CN105524862A - 鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌<i>spiC-rfaJ</i>双基因敲除减毒株及其制备与应用。所述减毒株为<i>spiC</i>基因和<i>rfaJ</i>基因都不表达的鸡白痢沙门菌。本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短。采用所述减毒株制备鸡白痢沙门菌活疫苗，鸡只接种所述疫苗后，无不良反应，可有效清除强毒力菌株感染。宿主不产生针对O-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原，可有效地应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分，具有DIVA疫苗的特征。

Description

鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用

技术领域

本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌(SalmonellaPullorum)引起的一种多发性传染病，对我国的养鸡业危害极大。该病原菌除了能够水平传播，还可经蛋垂直传播而导致孵化率和出雏率的降低，多侵害20日龄以内雏鸡，以白色下痢为特征，表现急性败血症经过，发病率和病死率相当高；成年鸡多为慢性或隐性感染，一般无明显临诊症状。防治此病的传统方法是使用抗生素类药物，长期使用易引起药物残留和细菌耐药性增强等诸多影响，因此，以疫苗预防鸡白痢的研究颇受重视。

根据长期以来对鸡白痢沙门菌防控措施的探索和实践，鸡白痢沙门菌的控制依赖一个地区的感染程度。感染水平低或可实施检疫淘汰制度的地区可采取血清学检测和扑杀的办法控制鸡白痢，感染水平高或者无法进行淘汰扑杀的地区考虑使用疫苗。因此，理想的鸡白痢沙门菌减毒活疫苗除了应具备安全性和有效性外，最好还应具备DIVA(DifferentiationofInfectedandVaccinatedAnimals,DIVA)的特点，即通过简单有效的血清学检测方法，就能区分疫苗免疫动物和自然感染动物，以指导生产现场的疫苗使用。O-抗原是革兰阴性菌细胞最外层结构脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的主要组成部分，不仅是病原菌的致病因子，其特异多糖重复单元的数目差异也是O-血清分型的依据。基于LPS特异性的玻板凝集试验以其简单易行的操作特点，目前在国内外被广泛用于鸡白痢的检疫诊断。综上所述，O-抗原可作为新型鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的操作靶点和选择标志，用以构建DIVA疫苗。

DIVA活疫苗已在畜禽中成功应用于防止病毒感染。

重组自杀质粒技术和Red同源重组技术作为基因突变方法已经被广泛应用于细菌的基因敲除与基因替换。沙门菌spiC与致病性密切相关，rfaJ参与细菌LPS的生物合成。双基因敲除极大地降低了减毒活疫苗在实际应用过程中发生回复突变的可能性，在不影响免疫原性的前提下，最大程度的规避毒力返祖的风险，保证了疫苗的安全性。

发明内容

鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfaJ基因都不表达的鸡白痢沙门菌。

优选的，所述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfaJ基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。

鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。spiC基因为现有技术，具体信息为：Accession:JN673268.1；GI:374304599。rfaJ基因为现有技术，具体信息为：ACCESSION:CP006575；REGION:3931100..3932113。

只要将鸡白痢沙门菌中的spiC基因和rfaJ基因都进行敲除，使得spiC基因和rfaJ基因都不表达，即可获得鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株。

优选地，本发明一实施例中，被敲除的spiC基因的序列如SEQIDNO.1所示，具体为：

TCTGAGGAGGGATTCATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAAGGCCGAAGGTAATAGCCGATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCTTAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTACATGATTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTATTGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATTCGGGTGGGGTATAA。

