CN1315871A - 控制禽类病原体的减毒沙门氏菌活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种保护家禽抵抗禽致病性革兰氏阴性微生物感染的疫苗。这种疫苗是一种重组沙门氏菌株,其表达对家禽是致病的,禽致病性革兰氏阴性微生物如大肠杆菌的O抗原。这种重组沙门氏菌株不表达沙门氏菌O抗原。还公开了用这种疫苗对禽类疫苗接种的方法。

Description

控制禽类病原体的减毒沙门氏菌活疫苗
发明背景
本发明总地涉及用于家禽和其它鸟类的疫苗，更具体地说，涉及保护家禽或其它鸟类抵抗禽类致病性革兰氏阴性菌感染的疫苗。
相关领域描述
禽类致病性大肠杆菌(APEC)菌株在家禽和其它鸟类中引起了许多相关的疾病，包括肺泡炎、蜂窝织炎、大肠杆菌病、大肠杆菌肉芽肿、大肠杆菌败血病、Hjarre病、脐炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎(Gross,W.B.,in Diseases of Poultry,Calnek等人编辑，Iowa State University Press,第138-144页，1991；Messier等人，Avian Diseases 37:839-844,1993)。这些疾病和由革兰氏阴性禽类致病菌导致的其它疾病可造成饲料转化成禽体的损失率或动物的死亡率的升高，从而导致家禽产业每年几百万美元的损失。Norton,R.A.Broiler Industry,Feb.1998，第28-32页。
被沙门氏菌污染的禽体制品是沙门氏菌感染人的重要来源，将导致人的胃肠炎，因此这是一个大众关心的公共卫生问题。口服给予鼠伤寒沙门氏菌株的活细胞(该菌株在cya和crp基因上有减毒缺失)，已显示能对小鸡提供优异的抗野生型沙门氏菌攻击的保护力(Hassan等人，Res.Microbiol.141:839-850,1990；Hassan等人，Infect.Immun.62:5519-5527,1994)，并已开发出在这种菌株中稳定表达异源抗原的系统(Hone等人，Microb.Pathog.5:407-418,1998；Strugnell等人，Gene,88:57-63,1990；Galan等人，Gene 94:29-35；1990；Nakayame等人，Bio/Technology 6:639-697,1995)。
APEC菌株基本上仅有几种血清型(O1、O2、O35和O78)(Cloud等人，Avian Dis.29:1084-1093,1985,Glantz等人，Avian Dis.6:322-328,1962；Gross同上)，而家禽中最普遍的沙门氏菌血清型是B、C和D群。用所谓O-抗原结构是在分子水平测定O血清型革兰氏阴性菌(如大肠杆菌和沙门氏菌)，也称为O-特异性链或O-多糖，其通常由各种长度的聚合同种糖单元组成，这些糖单元固着于细菌外膜，作为脂多糖(LPS)分子的最外层组分(Helander等人，in MolecularBiology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,R.A.Meyers编辑，VCH Publishers,Inc.,1995)。
抗LPS O-抗原的特异性抗体己表现出在人的肠道外大肠杆菌感染的哺乳动物模型中保护作用(Cryz等人，Vaccine 13；449-435,1995；Pluschke等人,Infect.Immun.49:365-370,1985)并和已认识到LPS O-抗原可作为其它革兰氏阴性病原菌的保护性抗原(Ding等人，J.Med.Microb.31:95-102,1990；MicheRi等人，Infect.Immun.60:1786-1792,1992；Robbins等人，Clin.Infect Dis.15:346-361,1992)。另外，一些研究小组已报导了用减毒的沙门氏菌和沙门氏菌-大肠杆菌杂交菌作为几种人病原菌(包括索氏志贺氏菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌)的O-抗原的疫苗送递运载体(Black等人，J.Infect.Dis.155:1260-1265,1987；Formal等人，Infect.Immun.34:746-750,1981；Pier等人，Infect.Immun.63:2818-2825,1995)；(Morona等人，美国专利号No.5,110,588)。然而，在本文所述的研究前，未曾报导过用表达APEC O-抗原的活的减毒沙门氏菌免疫接种家禽。
用大肠杆菌和沙门氏菌制得的LPS O-抗原包括脂类A、R-核心寡聚糖和O-特异性多糖(O-PS)，它们按此顺序共价连接。Sugiyama等人，J.Bacteriol.173:55-58,1991。在鼠伤寒沙门氏菌中，R-核心部分的合成是由rfa基因座和一些持家基因(如galE、galU和pgi)指导的，而O-PS的合成是由rfb基因簇(其编码参与单体糖单元生物合成的酶)和rfc基因(其编码负责糖单元聚合成大分子量多糖链的O-抗原聚合酶)指导的。Sugiyama等人，同上。
-研究合成大肠杆菌O9的LPS O-抗原所需基因的研究组，将含有大肠杆菌O9的rfb基因座的质粒引入到野生型鼠伤寒沙门氏菌和在rfb、rfc或rfe基因座中有缺失的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株中，并报导了含有该质粒的野生型菌株在细胞表面表达了大肠杆菌O9和鼠伤寒沙门氏菌的特异性LPS，而rfc突变体仅表达了O9特异性LPS。在鼠伤寒沙门氏菌rfb突变体中也合成了大肠杆菌O-抗原，但在rfe突变体中没有合成(Sugiyama等人，同上)。该研究组推断鼠伤寒沙门氏菌rfa和大肠杆菌O9 rfb基因座的基因产物可协作合成鼠伤寒沙门氏菌R-核心上的大肠杆菌O9抗原。然而，该研究组并未报导任何一种这些重组鼠伤寒沙门氏菌构建物是否能在动物宿主中生长或产生抗野生型大肠杆菌O9或鼠伤寒沙门氏菌的宿主保护性免疫应答。因此，需要一种二价疫苗来控制家禽中沙门氏菌和大肠杆菌的感染。这些疫苗将同时有利于公众的健康以及降低家禽产业的成本。
发明概述
本发明的一实施例涉及保护禽类抵抗禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物感染的疫苗。该疫苗含有表达APG-N微生物O抗原(系将APG-N的rfb基因簇和rfc基因(下文与APG-N rfb/rfc基因簇互换使用)整合到沙门氏菌染色体中)的重组沙门氏菌株的活细胞。由于沙门氏菌rfb基因簇和/或沙门氏菌rfc基因中的突变，这种重组沙门氏菌株(为毒性沙门氏菌株的减毒突变株)不表达毒性沙门氏菌株的O-抗原。在一优选实施例中，APG-N微生物是APEC菌株，且APG-N rfb/rfc基因簇为APEC rfb/rfc基因簇。
这种重组沙门氏菌株的其它特性使其可用于家禽和其它禽类的疫苗。首先，可将该疫苗配制成用于口服给予，且已知口服疫苗能刺激肠相关淋巴组织(GALT)，包括粘膜、体液和细胞免疫应答。同样口服活疫苗造价低廉，而且在饲养场中比注射用疫苗易于给药。其次，由于不表达载体菌株的特异性LPS O-抗原，避免了载体菌LPS O-抗原可能对APG-N O-抗原表达的干扰或疫苗接受者免疫系统对其的识别。第三，该重组沙门氏菌株具有抵抗APG-N微生物和沙门氏菌亲代株的保护作用，因为其表达了沙门氏菌亲代株的其它细胞表面抗原。另外，对于表达APEC菌株O-抗原的疫苗，用沙门氏菌(而不是大肠杆菌)作为载体菌能提供更强的抗APEC O-抗原的免疫应答，因为当肠炎沙门氏菌亚种在脾和法氏囊(bursa of Fabricius)中长期存在时，大肠杆菌不能有效地入侵这些淋巴组织或即使偶尔成功地进入也会被迅速杀死。
在一些实施例中，用于疫苗的重组沙门氏菌株也含有编码所需基因产物的重组多核苷酸。一优选基因产物是禽类致病性革兰氏阳性(APG-N)微生物或真核禽类病原体的抗原。
在另一实施例中，本发明提供用于免疫接种禽类以抵抗至少两种禽类致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的多价疫苗，该疫苗含有表达每种APG-N微生物O-抗原的重组沙门氏菌株的活细胞，该重组沙门氏菌株具有已整合入沙门氏菌染色体的每种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并在沙门氏菌rfb基因簇中或沙门氏菌rfc基因中有一个突变，从而使沙门氏菌O-抗原的表达失活，所述的重组沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。在一优选实施例中，一种或两种APG -N微生物是APEC菌株。
在另一实施例中，本发明提供用于免疫接种禽类以抵抗至少两种APG-N微生物的多价疫苗，该疫苗含有两种重组沙门氏菌的活细胞混合液，第一种重组沙门氏菌株已具有整合入沙门氏菌染色体的第一种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表达第一种APG-N微生物的O-抗原，第二种重组沙门氏菌株已具有整合入沙门氏菌染色体的第二种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表达第二种APG-N微生物的O-抗原，其中所述的第一和第二种重组沙门氏菌株在沙门氏菌rfb基因簇中或沙门氏菌rfc基因中各有一个突变，从而使沙门氏菌O-抗原的表达失活，所述的第一和第二种重组沙门氏菌株都是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。在一优选实施例中，在多价疫苗中的一种或两种重组沙门氏菌株表达APEC菌株的O-抗原。
