen extensamente en Dieffenbach &
Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN
0-87969-447-5
(1995).
Por lo tanto, en una forma más preferible, este
modo de realización de la invención se refiere a una bacteria que no
es capaz de expresar una flagelina como consecuencia de una mutación
en el gen flagelina.
Es sobre todo preferible que las bacterias se
seleccionen del grupo que consiste en S. typhimurium,
enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi,
abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi
A y B, derby, hadar, heidelbert, agona y arizonae.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar vacunas marcador adecuadas para la protección de seres
humanos y animales contra la salmonelosis. Las vacunas según la
invención presentan como rasgo característico el comprender una
bacteria tal como se ha definido anteriormente y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. La ventaja principal de las vacunas de
acuerdo con la presente invención es que los seres humanos y
animales vacunados con ellas pueden discriminarse tanto de seres
humanos y animales no vacunados como de seres humanos y animales
infectados con Salmonella de tipo salvaje en función de su
panel de anticuerpos.
Las vacunas según la presente invención pueden
presentarse en forma atenuada viva o en forma inactivada. En ambos
casos, la ausencia de al menos un determinante antigénico de
flagelos o flagelina tendrá como resultado un panel de anticuerpos
tras la vacunación que se puede discriminar fácilmente del inducido
tras la infección de tipo salvaje.
Las vacunas inactivadas presentan la ventaja con
respecto a las vacunas vivas de ser inherentemente seguras. Por lo
tanto, una forma preferible de la invención se refiere a vacunas en
las que las bacterias se encuentran en forma inactivada.
Las vacunas según la invención que se basan en
bacterias de Salmonella vivas, sin embargo, presentan una
ventaja con respecto a las vacunas que comprenden bacterias
inactivadas ya que imitan mejor la infección natural y, por
consiguiente, estimulan el sistema inmune de un modo mejor.
Asimismo, presentan otra importante ventaja tal como se explica más
adelante. El desarrollo de vacunas atenuadas vivas en general
resulta difícil y requiere tiempo. Por otra parte, el afinado
preciso del grado de atenuación es complejo: una alta virulencia
causa enfermedad y una baja virulencia no induce a una protección
insuficiente. Sorprendentemente, las vacunas según la invención no
presentan diferencias significativas en la virulencia cuando se
comparan con las vacunas que llevan flagelos. Es decir, la
eliminación del gen flagelina no cambia significativamente el nivel
de atenuación. Esto presenta la inesperada ventaja de que se pueden
utilizar cepas de Salmonella atenuadas vivas tanto futuras
como existentes aprobadas adecuadas para su uso en vacunas en la
presente invención siempre y cuando se las haga no capaces de
inducir anticuerpos contra al menos un determinante antigénico de
flagelina o flagelos. Por lo tanto, en una forma preferible, las
vacunas según la invención comprenden bacterias atenuadas
vivas.
Dada la gran cantidad de vacunas que se les
administra hoy en día a los animales de compañía y de granja, está
claro que sería deseable la administración combinada de varias
vacunas, aunque sólo sea por razones de economizar los costes. Por
consiguiente, resulta muy atractivo el uso de bacterias atenuadas
vivas como vehículo recombinante para genes heterólogos, que
codifican antígenos seleccionados entre otros virus o
microorganismos patógenos. La administración de dicho vehículo
recombinante presenta la ventaja de que se induce inmunidad contra
dos o más enfermedades al mismo tiempo. Las bacterias atenuadas
vivas para su uso en una vacuna con arreglo a la presente invención
proporciona vehículos muy adecuados para genes heterólogos. En
principio, dichos genes heterólogos se pueden insertar en el genoma
bacteriano en cualquier sitio no esencial.
Por consiguiente, otro modo de realización de la
invención se refiere a bacterias con arreglo a la invención en las
que se inserta un gen heterólogo. Dicho gen heterólogo puede ser,
tal como se ha mencionado antes, v.g., un gen que codifica un
antígeno seleccionado entre otros virus o microorganismos patógenos.
Dichos genes pueden derivarse por ejemplo de herpesvirus patógenos
(v.g., genes que codifican las proteínas estructurales de
herpesvirus), Retrovirus (v.g., la proteína de envoltura gp160),
adenovirus y similares.
