CN1046532A - 博德特氏菌疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了博德特氏菌属外膜蛋白质、含有这些蛋白质的疫苗组合物及其使用方法。可用重组方法并在用于免疫特定个体的无毒力载体微生物中表达该外膜蛋白质。该目的抗原提供了预防和治疗博德特氏菌属诱发之疾病如火鸡和鸡和上呼吸道感染、猪和狗的萎缩性鼻炎和人百日咳等的方法。
Description
本发明总地涉及疫苗组合物及其给药方法。更具体地说，本发明是涉及博德特氏菌粘附抗原及其用于刺激抗博德特氏菌属感染之免疫力的外膜蛋白质。
博德特氏菌属（Bordetella）包括下列四个菌种，即百日咳博德特氏菌（B.pertussis）、付百日咳博德特氏菌（B.parapertusis）、支气管炎博德特氏菌（B.bronchiseptica）及鸟博德特氏菌（B.avium）。鸟博德特氏菌可引起火鸡和鸡的上呼吸道疾病，其与人的百日咳博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌感染（21、23、37、38）以及由支气管炎博德特氏菌引起的猪鼻炎十分相似。鸟博德特氏菌感染引起的鸟的病症与儿童的百日咳症状相符（26）。在感染后5至7天，鸟会出现抑郁、食欲下降、体重减轻、咳嗽、湿性罗音、外鼻道粘液积聚、呼吸困难及声音沙哑等病症（3、18、21、34、37）。小鸟对感染较敏感，而年长的鸟则有一定的抗御能力（36）。临床症状可持续2周至几个月（7.34），且由病毒、细菌和真菌等病毒体引起的继发感染常常是导致发病和死亡的主要原因（3、4、17、21、34）。因此，这类疾病可对农场造成很大经济损失。迄今为止，还没有一种普遍适用的鸟博德特氏菌疫苗。
所有博德特氏菌都对有纤毛的气管上皮细胞表现有特异趋向性（2、41、5）。这些细胞是该细菌属特有的靶细胞。鸟博德特氏菌在气管中造成的组织病理学改变，与百日咳博德特氏菌感染的人和仑鼠气管中所见病变相同（2，3，17，18，19，12，33，34）。在细菌附着寄生于有纤毛的气管上皮细胞上之后，鸟博德特氏菌感染的鸟气管和百日咳博德特氏菌感染的仑鼠气管出现表面不规则、粘液积聚、白细胞渗出及纤毛气管细胞进行性减少等征象。
因为所有博德特氏菌均粘附于气管上皮细胞上，所以具有共同特征的表面结构均可参予粘附并可能在疫苗中用作抗原成分。与百日咳博德特氏菌的粘附有关的蛋白质包括菌丝血凝素（FHA）、凝集原（其可以是或不是菌毛）及百日咳毒素（PT）（有关综述参见文献44、9）。在体外细胞检测试验中，FHA-和PT-百日咳博德特氏菌突变株不能粘附于人纤毛上皮细胞上，而且抗FHA抗体可阻断百日咳博德特氏菌在各种细胞上的粘附（42）。但FHA-细胞可与Hela细胞很好地结合，且与野生型毒性百日咳博德特氏菌相比，当鼻内感染幼雅小鼠时，无菌毛血细胞凝集素的百日咳博德特氏菌突变株并没有降低毒力（45）。此外，支气管炎博德特氏菌、付百日咳博德特氏菌和鸟博德特氏菌均不产生百日咳毒素（20），鸟博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌的大多数菌株也不产生FHA。
关于凝集原在博德特氏菌之粘附中的作用也有相反的观点。百日咳博德特氏菌的凝集原2、3和6是菌毛抗原（参见文献44）。抗2型菌毛的单克隆抗体可抑制同源血清型在Vero细胞上的粘附（16），而抗凝集原1和2的抗体则抑制百日咳博德特氏菌在Hela细胞上的粘附（35，32）。反之，缺乏菌毛的百日咳博德特氏菌可粘附在无纤毛WiDr（43）和人纤毛细胞上。此外，某些有菌毛的菌株缺乏粘附能力（42）。
鸟博德特氏菌的表面上也有菌毛。同百日咳博德特氏菌一样，已有证据表明鸟博德特氏菌的菌毛参予粘附过程，因为鸟博德特氏菌的菌毛抗体可阻断该菌对火鸡气管组织分离块的粘附（22）。但有关鸟博德特氏菌中菌毛介导的粘附的结论性证据尚未得到证实。因此，对于参予细菌在气管上皮纤毛细胞上粘附之特异性蛋白质的认定仍是不明确的。
可能有几种以独立或加和方式起作用的粘附抗原。如果是独立起作用，则由于突变而缺失一种粘附蛋白（adhesin）时不会阻止粘附;如果是起加和作用的，则由突变而缺失一种粘附蛋白时将会降低粘附力（此与粘附的相对重要性成比例）。在这两种情况下，由于抗体-抗原相互作用的空间特性可有效地阻止其它结合物与其受体相互反应，所以抗粘附蛋白抗体可阻止粘附作用。
TnphoA的转座子诱变可用于鉴定细菌细胞的表面蛋白质。TnphoA转座（27）到基因中可导致野生型蛋白质N末端部分与碱性磷酸酶之间的蛋白质融合，同时丢失插入区下游顺序的表达。这些融合的蛋白质被定位到由野生型蛋白质限定的位点上（27）。因此，当将TnphoA插入编码外膜蛋白质、周质蛋白质或分泌蛋白质的基因后，即可在细菌细胞上表达碱性磷酸酶活性（27）。将携带这些插入段的大肠杆菌菌落接种在含有呈色碱性磷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-对位甲基联苯磷酸盐（XP）（作为唯一的磷酸盐）的改良的Neidhardt氏MOPS培养基上培养时，即可根据其呈现的兰色来鉴定这些插入的存在。因为只有存在于胞浆膜外的碱性磷酸酶才表现活性，所以插入到胞浆蛋白质基因中时不能出现兰色菌落。因此，TnphoA诱变为鉴定必须定位于细菌表面的移植抗原（即粘附抗原）提供了一种有效的方法。但这种TnphoA融合可使基因失活，而且如果该基因限定（编码）一种细菌存活所必须的蛋白质时，则将会丢失转座子诱导的突变体。因为博德特氏菌缺少磷酸酶，故可将TnphoA诱变用作鉴定粘附抗原（该抗原用于制作抗博德特氏菌的疫苗）的可靠方法。
也可使用不一定是粘附蛋白的其他外膜蛋白质治疗或预防博德特氏菌感染。具体地说，这些蛋白质或其抗体可以阻断移植抗原在其受体上的附着，从而预防感染的发生。
还可使用抗博德特氏菌外膜蛋白质粗提物的抗体，按本文所述方法鉴定博德特氏菌外膜蛋白质及假定的粘附抗原。可用这些抗体筛选基因库，以鉴定可产生反应性蛋白质的克隆。
已使用无毒的微生物在疫苗组合物中作为载体。可在这些菌株中引入某些突变，使之在宿主中失去存活能力，即这些菌株不能以一种能引起宿主发生损伤或病变的方式存活。在共同申请人的待批申请No.251，304（申请日1988年10月3日，Curtiss和Kelly（13））中已公开了这些突变体，且该文献已列为本文参考文献。
典型的是沙门氏菌突变株，其携带可损伤细菌合成腺苷酸环化酶（ATP焦磷酸裂解酶（环化）EC4.6.1.1）（Cya）和环ATP受体蛋白（crp）之能力的缺失突变。也已制成了携带天冬氨酸-β-半醛（asd）基因之点突变或缺失的突变体。该酶见于内消旋二氨基庚二酸（DAP）合成途径中。DAP是粘肽的必要成分，前者可直接影响到细菌细胞壁的形状和硬度。携带asd突变的细菌只能在小心控制的实验室环境中存活。因此，可将编码asd（Asd+载体）和有用抗原的重组载体导入Asd-载体细胞中。其中只有编码所需抗原的细胞能够存活。使用无毒力的微生物载体来控制博德特氏菌的外膜抗原即可能制成一种抗博德特氏菌感染的有效疫苗。
本发明是基于鉴定和分离在博德特氏菌对气管上皮细胞之粘附中有重要作用的群集抗原和外膜蛋白质而完成的。该抗原可用于疫苗组合物中，以使受试者免于各种感染。此外，可用重组DNA技术生产该疫苗组合物。基于这些发现，本发明提出下列几个实施方案。
在一个实施方案中，本发明涉及纯化的博德特氏菌属外膜蛋白质。另一实施方案则涉及得自鸟博德特氏菌的纯化的外膜蛋白质。
本发明的另一实施方案，涉及到选自一组根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western免疫印迹分析，分子量分别为21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的纯化的鸟博德特氏菌蛋白质。
本发明的另一实施方案，涉及一种在医药上可接受的载体中配制的、含一种或多种博德特氏菌属外膜蛋白质的疫苗组合物。
在本发明的另一实施方案中，所说的疫苗组合物含有选自一组根据用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和Western免疫印迹分析，分子量分别为21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD蛋白质的一种或多种鸟博德特氏菌蛋白质，且其中加有医药上可接受的载体。
在本发明的另一实施方案中，所说的疫苗组合物含有一种分子量约46KD的鸟博德特氏菌粘附抗原。该抗原是在基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性环AMP受体蛋白质和功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或其片段及编码粘附抗原之基因的鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）无毒力衍生株中表达的。该无毒力衍生物包含一个携带编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或其功能性片段之基因和编码粘附抗原之基因的载体。
本发明的另一实施方案，涉及到含有一种或多种鸟博德特氏菌蛋白质的疫苗组合物。所说的蛋白质选自一组根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测和Western免疫印迹分析，分子量分别为21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的蛋白质。这些蛋白质是在基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性环AMP受体蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的鼠伤寒沙门氏菌之无毒力衍生物中表达的。该无毒力衍生株包含一个携带编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或其功能性片段之基因的载体，所说的功能性片段是与编码一种或多种鸟博德特氏菌蛋白质的一个或多个基因相连接的。