本发明的其它实施例涉及免疫接种禽类以抵抗APG-N微生物感染的方法。这些方法包括免疫接种禽类以抵抗APG-N微生物的一种方法，其包括给予禽类免疫学有效剂量的疫苗，所述的疫苗含有表达APG-N微生物O-抗原的重组沙门氏菌的活细胞，该重组沙门氏菌株具有已稳定整合入沙门氏菌染色体的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在沙门氏菌rfb基因簇或沙门氏菌rfc基因中有一个突变，从而使沙门氏菌O-抗原的表达失活，所述的重组沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。这些方法还包括同时免疫接种禽类以抵抗多种APG-N微生物的方法，包括给予禽类免疫学有效剂量的上述多价疫苗。还包括同时免疫接种禽类以抵抗APG-N微生物和载体沙门氏菌的方法，包括给予禽类免疫学有效剂量的上述任何一种疫苗。
在另一实施例中，本发明提供制造用于免疫接种禽类以抵抗APG-N微生物的疫苗的方法。该方法包括以下步骤：选择能在禽类中定居的沙门氏菌；将APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合入沙门氏菌的染色体中；在沙门氏菌rfb基因簇和/或沙门氏菌rfc基因中引入突变；和分离表达APG-N微生物O-抗原但不表达沙门氏菌O-抗原的重组沙门氏菌。在一实施例中，所选定的沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。在另一实施例中，所选定的沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株，所述方法还包括在毒性沙门氏菌株中将减毒突变引入到沙门氏菌毒性基因中的步骤，以及分离毒性减弱(与毒性沙门氏菌株相比)的突变株。
本发明可实现的几个益处是：提供能保护禽类，尤其是家禽以抵抗APEC菌株和其它APG-N微生物感染的重组沙门氏菌活疫苗，以及制造这种疫苗的方法；提供可一同时保护禽类抵抗两种或多种APG-N微生物感染的多价疫苗；提供免疫接种禽类以抵抗APEC菌株和其它APG-N微生物的方法；和提供免疫接种禽类以抵抗APEC和沙门氏菌的方法。
附图简述
图1为自杀粘粒pMEG219的基因图，表现有以下特征：复制的pir-依赖性起点(P6K ori)；Tn10的四环素抗性基因(tetR,tetA)；质粒RK2的可移动片段(mob)、pCOS2EMBL的卡那霉素抗性基因(Kan)和双cos位点(cos)；和鼠伤寒沙门氏菌Δcya-27等位基因；和本文所述的NotⅠ和PvuⅡ限制位点；
图2显示了用抗鼠伤寒沙门氏菌B群LPS抗体(图2A)或抗O78LPS抗体(图2B)探测从示出的菌株分离得到的LPS作Western印迹的数字化图像；
图3显示了用抗鼠伤寒沙门氏菌B群LPS抗体(图3A)或抗O78LPS抗体(图3B)探测从示出的菌株分离得到的LPS作Western印迹的数字化图像，图3A显示的印迹凝胶中包括分子量标记；
图4显示了pMEG287的基因图，显示了本文所述的基因位点；和
图5显示了pMEG055的基因图，显示了本文所述的基因位点。
发明详述
本发明的基础是发现肠炎沙门氏菌，尤其是鼠伤寒沙门氏菌能被工程改造成在细胞表面以免疫原性形式表达APG-N微生物(尤其是O78和O1 APEC菌株)的O抗原，而这种表达不受载体沙门氏菌在家禽体内生长或在GALT中定居的干扰。另外，本发明发现口服给予小鸡这种重组沙门氏菌株，导致明显降低毒性APEC菌株在疫苗接种过的小鸡中感染并致病的能力。
因此，本发明的一实施例为用于免疫接种禽类以抵抗禽病原性革兰氏阴性微生物(APG-N)的疫苗，该疫苗包含表达APG-N菌株O抗原的重组沙门氏菌株的活细胞。以免疫原性形式表达的APG-N O抗原意味着APG-N O抗原是整个LPS O-抗原分子的一部分，其中APG-N O抗原连接于LPS核心部分，给予禽类后，能产生可与野生型APG-N微生物的LPS O抗原反应的抗体。通常，LPS核心部分是由重组沙门氏菌载体菌合成的，但在一些实施例中LPS核心可以来自O抗原相同的APG-N微生物或来自不同的APG-N微生物。
考虑可用此疫苗免疫接种各种类型禽类，包括鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸡和其它被分类为家禽的驯养禽类，以及未驯养的禽类如野火鸡，和外来品种如鹦鹉、长尾小鹦鹉等，使它们能抵抗任何目前已知的或后来测定的对禽类病原性APG-N微生物。这些APG-N微生物包括，但并不限制于：(1)APEC菌株，如大肠杆菌血清型O1、O2、O3、O6、O8、O15、O18、O35、O71、O74、O78、O87、O88、O95、O103和O109；(2)禽致病性沙门氏菌株，如C群和D群菌株；和(3)以下菌属的品种：弯曲杆菌属、拟杆菌属、博德特氏菌属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西丝氏菌属、放线杆菌属、克雷伯氏菌属、穆尔氏菌属、假单胞菌属、变形菌属和鸟杆菌属。较佳地，该重组沙门氏菌株表达APEC菌株的O抗原。更佳的是，APEC O抗原是O1、O2、O35或O78血清型特征，最佳的是O抗原是O1 LPS、O2 LPS或O78 LPS。
用于疫苗的重组沙门氏菌株的制备是通过将所需APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合到适当沙门氏菌株的染色体中。用作载体菌的沙门氏菌株可从能在禽类(尤其是家禽)中定居的沙门氏菌衍生获得。这些菌种包括，但并不限制于：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡沙门氏菌、雏沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种、海德尔堡沙门氏菌、鸭沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、会聚沙门氏菌、蒙得维的亚沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、施瓦曾格隆得沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、勃兰登堡沙门氏菌、S.instanbul、古巴沙门氏菌、布雷得尼沙门氏菌、布灵得卢柏沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌、贝塔沙门氏菌、加里福尼亚沙门氏菌、森夫顿堡沙门氏菌和salmonella mbandaka。本文所用的“定居的”指能附着于、侵入并保留在接种疫苗家禽的以下一种或多种组织中的沙门氏菌种：肺、脾、肝、法氏囊和盲肠。较佳地，该重组沙门氏菌株是从鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、雏沙门氏菌或肠炎沙门氏菌衍生获得的。更佳的是，APG-N rfb/rfc基因簇被插入到鼠伤寒沙门氏菌株中。
如本文所述，APG-N rfb/rfc基因簇含有合成APG-N微生物特征性O抗原必须的所有基因，包括所有rfb基因(其产物为生物合成单体糖单元所需的)，以及rfc基因(其编码糖单元聚合所需的O抗原聚合酶)。术语rfb基因和rfc基因是指任何APG-N微生物的那些经鉴定为编码基因产物的基因，其在O抗原生物合成中具有与大肠杆菌rfb/rfc基因簇相同的功能。在大多数大肠杆菌和沙门氏菌血清型中，rfc基因紧密连接于rfb基因簇，其在大肠杆菌中的长度约为10kb，位于大肠杆菌基因图上45分钟附近。但在一些大肠杆菌株以及鼠伤寒沙门氏菌中，rfc基因不连接于rfb基因簇，而且发现两者距离非常大。例如，在鼠伤寒沙门氏菌中，约21kb的rfb基因簇在鼠伤寒沙门氏菌基因图上从44.9-45.3 centisomes延伸，而rfc基因位于35.7 cenrisome。
用常规粘粒克隆方法已可克隆功能完全的APG-N rfb/rfc基因，如先前克隆细菌rfb/rfc基因簇所述。可参见Viret等人，欧洲专利0 564 689 B1；Neal等人，FEMSMicrobiol.Lett.82:345-352,1991；Haraguchi等人，Microb.Pathog.6:123-132,1989；Microb.Pathog.10:351-361,1991；Heuzenroeder等人,Mol.Microbiol.3:295-302,1989；Bastin等人，Mol.Microbiol.5:2223-2231,1991；和Valvano等人，Infect.Immun.57:937-943,1989。Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989中详细描述了一般的粘粒克隆方法。简单地说，在大肠杆菌K-12菌株中制备所需APG-N微生物染色体DNA的粘粒文库，由于rfb区域的突变K-12菌株不产生O抗原。接种此粘粒文库，用对所需APG-N菌株O抗原特异性的抗血清，来筛选分离出的菌落是否表达APG-NO抗原。可从阳性粘粒克隆中分离出APG-N染色体DNA片段，并用标准技术(如限制图和亚克隆)进一步鉴定以确定指导APG-NO抗原合成所需APG-NDNA的最小量。本文所述的最小量是指rfb/rfc基因簇。对于那些rfc基因与rfb基因簇距离相当远的APG-N微生物而言，在该粘粒文库中可能不存在含有功能性rfb/rfc基因簇的单个APG-N染色体片段。在这种情况中，需要进行其它常规克隆和筛选实验来克隆rfc基因并构建含有rfb基因和rfc基因的重组片段。然后将rfb/rfc基因簇作为粘粒或质粒转染入选定的沙门氏菌株，用本领域已知的方法以及以下简述的方法分析所得重组体产生的LPS。