Asimismo, se puede obtener un gen heterólogo de
bacterias patógenas. Como ejemplo, son muy adecuados como genes
heterólogos bacterianos genes que codifican toxinas bacterianas
tales como toxinas Actinobacillus pleuropneumoniae, toxinas
Clostridium, proteínas de membrana exterior y similares.
Otra posibilidad consiste en insertar un gen que
codifica una proteína relacionada con la estimulación del sistema
inmune, como por ejemplo una interleucina, factor de necrosis de
tumor o un interferón, u otro gen relacionado con la
inmunorregulación.
El uso del gen flagelina como sitio de inserción
presenta la ventaja de que no es necesario encontrar un sitio de
inserción nuevo para el gen heterólogo y, al mismo tiempo, se
inactiva el gen de flagelina y se puede expresar el gen heterólogo
recién introducido (en concierto con los genes bacterianos
homólogos). La construcción de dichos vehículos recombinantes se
puede realizar de forma rutinaria aplicando técnicas de biología
molecular convencionales como por ejemplo intercambio alélilo.
Por consiguiente, en una forma preferible de este
modo de realización, se inserta el gen heterólogo en el gen
flagelina. Se puede insertar el gen heterólogo en alguna parte del
gen flagelina o se puede insertar en el sitio del gen flagelina al
tiempo que este gen ha sido parcial o completamente suprimido.
Una vacuna según la invención contiene también,
además de la bacteria antes descrita, un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Dicho vehículo puede ser simplemente agua, si bien
también puede consistir en el fluido de cultivo en el que se
cultivaron las bacterias. Otro vehículo adecuado es por ejemplo una
solución de concentración salina fisiológica.
La dosis útil que se administre variará
dependiendo de la edad, el peso y el animal vacunado, el modo y la
ruta de administración, así como el tipo de patógeno contra el que
se prevé la vacuna. La vacuna puede comprender cualquier dosis de
bacterias, suficiente para evocar una respuesta inmune. Las dosis
comprendidas entre 10^{3} y 10^{10} bacterias, por ejemplo, son
dosis muy adecuadas.
Si la vacuna según la invención incluye bacterias
inactivadas, se deben añadir uno o más compuestos que tienen
actividad adyuvante para la vacuna. Si la vacuna según la invención
comprende bacterias atenuadas vivas, el uso de un adyuvante es
opcional. Los adyuvantes son estimuladores no específicos del
sistema inmune. Potencian la respuesta inmune del huésped a la
vacuna. Entre los ejemplos de adyuvantes conocidos en la
especialidad se incluyen adyuvante Incompleto y Completo de Freunds,
vitamina E, polímeros de bloque no iónicos, muramildipéptidos, ISCOM
(complejos de estimulación inmune, consultar por ejemplo la patente
europea EP 109942), Saponinas, aceite mineral, aceite vegetal y
Carbopol. Los adyuvantes especialmente adecuados para aplicación
mucosal son por ejemplo la toxina termo sensible E. Coli (LT)
o toxina Cholera (CT). Otros adyuvantes adecuados son por
ejemplo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de
aluminio, emulsiones en aceite (v.g., de Bayol F® o Marcol 52®,
saponinas o solubilizato de vitamina E.
Otros ejemplos de vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables útiles para la presente invención
incluyen estabilizantes como SPGA, hidratos de carbono (v.g.,
sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas
como albúmina o caseína, agentes que contienen proteína como suero
bovino o leche desnatada y tampones (v.g., tampón de fosfato).
Especialmente, cuando se añaden dichos estabilizantes a la vacuna,
la vacuna es muy adecuada para el liofilizado o deshidratado por
aspersión.
Por consiguiente, en una forma más preferible, la
vacuna se encuentra en forma liofilizada o deshidratada por
aspersión.
Para la administración a animales o seres
humanos, la vacuna según la presente invención se puede administrar
por ejemplo por vía intranasal, por aspersión, por vía intradérmica,
subcutánea, oral, por aerosol o por vía intramuscular. Para la
aplicación a pollos, la administración por red de ala o gotas
oculares son también adecuadas.