优选地，本发明一实施例中，被敲除的rfaJ基因的序列如SEQIDNO.2所示，具体为：

ATGGATTCATTTCCTGAGATAGAAATAGCTGAATATAAAGTTTTTGATGAAAGTAATAATAATAATGATGATAACGTATTAAACATTTCTTATGGTGCTGATGAAAACTATCTTGATGGTGTGGGGGTATCAATCGCTTCAGTTGTATTAAACAATAATATCCCGCTCGCTTTTCACATTATTTGTGATTCATACTCCCCGTGTTTTGTAAAATATATAGAGCGTTTAGCCGTACAGCATCACATAAAAATTTCTCTTTATCTTATTAAAGTAGAAAGCCTTGAGGTATTGCCTCAAACTAAAGTATGGTCGAGAGCAATGTATTTTCGTTTATTTGCTTTCGATTATCTCAGCAAGAAGGTAAATACCTTACTTTATTTGGATGCCGATGTTGTATGCAAAGGATCTTTGCAAGATCTTCTACGGCTTGATTTGACAGAGAAGATTGCTGCGGTCGTAAAAGATGTTGATTCCATCCAGAATAAGGTAAATGAGAGATTAAGCGCTTTTAATTTACAAGGTGGTTATTTTAACTCCGGCGTGGTTTTTGTTAACCTGAAATTATGGAAAGAGAATGCCTTAACCAAAAAGGCATTTTTACTTTTGGCAGGTAAAGAGGCTGACTCTTTTAAATATCCCGATCAGGATGTTTTGAATATTCTCCTACAGGATAAAGTCATTTTTCTACCGCGACCATATAATACCATTTATACTATCAAAAGTGAGTTGAAAGATAAGTCACATAAAAAATATAGCAATATAATTAATGATAATACTGTTTTAATTCATTATACGGGCGCTACAAAACCATGGCATGCCTGGGCAAATTATCCTTCAGTTATCTATTATAAAAATGCACGACTGAACTCGCCCTGGAAAGATTCTCCTGCAAAAGATGCGCGTACCATAGTCGAATTTAAGAAGCGATATAAACATCTTCTCGTGCAGGGTCATTATTTTAAAGGCCTTATGGCTGGAAGCGCATATCTTTATCGTAAACTTTTCCACAAATAA。

进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除spiC基因和rfaJ基因双敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。

基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。

优选地，本发明另一实施例中，如SEQIDNO.2所示的rfaJ基因被敲除并替换为FRT位点序列。所述FRT位点序列如SEQIDNO.3所示，具体为：

Tgggaattagccatggtccatatgaatatcctccttagttcctattccgaagttcctattctctagaagtataggaacttcgaagctgctccagcctaca。

上述FRT位点序列的引入，并不影响鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株的性能。

本发明的第二方面，提供了前述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株的构建方法，包括步骤：将鸡白痢沙门菌中的spiC基因和rfaJ基因都敲除。

可以采用现有的基因编辑方法敲除所述spiC基因和rfaJ基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除spiC基因和rfaJ基因。在优选的实施例中，采用Red同源重组的方法敲除spiC基因和rfaJ基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。

基于spiC基因的敲除，spiC基因的完整序列从染色体DNA中去除；基于rfaJ基因的敲除，rfaJ基因的完整序列从染色体DNA中被去除。

在一实施例中，先构建spiC基因敲除的鸡白痢沙门菌突变株，并在此基础上敲除rfaJ基因。

本发明的第三方面，提供了前述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株在制备鸡白痢沙门菌活疫苗中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种鸡白痢沙门菌活疫苗，含有前述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株。

进一步的，所述鸡白痢沙门菌活疫苗中还含有佐剂。

本发明的第五方面，提供了spiC基因和rfaJ基因共同作为靶基因在筛选鸡白痢沙门菌感染治疗药物中的用途。

本发明所述鸡白痢沙门菌感染治疗药物为以spiC基因和rfaJ基因为治疗靶基因，使spiC基因和rfaJ基因敲除、不表达的药物或者以spiC基因和rfaJ基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以spiC基因、rfaJ基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以spiC基因和rfaJ基因为靶点，筛选使这两个基因不表达的药物，用于使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染。例如，该鸡白痢沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使spiC基因和rfaJ基因敲除或不表达；或者通过制备spiC蛋白和rfaJ蛋白拮抗剂，使spiC基因和rfaJ基因表达的蛋白不发挥作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明旨研制了一种spiC-rfaJ双基因敲除的鸡白痢沙门菌减毒株，本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。

