JP2002521345A - 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン - Google Patents
鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
鳥類病原性グラム陰性微生物による感染に対して、鳥類を保護するためのワクチンを開示する。そのワクチンは鳥類には病原性である大腸菌菌株のような鳥類病原性グラム陰性微生物のＯ‐抗原を発現する組換えサルモネラ菌株である。また、組換えサルモネラ菌株はサルモネラＯ‐抗原を発現しない。鳥類を免疫化させるワクチンの使用方法も開示する。
Description
【０００１】 発明の背景 本発明は、飼鳥類及び他の鳥類のワクチンに係り、より詳細には鳥類病原体の
グラム陰性バクテリアによる感染に対する飼鳥類及び他の鳥類を保護するワクチ
ンに関する。
グラム陰性バクテリアによる感染に対する飼鳥類及び他の鳥類を保護するワクチ
ンに関する。
【０００２】 関連技術の説明 鳥類病原体である大腸菌（以下、「ＡＰＥＣ」という）菌株は、飼鳥類及び他
の鳥類に、エアサッカリティス（air sacculitis）、蟻巣炎、コリバシロリス（
colibacillosis）、コリグラヌローマ（coligranuloma）、コリセプチセミア（c
olisepticemia）、ヒエレ病、さい炎、腹膜炎、耳管炎、滑膜炎を含む数多くの
関連病気を引き起こす（Gross, W. B. in Diseases of Poultry, Clalnek他、編
集Iowa State University Press, p.138-144,1991; Messier他、Avian Duseases
37:839-844,1993）。グラム陰性鳥類病原体により発症する上記病気と他の病気
により、飼料要求が増大し、死体、または動物が死に至り、毎年何百万ドルの損
失を被る（Norton, R. A. Broiler Industry, Feb. 1998, pp.28-32）。
の鳥類に、エアサッカリティス（air sacculitis）、蟻巣炎、コリバシロリス（
colibacillosis）、コリグラヌローマ（coligranuloma）、コリセプチセミア（c
olisepticemia）、ヒエレ病、さい炎、腹膜炎、耳管炎、滑膜炎を含む数多くの
関連病気を引き起こす（Gross, W. B. in Diseases of Poultry, Clalnek他、編
集Iowa State University Press, p.138-144,1991; Messier他、Avian Duseases
37:839-844,1993）。グラム陰性鳥類病原体により発症する上記病気と他の病気
により、飼料要求が増大し、死体、または動物が死に至り、毎年何百万ドルの損
失を被る（Norton, R. A. Broiler Industry, Feb. 1998, pp.28-32）。
【０００３】 サルモネラによる飼鳥類産出物の汚染は、ヒトにおけるサルモネラ感染の重要
な源であり、胃腸炎を引き起こし、公共の重大な関心事である。ｃｙａ遺伝子及
びｃｙｐ遺伝子における欠失を弱毒化したＳ．タイフィムリウム（typhimurium
）菌株からの生きた細胞の経口投与により、チキンにおいて野性型サルモネラ攻
撃に対する優れた保護を与えることが判明し（Hassan他、Res: Microbiol. 141:
839-850, 1990; Hassan他、Infec.Immun. 62: 5519-5527, 1994）、かかる菌株
における異種抗原の安定な発現システムが開発された（Hone他、Microb. Pathog
. 5:407-418, 1998; Strugnell他、Gene 88: 57-63, 1990; Galan他、Gene 94:2
9-35; 1990; Nakayama他、Bio/Technology 6:693-696, 1995）。
な源であり、胃腸炎を引き起こし、公共の重大な関心事である。ｃｙａ遺伝子及
びｃｙｐ遺伝子における欠失を弱毒化したＳ．タイフィムリウム（typhimurium
）菌株からの生きた細胞の経口投与により、チキンにおいて野性型サルモネラ攻
撃に対する優れた保護を与えることが判明し（Hassan他、Res: Microbiol. 141:
839-850, 1990; Hassan他、Infec.Immun. 62: 5519-5527, 1994）、かかる菌株
における異種抗原の安定な発現システムが開発された（Hone他、Microb. Pathog
. 5:407-418, 1998; Strugnell他、Gene 88: 57-63, 1990; Galan他、Gene 94:2
9-35; 1990; Nakayama他、Bio/Technology 6:693-696, 1995）。
【０００４】 ＡＰＥＣ菌株は数種のセロタイプである、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３５及びＯ７８のみ
により、主に表わされるのに対し（Cloud他、Avian Dis. 29: 1084-1093, 1985,
Glantz他、Avian Dis. 6: 322-328, 1962; Gross、前掲）、飼鳥類に広く支配
しているサルモネラセロタイプは、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」と
いう）分子の外部成分としてバクテリア外部膜に固定した重合同一の糖ユニット
の長さが異なるものから通常なるＯ‐特異鎖又はＯ‐ポリサッカロイド（以下、
「Ｏ‐ＰＳ」という）と呼ばれるいわゆるＯ‐抗原構造により、分子レベルで決
定される（Helander他、in Molecular Biology and Biochemistry: Acomprehens
ive Desk Reference, R. A. Meyers編集、ＶＣＨPublishers, Inc., 1995）。
により、主に表わされるのに対し（Cloud他、Avian Dis. 29: 1084-1093, 1985,
Glantz他、Avian Dis. 6: 322-328, 1962; Gross、前掲）、飼鳥類に広く支配
しているサルモネラセロタイプは、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」と
いう）分子の外部成分としてバクテリア外部膜に固定した重合同一の糖ユニット
の長さが異なるものから通常なるＯ‐特異鎖又はＯ‐ポリサッカロイド（以下、
「Ｏ‐ＰＳ」という）と呼ばれるいわゆるＯ‐抗原構造により、分子レベルで決
定される（Helander他、in Molecular Biology and Biochemistry: Acomprehens
ive Desk Reference, R. A. Meyers編集、ＶＣＨPublishers, Inc., 1995）。
【０００５】 ＬＰＳ Ｏ−抗原に対する特異な抗体は、ヒトの腸外の大腸菌感染の哺乳類モ
デルでは保護的であることが分かり（Cryz他、Vaccine 13: 449-453, 1995; Plu
schke他、Infect. Immun. 49:365-370, 1985）、Ｏ−抗原は他のグラム陰性病原
対の保護高原として認識された（Ding他、J. Med. Microb. 31:95-102, 1990; M
icheti他、Infect. Immun. 60：1786-1792, 1992; Bobbins他、Clin. Infect Di
s. 15: 346-361, 1992）。加えて、数多の研究者グループは、シゲラソンネイ（
Shigella sonnei）、ビブリオコレラエ（Vibrio Cholerae）及びシュードモナス
アエルギノサ（Psudomonas aeruginosa）を含む数多のヒト抗原のＯ‐抗原のワ
クチン運搬ビヒクルとして、弱毒化サルモネラ及びサルモネラ大腸菌ハイブリッ
ドを利用していることを報告した（Black他、J. Infect. Dis. 155:1260-1265,
1987；Formal他、Infect. Immun. 34:746-750, 1981; Pier他、infect. Immun.
63:2818-2825, 1995; Morona他、米国特許代５，１１０、５８８号）。しかしな
がら、本願でその研究が説明されるまで、ＡＰＥＣ Ｏ‐抗原を発現する生きた
弱毒化サルモネラは報告されていない。
デルでは保護的であることが分かり（Cryz他、Vaccine 13: 449-453, 1995; Plu
schke他、Infect. Immun. 49:365-370, 1985）、Ｏ−抗原は他のグラム陰性病原
対の保護高原として認識された（Ding他、J. Med. Microb. 31:95-102, 1990; M
icheti他、Infect. Immun. 60：1786-1792, 1992; Bobbins他、Clin. Infect Di
s. 15: 346-361, 1992）。加えて、数多の研究者グループは、シゲラソンネイ（
Shigella sonnei）、ビブリオコレラエ（Vibrio Cholerae）及びシュードモナス
アエルギノサ（Psudomonas aeruginosa）を含む数多のヒト抗原のＯ‐抗原のワ
クチン運搬ビヒクルとして、弱毒化サルモネラ及びサルモネラ大腸菌ハイブリッ
ドを利用していることを報告した（Black他、J. Infect. Dis. 155:1260-1265,
1987；Formal他、Infect. Immun. 34:746-750, 1981; Pier他、infect. Immun.
63:2818-2825, 1995; Morona他、米国特許代５，１１０、５８８号）。しかしな
がら、本願でその研究が説明されるまで、ＡＰＥＣ Ｏ‐抗原を発現する生きた
弱毒化サルモネラは報告されていない。
【０００６】 大腸菌及びサルモネラバクテリアにより作出されたＬＰＳ Ｏ‐抗原は、次の
順番に共有結合で結合した、リピドＡと、Ｒ‐コアオリゴサッカライドと、Ｏ‐
特異ポリサッカライド（Ｏ−ＰＳ）とからなる（Sugiyama他、J. Bacteriol. 17
3: 55-58,1991）。Ｓ．タイフィムリウムでは、Ｒ‐コア部分の合成はｒｆａ遺
伝子座やｇａＩＵやｐｇｉのような特定のハウスキーピング遺伝子により誘導さ
れ、一方、Ｏ‐ＰＳ合成はｒｆｂ遺伝子クラスターにより誘導され、そのクラス
ターは単量体糖ユニットの生合成に関係する酵素をコードし、ｒｆｃ遺伝子は、
高分子量のポリサッカライド鎖への糖ユニットの重合の原因となるＯ‐抗原ポリ
マーをコードする（Sugiyama他、前掲）。
順番に共有結合で結合した、リピドＡと、Ｒ‐コアオリゴサッカライドと、Ｏ‐
特異ポリサッカライド（Ｏ−ＰＳ）とからなる（Sugiyama他、J. Bacteriol. 17
3: 55-58,1991）。Ｓ．タイフィムリウムでは、Ｒ‐コア部分の合成はｒｆａ遺
伝子座やｇａＩＵやｐｇｉのような特定のハウスキーピング遺伝子により誘導さ
れ、一方、Ｏ‐ＰＳ合成はｒｆｂ遺伝子クラスターにより誘導され、そのクラス
ターは単量体糖ユニットの生合成に関係する酵素をコードし、ｒｆｃ遺伝子は、
高分子量のポリサッカライド鎖への糖ユニットの重合の原因となるＯ‐抗原ポリ
マーをコードする（Sugiyama他、前掲）。
【０００７】 大腸菌Ｏ９のＬＰＳ Ｏ‐抗原の合成に必要な遺伝子を研究している一のグル
ープは、大腸菌Ｏ９からＳ．タイフィリムリム野性型へのｒｆｂ遺伝子座を含有
するプラスミドを導入し、突然変異菌株はｒｆｂ、ｒｆｃまたはｒｆｅ遺伝子座
にて欠失し、その野性型菌株は細胞表面の大腸菌Ｏ９及びＳ．タイフィムリムの
双方に特異であるプラスミド発現ＬＰＳを含有すると報告し、一方で、ｒｆｃ突
然変異はＯ９‐特異ＬＰＳのみ発現させる。また、大腸菌Ｏ‐抗原はＳ．タイフ
ィムリウムｒｆｂ突然変異にて合成されるが、ｒｆｅ突然変異では合成されない
（Sugiyama他、前掲）。本グループは、Ｓ．タイフィムリウムｒｆａ及び大腸菌
Ｏ９ｒｆｂ遺伝子座の遺伝子産出物は、Ｓ．タイフィムリウムのＲ−コアに大腸
菌Ｏ９−抗原を合成するように協働する。しかしながら、本グループは、上記の
組換えＳ．タイフィムリウ構築体のいずれもが動物宿主内で成長しない、または
野性型大腸菌Ｏ９又はＳ．タイフィムリウムに対する保護的宿主免疫応答が生じ
るなどを報告していない。したがって、飼鳥類のサルモネラ及び大腸菌感染を制
御するために、二価ワクチンが必要とされている。かかるワクチン同時に公共の
福祉、健康の利益を得、飼鳥類産出のコスト低減をもたらす。
ープは、大腸菌Ｏ９からＳ．タイフィリムリム野性型へのｒｆｂ遺伝子座を含有
するプラスミドを導入し、突然変異菌株はｒｆｂ、ｒｆｃまたはｒｆｅ遺伝子座
にて欠失し、その野性型菌株は細胞表面の大腸菌Ｏ９及びＳ．タイフィムリムの
双方に特異であるプラスミド発現ＬＰＳを含有すると報告し、一方で、ｒｆｃ突
然変異はＯ９‐特異ＬＰＳのみ発現させる。また、大腸菌Ｏ‐抗原はＳ．タイフ
ィムリウムｒｆｂ突然変異にて合成されるが、ｒｆｅ突然変異では合成されない
（Sugiyama他、前掲）。本グループは、Ｓ．タイフィムリウムｒｆａ及び大腸菌
Ｏ９ｒｆｂ遺伝子座の遺伝子産出物は、Ｓ．タイフィムリウムのＲ−コアに大腸
菌Ｏ９−抗原を合成するように協働する。しかしながら、本グループは、上記の
組換えＳ．タイフィムリウ構築体のいずれもが動物宿主内で成長しない、または
野性型大腸菌Ｏ９又はＳ．タイフィムリウムに対する保護的宿主免疫応答が生じ
るなどを報告していない。したがって、飼鳥類のサルモネラ及び大腸菌感染を制
御するために、二価ワクチンが必要とされている。かかるワクチン同時に公共の
福祉、健康の利益を得、飼鳥類産出のコスト低減をもたらす。
【０００８】 発明の要約 一の実施態様では、本発明は鳥類病原体グラム陰性（ＡＰＧ−Ｎ）微生物によ
り感染に対する鳥類を保護するワクチンに関する。そのワクチンは、ＡＰＧ−Ｎ （以後、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターにて相互交換であるように
利用する）ｒｆｃ遺伝子とｒｆｂ遺伝子クラスターのサルモネラ染色体への組込
みに起因するＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原発現する組換えサルモネラ菌株の生き
た細胞を含む。ビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異である組換えサルモ
ネラ菌株は、サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺
伝子の突然変異に起因するビルレントサルモネラ菌株のＯ‐抗原を発現しない。
好適な実施例では、ＡＰＧ−Ｎ微生物はＡＰＥＣ菌株であり、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ
/ｒｆｃ遺伝子クラスターはＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターである。
り感染に対する鳥類を保護するワクチンに関する。そのワクチンは、ＡＰＧ−Ｎ （以後、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターにて相互交換であるように
利用する）ｒｆｃ遺伝子とｒｆｂ遺伝子クラスターのサルモネラ染色体への組込
みに起因するＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原発現する組換えサルモネラ菌株の生き
た細胞を含む。ビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異である組換えサルモ
ネラ菌株は、サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺
伝子の突然変異に起因するビルレントサルモネラ菌株のＯ‐抗原を発現しない。
好適な実施例では、ＡＰＧ−Ｎ微生物はＡＰＥＣ菌株であり、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ
/ｒｆｃ遺伝子クラスターはＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターである。
【０００９】 この組換えサルモネラ菌株は、飼鳥類及び他の鳥類のワクチンとして特に有用
にする他の特徴を有する。第一に、ワクチンは経口投与用に配合され、経口ワク
チンは、粘膜、体液及び細胞免疫応答を含むリンパ系組織と関連した腸（ＧＡＬ
Ｔ）を刺激することが公知である。また、経口で、生きたワクチンは製造コスト
があまりかからず、注射可能なワクチンよりもフィールドにて投与し易い。第二
に、担体菌株に特異なＬＰＳ Ｏ‐抗原の発現の欠如は、担体ＬＰＳ Ｏ−抗原
がＡＰＧ−ＮＯ‐抗原を発現し、ワクチンレシピエント免疫システムにより認識
される干渉が回避される。第三に、組換えサルモネラ菌株はＡＰＧ−Ｎ微生物と
、親サルモネラ菌株の双方び対して保護する。なぜなら、組換えサルモネラ菌株
は親サルモネラ菌株の他の細胞表面抗原を発現するからである。加えて、ＡＰＥ
Ｃ菌株からのＯ−抗原を発現するワクチンでは、担体バクテリアとして、大腸菌
よりもサルモネラを利用することにより、ＡＰＥＣ Ｏ−抗原に対する激し位目
ね器応答をもたらす。なぜなら、Ｓ．エンテリカサブ種は脾臓に存続するのに対
し、ファブリキウス嚢、大腸菌は上記リンパ系組織を有効に攻撃せず、たとえた
まにうまく進入しても、直ぐに殺される。
にする他の特徴を有する。第一に、ワクチンは経口投与用に配合され、経口ワク
チンは、粘膜、体液及び細胞免疫応答を含むリンパ系組織と関連した腸（ＧＡＬ
Ｔ）を刺激することが公知である。また、経口で、生きたワクチンは製造コスト
があまりかからず、注射可能なワクチンよりもフィールドにて投与し易い。第二
に、担体菌株に特異なＬＰＳ Ｏ‐抗原の発現の欠如は、担体ＬＰＳ Ｏ−抗原
がＡＰＧ−ＮＯ‐抗原を発現し、ワクチンレシピエント免疫システムにより認識
される干渉が回避される。第三に、組換えサルモネラ菌株はＡＰＧ−Ｎ微生物と
、親サルモネラ菌株の双方び対して保護する。なぜなら、組換えサルモネラ菌株
は親サルモネラ菌株の他の細胞表面抗原を発現するからである。加えて、ＡＰＥ
Ｃ菌株からのＯ−抗原を発現するワクチンでは、担体バクテリアとして、大腸菌
よりもサルモネラを利用することにより、ＡＰＥＣ Ｏ−抗原に対する激し位目
ね器応答をもたらす。なぜなら、Ｓ．エンテリカサブ種は脾臓に存続するのに対
し、ファブリキウス嚢、大腸菌は上記リンパ系組織を有効に攻撃せず、たとえた
まにうまく進入しても、直ぐに殺される。
【００１０】 ある実施例では、ワクチンにて利用した組換えサルモネラ菌株は、所望の遺伝
子産出物をコードする組換えヌクレオチドを含む。好適な遺伝子産出物は、鳥類
病原体グラム陽性（ＡＰＧ-Ｐ）微生物から、又は真核生物の鳥類病原体からの
抗原である。
子産出物をコードする組換えヌクレオチドを含む。好適な遺伝子産出物は、鳥類
病原体グラム陽性（ＡＰＧ-Ｐ）微生物から、又は真核生物の鳥類病原体からの
抗原である。
【００１１】 別の実施例では、発明は各ＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現する組換えサル
モネラ菌株の生きた細胞を含む少なくとも二つの鳥類グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）
に対して鳥類を免疫化させる多価ワクチンであって、その組換えサルモネラ菌株
はサルモネラ染色体へ組込まれたそれぞれのＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ
遺伝子クラスターと、サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター又はサルモネラＯ−抗
原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子にて突然変異とを有し、その
組換えサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体である多
価ワクチンを提供する。好適な実施例では、ＡＰＧ−Ｎ微生物の一つ又は二つの
微生物はＡＰＥＣ菌株である。
モネラ菌株の生きた細胞を含む少なくとも二つの鳥類グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）
に対して鳥類を免疫化させる多価ワクチンであって、その組換えサルモネラ菌株
はサルモネラ染色体へ組込まれたそれぞれのＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ
遺伝子クラスターと、サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター又はサルモネラＯ−抗
原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子にて突然変異とを有し、その
組換えサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体である多
価ワクチンを提供する。好適な実施例では、ＡＰＧ−Ｎ微生物の一つ又は二つの
微生物はＡＰＥＣ菌株である。
【００１２】 さらに別の実施例では、本発明は、第一の、及び第二の組換えサルモネラ菌株
の生きた細胞の混合物を含む少なくとも二つのＡＰＧ−Ｎ微生物に対して鳥類を
免疫化する多価ワクチンを提供し、その第一の組換えサルモネラ菌株はサルモネ
ラ染色体へ組込まれた第一のＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスタ
ーを有し、第一のＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、第二の組換えサルモネ
ラ菌株はサルモネラ染色体へ組込まれた第二のＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆ
ｃ遺伝子クラスターを有し、第二のＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、それ
ぞれの第一の及び第二の組換えサルモネラ菌株はサルモネラｒｆｂ遺伝子クラス
ター又はサルモネラＯ−抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に
突然変異を有し、それぞれの第一の及び第二の組換えサルモネラ菌株はビルレン
トサルモネラ菌株の弱毒化突然変異である。好適な実施例では、多価ワクチンの
一つまたは二つの組替えサルモネラ菌株は、ＡＰＥＣ菌株のＯ−抗原を発現する
。
の生きた細胞の混合物を含む少なくとも二つのＡＰＧ−Ｎ微生物に対して鳥類を
免疫化する多価ワクチンを提供し、その第一の組換えサルモネラ菌株はサルモネ
ラ染色体へ組込まれた第一のＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスタ
ーを有し、第一のＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、第二の組換えサルモネ
ラ菌株はサルモネラ染色体へ組込まれた第二のＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆ
ｃ遺伝子クラスターを有し、第二のＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、それ
ぞれの第一の及び第二の組換えサルモネラ菌株はサルモネラｒｆｂ遺伝子クラス
ター又はサルモネラＯ−抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に
突然変異を有し、それぞれの第一の及び第二の組換えサルモネラ菌株はビルレン
トサルモネラ菌株の弱毒化突然変異である。好適な実施例では、多価ワクチンの
一つまたは二つの組替えサルモネラ菌株は、ＡＰＥＣ菌株のＯ−抗原を発現する
。
【００１３】 他の実施例における本発明は、ＡＰＧ−Ｎ微生物による感染に対する鳥類を免
疫化させる免疫方法に係る。上記方法は、ＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し
、サルモネラ染色体へ安定に組込まれたＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝
子クラスタを有し、サルモネラｒｄｂ遺伝子クラスター、又はサルモネラＯ‐抗
原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサ
ルモネラ菌株の生きた細胞を含むワクチンの免疫学的に有効量を投与する工程を
含む、ＡＰＧ−Ｎ微生物対して鳥類を免疫化させる方法を包含し、その組換えサ
ルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体である。また、そ
の方法は、一つ以上のＡＰＧ−Ｎ微生物に対して鳥類を同時に免疫化させる方法
であって、前記した多価ワクチンの免疫学的に有効量を投与することを含む。さ
らに、ＡＰＧ−Ｎ微生物と担体サルモネラ種に対して鳥類を同時に免疫化させる
方法であって、前記したワクチンのいずれかの免疫学的に有効量を鳥類へ投与す
ることを含む。
疫化させる免疫方法に係る。上記方法は、ＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し
、サルモネラ染色体へ安定に組込まれたＡＰＧ−Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝
子クラスタを有し、サルモネラｒｄｂ遺伝子クラスター、又はサルモネラＯ‐抗
原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサ
ルモネラ菌株の生きた細胞を含むワクチンの免疫学的に有効量を投与する工程を
含む、ＡＰＧ−Ｎ微生物対して鳥類を免疫化させる方法を包含し、その組換えサ
ルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体である。また、そ
の方法は、一つ以上のＡＰＧ−Ｎ微生物に対して鳥類を同時に免疫化させる方法
であって、前記した多価ワクチンの免疫学的に有効量を投与することを含む。さ
らに、ＡＰＧ−Ｎ微生物と担体サルモネラ種に対して鳥類を同時に免疫化させる
方法であって、前記したワクチンのいずれかの免疫学的に有効量を鳥類へ投与す
ることを含む。
【００１４】 さらに別の実施例では、発明は、ＡＰＧ−Ｎ微生物菌株に対する鳥類を免疫化
させるワクチンの製造方法を提供する。その方法は、鳥類のコロニー化が可能で
あるサルモネラ菌株を選択する選択工程と、サルモネラ染色体へＡＰＧ−Ｎ微生
物からのｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを組込む組込工程と、サルモネラｒｆ
ｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺伝子へ突然変異を導入する導
入工程と、ＡＰＧ−Ｎ微生物の特徴であるＯ−抗原を発現するが、サルモネラＯ
−抗原を発現しない組換えサルモネラバクテリアを単離する単離工程とを含む。
一の実施例では、選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒
化突然変異体である。別の実施例では、選択されたサルモネラ菌株はビルレント
サルモネラ菌株であり、さらに、その方法はビルレントサルモネラ菌株へ導入す
る導入工程と、サルモネラビルレント遺伝子へ突然変異を弱毒化させる弱毒化工
程と、ビルレントサルモネラ菌株と比較して弱毒化ビルレントを有する突然変異
体を単離する単離工程とを含む。
させるワクチンの製造方法を提供する。その方法は、鳥類のコロニー化が可能で
あるサルモネラ菌株を選択する選択工程と、サルモネラ染色体へＡＰＧ−Ｎ微生
物からのｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを組込む組込工程と、サルモネラｒｆ
ｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺伝子へ突然変異を導入する導
入工程と、ＡＰＧ−Ｎ微生物の特徴であるＯ−抗原を発現するが、サルモネラＯ
−抗原を発現しない組換えサルモネラバクテリアを単離する単離工程とを含む。
一の実施例では、選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒
化突然変異体である。別の実施例では、選択されたサルモネラ菌株はビルレント
サルモネラ菌株であり、さらに、その方法はビルレントサルモネラ菌株へ導入す
る導入工程と、サルモネラビルレント遺伝子へ突然変異を弱毒化させる弱毒化工
程と、ビルレントサルモネラ菌株と比較して弱毒化ビルレントを有する突然変異
体を単離する単離工程とを含む。
【００１５】 したがって、本発明により達成される数多の効果には、ＡＰＥＣ菌株及び他の
ＡＰＧ−Ｎ微生物による感染に対して鳥類及び特に飼鳥類を保護することができ
る生きた組換えサルモネラワクチンとかかるワクチンの製造方法の提供、２以上
のＡＰＧ−Ｎ微生物による感染に対して同時に鳥類を保護するのに有用な多価ワ
クチンの提供、ＡＰＥＣ菌株及び他のＡＰＧ−Ｎ微生物に対する鳥類の免疫化方
法の提供、ＡＰＥＣ及びサルモネラバクテリア双方に対する鳥類の免疫化方法の
提供がある。
ＡＰＧ−Ｎ微生物による感染に対して鳥類及び特に飼鳥類を保護することができ
る生きた組換えサルモネラワクチンとかかるワクチンの製造方法の提供、２以上
のＡＰＧ−Ｎ微生物による感染に対して同時に鳥類を保護するのに有用な多価ワ
クチンの提供、ＡＰＥＣ菌株及び他のＡＰＧ−Ｎ微生物に対する鳥類の免疫化方
法の提供、ＡＰＥＣ及びサルモネラバクテリア双方に対する鳥類の免疫化方法の
提供がある。
【００１６】 発明の詳細な説明 本発明は、サルモネラエンテリカサブ種、特に、Ｓ．タイフィムリウムが遺伝
子工学的に操作され、インビボ成長を又はサルモネラ担体により鳥類ＧＡＬＴの
コロニー化を干渉する発現のない細胞表面での免疫原性の形態で、ＡＰＧ−Ｎ微
生物、特にＯ７８及びＯ１ ＡＰＥＣ菌株のＯ抗原を発現するという発見を基礎
とする。加えて、本願の発明者らは、かかる組換えサルモネラ菌株のチキンへの
経口投与により、ワクチン接種させたチキンの病気を引き起こし感染させる、ビ
ルレントＡＰＥＣ菌株の能力を顕著に低下させることを発見した。
子工学的に操作され、インビボ成長を又はサルモネラ担体により鳥類ＧＡＬＴの
コロニー化を干渉する発現のない細胞表面での免疫原性の形態で、ＡＰＧ−Ｎ微
生物、特にＯ７８及びＯ１ ＡＰＥＣ菌株のＯ抗原を発現するという発見を基礎
とする。加えて、本願の発明者らは、かかる組換えサルモネラ菌株のチキンへの
経口投与により、ワクチン接種させたチキンの病気を引き起こし感染させる、ビ
ルレントＡＰＥＣ菌株の能力を顕著に低下させることを発見した。
【００１７】 よって、本発明の一の態様は、鳥類病原性グラム陰性微生物（ＡＰＧ−Ｎ）に
対して鳥類の免疫化させ、ＡＰＧ−Ｎ菌株のＯ‐抗原を発現する組換えサルモネ
ラ菌株の生きた細胞を含むワクチンである。ＡＰＧ−ＮＯ‐抗原は免疫原性の形
態で発現され、そのＡＰＧ−Ｎ抗原部分は完全なＬＰＳ Ｏ‐抗原分子の一部で
あり、ＡＰＧ−ＮＯ‐抗原はＬＰＳコア部分に付着しており、鳥類に投与すると
、野性型ＡＰＧ−Ｎ微生物のＬＰＳ Ｏ‐抗原と反応する抗体が生じる。通常、
ＬＰＳコア部分は組換えサルモネラ担体により合成されるが、ある実施例では、
ＬＰＳコアはＯ‐抗原と同じＡＰＧ−Ｎ微生物から、又は異なるＡＰＧ−Ｎ微生
物から由来する。
対して鳥類の免疫化させ、ＡＰＧ−Ｎ菌株のＯ‐抗原を発現する組換えサルモネ
ラ菌株の生きた細胞を含むワクチンである。ＡＰＧ−ＮＯ‐抗原は免疫原性の形
態で発現され、そのＡＰＧ−Ｎ抗原部分は完全なＬＰＳ Ｏ‐抗原分子の一部で
あり、ＡＰＧ−ＮＯ‐抗原はＬＰＳコア部分に付着しており、鳥類に投与すると
、野性型ＡＰＧ−Ｎ微生物のＬＰＳ Ｏ‐抗原と反応する抗体が生じる。通常、
ＬＰＳコア部分は組換えサルモネラ担体により合成されるが、ある実施例では、
ＬＰＳコアはＯ‐抗原と同じＡＰＧ−Ｎ微生物から、又は異なるＡＰＧ−Ｎ微生
物から由来する。
【００１８】 ワクチンは、現在公知ＡＰＧ−Ｎ微生物と、後に鳥類の病原体であると分かっ
た微生物に対して、すべてのタイプの鳥類を免疫化させるために利用でき、その
鳥類には、チキン、七面鳥、あひる、がちょう、きじ及び飼鳥類として分類され
る他の飼育鳥類、並びに野生の七面鳥及びおうむ、インコ等のような外来種が含
まれることを考える。かかるＡＰＧ−Ｎ微生物には、以下のものに限定されない
が、（１）大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、
Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、Ｏ７８、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ９５Ｏ１０３、及びＯ１
０９のようなＡＰＥＣ菌株と、（２）鳥類病原性サルモネラ菌株、例えば、グル
ープＣ及びグループＤ菌株と、（３）以下の属：カムピロバクター（Campylobac
ter）、バクテリオデス（Bacteroides）、ボルデテラ（Bordetella）、ハエモフ
ィルス（Haemophilus)、パスチューレア（Pasteurella）、フランシセラ（Franc
isella）、アクチノバチルス（Actinobacillus）、クレビセラ（Klebisella）、
モラセラ（Moraxella）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウス（Proteu
s）及びオルニソバクテリウム（Ornithobacterium）がある。組換えサルモネラ
菌株はＡＰＥＣ菌株のＯ‐抗原を発現することが好ましい。より好ましくは、Ａ
ＰＥＣ Ｏ−抗原はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５またはＯ７８セロタイプに特徴的であり
、さらに好ましくはＯ−抗原はＯ１ ＬＰＳ、Ｏ２ ＬＰＳ又はＯ７８ ＬＰＳで
ある。
た微生物に対して、すべてのタイプの鳥類を免疫化させるために利用でき、その
鳥類には、チキン、七面鳥、あひる、がちょう、きじ及び飼鳥類として分類され
る他の飼育鳥類、並びに野生の七面鳥及びおうむ、インコ等のような外来種が含
まれることを考える。かかるＡＰＧ−Ｎ微生物には、以下のものに限定されない
が、（１）大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、
Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、Ｏ７８、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ９５Ｏ１０３、及びＯ１
０９のようなＡＰＥＣ菌株と、（２）鳥類病原性サルモネラ菌株、例えば、グル
ープＣ及びグループＤ菌株と、（３）以下の属：カムピロバクター（Campylobac
ter）、バクテリオデス（Bacteroides）、ボルデテラ（Bordetella）、ハエモフ
ィルス（Haemophilus)、パスチューレア（Pasteurella）、フランシセラ（Franc
isella）、アクチノバチルス（Actinobacillus）、クレビセラ（Klebisella）、
モラセラ（Moraxella）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウス（Proteu
s）及びオルニソバクテリウム（Ornithobacterium）がある。組換えサルモネラ
菌株はＡＰＥＣ菌株のＯ‐抗原を発現することが好ましい。より好ましくは、Ａ
ＰＥＣ Ｏ−抗原はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５またはＯ７８セロタイプに特徴的であり
、さらに好ましくはＯ−抗原はＯ１ ＬＰＳ、Ｏ２ ＬＰＳ又はＯ７８ ＬＰＳで
ある。
【００１９】 ワクチンに利用される組換えサルモネラ菌株は、適切なサルモネラ菌株の染色
体へ所望のＡＰＧ−Ｎ微生物からのｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターを組込むこ
とにより調製される。担体バクテリアとして利用されるサルモネラ菌株は、鳥類
、特に飼鳥類をコロニー化させることができるいずれかのサルモネラ種由来であ
ればよい。かかる種には、以下のものに限定されないが、Ｓ．タイフィムリウム
、Ｓ．エンテリディティス（enteriditis）、Ｓ．ガリナルム(gallinarum)、S．
プロルム(pullorum)、S．アリゾナ、S．ハイデルベルグ、S．アナタム（anatum
）、S．ハーダ、S．アゴナ、S．モンテビデオ、S．ケンタッキー、S．インファ
ンティス（infantis）、S．シュワルツェングルンド、S．セントポール、S．ブ
ランデンブルグ、S．イスタアンブール、S．キュバナ、S．ブレデニー、S．ブラ
エンデルップ、S．リビングストーン、S．ベトラ、Ｓ．カリフォルニア、Ｓ．セ
ンフェンベルグ及びＳ．ンバンダカがある。本願で利用する「コロニー化」とは
、サルモネラ種がワクチン接種させた鳥類にて以下の一つ以上の組織にて付着し
、侵入し、持続することができることをいい、その組織とは、肺、脾臓、肝臓、
ファビリシウス嚢、セカである。好ましくは、組換えサルモネラ菌株はＳ．タイ
フィムリウム、Ｓ．ガリナルム、S．プロルム又はＳ．エンテリディティス由来
である。ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターがＳ．タイフィムリウムの
菌株に挿入されることがより好ましい。
体へ所望のＡＰＧ−Ｎ微生物からのｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターを組込むこ
とにより調製される。担体バクテリアとして利用されるサルモネラ菌株は、鳥類
、特に飼鳥類をコロニー化させることができるいずれかのサルモネラ種由来であ
ればよい。かかる種には、以下のものに限定されないが、Ｓ．タイフィムリウム
、Ｓ．エンテリディティス（enteriditis）、Ｓ．ガリナルム(gallinarum)、S．
プロルム(pullorum)、S．アリゾナ、S．ハイデルベルグ、S．アナタム（anatum
）、S．ハーダ、S．アゴナ、S．モンテビデオ、S．ケンタッキー、S．インファ
ンティス（infantis）、S．シュワルツェングルンド、S．セントポール、S．ブ
ランデンブルグ、S．イスタアンブール、S．キュバナ、S．ブレデニー、S．ブラ
エンデルップ、S．リビングストーン、S．ベトラ、Ｓ．カリフォルニア、Ｓ．セ
ンフェンベルグ及びＳ．ンバンダカがある。本願で利用する「コロニー化」とは
、サルモネラ種がワクチン接種させた鳥類にて以下の一つ以上の組織にて付着し
、侵入し、持続することができることをいい、その組織とは、肺、脾臓、肝臓、
ファビリシウス嚢、セカである。好ましくは、組換えサルモネラ菌株はＳ．タイ
フィムリウム、Ｓ．ガリナルム、S．プロルム又はＳ．エンテリディティス由来
である。ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターがＳ．タイフィムリウムの
菌株に挿入されることがより好ましい。
【００２０】 本願で使用するように、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターは、単量
体糖ユニットの生合成に要する産出物のすべてのｒｆｂ遺伝子と、並びにその糖
ユニットの重合に必要とされるＯ‐抗原ポリメラーゼをコードするｒｆｃ遺伝子
とを含むＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原特性の合成に必要なすべての遺伝子を包含
する。用語「ｒｆｂ遺伝子及びｒｆｃ遺伝子」とは、大腸菌ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝
子クラスターの産出物として、Ｏ−抗原生合成中の同じ機能を有する遺伝子産出
物をコードするとして道程されたいずれかのＡＰＧ−Ｎ微生物の遺伝子を意味す
るものである。多くの大腸菌及びサルモネラセロタイプでは、ｒｆｃ遺伝子はｒ
ｆｂ遺伝子クラスターにしっかりと結合しており、大腸菌では約１０ｋＢの長さ
であり、大腸菌遺伝子マップの４５分近傍に位置している。しかしながら、Ｓ．
タイフィムリウムのようなある大腸菌の菌株では、ｒｆｃ遺伝子はｒｆｂ遺伝子
クラスターに結合しておらず、顕著に離れた距離に存在する。例えば、Ｓ．タイ
フィムリウムでは、役２１ｋｂであるｒｆｂ遺伝子クラスターは、Ｓ．タイフィ
ムリウムの遺伝子マップの４４．９から４５．３センチサム（centisomes）から
延在するのに対し、ｒｆｃ遺伝子は３５．７センチサムに位置する。
体糖ユニットの生合成に要する産出物のすべてのｒｆｂ遺伝子と、並びにその糖
ユニットの重合に必要とされるＯ‐抗原ポリメラーゼをコードするｒｆｃ遺伝子
とを含むＡＰＧ−Ｎ微生物のＯ‐抗原特性の合成に必要なすべての遺伝子を包含
する。用語「ｒｆｂ遺伝子及びｒｆｃ遺伝子」とは、大腸菌ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝
子クラスターの産出物として、Ｏ−抗原生合成中の同じ機能を有する遺伝子産出
物をコードするとして道程されたいずれかのＡＰＧ−Ｎ微生物の遺伝子を意味す
るものである。多くの大腸菌及びサルモネラセロタイプでは、ｒｆｃ遺伝子はｒ
ｆｂ遺伝子クラスターにしっかりと結合しており、大腸菌では約１０ｋＢの長さ
であり、大腸菌遺伝子マップの４５分近傍に位置している。しかしながら、Ｓ．
タイフィムリウムのようなある大腸菌の菌株では、ｒｆｃ遺伝子はｒｆｂ遺伝子
クラスターに結合しておらず、顕著に離れた距離に存在する。例えば、Ｓ．タイ
フィムリウムでは、役２１ｋｂであるｒｆｂ遺伝子クラスターは、Ｓ．タイフィ
ムリウムの遺伝子マップの４４．９から４５．３センチサム（centisomes）から
延在するのに対し、ｒｆｃ遺伝子は３５．７センチサムに位置する。
【００２１】 機能的に完全なＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターは、バクテリアｒ
ｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターのクローン化で説明したように、通常のコスミド
クローニング方法を利用して容易にクローン化される。例えば、Viret他、欧州
特許第０５６４６８９Ｂ１号；Neal他、ＦＥＭＳ Microbiol. Lett. 82:345-352
, 1991; Haraguchi他、Microb. Pathog. 6:123-132,1989; Microb. Opathog, 10
: 351-361, 1991; Heuzenroeder他、Mol. Microbiol. 3: 295-302, 1989; Baste
in他、Mol．Microbiol. 5:2223-2231, 1991及びValvano他、Infect. Immun. 57:
937-943, 1989を参照するとよい。また、一般的コスミドクローン化法はSambroo
k他に詳細に記載されている：Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd E
d., Cold Spring Harbor laboratory Press，1989に記載されている。簡単に説
明すると、所望のＡＰＧ−Ｎ微生物からの染色体ＤＮＡのコスミドライブラリー
は、大腸菌Ｋ−１２菌っ株にて調製され、ｒｆｂ領域の突然変異に起因するＯ−
抗原を産出しない。コスミドライブラリーをプレートに載せ、所望のＡＰＧ−Ｎ 菌株のＯ−抗原に特異な抗血清を利用して、ＡＰＧ−ＮＯ−抗原の発現に対して
、分離コロニーをスクリーニングした。ＡＰＧ−Ｎ染色体ＤＮＡ断片を陽性コス
ミドクローンから単離し、さらに、制限マッピング及びサブクローニングのよう
な標準的方法を利用してキャラクタリゼーションを行い、ＡＰＧ−ＮＯ−抗原の
直接合成するに必要なＡＰＧ−ＮＤＮＡの最少量を算出した。本最少量を、本願
ではｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターという。ｒｆｃ遺伝子がｒｆｂ遺伝子クラ
スターからかなりの距離離れているＡＰＧ−Ｎ微生物では、機能性ｒｆｂ／ｒｆ
ｃ遺伝子クラスターを含有する単一のＡＰＧ−Ｎ染色体断片は、コスミドライブ
ラリーでは表示されない。かかる場合には、通常、追加のクローニング及びスク
リーニング実験を行うことが必要であり、ｒｆｃ遺伝子をクローン化させ、ｒｆ
ｂ遺伝子及びｒｆｃ遺伝子の双方を含有する組換え断片を構築させる。次いで、
ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターはコスミドまたはプラスミドとして、選択した
サルモネラ菌株へトランスフェクションされ、その結果生じた組換え体により算
出したＬＰＳが本技術分野では公知な方法により解析され、以下に簡潔に説明す
る。
ｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターのクローン化で説明したように、通常のコスミド
クローニング方法を利用して容易にクローン化される。例えば、Viret他、欧州
特許第０５６４６８９Ｂ１号；Neal他、ＦＥＭＳ Microbiol. Lett. 82:345-352
, 1991; Haraguchi他、Microb. Pathog. 6:123-132,1989; Microb. Opathog, 10
: 351-361, 1991; Heuzenroeder他、Mol. Microbiol. 3: 295-302, 1989; Baste
in他、Mol．Microbiol. 5:2223-2231, 1991及びValvano他、Infect. Immun. 57:
937-943, 1989を参照するとよい。また、一般的コスミドクローン化法はSambroo
k他に詳細に記載されている：Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd E
d., Cold Spring Harbor laboratory Press，1989に記載されている。簡単に説
明すると、所望のＡＰＧ−Ｎ微生物からの染色体ＤＮＡのコスミドライブラリー
は、大腸菌Ｋ−１２菌っ株にて調製され、ｒｆｂ領域の突然変異に起因するＯ−
抗原を産出しない。コスミドライブラリーをプレートに載せ、所望のＡＰＧ−Ｎ 菌株のＯ−抗原に特異な抗血清を利用して、ＡＰＧ−ＮＯ−抗原の発現に対して
、分離コロニーをスクリーニングした。ＡＰＧ−Ｎ染色体ＤＮＡ断片を陽性コス
ミドクローンから単離し、さらに、制限マッピング及びサブクローニングのよう
な標準的方法を利用してキャラクタリゼーションを行い、ＡＰＧ−ＮＯ−抗原の
直接合成するに必要なＡＰＧ−ＮＤＮＡの最少量を算出した。本最少量を、本願
ではｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターという。ｒｆｃ遺伝子がｒｆｂ遺伝子クラ
スターからかなりの距離離れているＡＰＧ−Ｎ微生物では、機能性ｒｆｂ／ｒｆ
ｃ遺伝子クラスターを含有する単一のＡＰＧ−Ｎ染色体断片は、コスミドライブ
ラリーでは表示されない。かかる場合には、通常、追加のクローニング及びスク
リーニング実験を行うことが必要であり、ｒｆｃ遺伝子をクローン化させ、ｒｆ
ｂ遺伝子及びｒｆｃ遺伝子の双方を含有する組換え断片を構築させる。次いで、
ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターはコスミドまたはプラスミドとして、選択した
サルモネラ菌株へトランスフェクションされ、その結果生じた組換え体により算
出したＬＰＳが本技術分野では公知な方法により解析され、以下に簡潔に説明す
る。
【００２２】 サルモネラＬＰＳコア部分は、あるバクテリアの異種Ｏ−抗原を受け入れるこ
とができず、担体バクテリアのコア部分に共有結合により付着した異種Ｏ−抗原
を有する完全なＬＰＳ分子よりは、免疫原性が多分ないＯ−抗原が未結合となる
（欧州特許第０５６４６８９Ｂ１号；Morona他、米国特許第５，１１０，５８８
号）。完全なＬＰＳ Ｏ−抗原を発現する組換え菌株は、急速な少スケールのミ
ニｐｒｅｐ法を利用して、遅い指数関数的又は定常的培養から抽出されたＬＰＳ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、未結合のＯ‐抗原を発現する菌株と明確に異な
る（HitchcookとBrown, J. Bacteriol. 154:269-277, 1983）。分離ＬＰＳ分子
は、銀染色により、又はＯ−抗原に特異な抗体を利用した免疫ブロット解析によ
り、ゲルにて検出され得る。完全なＬＰＳ Ｏ−抗原（または、滑らかで、つま
りＳ−タイプＬＰＳという）は、銀染色により、又は免疫ブロットによるいずれ
かにより検出可能な高分子量バンドのはしごが生じ、一方、未結合Ｏ−抗原はそ
のはしごは生じなく、抗体による染色、又は抗体によりプローブされ、汚れとし
て検出される。かかる場合、ＬＰＳの合成を導くサルモネラｒｆａ遺伝子座は、
大腸菌Ｋ−１２やＡＰＧ−Ｎ微生物のような別のバクテリアのｒｆａ遺伝子座に
より交換され、ｒｆａとＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターの組合わせ
を導出し、免疫原性形態でＡＰＧ−ＮＯ−抗原の合成を導く。
とができず、担体バクテリアのコア部分に共有結合により付着した異種Ｏ−抗原
を有する完全なＬＰＳ分子よりは、免疫原性が多分ないＯ−抗原が未結合となる
（欧州特許第０５６４６８９Ｂ１号；Morona他、米国特許第５，１１０，５８８
号）。完全なＬＰＳ Ｏ−抗原を発現する組換え菌株は、急速な少スケールのミ
ニｐｒｅｐ法を利用して、遅い指数関数的又は定常的培養から抽出されたＬＰＳ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、未結合のＯ‐抗原を発現する菌株と明確に異な
る（HitchcookとBrown, J. Bacteriol. 154:269-277, 1983）。分離ＬＰＳ分子
は、銀染色により、又はＯ−抗原に特異な抗体を利用した免疫ブロット解析によ
り、ゲルにて検出され得る。完全なＬＰＳ Ｏ−抗原（または、滑らかで、つま
りＳ−タイプＬＰＳという）は、銀染色により、又は免疫ブロットによるいずれ
かにより検出可能な高分子量バンドのはしごが生じ、一方、未結合Ｏ−抗原はそ
のはしごは生じなく、抗体による染色、又は抗体によりプローブされ、汚れとし
て検出される。かかる場合、ＬＰＳの合成を導くサルモネラｒｆａ遺伝子座は、
大腸菌Ｋ−１２やＡＰＧ−Ｎ微生物のような別のバクテリアのｒｆａ遺伝子座に
より交換され、ｒｆａとＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラスターの組合わせ
を導出し、免疫原性形態でＡＰＧ−ＮＯ−抗原の合成を導く。
【００２３】 異種抗原の安定な発現を評価し、サルモネラ菌株の染色体外の要素を維持する