Otro de los modos de realización de la invención
se refiere al uso de bacterias con arreglo a la invención para la
fabricación de una vacuna para la protección de seres humanos y
animales contra la infección de una bacteria de Salmonella o
los efectos patógenos de la infección.
La invención se refiere asimismo a métodos para
la preparación de una vacuna con arreglo a la invención. Dichos
métodos comprenden el mezclado de bacterias según la invención y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un ensayo de diagnóstico para la detección
selectiva de la ausencia/presencia de anticuerpos
anti-flagelina o anti-flagelos de
Salmonella en el suero puede consistir por ejemplo en un
ensayo ELISA simple en el que los flagelos o flagelina purificada o
un polipéptido corto que comprende un fragmento antigénico del
mismo recubren la pared de los pocillos de una placa ELISA. La
incubación con suero de los seres humanos o animales que se van a
someter a ensayo, seguido por ejemplo de incubación con un
anticuerpo etiquetado contra el anticuerpo humano o animal
correspondiente puede revelar la presencia o ausencia de
anticuerpos contra la flagelina.
Otro ejemplo de un sistema de ensayo de
diagnóstico consiste por ejemplo en la incubación de una mancha de
Western que incluye flagelina con suero de los seres humanos o
animales que se van a someter a ensayo, seguido del análisis de la
mancha.
Los ensayos de diagnóstico para la detección de
anticuerpos contra flagelina de Salmonella se presentan
preferiblemente en forma de un equipo que incluye flagelina en
forma purificada. La flagelina se puede purificar por ejemplo a
través de técnicas de separación de proteína convencionales sobre
una columna adecuada. Otra posibilidad es la separación de un gel
PAGE seguido del manchado de Western. En la mancha de Western, la
flagelina formará una banda específica, separada de otras bandas de
proteína de Salmonella, y por consiguiente también se
considera como purificada. Asimismo, se puede obtener una forma pura
de la proteína expresando secuencias de ácido nucleico que codifican
flagelina.
En principio, la forma más sencilla para obtener
dicho sistema de ensayo de diagnóstico consiste en utilizar
flagelina completa purificada tal como se ha explicado
anteriormente. Sin embargo, es muy posible el uso de únicamente una
parte de flagelina, siempre y cuando el fragmento utilizado siga
incluyendo un determinante antigénico de la proteína. Todos los
determinantes antigénicos de la flagelina inducirán anticuerpos por
definición. Por consiguiente, el uso de un fragmento de flagelina
que comprende incluso un solo determinante antigénico de la
flagelina será capaz de unirse a anticuerpos antiflagelina.
Un ensayo con el que se puede discriminar entre
suero de seres humanos o animales vacunados, infectados y no
infectados consiste por ejemplo en un pocillo A recubierto con
flagelina y un pocillo B recubierto con otro inmunógeno de
Salmonella, o posiblemente células de Salmonella
completas. El suero que reacciona con los pocillos A y B indica una
infección de campo o vacunación con una vacuna clásica, mientras
que el suero que reacciona solamente con el pocillo B indica que el
animal de ensayo está vacunado con la vacuna marcador.
Se utilizó la cepa Salmonella typhimurium
STMP, una cepa atenuada que ha sido sometida a ensayo como una
vacuna viva en pollos y cerdos y que proporciona buenos niveles de
protección como material de partida para mutagénesis química.
Se cultivo S. typhimurium STMP en un medio
agar sanguíneo y se comprobó la presencia de aglutinación de grupo B
antígeno O positiva y aglutinación tipo 2 de antígeno H. Se inoculó
una colonia en medio LB y se incubó durante 20 horas a 37ºC con
ventilación. Se diluyeron 10 \mul de cultivo de toda la noche en
10 ml de LB (3 cultivos) y se incubó a 37ºC durante 6 horas con
ventilación hasta que el cultivo alcanzó un diámetro exterior a 600
nm de 0,5. Se tomó una muestra para determinar el número de
bacterias viables. Se añadió a cada uno de los tres cultivos de 10
ml 100 \mul de trioxalen (forma de mutágenos químicos Sigma; 3
mg/ml en DMSO) y se vertió la suspensión en una placa petri de 10
cm \diameter. Se irradió la suspensión con U.V. (Transluminador
UVP; longitud de onda 365 nm) durante 5, 10, ó 15 minutos a una
distancia de 20 cm. Se transfirieron 10 \mul a 10 ml de NaCl al
0,9%, se realizaron diluciones 1/10 y se colocaron en placa 100
\mul sobre placas de agar sanguíneo con el fin de determinar el
índice de supervivencia de bacterias en cultivos mutagenizados. Se
desarrollaron cultivos con índices de supervivencia de
aproximadamente 3% y 20% en 100 mL LB hasta que se recogieron
bacterias de 0,5 de diámetro exterior a 600 nm por centrifugado, se
volvieron a suspender en 5 ml de LB y se almacenaron en glicerol al
30% a 70ºC.