进一步的，采用所述减毒株做制备的鸡白痢沙门菌活疫苗，其毒力相对于野生型鸡白痢沙门菌显著降低，表现在其对1日龄海兰白雏鸡的致死剂量明显提高。接种本发明鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，宿主不产生针对O-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原，可有效的应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分。所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果，并且可以通过玻板凝集试验快速地区分疫苗接种鸡与自然感染鸡。亦即，所述疫苗具有区分免疫接种鸡和自然感染鸡的功能，通过玻板凝集试验即可加以区别，疫苗应用不影响鸡白痢阳性鸡检疫淘汰制度的实施。

附图说明

图1：鸡白痢沙门菌rfaJ基因打靶片段的PCR扩增。M：DL2000DNAMarker；1：P1/P2扩增产物。

图2：减毒株S06004ΔspiCΔrfaJ的PCR鉴定。M：λ-EcoT14DNAMarker；1：S06004；2：S06004ΔspiCΔrfaJ::Cm。

图3：敲除株的吖啶橙凝集试验。1：S06004；2：S06004ΔspiCΔrfaJ。

图4：敲除株LPS结构的SDS-PAGE银染分析。1：S06004；2：S06004ΔspiCΔrfaJ。

图5：鸡白痢沙门菌减毒株在雏鸡肝脏、脾脏内的定殖。A：肝脏；B：脾脏。“Δ”代表减毒株。

图6：免疫后雏鸡体重变化。“Δ”代表减毒株。

图7：免疫雏鸡清除强毒力沙门菌感染的效率。“Δ”代表减毒株。

图8：敲除株具有区分疫苗接种动物和自然感染动物的DIVA性能。1：S06004；2：S06004ΔspiCΔrfaJ。“d.p.i”表示免疫后天数。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株S06004ΔspiCΔrfaJ的构建

1.材料和方法

1.1菌株与质粒

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株由本发明人实验室利用重组自杀质粒方法无痕敲除spiC基因构建获得并保存(所述鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株为现有技术，其具体的构建方法详见“鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定，中国兽医科学，2014年04期”)。

鸡白痢沙门菌S06004(Nal^R)、E.coliDH5α、E.coliSpy372(λpir)以及质粒pKD46(Amp^R)、pKD3(Cm^R)、pCP20(Amp^R、Cm^R)均由本发明人实验室保存，这些菌体以及质粒均为现有技术，具体参见鸡白痢沙门菌S06004株致病岛-2缺失株的构建及其生物学特性，微生物学报，2015，55(5)。

pMD20-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2主要试剂

GenomicDNAExtractionKit、dNTP、普通Taq酶、DNAmarker购自宝生物工程(大连)有限公司，DNAFragmentPurificationKit购自Tiangen公司，细菌微量生化发酵管购自杭州天和生物公司，L-阿拉伯糖购自Sigma公司，LPSExtractionKit购自iNtRON公司，PierceSilverStrainKit购自Thermo公司，其余常规试剂均为国产或进口分析纯产品。引物合成由南京金斯瑞生物公司完成。

1.3双基因敲除减毒株的构建方法

1.3.1引物

根据GenBank上已公布的鸡白痢沙门菌基因组序列，用引物设计软件Primer5.0设计用于同源重组的引物。

表1用于基因敲除的引物序列

引物P1/P2用于同源重组，该引物分别由两部分组成，5’端序列与rfaJ基因两翼序列同源，3’端斜体的序列与模板质粒pKD3上的氯霉素抗性基因两侧序列互补。YZ1/YZ2是rfaJ同源重组区域外侧的一对验证引物，该引物之间的序列在亲本株中是1258bp，rfaJ基因被氯霉素抗性基因置换后约为1260bp，氯霉素抗性基因被敲除后约350bp。