抗生物質の利用の必要性を排除するため、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラ
スターはサルモネラ染色体へ組込まれる。これは、公知の手法により行われ、病
原性遺伝子へ明確な突然変異の欠失／挿入により、後述する弱毒化突然変異体を
産出させることが好ましい。あるいは、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラス
ターは、組換えサルモネラ菌株を弱毒化させない方法で組込まれる。
抗生物質の利用の必要性を排除するため、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラ
スターはサルモネラ染色体へ組込まれる。これは、公知の手法により行われ、病
原性遺伝子へ明確な突然変異の欠失／挿入により、後述する弱毒化突然変異体を
産出させることが好ましい。あるいは、ＡＰＧ−Ｎｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子クラス
ターは、組換えサルモネラ菌株を弱毒化させない方法で組込まれる。
【００２４】 また、その組換えサルモネラ菌株は、サルモネラＯ−抗原ポリメラーゼの発現
を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を包含する。Ｏ−抗原ポリ
メラーゼに欠陥のあるサルモネラ突然変異体は、Ｒｆｃ＋菌株に観測される通常
の３０から４０の糖ユニットの代わりに、一定のコアに付着したせいぜい一つの
Ｏ−抗原糖ユニットを有するセミラウ（ＳＲ ＬＰＳ）と呼ばれるＬＰＳ分子を
産出させる。上記のＳＲ ＬＰＳ分子はより庁寿命のＡＰＥＣ ＬＰＳ Ｏ−抗原
の能力により干渉する傾向になく、保護的免疫応答を刺激する。組換えサルモネ
ラ菌株は既にｒｆｃ突然変異を含有する菌株から調製され、ｒｆｃ突然変異は同
時に導入され、その後、サルモネラ染色体へＡＰＥＣ ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子ク
ラスタ−が組込まれる。
を不活性化させるサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を包含する。Ｏ−抗原ポリ
メラーゼに欠陥のあるサルモネラ突然変異体は、Ｒｆｃ＋菌株に観測される通常
の３０から４０の糖ユニットの代わりに、一定のコアに付着したせいぜい一つの
Ｏ−抗原糖ユニットを有するセミラウ（ＳＲ ＬＰＳ）と呼ばれるＬＰＳ分子を
産出させる。上記のＳＲ ＬＰＳ分子はより庁寿命のＡＰＥＣ ＬＰＳ Ｏ−抗原
の能力により干渉する傾向になく、保護的免疫応答を刺激する。組換えサルモネ
ラ菌株は既にｒｆｃ突然変異を含有する菌株から調製され、ｒｆｃ突然変異は同
時に導入され、その後、サルモネラ染色体へＡＰＥＣ ｒｆｂ／ｒｆｃ遺伝子ク
ラスタ−が組込まれる。
【００２５】 サルモネラｒｆｃ突然変異は、本技術分野では公知の通常の方法を利用して発
生させ得る。例えば、ランダムトランスポゾン挿入が所望のサルモネラ菌株の染
色体にて行われ（例えば、Curtiss米国特許第５，６７２，３４５号）、突然変
異体は、単離されたＲｆｃ表現型（つまり、ＳＲ ＬＰＳの発現）を有する（Col
lins他、J. Bacteriol,: 173: 2521-2529, 1991）。あるいは、欠失突然変異は
、本願の例に記載するように組換えＤＮＡ技法を利用してサルモネラｒｆｃへ導
入され得る。簡単に説明すると、Ｓ．タイフィムリウムのｒｆｃ遺伝子は、クロ
ーン化され、配列決定され、セログループＡ、Ｂ及びＤ１のサルモネラ菌株の間
では保存されていると考えられる（Collins他、前掲）。上記の情報に基づいて
、上記のセログループの一に属するサルモネラ菌株からのｒｆｃ遺伝子がクロー
ン化され、クローン化されたｒｆｃ遺伝子の欠失を含有する自殺プラスミドを構
築するために利用される。上記のプラスミドのｒｆｃ＋サルモネラ菌株への導入
により、染色体ｒｆｃ遺伝子とΔｒｆｃプラスミドとの間の異種組換えを導く。
次いで、形質転換された細胞は、プラスミドの選択が欠如した場一にて培養され
、単離体はＲＦｃ＋表現型をスクリーニングした。
生させ得る。例えば、ランダムトランスポゾン挿入が所望のサルモネラ菌株の染
色体にて行われ（例えば、Curtiss米国特許第５，６７２，３４５号）、突然変
異体は、単離されたＲｆｃ表現型（つまり、ＳＲ ＬＰＳの発現）を有する（Col
lins他、J. Bacteriol,: 173: 2521-2529, 1991）。あるいは、欠失突然変異は
、本願の例に記載するように組換えＤＮＡ技法を利用してサルモネラｒｆｃへ導
入され得る。簡単に説明すると、Ｓ．タイフィムリウムのｒｆｃ遺伝子は、クロ
ーン化され、配列決定され、セログループＡ、Ｂ及びＤ１のサルモネラ菌株の間
では保存されていると考えられる（Collins他、前掲）。上記の情報に基づいて
、上記のセログループの一に属するサルモネラ菌株からのｒｆｃ遺伝子がクロー
ン化され、クローン化されたｒｆｃ遺伝子の欠失を含有する自殺プラスミドを構
築するために利用される。上記のプラスミドのｒｆｃ＋サルモネラ菌株への導入
により、染色体ｒｆｃ遺伝子とΔｒｆｃプラスミドとの間の異種組換えを導く。
次いで、形質転換された細胞は、プラスミドの選択が欠如した場一にて培養され
、単離体はＲＦｃ＋表現型をスクリーニングした。
【００２６】 サルモネラ突然変異体は、バクテリアから単離したＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
解析によるＲｆｃ＋表現型を試験し、サルモネラ菌株に特異なＯ−糖のあるＳＲ
ＬＰＳの高割合を検出した。Ｒｆｃ＋表現型のサルモネラ突然変異体をスクリ
ーニングするのに利用可能である別の方法は、バクテリオファージ感度アッセイ
であり、ｓ−タイプＬＰＳに特異なファージを利用する。例えば、Ｓ．タイフィ
ムリウム及びＲｆｃ＋表現型を有する他のサルモネラグループＢの菌株（つまり
、ｓ−タイプＬＰＳを発現する）は、Ｐ２２により溶菌するのに対し、上記菌株
のＲｆｃ−突然変異体は、Ｐ２２仲介溶菌に対して耐性を有する。なぜなら、上
記突然変異体の菌株により発現されるＳＲ ＬＰＳをＰ２２は認識しないからで
ある。
解析によるＲｆｃ＋表現型を試験し、サルモネラ菌株に特異なＯ−糖のあるＳＲ
ＬＰＳの高割合を検出した。Ｒｆｃ＋表現型のサルモネラ突然変異体をスクリ
ーニングするのに利用可能である別の方法は、バクテリオファージ感度アッセイ
であり、ｓ−タイプＬＰＳに特異なファージを利用する。例えば、Ｓ．タイフィ
ムリウム及びＲｆｃ＋表現型を有する他のサルモネラグループＢの菌株（つまり
、ｓ−タイプＬＰＳを発現する）は、Ｐ２２により溶菌するのに対し、上記菌株
のＲｆｃ−突然変異体は、Ｐ２２仲介溶菌に対して耐性を有する。なぜなら、上
記突然変異体の菌株により発現されるＳＲ ＬＰＳをＰ２２は認識しないからで
ある。
【００２７】 一以上ののＡＰＧ−Ｎ微生物からのＡＰＧ−ＮＯ−抗原を発現する組変えサル
モネラ菌株は、単一のＡＰＧ−ＮＯ−抗原を発現する菌株を調製するのに本願で
説明するのと同様な技法を利用して構築されうるとも、考えられる。
モネラ菌株は、単一のＡＰＧ−ＮＯ−抗原を発現する菌株を調製するのに本願で
説明するのと同様な技法を利用して構築されうるとも、考えられる。
【００２８】 ワクチンは組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含むので、生きた、組換えサ
ルモネラバクテリアは、卵及び肉のような飼鳥類の食料産出物のヒトコンシュー
マに伝わる。加えて、Ｓ．エンテリカ種は非常に若い鳥類に病気を発病させうる
。よって、本発明の重要な特徴は、組換えサルモネラ菌株がＳ．エンテリカのビ
ルレント菌株の弱毒化突然変異体であることである。本願で利用するように、弱
毒化突然変異体とは、組換えサルモネラ菌株が、ワクチン接種させた鳥類にてコ
ロニー化及び複製する能力を有し、特定の鳥類種の感染と関連した症状をそのビ
ルレントカウンターパートによりヒトの治療若しくは感染させることが実質的に
できないものをいう。用語「実質的に症状を引き起こすことができない」とは、
弱毒化された突然変異体が全く症状が発病しない、深刻でなく、及び／又は僅か
な症状を示すことを意味する。しかしながら、弱毒化突然変異体菌株は、ワクチ
ンレシピエント、つまちヒトに正常な生理的機能に及ぼすある種の効果を必ずし
も引き起こすわけではなく、目的とするワクチンレシピエントだけでなく、他の
非ヒト宿主以外の鳥類種でも病原性である。
ルモネラバクテリアは、卵及び肉のような飼鳥類の食料産出物のヒトコンシュー
マに伝わる。加えて、Ｓ．エンテリカ種は非常に若い鳥類に病気を発病させうる
。よって、本発明の重要な特徴は、組換えサルモネラ菌株がＳ．エンテリカのビ
ルレント菌株の弱毒化突然変異体であることである。本願で利用するように、弱
毒化突然変異体とは、組換えサルモネラ菌株が、ワクチン接種させた鳥類にてコ
ロニー化及び複製する能力を有し、特定の鳥類種の感染と関連した症状をそのビ
ルレントカウンターパートによりヒトの治療若しくは感染させることが実質的に
できないものをいう。用語「実質的に症状を引き起こすことができない」とは、
弱毒化された突然変異体が全く症状が発病しない、深刻でなく、及び／又は僅か
な症状を示すことを意味する。しかしながら、弱毒化突然変異体菌株は、ワクチ
ンレシピエント、つまちヒトに正常な生理的機能に及ぼすある種の効果を必ずし
も引き起こすわけではなく、目的とするワクチンレシピエントだけでなく、他の
非ヒト宿主以外の鳥類種でも病原性である。
【００２９】 組換えサルモネラ菌株は、Ｓ．エンテリカ種のビルレント菌株の天然無毒性突
然変異体由来であり、周知な技法を利用して、野生型のビルレント菌株へ弱毒化
突然変異を度負う乳されることにより、誘導されうる。弱毒化突然変異は、生合
成遺伝子、調節遺伝子及び／又は病原性に関係する遺伝子である（DoggettとBro
wn, In Mucoosal Vaccines, Kiyono他、編集、Academic Press, San Diego, 199
6, pp. 105-118）。弱毒化に至らす突然変異の遺伝子の例には、以下のものに限
定されないが、ｐａｂ遺伝子、ｐｕｒ遺伝子、ａｒｏ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄ
ａｐ遺伝子、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍ
ｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐ
ｏｘＡ、ｇａｌＵ及びそれらの組合わせにおける突然変異がある。遺伝子の発現
が低下し、毒性が減少する限り、突然変異は挿入、部分的または完全な欠失等で
ある。遺伝子のと乙前変異は微生物体を弱毒化させる限り、適正な遺伝子突然変
異が本発明にて利用可能であることは、当業者には容易に理解できる。本発明の
担体微生物は少なくとも二つの突然変異を有し、各々の突然変異は微生物を弱毒
化させるように作用し、組み合せて、微生物が野生型毒性を回復しない蓋然性を
著しく増大させることが好ましい。
然変異体由来であり、周知な技法を利用して、野生型のビルレント菌株へ弱毒化
突然変異を度負う乳されることにより、誘導されうる。弱毒化突然変異は、生合
成遺伝子、調節遺伝子及び／又は病原性に関係する遺伝子である（DoggettとBro
wn, In Mucoosal Vaccines, Kiyono他、編集、Academic Press, San Diego, 199
6, pp. 105-118）。弱毒化に至らす突然変異の遺伝子の例には、以下のものに限
定されないが、ｐａｂ遺伝子、ｐｕｒ遺伝子、ａｒｏ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄ
ａｐ遺伝子、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍ
ｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐ
ｏｘＡ、ｇａｌＵ及びそれらの組合わせにおける突然変異がある。遺伝子の発現
が低下し、毒性が減少する限り、突然変異は挿入、部分的または完全な欠失等で
ある。遺伝子のと乙前変異は微生物体を弱毒化させる限り、適正な遺伝子突然変
異が本発明にて利用可能であることは、当業者には容易に理解できる。本発明の
担体微生物は少なくとも二つの突然変異を有し、各々の突然変異は微生物を弱毒
化させるように作用し、組み合せて、微生物が野生型毒性を回復しない蓋然性を
著しく増大させることが好ましい。
【００３０】 本発明の弱毒化組換えサルモネラ菌株の作出のための突然変異を生じさるよう
に利用される方法は、公知である。例えば、トランスポゾン、Ｔｎ１０が利用さ
れ、サルモネラを含む広範のバクテリアに染色体欠失を生じさせる（Klekner他
、J. Mol. Biol. 116: 125−159, 1997; EPO刊行物第３１５、６８２号；米国特
許第５，３８７，７４４号）。
に利用される方法は、公知である。例えば、トランスポゾン、Ｔｎ１０が利用さ
れ、サルモネラを含む広範のバクテリアに染色体欠失を生じさせる（Klekner他
、J. Mol. Biol. 116: 125−159, 1997; EPO刊行物第３１５、６８２号；米国特
許第５，３８７，７４４号）。
【００３１】 最近、遺伝子に特異な欠失を生じさせる新たな方法が利用可能となった。上記
方法は、当初、欠失を生じさせるべき遺伝子を選択する工程を含む。ある手法で
は、遺伝子は市販のゲノムライブラリーから選択される、または本技術分野では
周知な方法を利用して構築される（Sambrook他、Mlecular Cloning: A Laborato
ry manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor,
NY）。遺伝子を含有すうるクローンは、同じ遺伝子に突然変異を有する菌株の相
補性によりゲノムライブラリーから分離される。あるいは、遺伝子のＤＮＡ配列
が公知なときは、あるフランキング配列により、バクテリアサンプル又は精製ゲ
ノムＤＮＡから、ＰＣＲ産出物をクローニングベクターへ挿入し得る。 選択遺伝子の特定欠失は、二つの一般的な方法により生じ得る。第一の方法は
、制限酵素を利用して、ゲノムＤＮＡライブラリーに含有されるクローンの集団
からの単離遺伝子に突然変異を生じさせ、第二の方法はＰＣＲを利用して公知の
配列の遺伝子に突然変異を生じさせる。第一の方法を利用して、ベクター遺伝子
の位置がトランスポゾンタグ（ｔａｇｇｉｎｇ）を利用して確認され、ベクター
の組換えＤＮＡの制限マップが生じる。トランスポゾンタグから得られる情報に
より、公知の制限控訴部位を利用して、すべてのまたは部分的な遺伝子はベクタ
ーから切除される。ＰＣＲ法に基づく第二の方法は、遺伝子のＤＮＡ配列が公知
であるときに利用され得る。本方法に従うと、分岐ＰＣＲプライマーは遺伝子か
ら欠失させるべきＤＮＡの特定セグメントにフランキングする上流及び下流領域
を増幅させ、クローニングベクターと、ヌクレオチド配列にフランキングする上
流及び下流とからなるＰＣＲ産出物が生じる（Innes他、編集、PCR Protocols,
1990, Academic Press, New York）。本方法の変形では、ＰＣＲ産出物はクロー
ニングベクターの一緒に接合した遺伝子の部分、又はフランキング配列を表して
産出される。 突然変異遺伝子を含有するＤＮＡは、化学的手段またはエレクトロポレーショ
ンを利用して形質転換により、組換えファージ感染により、または接合により、
バクテリア宿主に導入される。好適な実施例では、突然変異体の遺伝子は、例え
ば、温度感応性レプリコン（Hamilton他、J. Bacteriol. 159: 783-786, 1984）
、recBC 突然変異体の線形形質転換（Iasin他、J. Bacteriol. 159: 783-786, 1
984）又は自殺ベクターとして公知な宿主制限レプリコン（Mille他、J. Bacteri
ol. 170: 2575-2583, 1998） を利用したような、本技術分野では周知な数多く
の方法を利用して行われるバクテリア染色体へ導入され得る。利用した特定の方
法は、例えば、フザリン酸耐性またはスクロース耐性と、それに続いて、表現型
特性に基づく突然変異体対立遺伝子を含有するクローンのその後のスクリーニン
グと、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又は免疫原性法を利用するような適
正な逆選択方法と結合される。
方法は、当初、欠失を生じさせるべき遺伝子を選択する工程を含む。ある手法で
は、遺伝子は市販のゲノムライブラリーから選択される、または本技術分野では
周知な方法を利用して構築される（Sambrook他、Mlecular Cloning: A Laborato
ry manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor,
NY）。遺伝子を含有すうるクローンは、同じ遺伝子に突然変異を有する菌株の相
補性によりゲノムライブラリーから分離される。あるいは、遺伝子のＤＮＡ配列
が公知なときは、あるフランキング配列により、バクテリアサンプル又は精製ゲ
ノムＤＮＡから、ＰＣＲ産出物をクローニングベクターへ挿入し得る。 選択遺伝子の特定欠失は、二つの一般的な方法により生じ得る。第一の方法は
、制限酵素を利用して、ゲノムＤＮＡライブラリーに含有されるクローンの集団
からの単離遺伝子に突然変異を生じさせ、第二の方法はＰＣＲを利用して公知の
配列の遺伝子に突然変異を生じさせる。第一の方法を利用して、ベクター遺伝子
の位置がトランスポゾンタグ（ｔａｇｇｉｎｇ）を利用して確認され、ベクター
の組換えＤＮＡの制限マップが生じる。トランスポゾンタグから得られる情報に
より、公知の制限控訴部位を利用して、すべてのまたは部分的な遺伝子はベクタ
ーから切除される。ＰＣＲ法に基づく第二の方法は、遺伝子のＤＮＡ配列が公知
であるときに利用され得る。本方法に従うと、分岐ＰＣＲプライマーは遺伝子か
ら欠失させるべきＤＮＡの特定セグメントにフランキングする上流及び下流領域
を増幅させ、クローニングベクターと、ヌクレオチド配列にフランキングする上
流及び下流とからなるＰＣＲ産出物が生じる（Innes他、編集、PCR Protocols,
1990, Academic Press, New York）。本方法の変形では、ＰＣＲ産出物はクロー
ニングベクターの一緒に接合した遺伝子の部分、又はフランキング配列を表して
産出される。 突然変異遺伝子を含有するＤＮＡは、化学的手段またはエレクトロポレーショ
ンを利用して形質転換により、組換えファージ感染により、または接合により、
バクテリア宿主に導入される。好適な実施例では、突然変異体の遺伝子は、例え
ば、温度感応性レプリコン（Hamilton他、J. Bacteriol. 159: 783-786, 1984）
、recBC 突然変異体の線形形質転換（Iasin他、J. Bacteriol. 159: 783-786, 1
984）又は自殺ベクターとして公知な宿主制限レプリコン（Mille他、J. Bacteri
ol. 170: 2575-2583, 1998） を利用したような、本技術分野では周知な数多く
の方法を利用して行われるバクテリア染色体へ導入され得る。利用した特定の方
法は、例えば、フザリン酸耐性またはスクロース耐性と、それに続いて、表現型
特性に基づく突然変異体対立遺伝子を含有するクローンのその後のスクリーニン
グと、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション又は免疫原性法を利用するような適
正な逆選択方法と結合される。
【００３２】 また、本発明で利用する組換えサルモネラ菌株は、所望の遺伝子産出物をワク
チン接種鳥類へ運搬するために利用され得る。本願で使用する用語「遺伝子産出
物」とは、いずれかの生物学的産出物、または遺伝子の制御下で起こる生化学反
応の結果として産出される産出物をいう。遺伝子産出物とは、例えば、ＲＮＡ分
子、ペプチド、タンパク質、酵素または遺伝子の初期の産出物である他の分子、
つまり、代謝産出物の制御下で産出される産出物をいう。例えば、遺伝子はまず
ＲＮＡ分子の合成を制御し、リボソームの作用により、遺伝子が発見される原細
胞の外部の環境のグルカンの生成を制御する酵素へ翻訳される。ＲＮＡ分子、酵
素及びグルカンは、本願で使用される用語としてのすべての遺伝子産出物である
。所望の遺伝子産出物の例には、以下に限定されないが、抗原、多様な宿主細胞
タンパク質、薬理学的に活性な産出物、トキシン及びアポトーシス調製剤がある
。
チン接種鳥類へ運搬するために利用され得る。本願で使用する用語「遺伝子産出
物」とは、いずれかの生物学的産出物、または遺伝子の制御下で起こる生化学反
応の結果として産出される産出物をいう。遺伝子産出物とは、例えば、ＲＮＡ分
子、ペプチド、タンパク質、酵素または遺伝子の初期の産出物である他の分子、
つまり、代謝産出物の制御下で産出される産出物をいう。例えば、遺伝子はまず
ＲＮＡ分子の合成を制御し、リボソームの作用により、遺伝子が発見される原細
胞の外部の環境のグルカンの生成を制御する酵素へ翻訳される。ＲＮＡ分子、酵
素及びグルカンは、本願で使用される用語としてのすべての遺伝子産出物である
。所望の遺伝子産出物の例には、以下に限定されないが、抗原、多様な宿主細胞
タンパク質、薬理学的に活性な産出物、トキシン及びアポトーシス調製剤がある
。
【００３３】 抗原、つまり免疫原は、宿主免疫システムを刺激して分泌、体液及び／又はそ
の抗原に特異な細胞応答をさせる一つ以上のエピトープを含有する分子を意味す
る。エピトープは抗原の部位であり、その部位に特異な抗体が結合する。タンパ
ク質抗原では、エピトープは、エピトープに固有な空間的配置に３つのアミノ酸
を含み、通常、エピトープは少なくとも６つの連続アミノ酸からなり、さらに、
抗原の少なくとも１０から１２の連続アミノ酸からなる。頭語「エピトープ」と
は、本願で使用する用語「抗原決定因子」と相互交換可能である。また、用語「
エピトープ」とは、Ｔ−ヘルパ細胞エピトープを包含し、抗原決定因子は主な組
織適合性複合体クラスＩＩ分子との会合を介して、Ｔ−ヘルパ細胞により認識さ
れる。加えて、用語エピトープとは、抗原提示細胞の表面にＭＨＣクラスＩ分子
により提示される際に細胞障害性Ｔ細胞により認識されるいずれかの抗原、エピ
トープ又は抗原決定因子を含む。細胞障害性Ｔ細胞エピトープは、約６個から１
１個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を、好ましくは８又は９の連続したアミノ酸
の配列を含む。
の抗原に特異な細胞応答をさせる一つ以上のエピトープを含有する分子を意味す
る。エピトープは抗原の部位であり、その部位に特異な抗体が結合する。タンパ
ク質抗原では、エピトープは、エピトープに固有な空間的配置に３つのアミノ酸
を含み、通常、エピトープは少なくとも６つの連続アミノ酸からなり、さらに、
抗原の少なくとも１０から１２の連続アミノ酸からなる。頭語「エピトープ」と
は、本願で使用する用語「抗原決定因子」と相互交換可能である。また、用語「
エピトープ」とは、Ｔ−ヘルパ細胞エピトープを包含し、抗原決定因子は主な組
織適合性複合体クラスＩＩ分子との会合を介して、Ｔ−ヘルパ細胞により認識さ
れる。加えて、用語エピトープとは、抗原提示細胞の表面にＭＨＣクラスＩ分子
により提示される際に細胞障害性Ｔ細胞により認識されるいずれかの抗原、エピ
トープ又は抗原決定因子を含む。細胞障害性Ｔ細胞エピトープは、約６個から１
１個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を、好ましくは８又は９の連続したアミノ酸
の配列を含む。
【００３４】 所望の遺伝子産出物がバクテリア、菌類、寄生又はウイルス病剤の抗原由来で
あるならば、組換えサルモネラ菌株はかかる病剤により引き起こされる病気に対
して鳥類をワクチン接種させるために利用され、同時に、ＡＰＧ−Ｎ微生物に対
するワクチン化剤として利用され得る。例えば、組換えサルモネラ菌株は、グラ
ム陽性（ＡＰＧ−Ｎ）バクテリアのようなＯ−抗原を発現させない鳥類病原性微
生物からの抗原を運搬するために利用された。かかる微生物は、以下に限定され
ないが、マイコプラズマ、リステリア（Listeria）、ボレリア、クラミジア、ク
ロストリディア（Clostridia）、コリンバクテリア、コキシエラ（Coxiella）、
エイシペロスリックス（Eysipelothrix）、フラボバクテリア、スタフィロコッ
カス（Staphylococcus）及びストレプトコッカスがある。鳥類を感染させること
が公知である菌類及び寄生鳥類病原体の例には、アモエボタエニア（Amoebotaen
ia）、アプロクテラ（Aproctella）、アスペルギラス（Aspergillus）、カナデ
ィダ（Canadida）、カピラリア（Capillaria）、クリプトスポリジウム（Crypto
sporidium）、シアソストロオマ（Cyathostroma）、ディスファリンクス（Disph
arynx）、エイメリア（Eimeria）、フィンブリアリア（Fimbriaria）、ゴンギロ
ネミア（Gongylonemia）、ヘテラキス（Hetrakis）、ヒストモナス（Histomonas
）、オキシスピルラ（Oxyspirura）、プラズモンディウム（Plasmondium）、ス
トロンギロイデス（Strongyloides）、スブルラ（Sublura）、シンガマス（Syng
amus）、テトラメレス（Tetrameres）及びトリコストロンギルス（Trichostrong