已报导了沙门氏菌LPS核心部分不接受一些细菌的异源性O抗原，导致非结合O抗原，其可能比携带异源性O抗原(共价连接于载体菌的核心部分)的完整LPS分子免疫原性低(欧洲专利0 564 689 B1；Morona等人，美国专利No.5,110,588)。可用SDS-PAGE分析指数生长后期提取的LPS或用快速小规模小量制备方法进行静止培养，将表达完整LPS O抗原的重组菌株与那些表达非结合O抗原的重组菌株相区别(Hitchcock和Brown,J.Bacteriol.154:269-277,1983)。可用银染色法或用O抗原特异性抗体作免疫印迹分析检测凝胶中分开的LPS分子。完整LPS O抗原(本文也称为光滑性、或S型LPS)能产生可用银染色法或免疫印迹分析检测的高分子量梯状条带，而非结合O抗原用银染色法或抗体检测不产生(序列)梯而为成片条带。在这种情况中，沙门氏菌rfa基因座(指导LPS核心的合成)可用其它细菌(如大肠杆菌K-12或APG-N微生物)的rfa基因座替换，以衍生得到rfa和APG-N rfb/rfc基因簇的组合，该组合将指导免疫原性形式的APG-NO抗原的合成。
为了确保异源性抗原的稳定表达并消除维持沙门氏菌株的染色体外元件所需要使用的抗生素，可将APG-N rfb/rfc基因簇整合到沙门氏菌染色体中。这可用任何已知的方法实现，较佳地通过在毒力基因中缺失/插入明确的突变，以产生下述的减毒突变株。另外，也可以不减弱重组沙门氏菌株毒性的方式整合入APG-Nrfb/rfc基因簇。
重组沙门氏菌株在沙门氏菌rfc基因中也含有突变，从而使沙门氏菌O抗原聚合酶的表达失活。O抗原聚合酶缺陷型沙门氏菌突变株能产生称为半粗糙型(SRLPS)的LPS分子，其最多具有一个连接于给定核心单元的O抗原性糖单元，而不是通常在Rfc+菌株中所见到的30-40个糖单元。这些SR LPS分子不大可能干扰长得多的APEC LPS O抗原刺激保护性免疫应答的能力。可从已含有rfc突变的菌株制备重组沙门菌株，或在将APEC rfb/rfc基因簇整合入沙门氏菌染色体的同时或之后引入rfc突变。
可用本领域已知的常规方法制造沙门氏菌rfc突变株。例如，在所需沙门氏菌株(见，如Curtiss，美国专利5,672,345)和具有Rfc-表型(即，表达SR LPS)的突变体(Collins等人，J.Bacteriol.173:2521-2529,1991)的染色体中进行随机转座子插入。另外，可用重组DNA技术(如本文实施例中所述)在沙门氏菌rfc基因中引入一个缺失突变。简单地说，已克隆和测序了鼠伤寒沙门氏菌的rfc基因，据信其在沙门氏菌株血清群A、B和D1中是保守的(Collins等人，同上)。根据这一信息，可克隆沙门氏菌株(属于这些血清群之一)的rfc基因，并用于构建在克隆的rfc基因中含有一个缺失的自杀质粒。将这种质粒引入到rfc+沙门氏菌株中，将使染色体rfc基因和Δrfc质粒间发生同源重组。然后在培养基上培养转化的细胞，而无需选择质粒和筛选Rfc-表型的分离物。
可通过SDS-PAGE分析从细菌分离得的LPS和检测具有沙门氏菌株特异性O-糖单元的高比例SR LPS，以测试沙门氏菌突变株的Rfc-表型。另一可用于筛选Rfc-表型的沙门氏菌突变株的方法是用S型LPS特异性噬菌体的噬菌体敏感试验。例如，用P22裂解鼠伤寒沙门氏菌和其它具有Rfc+表型(即表达S型LPS)的B群沙门氏菌株，而这些菌株的Rfc-突变体抵抗P22介导的裂解，因为P22不识别这些突变体菌株表达的SR LPS。
同样也设想采用与本文所述的制备仅表达APG-N O抗原菌株方法类似的技术，可构建表达多种APG-N微生物APG-N O抗原的重组沙门氏菌株。
因为此疫苗含有重组沙门氏菌的活细胞，因此可将活的重组沙门氏菌送递给消耗家禽食品(如蛋和肉)的人。另外，肠炎沙门氏菌会在幼禽中引起疾病。因此，本发明的一个重要特征是此重组沙门氏菌株是毒性肠炎沙门氏菌的减毒突变株。如本文所述，减毒突变株是指能在疫苗接种过的禽类中定居并复制，但基本上不能导致疾病症状的重组沙门氏菌株，所述的病症与相应的毒性菌感染禽类和感染人相关。术语“基本不能导致病症”是指减毒突变株不产生病症或产生不大严重和/或数量较少的这些病症。然而减毒突变株对疫苗接受者的正常生理功能可能有一定的影响，可能是禽类而不是预定疫苗接受者以及其它非人类宿主的病原体。
此重组沙门氏菌株可从毒性肠炎沙门氏菌天然无毒突变株衍生获得，或通过用熟知的方法将减毒突变引入到野生型毒性菌株中。减毒突变可位于生物合成基因、调节基因和/或与毒力有关的基因中。(见Doggett和Brown,in Mucosal Vaccines,Kiyono等人编辑，Academic Press,San Diego,1996，第105-118页)。突变能导致减毒的基因例子包括，但并不限制于，在pab基因、pur基因、aro基因、asd、dap基因、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA、galU中的突变和它们的混合。突变可以是插入、部分或完全缺失等，只要降低该基因的表达并减少毒性。本领域技术人员易于理解，任何适当的基因突变可用于本发明，只要该基因的突变使微生物减毒。较佳地，本发明的载体菌至少有两个突变，每个突变都能起降低微生物毒性作用，而且联合起来能明显增加微生物不能回复成野生型毒力的可能性。
可用本领域已知的方法进行突变，以产生本发明的减毒重组沙门氏菌株。例如，可用转座子Tn10在各种细菌(包括沙门氏菌)中产生染色体缺失(Kleckner等人，J.Mol.Biol.116:125-159,1997；欧洲专利局公开号No.315,682；美国专利号No.5,387,744)。
最近已有新方法在基因中产生特异性缺失。这些方法包括首先选出其中要产生缺失的基因。在一种方法中，这种基因可选自可购得的或用本领域熟知方法构建的基因组文库(Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版,1989,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。用在相同基因中含有突变的菌株进行互补，从该基因组文库中分离出含该基因的克隆。另外，当已知该基因的DNA序列时，选出的用于聚合酶链反应(PCR)的引物能从细菌样品或纯化的基因组DNA扩增该基因，通常带有某些侧翼序列，可将PCR产物插入到一个克隆载体中。
可用两种通用常规方法之一在选定的基因中产生特异性缺失。第一个方法用限制酶从基因组DNA文库所含的克隆群分离的基因中产生突变，第二种方法用PCR在已知序列的基因中产生突变。第一种方法中，用转座子靶向鉴定该基因在载体上的位置，并产生该载体中重组DNA的限制图。由转座子靶向得到的信息，使得能用已知的限制酶位点从该载体切出基因的所有部分或一部分。当该基因的DNA序列是已知时，可采用基于PCR方法的第二种方法。按这种方法，趋异性(divergent)PCR引物扩增了(将从该基因中缺失的)侧接特定DNA序列的上游和下游区域，并产生PCR产物，包含克隆载体和侧翼核苷酸序列的上游和下游(Innes等人编辑，PCR Protocols,1990,Academic Press,New York)。在该方法的改进中，产生的PCR产物具有该基因部分或侧翼序列，然后将其与一克隆载体连接在一起。
用化学方法或电穿孔法转化、重组噬菌体感染或偶联，可将含有突变基因的DNA引入到细菌宿主中。在优选实施例中，将突变基因引入到细菌的染色体中，这可通过本领域熟知的许多方法之一来实现，例如用温度敏感复制子的方法(Hamilton等人，J.Bacteriol.171:4617-4622,1989)、recBC突变体的线性转化(Jasin等人，J.Bacteriol.159:783-786,1984)或称为自杀载体的宿主限制的复制子(Milller等人，J.Bacteriol.170:2575-2583,1988)。将所用的特定方法与适当的反选择方法如镰孢菌酸抗性或蔗糖抗性联合，然后筛选含有突变体等位基因(根据表型特征)的克隆，或作PCR、核酸杂交，或用免疫学方法。
本发明中所用的重组沙门氏菌株也可用于将所需的基因产物送递给接种疫苗的禽类。术语“基因产品”是指在某基因控制下发生的生物化学反应结果而产生的任何生物产品。基因产品的可以是如RNA分子、肽、蛋白质、或在酶或其它分子(是该基因的最初产物)控制下得到的产物，即代谢产物。例如，基因可能先控制RNA分子的合成，而RNA分子通过核糖体的作用翻译产生成酶，该酶控制发现该基因的原细胞的外环境中聚糖的形成。此RNA分子、酶和聚糖都是本文所述的基因产物。理想基因产物的例子包括，但并不限制于，抗原、各种宿主细胞蛋白质、药理活性产物、毒素和细胞凋亡调节剂。
抗原或免疫原是指含有一个或多个表位的分子，这些表位能刺激宿主免疫系统产生对该抗原特异性的分泌性体液和/或细胞免疫应答。表位可以是抗原上抗体特异性接合的位点。对于蛋白质抗原，一个表位包含有呈立体构象的3个氨基酸，此构象是该表位特有的；通常，一个表位至少由此抗原的6个连续氨基酸构成，或更经常由此抗原的至少10-12个连续氨基酸构成。术语“表位”与本文所用的“抗原决定簇”可互换。术语“表位”还包括T-辅助细胞表位，其中包括T-辅助细胞通过与主要组织相容性复合物Ⅱ类分子相结合而识别的抗原决定簇。此外，术语表位包括细胞毒T细胞所识别的抗原、表位或抗原决定簇(当通过抗原递呈细胞表面的MHCⅠ类分子递呈时)。细胞毒T细胞表位可包含约6-11个连续氨基酸构成的氨基酸序列，较佳地是由8-9个连续氨基酸构成的氨基酸序列。