Se inocularon las bacterias mutagenizadas (3% de
supervivencia; entre 5.000 y 10.000 mutantes independientes) desde
la reserva de glicerol en 3 placas de agar sanguíneo. Se recogieron
bacterias en LB y se ajustó el diámetro exterior a 600 nm a 2,17.
Se realizaron 6 diluciones de diez veces en LB y a continuación, se
añadieron 50 \mul de antisuero H2 (Difco) a una suspensión
bacteriana de 450 \mul. Se incluyó esta etapa de selección con
antisuero H con el fin de enriquecer la suspensión de mutantes para
bacterias sin flagelos. Se incubó esta suspensión a 37ºC durante 6
horas mientras se agitaba (250 rpm) y a continuación se centrifugó
durante 1 minuto a 1000 rpm en una mini centrífuga Eppendorf con el
fin de eliminar la aglutinación-complejo. A partir
del sobrenadante, se colocaron en placa 1, 10, y 100 \mul en
placas de agar sanguíneo y se incubaron 20 h a 27ºC.
La selección de bacterias no flageladas por
incubación con anticuerpo H2 tuvo como resultado el crecimiento de
aproximadamente 40 colonias sobre placas (dilución 10^{6})
inoculadas con suspensión de mutante tratado con suero (3% de
supervivencia), en cambio no creció ninguna colonia sobre placas
(10^{6} dilución) inoculadas con suspensión STMP tratada con
suero. Este resultado indicó que estaban presentes mutantes que no
se aglutinaron con el antisuero H2, que posiblemente no tenían
flagelos. Se sometieron a ensayo las 40 colonias para determinar la
aglutinación H2 y para determinar la movilidad utilizando un
microscopio óptico. Todos los mutantes resultaron negativos para la
aglutinación H2, pero solamente apareció un mutante no móvil tal
como se observó con el microscopio óptico. Este mutante no móvil
resultó positivo para la aglutinación de antígeno O de grupo B. Se
denominó al mutante STM2000.
Se sometió a ensayo la estabilidad fenotípica de
STM2000 por 12 pasos in vitro sobre placas de agar
sanguíneo. En el mismo experimento, se pasó la cepa progenitora,
STMP 12 veces. Se observó estos cultivos con un microscopio óptico
y todas las bacterias en el mutante-cultivo
resultaron aún no móviles. Las bacterias de STMP eran móviles, si
bien no todas las células presentaron el mismo nivel de movilidad.
La comparación con microscopio de electrones de STMP y STM2000
confirmó que no estaban presentes flagelos en las bacterias
mutantes.
En un experimento diferente se mutagenizó
químicamente S. typhimurium SL3261 (número de depósito SGSC
439, Salmonella Genetic Stock Centre, University of Calgary,
Alberta, Canadá) con NTG y se seleccionaron mutantes no móviles tal
como se ha descrito anteriormente. Uno de los mutantes, STM2001 no
mostró reacción con un anticuerpo monoclonal específico de
flagelina. Tras la electroforesis de gel de proteína 2D se demostró
que STM2001 carecía del punto de flagelina de 51 kDa y pI 4,7 en
comparación con su cepa progenitora.
Se sometió a ensayo la estabilidad genética
cultivando durante al menos 50 generaciones. Una vez transcurrido
este período, no se encontraron inversiones: todas las bacterias
seguían siendo no móviles.
La cepa STM2001 había sido depositada en el
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, PO box
273,3740 AG Baarn, Países Bajos, bajo el número de acceso CBS
108955.