ylus）がある。鳥類を感染させることが公知であるウイルスには、アデノウイル
ス（例えば、ヘモルハギックエンテリティス（hemorrhagic enteritis）ウイル
ス）、アストロウイルス、コロナウイルス（例えば、感染性ブロンキティス（br
onchitis）ウイルス）、パラミクソ（paramyxo）ウイルス（例えば、ニューキャ
ッスル病ウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、鳥類エンセファロミエリティ
スウイルス）、ポックスウイルス、レトロウイルス（例えば、鳥類ロイコシス／
サルコーマウイルス）、レオウイルス及びロタウイルスがある。抗原として使用
される好適な遺伝子産出物は、糖タンパク質及びリポタンパク質を含む、ポリサ
ッカロイド及びタンパク質である。上記原核及び真核生物からの抗原をコードす
る遺伝子は、クローン化され、標準的技法を利用して、組換えサルモネラ菌株に
て発現される。
あるならば、組換えサルモネラ菌株はかかる病剤により引き起こされる病気に対
して鳥類をワクチン接種させるために利用され、同時に、ＡＰＧ−Ｎ微生物に対
するワクチン化剤として利用され得る。例えば、組換えサルモネラ菌株は、グラ
ム陽性（ＡＰＧ−Ｎ）バクテリアのようなＯ−抗原を発現させない鳥類病原性微
生物からの抗原を運搬するために利用された。かかる微生物は、以下に限定され
ないが、マイコプラズマ、リステリア（Listeria）、ボレリア、クラミジア、ク
ロストリディア（Clostridia）、コリンバクテリア、コキシエラ（Coxiella）、
エイシペロスリックス（Eysipelothrix）、フラボバクテリア、スタフィロコッ
カス（Staphylococcus）及びストレプトコッカスがある。鳥類を感染させること
が公知である菌類及び寄生鳥類病原体の例には、アモエボタエニア（Amoebotaen
ia）、アプロクテラ（Aproctella）、アスペルギラス（Aspergillus）、カナデ
ィダ（Canadida）、カピラリア（Capillaria）、クリプトスポリジウム（Crypto
sporidium）、シアソストロオマ（Cyathostroma）、ディスファリンクス（Disph
arynx）、エイメリア（Eimeria）、フィンブリアリア（Fimbriaria）、ゴンギロ
ネミア（Gongylonemia）、ヘテラキス（Hetrakis）、ヒストモナス（Histomonas
）、オキシスピルラ（Oxyspirura）、プラズモンディウム（Plasmondium）、ス
トロンギロイデス（Strongyloides）、スブルラ（Sublura）、シンガマス（Syng
amus）、テトラメレス（Tetrameres）及びトリコストロンギルス（Trichostrong
ylus）がある。鳥類を感染させることが公知であるウイルスには、アデノウイル
ス（例えば、ヘモルハギックエンテリティス（hemorrhagic enteritis）ウイル
ス）、アストロウイルス、コロナウイルス（例えば、感染性ブロンキティス（br
onchitis）ウイルス）、パラミクソ（paramyxo）ウイルス（例えば、ニューキャ
ッスル病ウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、鳥類エンセファロミエリティ
スウイルス）、ポックスウイルス、レトロウイルス（例えば、鳥類ロイコシス／
サルコーマウイルス）、レオウイルス及びロタウイルスがある。抗原として使用
される好適な遺伝子産出物は、糖タンパク質及びリポタンパク質を含む、ポリサ
ッカロイド及びタンパク質である。上記原核及び真核生物からの抗原をコードす
る遺伝子は、クローン化され、標準的技法を利用して、組換えサルモネラ菌株に
て発現される。
【００３５】 別の実施例では、所望の遺伝子産出物は、免疫化動物に及ぼす抗産出力効果を
付与する免疫応答を誘発することができる配偶子特異抗原の発現を導く（米国特
許第５，６５６、４８８号を参照）。
付与する免疫応答を誘発することができる配偶子特異抗原の発現を導く（米国特
許第５，６５６、４８８号を参照）。
【００３６】 本願で使用するように、ワクチンは動物の免疫システムを刺激するように使用
する薬剤を意味し、その結果、免疫システムにより自己抗原として認識されない
抗原に対して保護が実現される。免疫化とは、高レベルの抗体及び／又は細胞免
疫応答を持続させることを含む過程をいい、Ｔ‐リンパ組織は病原体を殺す、及
び／又は他の細胞（例えば、食細胞）を不活性化させ、免疫化動物にてかかる状
態にし、以前に晒された動物の病原体又は抗原に対して導く。本願では、語句「
免疫システム」とは、鳥類種が脊椎動物の細胞又は個体の細胞外の液体に侵入す
る抗原材料に対して抗体を産出させる解剖学的特徴及び解剖学的機構をいうだけ
でなく、細胞免疫応答をも包含する。
する薬剤を意味し、その結果、免疫システムにより自己抗原として認識されない
抗原に対して保護が実現される。免疫化とは、高レベルの抗体及び／又は細胞免
疫応答を持続させることを含む過程をいい、Ｔ‐リンパ組織は病原体を殺す、及
び／又は他の細胞（例えば、食細胞）を不活性化させ、免疫化動物にてかかる状
態にし、以前に晒された動物の病原体又は抗原に対して導く。本願では、語句「
免疫システム」とは、鳥類種が脊椎動物の細胞又は個体の細胞外の液体に侵入す
る抗原材料に対して抗体を産出させる解剖学的特徴及び解剖学的機構をいうだけ
でなく、細胞免疫応答をも包含する。
【００３７】 抗体産出の場合、そのように産出させた抗体はいずれかの免疫原性クラス、例
えば、免疫グロブリンＡ，Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭのようなクラスに属し得る。特に重
要なのは、免疫グロブリンＡ（以下、「ＩｇＡ」という）の産出を刺激するワク
チンである。なぜならば、これは鳥類種の分泌システムにより産出される原則的
な免疫グロブリンだからである。ただし、本発明のワクチンはＩｇＡ産出を刺激
するものに限らない。例えば、本願で記載する性質のワクチンはＩｇＡ生成に他
に、細胞及び体液免疫のような広範囲な他の免疫応答を産出する傾向にある。抗
原に対する免疫応答は充分に研究され、広範囲に報告されている。
えば、免疫グロブリンＡ，Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭのようなクラスに属し得る。特に重
要なのは、免疫グロブリンＡ（以下、「ＩｇＡ」という）の産出を刺激するワク
チンである。なぜならば、これは鳥類種の分泌システムにより産出される原則的
な免疫グロブリンだからである。ただし、本発明のワクチンはＩｇＡ産出を刺激
するものに限らない。例えば、本願で記載する性質のワクチンはＩｇＡ生成に他
に、細胞及び体液免疫のような広範囲な他の免疫応答を産出する傾向にある。抗
原に対する免疫応答は充分に研究され、広範囲に報告されている。
【００３８】 また、本発明の無毒性微生物は、鳥類種により作出される免疫調節分子や、さ
まざまな生理学的機能（例えば、成長速度、脂肪又はタンパク質含有量等）を刺
激若しくは抑制する薬理学的に活性な産出物を含む、他のタンパク質合成のベク
ターとして利用され得る。
まざまな生理学的機能（例えば、成長速度、脂肪又はタンパク質含有量等）を刺
激若しくは抑制する薬理学的に活性な産出物を含む、他のタンパク質合成のベク
ターとして利用され得る。
【００３９】 所望の遺伝質産出物は、組換えポリヌクレオチドによりコードされる。用語「
組換えポリヌクレオチド」とは、本願では、さまざまな内因性及び／又は外因性
ソースからの遺伝子へ操作可能に結合したプロモータのサルモネラ菌株へ導入さ
せた研究室操作の結果をいう。そのプロモータは遺伝子の発現を発生させるサル
モネラ菌株にて機能的であるものである。その遺伝子は染色体、プラスミドまた
はウイルスオリジンである。本願で使用する遺伝子は、所望の遺伝子産出物を産
出させることができる遺伝の生物学的単位である。しかしながら、遺伝子は親生
物体に存在しているように完全な遺伝子であり必要はなく、例えば、機能性ポリ
ペプチドのような高分子の産出を行う又は調節することができればよい。よって
、組換えポリヌクレオチドはすべてのまたは部分的な抗原産出物をコードする。
また、遺伝子とは、親生物体にて発見される天然の配列からの突然変異による配
列を有するポリヌクレオチドをいう。さらに、組換えポリヌクレオチドは、数他
の遺伝子産出物をコードするＤＮＡの長いセクションをいい、一つまたはすべて
の産出物は抗原、若しくは所望の遺伝子産出物を導く生合成経路の一部である。
例えば、かかるＤＮＡの長いセクションは、フィンブリン抗原（フィンブリアエ
（fimbriae）の合成に必要な５から１５のタンパク質をコードし、宿主細胞への
病原体の付着を仲介する（Baumler他、前掲）。フィンブリアエに対する免疫応
答の誘導は、抗原に対する保護を与える。ＤＮＡ配列が所望の遺伝子産出物をコ
ードする限り、本願で使用する用語「遺伝子」とは、例えば、ｃＤＮＡ分子の場
合がそうであるように、イントロンを欠如したＤＮＡ分子をさらに包含すること
は理解される。所望の遺伝子産出物をコードする組換えポリヌクレオチドには、
ターミネーション配列のようなプロモータ以外のＤＮＡ配列と、原核生物の遺伝
子発現の他の調節因子を包含する。
組換えポリヌクレオチド」とは、本願では、さまざまな内因性及び／又は外因性
ソースからの遺伝子へ操作可能に結合したプロモータのサルモネラ菌株へ導入さ
せた研究室操作の結果をいう。そのプロモータは遺伝子の発現を発生させるサル
モネラ菌株にて機能的であるものである。その遺伝子は染色体、プラスミドまた
はウイルスオリジンである。本願で使用する遺伝子は、所望の遺伝子産出物を産
出させることができる遺伝の生物学的単位である。しかしながら、遺伝子は親生
物体に存在しているように完全な遺伝子であり必要はなく、例えば、機能性ポリ
ペプチドのような高分子の産出を行う又は調節することができればよい。よって
、組換えポリヌクレオチドはすべてのまたは部分的な抗原産出物をコードする。
また、遺伝子とは、親生物体にて発見される天然の配列からの突然変異による配
列を有するポリヌクレオチドをいう。さらに、組換えポリヌクレオチドは、数他
の遺伝子産出物をコードするＤＮＡの長いセクションをいい、一つまたはすべて
の産出物は抗原、若しくは所望の遺伝子産出物を導く生合成経路の一部である。
例えば、かかるＤＮＡの長いセクションは、フィンブリン抗原（フィンブリアエ
（fimbriae）の合成に必要な５から１５のタンパク質をコードし、宿主細胞への
病原体の付着を仲介する（Baumler他、前掲）。フィンブリアエに対する免疫応
答の誘導は、抗原に対する保護を与える。ＤＮＡ配列が所望の遺伝子産出物をコ
ードする限り、本願で使用する用語「遺伝子」とは、例えば、ｃＤＮＡ分子の場
合がそうであるように、イントロンを欠如したＤＮＡ分子をさらに包含すること
は理解される。所望の遺伝子産出物をコードする組換えポリヌクレオチドには、
ターミネーション配列のようなプロモータ以外のＤＮＡ配列と、原核生物の遺伝
子発現の他の調節因子を包含する。
【００４０】 所望の遺伝子産出物をコードする組換えポリヌクレオチドは、プラスミド、フ
ァージ又はコスミドベクターの形態で、接合、エレクトロポレーション若しくは
形質転換のようなさまざまな手段によりサルモネラ菌株へ移入されうる（外部環
境から裸にＤＮＡの摂取は、カルシウムイオンのようなさまざまな化学的薬剤の
存在により人工的に誘発されうる）。形質導入のような他の方法も適切であり、
ファージ又はコスミドベクターを形質導入させる形態の組換えＤＮＡはファージ
内に組み込まれる。組換えポリヌクレオチドが担体サルモネラに一旦存在すると
、分離自律レプリコンとして存在し続ける、又はサルモネラ染色体に酢乳され、
細胞分裂中に染色体とともに複製される。
ァージ又はコスミドベクターの形態で、接合、エレクトロポレーション若しくは
形質転換のようなさまざまな手段によりサルモネラ菌株へ移入されうる（外部環
境から裸にＤＮＡの摂取は、カルシウムイオンのようなさまざまな化学的薬剤の
存在により人工的に誘発されうる）。形質導入のような他の方法も適切であり、
ファージ又はコスミドベクターを形質導入させる形態の組換えＤＮＡはファージ
内に組み込まれる。組換えポリヌクレオチドが担体サルモネラに一旦存在すると
、分離自律レプリコンとして存在し続ける、又はサルモネラ染色体に酢乳され、
細胞分裂中に染色体とともに複製される。
【００４１】 組換えポリヌクレオチドが、微生物体を含有するように選択し、組換えポリヌ
クレオチドが継続して存在と微生物体の生存とを結合させることによる所望の遺
伝子産出物を発現すすることができる「致死のバランスのとれた」システムに導
入されることが好ましい。このタイプの「致死のバランスのとれた」突然変異体
は、細胞生存に必須である酵素、より好ましくはジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）
の生合成の工程を触媒する酵素をコードする機能性天然染色体遺伝子、さらに好
ましくはβ−アスピリン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）をコード
する遺伝子が欠乏している特徴がある。ＤＡＰ経路酵素及びＡｓｄは細胞壁合成
に必要である。また、「致死のバランスのとれた」突然変異体は、非機能的染色
体遺伝子を相補するに役に立つ組換え遺伝しを含有し、この相補組換え遺伝子は
所望の遺伝子産出物をコードする組換えポリヌクレオチドと構造的に結合してい
る。その相補組換え遺伝子の損失のため、細胞がＤＡＰが欠乏している環境にて
存在すると、溶菌により細胞は死亡する。ＤＡＰが真核生物により合成されない
ので、このストラテジーは特に有用であり、よって、感染した鳥類組織には存在
しない。上記タイプの「致死のバランスのとれた」微生物の調整方法は、米国特
許第５，６７２，３４５号に開示されている。
クレオチドが継続して存在と微生物体の生存とを結合させることによる所望の遺
伝子産出物を発現すすることができる「致死のバランスのとれた」システムに導
入されることが好ましい。このタイプの「致死のバランスのとれた」突然変異体
は、細胞生存に必須である酵素、より好ましくはジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）
の生合成の工程を触媒する酵素をコードする機能性天然染色体遺伝子、さらに好
ましくはβ−アスピリン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）をコード
する遺伝子が欠乏している特徴がある。ＤＡＰ経路酵素及びＡｓｄは細胞壁合成
に必要である。また、「致死のバランスのとれた」突然変異体は、非機能的染色
体遺伝子を相補するに役に立つ組換え遺伝しを含有し、この相補組換え遺伝子は
所望の遺伝子産出物をコードする組換えポリヌクレオチドと構造的に結合してい
る。その相補組換え遺伝子の損失のため、細胞がＤＡＰが欠乏している環境にて
存在すると、溶菌により細胞は死亡する。ＤＡＰが真核生物により合成されない
ので、このストラテジーは特に有用であり、よって、感染した鳥類組織には存在
しない。上記タイプの「致死のバランスのとれた」微生物の調整方法は、米国特
許第５，６７２，３４５号に開示されている。
【００４２】 鳥類へのワクチンの投与は、粘膜または筋肉内注射を含むいずれかの公知な、
若しくは標準的な方法により行われる。好適な投与方法は、経口摂取又は気管支
−鼻−眼スプレイを含む。上記方法により、組換えサルモネラは容易に腸関連リ
ンパ系組織（ＧＡＬＴ）又は気管支関連リンパ系組織（ＢＡＬＴ）に到達し、抗
体生成と細胞仲介免疫を誘発する。特に好適な投与方法は、新生児鳥類のワクチ
ン接種であり、粗雑なスプレイにより孵化した日に行うことである。
若しくは標準的な方法により行われる。好適な投与方法は、経口摂取又は気管支
−鼻−眼スプレイを含む。上記方法により、組換えサルモネラは容易に腸関連リ
ンパ系組織（ＧＡＬＴ）又は気管支関連リンパ系組織（ＢＡＬＴ）に到達し、抗
体生成と細胞仲介免疫を誘発する。特に好適な投与方法は、新生児鳥類のワクチ
ン接種であり、粗雑なスプレイにより孵化した日に行うことである。
【００４３】 組換えサルモネラ菌株の成長と収集の後、特に、食料中にて混合させたい場合
はバクテリア細胞を凍結乾燥させる。組換えサルモネラバクテリアからなるワク
チンは、被免疫化鳥類のタイプに対して薬学的に許容ないずれかの賦形剤を利用
して調製されうる。例えば、固体形態でワクチンを投与させたいなら、細胞は接
種鳥類に非毒性であり、縛照りと相溶性である材料で塗布及び／又はカプセル化
される。タルク若しくはスクロースのような固体担体も利用できる。投与を液体
形態でしたいなら、細胞は、例えば、スキムミルク、生理学的に近い濃度で正常
な生理食塩水及び／又は他の非毒性塩を含む適正な液体担体で、並びに当業者に
は公知な適正な他の液体担体で懸濁させる。必要ならば、抗原性を向上させるた
めに、アジュバントを添加してもかまわない。ワクチンがスプレイとして投与す
るならば、組換えサルモネラ細胞ＢＳＧのような適正な緩衝液中で懸濁させる（
ゼラチンのある緩衝化生理食塩水、Curtiss III, R., J. Bactriol. 89：28-40,
1965）。
はバクテリア細胞を凍結乾燥させる。組換えサルモネラバクテリアからなるワク
チンは、被免疫化鳥類のタイプに対して薬学的に許容ないずれかの賦形剤を利用
して調製されうる。例えば、固体形態でワクチンを投与させたいなら、細胞は接
種鳥類に非毒性であり、縛照りと相溶性である材料で塗布及び／又はカプセル化
される。タルク若しくはスクロースのような固体担体も利用できる。投与を液体
形態でしたいなら、細胞は、例えば、スキムミルク、生理学的に近い濃度で正常
な生理食塩水及び／又は他の非毒性塩を含む適正な液体担体で、並びに当業者に
は公知な適正な他の液体担体で懸濁させる。必要ならば、抗原性を向上させるた
めに、アジュバントを添加してもかまわない。ワクチンがスプレイとして投与す
るならば、組換えサルモネラ細胞ＢＳＧのような適正な緩衝液中で懸濁させる（
ゼラチンのある緩衝化生理食塩水、Curtiss III, R., J. Bactriol. 89：28-40,
1965）。
【００４４】 必要とされる投与量は、組換えサルモネラ菌株によりは発現されるＡＰＥＣ
ＬＰＳＯ−抗原の量及び抗原性、並びにそのタイプ、サイズ及び被ワクチン接種
鳥類の年齢に応じて変化する。例えば、加齢した鳥類にワクチン接種させるのに
適する投与量よりは、新生児鳥類をワクチン接種させるには低投与量が必要とさ
れる。通常の実験により、必要な量は容易に確立される。一般に、投与量は鳥類
類につき１０５から１０９の生きた細胞の範囲の濃度である。生きた組換えＳ．
タイフィムリウム細胞を含むワクチンによる、新生児チキンのスプレイワクチン
接種の好適な投与量は、鳥類当たり約１０６から１０８の生きた細胞であり、特
に好適な投与量は、鳥類当たり約５ｘ１０７の生きた細胞である。
ＬＰＳＯ−抗原の量及び抗原性、並びにそのタイプ、サイズ及び被ワクチン接種
鳥類の年齢に応じて変化する。例えば、加齢した鳥類にワクチン接種させるのに
適する投与量よりは、新生児鳥類をワクチン接種させるには低投与量が必要とさ
れる。通常の実験により、必要な量は容易に確立される。一般に、投与量は鳥類
類につき１０５から１０９の生きた細胞の範囲の濃度である。生きた組換えＳ．
タイフィムリウム細胞を含むワクチンによる、新生児チキンのスプレイワクチン
接種の好適な投与量は、鳥類当たり約１０６から１０８の生きた細胞であり、特
に好適な投与量は、鳥類当たり約５ｘ１０７の生きた細胞である。
【００４５】 発明の好適な実施例は以下の例にて説明する。本願の特許請求の範囲内の他の
実施例は、本願で開示する明細書又は発明の実施形態を熟慮すれば、当業者には
明白である。特許請求の範囲及び発明の趣旨内で、例とともに明細書は例示的で
のみある。
実施例は、本願で開示する明細書又は発明の実施形態を熟慮すれば、当業者には
明白である。特許請求の範囲及び発明の趣旨内で、例とともに明細書は例示的で
のみある。
【００４６】 例 １ 本例では、Ｓ．タイフィムリウムのグループＢ ＬＰＳ及び大腸菌Ｏ７８ Ｌ
ＰＳを共発現する弱毒化組換えＳ．タイフィムリウムの構築を例示する。弱毒化ストラテジー ： ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に欠失を有するＳ．ライフィム
リウム菌株は、チキンにて弱毒化され、免疫原性であることが示され（Hassan他
、Res. Microbiol. 141;839‐850, 1990; Porter他、Avian Dis. 37: 265‐273
、1993）、加えて、本種にて野性型Ｓ．タイフィムリウム攻撃に対して保護的免
疫応答を誘発する（Hassan他、前掲、Hassan他、Infect. Immun. 62: 5519−552
7, 1994）。生化学的には、ｃｙａ又はｃｒｐの何れかの欠失により、マルトー
スを含む多様な糖の発酵をすることができなくなる（Botsford他、Microbiol. R
ev. 1992）。したがって、ΔｃｙａΔｃｒｙＳ．タイフィムリウムワクチン菌株
はマッコンキーマルトース場位置に白いコロニーを形成するのに対し、野性型Ｓ
．タイフィムリウムワクチン菌株は赤いコロニーを形成し、ワクチン菌株と野性
型Ｓ．タイフィムリウムワクチンとの間の識別の簡単な方法を提供する。上記の
早期発見に基づき、ΔｃｙａΔｃｒｙＳ．タイフィムリウムは担体菌株として選
択した。サルモネラ染色体へのＯ７８ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターの挿入 Ｓ．タイフィムリウム染色体へのＯ７８ｒｆｂの挿入を容易にし、単一の工程
でサルモネラｃｙａ遺伝子の弱毒化欠失突然変異を産出するために、ｐｉｒ依存
コスミドベクター、ｐＭＥＧ２１９を構築した。図１及び以下の表１に例示する
ように、ｐＭＥＧ２１９は以下の特徴を有する：複製のｐｉｒ依存オリジンと、
Ｔｎ１０からのテトラサイクリン耐性遺伝子と、プラスミドＲＫ２からの可動断
片と、ｐＣＯＳ２ＥＭＢＬからのカナマイシン耐性遺伝子及び二重ｃｏｓ部位と
、クローン化Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ２７対立遺伝子とを有する。オリジ
ンはｐｉｒ依存性であるので、本コスミドはＰｉｒタンパク質を支えるように工
業的に作出された特別な大腸菌菌株でのみ複製し得る（Kolter他、Cell 15: 119
9‐1208, 1978）が、野性型Ｓ．タイフィムリウム菌株では複製しない。ｃｙａ
−２７対立遺伝子は、第一の１３個のコドンを含むｃｙａの上流領域の３２７ｂ
ｐ欠失だけでなく、フランキング配列の上流の４７６ｂｐと欠失のフランキング
配列下流の１，８２６ｂｐからなるｃｙａの明確な欠失を含有する。加えて、No
tｌ部位は欠失点にて操作され、ｃｙａ遺伝子のＤＮＡの挿入を容易にした（P.
Sundarum, 個人的意見交換）。
ＰＳを共発現する弱毒化組換えＳ．タイフィムリウムの構築を例示する。弱毒化ストラテジー ： ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に欠失を有するＳ．ライフィム
リウム菌株は、チキンにて弱毒化され、免疫原性であることが示され（Hassan他
、Res. Microbiol. 141;839‐850, 1990; Porter他、Avian Dis. 37: 265‐273
、1993）、加えて、本種にて野性型Ｓ．タイフィムリウム攻撃に対して保護的免
疫応答を誘発する（Hassan他、前掲、Hassan他、Infect. Immun. 62: 5519−552
7, 1994）。生化学的には、ｃｙａ又はｃｒｐの何れかの欠失により、マルトー
スを含む多様な糖の発酵をすることができなくなる（Botsford他、Microbiol. R
ev. 1992）。したがって、ΔｃｙａΔｃｒｙＳ．タイフィムリウムワクチン菌株
はマッコンキーマルトース場位置に白いコロニーを形成するのに対し、野性型Ｓ
．タイフィムリウムワクチン菌株は赤いコロニーを形成し、ワクチン菌株と野性
型Ｓ．タイフィムリウムワクチンとの間の識別の簡単な方法を提供する。上記の
早期発見に基づき、ΔｃｙａΔｃｒｙＳ．タイフィムリウムは担体菌株として選
択した。サルモネラ染色体へのＯ７８ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターの挿入 Ｓ．タイフィムリウム染色体へのＯ７８ｒｆｂの挿入を容易にし、単一の工程
でサルモネラｃｙａ遺伝子の弱毒化欠失突然変異を産出するために、ｐｉｒ依存
コスミドベクター、ｐＭＥＧ２１９を構築した。図１及び以下の表１に例示する
ように、ｐＭＥＧ２１９は以下の特徴を有する：複製のｐｉｒ依存オリジンと、
Ｔｎ１０からのテトラサイクリン耐性遺伝子と、プラスミドＲＫ２からの可動断
片と、ｐＣＯＳ２ＥＭＢＬからのカナマイシン耐性遺伝子及び二重ｃｏｓ部位と
、クローン化Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ２７対立遺伝子とを有する。オリジ
ンはｐｉｒ依存性であるので、本コスミドはＰｉｒタンパク質を支えるように工
業的に作出された特別な大腸菌菌株でのみ複製し得る（Kolter他、Cell 15: 119
9‐1208, 1978）が、野性型Ｓ．タイフィムリウム菌株では複製しない。ｃｙａ
−２７対立遺伝子は、第一の１３個のコドンを含むｃｙａの上流領域の３２７ｂ
ｐ欠失だけでなく、フランキング配列の上流の４７６ｂｐと欠失のフランキング
配列下流の１，８２６ｂｐからなるｃｙａの明確な欠失を含有する。加えて、No
tｌ部位は欠失点にて操作され、ｃｙａ遺伝子のＤＮＡの挿入を容易にした（P.