在另一实施方案中，本发明涉及一种预防和治疗脊椎动物上呼吸道疾病的方法，该方法包括给被试对象使用有效量的疫苗组合物，该组合物含有与医药上可接受的载体配制的博德特氏菌属外膜蛋白质。优选的实施方案是，该蛋白质由鸟博德特氏菌产生，且该疫苗组合物的给药对象为家禽。
在另一实施方案中，本发明提供了用于表达博德特氏菌属外膜蛋白质的载体微生物，其包括病原微生物的无毒力衍生株，该衍生株实质上不能产生功能性腺苷酸环化酶和功能性环AMP受体蛋白，而能够表达编码该外膜蛋白质的重组基因。
在另一实施方案中，本发明提供了用于表达鸟博德特氏菌粘附抗原（分子量约为46KD）的载体微生物，它包括鼠伤寒沙门氏菌的无毒力衍生株。使无毒力衍生株实质上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性环AMP受体蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶。该载体微生物含有一个携带编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶之基因或其功能性片段及编码该粘附抗原之基因的载体。
在另一实施方案中，本发明提供了用于表达鸟博德特氏菌属蛋白质的载体微生物。所说的蛋白质选自一组用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测和Western免疫印迹分析确定分子量分别为21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的蛋白质。该载体微生物包括鼠伤寒沙门氏菌的无毒力衍生株。该衍生株实质上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性环AMP受体蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶。该载体微生物含有一个携带编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶之基因或其连接到编码一种或多种鸟博德特氏菌蛋白质的一个或多个基因上的功能性片段的载体。
在另一实施方案中，本发明提供了含有表达暗盒的DNA构建物，该构建物由以下部分组成：
（a）编码一个多肽的DNA顺序，该多肽至少含有博德特氏菌属或鸟博德特氏菌外膜蛋白质的一个抗原决定基;
（b）可操作地连接到编码顺序上的控制顺序，从而使该编码顺序能在宿主细胞中转录和转译，而且DNA编码顺序或控制顺序中至少一个是与宿主细胞异源的。
在另一实施方案中，本发明提供了生产这些融合蛋白质的方法，以及生产纯化的、对这些外膜蛋白质特异之多克隆或单克隆抗体的方法。
本专业领域内的技术人员将会理解到本发明的其他一些实施方案。
图1显示克隆到pYA2402的XhoI限制性位点中的XhoI DNA片段的限制性酶切图。其中B＝BamHⅠ，Bg＝BglⅡ，Cla＝ClaⅠ，E＝EcoRⅠ，H＝HindⅢ，Sal＝SalⅠ，S＝SatⅠ，P＝PstⅠ，X＝XhoⅠ，Xb＝XbaⅠ;
＝鸟博德特氏菌GOBL124的DNA;｜ ｜＝从pYA2402上切下的片段，再与Bg1Ⅱ酶切的pCP13连接，连接时可能有两个方向。
图2显示Asd+载体，pYA292的有意义特征。
图3显示对鸟博德特氏菌突变株和亲本菌株的溶菌产物进行免疫印迹分析的结果。泳道A显示STL389的蛋白图形;泳道B显示STL258的蛋白图形;泳道C显示STL167的蛋白图形;泳道D显示STL6的蛋白图形。泳道E显示亲本菌株GOBL124的蛋白图形。泳道F代表分子量标准。
图4显示对携带含GOBL124 DNA插入段之装配型质粒（cosmid）pCP13的大肠杆菌LE392菌落的溶菌产物所作免疫印迹分析的结果。泳道A显示LE392的蛋白图形;泳道B显示含有pCP13克隆之LE392的蛋白图形，所说的克隆中有一个不与分离自非粘着突变株的探针反应的插入段;泳道C显示含装配型质粒pYA2402之LE392的图形;泳道D、E和F显示具有与分离自非粘着突变株之探针起反应的重组插入物的LE392菌株的蛋白图形。最后泳道代表分子量标准。
图5是非粘着突变菌株STL258的电镜图。从中可以看出，细菌外周有菌毛，箭头则指示鞭毛的一个部分（放大30000倍）。
图6显示对鸟博德特氏菌外膜蛋白质的大肠杆菌LE392克隆溶菌产物所作免疫印迹分析的结果。用抗鸟博德特氏菌外膜蛋白质粗提物的抗体探测该溶菌产物。泳道1代表分子量标准。泳道2显示鸟博德特氏菌GOBL124的图形。泳道3-8分别显示含装配型质粒pYA2320、pYA2337、pYA2338、pYA2339、pYA2326和pYA2329之LE392的蛋白质图形。泳道9表示分子量标准。
图7显示对用鸟博德特氏菌感染的火鸡恢复期血清探测的溶菌产物进行免疫印迹分析的结果。泳道1显示鸟博德特氏菌GOBL124的蛋白质图形。泳道2-4分别显示含有装配型质粒pYA2320、pYA2333和pYA2329之LE392的蛋白质图形。泳道5代表分子量标准。
图8是显示质粒pYA2336之有意义特征的酶切图。该质粒含有编码21KD蛋白质的6KD BamHⅠ-PstⅠ鸟博德特氏菌DNA片段。
图9显示对用抗鸟博德特氏菌外膜蛋白质粗提物抗体探测的细菌溶菌产物进行免疫印迹分析的结果。泳道1显示鸟博德特氏菌GOBL124的蛋白质图形。泳道3和4分别显示携带pYA2336之大肠杆菌chi6097和鼠伤寒沙门氏菌chi3987的蛋白质图形。泳道5和6分别显示携带pYA292之大肠杆菌chi6097和鼠伤寒沙门氏菌chi3987的蛋白质图形。
可用本领域内普通技术人员熟知的常规细胞培养及分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学方面的技术（除特别说明者外）实现本发明。有关技术可参见下列文献：Maniatis et al;Molecular Cloning：A Laboratory Manual（1982）;DNA Cloning（1985）vol.Ⅰ and Ⅱ，D.N.Glover（eds.）;Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）;Method in Enzymology（the series），Academic Press，Inc.;Vector：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses（1987），R.L.Rodriguez，et al.，（eds.），Butterworthes;以及Miller，J.H.，et al.，Experiments in Mole-cular Genetics（1972），Cold Spring Harbor Laboratory。
上文或下文中提到的所有专利、专利申请及其他出版物均以其全文列为本文的参考文献。
A.定义
“抗原”是指含有一个或多个抗原决定基的分子，其可刺激宿主的免疫系统使之产生分泌的、体液和/或细胞的抗原特异性反应。该术语也可与“免疫原”交互使用。
“半抗原”是指含有一个或多个抗原决定基的、自身不能刺激宿主免疫系统产生分泌的、体液或细胞反应的分子。
“抗原决定基”是指抗原或半抗原上能结合特异性抗体分子的部位。这一术语也可与“抗原性决定簇”或“抗原决定位点”通用。一个抗原决定基通常至少包含3个，较多见的是5个，更常见的是有8-10个识别空间构象所必需的氨基酸。
对组合物或疫苗的“免疫学反应”是宿主体内发展的对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常这种反应包括使受试对象产生针对目的组合物或疫苗中一种或多种特异抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。
“疫苗组合物”是指用于刺激活生物体的免疫系统以使之免受进一步损伤的药剂。“免疫”是指诱导生物体产生持续高水平抗体和/或细胞免疫反应的方法，其中T淋巴细胞可杀死病原体和/或激活其他细胞（如巨噬细胞），这些免疫反应是针对所说的生物体先前接触的病原体或抗原的。虽然术语“免疫系统”可包括单细胞生物体对外来因子的反应这一含意（如干扰素的产生），但在本申请中该术语只限于多细胞生物体产生特异抗体的特性和机制，所说的抗体可对抗侵入该生物体的细胞或细胞外液的抗原物质。如此产生的抗体可以是A、D、E、G或M等各类免疫球蛋白。
其中特别有用的是可刺激产生免疫球蛋白A（ⅠgA）的疫苗，因为它是温血动物之分泌系统产生的主要免疫球蛋白。已对抗原的免疫反应作了深入研究，并已有许多这方面的报导。有关免疫学的综述可参见Barrett，James T.，Textbook of Immunology：Fourth Edition，C.V.Mosby Co.，St.Louis.Mo（1983）。鸟类具有包括消化道相关淋巴组织[称为GALT或派伊尔氏斑（Peyer′s patches）]、支气管相关淋巴组织（BALT）及位于眼球上部中间编后部位的哈德氏腺（Harder′s gland）在内粘膜免疫网络。当抗原浸入这些组织时，会激发体内分泌组织和腺体中B细胞的增殖和分化，最终产生分泌型IgA（SIgA）（6、10、25、28、47、15、30、31）。SIgA能阻止特异性表面抗原粘附或侵入粘膜表面（39、48）。
“脊椎动物”是指脊椎动物亚门中的任一成员，脊索动物门的主要分类包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳动物，它们的特征是具有分节的骨或软骨质脊髓腔。所有脊椎动物均具有功能性免疫系统，并通过产生抗体而与抗原反应。