Se prepararon vacunas a partir de la cepa tipo 4
de fago de S. enteritidis (S.e.) flagelada y no flagelada.
Se cultivaron las bacterias en caldo de cultivo de triptosa
fosfato, se inactivaron por adición de formalina a una
concentración final de 0,5% seguido de la recogida de las células
bacterianas por centrifugado. Se volvieron a suspender las células
en solución salina tamponada con fosfato y se formularon en agua
para formar vacunas de emulsión oleosa a 5 x 10^{9} bacterias
/ml. Se inyectaron por vía intramuscular cinco pollos con la vacuna
S.e fla^{+}y 5 pollos recibieron la vacuna S.e. fla^{-}. Se
vacunó a los animales con 0,5 ml de vacuna a los 14 y 18 semanas de
vida. A las 22 semanas de vida, se desangró a los pollos y se
sometió a ensayo el suero en un sistema ELISA de bloqueo de sándwich
de anticuerpo doble específico para anticuerpos para la flagelina
g,m de S.e (Zijderveld, F.G. van y cols. (1993) Vet. Quart.
15, 135-137).
Se obtuvieron pollos de tipo ponedor comerciales,
de aproximadamente 14 semanas de vida de un grupo sin
Salmonella.
Los 5 pollos que recibieron la vacuna S.e.
fla^{+} se seroconviertieron en el ensayo ELISA específico g,m
(porcentaje de bloqueo >60%) mientras que los 5 pollos
vacunados con la vacuna fla^{-} permanecieron seronegativos.
Experimento
1
Para valorar la seguridad, se inculó a pollos
tomateros por vía oral (1 ml), subcutánea (0,5) e intramuscular
(0,5 ml) cepa STMP de typhimurium de Salmonella
flagelo positiva, cepa STM2000 de typhimurium Salmonella
flagelo negativa o S. typhimurium de tipo salvaje
(Salmonella typhimurium). Se observó a los animales durante
una semana tras la inoculación seguido del examen
post-mortem de los pollos que sobrevivieron.
Se obtuvieron pollos de corral comerciales, de
tres semanas de vida obtenidos de un grupo que no tenía
Salmonella.
Después de la inoculación, 8 de cada 10 animales
que recibieron Salmonella typhimurium de tipo salvaje
murieron (tabla 1). En la necropsia, los 2 pollos que sobrevivieron
inoculados con la cepa de tipo salvaje tenían los hígados hinchados
con focos necróticos, bazos hinchados y edema pericárdico. Uno de
los pollos inoculados con STMP tenía un hígado ligeramente hinchado
y uno de los pollos a los que se le inoculó STM200 tenía un bazo
ligeramente hinchado. No se observó ninguna otra anormalidad en los
dos grupos.
| Grupo | STMP | STM2000 | Tipo salvaje |
| Dosis (CFU/ml) | 10^{8,0} | 10^{7,7} | 10^{8,0} |
| Mortalidad | 0/10^{a} | 0/10^{a} | 8/10^{b} |
| Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher). |
Experimento
2
Para ensayar tanto la seguridad como la eficacia,
se inocularon los pollos tomateros por vía oral a los 3 y 15 días de
vida tanto con STMP como STM2000 seguido de una infección de
estimulación con una cepa de Salmonella typhimurium de tipo
salvaje resistente a la tetraciclina a los 22 días de vida.
Se valoró la seguridad por observación clínica
tras la vacunación y determinación de la ganancia de peso. Asimismo,
se tomaron escobillones cloacales a los 10 y 22 días para determinar
la presencia de cepas de vacuna en el tracto intestinal. Se
utilizaron los escobillones para inocular Agares Verde Brillante
(BGA) directamente y tras el enriquecimiento en caldo de cultivo
Rappaport Vassiliades (RVB). Se observó a los animales durante una
semana tras la infección de estímulo seguido del examen
post-mortem de los pollos supervivientes. Se
cultivaron los hígados, bazos, escobillones cloacales y escobillones
del contenido del ciego de los pollos vacunados supervivientes para
determinar la cepa de estímulo por inoculación directa de
tetraciclina con contenido en BGA (BGAtet). Por otra parte, se
incubaron los escobillones en un medio de enriquecimiento (agua con
peptona tamponada que contenía tetraciclina) seguido de placa sobre
BGAtet.