Sundarum, 個人的意見交換）。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】 ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターは、コスミドベクターｐＹＡ３１７４のＢａ
ｍＨＩクローニング部位へ挿入させたＡＯＰＥＣ菌株χ７１２２（Brown他、Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11149-11154, 1996）のｒｆｂ領域を含むコスミドク
ローンｐＹＡ３２５５から入手できた。ｐＹＡ３２５５の制限分析から、Ｂａｍ
ＨＩクローニング部位にフランクする二つのＮｏｔｌ部位の他に、クローン化さ
れたχ７１２２ＤＮＡ内のNotI部位の存在が示された（Brown他、前掲）。した
がって、コスミドｐＹＡ３２５５は、Ｎｏｔｌにより部分的に消化され、Ｎｏｔ
Ｌ/ＰｖｕＩＩ消化ｐＭＥＧ２１９とライゲートし、コスミドｐＭＥＧ２２６が
でき、コスミドｐＭＥＧ２１９のΔｃｙａ対立遺伝子へ挿入されたＡＰＥＣ菌株
χ７１２２からのｒｆｂ領域を有する。次いで、コスミドｐＭＥＧ２２６はエレ
クトロポレ−ションにより大腸菌菌株ＭＧＮ６１７へ導入され、ＭＧＮＮ８０３
を産出した（表１を参照）。菌株ＭＧＮ６１７はａｓｄ遺伝子に欠失を有し、ジ
アミノピメリン酸（以下、「ＤＡＰ」という）の必要性が生じ（Schleifer他、B
acreriol Rev. 36: 407‐477, 1972）、ｐＭＥＧ２２６の複製をささえることが
できる。なぜなら、ｐｉｒ遺伝子のコピーを有するからである。
ｍＨＩクローニング部位へ挿入させたＡＯＰＥＣ菌株χ７１２２（Brown他、Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11149-11154, 1996）のｒｆｂ領域を含むコスミドク
ローンｐＹＡ３２５５から入手できた。ｐＹＡ３２５５の制限分析から、Ｂａｍ
ＨＩクローニング部位にフランクする二つのＮｏｔｌ部位の他に、クローン化さ
れたχ７１２２ＤＮＡ内のNotI部位の存在が示された（Brown他、前掲）。した
がって、コスミドｐＹＡ３２５５は、Ｎｏｔｌにより部分的に消化され、Ｎｏｔ
Ｌ/ＰｖｕＩＩ消化ｐＭＥＧ２１９とライゲートし、コスミドｐＭＥＧ２２６が
でき、コスミドｐＭＥＧ２１９のΔｃｙａ対立遺伝子へ挿入されたＡＰＥＣ菌株
χ７１２２からのｒｆｂ領域を有する。次いで、コスミドｐＭＥＧ２２６はエレ
クトロポレ−ションにより大腸菌菌株ＭＧＮ６１７へ導入され、ＭＧＮＮ８０３
を産出した（表１を参照）。菌株ＭＧＮ６１７はａｓｄ遺伝子に欠失を有し、ジ
アミノピメリン酸（以下、「ＤＡＰ」という）の必要性が生じ（Schleifer他、B
acreriol Rev. 36: 407‐477, 1972）、ｐＭＥＧ２２６の複製をささえることが
できる。なぜなら、ｐｉｒ遺伝子のコピーを有するからである。
【００５０】 Ｓ．タイフィムリウムへのコスミドｐＭＥＧ２２６を導入することは、２００
μｇ/ｍｌＤＡＰを含有するＬＢ寒天プレート（Miller, H., in Methods in Enz
ymology, Vol 152のp.14７, Berger, S. L.及びKimmel, A. R.,編集 Academic P
ress, Inc. 1987)各菌株の一晩の通気培養の５０μｌをスポッティングすること
により、大腸菌ドナー菌株ＭＧＮ８０３を野性型ＵＫ‐１Ｓ．タイフィムリウム
菌株χ３７６１と交配させ、３７℃で一晩インキュベートさせた。交配混合物を
プレートから無菌ワイヤループにより擦り取り、１ｍｌのＢＳＧ中にて懸濁させ
た。細胞を１０μｇ/ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上で拡散
させ、３７°で一晩インキュベートさせた。ドナー菌株であるＭＧＮ８０３に対
する逆選択は、ＤＡＰを含有しない選択場位置に平板培養させて行った。コスミ
ドｐＭＥＧ２２６はＳ．タイフィムリウムにて複製することができないので、プ
ラスミドを同種組換えにより染色体へ組込まれるならば、組換え細胞がテトラサ
イクリン耐性を得る方法のみである。テトラサイクリン耐性トランスコンジュゲ
ートは、ペンシルベニア州立大学の大腸菌レファレンスセンターから入手したア
ンチＯ７８特異坑血清を利用して、スライド凝集によりＯ７８ ＬＰＳの産出に
対してスクリーニングした。ＭＧＮ８０６（表１）と称される一つのテトラサイ
クリン耐性Ｏ７８+単離体は、ＬＢ肉汁中にて３７°で一晩静的に成長させ、フ
ザリン酸場位置上で平板培養させ（Bochner他、J. Baceriol. 243: 926‐933, 1
980）組込みプラスミドに対して逆選択した。フザリン酸耐性コロニーはテトラ
サイクリン体制の損失とマッコンキーマルトース培地上の白色に対してスクリー
ニングされた。Ｃｙａ突然変異体は上記培地上では白色である。なぜなら、その
トル全変異体はマルトースを発酵させることができないからであり（Botsford他、 前掲）、マルトースを発酵させることができる野性型Ｓ．タイフィムリウムは赤
いコロニーを産出させる。テトラサイクリン感応性Ｃｙａ‐、Ｏ７８+単離体が
選択され、ＭＧＮ８０７と称する（表１を参照）。
μｇ/ｍｌＤＡＰを含有するＬＢ寒天プレート（Miller, H., in Methods in Enz
ymology, Vol 152のp.14７, Berger, S. L.及びKimmel, A. R.,編集 Academic P
ress, Inc. 1987)各菌株の一晩の通気培養の５０μｌをスポッティングすること
により、大腸菌ドナー菌株ＭＧＮ８０３を野性型ＵＫ‐１Ｓ．タイフィムリウム
菌株χ３７６１と交配させ、３７℃で一晩インキュベートさせた。交配混合物を
プレートから無菌ワイヤループにより擦り取り、１ｍｌのＢＳＧ中にて懸濁させ
た。細胞を１０μｇ/ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上で拡散
させ、３７°で一晩インキュベートさせた。ドナー菌株であるＭＧＮ８０３に対
する逆選択は、ＤＡＰを含有しない選択場位置に平板培養させて行った。コスミ
ドｐＭＥＧ２２６はＳ．タイフィムリウムにて複製することができないので、プ
ラスミドを同種組換えにより染色体へ組込まれるならば、組換え細胞がテトラサ
イクリン耐性を得る方法のみである。テトラサイクリン耐性トランスコンジュゲ
ートは、ペンシルベニア州立大学の大腸菌レファレンスセンターから入手したア
ンチＯ７８特異坑血清を利用して、スライド凝集によりＯ７８ ＬＰＳの産出に
対してスクリーニングした。ＭＧＮ８０６（表１）と称される一つのテトラサイ
クリン耐性Ｏ７８+単離体は、ＬＢ肉汁中にて３７°で一晩静的に成長させ、フ
ザリン酸場位置上で平板培養させ（Bochner他、J. Baceriol. 243: 926‐933, 1
980）組込みプラスミドに対して逆選択した。フザリン酸耐性コロニーはテトラ
サイクリン体制の損失とマッコンキーマルトース培地上の白色に対してスクリー
ニングされた。Ｃｙａ突然変異体は上記培地上では白色である。なぜなら、その
トル全変異体はマルトースを発酵させることができないからであり（Botsford他、 前掲）、マルトースを発酵させることができる野性型Ｓ．タイフィムリウムは赤
いコロニーを産出させる。テトラサイクリン感応性Ｃｙａ‐、Ｏ７８+単離体が
選択され、ＭＧＮ８０７と称する（表１を参照）。
【００５１】 サルモネラｃｒｐ遺伝子に欠失を付加させるために、菌株ＭＧＮ８０７は前記
したように、菌株ＭＧＮ５１０（表１）にて成長させたＰ２２ファージにより形
質導入させた（Maloy, S. R., Experimental Techniques in bacterial genetic
s, JonesとBartlett, Boston, 1990）。ＭＧＮ５１０をプラスミドｐＭＥＧ１１
３（表１）の染色体へ組込んだ。そのｐＭＥＧ１１３は明確な欠失突然変異のあ
るＳ．タイフィムリウムｃｒｐ遺伝子を含有するｐｉｒ‐依存テトラサイクリン
耐性自殺ベクターである。形質導入体は１０μｇ/ｍｌテトラサイクリンを含有
するＬＢプレート上で選択した。ある形質導入体が選択され、フザリン酸培地上
で平板培養させた。フザリン酸耐性単離体を、２ｍＭのｃＡＭＰを含有するマッ
コンキーマルトースプレート上に線状に塗ることにより、Ｃｒｐ-表現型に対し
てスクリーニングした。培地上では、Ｃｙａ-、Ｃｒｐ+菌株が赤であり、一方、
Ｃｙａ-、Ｃｒｐ-菌株が白であった。一つのΔｃｙａ：：ｒｆｂΔｃｒｐ単離体
をＭＧＮ８６８と称した。
したように、菌株ＭＧＮ５１０（表１）にて成長させたＰ２２ファージにより形
質導入させた（Maloy, S. R., Experimental Techniques in bacterial genetic
s, JonesとBartlett, Boston, 1990）。ＭＧＮ５１０をプラスミドｐＭＥＧ１１
３（表１）の染色体へ組込んだ。そのｐＭＥＧ１１３は明確な欠失突然変異のあ
るＳ．タイフィムリウムｃｒｐ遺伝子を含有するｐｉｒ‐依存テトラサイクリン
耐性自殺ベクターである。形質導入体は１０μｇ/ｍｌテトラサイクリンを含有
するＬＢプレート上で選択した。ある形質導入体が選択され、フザリン酸培地上
で平板培養させた。フザリン酸耐性単離体を、２ｍＭのｃＡＭＰを含有するマッ
コンキーマルトースプレート上に線状に塗ることにより、Ｃｒｐ-表現型に対し
てスクリーニングした。培地上では、Ｃｙａ-、Ｃｒｐ+菌株が赤であり、一方、
Ｃｙａ-、Ｃｒｐ-菌株が白であった。一つのΔｃｙａ：：ｒｆｂΔｃｒｐ単離体
をＭＧＮ８６８と称した。
【００５２】 ΔｃｙａΔｃｒｐ菌株は非運動性である（Yokota他、J. Bactriol. 103:513‐
516, 1970）。なぜなら、アンチ鞭毛抗体はＳ．タイフィムリウムに対して保護
することが公知であり（Yokoyama他、Vaccine 16: 388‐393, 1998）、ＭＧＮ８
６８は運動性寒天(Ｄｉｆｃｏ社製)で充填した運動性チューブを介して継代培養
され（Holt他、Enrichiment and Isolation, in Methods for general and Mol
ecular Bacteriology, Gerhardt他編集、p222, Am. Soc. For Microbiol., Wash
ington, D. C.）、ＭＧＮ９９６（表１）と称される、ＭＧＮ８６８の運動性変
異体が産出した。
516, 1970）。なぜなら、アンチ鞭毛抗体はＳ．タイフィムリウムに対して保護
することが公知であり（Yokoyama他、Vaccine 16: 388‐393, 1998）、ＭＧＮ８
６８は運動性寒天(Ｄｉｆｃｏ社製)で充填した運動性チューブを介して継代培養
され（Holt他、Enrichiment and Isolation, in Methods for general and Mol
ecular Bacteriology, Gerhardt他編集、p222, Am. Soc. For Microbiol., Wash
ington, D. C.）、ＭＧＮ９９６（表１）と称される、ＭＧＮ８６８の運動性変
異体が産出した。
【００５３】 ＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及びＭＧＮ９９６により発現されたＬＰＳは、Ｓ
ＤＳ‐ＰＡＧＥにより検査し、以下のようにウエスタンブロットされた。上記菌
株の各細胞、並びにそれぞれ、Ｏ７８ ＬＰＳとＳ．タイフィムリウムグループ
Ｂ ＬＰＳのコントロールとしてのχ７１２２及びＭＧＮ４３１（表１）をＬＢ
肉汁に一晩成長させた。ＯＤ６００で等価となるように細胞を調整し、各培養の
１ｍｌを遠心分離によりペレット化した。ＬＰＳをヒッチコックとブラウンの方
法によりペレット化細胞から調製した（J. Bateriol. 154: 269‐277, 1983）。
サンプルを２回、１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、
ニトロセルロース膜へ移動させ、前記したアンチグループＢ特異坑血清（Ｄｉｆ
ｃｏ社製）又はアンチ−Ｏ７８特異坑血清（ECL, Western Blotting Protocols,
p. 16-17, Amersham Life Science, 1977）でプローブした。結果を図２に示す
。
ＤＳ‐ＰＡＧＥにより検査し、以下のようにウエスタンブロットされた。上記菌
株の各細胞、並びにそれぞれ、Ｏ７８ ＬＰＳとＳ．タイフィムリウムグループ
Ｂ ＬＰＳのコントロールとしてのχ７１２２及びＭＧＮ４３１（表１）をＬＢ
肉汁に一晩成長させた。ＯＤ６００で等価となるように細胞を調整し、各培養の
１ｍｌを遠心分離によりペレット化した。ＬＰＳをヒッチコックとブラウンの方
法によりペレット化細胞から調製した（J. Bateriol. 154: 269‐277, 1983）。
サンプルを２回、１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、
ニトロセルロース膜へ移動させ、前記したアンチグループＢ特異坑血清（Ｄｉｆ
ｃｏ社製）又はアンチ−Ｏ７８特異坑血清（ECL, Western Blotting Protocols,
p. 16-17, Amersham Life Science, 1977）でプローブした。結果を図２に示す
。
【００５４】 予期したように、大腸菌菌株χ７１２２から単離したＬＰＳはアンチグループ
Ｂ抗体とは反応せず（図２Ａ）、アンチ−Ｏ７８抗体と反応した（図２Ｂ）。同
様に、Ｓ．タイフィムリウムコントロール菌株ＭＧＮ４３１（ｃｙａ−２７ｃｒ
ｐ−２８，Ｍｏｔ+）はＬＰＳを作出し、アンチ−グループＢ抗体と反応した（
図２Ａ）が、アンチ−Ｏ７８抗体とは反応しなかった（図２Ｂ）。しかしながら
、組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及びＭＧＮ９９
６から単離したＬＰＳは双方の抗体と反応し（図２Ａ及び図２Ｂ）、識別性のあ
る高分子量バンドのラダーパターンができ、上記菌株はＳ．タイフィムリウムグ
ループＢとサルモネラコアに付着した大腸菌Ｏ７８Ｏ‐抗原との双方を発現する
ことが判明した。また、組換えサルモネラ菌株による高分子量のＯ７８ ＬＰＳ
の発現は、プラスミドｐＹＡ３２５５のクローン化χ７１２２ｒｆｂ領域はχ７
１２２のｒｆｃ遺伝子をも含有することを示す。
Ｂ抗体とは反応せず（図２Ａ）、アンチ−Ｏ７８抗体と反応した（図２Ｂ）。同
様に、Ｓ．タイフィムリウムコントロール菌株ＭＧＮ４３１（ｃｙａ−２７ｃｒ
ｐ−２８，Ｍｏｔ+）はＬＰＳを作出し、アンチ−グループＢ抗体と反応した（
図２Ａ）が、アンチ−Ｏ７８抗体とは反応しなかった（図２Ｂ）。しかしながら
、組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及びＭＧＮ９９
６から単離したＬＰＳは双方の抗体と反応し（図２Ａ及び図２Ｂ）、識別性のあ
る高分子量バンドのラダーパターンができ、上記菌株はＳ．タイフィムリウムグ
ループＢとサルモネラコアに付着した大腸菌Ｏ７８Ｏ‐抗原との双方を発現する
ことが判明した。また、組換えサルモネラ菌株による高分子量のＯ７８ ＬＰＳ
の発現は、プラスミドｐＹＡ３２５５のクローン化χ７１２２ｒｆｂ領域はχ７
１２２のｒｆｃ遺伝子をも含有することを示す。
【００５５】 組換えＳ．タイフィムリウム菌株にて発現したＯ７８ ＬＰＳの平均鎖長は、
同じ菌株（図３Ａと図３ＢのＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及びＭＧＮ９６６レー
ンを比較）で発現したグループＢ ＬＰＳの平均鎖長とほぼ同じサイズであり、
χ７１２２のＯ７８発現ではより短い鎖長が生じる（図３Ｂ）。異なるグループ
であるｃｌｄ（Bastin他、Mol. Microbol. 7:724‐734, 1993;Basytin他、Mol.
Microbiol. 5: 2223‐2231, 1991）、ｒｏｌ（Batchelor他、J. bacreriol. 174
: 5528‐5236, 1992; Batchelor他、J. bacteriol. 173: 5699‐5704, 1991）に
よる数多の異なる名前に割り当てられたＬＰＳ鎖長を調節することは公知であり
，最近では、ｗｚｚ（Reeves他、Trends Microbiol. 4: 495‐503, 1996）が知
られている。組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及び
ＭＧＮ９６６では、Ｏ７８ ＬＰＳ鎖長はＳ．タイフィムリウムｗｚｚ遺伝子に
より決定される傾向である。
同じ菌株（図３Ａと図３ＢのＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及びＭＧＮ９６６レー
ンを比較）で発現したグループＢ ＬＰＳの平均鎖長とほぼ同じサイズであり、
χ７１２２のＯ７８発現ではより短い鎖長が生じる（図３Ｂ）。異なるグループ
であるｃｌｄ（Bastin他、Mol. Microbol. 7:724‐734, 1993;Basytin他、Mol.