“禽类”是指家禽、野鸟和狩猎鸟，如公鸡和母鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟以及其他鸟。它们可以是任何令期的鸟。
“微生物的无毒力衍生株”是指用特定的无毒力微生物感染时基本上不会使宿主患病的生物体。无毒力并非指该属或种微生物在任何情况下都不是病原体，而是所用的特定微生物对被处理的特定动物来说是无毒力的。该微生物可属于正常致病性菌属或菌种，但必须是无毒力的菌株。“致病性”是指导致疾病或破坏正常生理功能的能力。与有毒力的致病菌相比，无毒力菌株不能引起呈现全部病征的疾病。本文所用的术语“微生物”，包括细菌、原生动物和单细胞真菌。
“载体微生物”是上文限定的无毒力微生物，它含有并表达编码所需蛋白质如博德特氏菌属外膜粘附抗原或外膜蛋白质的重组基因。
“外膜粘附抗原”是指位于细菌细胞外膜上并参予病原菌对宿主靶细胞粘附的抗原。博德特氏菌属的宿主靶细胞是气管上皮细胞。该粘附抗原的例子是见于鸟博德特氏菌的分子量约为46KD的蛋白质。本文定义的“外膜蛋白质”是指能与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白质粗提物抗体（按实验部分所述方法分离并提取的）反应的蛋白质。这些外膜蛋白质包括但不只限于以下述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量分别为21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa和50KDa的蛋白质。外膜粘附抗原也可以是外膜蛋白质。外膜蛋白质可以是或不是粘附抗原。由这些蛋白质产生的抗体可预防博德特氏菌感染。另一方面，由此产生的这些蛋白质或抗体可通过干扰这些抗原或细胞表面受体的结合而阻断粘附抗原的作用。
“纯化的蛋白质或抗原”是指基本上无其他杂质的蛋白质或抗原。例如，蛋白质A实质上不含B，B是其他细胞成分与蛋白质的混合物，则纯化的蛋白质是指A至少为A+B之总量的30%;较好是至少占50%，更好是至少占75%，最好是占90-95%，甚至99%（重量）。“纯化”不是指蛋白质的生产方法。因此，纯化的蛋白质可通过DNA重组方法、合成方法或直接由自然界含该蛋白质的生物体中分离得到。
术语“多肽”有很广的含义，即可以是通过肽链连接的任何氨基酸聚合物（二肽或更多肽）。因此，“多肽”包括蛋白质、寡肽、蛋白质片段、类似物、天变蛋白质、融合蛋白质等。这一术语还包括突然和重组的蛋白质。
“天然的”蛋白质或多肽是指从天然来源中发现的蛋白质或多肽。因此，“天然博德特氏菌蛋白质或多肽”包括天然存在的博德特氏菌蛋白质及其片段。
“重组”多肽是指由重组基因表达的多肽，即由编码所需多肽的外源DNA构建物转化的细胞所产生的多肽。
“重组基因”是较大多核苷酸分子内的可鉴别的多核苷酸片段，它与天然大分子无关。
“复制子”是指任何遗传成分（如质粒、染色体、病毒），它能在体内作为DNA复制的自主单位，即能在其自身控制下复制。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘性质粒，它上面可接有另一个DNA片段，从而可与被连接的片段一起复制。
DNA“编码顺序”是一段DNA顺序，当该顺序被置于合适的调控顺序控制下时，它能在体内转录或转译成多肽。该编码顺序的边界是由位于5′（氨基）端的起始密码子和3′（羧基）端的转译终止密码子确定的。编码顺序可包括但不仅限于原核生物顺序、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物（如哺乳动物）DNA的基因组DNA顺序及合成的DNA顺序。转录终止顺序通常位于编码顺序的3′端。
“启动子顺序”是指细胞中能结合RNA聚合酶并启动下游端（3′方向）编码顺序转录的DNA调节区。为更清楚地限定本发明，该启动子顺序系结合于编码顺序之转译起始密码子（ATG）的3′端，并向上游（5′方向）延伸以含有最小数目的、高于本底之可检测水平的启动转录所必需的碱基或单元。在启动子顺序中含有转录起始位点（通常由核酸酶S1的酶切图所限定），以及结合RNA聚合酶的蛋白质结合区（共感顺序）。真核生物启动子常常（但不总是）含有“TATA”和“CAT”暗盒。原核启动子除含有-10和-35区的共感顺序外还含有SD（Shine-Dalgarno）顺序。
DNA“控制顺序”总体说来是指启动子顺序、核糖体结合位点、聚腺苷酸化加尾信号、转录终止顺序、上游调节区及增强子（enhan-cers）等。它们均可使编码顺序在宿主细胞中得以转录和转译。
当RNA聚合酶与启动子顺序结合并将编码顺序转录成信使核糖核酸（mRNA），然后再将mRNA转译成该编码顺序所编码的多肽时，编码顺序在细胞内即被“可操作地连接到”控制顺序上或处于控制顺序的“控制下”。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”及其他代表微生物的这类术语均可互换使用。它们是指能或已用作重组载体或其他被转移DNA之接受体的细胞，并包括原始被转染细胞的后代。应该明确的是，由于偶然或人为的突变，单个亲代细胞的后代在基因组或总DNA互补性上不一定与亲代完全相同。亲代细胞的后代包括那些就相关特性（如用连接于编码所需基因产物之结构基因上的已克隆的基因取代编码重要酶的天然基因）与亲代十分相似的细胞。
“克隆”是由单个细胞或共同祖细胞经细胞分裂所产生的细胞群体。细胞系是指能在体外稳定生长许多代的原始细胞的克隆。
“基因库”是指已克隆之基因的集合体，通常包含许多或所有的特定基因。其构建程序是，首先用选定的限制性内切酶处理DNA，然后将酶切片段克隆到合适的载体中。用得自相关生物体的同源DNA顺序探查基因库，以鉴定该库内含有所需基因的克隆。
DNA构建体的“异源”区是指DNA分子中或与其连接的其他DNA分子（与自然界中存在的其他分子无关）中的可鉴定的DNA片段。因此，当异源区编码细菌基因时，该基因侧接的通常不是来源细菌之基因组中细菌基因的侧冀DNA。异源编码顺序的另一个例子是一种构建体中的编码顺序本身并不是自然界存在的（如与天然基因有不同密码子的合成基因）。等位基因变异或自然发生的突变不会产生本文所说的DNA异源区。
“转化”在本文中是指将外源多核苷酸插入宿主细胞所使用的方法，如直接摄入、转导或连接等方法。所说的外源多核苷酸可以象质粒一样得以保留，或被整合到宿主基因组内。
B.一般方法
本发明包括发现可将博德特氏菌属的外膜粘附蛋白，以及能够与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白粗提物之抗体起反应的蛋白质，可用于抗博德特氏菌感染的疫苗组合物中。由于粘附蛋白质存在于细菌外膜上，所以使用TnphoA进行转座子诱变便为鉴定本发明的抗原提供了一种方法。可通过与大肠杆菌供体接合而将TnphoA导入博德特氏菌的细胞中（详见下文所述）。当TnphoA转座到博德特氏菌染色体中时，它总是获得抗卡那霉素抗性，如果TnphoA插入编码穿越胞浆膜运输之蛋白质的基因中，则可产生碱性磷酸酶。通常碱性磷酸酶是博德特氏菌属所没有的。因此，可在含卡那霉素的培养基中选择出转座子诱导的突变体，并通过水解加在培养基中的显色底物5-溴-4-氯-3-碘-对位甲苯磷酸铵（XP），来检测碱性磷酸酶基因的表达。在使用鸡和火鸡的气管环进行体外试验中筛选能在气管上皮细胞上附着的突变株。可按下述方法用各种菌株接种合适的动物，从而在体内研究粘附和非粘附菌株的群集情况。
可用普通的限制性内切酶部分消化来自证明损伤粘附力之突变株的染色体DNA。可使用琼脂糖凝胶分离各限制性片段。由于TnphoA长约7.5Kb，故可由该凝胶中切上长度大于7.5Kb的片段，用电洗脱法洗脱，并连接于合适的经消化的质粒中（详见下文）。可用这些构建体转化大肠杆菌并选择具有卡那霉素抗性的菌落。可用含有从突变株中分离之DNA的质粒作为探针，检测由野生型博德特氏菌制得的基因库中粘附基因的存在。
可按实验部分所述的方法，对突变株和野生株的溶菌产物进行Western免疫印迹分析，并鉴定粘附抗原。可用常规方法分离这些蛋白质。
各种博德特氏菌外膜粘附蛋白质有着高度的同源性。很可能用携带编码这样一种蛋白质基因之TnphoA片段的质粒来检测其他博德特氏菌属的相似粘附蛋白。而且，抗一种博德特氏菌外膜粘附抗原的多克隆抗体（详见下文）很可能与其他种博德特氏菌的外膜粘附抗原产生交叉反应。
另外，可用博德特氏菌外膜蛋白质的粗制剂制备抗体，该抗体又可用于重组体表达的筛选。从而可鉴定并进一步定性能表达与这些抗体起反应之蛋白质的克隆，并试验这些蛋白质与气管上皮细胞结合的能力。这些蛋白质也可以是粘附抗原。
可用本领域内熟练技术人员已知的各种方法测定已分离的蛋白质顺序。例如，可重复进行Edman降解，然后用HPHC法分析氨基酸。反复多次后，即可测出纯化之蛋白质中目的蛋白质的氨基酸顺序。其他检测氨基酸顺序的方法是本技术领域中已知的。
可用依据上述方法测定的氨基酸顺序设计寡核苷酸探针，该探针含有一部分已确定的氨基酸顺序的密码子，用于从DNA库中筛选目的蛋白质的基因。制备寡核苷酸探针和构建DNA库以及用核酸杂交法进行筛选的基本战略，是本领域中熟练技术人员已知的（如参见DNA Cloning：Vol.Ⅰ，上述文献;Nuclecic Acid Hybridization，上述文献;Oligonucleotide Synthesis，出处同上;Maniatis，T.，et al，上述文献）。