1.3.2打靶片段的扩增与纯化

以pKD3质粒为模板，用引物P1/P2对rfaJ同源重组片段进行PCR扩增，扩增条件：94℃变性5min，94℃45s，58℃45s，72℃60s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，使用胶回收试剂盒纯化，回收片段作为rfaJ基因打靶片段。

1.3.3电击转化打靶片段到感受态细胞

将编码Red重组系统的pKD46质粒电转化到鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC敲除株中，获得S06004ΔspiC(pKD46)。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中30℃振荡培养过夜，按1:100比例转接培养物至10mL含氨苄青霉素的LB培养基中，同时加入终浓度30mmol/L的L-阿拉伯糖，30℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.6，冰浴10min，4℃、4000rpm离心10min收集细菌，用冰浴的无菌去离子水洗1遍，再用预冷的10％甘油洗2遍，最后以1:200体积的预冷的10％甘油重悬，即制备好感受态细胞。

将浓度不低于150ng/μL的打靶片段与50μL感受态细胞混合后加入到直径为1mm的电击杯中，冰浴2min后进行电击转化。电击参数：电阻200Ω，电容25μF，电压1800V。电击结束后，立即加入1mLSOC培养基，180rpm培养1.5～2h，随后涂布含有氯霉素的LB培养基，37℃培养。挑取单克隆进行PCR鉴定，正确的即命名为S06004ΔspiCΔrfaJ::Cm。

1.3.4抗性基因的消除

将携带FLP位点特异性重组酶的pCP20质粒导入S06004ΔspiCΔrfaJ::Cm突变株中，通过含氨苄青霉素和氯霉素的双抗性LB培养基30℃培养，筛选得到阳性克隆S06004ΔspiCΔrfaJ::Cm(pCP20)，挑取单菌落在42℃LB液体培养基中培养12h左右，即可获得不含pCP20质粒和氯霉素抗性基因的敲除株，命名为S06004ΔspiCΔrfaJ。

1.3.5敲除株的生物学特性

通过接种葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、卫矛醇、山梨醇、乳糖、赖氨酸脱羧酶、乙酰胺、硫化氢、蛋白胨水、侧金花醇等生化鉴定管，对鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ缺失株进行生化特性测定。

1.3.6敲除株的表型鉴定

采用吖啶橙凝集试验、菌落结晶紫染色对敲除株进行S-R型鉴定。按照LPS提取试剂盒及银染试剂盒说明书，对突变株LPS结构进行分析。

2实验结果

2.1打靶片段的PCR扩增

以pKD3质粒为模板，使用P1/P2引物扩增出两端与rfaJ基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因Cm的DNA片段，经过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期1100bp的大小一致，如图1所示。

2.2敲除株的PCR鉴定

使用表1中的验证引物对抗性基因消除前后的突变株进行PCR鉴定，如图2所示。通过外侧引物将扩增出的片段克隆到pMD20-T载体上送测序，序列比对证明敲除株构建成功。质粒pCP20表达的FLP重组酶能识别抗性基因两侧的FRT位点，通过位点特异性重组将中间的抗性基因去除，仅在作用位点留下单拷贝的FRT位点。

亦即，本实施例中采用如上方法，将鸡白痢沙门菌中如SEQIDNO.1所示spiC基因敲除，以及如SEQIDNO.2所示的rfaJ基因替换为如SEQIDNO.3所示FRT位点序列(实现了rfaJ基因的敲除)，使得spiC基因和rfaJ基因都不表达，成功获得了鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株。

2.3S06004ΔspiCΔrfaJ的生化特性鉴定

细菌转接葡萄糖、鼠李糖、木糖、麦芽糖、甘露醇、卫矛醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、赖氨酸脱氢酶、氰化钾、尿素、乙酰胺、七叶苷、硫化氢、蛋白胨水、侧金花醇等生化鉴定管，37℃过夜培养，生化鉴定结果(表2)表明突变株与野生株细菌生化特性一致。