若所需的基因产物是细菌、真菌、寄生虫或病毒疾病因子的抗原，可用此重组沙门氏菌株疫苗接种禽类以抵抗这些因子造成的疾病，同时也是抗APG-N微生物的疫苗接种。例如，可用此重组沙门氏菌株送递不表达O-抗原的禽类病原性微生物的抗原，如革兰氏阳性(APG-P)菌。这些微生物包括，但并不限制于，枝原体属、利斯特氏菌属、疏螺旋体属、衣原体属、梭菌属、棒杆菌属、柯克斯立克次体属、Eysipelothrix、黄杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属。已知感染家禽的真菌和寄生虫禽致病体的例子为变形带属、Aproctella、鸡蛔虫属、曲霉属、念珠菌属、毛细线虫属、隐孢子虫属、Cvathostroma、咽饰带属、艾美虫属、绉缘绦虫属、筒线虫属(Gongylonemia)、异刺属、组织滴虫属、尖旋尾线虫属、疟原虫属(P1asmondium)、瑞立绦虫属、类圆线虫属、锥尾线属、比翼属、四棱线虫属和毛圆线虫属。已知感染家禽的病毒包括腺病毒(如出血性肠炎病毒)、星形病毒、冠状病毒(如传染性支气管炎病毒)、副粘病毒(如新城疫鸡瘟病毒)、小核糖核酸病毒(如禽脑脊髓炎病毒)、痘病毒、逆转录病毒(如禽造白细胞组织增生/肉瘤病毒)、呼肠孤病毒和轮状病毒。较佳地用作抗原的基因产物是多糖和蛋白质，包括糖蛋白和脂蛋白。可克隆这些原核和真核微生物的抗原编码基因，并用标准方法在此重组沙门氏菌株中表达。
在其它实施例中，该所需基因产物指导了配子特异性抗原的表达，该抗原能引发免疫应答，从而对免疫接种的动物起抗生殖作用(见美国专利5,656,488)。
如本文所述，疫苗是指用于刺激动物免疫系统的制剂，从而提供针对免疫系统不识别为自身抗原的抗原的保护作用。免疫接种是指在受免疫接种的动物中诱导持续高水平的抗体和/或细胞免疫应答的过程，应答中T淋巴细胞能杀死病原体和/或激活其它细胞(如吞噬细胞)来杀死病原体，该应答是针对动物先前接触过的病原体或抗原的。在本申请中术语“免疫系统”是指解剖特征和机理，禽类通过该系统产生针对抗原性物质(侵入脊椎动物的细胞或个体的细胞外液态)的抗体，并包括细胞免疫应答。
就抗体产生而言，如此产生的抗体可属于任何免疫类别，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特别感兴趣的是刺激产生免疫球蛋白A(IgA)的疫苗，因为其是禽类分泌系统产生的主要免疫球蛋白，但本发明的疫苗并不仅限制于那些刺激产生IgA的疫苗。例如，本文所述的天然疫苗除形成IgA外，可产生范围广泛的其它免疫应答，例如细胞和体液免疫力。已很好的研究了对抗原的免疫应答并有许多报导。
也可用本发明的无毒微生物作为合成其它蛋白质的载体，包括合成禽类产生的免疫调节分子，和刺激或抑制各种生理功能(如生长速率、脂肪或蛋白质含量等)的药理活性产物的载体。
重组多核苷酸编码了所需的基因产物。术语“重组多核苷酸”是指实验室操作的结果，导致将一启动子引入到此沙门氏菌株中，该启动子可操作性连接于来自各种内源和/或外源的基因。这种启动子是在沙门氏菌株中有功能性的启动子，以表达此基因。该基因可以来自染色体、质粒或病毒。本文所用的基因是任何能产生所需基因产物的生物性遗传单元。但该基因不必是亲代微生物中那样的完整基因，也无需具备产生大分子(如功能性多肽)或调节大分子产生的能力。因此该重组多核苷酸可编码某抗原性产物的全部或部分。基因也可指具有从亲代微生物天然序列突变产生的序列的多核苷酸。该重组多核苷酸也可指编码几种基因产物的DNA的一长段，这些基因产物中的一个或多个可以是抗原性的或是生物合成通路(导致产生所需的基因产物)的一部分。例如，这种DNA的一长段可编码5-15个菌毛抗原(菌毛)合成所必需的蛋白质，该菌毛介导了病原体与宿主细胞的粘附(Baumler等人，同上)。诱导抗菌毛的免疫应答能提供抵抗病原体的保护力。本文所用的术语“基因”还包括缺失内含子的DNA分子，例如cDNA分子，只要此DNA序列能编码所需的基因产物。编码所需基因产物的重组多核苷酸可包括除启动子以外的其它DNA序列，如终止序列和原核基因表达的其它调节子。
可用各种方法如偶联、电穿孔或转化(从外环境中摄取裸DNA，可用各种化学试剂(如钙离子)进行人工诱导)，以质粒、噬菌体或粘粒载体形式将编码所需基因产物的重组多核苷酸转移到沙门氏菌株中。其它方法如转导也是适用的，其中用噬菌体包装呈转导噬菌体或粘粒载体形式的重组DNA。一旦重组多核苷酸在载体沙门氏菌中，它就可作为独立自主的复制子持续存在，或它可插入到沙门氏菌染色体中，在细胞分裂过程中随染色体一起再生。
较佳地，将该多核苷酸掺入一“平衡致死”系统中，通过将存活的微生物与持续存在的该重组多核苷酸相连，选择含有并能表达所需基因产物的微生物。这种类型的“平衡致死”突变体的特征为缺失编码细胞存活所必须的酶的功能性天然染色体基因，较佳地是催化生物合成二氨基庚二酸(DAP)中一个步骤的酶，更佳的是一编码β-天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd)的基因。细胞壁合成需要DAP通路的酶和Asd。“平衡致死”突变体也含有起补充非功能性染色体基因作用的一个重组基因，该补充性重组基因结构上连接于编码所需基因产物的重组多核苷酸。当细胞处于缺乏DAP的环境时，丢失该补充性重组基因将导致细胞因裂解而死亡。由于DAP不是由真核生物合成的，因此DAP在感染的禽类组织中并不存在，故这一策略尤其有用。美国专利No.5,672,345中公开了制备这些类型“平衡致死”微生物的方法。
可用任何已知的或标准方法(包括粘膜或肌内注射)，将此疫苗给予家禽。较佳地给药方法包括口服或支气管-鼻腔-眼喷雾。这些方法使重组沙门氏菌易于到达肠相关淋巴组织(GALT)或支气管相关淋巴组织(BALT)，并诱导抗体形成和细胞介导免疫。特别优选的给药方法是疫苗接种刚孵化的家禽，如在孵化日通过粗喷淋接种。
在重组沙门氏菌株生长和收获后，冻干细菌细胞，尤其当它们与食物混合时。可用任何药学上欲接种疫苗禽类可接受的赋形剂，来制备由重组沙门氏菌组成的疫苗。例如，若疫苗是以固态形式给予的，可用对待接种禽类无毒的且与该细菌相容的材料包被细胞和/或胶囊化。也可用固态运载体如滑石粉或蔗糖。如果是以液态形式给予的，可将细胞悬浮在适当的液态运载体中，包括如脱脂乳、普通盐水和/或其它无毒盐水(生理浓度或接近生理浓度)，和其它本领域技术人员已知的适当液态运载体。需要时也可加入佐剂已提高抗原性。当疫苗是以喷淋形式给予时，可将重组沙门氏菌细胞悬浮在适当的缓冲液中，如BSG中(含明胶的缓冲盐水，CurtissⅢ,R.,J.Bacteriol.89:28-40,1965)。
需要的剂量取决于重组沙门氏菌株表达的APEC LPS O-抗原的量和抗原性，也取决于待疫苗接种的禽的类型、大小和年龄。例如，与疫苗接种年老禽类所需的剂量相比，疫苗接种刚孵化的禽类需要的剂量较小。用例行实验易得出所需的剂量。通常剂量的浓度范围为105-109活细胞/禽。用活重组沙门氏菌细胞组成的疫苗喷淋接种刚孵化的小鸡的优选剂量为约106-108活细胞/禽，更佳的剂量是约5×107活细胞/禽。
以下实施例描述了本发明的优选实例。本领域技术人员在参考了本文所公开的本发明的说明书或实例后，将会明了在权利要求书范围以内的其它实施例。本说明书以及实施例仅作说明用，权利要求书才表明本发明的范围和精神。
实施例1
本实施例说明共表达鼠伤寒沙门氏菌B群LPS和大肠杆菌O78 LPS的减毒重组鼠伤寒沙门氏菌株的构建。
减毒策略在cya和crp基因中具有缺失的鼠伤寒沙门氏菌株已表现出是减毒的，且对小鸡有免疫原性(Hassan等人，Res.Microbiol.141:839-850,1990；Porter等人，Avian Dis.37:265-273,1993)，此外，能引发抗野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击的保护性免疫应答(Hassan等人，同上，Hassan等人，Infect.Immun.62:5519-5527,1994)。从生化角度而言，cya或crp中的缺失将导致不能发酵各种糖，包括麦芽糖(Botsford等人，Microbiol.Rev.1992)。因此，在MacConkey麦芽糖培养基上ΔcyaΔcrp鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株形成白色菌落，而野生型沙门氏菌株形成红色菌落，因此就可用简单的方法鉴别疫苗菌株和野生型鼠伤寒沙门氏菌。根据早期的这些发现，选择ΔcyaΔcrp鼠伤寒沙门氏菌作为载体菌株。
将O78 rfb/rfc基因簇插入到沙门氏菌染色体中。为了便于将O78 rfb插入到鼠伤寒沙门氏菌染色体中，并在一个步骤中在沙门氏菌cya基因中产生减毒性缺失突变，构建了一pir依赖性粘粒载体，pMEG219。如图1和下表1所示，pMEG219具有以下特征：复制的pir-依赖性起点；Tn10的四环素抗性基因、质粒RK2的可动片段、pCOS2EMBL的卡那霉素抗性基因和双cos位点、以及克隆的鼠伤寒沙门氏菌Δcya-27等位基因。因为起点是pir依赖性的，该粘粒只能在已工程改造过提供Pir蛋白质的特异性大肠杆菌株中复制，但在野生型鼠伤寒沙门氏菌株中则不能(Kolter等人，Cell 15:1199-1208,1978)。cya-27等位基因含有确定的cya缺失(其由cya下游区域的327bp缺失构成，包括前13个密码子)、和此缺失侧翼序列上游的476bp及侧翼序列下游的1,826bp。此外，在该缺失点工程改造了一NotⅠ位点，以便于将DNA插入到cya基因中(P.Sundarum，个人通信)。
表1．菌株和质粒
菌株       相关基因型                        来源或参考文献
大肠杆菌
x7122      禽病原性菌株078:K80:H9,nalr     Provence等人.,Infect.Immun.