首先构建DNA库。该库可由博德特氏菌属的基因组DNA库构成。一旦构建了该库，即制备探测该库的寡核苷酸，并用于分离编码外膜蛋白质的基因。可用任何合适的方法合成寡核苷酸。选出特定的核苷酸顺序，以使其与编码所需博德特氏菌抗原的已知氨基酸顺序的密码子相一致。由于遗传密码子的简并性，通常必须合成几条寡核苷酸才能覆盖所有的或一定数目的核苷酸顺序（以足够编码蛋白质的某个特定区域）。因此，最好选择不含密码子有高简并性之氨基酸区域来设计探针。在某些情况下，本领域技术人员发现，须制备相当长的探针和/或与包含的氨基酸顺序区域相应的核酸顺序有高度的重复性，特别是当目的蛋白质具有这样的特征性长度和/或重复区的情况下。可以在一次杂交试验中使用两个（或一组）探针，各探针用于探查基因的不同区域。寡核苷酸的自动化合成使得制备家族探针的工作更为简化。虽然对所用探针的确切长度要求并不严格，但一般认为，约14-20个碱基对的探针是有效的。不过也可以使用约25-60个碱基对的较长探针。
按标准方法用标记物如放射性核苷酸或生物素标记选定的寡核苷酸探针。然后将已标记的一组探针用于筛选步骤，其中包括按标准方法使单链（ss）探针与从DNA库中分离的单链DNA杂交。杂交条件可以是严格的或者比较随意的，这将取决于探针长度、探针是由同种菌或由进化中形成的近亲或远亲菌种（作为DNA库）得到的某因素。本领域技术人员可根据已有知识选择合适的条件（参见Nucleic Acid Hybridization，文献同上）。基本要求是要有足够严格的杂交条件，以便进行选择性杂交;即杂交是由于核酸的充分同源性而发生的（如至少约有75%的同源性），而不是非特异性结合。一旦经过阳性杂交鉴定了来自己筛选库的克隆后，即可通过限制性酶切分析和DNA顺序测定来进一步证实该克隆是否含有编码所需蛋白质的基因。
另外，也可用合成方法而不是克隆技术制得编码所需蛋白质的DNA顺序。可根据特定的博德特氏菌氨基酸顺序的适当密码子设计该DNA顺序。一般说来，若将该顺序用于表达时，最好选择宿主更易接受的密码子。整个顺序是由依照标准方法制得的交迭寡核苷酸组装而成的完整编码顺序（如参见Edge，Nature（1981）292;756;Nam-bair et al.，Science（1984）223：1299;Tay et al.，J.Biol.Chem.（1984）259：6311）。
一旦制备和分离了所需蛋白质的编码顺序后，即可将其克隆到合适的载休或复制子中。许多克隆载体都是本领域内熟练技术人员已知的，问题在于要选择更适用的克隆载体。例如，适用于克隆的重组DNA载体及可转化的宿主细胞包括噬菌体λ（大肠杆菌）、pBR322（大肠杆菌）、pACYC177（大肠杆菌）、pKT230（革兰氏阴性菌）、pGV1106（革兰氏阴性菌）、pLAFR1（革兰氏阴性菌）、pME290（大肠杆菌以外的革兰氏阴性菌）、pHV14（大肠杆菌和枯草杆菌）、pBD9（芽胞杆菌）、pIJ61（链霉菌）、pUC6（链霉菌）、YIp5（酵母）、YCp19（酵母）及牛乳头瘤病毒（哺乳动物）（参见DNA Cloning：Vols.Ⅰ&Ⅱ，文献出处同上;Maniatis，T.，et al.文献同上;perbal，B.，文献同上）。
可将博德特氏菌外膜蛋白的编码顺序置于启动子、核糖体结合位点（用于细菌表达）和操纵子（本文中总称为“控制”元件）的控制下，从而使编码该蛋白质的DNA顺序能在被含该表达结构之载体转化的宿主细胞内转录成RNA。编码顺序可含有或不含信号肽或引导顺序。可使用天然博德特氏菌启动子或能在革兰氏阴性菌中发挥功能的其他已知启动子如tac或trp启动子表达本发明的全长博德特氏菌蛋白质。
当载体微生物中存在外膜抗原时，该抗原将在只允许在被免疫宿主体内表达的启动子的控制下得以正常表达。但如果要大量生产蛋白质，则须外加一个调节顺序，用以调节与宿主细胞生长有关的抗原顺序的表达。调节顺序对本技术领域内的熟练技术人员来说是已知的，它包括能在化学或物理刺激物（包括调节化合物）存在下，打开或关闭基因之表达的调节顺序。载体中也可存在其他调节顺序元件，如增强子顺序。也可以融合蛋白的形式表达该目的蛋白质，其中异源氨基酸顺序是在融合蛋白质的N端被表达的（如参见美国专利4431739号.4425437号）。
构建一个表达载体，以使特定的编码顺序定位于具有合适调节顺序的载体中，该编码顺序的位置和方向要与控制顺序相适应，以使编码顺序的转录处于控制顺序的控制下（即使RNA聚合酶在控制顺序处结合到DNA分子上，以转录编码顺序）。可望通过修饰特定目的抗原的编码顺序来达到这一目的。例如，在某些情况下，必须修饰该顺序才能使其以合适的方向连接到控制顺序上;即保持该读码不变。可在插入载体之前将控制顺序及其他调节顺序连接到编码顺序上。另一方法是，将编码顺序直接克隆到已含有控制顺序和适当限制性酶切点的表达载体中。
在某些情况下，可望加入先导顺序以使多肽由宿主生物体内分泌出来，然后再切掉该分泌信号（这种情况即使有也很少见）。可在转译后加工过程中从细菌宿主中除去先导顺序（参见美国专利4431739号，4425437号、4338397号）。也可以产生目的抗原的突变型或类似物。可通过缺失部分抗原编码顺序。插入一段顺序和/或替换顺序中的一个或多个核苷酸来制备突变型或类似物。例如，用于免疫宿主的蛋白质可含有刺激辅助细胞的抗原决定基及刺激抑制细胞的抗原决定基。因此，缺失或修饰这些先导核苷酸是可行的。修饰核苷酸顺序的方法，如定点诱变法是本领域内技术人员已知的（如参见Maniatis，T.et al.，文献同上;DNA Cloning，Vols Ⅰ&Ⅱ，文献同上;Nucleic Acid Hybridization，文献同上）。
许多原核表达载体都是本领域中已知的（如参见美国专利4440859、4436815、4431740、4431739、4428941、4425437、4418149、4411994、4366246、4342832;和英国专利申请2121054、2008123、2007675以及欧洲专利申请EP103395。
根据选用的表达系统和宿主，可在目的蛋白质得以表达的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞，以生产本发明的蛋白质。然后从宿主细胞中分离特定的博德特氏菌蛋白并纯化之。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，即可直接从培养基中纯化该蛋白质。如果蛋白质已被运输到细胞周质中，则可用现有技术中已知的冷渗透体克方法，使其释放到培养基中。如果该蛋白质没有分泌出来或没被运输到细胞周质空间，则可以从细胞溶解产物中分离之。本领域技术人员可以选择合适的培养条件和回收方法。
也可用现有技术中已知的标准蛋白质纯化方法，由博德特氏菌培养物中分离本发明的抗原（如参见Protein Purification Priciples and Practice（1987），2nd.ed.，R.R.Scopes（ed.））。这些技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、免疫吸附层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳及其他电泳方法、离心法、透析法及沉淀法。
也可根据已知的氨基酸顺序或从目的基因的DNA顺序推测的氨基酸顺序，通过化学合成如固相肽合成法生产本发明的抗原。这些方法是本领域内技术人员已知的，如果所研究的抗原的小片段能在试验对象体内产生免疫反应，则化学合成肽更为可取。
可用本发明的蛋白质或其片段生产多克隆或单克隆抗体。如需要得到多克隆抗体，可用本发明的抗原或其片段或突变抗原免疫选择的鸟类或哺乳动物（如鸡、火鸡、小鼠、兔、羊、马等）。按照已知方法收集并处理被免疫动物的血清。如含有抗目的蛋白之多克隆抗体中混有抗其他抗原的抗体，可按已知方法用免疫亲合层析技术纯化该多克隆抗体。
本专业熟练技术人员也能很容易地生产抗本发明蛋白质及其片段的单克隆抗体。用杂交瘤技术生产单克隆抗体的普通方法学是众所周知的。可经细胞融合，及用致癌基因DNA直接转化B淋巴细胞或用E-B病毒转染等其他技术得到永久性抗体生成细胞系（如参见Schreier，M.et al.，Hybridoma Techniques（1980）;Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas（1981）;Kennett et al.，Mohoclonal Antibodies（1980）;以及美国专利US4341761、4399121、4427783、4444887、4452570、4466917、4472500、4491632及4493890号）。可根据各种特性，如同型或抗原决定基亲和性等筛选一组抗目的抗原或其片段的单克隆抗体。可使用免疫亲和技术，用抗目的抗原的单克隆抗体来纯化该抗原。
可用按上述方法生产的本发明外膜蛋白质免疫被试对象，以使其能抵抗博德特氏菌诱发的疾病。可借助无毒力载体微生物给予本发明的抗原。因为合适的载体微生物能侵入GALT和BALT并在其中增殖，所以这种使用方法是特别适宜的。抗原进入BALT或GALT细胞后，可诱发细胞产生上述的总体化分泌性免疫反应及体液和细胞免疫反应。
可将含目的蛋白质基因的重组质粒导入某种无毒力细菌的菌株中，这些菌株含有在靶宿主中长期存活所必须的突变基因。特别有用的是上述的cya、crp和asd突变株，但其他无毒力微生物也可用于本发明。如果用Asd-突变株，可用编码粘附抗原和asd的载体将目的粘附抗原转移到载体微生物中。因此，只有那些含所需粘附抗原的载体微生物才能存活，并可进一步在其中克隆编码所需粘附抗原之基因的载体。然后将该载体转移到Asd-载体微生物中。编码所需抗原的重组基因的表达可依赖于连接该Asd基因的控制顺序。这种连锁关系是由载体中两个基因的取向而决定的，从而使这两个基因都处于相同控制因子即同一启动子和操纵子的控制之下。用重组DNA技术构建具有这些特性的载体是本领域中已知的，并在待批专利申请251304号中作了详细讨论。