Se obtuvieron pollos tomateros comerciales, de
tres días de vida de un grupo que no tenía Salmonella.
No se observaron anomalías clínicas después de
las vacunas orales a los 3 y 15 días de vida. Asimismo, las
ganancias de peso medio en los grupos vacunados no fueron diferentes
del grupo de control (tabla 3). Estuvieron presentes ambas cepas en
los escobillones cloacales de los animales vacunados tomados 7 días
después de la vacunación (Tabla 2). El hecho de que una mayor
proporción de los pollos en el grupo al que se inoculó STMP fue
positivo al cultivo tras la colocación en placa directa indica que
esta cepa coloniza el tracto intestinal en números más altos que la
cepa STM2000.
| Escobillones STMP positivos | Escobillones STM2000 positivos | |||
| Reaislamiento | Directo | Enriquecimiento | Directo | Enriquecimiento |
| Día 10 | 15/15^{a} | Sin realizar | 7/15^{b} | 14/15 |
| Día 22 | 1015^{a} | 15/15^{A} | 4/15^{a} | 14/15^{A} |
| Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher). |
Murió un pollo en el grupo STMP tras la infección
de estímulo (7%) en comparación con la ausencia de mortalidad en el
grupo STM2000 y el 80% de mortalidad en los controles sin vacunar
(Tabla 3). Los pollos supervivientes en el grupo de control también
ganaron mucho menos peso que los vacunados. La ganancia de peso del
grupo vacunado con STM2000 tras la infección de estimulación fue
significativamente más alta que la ganancia de peso del grupo
vacunado STMP.
| Grupo | STMP | STM2000 | Control |
| Dosis d3 | 10^{8,8} | 10^{8,5} | - |
| Dosis d15 | 10^{8,5} | 10^{8,5} | - |
| Ganancia peso d3-d22 | 636\pm98^{a} | 594\pm72^{a} | 624\pm82^{a} |
| Dosis estimulación S.t. d22 | 10^{8,0} | 10^{8,0} | 10^{8,0} |
| Ganancia peso d22-d29 | 299\pm45^{a} | 339\pm42^{b} | 31\pm39^{c} |
| Mortalidad | 1/15^{a} | 0/15^{a} | 8/10^{b} |
| Los grupos con diferentes superíndices en fila difieren (p<0,5, ensayo exacto de Fisher (mortalidad) o ensayo t | |||
| de dos muestras (ganancia de peso). |
Tal como se muestra en la tabla 4, no hubo
diferencia en los índices de reaislamiento del organismo de
estimulación entre el bazo y el hígado. La colonización del tracto
intestinal, tal como se valora por reaislamiento de los escobillones
cloacales y el contenido del ciego, fue significativamente más bajo
en el grupo vacunado con STM2000.
| Salmonella typhimurium(tet^{r}) positivo | ||||
| Grupo | Vacunado con STMP | Vacunado con STM2000 | ||
| Reaislamiento | Directo | Enriquecimiento | Directo | Enriquecimiento |
| Bazo | 2/14^{a} | Sin realizar | 1/14^{a} | Sin realizar |
| Hígado | 1/14^{a} | Sin realizar | 0/15^{a} | Sin realizar |
| Cloaca | 7/14^{a} | 14/14^{A} | 3/15^{a} | 7/15^{B} |
| Ciego | 13/14^{a} | 14/14^{A} | 5/15^{b} | 9/15^{B} |
| Grupos con diferentes superíndices en una fila diferente (p<0,5 ensayo exacto de Fisher). |
Para ensayar la eficacia, se inoculó a cerdos por
vía oral STMP (10^{0,9} CFU) o STM2000 (10^{9,3} CFU) seguido
de una infección de estímulo oral con una cepa de Salmonella
typhimurium de tipo salvaje resistente a estreptomicina
(10^{11,0} CFU) 2 semanas después.