                                            60:4460-4467,1992
MGN026     endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1
           gyrA relA1Δ(lacZYA-argF)U169        S.Tinge
           λpir deoR(φ80ΔlacZM15)
MGN617     SM10λpir[thi-1 thr-1 leuB6 supE44 tonA21
           lacY1 recA RP4-2-Tc::Muλpir]ΔasdA4   本研究
           Δzgf-2::Tn10
MGN803     MGN617(pMEG226)                        本研究
MGN1142    MGN617(pMEG315)                        本研究鼠伤寒沙门氏菌
χ3761     UK-1，野生型                        R.CurtissⅢ
MGN394     Δcya-27Δcrp-28                    P.Sundaram
MGN431     Δcya-27Δcrp-28, Mot+             P.Sundaram
MGN510     ΔphoP22 pMEG113整合体              P.Sundaram
MGN806     x3761 pMEG226整合体                    本研究
MGN807     Δcya-28::rfb078                       本研究
MGN868     Δcya-28∷rfb078 Δcrp-28              本研究
MGN996     Δcya-28::rfb078Δcrp-28,Mot+           本研究
MGN1175    MGN431Δasd::xylE729(pYA292)             本研究
MGN1180    Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+      本研究
MGN1181    Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+      本研究
MGN1182    Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+      本研究
MGN1183    Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+      本研究
MGN1184    Δcya-27Δcrp-28Δffc,Mot+              本研究
MGN1185    Δcya-27Δcrp-28Δrfc,Mot+              本研究
MGN1717    MGN1180Δasd::xylE729                    本研究
MGN1718    MGN1717(pYA292)                          本研究
MGN1720    MGN1717(pMEG287)                         本研究质粒
pYA292     带p15a ori,Ptrc启动子Asd+的表达载体     R.Curtiss
pYA3255    pYA3174(带pSC101 ori Apr粘粒克隆载体)   Brown等人.,Proc.
           携带x7122的rfb                           Nat.Acad.Sci.USA
                                                    Vol.93第.11149-
                                                    11154页，1996
pMEG055    携带大肠杆菌衍生的iutA的pYA292           本研究
pMEG113    携带Δcrp-28、Tetr的pir-依赖性自杀载体，P.Sundaram
pMEG219    携带Δcya-27,Tetr,Kanr的pir-依赖性    本研究
           “自杀”粘粒载体
pMEG226    携带x7122的rfb的pMEG219                  本研究
           (Δcya-28::rfbO78)
pMEG387    携带大肠杆菌衍生的Ⅰ类菌毛的pYA292       本研究
pMEG315    携带Δrfc的pMEG149(pir-依赖性自杀质粒，  本研究
           sacBR,Apr，由S.Tinge提供)
从粘粒克隆pYA3255得到的078 rtb/rfc基因簇，含有插入到粘粒载体pYA3174的BamHⅠ克隆位点的APECx7122菌株的rfb区域(Brown等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:11149-11154,1996)。pYA3255的限制分析表明除侧接于BamHⅠ克隆位点的两个NotⅠ位点外，在克隆的x7122 DNA中还存在一个NotⅠ位点(Brown等人，同上)。因此，用NotⅠ部分消化粘粒pYA3255，并与NotⅠ/PvuⅡ消化的pMEG219连接，得到粘粒pMEG226，其具有APEC菌株x7122的rfb区域插入到粘粒pMEG219的Δcya-27等位基因中。然后用电穿孔将粘粒pMEG226引入到大肠杆菌株MGN617中，产生MGN803(表1)。菌株MGN617在asd基因中有一个缺失，导致需要补充二氨基庚二酸(DAP)(Schleifer等人，Bacteriol Rev.36:407-477,1972)，且因为它还携带有pir基因的一个拷贝，所以能支持pMEG226的复制(表1)。
为了将粘粒pMEG226引入到鼠伤寒沙门氏菌中，将大肠杆菌供体菌株MGN803与野生型UK-1鼠伤寒沙门氏菌x3761交配，方法是将每种菌株的50μl通气过夜培养物点滴到LB琼脂板上(Miller,H.,in Methods in Enzymology,Vol.152,第147页，Berger,S.L.和Kimmel,A.R编辑，Academic Press,Inc.1978)，该琼脂板含有200μg/ml DAP,37℃培养过夜。用无菌金属圈从平板上刮下交配的混合物，悬浮于1ml BSG中。将细胞分散在含有10μg/ml四环素的LB板上，37℃培养过夜。接种在不含DAP的选择性培养基上，进行针对供体菌株MGN803的反选择。因为粘粒pMEG226在鼠伤寒沙门氏菌中不能复制，重组细胞获得四环素抗性的唯一途径是通过同源重组将该质粒整合入染色体中。用抗078特异性抗血清，以玻片凝集法筛选产生078 LPS的耐四环素的反偶联物，该抗血清获自PennsylvaniaState University的大肠杆菌参品中心。37℃使一个耐四环素的O78+分离物(命名为MGN806)(表2)在LB肉汤中稳定生长过夜，接种到镰孢菌酸培养基(Bochner等人，J.Bacteriol.243:926-933,1980)上，进行针对整合质粒的反选择。筛选出丢失四环素抗性的耐镰孢菌酸菌落以及MacConkey麦芽糖培养基上的白色菌落。在该培养基上cya突变体是白色的，因为它们不能发酵麦芽糖(Botsford等人，同上)，而能发酵麦芽糖的野生型鼠伤寒沙门氏菌产生红色的菌落。选出四环素敏感的、Cya-、O78+分离物，命名为MGN807(表1)。
为了在沙门氏菌crp基因中加入一个缺失，用上述菌株MGN510(表1)上生长的P22噬菌体转导菌株MGN807(Maloy,S.R.,Experimental Techniques inbacterial genetics,Jones and Bartlett,Boston,1990)。MGN510已被整合入其染色体，质粒pMEG113(表1)是pir-依赖性、耐四环素的自杀载体，含有带一明确缺失突变的鼠伤寒沙门氏菌crp基因。在含有10μg/ml四环素的LB平板上选择转导子。选出一个转导子，接种在镰孢菌酸培养基上。通过在含有2mM cAMP的MacConkey麦芽糖平板上划线，筛选出Crp-表型的耐镰孢菌酸分离物。在该培养基上，Cya-、Crp+菌株是红色的，而Cya-、Crp-菌株是白色的。将一个Δcya::rfbO78Δcrp分离物命名为MGN868。
由于ΔcyaΔcrp菌株是不能动的(Yokota等人，J.Bacteriol.103:513-516,1970)，而且因为已知抗鞭毛抗体能保护动物抵抗鼠伤寒沙门氏菌(Yokoyama等人，Vaccine 16:388-393,1998)，将MGN868通过一个装满流动琼脂(Difco)的流动管传代(Holt等人，Enrichment and Isolation,in Methods for General andMolecular Bacteriology,Gerhardt等人编辑.，第222页，Am.Soc.for Microbiol.,Washington,D.C.)，产生MGN868的能动变体，命名为MGN996(表1)。
如下用SDS-PAGE和Western印迹法检验MGN807、MGN868和MGN996表达的LPS。将这些菌株各自的细胞，以及分别作为O78 LPS和鼠伤寒沙门氏菌B群LPS对照的x7122和MGN431的细胞(表1)在LB肉汤中培养过夜。将细胞调节到OD600当量，离心沉淀1ml每种培养物。用Hitchcock和Brown(J.Bacteriol.154:269-277,1983)的方法从沉淀细胞制备LPS。将样品在双份12.5％聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳，转移到硝酸纤维膜上，用抗B群特异性抗血清(Difco)或抗O78特异性抗血清探测(如ELC Western Blotting Protocols，第16-17页，Amersham LifeScience,1997中所述)。图2显示了结果。
如预期的，从大肠杆菌x7122株分离的LPS不与抗B群抗体(图2A)反应，但与抗O78抗体(图2B)反应。类似地，鼠伤寒沙门氏菌对照菌株MGN431(cya-27crp-28,Mot+)产生的LPS，与抗B群抗体(图2A)反应但不与抗078抗体(图2B)反应。然而，从重组鼠伤寒沙门氏菌株MGN807、MGN868和MGN996分离的LPS与这两种抗体均反应(图2A、2B)，产生了梯级图形不同的高分子量条带，表明这些菌株表达了鼠伤寒沙门氏菌B群和大肠杆菌O78 O抗原(连接于沙门氏菌核心)。该重组沙门氏菌株表达了高分子量O78 LPS也表明，在质粒pYA3255中克隆的x7122rfb区域也含有x7122的rfc基因。
在重组鼠伤寒沙门氏菌中表达的O78 LPS的平均链长与在同一菌株中表达的B群LPS的平均链长大约相同(与图3A和3B中的MGN807、MGN868和MGN996泳道相比)，而在x7122中表达的O78的链长则较短(图3B)。已知该基因的产物能调节LPS的链长，并被不同研究组分别命名为cld(Bastin等人，Mol.Microbiol.7:724-734,1993；Bastin等人，Mol.Microbiol.5:2223-2231,1991)、rol(Batchelor等人，J.Bacteriol.174:5528-5236,1992；Batchelor等人，J.Bacteril.173:5699-5704,1991)和最近被命名为wzz(Reeves等人,Trends Microbiol.4:495-503,1996)。有可能通过鼠伤寒沙门氏菌wzz基因来测定重组鼠伤寒沙门氏菌株MGN807、MGN868、和MGN996中的O78链长。