有用的无毒力微生物包括但不只限于沙门氏菌和大肠杆菌-沙门氏菌杂交株的突变衍生菌。优选的微生物是沙门氏菌属的成员，如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、伤寒沙门氏菌（S.typhi）、付伤寒沙门氏菌（S.paratyphi）、鸡沙门氏菌（S.gallinarum）、雏沙门氏菌（S.pullorum）、肠类沙门氏菌（S.enteritidis）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、亚利桑那沙门氏菌（S.arizona）或都伯林沙门氏菌（S.dublin）。鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的无毒力衍生株可用于许多宿主。鸡沙门氏菌、雏沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌的无毒力衍生株特别适于免疫鸟类，而免疫人最好用鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和付伤寒沙门氏菌的无毒力衍生株，最好用猪霍乱沙门氏菌免疫猪，用都伯林沙门氏菌免疫牛。这些无毒力沙门氏菌菌株能够定居到GALT和BALT上存活几周而不使宿主致病。在共同待批专利申请251304号及Curtiss和Kelly的文献（13）中已描述了产生这些突变菌的方法。
为了更好地刺激GALT或BALT反应，最好通过口服、鼻内给药、胃插管或气雾剂等形式和气囊接种（只用于鸟类）和气管内接种等方法，将该微生物或基因产物直接导入消化道或支气管内。其他合适的方法包括通过结合膜达到哈德氏腺给药和乳腺接种。其他疫苗接种方法如静脉、肌肉或皮下注射也是适用的。这些给药途径主要用于刺激如下所述的二次免疫反应。
通过饮水给药是一种特别适用于鸟类的给药方法。即将表达博德特氏菌外膜抗原的载体微生物直接放在这些动物的饮用水中。也可在卵孵化之前（一般约18天前），将疫苗注入卵内达到卵内接种的目的。
一般说来，给人或其他哺乳动物使用表达博德特氏菌抗原的载体微生物时，要按已知方法用合适的明胶类物质包被或胶囊包裹之。
载体微生物进入动物体后，必须使动物免疫系统获得该抗原。当载体微生物死亡并释放出抗原分子时才能达到上述目的。当然，也可使用“渗透”型无毒力突变菌，该菌无需溶菌即可将内涵物释放到周质中。另一种方法是选择一个控制抗原产生的基因，以便在载体细胞死亡前，使由该细胞产生的抗原进入外界环境中。
也可不用载体微生物，而只通过给予目的蛋白质或其片段或其类似物，用本发明的抗原免疫被试对象。如使用抗原片段或类似物，它应包含一个或多个可与免疫对象的免疫系统相互作用的抗原决定基的氨基酸顺序，从而达到预期的免疫效果。在免疫接种前，最好先增加博德特氏菌蛋白质或其类似物或其片段的免疫原性。此可用本领域内技术人员已知的任何一种方法来实现。例如使用连接到载体上的抗原肽，如将片段连接在大分子载体上。合适的载体一般是大的、代谢缓慢的分子，如蛋白质、多糖（如琼脂糖、纤维素、纤维素小珠等）、多聚氨基酸（如多聚谷氨酸、多聚赖氨酸等）、氨基酸共聚物及无活性的病毒颗粒。特别有用的蛋白质底物是钥孔
血兰蛋白（KLH）、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、大肠杆菌的热不稳定性毒素或霍乱毒素的β亚单位，以及本领域内已知的其他蛋白质。
可使用天然形式的蛋白质底物，或者以化学方法对其功能性基因进行修饰，如赖氨酸残基的琥珀酰化或与胱氨酸巯基内酯反应。也可利用氨基功能基与2-亚胺基硫代烃（2-iminothiolane）或3-（4-二硫代吡啶基）丙酸盐的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，而将巯基掺入载体（或抗原）中。也可以修饰适当的载体，以加入一个空间臂（如环己二胺或其他有相似大小的双功能分子）。
此外，在没有载体微生物的情况下给药时，可将博德特氏菌抗原以中性形式或盐形式加到疫苗组合物中。医药上可接受的盐包括酸加成盐（与活性多肽的游离氨基形成的）和与无机酸（如盐酸或磷酸）或有机酸（如乙酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等）形成的盐。也可以是游离羧基与无机碱（如氢氧化钠、钾、铵、钙或氢氧化铁）及有机碱（如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等）形成的盐。
一般抗原在没有无毒力载体的情况下使用时，可制成气雾剂或经鼻内途径使用。哺乳动物的鼻内用药配方通常含有不会刺激鼻粘膜，也不会影响纤毛功能的载体。稀释剂如水、盐水或其他已知物质也可用于本发明。鼻内给药的配方中还含有防腐剂，其包括但不仅限于氯丁醇和benzalkonium chloride。可加入表面活性剂以增加鼻粘膜对目的蛋白质的吸收。
在进行口内、鼻内、胃或气雾剂免疫接种之前，还可同时注射病原体衍生的基因产物。一旦用表达该病原体衍生之基因产物的载体微生物免疫接种以刺激GALT或BALT的淋巴样细胞，并引发分泌性免疫系统后，这种肠胃道外免疫即可作为加强免疫手段，用于增强分泌性免疫反应的表达。增强反应可以是继发反应、加强或既往反应，结果会延长对寄主的免疫保护作用。如反复进行加强免疫接种，效果可能更好。
如将疫苗制成用于加强免疫的可注射剂，其剂型可以是水溶液或悬浮液;也可制成固体形式的，注射前再加入液体载体配成溶液或悬浮液。也可使该制剂乳化或将活性成分包裹在脂质体载体中。活性免疫原成分通常与含医药上可接受之赋形剂的载体混合。适用的载体包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或其混合物。此外，必要时还可含有少量辅助剂如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或能增强疫苗效力的佐剂。佐剂可包括胞壁酰二肽、avridine、氢氧化铝、油、皂甙及其他已知物质。这些剂型的配制方法是已知的，或对本技术领域内普通技术人员来说是显而易见的（如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA，15th ed.，1975）。无论如何，所使用的组合物或制剂均应含有足够量，以使待处理对象达到所要求的免疫状态。
使用的抗原量将取决于待处理对象，其免疫系统合成抗体的能力及期望达到的保护程度。本领域普遍技术人员通过测定剂量反应曲线的常规试验即可很容易地确定有效剂量。至少使用一次含或不含载体微生物的特定抗原或其片段或类似物来免疫被试对象。用载体微生物时，一般剂量为1×106-1×1010个重组无毒力细菌/免疫对象。如使用无毒力微生物的蛋白质时，疫苗的初始剂量为0.001-1mg抗原/Kg体重。再者，当需要保护对博德特氏菌的免疫状态时，可增加使用剂量及免疫次数。
以上对本发明作了一般性的描述，下列实施例将更清楚地说明发明的技术内容。这些实施例决不构成对本发明范围的限制。
用于实施本发明之菌株的寄存
下列菌株的生物学纯培养物已寄存在美国典型培养物保藏中心（ATCC），12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland。存活试验后确定了寄存号并支付了保藏费用。根据37CFR1.14和35USC122的规定，在专利申请待批期间，专利局局长有权确定获得该培养物的人，直到该申请被授予专利后才能取消对公众获得该培养物的所有限制。指定的寄存期自寄存日起30年，或到期后再延续5年，或美国专利的实施有效期（这一期限较长）。如果培养物未能存活或由于疏忽而受到损坏，或含质粒的菌株中质粒丢失，应用有相同分类描述的活的培养物替换之。
菌株 寄存日期 ATCC号
chi4064 July 15，1987 53648
chi4072 Oct.6，1987 67538
pYA292 Asd+
in chi6097 Sept.26，1988 67813
pYA2402
in chi6121 March.28，1989 67921
pYA2336
in chi3987 March 22，1990 -
pYA2326
in LE 392 March 22，1990 -
pYA2333
in LE 392 March 22，1990 -
pYA2337
in LE 392 March 22，1990 -
pYA2338
in LE 392 March 22，1990 -
pYA2339
in LE 392 March 22，1990 -
C.实验
1.材料和方法
除特别指出者外，每次实验均使用下列材料和方法。
菌株、培养基和载体：从得自Y.M.Saif（OH）的菌株197中分离鸟博德特氏菌GOBL124。已发现该菌株对幼小火鸡、凝集的豚鼠红血细胞有毒性，并通过对底物的氧化碱化鉴定其为鸟博德特氏菌。为达到最大粘附，在体外粘附试验前，使GCBL124于37℃下在添加有15%去纤维羊血的Bordet-Gengou琼脂（BGB琼脂）上或心脑浸液培养基（BHI）上生长24小时。GOBL124是各种载体中使用的DNA染色体源。大肠杆菌菌株生长于LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、0.1%葡萄糖、1.5%琼脂）上。培养基中添加有适当的抗生素。自杀载体pRT733为携带TnphoA之pJM703.1（29）的衍生株，它是在其供体大肠杆菌菌株SM10-λ-pir中由J.J.Mekalanos（29）提供的。粘性质粒pYA2329是使1.8Kb SacⅡ-KpnⅠ消化的、经T4DNA聚合酶处理的pUCD2之携带壮观霉素抗性的DNA片段连接到SalI消化的经Klenow酶处理的pCP13上而构建的。
动物：能育的Nicholas火鸡卵得自Cargill.Inc.，Elgin，MO。能育的白色来享鸡卵得自SPAFAS.Inc.，Roanoke，IL。在21型Humidaire孵化器中孵化至产出小鸡。