Microbiol. 5: 2223‐2231, 1991）、ｒｏｌ（Batchelor他、J. bacreriol. 174
: 5528‐5236, 1992; Batchelor他、J. bacteriol. 173: 5699‐5704, 1991）に
よる数多の異なる名前に割り当てられたＬＰＳ鎖長を調節することは公知であり
，最近では、ｗｚｚ（Reeves他、Trends Microbiol. 4: 495‐503, 1996）が知
られている。組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ８０７、ＭＧＮ８６８及び
ＭＧＮ９６６では、Ｏ７８ ＬＰＳ鎖長はＳ．タイフィムリウムｗｚｚ遺伝子に
より決定される傾向である。
【００５６】 例 ２ 本例では、チキンをコロニー化させ、野性型ＡＯＥＣ菌株χ７１２２による攻
撃に対してチキンを保護する組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ９６６（Δ
ｃｙａ‐２８：：ｒｆｂＯ７８、Δｃｒｐ−２８，Ｍｏｔ+）の能力を例示する
。
撃に対してチキンを保護する組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ９６６（Δ
ｃｙａ‐２８：：ｒｆｂＯ７８、Δｃｒｐ−２８，Ｍｏｔ+）の能力を例示する
。
【００５７】 例２から例４にて説明する実験で使用するすべてのチキンは、特定病原性フリ
ー鳥類サービス（イリノイ州ロアノ−クにあるＳＰＡＦＡＳ社製）から入手した
特定病原性フリー（ＳＰＦ）チキンからの卵から孵化させたホワイトレグホンで
あった。その卵をインキュベートさせ、ミズーリ州セントルイスにあるワシント
ン大学の生物学科に位置するヒュミダイレ（Humidaire）インキュベータ/ハッチ
ャーにて孵化させた。
ー鳥類サービス（イリノイ州ロアノ−クにあるＳＰＡＦＡＳ社製）から入手した
特定病原性フリー（ＳＰＦ）チキンからの卵から孵化させたホワイトレグホンで
あった。その卵をインキュベートさせ、ミズーリ州セントルイスにあるワシント
ン大学の生物学科に位置するヒュミダイレ（Humidaire）インキュベータ/ハッチ
ャーにて孵化させた。
【００５８】 本実験では、鳥類は２回ワクチン接種し、孵化の日に１回と、生後１４日後に
１回行った。チキンは粗雑なスプレイにより、ひよこ当たり４．６ｘ１０６ＣＦ
ＵのＭＧＮ９９６で、孵化後に接種させた。粗雑なスプレイワクチン接種は１０
から１５ひきのチキンをPlexiglasスプレイボックスに載置させ、１００ｐｓｉ
の圧のスレンレススチールシュアショットモデルＡスプレイヤ（ワイオミング州
ミルウォーキにあるミルウォーキスプレイヤマニュファクチュアリングコンパニ
ーインク社製）を利用して接種材料を運んだ。前もって試行錯誤を行い、０．３
ｍｌ/ひよこを[運搬する適正な条件を求めた。２６ひきのひよこをＭＧＮ９６６
によりワクチン接種させ、１２ひきのひよこをＢＳＧにてみせかけのワクチン接
種を行った。接種後、ひよこをHorsfall分離器へ移動させ、孵化後のワクチン接
種の後、アドリビタム（実験動物）にエサ及び水を供給した。
１回行った。チキンは粗雑なスプレイにより、ひよこ当たり４．６ｘ１０６ＣＦ
ＵのＭＧＮ９９６で、孵化後に接種させた。粗雑なスプレイワクチン接種は１０
から１５ひきのチキンをPlexiglasスプレイボックスに載置させ、１００ｐｓｉ
の圧のスレンレススチールシュアショットモデルＡスプレイヤ（ワイオミング州
ミルウォーキにあるミルウォーキスプレイヤマニュファクチュアリングコンパニ
ーインク社製）を利用して接種材料を運んだ。前もって試行錯誤を行い、０．３
ｍｌ/ひよこを[運搬する適正な条件を求めた。２６ひきのひよこをＭＧＮ９６６
によりワクチン接種させ、１２ひきのひよこをＢＳＧにてみせかけのワクチン接
種を行った。接種後、ひよこをHorsfall分離器へ移動させ、孵化後のワクチン接
種の後、アドリビタム（実験動物）にエサ及び水を供給した。
【００５９】 １０日後、ワクチン接種させたグループからランダムに選択した３匹のひよこ
を、ＣＯ２吸入により安楽死させ、直ぐにコロニー化を評価するために検死した
。肺、肝臓、脾臓、ファビリシウス嚢及び盲腸内容物のサンプルを各鳥類から取
出し、個々のストマッチャーバッグに載置し、５ｍｌのＢＳＧを各サンプルに添
加した。組織をスワードストマッチャー８０ラボラトリーブレンダーにて均質化
させた。次いで、脾臓、肝臓及び肺のサンプルでは、０．１ｍｌの均質化サンプ
ルを１％のマルトースで補充したマッコンキー寒天ベース（Ｄｉｆｃｏ社製）に
載置させ、ファブリシウス嚢のサンプル及び盲腸内容物では、３５μｇ/ｍｌの
ノボビオチンを含有するブリリアントグリーン寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）に載置さ
せた。各プレートからの少なくとも一つの典型的なコロニーをさらに分析し、ス
ライド凝集により適正なＬＰＳタイプの発現を確認した。直接の平板培養から全
くコロニーが得られなかった場合では、０．５ｍｌの均質化組織サンプルを４．
５ｍｌのハジナ（Hajna）肉汁へ添加し、二次的豊富として４２℃で一晩インキ
ュベートした。環のハジナ豊富培養をブルルアンとグリーン寒天上に線状に塗り
、３７°で一晩インキュベートさせた。ＭＧＮ９９６菌株は検査した全ての組織
サンプルにて観測された。
を、ＣＯ２吸入により安楽死させ、直ぐにコロニー化を評価するために検死した
。肺、肝臓、脾臓、ファビリシウス嚢及び盲腸内容物のサンプルを各鳥類から取
出し、個々のストマッチャーバッグに載置し、５ｍｌのＢＳＧを各サンプルに添
加した。組織をスワードストマッチャー８０ラボラトリーブレンダーにて均質化
させた。次いで、脾臓、肝臓及び肺のサンプルでは、０．１ｍｌの均質化サンプ
ルを１％のマルトースで補充したマッコンキー寒天ベース（Ｄｉｆｃｏ社製）に
載置させ、ファブリシウス嚢のサンプル及び盲腸内容物では、３５μｇ/ｍｌの
ノボビオチンを含有するブリリアントグリーン寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）に載置さ
せた。各プレートからの少なくとも一つの典型的なコロニーをさらに分析し、ス
ライド凝集により適正なＬＰＳタイプの発現を確認した。直接の平板培養から全
くコロニーが得られなかった場合では、０．５ｍｌの均質化組織サンプルを４．
５ｍｌのハジナ（Hajna）肉汁へ添加し、二次的豊富として４２℃で一晩インキ
ュベートした。環のハジナ豊富培養をブルルアンとグリーン寒天上に線状に塗り
、３７°で一晩インキュベートさせた。ＭＧＮ９９６菌株は検査した全ての組織
サンプルにて観測された。
【００６０】 １４日目、ワクチン接種させた鳥類は、１ｃｃシ臨時に付着させた栄養補給カ
ニューレを利用して、経口栄養により０．２ｍｌ体積中の３．８ｘ１０７ＣＦＵ
のＭＧＮ９９６でブーストさせた。２８日目、すべての鳥類は気管内経路により
０．５ｍｌ体積中の７．５ｘ１０７ＣＦＵの大腸菌菌株χ７１２２で攻撃し、４
日後に、ＣＯ２吸入により安楽死させ、次いで、検死した。
ニューレを利用して、経口栄養により０．２ｍｌ体積中の３．８ｘ１０７ＣＦＵ
のＭＧＮ９９６でブーストさせた。２８日目、すべての鳥類は気管内経路により
０．５ｍｌ体積中の７．５ｘ１０７ＣＦＵの大腸菌菌株χ７１２２で攻撃し、４
日後に、ＣＯ２吸入により安楽死させ、次いで、検死した。
【００６１】 検死鳥類をＡＰＥＣ感染と関連した病変に対して評価した。本実験及び例３と
例４では、病変評価の解析をウィルコキソン−マン−ホィットニーＵテストを利
用して行った（Zar, J. H. Biostatistical Analysis, pretice-Hall, Inc., En
glewood Cliffs）。本実験では、χ２解析を利用して病変を示さない（病変記録
１）鳥類の数に基づくグループ関の差異を求め、結果を以下の表２に示す。
例４では、病変評価の解析をウィルコキソン−マン−ホィットニーＵテストを利
用して行った（Zar, J. H. Biostatistical Analysis, pretice-Hall, Inc., En
glewood Cliffs）。本実験では、χ２解析を利用して病変を示さない（病変記録
１）鳥類の数に基づくグループ関の差異を求め、結果を以下の表２に示す。
【００６２】
【表４】 平均病変評価は、ＭＧＮ９９６によるワクチン接種させた鳥類は、非ワクチン
接種コントロール鳥類と比較すると、攻撃から十分に保護された（χ２＝５．３
、ｐ＝０．０２）。加えて、ワクチン接種させたグループは，全体の平均病変評
価を顕著に低下させた（ｐ＝０．０１５７）。上記結果は、グループＢのＯ‐抗
原を発現する弱毒化Ｓ．タイフィムリウムによる大腸菌ＬＰＳの運搬により、チ
キンに野性型大腸菌のよる攻撃からの十分な保護が実現される。
接種コントロール鳥類と比較すると、攻撃から十分に保護された（χ２＝５．３
、ｐ＝０．０２）。加えて、ワクチン接種させたグループは，全体の平均病変評
価を顕著に低下させた（ｐ＝０．０１５７）。上記結果は、グループＢのＯ‐抗
原を発現する弱毒化Ｓ．タイフィムリウムによる大腸菌ＬＰＳの運搬により、チ
キンに野性型大腸菌のよる攻撃からの十分な保護が実現される。
【００６３】 例 ３ 本例では、さまざまなひよこ組織をコロニー化させる能力に及ぼすサルモネラ
Ｏ−抗原の発現を排除する効果を例示する。
Ｏ−抗原の発現を排除する効果を例示する。
【００６４】 組換えＳ．タイフィムリウムワクチン菌株によるグループＢのＯ−こげんの発
現を排除するために、明確な欠失をＭＧＮ９９６（Δｃｙａ：：Ｏ７８９Δｃｒ
ｐ；表１）及びＭＧＮ４３１（明確なΔｃｙａΔｃｒｐ欠失コントロール菌株、
表１）のサルモネラｒｆｃ遺伝子にて行った。菌株ＭＧＮ９９６またはＭＧＮ４
３１は、アンピシリン耐性の選択を有する例１に記載した菌株ＭＧＮ１１４２（
表１）と交配させた。ＭＧＮ１１４２はＳ．タイフィムリウム突然変異体ｒｆｃ
遺伝子を有するｐｉｒ‐依存自殺ベクターを含む。各交配からのトランスコンジ
ュゲイトは５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ肉汁中にて一晩成長さ
せ、５％のスクロースにて補充したＬＢ寒天プレートマイナスＮａＣｌに載置さ
せ、室温で４８時間インキュベートさせた。単離体はＰ２２ファージに対してク
ロスに線状に塗ることによりＲｆｃ表現型をスクリーニングした。前述のように
、本アッセイにて、Ｓ．タイフィムリウムＯ‐抗原ポリメラーゼに欠陥のある突
然変異体はＰ２２に耐性があるのに対し、機能性Ｓ．タイフィムリウムＯ‐抗原
ポリメラーゼを発現する単離体は感応性を有する。
現を排除するために、明確な欠失をＭＧＮ９９６（Δｃｙａ：：Ｏ７８９Δｃｒ
ｐ；表１）及びＭＧＮ４３１（明確なΔｃｙａΔｃｒｐ欠失コントロール菌株、
表１）のサルモネラｒｆｃ遺伝子にて行った。菌株ＭＧＮ９９６またはＭＧＮ４
３１は、アンピシリン耐性の選択を有する例１に記載した菌株ＭＧＮ１１４２（
表１）と交配させた。ＭＧＮ１１４２はＳ．タイフィムリウム突然変異体ｒｆｃ
遺伝子を有するｐｉｒ‐依存自殺ベクターを含む。各交配からのトランスコンジ
ュゲイトは５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ肉汁中にて一晩成長さ
せ、５％のスクロースにて補充したＬＢ寒天プレートマイナスＮａＣｌに載置さ
せ、室温で４８時間インキュベートさせた。単離体はＰ２２ファージに対してク
ロスに線状に塗ることによりＲｆｃ表現型をスクリーニングした。前述のように
、本アッセイにて、Ｓ．タイフィムリウムＯ‐抗原ポリメラーゼに欠陥のある突
然変異体はＰ２２に耐性があるのに対し、機能性Ｓ．タイフィムリウムＯ‐抗原
ポリメラーゼを発現する単離体は感応性を有する。
【００６５】 数多の独立したΔｒｆｃＳｔ（Ｓ．タイフィムリウムのｒｆｃ遺伝子を表わす
）単離体を得、ＭＧＮ９９６由来のＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１、ＭＧＮ１
１８２及びＭＧＮ１１８３と称し、菌株ＭＧＮ１１８４及びＭＧＮ１１８５はΔ
ｃｙａΔｃｒｐＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ４３１由来である。表１を参照
するとよい。上記菌株により作出されたＬＰＳを単離し、グループＢ及び例１に
て前記さひたようにウエスタンブロットによるＯ７８Ｏ‐抗原を分析し、結果を
図３に示す。
）単離体を得、ＭＧＮ９９６由来のＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１、ＭＧＮ１
１８２及びＭＧＮ１１８３と称し、菌株ＭＧＮ１１８４及びＭＧＮ１１８５はΔ
ｃｙａΔｃｒｐＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ４３１由来である。表１を参照
するとよい。上記菌株により作出されたＬＰＳを単離し、グループＢ及び例１に
て前記さひたようにウエスタンブロットによるＯ７８Ｏ‐抗原を分析し、結果を
図３に示す。
【００６６】 予期したように、ΔｃｙａΔｃｒｐコントロール菌株ＭＧＮ４３１及びそのΔ
ｒｆｃＳｔ誘導体ＭＧＮ１１８４及びＭＧＮ１１８５により作出されたＬＰＳは
、アンチ−グループＢ ＬＰＳ抗体と反応し（図４Ａ）、アンチ−Ｏ７８ＬＰＳ
抗体とは反応しなかった（図４Ｂ）。しかしながら、ΔｒｆｃＳｔ菌株から単離
したＬＰＳは、アンチ−グループＢ ＬＰＳ抗体でプローブした際に低分子量の
みを産出し、全長のグループＢ ＬＰＳを発現しないことが判明した。アンチ−
Ｏ７８ ＬＰＳ抗体でプローブした際に、ＭＧＮ９９６及びそのΔｒｆｃＳｔ誘
導体菌株（ＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１、ＭＧＮ１１８２及びＭＧＮ１１８
３）により作出されたＬＰＳは、完全なＯ７８大腸菌Ｏ‐抗原を示すパターンが
生じた（図４Ｂ）。菌株ＭＧＮ１１８０（図４Ｂ）のＯ７８特異ＬＰＳパターン
は、ＭＧＮ９９６のグループＢ ＬＰＳ鎖長と類似しているが、ＭＧＮ１１８１
のＯ７８‐特異ＬＰＳパターン（図４Ｂ）は、野性型Ｏ７８大腸菌χ７１２２（
図４Ｂ）にて観測されたＯ７８ＬＰＳパターンにより類似していた。ＬＰＳパタ
ーンにおける差異は予想できなかった。なぜなら、二つの菌株はめかけ上同一の
遺伝子型を有するからである（表１）。菌株ＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１及
びＭＧＮ１１８４は大腸菌χ７１２２に対する可能なワクチンとしてさらに研究
するために選択した。
ｒｆｃＳｔ誘導体ＭＧＮ１１８４及びＭＧＮ１１８５により作出されたＬＰＳは
、アンチ−グループＢ ＬＰＳ抗体と反応し（図４Ａ）、アンチ−Ｏ７８ＬＰＳ
抗体とは反応しなかった（図４Ｂ）。しかしながら、ΔｒｆｃＳｔ菌株から単離
したＬＰＳは、アンチ−グループＢ ＬＰＳ抗体でプローブした際に低分子量の
みを産出し、全長のグループＢ ＬＰＳを発現しないことが判明した。アンチ−
Ｏ７８ ＬＰＳ抗体でプローブした際に、ＭＧＮ９９６及びそのΔｒｆｃＳｔ誘
導体菌株（ＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１、ＭＧＮ１１８２及びＭＧＮ１１８
３）により作出されたＬＰＳは、完全なＯ７８大腸菌Ｏ‐抗原を示すパターンが
生じた（図４Ｂ）。菌株ＭＧＮ１１８０（図４Ｂ）のＯ７８特異ＬＰＳパターン
は、ＭＧＮ９９６のグループＢ ＬＰＳ鎖長と類似しているが、ＭＧＮ１１８１
のＯ７８‐特異ＬＰＳパターン（図４Ｂ）は、野性型Ｏ７８大腸菌χ７１２２（
図４Ｂ）にて観測されたＯ７８ＬＰＳパターンにより類似していた。ＬＰＳパタ
ーンにおける差異は予想できなかった。なぜなら、二つの菌株はめかけ上同一の
遺伝子型を有するからである（表１）。菌株ＭＧＮ１１８０、ＭＧＮ１１８１及
びＭＧＮ１１８４は大腸菌χ７１２２に対する可能なワクチンとしてさらに研究
するために選択した。
【００６７】 菌株当たり１０匹のひよこを、ＭＧＮ９９６（６．９ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ
）、ＭＧＮ１１８０（４．０ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）、ＭＧＮ１１８１（２．
４ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）、ＭＧＮ１１８４（１．３ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）
またはＭＧＮ４３１（７．８ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）の経口栄養により、孵化
後に接種させた。ワクチン接種させた鳥類は分離器へ載置させ、前記したように
１０日目で検死した。肺、肝臓、脾臓、ファブリシウス嚢のサンプル及び盲腸内
容物を収集し、処理し、例２で記載したようにコロニー化を評価し、その結果を
以下の表３に示す。
）、ＭＧＮ１１８０（４．０ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）、ＭＧＮ１１８１（２．
４ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）、ＭＧＮ１１８４（１．３ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）
またはＭＧＮ４３１（７．８ｘ１０７ＣＦＵ/ひよこ）の経口栄養により、孵化
後に接種させた。ワクチン接種させた鳥類は分離器へ載置させ、前記したように
１０日目で検死した。肺、肝臓、脾臓、ファブリシウス嚢のサンプル及び盲腸内
容物を収集し、処理し、例２で記載したようにコロニー化を評価し、その結果を
以下の表３に示す。
【００６８】
【表５】 結果から、ＭＧＮ１１８４以外の試験したすべてのΔｒｆｃＳｔ菌株は鳥類の
肺、脾臓、肝臓、ファビリシウス嚢及び盲腸の大部分をコロニー化さえることが
できることが分かる。コントロール菌株ＭＧＮ４３１及びＭＧＮ９９６と同様に
、菌株ＭＧＮ１１８０及びＭＧＮ１１８１は、ワクチン化鳥類の１００％の脾臓
をコロニー化させることが判明した。菌株ＭＧＮ１１８４はΔｒｆｃ突然変異に
起因するセミラフ表現型を有する。ＬＰＳ‐欠陥Ｓ．タイフィムリウム菌株はチ
キンの減少したコロニー化を示すことを報告されている（Craven他、Avian. Dis
. 38:401‐408, 1994）。鳥類から鳥類への変動には耐えられず、実験で得られ
た結果はＭＧＮ１１８４によるコロニー化を非常に損なうという事実と一致し、
コロニー化におけるラン全ＬＰＳ Ｏ−抗原の役割を確認した。しかしながら、
Ｒｆｃバックグラウンド（ＭＧＮ１１８０及びＭＧＮ１１８１）中のＯ７８大腸
菌Ｏ‐抗原の発言により、ＭＧＮ１１８４と比較して、コロニー化された鳥類の
割合が顕著に増大し、上記菌株の大腸菌の攻撃に対して保護する能力を評価する
のに有用であることを示唆している。
肺、脾臓、肝臓、ファビリシウス嚢及び盲腸の大部分をコロニー化さえることが
できることが分かる。コントロール菌株ＭＧＮ４３１及びＭＧＮ９９６と同様に
、菌株ＭＧＮ１１８０及びＭＧＮ１１８１は、ワクチン化鳥類の１００％の脾臓
をコロニー化させることが判明した。菌株ＭＧＮ１１８４はΔｒｆｃ突然変異に
起因するセミラフ表現型を有する。ＬＰＳ‐欠陥Ｓ．タイフィムリウム菌株はチ
キンの減少したコロニー化を示すことを報告されている（Craven他、Avian. Dis
. 38:401‐408, 1994）。鳥類から鳥類への変動には耐えられず、実験で得られ
た結果はＭＧＮ１１８４によるコロニー化を非常に損なうという事実と一致し、
コロニー化におけるラン全ＬＰＳ Ｏ−抗原の役割を確認した。しかしながら、
Ｒｆｃバックグラウンド（ＭＧＮ１１８０及びＭＧＮ１１８１）中のＯ７８大腸
菌Ｏ‐抗原の発言により、ＭＧＮ１１８４と比較して、コロニー化された鳥類の
割合が顕著に増大し、上記菌株の大腸菌の攻撃に対して保護する能力を評価する
のに有用であることを示唆している。
【００６９】 例 ４ 本例では、Ｏ７８大腸菌Ｏ‐抗原を発現するが、Ｏ７８ＡＰＥＣ菌株、χ７１
２２による感染により生じた病気に対するひよこを保護する際に、グループＢＯ
‐抗原を発現しない組換えＳ．タイフィムリウム菌株の効能を例示する。
２２による感染により生じた病気に対するひよこを保護する際に、グループＢＯ
‐抗原を発現しない組換えＳ．タイフィムリウム菌株の効能を例示する。
【００７０】 菌株当たり３５匹のひよこを、６．５ｘ１０７ＣＦＵのＭＧＮ９６６（Δｃｙ
ａ−２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８、Ｍｏｔ+）又は７．７ｘ１０７ＣＦ
ＵのＭＧＮ１１８０（Δｃｙａ−２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８Δｒｆｃ
、Ｍｏｔ+）のいずれかの経口栄養により孵化後に接種させた。２５匹のひよこ
はＢＳＧによるみけかけのワクチン接種させた。１０日後、各接種グループから
の５匹のひよこを検死し、例２で説明したようにコロニー化の評価を行った。コ
ロニー化の結果は、実験２（データを示さず）にて観測されたものと同様であっ
た。１４日後、ＭＧＮ９９６により以前に接種させた鳥類は、ＭＧＮ９９６の７
．４ｘ１０７ＣＦＵによりブーストさせ、以前にＭＧＮ１１８０で接種させた鳥
類は、６．４ｘ１０７ＣＦＵのＭＧＮ１１８０によりブーストさせた。すべての
鳥類は２４日目に足を紐で縛った。ワクチン接種後の血清抗体応答を評価するた
めに、２７日目に半分の鳥類からの羽の血管に穴から血清を収集した。各グルー
プの半分の鳥類は３０日目に免疫性のテストをし、残存した鳥類は３１日目に免
疫性をテストした。攻撃投与量は９．６ｘ１０７ＣＦＵの大腸菌菌株、χ７１２
２であった。二つのコントロール鳥類は出血する前に死に、たった１８のコント
ロール鳥類が出血し、攻撃された。攻撃後４日目にすべての鳥類に対して検死を
行い、心臓血液を収集した以外は、例２のようにχ７１２２によりコロニー化を
評価した。攻撃菌株はすべての鳥類から単離されたが、ＭＧＮ９９６若しくはＭ
ＧＮ１１８０によりワクチン接種させた鳥類の盲腸にはのみ発見された。二つの
検死日からの病変評価データを解析のためにまとめ、結果を以下の表４に示す。
ａ−２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８、Ｍｏｔ+）又は７．７ｘ１０７ＣＦ
ＵのＭＧＮ１１８０（Δｃｙａ−２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８Δｒｆｃ
、Ｍｏｔ+）のいずれかの経口栄養により孵化後に接種させた。２５匹のひよこ
はＢＳＧによるみけかけのワクチン接種させた。１０日後、各接種グループから
の５匹のひよこを検死し、例２で説明したようにコロニー化の評価を行った。コ
ロニー化の結果は、実験２（データを示さず）にて観測されたものと同様であっ
た。１４日後、ＭＧＮ９９６により以前に接種させた鳥類は、ＭＧＮ９９６の７
．４ｘ１０７ＣＦＵによりブーストさせ、以前にＭＧＮ１１８０で接種させた鳥
類は、６．４ｘ１０７ＣＦＵのＭＧＮ１１８０によりブーストさせた。すべての
鳥類は２４日目に足を紐で縛った。ワクチン接種後の血清抗体応答を評価するた
めに、２７日目に半分の鳥類からの羽の血管に穴から血清を収集した。各グルー
プの半分の鳥類は３０日目に免疫性のテストをし、残存した鳥類は３１日目に免
疫性をテストした。攻撃投与量は９．６ｘ１０７ＣＦＵの大腸菌菌株、χ７１２
２であった。二つのコントロール鳥類は出血する前に死に、たった１８のコント
ロール鳥類が出血し、攻撃された。攻撃後４日目にすべての鳥類に対して検死を
行い、心臓血液を収集した以外は、例２のようにχ７１２２によりコロニー化を
評価した。攻撃菌株はすべての鳥類から単離されたが、ＭＧＮ９９６若しくはＭ
ＧＮ１１８０によりワクチン接種させた鳥類の盲腸にはのみ発見された。二つの
検死日からの病変評価データを解析のためにまとめ、結果を以下の表４に示す。
【００７１】
【表６】 結果から、菌株ＭＧＮ９９６の効能が確認され、ＭＧＮ１１８０は優れた大腸
菌ワクチンであることが示された。なぜなら、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接