实施例2
本实施例说明鼠伤寒沙门氏菌株MGN996(Δcya-28::rfbO78,Δcrp-28,Mot+)在小鸡中定居和保护它们抵抗野生型APEC菌株x7122攻击的能力。
在实施例2-4所述实验中所用的所有小鸡都是从Specific Pathogen Free AvianServices(SPAFAS,Roanoke,IL)得到的无特异性病原体(SPF)鸡的受精蛋孵化的白色来亨鸡。在华盛顿大学(St.Louis,MO)的生物学院的Humidaire培养箱/孵化器中培养和孵化这些蛋。
在本实验中疫苗接种禽类2次：第一次在孵化日，然后再在14日龄时。在孵化日通过粗喷淋用4.6×106CFU/鸡的MGN996接种小鸡。将10-15只小鸡置于Plexiglas喷淋箱中，用加压到100psi的不锈钢Sure Shot Model A喷雾器(Milwaukee Sprayer Manufacturing Co.,Inc.,Milwaukee,WI)送递接种物进行粗喷淋疫苗接种。事先进行演习实验以确定送递0.3ml/鸡的适合条件。用MGN966疫苗接种26只小鸡，用BSG模拟疫苗接种12只小鸡。孵化日接种后，将小鸡转移到Horsfall隔离器中，给予食物并任意饮水(在孵化疫苗接种后)。
在第10日，随机从疫苗接种组选择3只小鸡，吸入CO2致死，然后立即检验禽体以评估(细菌)定居情况。从每只小鸡采集肺、肝、脾、法氏囊和盲肠内含物样品，分别置于Stomacher袋中，在每个样品中加入5ml BSG。在SewardStomacher 80 Laboratory Blender中匀浆化组织。然后将脾、肝和肺0.1ml匀浆化的样品置于补充有1％麦芽糖的MacConkey琼脂基底上(Difco)或将法氏囊样品和盲肠内含物的匀浆化样品置于含有35μg/ml新生霉素的亮绿琼脂上。37℃培养这些平板过夜。进一步分析每个平板的至少一个典型菌落作，以验证玻片凝集法测定的相应LPS类型的表达。对于直接接种未获得菌落的情况，在4.5ml Hajna肉汤中加入0.5ml匀浆化组织，42℃培养过夜作为二次富集。将一环Hajna-富集的培养物划样到亮绿琼脂上，37℃培养过夜。在所有测试的组织样品中发现了MGN996菌株。
在第14日，用连接于1ce针筒的送药插管以口服管饲法，以3.8×107CFUMGN996(0.2ml体积)加强接种已接种过疫苗的小鸡。在第28日，通过气管内途径，用7.5×107CFU大肠杆菌x7122株(0.5ml)攻击所有小鸡，四天后以吸入CO2处死，然后解剖禽体。
对解剖的禽类作APEC感染相关病损的评分。在本实验和实施例3-4所述的实验中，用Wilcoxon-Mann-Whitney U检验(Zar,J.H.,Biostatistical Analysis,Prentice-Hall,Inc.,Englewood Cliffs)进行病损评分的分析。在本实验中，用x2分析确定两组间的差异(根据未显示病损的禽(病损评分为1)数目)，下表2列出了结果。
表2．用APEC菌株x71221攻击后，接种MGN996疫苗的与未接种疫苗的小鸡的病损评分平均值。
组别                    #各病损评分的小鸡数  平均评分2
 1  2     3     4     5
BSG  1  0     1     8     2     3.8a
MGN996  10  2     1     7     1     2.4b
1如下进行小鸡的评分：1．活小鸡，无病损2．活小鸡，云斑(cloudy)状肺泡3．活小鸡，仅有一种类型病损(如肝周炎)4．活小鸡，有多处病损5．死亡或濒死小鸡，带有大肠杆菌病典型病损(肝周炎、心包炎、肺泡炎、严重脱水)。
2与b有差异(p=0.0157)
此病损评分的平均值表明，与未接种疫苗的对照小鸡相比，接种MGN996疫苗的小鸡明显受到保护抵抗了攻击(x2=5.3,p=0.02)。此外，疫苗接种组显示出总病损评分平均值明显降低。这些结果表明由表达B群O抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌送递的大肠杆菌LPS向小鸡提供了显著的抵抗野生型大肠杆菌攻击的保护作用。
实施例3
本实施例说明除去沙门氏菌O抗原的表达对疫苗菌在各种小鸡组织中定居能力的影响。
为了消去重组鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株的B群O抗原的表达，在MGN996(Δcya::O78Δcrp；表1)和MGN431(明确的ΔcyaΔcrp缺失对照菌株，表1)的沙门氏菌rfc基因中制作了一个明确的缺失。将菌株MGN996或MGN431与实施例1中所述的MGN1142(涉及氨苄青霉素抗性的选择)交配(表1)。MGN1142含有携带鼠伤寒沙门氏菌突变rfc基因的pir-依赖性自杀载体。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中培养每个交配的反偶联物过夜，接种于补充有5％蔗糖、缺NaCl的LB琼脂平板上，室温培养48小时。用针对P22噬菌体的交叉划样筛选出Rfc表型的分离物。如上述，在该试验中鼠伤寒沙门氏菌O抗原聚合酶缺陷的突变株耐P22，而表达功能性鼠伤寒沙门氏菌O抗原聚合酶的分离物对P22是敏感的。
得到几个独立的ΔrfcSt(表示鼠伤寒沙门氏菌rfc基因)分离物，命名为MGN1180、MGN1181、MGN1182和MGN1183(都是从MGN996衍生的)；和菌株MGN1184和MGN1185(从ΔcyaΔcrp鼠伤寒沙门氏菌株MGN431衍生的)。见表1。分离由这些菌株产生的LPS，并如实施例1所述用Western印迹法作B群和O78 O抗原分析，结果显示于图3。
如所预期的，由ΔcyaΔcrp对照菌株MGN431和其ΔrfcSt衍生物MGN1184和MGN1185产生的LPS与抗B群LPS抗体反应(图4A)，而不与抗O78 LPS抗体反应(图4B)。但用抗B群LPS抗体探测时，ΔrfcSt菌株分离出的LPS仅产生低分子量条带，表明它们不表达B群全长LPS。当用抗O78 LPS抗体探测时，MGN996和其ΔrfcSt衍生菌株(MGN1180、MGN1181、MGN1182和MGN1183)产生的LPS得到完整O78大肠杆菌O抗原的图形(图4B)。菌株MGN1180的O78特异性LPS图形(图4B)与MGN996的B群LPS链长(图4A)相似，而MGN1181的O78特异性LPS图形与野生型O78大肠杆菌株x7122中的O78 LPS图形(图4B)更相似。由于这两个菌株具有明确相同的基因型(表1)，未预计到它们在LPS图形上的差异。选择MGN1180、MGN1181和MGN1184株作为可能的抗大肠杆菌x7122疫苗的进一步研究。
在孵化日，通过口腔管饲法用MGN996(6.9×107CFU/鸡)、MGN1180(4.0×107CFU/鸡)、MGN1181(2.4×107CFU/鸡)、MGN1184(1.3×107CFU/鸡)、或MGN431(7.8×107CFU/鸡)接种小鸡，每种菌株接种10只小鸡。将接种疫苗的小鸡置于隔离器中，如上述在第10日解剖禽体。如实施例2所述，收集肺、肝、脾、法氏囊和盲肠内含物的样品，加工并作细菌定居分析，下表3列出了结果。
表3．重组ΔcyaΔcrpΔrfc鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗和对照菌株在小鸡中的定居(％小鸡阳性)
菌株        基因型  肺  脾  肝  囊 盲肠
MGN996MGN1180MGN1181MGN1184MGN431  cya::rfb O78Δcrpcya::rfb O78ΔcrpΔrfccya::rfb O78ΔcrpΔrfcΔcyaΔcrpΔrfcΔcyaΔcrp 100％80％70％20％77％ 100％100％100％50％100％ 100％100％100％70％66％ 100％100％100％100％100％ 100％100％100％100％100％
这些结果表明所有测试的ΔrfecSt菌株(除MGN1184外)都能大百分比的定居于禽类的肺、脾、肝、法氏囊和盲肠中。发现像对照菌株MGN431和MGN996一样，菌株MGN1180和MGN1181能定居在100％疫苗接种过的禽类的脾中。由于Δrfc突变菌株MGN1184为半粗糙表型。已有报导说LPS缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株表现出在小鸡中定居降低(Craven等人，Avian Dis.38:401-408,1994)。不能承受禽类与禽类间的变化，本试验得到的结果与MGN1184的定居受到严重破坏的事实相一致，证实了完整LPS O抗原在定居中的作用。但在Rfc背景(MGN1180和MGN1181)中，与MGN1184相比，O78大肠杆菌O抗原的表达导致该菌在禽类中定居百分比的明显增加，表明其可用于提高这些菌株抗大肠杆菌攻击的保护能力。
实施例4
本实施例说明表达O78大肠杆菌O抗原但不表达B群O抗原的重组鼠伤寒沙门氏菌株，对保护小鸡抵抗O78 APEC菌株x7122感染所致疾病的有效性。
在孵化日，通过口腔管饲法用6.5×107CFU MGN996(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28,Mot+)或7.7×107 CFU MGN1180(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28Δrfc,Mot+)，接种小鸡，每种菌株接种35只小鸡。用BSG模拟接种20只小鸡。在第10日如实施例2所述，解剖每个接种组的5只小鸡，作细菌定居评估。定居结果与实施例2中的类似(未显示数据)。在第14日，用7.4×107CFU MGN996加强免疫先前用MGN996接种的小鸡，用6.4×107CFU MGN1180加强免疫先前用MGN1180接种的小鸡。在第24日将所有禽类作腿部绷带标记。为了评估疫苗接种后血清抗体应答，在第27日翅静脉穿刺采集半数小鸡的血清，在第28日收集另一半小鸡的血清。第30日攻击每组一半小鸡，第31日攻击其余一半小鸡。攻击的剂量为9.6×107CFU大肠杆菌株x7122。采血前死去了两只对照小鸡，因此只有18只对照小鸡可采血和攻击。攻击后4天如实施例2所述，进行全部小鸡解剖评估x7122的定居，还收集心血。在所有小鸡中均分离到攻击菌株，但用MGN996或MGN1180疫苗接种的小鸡中仅在盲肠中发现攻击菌株。将两天小鸡解剖得到的病损评分数据合并分析，下表4显示了结果。
表4．用APEC菌株x7122攻击后，用鼠伤寒沙门氏菌株MGN996、MGN1180疫苗接种的小鸡或未疫苗接种的小鸡的平均病损评分。
处理类别                 #各种病损评分的小鸡数   平均病损评分1
 1     2     3     4     5
  无  0     4     6     8     0       3.2a
MGN996  9     8     8     5     0       2.3b
MGN1180  14     10     4     2     0       1.8c
如表2所述确定病损评分。
1与b的差异，p=0.0064
与c的差异，p＜0.0001
这些结果证实菌株MGN996的有效性，表明MGN1180可能是一种优秀的大肠杆菌疫苗，因为用MGN1180疫苗接种的小鸡的平均病损评分比用MGN996疫苗接种的小鸡平均病损评分低，虽然这两者的差异不明显(p=0.08)。