试剂：除另外指出者外，试剂均得自Sigma，St.Louis，MO。Bordet-Gengou琼脂和用于配制LB、BHI培养基的试剂购自Difco Labora-tories，Detroit，MI。羊血得自Drown Laboratories，Topeka，KS。限制性内切酶和T4DNA连接酶得自International Biotechno-logies，Inc.，New Haven CT，并按厂商推荐的方法使用之。辣根过氧化物酶连接的羊抗火鸡免疫球蛋白得自ICN Immunochemicals，Lisle，IL。
含抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体的多克隆血清：在新西兰白兔皮内注射纯化的鸟博德特氏菌GOBL124外膜蛋白质，得到多克隆抗血清。按Rapp等人的方法（稍加改动）制备鸟博德特氏菌GOBL124外膜蛋白质（49）。于37℃下，在1升SSM-S培养基中振荡过夜使鸟博德特氏菌菌GOBL124生长至滴度为9.9×108/ml。离心沉淀细胞，再悬浮于50mlpBS（pH7.5）中，并用Heat Systems-Ultrasonics Inc.Mode W185D超声细胞破碎器（调至40瓦，输出功率50%）进行超声处理，共处理4次，每次间隔5分钟。每次处理之间将处理物置于冰上保温5分钟。4℃下以2，000g离心沉淀细胞碎片20分钟。取上清液，用SS34转子4℃下以19，000rpm离心1小时，除去细胞膜。将沉淀物再悬浮于5ml PBS（pH7.5）中，测得蛋白质浓度为4mg/ml。向悬浮的膜中加入1体积2%十二烷基肌氨酸钠（在PBS中，pH7.5）使其浓度达到1%。室温下搅拌30分钟，用SS34转子以19，000rpm离心1小时，以沉淀不溶性外膜蛋白质。将沉淀的蛋白质悬浮在2ml PBS（pH7.5）中，测得蛋白质浓度为2.5mg/ml。
皮内注射500μg纯化的外膜蛋白质（OMP）制剂（加有等体积完全弗氏佐剂）免疫兔。2周后，再次皮内注射500μgOMP制剂（与等体积不完全弗氏佐剂混合乳化）以加强免疫。抽小量兔血，用所得血清检测产生鸟博德特氏菌外膜蛋白质的大肠杆菌重组体克隆（详见下述）。定期用500μg OMP制剂（混有不完全弗氏佐剂）进行加强免疫，抽取大体积（40ml）兔血，并收集血清。将血清于-20℃下冻干或与等体积100%甘油混合，保存于-20℃下备用。
火鸡恢复期血清：使孵出4天的Nicholas火鸡雏与已感染鸟博德特氏菌GOBL124的30天令火鸡（已感染2天）接触，并使之接触感染。接触40天后将小火鸡麻醉并采血得到恢复期血清，用以检测产生与其反应之蛋白质的大肠杆菌克隆。另外，也可用1.5×107个细菌经鼻内感染1天令的火鸡雏，感染后1个月采血，得到抗鸟博德特氏菌抗血清。
Western免疫印迹法：在样品缓冲液（50mM Tris-HCl，pH6.8，10%甘油、1%SDS、1%2-β-巯基乙醇、0.01%溴酚兰）中煮沸整个细菌细胞以使之变性，并按Laemmli所述方法（24）进行SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。用已知方法（40）将凝胶转移到硝酸纤维素滤纸上。用缓冲液A（50mM Tris、150mM NaCl、3%牛血清白蛋白，pH8）饱和滤纸，与抗鸟博德特氏菌的恢复期火鸡抗血清或抗鸟博德特氏菌外膜蛋白质抗体保温，在缓冲液A中洗涤，与辣根过氧化物酶结合的羊抗火鸡免疫球蛋白保温，并用4-氯-1-萘酚显色。
2.鸟博德特氏菌的诱变
按Bradley等人的平皿培养法（8）、经与pRT733的大肠杆菌菌株SM10-λ-pir供体接合，将TnphOA转移到鸟博德特氏菌中。4小时后将细胞散布在添加有25μg/ml四环素、150μg/ml链霉素、75μg/ml卡那霉素和40mg/ml碱性磷酸酶的产色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐的BHI琼脂上。37℃保温5天后，收集兰色的鸟博德特氏菌菌落。由于只有碱性磷酸酶位于外膜中或细胞外周质中时，该酶活性才得以表达，而且由于PhoA基因的启动子和信号顺序在TnphoA中丢失，所以兰色菌落是在连有与蛋白质输出有关之启动子和信号顺序的读码中发生了PhoA转位和融合的菌落。
约0.2%的转移接合体是兰色的，因此PhoA是与编码细菌膜外或周质中蛋白质之基因的启动子和信号顺序相联接的。几次实验后，共收集到487个兰色克隆。
3.鸟博德特氏菌粘附于气管细胞的体外试验
由于鸟博德特氏菌对纤毛上皮细胞的粘附是很特异的（2），故可用下述方法，根据TnphoA诱导的突变株与这些细胞的结合能力来筛选之。无菌分离1周令小鸡或火鸡的气管，切成长2mm的环。使5×109个鸟博德特氏菌在BGB琼脂上生长并悬浮于1ml缓冲液B（150mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Na2HPO4，pH7.4）中，然后与气管环3℃下保温30分钟。用缓冲液B洗5次以除去未粘附的细菌。在旋转器（30rpm）上，将气管环在100μl1%Triton X-100（在缓冲液中配制）中37℃保温5分钟，以回收粘附的细菌。将细菌悬液的系列稀释液散布于BHI琼脂上，37℃保温24小时，并计数粘附细菌的数目。对每个菌株重复分析3次。
4.体内移殖
分别将各菌株的1.5×107个或1.5×109个菌落形成单位（CFU）接种于5只1天令火鸡鼻内，以体内检测按上述方法选出的亲代菌株和未粘附的突变株。2周后，CO2窒息杀死动物，无菌切除气管，用OMNI混合器（Dupont，Wilmington，DE）在3ml缓冲液B中打成匀浆。将稀释液散布在含25μg/ml四环素和150μg/ml链霉素的BH琼脂上。
表1中给出了野生型菌株和4个非粘附（Adh-）突变菌株（分别定名为STL6、167、258和389）在分离的气管环上的粘附结果。其他TnphoA产生的突变株粘附效力与野生型菌株相同。表1还给出了用这些菌株感染火鸡的结果。虽然当给火鸡接种1.5×107CFU后，从火鸡组织上不能分离到突变菌，但当生物接种物为1.5×109CFU时，则可从所有火鸡组织上分离到细菌。在气管环粘附的体外试验中，可见到这些回收的细菌是同野生型菌株一样粘附的。
表1
野生型和TnphoA诱导的鸟博德特氏菌突变株的粘附和移殖接种2
周后从气管环上回收的CFU（lOg）b
菌株号 表型 对气管环的粘附a1.5×107个 1.5×109
接种物 接种物
GOBL124 野生型 100 8.4±0.5 8.7±0.3
STL6 Adh-c10.1±1 NDdND
STL167 Adh-7.6±1.7 NDd8.5±0.4e
STL258 Adh-8.8±1.4 NDd3.7±0.3e
STL389 Adh-0.9±0.3 NDd8.0±0.3e
a.1周令火鸡的气管环接种5×109CFU（在PBS中）后37℃保温30分钟。洗涤后再与1%Triton X-100保温，回收仍粘附的细菌。重复进行三次。
b.取出气管环，破碎后检查细菌数。
c.Adh-：未粘附表型。
d.未检出。
e.从火鸡组织中回收的更易于在气管环上集群生长的细菌。
5.电子显微镜观察
用电子显微镜观察突变菌和野生菌的菌毛。将1滴BHI中生长的细菌加在用300-mesh Formvar涂布的铜网上，静止1小时。用3滴水洗该铜网，用滤低吸去过量的水，使铜网自然干燥。然后用2%脲-醛类树脂粘合剂（Urac）将铜网复盖30秒钟，再用0.2%Urac冲洗。用滤纸除去过量的液体，使铜网自然干燥。用Hitachi H-600透射电子显微镜检查细菌制备物。四个未粘附突变株看起来与野生型菌株完全相同。更确切地说，可以很容易地看到突变株STL258的菌毛和鞭毛（如图5所示）。这表明失活的蛋白质可能不是菌毛蛋白。
6.46KDa外膜粘附蛋白质的鉴定
a.侧接TnphoA之DNA顺序的克隆
ThphoA插入段含有一个卡那霉素抗性基因。因此，可根据卡那霉素抗性选择含TnphoA插入段的克隆。用Sau3A部分消化鸟博德特氏菌TnphoA诱导之突变菌的染色体DNA，并用凝胶电泳法按大小分离各片段。因为TnphoA长约7.5Kb，克隆较大的片段可确保能根据卡那霉素抗性选择出包含外周鸟博德特氏菌DNA的部分。从凝胶中切下大小约10-20Kb的片段，用电洗脱法从琼脂糖中回收该片段，并且标准方法将其连接到BamHI消化的质粒pACYC184（59）上。用这些连接物转化大肠杆菌HB101并选择卡那霉素抗性菌落。
b.野生型鸟博德特氏菌粘性质粒库的构建
用XhoI部分消化鸟博德特氏菌GOBL124的染色体DNA，加于10-40%蔗糖梯度上按大小分离之。然后将大小为13-27Kb的片段与XhoI切割的粘性质粒（cosmid）pCP13（14）连接opCP13是有较宽宿主范围的粘性质粒克隆载体，每个染色体的拷贝数相对较低（5-8个）。用λ体外包装提取物（Packagene，Promega Biotec.Madison，WI）将所制得的连接物包裹到噬菌体颗粒中。于37℃下使已包裹的粘性质粒在大肠杆菌LE392上吸附20分钟，加入LB液体培养基，继续保温45分钟后将细菌培养物散布于含15μg/ml四环素的LB平皿上。
用体外缺口转译试剂盒（Bethesda Research Laboratories，Gaitnersburg，MD.）通过缺口转译对含有从突变株中分离之DNA的质粒进行32P标记，并用作探针与质粒库进行原位菌落杂交，以检测含野生型菌株之基因插入段的大肠杆菌克隆。具体地说，即用克隆pACYC184之各突变体的TnphoA突变顺序所得到的4个探针与大肠杆菌中野生型鸟博德特氏菌的粘性质粒库杂交。这4个探针均与同样的粘性质粒克隆反应。所有这些粘性质粒都具有共同的17.6kb XhoI DNA片段（其酶切图如图1所示）。将这些pCP13克隆中的一个定名为pYA2402。
C.在Adh-突变株中丢失之蛋白质的鉴定
为鉴定由非粘附突变株中丢失的粘附蛋白质，按上述方法对突变株和亲代菌株的溶胞产物进行免疫印迹分析。如图3所示，显然在4个突变株中丢失了由野生型鸟博德特氏菌菌株产生的46KD蛋白质。另一方面，图4中显示了这种由质粒pYA2402限定的蛋白质是在携带相关粘性质粒克隆的大肠杆菌LE392中表达的，所说的质粒是由其质粒库中分离的。