種された鳥類の平均病変評価は、ＭＧＮ９９６ワクチンによる平均病変評価より
も低いからである。もっとも、その差異は重要ではない（ｐ＝０．０８）。
菌ワクチンであることが示された。なぜなら、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接
種された鳥類の平均病変評価は、ＭＧＮ９９６ワクチンによる平均病変評価より
も低いからである。もっとも、その差異は重要ではない（ｐ＝０．０８）。
【００７２】 各鳥類からの血清は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による大腸菌
Ｏ７８ＬＰＳ及びＳ．タイフィムリウムＬＰＳに対して導かれた抗体応答を評価
した。イムロン−Ｉフラット底プレートのウェルは、３７℃で２時間０．２％の
ＴＣＡ（トリクロロ酢酸；シグマ社製）中で２．５μｇ/ｍｌで調製された、１
００μｌの大腸菌ＬＰＳ（シグマ社製）またはＳ．タイフィムリウムＬＰＳ（シ
グマ社製）により塗布された。塗布に続いて、プレートを３回ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ
緩衝生理食塩水）/０．１％TWEEN２０溶液で洗浄した。希釈血清（１：１００）
を重複したウェルに添加し、３０℃で１時間インキュベートさせた。本工程に続
いて、TBS/０．１％tween２０溶液で３回洗浄した。結合ＩｇＧを１：３０，０
００希釈ヤギアンチ−チキンＩｇＧＨＲＰ複合抗体（ＫＰＬ）の添加により検出
した。プレートはＴＢＳ/０．１％ｔｗｅｅｎ２０で再び洗浄し、未結合検出抗
体を除去した。洗浄は過ホウ酸ナトリウムのあるリン酸−クエン酸緩衝液中のＯ
ＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤（シグマ社製）での展開に続いて
行った。３７℃、１５分後、各ウェルに３ＮＨＣｌを添加することにより反応を
停止した。ＢＴ２０００マイクロキネティックスリーダ（フィッシャーバイオテ
ック社製）を利用して、プレートを波長４９０ｎｍでその吸光度を測定した。結
合ＩｇＭ及びＩｇＡを検出するために、１：５希釈の正常なラビット血清を[利
用して、３７℃４５分間、プレートをまずブロックし、その後、ＴＢＳ/０．１
％ｔｗｅｎｎ２０により３回洗浄した。ブロッキング後、１：５０００希釈のヤ
ギアンチチキンＩｇＭまたはＩｇＡ（イムノビジョン社製）を各ウェルに添加し
、３５℃でさらに４５分間、プレートをインキュベートさせた。未結合抗体を除
去するようにＴＢＳ/０．１％ｔｗｅｅｎをにて３回洗浄した後、１：５０００
希釈ラビットアンチ−ヤギＩｇＧアルカリリン酸複合抗体（シグマ社製）を各ウ
ェルに添加した。再び、プレートを３７℃で４５分間インキュベートさせた。未
結合複合抗体の除去後、ｐ‐ＮＰＰ（ジエタノールアミン中のｐ‐ニトロフェニ
ルリン酸；シグマ社製）基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０
分間インキュベートさせた。３Ｍ ＮａＯＨの添加により反応を停止させ、４０
５ｎｍにてプレートの吸光度を測定した。０．２以上のＯＤ値が観測されるなら
ば、鳥類はセロ陽性であった。コントロールでは１２匹の鳥類から予め出血させ
、ウェルは複合抗体のみを含有した。結果を以下の表５及び表６に示す。
Ｏ７８ＬＰＳ及びＳ．タイフィムリウムＬＰＳに対して導かれた抗体応答を評価
した。イムロン−Ｉフラット底プレートのウェルは、３７℃で２時間０．２％の
ＴＣＡ（トリクロロ酢酸；シグマ社製）中で２．５μｇ/ｍｌで調製された、１
００μｌの大腸菌ＬＰＳ（シグマ社製）またはＳ．タイフィムリウムＬＰＳ（シ
グマ社製）により塗布された。塗布に続いて、プレートを３回ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ
緩衝生理食塩水）/０．１％TWEEN２０溶液で洗浄した。希釈血清（１：１００）
を重複したウェルに添加し、３０℃で１時間インキュベートさせた。本工程に続
いて、TBS/０．１％tween２０溶液で３回洗浄した。結合ＩｇＧを１：３０，０
００希釈ヤギアンチ−チキンＩｇＧＨＲＰ複合抗体（ＫＰＬ）の添加により検出
した。プレートはＴＢＳ/０．１％ｔｗｅｅｎ２０で再び洗浄し、未結合検出抗
体を除去した。洗浄は過ホウ酸ナトリウムのあるリン酸−クエン酸緩衝液中のＯ
ＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤（シグマ社製）での展開に続いて
行った。３７℃、１５分後、各ウェルに３ＮＨＣｌを添加することにより反応を
停止した。ＢＴ２０００マイクロキネティックスリーダ（フィッシャーバイオテ
ック社製）を利用して、プレートを波長４９０ｎｍでその吸光度を測定した。結
合ＩｇＭ及びＩｇＡを検出するために、１：５希釈の正常なラビット血清を[利
用して、３７℃４５分間、プレートをまずブロックし、その後、ＴＢＳ/０．１
％ｔｗｅｎｎ２０により３回洗浄した。ブロッキング後、１：５０００希釈のヤ
ギアンチチキンＩｇＭまたはＩｇＡ（イムノビジョン社製）を各ウェルに添加し
、３５℃でさらに４５分間、プレートをインキュベートさせた。未結合抗体を除
去するようにＴＢＳ/０．１％ｔｗｅｅｎをにて３回洗浄した後、１：５０００
希釈ラビットアンチ−ヤギＩｇＧアルカリリン酸複合抗体（シグマ社製）を各ウ
ェルに添加した。再び、プレートを３７℃で４５分間インキュベートさせた。未
結合複合抗体の除去後、ｐ‐ＮＰＰ（ジエタノールアミン中のｐ‐ニトロフェニ
ルリン酸；シグマ社製）基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０
分間インキュベートさせた。３Ｍ ＮａＯＨの添加により反応を停止させ、４０
５ｎｍにてプレートの吸光度を測定した。０．２以上のＯＤ値が観測されるなら
ば、鳥類はセロ陽性であった。コントロールでは１２匹の鳥類から予め出血させ
、ウェルは複合抗体のみを含有した。結果を以下の表５及び表６に示す。
【００７３】
【表７】 ＭＧＮ９９６によりワクチン接種された鳥類の約５０％は、Ｏ７８特異ＩｇＭ
抗体に対してセロ陽性であるのに対し、２０から３０％のみがＯ７８特異ＩｇＧ
及びＩｇＡ抗体のプレ攻撃に対して陽性であった。対照的に、ＲｆｃＳｔ -菌株
、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された８０％の鳥類が、Ｏ７８特異ＩｇＮ
抗体プレ攻撃に対して陽性であり、５７％と７０％の鳥類がＩｇＧとＩｇＡＯ７
８特異抗体にそれぞれセロ陽性であった。上記の結果から、ＲｆｃＳｔ +菌株Ｍ
ＧＮ９９６よりもＭＧＮ１１８０によるワクチン接種により発生した体液免疫応
答のさらなる突然変異を示す。ポスト攻撃の血清変換はグループ間で類似である
が、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された８５％（２２/２６）のＩｇＡセ
ロ陽性鳥類のＯＤ４０５値はＭＧＮＭ９９６によりワクチン接種された鳥類のわ
ずか４２％（１１/２６）と比較して、０．５以上であった。アンチ−Ｏ７８Ｉ
ｇＮに対してみかけ上ワクチン接種させた鳥類のセロ陽性の高割合は、Ｏ７８
ＬＰＳ調製（例えばＬＰＳコア）に存在する共有の大腸菌抗原と反応性であるメ
モリＢ細胞の再刺激に起因する。予期したように、ＭＧＮ１１８０ワクチンより
もＳ．タイフィムリウムＬＰＳに対する強い体液抗体応答を、ＭＧＮ９９６は与
える。なぜならば、ＭＧＮ１１８０はＯ７８ ＬＰＳによりマスクされたＯ‐抗
原に単一の糖ユニットのみを有するＳ．タイフィムリウム ＬＰＳを産出するか
らである。この推測は、菌株ＭＧＮ１１８０がグループＢ特異坑血清の存在下で
も凝集せず、たとえ、完全なＬＰＳＯ−抗原を発現するＳ．タイフィムリウム菌
株よりも弱いが、菌株ＭＧＮ１１８４（ΔｃｙａΔｃｒｐΔｒｆｃ）が凝集する
という観測に基づいている。
抗体に対してセロ陽性であるのに対し、２０から３０％のみがＯ７８特異ＩｇＧ
及びＩｇＡ抗体のプレ攻撃に対して陽性であった。対照的に、ＲｆｃＳｔ -菌株
、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された８０％の鳥類が、Ｏ７８特異ＩｇＮ
抗体プレ攻撃に対して陽性であり、５７％と７０％の鳥類がＩｇＧとＩｇＡＯ７
８特異抗体にそれぞれセロ陽性であった。上記の結果から、ＲｆｃＳｔ +菌株Ｍ
ＧＮ９９６よりもＭＧＮ１１８０によるワクチン接種により発生した体液免疫応
答のさらなる突然変異を示す。ポスト攻撃の血清変換はグループ間で類似である
が、ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された８５％（２２/２６）のＩｇＡセ
ロ陽性鳥類のＯＤ４０５値はＭＧＮＭ９９６によりワクチン接種された鳥類のわ
ずか４２％（１１/２６）と比較して、０．５以上であった。アンチ−Ｏ７８Ｉ
ｇＮに対してみかけ上ワクチン接種させた鳥類のセロ陽性の高割合は、Ｏ７８
ＬＰＳ調製（例えばＬＰＳコア）に存在する共有の大腸菌抗原と反応性であるメ
モリＢ細胞の再刺激に起因する。予期したように、ＭＧＮ１１８０ワクチンより
もＳ．タイフィムリウムＬＰＳに対する強い体液抗体応答を、ＭＧＮ９９６は与
える。なぜならば、ＭＧＮ１１８０はＯ７８ ＬＰＳによりマスクされたＯ‐抗
原に単一の糖ユニットのみを有するＳ．タイフィムリウム ＬＰＳを産出するか
らである。この推測は、菌株ＭＧＮ１１８０がグループＢ特異坑血清の存在下で
も凝集せず、たとえ、完全なＬＰＳＯ−抗原を発現するＳ．タイフィムリウム菌
株よりも弱いが、菌株ＭＧＮ１１８４（ΔｃｙａΔｃｒｐΔｒｆｃ）が凝集する
という観測に基づいている。
【００７４】 全体では、頑丈なプレ攻撃抗体応答と低病変評価との間には強い創刊関係があ
る。もっとも、保護された検出可能なプレ攻撃抗体応答を示さない数鳥類があり
、検出可能なプレ攻撃抗体応答を示す数鳥類があったが、保護されないとして評
価した。ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された多くの鳥類は、攻撃前のＯ７
８抗体（２４/３０）に対してセロ陽性であったが、一方、ＭＧＮ９９６グルー
プから鳥類（１７/３０）がセロ陽性ではほとんどなかった。
る。もっとも、保護された検出可能なプレ攻撃抗体応答を示さない数鳥類があり
、検出可能なプレ攻撃抗体応答を示す数鳥類があったが、保護されないとして評
価した。ＭＧＮ１１８０によりワクチン接種された多くの鳥類は、攻撃前のＯ７
８抗体（２４/３０）に対してセロ陽性であったが、一方、ＭＧＮ９９６グルー
プから鳥類（１７/３０）がセロ陽性ではほとんどなかった。
【００７５】 例 ５ 本例は、追加の異種遺伝子産出物を発現するために利用されうるＡｓｄ+ベク
ターをも含有する組換えワクチンのＳ．タイフィムリウム菌株によるひよこのワ
クチン接種を例示する。
ターをも含有する組換えワクチンのＳ．タイフィムリウム菌株によるひよこのワ
クチン接種を例示する。
【００７６】 Ａｓｄ+ベクターｐＹＡ２９２（表１）をＭＧＮ１７１７（表１）へ、エレク
トロポレーションにより導入し、菌株ＭＧＮ１７１８［（Δｃｙａ‐２８：：ｒ
ｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８ΔｒｆｃΔａｓｄ：：ｘｙｌＥ７２９）/ｐＹＡ２９
２、Ｍｏｔ+］を産出した。本例で利用したすべてのチキンは、サンライズファ
ーム（ニューヨーク州キャットスキル）から入手した特定病原性フリー（ＳＰＦ
）チキンからの繁殖力のある卵から孵化させた。２０匹のひよこはＢＳＧにより
みけかけのワクチン接種され、２９匹にひよこは孵化の日に、前述のように経口
栄養により５．６ｘ１０７ＣＦＵのＭＧＮ１７１８によりワクチン接種させた。
１４日後、ワクチン接種させた鳥類は、経口栄養により５．２ｘ１０７ＣＦＵの
ＭＧＮ１７１８にてブーストさせ、２８日目にはすべての鳥類は前記したように
５ｘ１０７ＣＦＵのχ７１２２により攻撃された。４日後、鳥類は安楽死させ、
検死し、新しく、より感度のある評価システムを利用した以外は、前記したよう
に病変を評価し、以下の表７に掲載し、本評価システムを利用した平均病変評価
を次の表８に示す。
トロポレーションにより導入し、菌株ＭＧＮ１７１８［（Δｃｙａ‐２８：：ｒ
ｆｂＯ７８Δｃｒｐ‐２８ΔｒｆｃΔａｓｄ：：ｘｙｌＥ７２９）/ｐＹＡ２９
２、Ｍｏｔ+］を産出した。本例で利用したすべてのチキンは、サンライズファ
ーム（ニューヨーク州キャットスキル）から入手した特定病原性フリー（ＳＰＦ
）チキンからの繁殖力のある卵から孵化させた。２０匹のひよこはＢＳＧにより
みけかけのワクチン接種され、２９匹にひよこは孵化の日に、前述のように経口
栄養により５．６ｘ１０７ＣＦＵのＭＧＮ１７１８によりワクチン接種させた。
１４日後、ワクチン接種させた鳥類は、経口栄養により５．２ｘ１０７ＣＦＵの
ＭＧＮ１７１８にてブーストさせ、２８日目にはすべての鳥類は前記したように
５ｘ１０７ＣＦＵのχ７１２２により攻撃された。４日後、鳥類は安楽死させ、
検死し、新しく、より感度のある評価システムを利用した以外は、前記したよう
に病変を評価し、以下の表７に掲載し、本評価システムを利用した平均病変評価
を次の表８に示す。
【００７７】
【表８】
【００７８】
【表９】 Ｓ．タイフィムリウム担体菌株がＡＰＥＣ菌株による攻撃に対する保護の寄与
するか否かを評価するために、ＭＧＮ１７１８と遺伝学的に非常に類似するがＯ
７８ｒｆｂ遺伝子クラスターを欠如したＭＧＮ１１７５（表１）を利用して、非
常に類似する実験を行った。みかけ上のワクチン接種させたコントロールまたは
ワクチン接種させた鳥類を７．５ｘ１０７ＣＦＵのχ７１２２による攻撃の平均
病変評価を、以下の表９に示す。
するか否かを評価するために、ＭＧＮ１７１８と遺伝学的に非常に類似するがＯ
７８ｒｆｂ遺伝子クラスターを欠如したＭＧＮ１１７５（表１）を利用して、非
常に類似する実験を行った。みかけ上のワクチン接種させたコントロールまたは
ワクチン接種させた鳥類を７．５ｘ１０７ＣＦＵのχ７１２２による攻撃の平均
病変評価を、以下の表９に示す。
【００７９】
【表１０】 ワクチン接種させた鳥類の平均病変評価は、みかけ上ワクチン接種させたコン
トロール鳥類のそれと格別な差異はなかった。この結果から、組換えＳ．タイフ
ィムリウムワクチン菌株ＭＧＮ１７１８及びＭＧＮ１１８０菌株によるＰＡＥＣ
χ７１２２に対する保護は、Ｏ７８大腸菌Ｏ‐抗原の発現に起因することが分か
る。
トロール鳥類のそれと格別な差異はなかった。この結果から、組換えＳ．タイフ
ィムリウムワクチン菌株ＭＧＮ１７１８及びＭＧＮ１１８０菌株によるＰＡＥＣ
χ７１２２に対する保護は、Ｏ７８大腸菌Ｏ‐抗原の発現に起因することが分か
る。
【００８０】 例 ６ 本例では、Ｏ１：Ｋ１：Ｈ７ＡＰＥＣ菌ヵブのフィンブリアオペロンをも発現
するＯ−７８ワクチン菌株の一の実施例の構築及び効能を例示する。
するＯ−７８ワクチン菌株の一の実施例の構築及び効能を例示する。
【００８１】 フィンブリアルオペロンは、ＡＰＥＣ菌株の毒性（Dozois他、Infect. Immun.
60: 2648‐2656, 1992; Dozois他、Avian Dis. 38: 231‐239, 1994; Wooley他
、Av. Dis., 36: 679‐684, 1992）と、特に鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌株
（Gyimah他、Avian Dis. 32: 74‐78、 1988）による鳥類気管上皮細胞によって
重要であるタイプＩフィンブリエとに関連した細胞表面構造である。タイプＩフ
ィンブリエ産出に関係する遺伝子は、Ｏ１：Ｋ１：Ｈ７ＡＰＥＣ単離体からクロ
ーン化され、Ａｓｄ+プラスミドベクター（ｐＹＡ２９２）へ挿入され、連続し
て発現する。生じたプラスミド、ｐＭＥＧ２８７の遺伝子マップを図４に示す。
プラスミドｐＭＥＧ２８７は組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ１７１７（
表１）に導入され、ＭＧＮ１７２０［Δｃｙａ‐２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ
−２８ΔｒｆｃｌΔａｓｄ：ｘｙｌＥ７２９］/ｐＹ２９２、Ｍｏｔ+が産出する
。菌株ＭＧＮ１７２０のタイプＩフィンブリエんの発現は、３７℃で一晩通気培
養させて、酵母凝集アッセイにより確認した（Kofhonen, T. K. FEMS Microl Le
tt, 6: 421‐425, 1979）。タイプＩフィンブリエで予想されたように、凝集は
マンノース感応的であり、コントロール菌株ＭＧＮ１７１８が酵母細胞を凝集さ
せなかった。野性型Ｓ．タイフィムリウム菌株はタイプＩフィンブリエを発現す
るが、菌株ＭＧＮ１７１８による結果は、タイプＩフィンブリエ発現の発現がΔ
ｃｙａΔｃｒｐにより調節され、したがって、Ｃｙａ-Ｃｒｐ-菌株（Saier他、J
. Bacteriol. 134: 356‐358, 1978）にて殆ど発現せず、３７℃での静的成長の
２日後にのみ発現するという事実と一致する。
60: 2648‐2656, 1992; Dozois他、Avian Dis. 38: 231‐239, 1994; Wooley他
、Av. Dis., 36: 679‐684, 1992）と、特に鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌株
（Gyimah他、Avian Dis. 32: 74‐78、 1988）による鳥類気管上皮細胞によって
重要であるタイプＩフィンブリエとに関連した細胞表面構造である。タイプＩフ
ィンブリエ産出に関係する遺伝子は、Ｏ１：Ｋ１：Ｈ７ＡＰＥＣ単離体からクロ
ーン化され、Ａｓｄ+プラスミドベクター（ｐＹＡ２９２）へ挿入され、連続し
て発現する。生じたプラスミド、ｐＭＥＧ２８７の遺伝子マップを図４に示す。
プラスミドｐＭＥＧ２８７は組換えＳ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ１７１７（
表１）に導入され、ＭＧＮ１７２０［Δｃｙａ‐２８：：ｒｆｂＯ７８Δｃｒｐ
−２８ΔｒｆｃｌΔａｓｄ：ｘｙｌＥ７２９］/ｐＹ２９２、Ｍｏｔ+が産出する
。菌株ＭＧＮ１７２０のタイプＩフィンブリエんの発現は、３７℃で一晩通気培
養させて、酵母凝集アッセイにより確認した（Kofhonen, T. K. FEMS Microl Le
tt, 6: 421‐425, 1979）。タイプＩフィンブリエで予想されたように、凝集は
マンノース感応的であり、コントロール菌株ＭＧＮ１７１８が酵母細胞を凝集さ
せなかった。野性型Ｓ．タイフィムリウム菌株はタイプＩフィンブリエを発現す
るが、菌株ＭＧＮ１７１８による結果は、タイプＩフィンブリエ発現の発現がΔ
ｃｙａΔｃｒｐにより調節され、したがって、Ｃｙａ-Ｃｒｐ-菌株（Saier他、J
. Bacteriol. 134: 356‐358, 1978）にて殆ど発現せず、３７℃での静的成長の
２日後にのみ発現するという事実と一致する。
【００８２】 菌株ＭＧＮ１７１８及びＭＧＮ１７２０の効能は、５ｘ１０７ＣＦＵの攻撃投
与量を利用して、前記したのと本質的に同じチキンにて評価し、結果を以下の表
１０に示す。
与量を利用して、前記したのと本質的に同じチキンにて評価し、結果を以下の表
１０に示す。
【００８３】
【表１１】 上記結果は、タイプＩフィンブリエの添加により低い病変評価が起こった。も
とも統計学的には重要ではないが。タイプＩフィンブリエのワクチン菌株への添
加は、Ｏ７８攻撃に対する保護を向上させず、他のＡＰＥＣセロタイプに対する
交差保護をもたらす。
とも統計学的には重要ではないが。タイプＩフィンブリエのワクチン菌株への添
加は、Ｏ７８攻撃に対する保護を向上させず、他のＡＰＥＣセロタイプに対する
交差保護をもたらす。
【００８４】 利用した他のフィンブリエは、ＡＰＥＣ菌株と関連したＦ１１を含むＰタイプ
フィンブリエである（van den Bosch他、Infect . Immun. 61: 800‐806, 1993
）。
フィンブリエである（van den Bosch他、Infect . Immun. 61: 800‐806, 1993
）。
【００８５】 例 ７ 本例は、大腸菌鉄−調節外膜タンパク質をも発現するO７８ワクチン菌株の具
体的な構築を例示する。
体的な構築を例示する。
【００８６】 鉄の利用可能性は動物宿主環境に制限されるので、鉄を排除する能力は、病原
体の重要な生存特徴である（Litwun他、Clin. Microbiol. Rev. 6: 509‐1993;
Peighambari他、 Avian Dis. 39: 116‐124, 1995）。数多くの鉄応答遺伝子は
外膜タンパク質（以下、「ＯＭＰ」という）をコードし、その多くはバクテリア
若しくは宿主により産出される鉄キレート化合物のレセプターとして作用する（
Bagg他、Microbiol. Rev. 51: 509‐518, 1987）。
体の重要な生存特徴である（Litwun他、Clin. Microbiol. Rev. 6: 509‐1993;
Peighambari他、 Avian Dis. 39: 116‐124, 1995）。数多くの鉄応答遺伝子は
外膜タンパク質（以下、「ＯＭＰ」という）をコードし、その多くはバクテリア
若しくは宿主により産出される鉄キレート化合物のレセプターとして作用する（
Bagg他、Microbiol. Rev. 51: 509‐518, 1987）。
【００８７】 鉄−調節ＯＭＰは抗原性であり、大腸菌鉄−調節ＯＭＰに対する抗体は健康な
ヒト、ラビット、マウス及びモルモットにて検出されていた（Griffiths他、Inf
ect. Immun. 47: 808‐813, 1985）。大腸菌鉄−調節ＯＭＰに対して育成させた
抗体は、鳥類病原性Ｏ７８大腸菌によるその後の攻撃に対して七面鳥を受動的に
保護し（Bolin他、Infect. Immun. 55: 1239‐1242, 1987）、上記タンパク質は
保護的抗原であることが分かる。
ヒト、ラビット、マウス及びモルモットにて検出されていた（Griffiths他、Inf
ect. Immun. 47: 808‐813, 1985）。大腸菌鉄−調節ＯＭＰに対して育成させた
抗体は、鳥類病原性Ｏ７８大腸菌によるその後の攻撃に対して七面鳥を受動的に
保護し（Bolin他、Infect. Immun. 55: 1239‐1242, 1987）、上記タンパク質は
保護的抗原であることが分かる。
【００８８】 ワクチン抗原の優秀な候補は、鉄応答性７８‐ｋＤａＯＭＰＩｕｔＡである。
ＩｕｔＡはアエロバクチン及びクロアチンのレセプターである（Bagg他、Microb
iol. Rev. 51: 509‐518, 1987）。アエロバクチンの合成は、ヒト及び哺乳類（
Litwim他、Clin. Microbiol. Rev. 6: 509‐518, 1993; Payne, S. M., Crit.
Ｒｅｖ。Microbiol. 16: 81‐111, 1998）、並びに鳥類（Dho他、Avian Dis. 28
: 1016‐1025; Emery他、36: 504‐511, 1992; Lafont他、Infect. Immun. 55:
193‐197, 1987, Linggood他、J. Gen. Microbiol. 133: 835‐842, 1987; Wool
ey他、Av. Dis. 36: 679‐684, 1992）の大腸菌毒性と直接相関関係がある。ア
エロバクチンは項親和性の鉄摂取システムの成分であり（Gabb他、Microbiol. R
ev. 51: 509‐518、1987）、病原性生物体中でのその有病率を原因である。鳥類
大腸菌単離体の数多くの研究から、８０％以上の病原性単離体がアエロバクチン
を産出することが判明しているのに対し（Dho他、前掲；Emery他、前掲；Lafont
他、前掲；Yokoyama他、前掲）、非病原性菌株中では稀である。アエロバクチン
合成の遺伝子は、ＣｏｌＶプラスミドにて頻繁に発見され、したがって、コリシ
ンＶ産出としっかりと関連している（Bagg他、前掲）。
ＩｕｔＡはアエロバクチン及びクロアチンのレセプターである（Bagg他、Microb
iol. Rev. 51: 509‐518, 1987）。アエロバクチンの合成は、ヒト及び哺乳類（
Litwim他、Clin. Microbiol. Rev. 6: 509‐518, 1993; Payne, S. M., Crit.