Se midió el desprendimiento de la cepa de
estímulo cultivando muestras fecales en los días 5 y 8 tras la
estimulación. Se colocaron en placa aproximadamente 5 gramos de
heces en agua con peptona y se incubaron durante 2 horas. A
continuación, se realizaron diluciones de diez veces en serie en
medio RVB que contenía estreptomicina, se incubó durante toda la
noche y se colocó en placa sobre Caldo de cultivo de triptosa
fosfato que contenía estreptomicina. Se utilizó la dilución máxima
que contenía la cepa de estímulo para calcular la puntuación de
reaislamiento (recíproco de la dilución positiva máxima).
Se utilizaron ocho cerdos vacunados con STMP y 8
controles sin vacunar en un primer experimento. En un segundo
experimento se utilizaron 9 cerdos vacunados con STM2000 y 9
controles sin vacunar.
Se utilizaron cerdos SPF de seis semanas de vida
en ambos experimentos.
Tal como se muestra en la tabla 5, ambas cepas de
vacuna fueron capaces de reducir el desprendimiento fecal de la
cepa de estímulo significativamente.
| Puntuación de reaislamiento media | ||
| Día 5 | Día 8 | |
| STMP (n=8) | 10^{0,9a} | 10^{10a} |
| Control (n=8) | 10^{6,4a} | 10^{3,8b} |
| STM2000 (n=9) | 10^{1,0A} | 10^{1,3A} |
| Control (n=9) | 10^{5,0B} | 10^{4,9B} |
| Grupos con diferentes superíndices difieren (p<0,5 ensayo U Mann-Whitney). |
Figura 1: análisis de perfil de proteína de
STM2000 y su cepa parenteral S. typhimurium STMP. línea 1, 11
y 12 marcadores de peso molecular tal como se indica; línea 2, 5 y
8, S. typhimurium STMP 12x pasado sobre medio de agar
sanguíneo; líneas 3,6 y 9, STM2000 12 x pasado sobre medio de agar
sanguíneo; líneas 4, 7 y 10, STM2000 2 x pasado sobre medio de agar
sanguíneo. Líneas 2, 3 y 4, perfil de proteína total; líneas 5, 6 y
7, pelet tras la sonicación y el centrifugado; líneas 8, 9 y 10,
sobrenadante tras la sonicación y el centrifugado. Se mancharon
proteínas con Azul Brillante de Coomassie.
Figura 2: Fotografías del examen por microscopio
electrónico de S. typhimurium STMP (A) y su mutante no móvil
STM2000 (B).
Claims (9)
1. Uso de una bacteria del género
Salmonella que en su forma salvaje lleva flagelos, no siendo
capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos un
determinante antigénico de flagelina o flagelos, y un adyuvante para
la fabricación de una vacuna inactivada para la protección de seres
humanos o animales contra infección por bacteria Salmonella
o los efectos patógenos de la infección.
2. Uso de una bacteria del género
Salmonella que en su forma tipo salvaje lleva flagelos, no
siendo capaz dicha bacteria de inducir anticuerpos contra al menos
un determinante antigénico de flagelina o flagela, para la
fabricación de una vacuna atenuada viva para la protección de seres
humanos o animales contra la infección con una bacteria
Salmonella o los efectos patógenos de la infección.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que
dicha bacteria no es capaz de inducir anticuerpos contra al menos un
determinante antigénico de flagelina o flagelos debido a una
mutación en un gen o la ruta de biogénesis flagelar.
4. Uso según la reivindicación 3, en la que dicha
mutación está localizada en el gen flagelina.
5. Uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el
que dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en S.
typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi,
abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi
A y B, derby, hadar, heidelberg, agona y arizonae.
6. Uso según la reivindicación
1-5 en la que dicha bacteria lleva además un gen
heterólogo, insertándose dicho gen heterólogo preferiblemente en el
gen flagelina.
7. Vacuna para la protección de animales contra
salmonelosis, caracterizada porque la vacuna comprende
bacteria inactivada tal como se ha descrito en las
reivindicaciones 1 ó 3-5, un adyuvante y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Vacuna para la protección de animales contra
salmonelosis, caracterizada porque la vacuna comprende
bacterias atenuadas vivas tal como se ha descrito en las
reivindicaciones 2-5 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
9. Vacuna según la reivindicación 7 u 8,
caracterizado porque está en forma liofilizada o deshidratada
por aspersión.
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