表2鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株及野生株S06004的生化特性比较

注：“+”代表阳性，“—”表示阴性，“WT”指鸡白痢沙门菌S06004，“ΔspiCΔrfaJ”指鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ敲除株。

2.4敲除株的表型

敲除株与0.1％吖啶橙溶液充分混合，可观察到菌体凝集颗粒(图3)，所提LPS经SDS-PAGE凝胶银染，结果表明LPS的O-抗原结构缺失(图4)，符合粗糙型鸡白痢沙门菌的特点。

实施例2鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株S06004ΔspiCΔrfaJ的DIVA疫苗应用

试验材料为实施例1所构建的鸡白痢沙门菌双基因敲除S06004ΔspiCΔrfaJ减毒株。

挑取细菌单菌落在LB培养板上全板划线，37℃静置培养20h，使用无菌PBS将LB平板上的细菌小心刮下，用无菌的PBS洗涤3遍，调整细菌浓度为10⁹CFU/mL，即制成减毒鸡白痢沙门菌疫苗。

试验例1鸡白痢沙门菌双基因敲除株的安全性试验

1.试验方法

将110只1日龄海兰白雏鸡随机分为11组，每组10只，分别以1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶CFU的S06004ΔspiCΔrfaJ和1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵CFU的S06004肌肉注射0.1mL细菌悬液，一组为空白对照组。连续观察两周记录死亡情况，计算细菌的LD₅₀，评价减毒株对雏鸡的安全性。

2.试验结果

根据Karber-Behrens法计算，S06004ΔspiCΔrfaJ对1日龄雏鸡的LD₅₀为3.98×10⁹CFU，S06004对雏鸡的LD₅₀为1.0×10⁷CFU(表3)。S06004ΔspiCΔrfaJ敲除株相较于野生株LD₅₀升高398倍，其毒力显著下降。

表3鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ敲除株的LD₅₀测定

试验例2减毒鸡白痢沙门菌在宿主体内的定殖试验

1.试验方法

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株以1×10⁷CFU/0.1mL/只的剂量肌肉注射免疫1日龄海兰白雏鸡，同时设立S06004野生株阳性对照组。分别在感染后7d、14d、21d、28d剖杀实验鸡，每组3只，无菌取其脾脏、部分肝脏，称重，加入1mL无菌的PBS充分研磨，取100μL研磨液连续10倍稀释，选取3个合适的稀释度，每个稀释度取100μL涂布LB平板(Nal30μg/mL)，各做3个重复，细菌计数。计算细菌在内脏器官(脾脏、肝脏)中的动态变化规律。

2.试验结果

鸡白痢沙门菌减毒株在雏鸡肝脏、脾脏内的定殖情况如图5所示。在检测的各时间点，野生株感染组的载菌量均明显高于减毒株组，减毒株在雏鸡内脏中最终被完全清除。

试验例3减毒鸡白痢沙门菌免疫雏鸡后体重变化

1.试验方法

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株以1×10⁷CFU/0.1mL/只的剂量肌肉注射免疫1日龄海兰白雏鸡，同时设立空白对照组。在免疫后7d、14d、21d、28d，进行称重，记录体重变化，评价突变株免疫后对雏鸡增重的影响。

2.试验结果

通过比较减毒鸡白痢沙门菌免疫后对雏鸡增重的影响，免疫接种组与空白对照组相比体重无显著差异(图6)，表明疫苗接种不影响雏鸡生长。

试验例4免疫雏鸡后病理组织学观察

1.试验方法

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株以1×10⁷CFU/0.1mL/只的剂量肌肉注射免疫1日龄海兰白雏鸡，同时设立空白对照组。观察雏鸡状态，并分别在免疫后7d、14d、21d、28d剖杀各组3只雏鸡，对肝脏、脾脏、盲肠进行病理组织学观察。

2.试验结果

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株不引起雏鸡任何临床症状，所检脏器与对照组相同，均无病变。试验结果进一步表明该减毒株对雏鸡具有良好的安全性。