Ｒｅｖ。Microbiol. 16: 81‐111, 1998）、並びに鳥類（Dho他、Avian Dis. 28
: 1016‐1025; Emery他、36: 504‐511, 1992; Lafont他、Infect. Immun. 55:
193‐197, 1987, Linggood他、J. Gen. Microbiol. 133: 835‐842, 1987; Wool
ey他、Av. Dis. 36: 679‐684, 1992）の大腸菌毒性と直接相関関係がある。ア
エロバクチンは項親和性の鉄摂取システムの成分であり（Gabb他、Microbiol. R
ev. 51: 509‐518、1987）、病原性生物体中でのその有病率を原因である。鳥類
大腸菌単離体の数多くの研究から、８０％以上の病原性単離体がアエロバクチン
を産出することが判明しているのに対し（Dho他、前掲；Emery他、前掲；Lafont
他、前掲；Yokoyama他、前掲）、非病原性菌株中では稀である。アエロバクチン
合成の遺伝子は、ＣｏｌＶプラスミドにて頻繁に発見され、したがって、コリシ
ンＶ産出としっかりと関連している（Bagg他、前掲）。
【００８９】 ｐＣＯＩＶ‐Ｋ３０からのＩｕｔＡクローンはプラスミドｐＦＳ８として利用
可能である（Krone他、J. Bacteriol。 153: 716‐721、 1983）。ｉｕｔＡ遺伝子
はｐＦＳ８からＡｓｄ+プラスミドベクターｐＹＡ２９２へサブクローン化され
、ｐＭＥＧ０５５（図５）が生じ、Ｓ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ９９６のΔ
ａｓｄ誘導体へ導入された。ウエスタンブロット解析の結果から、ＩｕｔＡタン
パク質は構成成分として発現され、その発現はＬ肉汁にて５０世代以上安定であ
った。
可能である（Krone他、J. Bacteriol。 153: 716‐721、 1983）。ｉｕｔＡ遺伝子
はｐＦＳ８からＡｓｄ+プラスミドベクターｐＹＡ２９２へサブクローン化され
、ｐＭＥＧ０５５（図５）が生じ、Ｓ．タイフィムリウム菌株ＭＧＮ９９６のΔ
ａｓｄ誘導体へ導入された。ウエスタンブロット解析の結果から、ＩｕｔＡタン
パク質は構成成分として発現され、その発現はＬ肉汁にて５０世代以上安定であ
った。
【００９０】 発現された他の外膜タンパク質には、鉄−調節外膜タンパク質であるＦｅｐＡ
、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、ＦｅｃＡ、及び血清耐性に関係するタンパク質Ｉｓｓが
ある。
、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＡ、ＦｅｃＡ、及び血清耐性に関係するタンパク質Ｉｓｓが
ある。
【００９１】 本願明細書で引用したすべての文献は引用文献として援用される。本願での文
献の説明は著者らによる主張を要約したものであり，文献の正確性又は関連性、
又は特許性に重要な及ぼす影響に関しては完全なものでない。
献の説明は著者らによる主張を要約したものであり，文献の正確性又は関連性、
又は特許性に重要な及ぼす影響に関しては完全なものでない。
【図１】 以下の特徴を示す自殺コスミドｐＭＥＧ２１９の遺伝子マップであり、その特
徴とは、複製のｐｉｒ依存オリジンと、Ｔｎ１０（ｔｅｔＲ，ｔｅｔＡ）からの
テトラサイクリン耐性遺伝子と、プラスミドＲＫ２（ｍｏｂ）からの動態化断片
と、ｐＣＯＳ２ＥＭＢＬからのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）及び二重ｃｏ
ｓ部位と、Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ−２７対立遺伝子とが、テキストに記
載したＮｏｔＩ及びＰｖｕＩＩ制限部位の位置にある。
徴とは、複製のｐｉｒ依存オリジンと、Ｔｎ１０（ｔｅｔＲ，ｔｅｔＡ）からの
テトラサイクリン耐性遺伝子と、プラスミドＲＫ２（ｍｏｂ）からの動態化断片
と、ｐＣＯＳ２ＥＭＢＬからのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）及び二重ｃｏ
ｓ部位と、Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ−２７対立遺伝子とが、テキストに記
載したＮｏｔＩ及びＰｖｕＩＩ制限部位の位置にある。
【図２】 アンチ‐Ｓ．タイフィムリムグループＢ ＬＰＳ抗体（図２Ａ）又はアンチ‐
Ｏ７８ ＬＰＳ抗体でプローブしたバクテリア菌株からのＬＰＳ単離されたウエ
スタンブロットのデジタル画像である。
Ｏ７８ ＬＰＳ抗体でプローブしたバクテリア菌株からのＬＰＳ単離されたウエ
スタンブロットのデジタル画像である。
【図３】 図３Ａに示すブロットのゲルに含有された分子量マーカを有し、アンチ‐Ｓ．
タイフィムリウムグループＢ ＬＰＳ抗体（図３Ａ）、又はアンチ‐Ｏ７８ Ｌ
ＰＳ抗体（図３Ｂ）でプローブさせたバクテリア菌株からのＬＰＳ単離されたウ
エスタンブロットのデジタル化画像である。
タイフィムリウムグループＢ ＬＰＳ抗体（図３Ａ）、又はアンチ‐Ｏ７８ Ｌ
ＰＳ抗体（図３Ｂ）でプローブさせたバクテリア菌株からのＬＰＳ単離されたウ
エスタンブロットのデジタル化画像である。
【図４】 テキストにて説明する遺伝子の位置を示すｐＭＥＧ２８７の遺伝子マップであ
る。
る。
【図５】 テキストにて説明する遺伝子の位置を示すｐＭＥＧ０５５の遺伝子マップであ
る。
る。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１８日（２０００．８．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、
Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と
、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテ
ラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレ
ビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムから
の鳥類病原性種とからなる群から選択された鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ
）微生物に対して鳥類の免疫化用のワクチンであって、ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐
抗原を発現し、サルモネラ染色体へ安定的に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆ
ｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させ
るサルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然
変異を有する組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ
菌株は鳥類をコロニー化させることができるビルレントサルモネラ菌株の弱毒化
突然変異体であるワクチン。
Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と
、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテ
ラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレ
ビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムから
の鳥類病原性種とからなる群から選択された鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ
）微生物に対して鳥類の免疫化用のワクチンであって、ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐
抗原を発現し、サルモネラ染色体へ安定的に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆ
ｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させ
るサルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然
変異を有する組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ
菌株は鳥類をコロニー化させることができるビルレントサルモネラ菌株の弱毒化
突然変異体であるワクチン。
【請求項７】 サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させる突然変異は、サ
ルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターの突然変異である、請求項１に記載のワクチン
。
ルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターの突然変異である、請求項１に記載のワクチン
。
【請求項８】 前記組換えサルモネラ菌株は所望の遺伝子産出物をコードす
る組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１に記載のワクチン。
る組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】 前記所望の遺伝子産出物は鳥類病原性生物体からの抗原であ
る、請求項８に記載のワクチン。
る、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】 前記鳥類病原性生物体は鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌
株であり、前記抗原はフィンブリア又はＡＰＥＣ菌株の鉄−調節外膜タンパク質
である、請求項９に記載のワクチン。
株であり、前記抗原はフィンブリア又はＡＰＥＣ菌株の鉄−調節外膜タンパク質
である、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】 大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５
、 １８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と、
サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテラ
、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレビ
セラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムからの
鳥類病原性種とからなる群から選択された 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）
微生物に対する鳥類の免疫化方法であって、前記ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を
発現し、サルモネラ染色体に安定に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ
遺伝子クラスタを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラ
ｒｆｂ遺伝子クラスターに又はサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換
えサルモネラ菌株の生きた細胞を含むワクチンの免疫原性に有効な量を前記鳥類
に投与する工程を含み、前記組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化させるこ
とができるサルモネラ菌株のビルレント菌株の弱毒化突然変異体である免疫化方
法。
、 １８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と、
サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテラ
、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレビ
セラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムからの
鳥類病原性種とからなる群から選択された 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）
微生物に対する鳥類の免疫化方法であって、前記ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を
発現し、サルモネラ染色体に安定に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ
遺伝子クラスタを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラ
ｒｆｂ遺伝子クラスターに又はサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換
えサルモネラ菌株の生きた細胞を含むワクチンの免疫原性に有効な量を前記鳥類
に投与する工程を含み、前記組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化させるこ
とができるサルモネラ菌株のビルレント菌株の弱毒化突然変異体である免疫化方
法。
【請求項１２】 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物は鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌
株である、請求項１１に記載の免疫化方法。
株である、請求項１１に記載の免疫化方法。
【請求項１３】 前記組込みＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターは、
ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐ
ｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃ
ｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択
されたサルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項１２に記載の免疫化方
法。
ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐ
ｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃ
ｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択
されたサルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項１２に記載の免疫化方
法。
【請求項１４】 前記弱毒化突然変異はサルモネラｃｙａ遺伝子に明確な欠
失/挿入突然変異である、請求項１３に記載の免疫化方法。
失/挿入突然変異である、請求項１３に記載の免疫化方法。
【請求項１５】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラｃｒｐ遺伝子に弱
毒化突然変異をも有する、請求項１４に記載の免疫化方法。
毒化突然変異をも有する、請求項１４に記載の免疫化方法。
【請求項１６】 前記ＡＰＥＣ菌株はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５及びＯ７８のセロ
タイプを有する、請求項１５に記載の免疫化方法。
タイプを有する、請求項１５に記載の免疫化方法。
【請求項１７】 サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させる突然変異は、
サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターの突然変異である、請求項１１に記載の免疫
化方法。
サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターの突然変異である、請求項１１に記載の免疫
化方法。
【請求項１８】 前記組換えサルモネラ菌株は所望の遺伝子産出物をコード
する組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１１に記載の免疫化方法。
する組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１１に記載の免疫化方法。
【請求項１９】 前記鳥類はチキン又は七面鳥である、請求項１１に記載の
免疫化方法。
免疫化方法。
【請求項２０】 前記ワクチンは孵化後に粗雑なスプレイにより投与される
、請求項１９に記載の免疫化方法。
、請求項１９に記載の免疫化方法。
【請求項２１】 ワクチンのブースター量を前記鳥類に経口投与することを
さらに含む、請求項２０に記載の免疫化方法。
さらに含む、請求項２０に記載の免疫化方法。
【請求項２２】 前記ブースター量は孵化後１３、１４又は１５日目に投与
される、請求項２１に記載の免疫化方法。
される、請求項２１に記載の免疫化方法。
【請求項２３】 少なくとも二つの鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微
生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンであって、第一のＡＰＧ-Ｎ微生物
のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第一のＡＰＧ-Ｎ微生物の
ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第一の組換えサルモネラ菌株と、第二
のＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第二の
ＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第二の組換えサルモ
ネラ菌株との生きた細胞の混合物を含み、各々の第一及び第二の組換えサルモネ
ラ菌株は、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化するサルモネラｒｆｂ遺伝子ク
ラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有し、前記第一のＡＰ Ｇ-Ｎ 微生物及び前記第二のＡＰＧ-Ｎ微生物は、大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、
Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、
サルモネラグループＣ菌株と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター
、バクテリオデス、ボルデテラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセ
ラ、アクチノバチルス、クレビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又
はオルニソバクテリウムからの鳥類病原性種とからなる群から選択され、各々の
第一及び第二の組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化させることができるビ
ルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチン。
生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンであって、第一のＡＰＧ-Ｎ微生物
のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第一のＡＰＧ-Ｎ微生物の
ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第一の組換えサルモネラ菌株と、第二
のＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第二の
ＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第二の組換えサルモ
ネラ菌株との生きた細胞の混合物を含み、各々の第一及び第二の組換えサルモネ
ラ菌株は、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化するサルモネラｒｆｂ遺伝子ク
ラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有し、前記第一のＡＰ Ｇ-Ｎ 微生物及び前記第二のＡＰＧ-Ｎ微生物は、大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、
Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、
サルモネラグループＣ菌株と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター
、バクテリオデス、ボルデテラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセ
ラ、アクチノバチルス、クレビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又
はオルニソバクテリウムからの鳥類病原性種とからなる群から選択され、各々の
第一及び第二の組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化させることができるビ
ルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチン。
【請求項２４】 少なくとも二つの鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微
生物の各々の微生物が、大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１
５、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌
株と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボル
デテラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、
クレビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウム
からの鳥類病原性種とからなる群から選択された微生物に対して鳥類の免疫化の
ためのワクチンであって、各々のＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモ
ネラ染色体へ安定に組込んだ各々のＡＰＧ-Ｎ微生物ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラス
ターを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｂ遺伝
子クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサル
モネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化
させることができるビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチ
ン。
生物の各々の微生物が、大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１
５、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌
株と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボル
デテラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、
クレビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウム
からの鳥類病原性種とからなる群から選択された微生物に対して鳥類の免疫化の
ためのワクチンであって、各々のＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモ
ネラ染色体へ安定に組込んだ各々のＡＰＧ-Ｎ微生物ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラス
ターを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｂ遺伝
子クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサル
モネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ菌株は鳥類をコロニー化
させることができるビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチ
ン。
【請求項２５】 大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５
、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株
と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデ
テラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、ク
レビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムか
らの鳥類病原性種とからなる群から選択された鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-
Ｎ）微生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンの製造方法であって、 （ａ） 前記鳥類をコロニー化させることができるサルモネラ菌株を選択する
選択工程と、 （ｂ） 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物からｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターをサルモネ
ラ染色体へ組込む組込工程と、 （ｃ） サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺伝
子へ突然変異を導入する導入工程と、 （ｄ） ＡＰＥＣ菌株に特徴的なＯ‐抗原を発現するがサルモネラＯ‐抗原を
発現しない組換えサルモネラバクテリアを単離する単離工程とを具備し、 前記工程（ｂ）及び（ｃ）はいずれかの順序で行われる製造方法。
、Ｏ１８、Ｏ３５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株
と、サルモネラグループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデ
テラ、ハエモフィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、ク
レビセラ、モラセラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムか
らの鳥類病原性種とからなる群から選択された鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-
Ｎ）微生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンの製造方法であって、 （ａ） 前記鳥類をコロニー化させることができるサルモネラ菌株を選択する
選択工程と、 （ｂ） 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物からｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターをサルモネ
ラ染色体へ組込む組込工程と、 （ｃ） サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺伝
子へ突然変異を導入する導入工程と、 （ｄ） ＡＰＥＣ菌株に特徴的なＯ‐抗原を発現するがサルモネラＯ‐抗原を
発現しない組換えサルモネラバクテリアを単離する単離工程とを具備し、 前記工程（ｂ）及び（ｃ）はいずれかの順序で行われる製造方法。
【請求項２６】 前記選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌
株の弱毒化突然変異体である、請求項２５に記載の製造方法。
株の弱毒化突然変異体である、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】 前記選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌
株であり、ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇ
ａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる
群から選択されたサルモネラ遺伝子の弱毒化突然変異をビルレントサルモネラ菌
株に導入する導入工程と、次いで、前記ビルレントサルモネラ菌株に比較して弱
毒化毒性を有する突然変異体を単離する単離工程とをさらに具備する、請求項２
６に記載の製造方法。
株であり、ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇ
ａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる
群から選択されたサルモネラ遺伝子の弱毒化突然変異をビルレントサルモネラ菌
株に導入する導入工程と、次いで、前記ビルレントサルモネラ菌株に比較して弱
毒化毒性を有する突然変異体を単離する単離工程とをさらに具備する、請求項２
６に記載の製造方法。
【請求項２８】 前記（Ｃ）工程は突然変異を前記サルモネラｒｆｂい電子
クラスターへ導入することを含む、請求項２５に記載の製造方法。
クラスターへ導入することを含む、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２９】 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微生物に対して鳥類
の免疫化用のワクチンであって、ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモ
ネラ染色体へ安定的に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラス
ターを有する組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ
菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であり、前記ＡＰＧ-Ｎ微
生物は大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、Ｏ３
５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と、サルモネラ
グループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテラ、ハエモフ
ィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレビセラ、モラ
セラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムからの鳥類病原性
種とからなる群から選択されたワクチン。
の免疫化用のワクチンであって、ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモ
ネラ染色体へ安定的に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラス
ターを有する組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ
菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であり、前記ＡＰＧ-Ｎ微
生物は大腸菌セロタイプＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１８、Ｏ３
５、Ｏ７１、Ｏ７４、又はＯ７８と、サルモネラグループＣ菌株と、サルモネラ
グループＤ菌株と、カムピロバクター、バクテリオデス、ボルデテラ、ハエモフ
ィルス、パスシューレア、フランシセラ、アクチノバチルス、クレビセラ、モラ
セラ、シュードモノス、プロテウス又はオルニソバクテリウムからの鳥類病原性
種とからなる群から選択されたワクチン。
【請求項３０】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラタイフィムリウム
、サルモネラエンテリディティス、サルモネラハイデルベルグ、サルモネラガリ
ナルム、サルモネラハーダ、サルモネラアゴナ、サルモネラケンタッキー及びサ
ルモネラインファンティスからなる群から選択される、請求項２９に記載のワク
チン。
、サルモネラエンテリディティス、サルモネラハイデルベルグ、サルモネラガリ
ナルム、サルモネラハーダ、サルモネラアゴナ、サルモネラケンタッキー及びサ
ルモネラインファンティスからなる群から選択される、請求項２９に記載のワク
チン。
【請求項３１】 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物は鳥類病原性大腸菌菌株である、請
求項２９に記載のワクチン。
求項２９に記載のワクチン。
【請求項３２】 前記組込みＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターは、
ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐ
ｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃ
ｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択
されたサルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項３１に記載のワクチン
。
ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐ
ｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃ
ｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択
されたサルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項３１に記載のワクチン
。
【請求項３３】 前記弱毒化突然変異はサルモネラｃｙａ遺伝子の明確な欠
失/挿入突然変異である、請求項３２に記載のワクチン。
失/挿入突然変異である、請求項３２に記載のワクチン。
【請求項３４】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラｃｒｐ遺伝子に弱
毒化突然変異をも有する、請求項３３に記載のワクチン。
毒化突然変異をも有する、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３５】 前記ＡＰＥＣ菌株はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５又はＯ７８のセロ
タイプを有する、請求項３４に記載のワクチン。
タイプを有する、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】 前記組換えサルモネラ菌株は所望の遺伝子産出物をコード
する組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項２９に記載のワクチン。
する組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項２９に記載のワクチン。
【請求項３７】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラタイフィムリウム
、サルモネラエンテリディティス、サルモネラハイデルベルグ、サルモネラガリ
ナルム、サルモネラハーダ、サルモネラアゴナ、サルモネラケンタッキー及びサ
ルモネラインファンティスからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチ
ン。
、サルモネラエンテリディティス、サルモネラハイデルベルグ、サルモネラガリ
ナルム、サルモネラハーダ、サルモネラアゴナ、サルモネラケンタッキー及びサ
ルモネラインファンティスからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチ
ン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】 発明の好適な実施例は以下の例にて説明する。本願の特許請求の範囲内の他の
実施例は、本願で開示する明細書又は発明の実施形態を熟慮すれば、当業者には
明白である。特許請求の範囲内で、例とともに明細書は例示的でのみある。
実施例は、本願で開示する明細書又は発明の実施形態を熟慮すれば、当業者には
明白である。特許請求の範囲内で、例とともに明細書は例示的でのみある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】削除
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ
Claims (25)
- 【請求項１】 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微生物に対して鳥類の
免疫化用のワクチンであって、ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモネ
ラ染色体へ安定的に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスタ
ーを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｂ遺伝子
クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサルモ
ネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサルモネラ菌株はビルレントサルモネ
ラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチン。 - 【請求項２】 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物は鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌株
である、請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項３】 組込みＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターは、ｐａｂ
、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、
ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、
ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択された
サルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項２に記載のワクチン。 - 【請求項４】 前記弱毒化突然変異はサルモネラｃｙａ遺伝子に明確な欠質
/挿入突然変異である、請求項３に記載のワクチン。 - 【請求項５】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラｃｒｐ遺伝子に弱毒
化突然変異をも有する、請求項４に記載のワクチン。 - 【請求項６】 前記ＡＰＥＣ菌株はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５又はＯ７８のセロタ
イプを有する、請求項５に記載のワクチン。 - 【請求項７】 前記組換えサルモネラ菌株は所望の遺伝子産出物をコードす
る組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項８】 前記所望の遺伝子産出物は鳥類病原性生物体からの抗原であ
る、請求項７に記載のワクチン。 - 【請求項９】 前記鳥類病原性生物体は鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌株
であり、前記抗原はフィンブリア又はＡＰＥＣ菌株の鉄−調節外膜タンパク質で
ある、請求項８に記載のワクチン。 - 【請求項１０】 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微生物に対する鳥類
の免疫化方法であって、前記ＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ
染色体に安定に組込まれたＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスタを有
し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化させるサルモネラｒｆｂ遺伝子クラス
ターに又はサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有する組換えサルモネラ菌株の
生きた細胞を含むワクチンの免疫原性に有効な量を前記鳥類に投与する工程を含
み、前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラ菌株のビルレント菌株の弱毒化突然
変異体である免疫化方法。 - 【請求項１１】 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物は鳥類病原性大腸菌（ＡＰＥＣ）菌
株である、請求項１０に記載の免疫化方法。 - 【請求項１２】 前記組込みＡＰＥＣｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターは、
ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐ
ｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃ
ｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる群から選択
されたサルモネラ遺伝子に弱毒化突然変異を含む、請求項１１に記載の免疫化方
法。 - 【請求項１３】 前記弱毒化突然変異はサルモネラｃｙａ遺伝子に明確な欠
失/挿入突然変異である、請求項１２に記載の免疫化方法。 - 【請求項１４】 前記組換えサルモネラ菌株はサルモネラｃｒｐ遺伝子に弱
毒化突然変異をも有する、請求項１３に記載の免疫化方法。 - 【請求項１５】 前記ＡＰＥＣ菌株はＯ１、Ｏ２、Ｏ３５及びＯ７８のセロ
タイプを有する、請求項１４に記載の免疫化方法。 - 【請求項１６】 前記組換えサルモネラ菌株は所望の遺伝子産出物をコード
する組換えポリヌクレオチドをも有する、請求項１０に記載の免疫化方法。 - 【請求項１７】 前記鳥類はチキン又は七面鳥である、請求項１０に記載の
免疫化方法。 - 【請求項１８】 前記ワクチンは孵化後に粗雑なスプレイにより投与される
、請求項１７に記載の免疫化方法。 - 【請求項１９】 ワクチンのブースター量を前記鳥類に経口投与することを
さらに含む、請求項１８に記載の免疫化方法。 - 【請求項２０】 前記ブースター量は孵化後１３、１４又は１５日目に投与
される、請求項１９に記載の免疫化方法。 - 【請求項２１】 少なくとも二つの鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微
生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンであって、第一のＡＰＧ-Ｎ微生物
のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第一のＡＰＧ-Ｎ微生物の
ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第一の組換えサルモネラ菌株と、第二
のＡＰＧ-Ｎ微生物のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ組込まれた第二の
ＡＰＧ-Ｎ微生物のｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有する第二の組換えサルモ
ネラ菌株との生きた細胞の混合物を含み、各々の第一及び第二の組換えサルモネ
ラ菌株は、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性化するサルモネラｒｆｂ遺伝子ク
ラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子に突然変異を有し、各々の第一及び
第二の組換えサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体で
あるワクチン。 - 【請求項２２】 少なくとも二つの鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微
生物に対して鳥類の免疫化のためのワクチンであって、各々のＡＰＧ-Ｎ微生物
のＯ‐抗原を発現し、サルモネラ染色体へ安定に組込んだ各々のＡＰＧ-Ｎ微生
物ｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターを有し、サルモネラＯ‐抗原の発現を不活性
化させるサルモネラｒｆｂ遺伝子クラスターに若しくはサルモネラｒｆｃ遺伝子
に突然変異を有する組換えサルモネラ菌株の生きた細胞を含み、前記組換えサル
モネラ菌株はビルレントサルモネラ菌株の弱毒化突然変異体であるワクチン。 - 【請求項２３】 鳥類病原性グラム陰性（ＡＰＧ-Ｎ）微生物に対して鳥類
の免疫化のためのワクチンの製造方法であって、 （ａ） 前記鳥類をコロニー化させることができるサルモネラ菌株を選択する
選択工程と、 （ｂ） 前記ＡＰＧ-Ｎ微生物からｒｆｂ/ｒｆｃ遺伝子クラスターをサルモネ
ラ染色体へ組込む組込工程と、 （ｃ） サルモネラｒｆｂ遺伝子クラスター及び/又はサルモネラｒｆｃ遺伝
子へ突然変異を導入する導入工程と、 （ｄ） ＡＰＥＣ菌株に特徴的なＯ‐抗原を発現するがサルモネラＯ‐抗原を
発現しない組換えサルモネラバクテリアを単離する単離工程とを具備し、 前記工程（ｂ）及び（ｃ）はいずれかの順序で行われる製造方法。 - 【請求項２４】 前記選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌
株の弱毒化突然変異体である、請求項２３に記載の製造方法。 - 【請求項２５】 前記選択されたサルモネラ菌株はビルレントサルモネラ菌
株であり、ｐａｂ、ｐｕｒ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｄａｐ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｇ
ａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ及びｇａｌＵからなる
群から選択されたサルモネラ遺伝子の弱毒化突然変異をビルレントサルモネラ菌
株に導入する導入工程と、次いで、前記ビルレントサルモネラ菌株に比較して弱
毒化毒性を有する突然変異体を単離する単離工程とをさらに具備する、請求項２
４に記載の製造方法。
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| MX2008013451A (es) * | 2006-04-17 | 2008-10-30 | Schering Plough Ltd | Organismos clostridium atenuados recombinantes y vacuna. |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| US20080115830A1 (en) * | 2006-11-22 | 2008-05-22 | High Power-Factor Ac/Dc Converter With Parallel Power Processing | Test device for solar concentrator module |
| US20080260777A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Sotomayor Konky | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
| US7935355B2 (en) * | 2007-04-19 | 2011-05-03 | Nutritional Health Institute Laboratories, Llc | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
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| US20100317084A1 (en) * | 2007-05-10 | 2010-12-16 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacteria comprising vectors for expression of nucleic acid sequences encoding antigens |
| US8465755B2 (en) * | 2007-10-05 | 2013-06-18 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens |
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| US9045742B2 (en) * | 2009-05-29 | 2015-06-02 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant Edwardsiella bacterium |
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| CN101920011A (zh) * | 2010-06-29 | 2010-12-22 | 西北农林科技大学 | 表达ibdv免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法 |
| US9303264B2 (en) | 2012-05-18 | 2016-04-05 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase |
| EP2879700B1 (en) | 2012-09-06 | 2017-06-07 | EveliQure Biotechnologies GmbH | A novel live attenuated shigella vaccine |
| CN104093419B (zh) * | 2012-09-24 | 2016-04-20 | 河北科星药业有限公司 | 预防禽类大肠杆菌病的广谱菌苗的制备方法 |
| CN103055310B (zh) * | 2013-02-04 | 2014-01-08 | 齐鲁动物保健品有限公司 | 一种禽流感（h9 亚型）、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗及其制备方法 |
| US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
| US9580718B2 (en) | 2013-06-17 | 2017-02-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof |
| WO2015103104A1 (en) * | 2014-01-06 | 2015-07-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Attenuated salmonella enterica |
| KR101660294B1 (ko) * | 2014-01-08 | 2016-09-27 | 전남대학교 산학협력단 | glmS 기반의 숙주 벡터 시스템 |
| US9737592B1 (en) | 2014-02-14 | 2017-08-22 | David Gordon Bermudes | Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| CN105132350B (zh) * | 2015-09-30 | 2018-03-16 | 四川农业大学 | 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建方法及其所得菌株和应用 |
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