用酶联免疫吸附试验(ELISA)评估每只小鸡的血清对大肠杆菌O78LPS和鼠伤寒沙门氏菌LPS的抗体应答。37℃用100μl的大肠杆菌LPS(Sigma)或鼠伤寒沙门氏菌LPS(Sigma)(用0.2％TCA(三氯乙酸；Sigma)配成2.5μg/ml)包被Immulon-Ⅰ平底板孔2小时(Hardy,1994)。包被后，用TBS(Tris缓冲盐水)/0.1％Tween20溶液洗涤板3次。将稀释的血清(1∶100)加入到一式二孔中，37℃培育板1小时。然后再用TBS/0.1％Tween20溶液洗涤板3次。加入1∶30,000稀释的山羊抗鸡IgG HRP偶联抗体(KPL)检测结合的IgG。用TBS/0.1％Tween20再次洗涤板以除去未结合的检测抗体。洗涤后用溶于过硼酸钠的磷酸-柠檬酸缓冲液中的OPD(二氢氯邻苯二胺)片剂(Sigma)显色。37℃15分钟后，加入3N HCl终止反应。用BT2000 Microkinetics读数仪(FisherBiotech)在490nm对板读数。为了检测结合的IgM和IgA，首先用1∶5稀释的正常兔血清封闭板37℃45分钟，然后用TBS/0.1％Tween20洗涤3次。封闭后，每孔中加入1∶5000稀释的山羊抗鸡IgM或IgA(Immunovision),37℃培育板45分钟。用TBS/0.1％Tween 20洗涤3次除去了未结合的抗体，再每孔加入1∶5000稀释的兔抗山羊IgG碱性磷酸偶联抗体(Sigma)。37℃培育板45分钟。除去未结合的偶联抗体后，每孔中加入检测步骤用的p-NPP(二乙醇胺配的P-硝基苯磷酸；Sigma底物溶液，37℃培育板30分钟。然后加入3M NaOH终止反应，在405nm读数。如果观察到比0.2大的OD值，则认为该小鸡为血清阳性。对照为事先从12只小鸡采集的血样和仅含偶联抗体的孔。下表5和6列出了结果。
表5．攻击之前和攻击之后，078LPS血清阳性的百分比
  同种型          对照                            处理组
         MGN996(Rfc+)           MGN1180(Rfc)
 之前    之后    之前    之后    之前    之后
    IgM     0     88     53     100     80     97
    IgG     0     17     20     77     57     83
    IgA     0     17     30     87     70     87
表6．攻击之前和攻击之后，B群LPS血清阳性的百分比
  同种型          对照                            处理组
         MGN996(Rfc+)           MGN1180(Rfc)
  之前   之后    之前    之后    之前    之后
    IgM     0     17     93     100     30     57
    IgG     0     6     27     67     7     17
    IgA     0     0     70     87     10     20
攻击前约50％用MGN996疫苗接种的小鸡为O78特异性IgM抗体血清阳性，而只有20-30％小鸡为特异性IgG和IgA抗体阳性。相反，攻击前80％用RfcSt -菌株MGN1180疫苗接种的小鸡为O78特异性IgM抗体阳性，57％和70％小鸡分别为IgG和IgA O78特异性抗体血清阳性。这些结果表明用MGN1180疫苗接种比用RfcSt -菌株MGN996，产生的体液免疫应答更成熟。虽然攻击之后两组间血清转化相似，用MGN1180疫苗接种小鸡的IgA血清OD405阳性的值为85％(22/26)，比用MGN996疫苗接种小鸡(仅42％,11/26)高0.5。模拟疫苗接种小鸡的抗O78IgM血清阳性高百分比可能是因为记忆B细胞(能对O78 LPS制剂中存在的普通大肠杆菌抗原如LPS核心起反应)的重刺激造成的。如预期的那样，MGN996疫苗接种比MGN1180疫苗接种，产生了对鼠伤寒沙门氏菌LPS更强的体液抗体应答，因为MGN1180产生的鼠伤寒沙门氏菌LPS仅有O抗原的一个单糖单元，其可能被O78 LPS掩蔽。这种推测的根据是观察到，存在B群特异性抗血清时菌株MGN1180不凝集，而菌株MGN1184(ΔcyaΔcrpΔrfc)则凝集，虽然比表达完整LPS O抗原的鼠伤寒沙门氏菌株更弱。
总而言之，攻击之前的强抗体应答与低病损评分之间强相关，虽然少数禽类没有发动可检测的攻击之前的抗体应答(被保护的)，少数禽类发动了可推测的攻击之前抗体应答，但作为未被保护记分。大多数接种MGN1180疫苗的小鸡在攻击之前为O78抗体血清阳性(24/30)，而MGN996组的少数小鸡为血清阳性(17/30)。
实施例5
本实施例说明用含有Asd+载体的重组疫苗鼠伤寒沙门氏菌株疫苗接种小鸡，所述的Asd+载体可用于表达其它异源基因产物。
用电穿孔法将Asd+载体pYA292(表1)引入到MGN1717(表1)中，产生菌株MGN1718[(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28ΔrfclΔasd∷xylE729)/pYA292,Mot+]。本实施例所用的小鸡都是从Sunrise Farms(Catskill,NY)得到的无特异性病原体(SPF)鸡的受精蛋孵化的。用BSG模拟疫苗接种20只小鸡，通过上述的口腔管饲法在孵化日用5.6×107CFU MGN1718疫苗接种29只小鸡。第14日，以口腔管饲法，用5.2×107CFU MGN1718加强免疫接种过疫苗的小鸡，第28日如上述用5×107CFU x7122攻击所有小鸡。四天后，如上述处死小鸡、解剖、并对病损评分，但用更灵敏的评分系统(在下表7中列出)，下表8列出了用该评分系统得到的平均病损评分。
表7
对病损评分的方法
肺泡(胸)
正常                                                         0
轻度云斑和增厚                                               1
中度云斑和增厚、伴有血清渗出和纤维蛋白斑点                   2
广泛云斑和增厚伴有粘液或纤维蛋白化脓性渗出物                 3
心脏和心包
正常                                                         0
混浊、心包腔中存在过量液体                                   1
急性心包炎                                                   2
肝
正常                                                         0
脱色和/或少量纤维素性渗出物                                  1
明显的肝周炎                                                 2
细菌检验：
大肠杆菌重分离物
将肺泡拭子样品在BHI中培养后                                  1
肺泡直接划样                                                 2
将心包液或心脏拭子样品在BHI中培养后                          1
心包或心脏样品直接划样                                       2
肝拭子样品在BHI中培养后                                      1
肝直接划样                                                   2
每只小鸡可能的最高分=13。
                                  表8．x7122攻击的平均病损评分
处理分组                     #各种病损评分的小鸡数 平均病损评分1
0  1  2  3  4  5  6  7  8  9
未疫苗接种的 1  2  1  2  2  2  2  2  2  4     5.30a
MGN1718 8  8  9  1  1  0  0  2  0  0     1.62b
为了评估鼠伤寒沙门氏菌载体菌株是否提供抵抗APEC菌株攻击的保护作用，用MGN1175(表1)进行了十分类似的实验，从遗传角度而言MGN1175与MGN1718十分类似，但缺少O78 rfb基因簇。下表9列出了用7.5×107CFU x7122攻击后，模拟接种的对照或疫苗接种的小鸡的平均病损评分。
                                  表9 x7122攻击的平均病损评分
处理分组                     #各种病损评分的小鸡数 平均病损评分
0  1  2  3  4  5  6  7  10  11
未疫苗接种的 3  1  2  2  2  6  2  1  0  1     3.95
MGN1175 3  3  4  8  2  6  1  1  2  0     3.53
疫苗接种小鸡的平均病损评分与模拟疫苗接种对照小鸡的没有明显差异。这一结果表明重组鼠伤寒沙门氏菌疫苗株MGN1718和MGN1180菌株提供的抵抗APEC x7122的保护作用是由于表达了O78大肠杆菌的O-抗原。
实施例6
本实施例说明了还表达O1:K1:H7 APEC菌株的菌毛操纵子的O78疫苗菌株的构建及其效力。
菌毛操纵子是与PAEC菌株毒力相关的细胞表面结构(Dozios等人，Infect.Immun.60:2648-2656,1992；Dozios等人,Avian Dis,38:231-239,1994；Wooley等人，Av.Dis,36:679-684,1992)，具体地说，已显示了Ⅰ型菌毛对禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株定居于禽类气管上皮细胞的重要性(Gyimah等人，Avian Dis,32:74-78,1988)。已从O1:K1:H7 APEC分离物中克隆了参与形成Ⅰ型菌毛的基因，并将其插入到Asd+质粒载体(pYA292)中，并组成型表达。图4显示了所得质粒pMEG287的遗传学图。将质粒pMEG287引入到重组鼠伤寒沙门氏菌MGN1717(表1)中得到MGN1720([Δcya-28:rfb O78Δcrp-28ΔrfclΔasd::xylE729]/pYA292,Mot+)。以酵母凝集试验(Korhonen,TK.,FEMS Microbiol,Lett.6:421-425,1979),37℃通气培养过夜，证明在MGN1720菌株中有Ⅰ型菌毛的表达。如预计的Ⅰ型菌毛的凝集是甘露糖敏感性的，而对照菌株MGN1718不能凝集酵母细胞。虽然野生型鼠伤寒沙门氏菌株表达Ⅰ型菌毛，菌株MGN1718得到的结果与Ⅰ型菌毛的表达受ΔcyaΔcrp调节的事实相一致，因此在Cya-Crp-菌株中表达很差(Saier等人，J.Bacteriol.134:356-358,1978)且37℃仅在静置培养的两天后表达。
如上述，用5×107CFU剂量攻击，评估小鸡中MGN1718和MGN1720菌株的效力，表10列出了实验结果。
                                  表10．x7122攻击的平均病损评分
处理分组                     #各种病损评分的小鸡数 平均病损评分1
 0  1  2  3  4  5  6  7  8  9
未疫苗接种的  1  2  1  2  2  2  2  2  2  4     5.30a
MGN1718  8  8  9  1  1  0  0  2  0  0     1.62b
MGN1720  6  16  6  0  0  1  0  0  0  0     1.14b
p＜0.0001
1与b有差异(p＜0.0001)