试验例5免疫保护试验

1.试验方法

以肌肉注射的方式免疫1日龄海兰白雏鸡，肌注剂量10⁷CFU。在免疫后第14天，以鸡白痢沙门菌野生株S06004、鸡伤寒沙门菌Sg9、肠炎沙门菌C50041采用肌注方式分别对免疫鸡攻毒，攻毒剂量为10⁹CFU。攻毒后连续观察记录雏鸡死亡情况，以评价减毒沙门菌的免疫保护作用。攻毒时设立未免疫鸡强毒攻毒组和健康对照组，每组10只。

2.试验结果

减毒株S06004ΔspiCΔrfaJ表现出理想的抵御鸡白痢沙门菌感染的免疫保护效力，强毒株攻毒后雏鸡存活率达100％。同时具有良好的交叉保护能力，能保护鸡伤寒沙门菌的感染(存活率为60％)，对肠炎沙门菌也有70％的保护效力(表4)。

表4减毒株的免疫保护效力

试验例6免疫雏鸡清除强毒力沙门菌感染的效率

1.试验方法

以肌肉注射的方式免疫1日龄海兰白雏鸡，肌注剂量10⁷CFU。在免疫后第14天，以鸡白痢沙门菌野生株S06004、鸡伤寒沙门菌Sg9、肠炎沙门菌C50041采用肌注方式分别对免疫鸡攻毒，攻毒剂量为10⁹CFU。攻毒后第14天，剖杀所有幸存活鸡，对肝脏、脾脏和盲肠内的攻毒细菌进行分离计数。

2.试验结果

攻毒后，免疫雏鸡脏器内的细菌量明显少于非免疫组(图7)，表明本发明减毒鸡白痢沙门菌能有效地诱导机体清除强毒菌株的感染。

试验例7突变株DIVA功能

1.试验方法

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiCΔrfaJ突变株以1×10⁷CFU/0.1mL/只的剂量肌肉注射免疫1日龄海兰白雏鸡，同时设立野生型感染对照组(肌注10⁶CFU鸡白痢沙门菌S06004)。分别在免疫后7d、14d、21d、28d无菌心脏采血，分离血清。使用鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原进行玻板凝集试验，观察凝集情况，判断结果。

2.试验结果

鸡白痢沙门菌减毒株S06004ΔspiCΔrfaJ免疫后，雏鸡血清始终不与检测抗原发生凝集，而阳性组在第21d即可产生凝集(图8)，极易区分疫苗免疫组和野生型感染组，具有明显的DIVA特征。

本发明的发明人还采用重组自杀质粒介导的同源重组方法，对rfaJ基因进行了无痕敲除，亦即，鸡白痢沙门菌中，如SEQIDNO.1所示spiC基因以及如SEQIDNO.2所示的rfaJ基因都被敲除，不引入其他的任何基因，成功获得了鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，所获得的减毒株性能与实施例1中的减毒株性能一致。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfaJ基因都不表达的鸡白痢沙门菌。

2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfaJ基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。

3.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，其特征在于，被敲除的spiC基因的序列如SEQIDNO.1所示。

4.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株，其特征在于，被敲除的rfaJ基因的序列如SEQIDNO.2所示。

5.如权利要求1～4任一权利要求所述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株的构建方法，包括步骤：将鸡白痢沙门菌中的spiC基因和rfaJ基因都敲除。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用同源重组的方法敲除spiC基因和rfaJ基因。

7.如权利要求1～4任一权利要求所述鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株在制备鸡白痢沙门菌活疫苗中的用途。

8.一种鸡白痢沙门菌活疫苗，含有如权利要求1～4任一权利要求所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株。

9.根据权利要求8所述的鸡白痢沙门菌活疫苗，其特征在于，还含有佐剂。

10.spiC基因和rfaJ基因共同作为靶基因在筛选鸡白痢沙门菌感染治疗药物中的用途。