得自博德特氏菌属各菌种的DNA具有高度同源性。而且，由鸟博德特氏菌引起的鸟气管炎在生理病理学上与由百日咳博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌引起的人百日咳及由支气管博德特氏菌引起的猪萎缩性气管炎相似。因此，所有这些菌均可能具有与鸟博德特氏菌中检测到的46KDa粘附蛋白质相同或相似的毒性因子。
编码该因子的基因，可与其基因组DNA进行Southern印迹杂交，以研究其他博德特氏菌中编码该因子或其他相关抗原的基因。可使用由鸟博德特氏克隆的粘附基因的内在部分进行检测。如上所述，可用抗鸟博德特氏菌粘附蛋白的免疫血清经Western免疫印迹杂交确定相关蛋白质的产生。如发现类似的粘附，则可在百日咳患者的恢复期血清或患有萎缩性气管炎的猪血清中检测到抗这些蛋白质的抗体。可将这些抗原用于疫苗组合物中，以产生抗各种博德特氏菌感染的免疫力。
7.抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体反应的蛋白质的鉴定
a.大肠杆菌中鸟博德特氏菌基因库的构建
用Hull等人的方法（50）从鸟博德特氏菌GOBL124中分离染色体DNA。用Sau3a、HindⅢ或XhoⅠ部分消化鸟博德特氏菌GOBL124 DNA，通过蔗糖梯度分离按大小分离各片段，然后选出25-27kb Sau3a、HindⅢ或XhoⅠ酶切之DNA片段用于连接。将按大小分离的、经Sau3a消化的鸟博德特氏菌DNA连接到经BamHⅠ消化的粘性质粒pYA2329DNA上，同时将按大小分离的、经HindⅢ和XhoⅠ消化的鸟博德特氏菌DNA连接到经HindⅢ和XhoⅠ消化的pCP13DNA上。将已连接的DNA包裹到由Promega提供的Packageneλ头和尾蛋白质中，并使用promega方法转染到大肠杆菌LE392中。将重组大肠杆菌克隆铺敷在含50μg/ml四环素（选择有pCP13载体的重组粘性质粒）或50μg/ml链霉素（选择有pYA2329载体的重组粘性质粒）的LB琼脂上。
b.产生与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体和恢复期火鸡血清反应之蛋白质的大肠杆菌重组粘性质粒克隆的鉴定：以菌落免疫印迹分析法检测能与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体反应、并与鸟博德特氏菌感染之火鸡恢复期血清反应的重组大肠杆菌克隆。简单地说，将重组大肠杆菌克隆铺敷在含50μg/ml四环素的LB琼脂上，再将菌落印迹转移到硝酸纤维素滤纸上，经暴露于氯仿气雾而溶菌，并与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体反应4小时。洗涤后除去残留的第一抗体，使含有已溶解之重组克隆的滤纸与得自ICN公司的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ⅠgG（亲和纯化的）反应4-5小时，保温后用4-氯-1-萘酚底物显色，并照相记录实验结果。
用相同方法鉴定产生能与恢复期火鸡血清反应之鸟博德特氏菌蛋白质的大肠杆菌重组克隆，所不同的是用恢复期火鸡血清作第一抗体，用Kappel公司的辣根过氧化物酶标记的羊抗火鸡ⅠgG抗体作为第二抗体。
C.由大肠杆菌重组克隆产生之鸟博德特氏菌蛋白质的Western免疫印迹：用菌落免疫印迹杂交法初步鉴定大肠杆菌LE392克隆后，用SDS-聚丙烯酰胺电泳法分析大肠杆菌阴性克隆。将煮沸的完整细胞蛋白质电转移到硝化纤维素滤纸上，并按“材料和方法”部分所述进行Western免疫印迹分析。根据与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白质的反应性，鉴定出5个重组粘性质粒克隆（图6）。从XhoⅠ产生的粘性质粒库中分离出这些大肠杆菌LE392克隆中的一个。该克隆可产生21KDa蛋白质，并被定名为pYA2320。重组克隆pYA2326是从HindⅢ产生的粘性质粒库中分离得到的，它编码40KDa蛋白质。称为pYA2337、pYA2338和pYA2339的三个重组克隆是Sau 3a产生的粘性质粒库中分离出来的，并分别在LE392中表达37KDa、43KDa和46KDa蛋白质。
鉴定Sau3a产生之质粒库中的一个重组粘性质粒克隆，该克隆可在LE392中表达能与恢复期火鸡血清起反应的50KDa蛋白质，并将其称为pYA2333（图7）。
按实例C.3中所述方法，进一步检验这些蛋白质在气管细胞上的粘附活性，以确定是否为外膜粘附蛋白质。
d.粘性质粒克隆pYA2320的特性
分离pYA2320DNA，用BamHⅠ-PstⅠ消化，与BamHⅠ-PstⅠ消化的pYA2329连接，并将该重组体转化到大肠杆菌LE292中。与抗鸟博德特氏菌OMP抗体进行菌落免疫印迹分析，筛选转化体，以鉴定能产生21KDa蛋白质的大肠杆菌亚克隆。经菌落免疫印迹分析鉴定出一个转化体，并经限制性核酸内切酶分析表明该重组克隆（称为pYA2332）含有6Kb BamHⅠ-PstⅠ DNA片段。对含pYA2332的LE392完整细胞蛋白质进行Western免疫印迹分析，表明该克隆产生了21KDa蛋白质。这一结果表明6Kb BamHⅠ-PstⅠ DNA片段编码21KDa蛋白质的整个基因，并提示该基因在大肠杆菌中的表达是由该克隆基因的启动子操纵的。将6Kb BamHⅠ-PstⅠ片段与作类似消化的pUC8-1 DNA相连接，并转化到大肠杆菌JM109中，以进行限制性核酸内切酶图谱分析，并作进一步的操纵。该大肠杆菌克隆被定名为pYA2340。按Maniatis等人所述方法对pYA2340的质粒DNA进行限制性核酸内切酶图谱分析。
8.大肠杆菌重组克隆的保留
按下述方法，将能产生与抗鸟博德特氏菌外膜蛋白抗体或恢复期火鸡血清反应之鸟博德特氏菌蛋白质的大肠杆菌重组克隆保存于-70℃下。即在含有合适抗生素的LB琼脂培养基中使该大肠杆菌克隆37℃下生长过夜，与等体积80%甘油（在水中）混合后保存于-70℃下。
9.沙门氏菌重组疫苗菌株的生产
经缺失分别编码腺苷酸环化酶和cAMP受体蛋白质的cya和crp基因，使沙门氏菌成为无毒力的。这两种蛋白质对许多基因及许多与分解代谢产物的运输和分解有关的操纵子的转录都是必不可少的。而且，可以缺失编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的基因（asd基因）。该酶可用于催化二氨基庚二酸（DAP）（细菌细胞壁的成分）的合成。不能合成DAP的突变株则不能在没有DAP的培养基中存活。已建立了几个含有这些缺失突变的沙门氏菌菌株。特别有用的是菌株chi4064和chi4072（参见Curtiss和Kelly的文献（13）及待批专利申请251304号）。试验表明chi4064对1天令的小鸡无毒力。可在其肠壁上寄生几周。
也已表明这些寄生在GALT上的菌株可引起全身性免疫反应，在一些粘膜表面产生抗该克隆抗原的分泌型免疫球蛋白A（SIgA）。
为了将鸟博德特氏菌粘附抗原引入无毒力的沙门氏菌菌株中，可使用标准技术将该抗原克隆到Asd+载体pYA292中。待批专利申请251304号中已对这一载体作了描述，并在图2中作了图解说明。可将该载体引入上述的无毒力菌株chi4072中。
10.表达21KDa抗原之沙门氏菌重组疫苗菌株的构建
将6Kb来自pYA2332的BamHI-PstI鸟博德特氏菌DNA片段连接到BamHI-PstI消化的pYA292上，并转化到大肠杆菌chi6097中。与抗鸟博德特氏菌OMP抗体进行Western免疫印迹杂交（图9）。结果发现所得到的含pYA2336重组质粒（图8）的转化株能产生21KDa蛋白质。将分离得到的pYA2336 DNA转化到鼠伤寒沙门氏菌chi3730中。当用上述Western免疫印迹法检测时，发现所得转化体[称为chi3730（pYA2336）]也能产生21KDa蛋白质。按Davis，Botstein和Roth，Adranced Bac-terial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratories）所述方法，用噬菌体P22HⅠint以0.01多重性感染对数生长期的chi3730（pYA2336），结果该转化株产生噬菌体P22HⅠint溶菌产物。生长12-15小时后，用氯仿溶解被感染的细菌，离心除去细胞碎片，收获并滴定该噬菌体溶菌产物。用上述感染对数生长期细菌（感染重复数为0.5）所产生的P22HⅠint溶胞产物转染鼠伤寒沙门氏菌，然后在LB琼脂中选择转导体。用抗鸟博德特氏菌OMP（图9）抗体进行Western免疫印迹分析，发现该转录体能产生21KDa蛋白质。
11.用重组沙门氏菌菌株免疫鸡和火鸡
按下述方法，用C.9和C.10中所述重组沙门氏菌菌株免疫鸡和火鸡。将该重组无毒力微生物加入饮用水中，经口和鼻内途径免疫1-3天令的雏鸡。检测血清和呼吸道分泌物以确定抗体反应的类型[ⅠgY（ⅠgG、7SⅠg）、ⅠgM和ⅠgA（ⅠgB）]和程度。比较免疫和未免疫鸡和火鸡雏的体重减少量，以监测该疫苗可能产生的付作用。另外，将109个有毒力的鸟博德特氏菌经鼻内途径接种，或使其接触已被感染的鸡，以攻击鸡和火鸡幼雏，然后观察被攻击鸡雏的发病和尸检结果，并检查气管组织损伤和感染对象的滴度变化。
如果抗鸟博德特氏菌的粘膜免疫反应不足以保护小的鸡和火鸡，可用表达鸟博德特氏菌外膜抗原的无毒力沙门氏菌免疫有繁殖力的母鸡，由鸡卵传递母体抗体。当年青鸡或小火鸡成长后，这种处理便可增强对鸟博德特氏菌的免疫力。也可在幼禽成长过程中用相同的重组载体给予口服，以产生保护性免疫作用。
据此，本发明公开了博德特氏菌外膜抗原，含这些抗原的疫苗及其给药方法。虽然对本发明的优选方案已作了较详细的叙述，但在不脱离本发明的精神和待批权利要求之范围的情况下，本领域技术人员可以作出较明显的改动。