这些结果显示虽然统计学显著性不大，但添加Ⅰ型菌毛导致较低的病损评分。虽然将Ⅰ型菌毛添加到疫苗菌株中不能提高抵抗O78攻击的保护作用，但可提供抗其它APEC血清型的交叉保护作用。
其它可用的菌毛是P型菌毛，包括F11，其与APEC菌株相关(van den Bosch,等人，Infect.Immun.61:800-806,1993)。
实施例7
本实施例说明还表达大肠杆菌铁调节外膜蛋白的O78疫苗菌株的构建。
清除铁的能力是对病原体的一种重要的存活性状，因为在动物宿主环境中铁的获得是有限的(Litwin等人,Clin.Microbiol.Rev.6:509-518,1993；Peighambari等人，Avian Dis.39:116-124,1995)。一些铁应答性基因编码外膜蛋白(OMPs)，其中大部分作为细菌或宿主产生的铁螯合化合物的受体(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)。
铁调节OMPs是抗原性的并且在健康人、兔、小鼠和豚鼠中已测到是抗大肠杆菌铁调节OMPs的抗体(Griffiths等人，Infect.Immun.47:808-813,1985)。产生的抗大肠杆菌铁调节OMPs的抗体，能被动地保护火鸡抵抗禽致病性O78大肠杆菌的攻击(Bolin等人，Infect.Immun.55:1239-1242,1987)，表明这些蛋白是保护性抗原。
铁应答性78-kDa OMP IutA是一优良的候选疫苗抗原。IutA是气杆菌素(aerobactin)和阴沟杆菌素(cloacin)的受体(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)。气杆菌素的合成直接与人和哺乳动物(Litwin等人，Clin.Microbiol.Rev.6:509-518,1993；Payne,S.M.,Cdt,Rev.Microbiol.16:81-111,1988)以及家禽(Dho等人，Avian Dis.28:1016-1025,1984；Emery等人，Avian Dis.36:504-511,1992；Lafont等人，Infect.Immun.55:193-197,1987,Linggood等人，J.Gen.Microbil.133:835-842,1987；Wooley等人,Av.Dis,36:679-684,1992)中的大肠杆菌毒力相关。气杆菌素是高亲和性铁摄取系统一个的成分(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)，可能是它在致病微生物中流行的原因。大量禽类大肠杆菌分离物的研究发现了80％以上病原性分离物能产生气杆菌素(Dho等人，同上；Emery等人，同上；Lafont等人，同上；Yokoyama等人，同上)，而在非病原性菌株中则非常少见。合成气杆菌素的基因最常见于ColV质粒，并因此与大肠杆菌素V的产生密切相关(Bagg等人，同上)。
将得到的pColV-K30的一个IutA克隆作为质粒pFS8(Krone等人，J.Bacteriol.153:716-721,1983)。将iutA基因从pFS8亚克隆到Asd+质粒载体pYA292中，产生pMEG055(图5)，并引入到鼠伤寒沙门氏菌株MGN055的Δasd衍生物中(图5)。Western印迹的结果表明组成型表达了IutA蛋白质，且该表达在L肉汤50次传代中是稳定的。
也可表达其它外膜蛋白，包括铁调节外膜蛋白、FepA、FecA、FhuA、FeeA和参与血清抗性的蛋白质、Iss。
本说明书以上和以下引用的所有参考文献全部纳入作为参考。本文参考文献中的讨论都是总结它们的作者的见解，不保证参考文献的准确性或恰当性，或任何参考文献的专利性。

Claims (25)

1．一种用于疫苗接种禽类以抵抗禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含表达APG-N微生物O抗原的重组沙门氏菌株的活细胞，所述的重组沙门氏菌株具有稳定整合入沙门氏菌染色体的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在沙门氏菌的rfb基因簇或沙门氏菌rfc基因中有突变，所述的突变使沙门氏菌O抗原的表达失活，所述的重组沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。
2．如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的APG-N微生物是禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株。
3．如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述的整合的APEC rfb/rfc基因簇包括沙门氏菌基因中的减毒突变，所述的基因选自：pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU。
4．如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的减毒突变是沙门氏菌cya基因中明确的缺失/插入突变。
5．如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的重组沙门氏菌株在沙门氏菌crp基因中还有减毒突变。
6．如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的APEC菌株为O1、O2、O35或O78血清型。
7．如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的重组沙门氏菌株还具有编码所需基因产物的重组多核苷酸。
8．如权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述的所需基因产物是禽致病性微生物的抗原。
9．如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的禽致病性微生物是禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株，所述的抗原是APEC菌株的菌毛或铁调节外膜蛋白质。
10．一种免疫接种禽类以抵抗禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的方法，其特征在于，所述的方法包括给予禽类免疫有效剂量的疫苗，所述的疫苗包含表达APG-N微生物O抗原的重组沙门氏菌株的活细胞，所述的重组沙门氏菌株具有稳定整合入沙门氏菌染色体的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在该沙门氏菌的rfb基因簇或沙门氏菌rfc基因中有突变，所述的突变使沙门氏菌O抗原的表达失活，所述的重组沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的APG-N微生物是禽致病性大肠杆(APEC)菌株。
12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的整合的APEC rfb/rfc基因簇包括在沙门氏菌的基因中的减毒突变，所述的基因选自：pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU。
13．如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的减毒突变是在沙门氏菌cya基因中明确的缺失/插入突变。
14．如权利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述的重组沙门氏菌株在沙门氏菌crp基因中还有减毒突变。
15．如权利要求14所述的疫苗，其特征在于，所述的APEC菌株为O1、O2、O35或O78血清型。
16．如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的重组沙门氏菌还具有一个编码所需基因产物的重组多核苷酸。
17．如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的禽类是鸡或火鸡。
18．如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的疫苗是在孵化日以粗喷淋给予的。
19．如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括口服给予禽类加强量的疫苗。
20．如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的加强量疫苗是在孵化日后的第13、14或15天给予的。
21．一种用于疫苗接种禽类以抵抗至少两种禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含两种重组沙门氏菌株的活细胞混合液，第一种重组沙门氏菌株具有整合入沙门氏菌染色体的第一种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表达第一种APG-N微生物的O-抗原，第二种重组沙门氏菌株具有整合入沙门氏菌染色体的第二种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表达第二种APG-N微生物的O-抗原，其中所述的第一和第二种重组沙门氏菌株在沙门氏菌rfb基因簇中或沙门氏菌rfc基因中有突变，从而使沙门氏菌O-抗原的表达失活，且所述的第一和第二种重组沙门氏菌株都是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。
22．一种用于疫苗接种禽类以抵抗至少两种禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含表达每种APG-N微生物O抗原的重组沙门氏菌株的活细胞，所述的重组沙门氏菌株具有稳定整合入沙门氏菌染色体的每种APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在该沙门氏菌的rfb基因簇或沙门氏菌rfc基因中有突变，所述的突变使沙门氏菌O抗原的表达失活，所述的重组沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。
23．一种制造用于免疫接种禽类以抵抗禽致病性革兰氏阴性(APG-N)微生物的疫苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(a)选择能在禽类中定居的沙门氏菌；
(b)将APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合入沙门氏菌的染色体中；
(c)在沙门氏菌rfb基因簇和/或沙门氏菌rfc基因中引入突变；和
(d)分离出表达APEC菌株特征性O-抗原但不表达沙门氏菌O-抗原的重组沙门氏菌，其中步骤(b)和(c)可以任何顺序进行。
24．如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述选定的沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株的减毒突变株。
25．如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述选定的沙门氏菌株是毒性沙门氏菌株，所述的方法还包括在该毒性沙门氏菌株的基因中引入减毒突变，所述的基因选自：pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU，然后将分离出与毒性沙门氏菌株相比的减毒突变株。
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