参考文献
1. Arp，L.H.，Am J Vet Res（1986）47，12∶2618-2620.
2. Arp，L.H.，et al.，Vet Pathol（1987）24∶411-418.
3. Arp，L.H.et al.，Am J Vet Res（1984）45∶2196-2200.
4. Barnes，H.J.，et al.，J Am Vet Assoc（1978）173∶753-762
5. Bemis，D.A.，et al.，J Infect Dis（1977）135∶753-762
6. Bienenstock，J.，et al.，Adv Exp Med Biol（1978）107∶53-59
7. Boycott，B.R.，et al.，Avian Dis（1984）28∶1110-1114.
8. Bradley，D.E.，et al.，J Bact（1980）143∶1466-1470.
9. Brennan，M.，et al.，Abstr Annu Meet Am Soc Microbiol（1988）B2，p.30.
10. Cebra，J.J.，et al.，Cold Spring Harbor Symp Quant Biol（1976）41∶201-215.
11. Chang，A.C.Y.，et al.，J Bacteriol（1978）134∶1141-1166.
12. Collier，A.M.，et al.，J Infect Dis（1977）36（Suppl）∶S196-S203.
13. Curtiss，R.Ⅲ，et al.，Infect Imm（1987）55∶3035-3043.
14. Darzins，A.，et al.，J Bact（1984）159，1∶9-17.
15. Davelaar，F.G.，et al.，Avian Path（1982）11∶63-79.
16. Gorringe，A.R.，et al.，FEMS Microbiol Lett（1985）26∶5-9.
17. Gray，J.G.，et al.，Am J Vet Res（1981）42∶2184-2186.
18. Gray，J.G.，et al.，Infect Immun（1983）42∶350-355.
19. Gray，J.G.，et al.，Avian Dis（1983）27∶1142-1150.
20. Hewlett，E.L.，et al.，Infect Immun（1983）40∶1198-1203.
21. Hinz，K.H.，et al.，Vet Rec（1978）103∶262-263.
22. Jackwood，M.W.，et al.，Avian Dis（1987）31∶277-286.
23. Kersters，K.，et al.，IntJ syst Bacteriol（1984）34∶56-70.
24. Laemmli，U.K.，Nature（1970）227∶680-685.
25. LeFever，M.E.，et al.，Intestinal Toxicology（1984）pp.45-56，C.M.Schiller（ed.），Raven Press，NY.
26. Manclark，C.R.，et al.，Bacterial Vaccines（1984）pp.69-105，R.Germanler（ed.），Academic Press，Inc.，NY.
27. Manoil，C.R.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA（1985）82∶8129-8133.
28. McCaughan，G.，et al.，Internal Rev Physiol（1983）28∶131-157.
29. Miller，V.L.，et al.，J Bact（1988）170∶2575-2583.
30. Mueller，A.P.，et al.，Cell Immunol（1971）2∶140-152.
31. Powell，P.C.，Vet Immunol Immunopath（1987）15∶87-113.
32. Redhead，K.，J Med Microbiol（1985）19∶99-108.
33. Saif，Y.M.，et al.，Avian Dis（1981）24∶665-684.
34. Saif，Y.M.，et al.，Avian Dis（1980）24∶665-685.
35. Sato，Y.K.，et al.，International Symposium on Pertussis（1979），US DHEW Publ.No.NIH 79-1830，Washington，DC，In C.R.Manclark，et al.，（eds.），pp.51-57.
36. Simmons，D.G.，et al.，Avian Dis（1979）23∶132-138.
37. Simmons，D.G.，et al.，Avian Dis（1979）23∶194-203.
38. Simmons，D.G.，et al.，Avian Dis（1979）24∶82-90.
39. Tagliabue，A.D.，et al.，J Immunol（1984）133∶988-992.
40. Towbin，H.T.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA（1979）76∶4350-4354.
41. Tuomanen，E.，et al.，J Infect Dis（1983）148∶125-130.
42. Tuomanen，E.，et al.，J infect Dis（1985）152∶118-125.
43. Urisu，A.，et al.，Infect Immun（1986）52∶695-701.
44. Wardlaw，A.C.，et al.，Pathogenesis and Immunity in Pertussis（1988）R.Parton（ed.），John Wiley and Sons.
45. Weiss，A.A.，et al.，J Infect Dis（1984）150∶219-222.
46. Weiss，A.A.，et al.，Develop Biol Standard（1985）61∶11-19.
47. Weisz-Carrington，P.，et al.，J Immunol（1979）123∶1705-1708.
48. Williams，R.C.，et al.，Science（1972）177∶697-699.
49. Rapp，V.J.，et al.，Infect Immun（1986）52∶414-420.
50. Hull，R.A.，et al.，Infect Immun（1981）33∶933-938.
Claims (15)
1、纯化的博德特氏菌属外膜蛋白质。
2、纯化的鸟博德特氏菌外膜蛋白质。
3、根据权利要求1或2的蛋白质，其中蛋白质分子量约为21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa或50KDa。
4、包括病原微生物之无毒力衍生株的用以表达博德特氏菌外膜蛋白质的载体微生物，该衍生株基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和功能性环AMP受体蛋白质，而能够表达编码该外膜蛋白质的重组基因。
5、根据权利要求4的载体微生物，其中所说的微生物还基本上不能产生功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、该重组体基因借助载体被引入所说的载体微生物中，且所说的载体携带与编码所说外膜蛋白质的基因连接之编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或其功能性片段的蛋白质。
6、根据权利要求5的载体微生物，其中所说的外膜蛋白质来自鸟博德特氏菌（B.arium）。
7、用于表达分子为21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa或50KDa之鸟博德特氏菌蛋白质的载体微生物，所说的载体微生物包括病原微生物的无毒力衍生株，所说的衍生株基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性环AMP受体蛋白质和功能性天冬氨酸-β-半醛脱氢酶，其中所说的载体微生物包含携带编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶或其功能性片段的基因，且该基因是与编码鸟博德特氏菌蛋白质的基因相连的。
8、根据权利要求4、5、6或7中任一项的载体微生物，其中所说的微生物是沙门氏菌属的成员。
9、根据权利要求4的载体微生物，其中所说的微生物是chi4064（ATCC53648）。
10、根据权利要求5的载体微生物，其中所说的微生物是chi4072（ATCC67538）或chi6987（ATCC_）。
11、包含表达暗盒的DNA构建体，其包括
（a）编码至少含一个博德特氏菌属外膜蛋白质抗原决定基或至少一个鸟博德特氏菌外膜蛋白质抗原决定基之多肽的DNA编码顺序;及
（b）可操作地连接到上述编码顺序上的控制顺序，从而使所说的编码顺序能在宿主细胞内转录和转译，且所说的DNA编码顺序或控制顺序中至少一个是与宿主细胞异源的。
12、被根据权利要求11的DNA构建体稳定转化的宿主细胞。
13、一种产生重组多肽的方法，包括：
（a）提供权利要求12的宿主细胞群体，并
（b）在适于由所说的表达暗盒编码的多肽表达的条件下培养所说的细胞群体。
14、对博德特氏菌属外膜蛋白质或鸟博德特氏菌外膜粘附蛋白质特异的纯化的多克隆抗体。
15、对博德特氏菌属外膜蛋白质或鸟博德特氏菌外膜蛋白质特异的单克隆抗体。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100387618C (zh) * | 1995-05-04 | 2008-05-14 | 康诺特实验室有限公司 | 无细胞百日咳疫苗和其制备方法 |
| CN101157907B (zh) * | 2007-09-27 | 2010-05-19 | 华中农业大学 | 一种表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株、疫苗及应用 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5156958A (en) * | 1990-09-21 | 1992-10-20 | American Cyanamid Company | Gene encoding a 30 kilodalton outer membrane protein of bordetella pertussis and method of recombinant production of said protein |
| NL9002092A (nl) * | 1990-09-25 | 1992-04-16 | Nederlanden Staat | Vaccin, geschikt voor de bestrijding van bordetella pertussis. |
| TW201794B (zh) * | 1991-05-03 | 1993-03-11 | American Cyanamid Co | |
| US5922583A (en) * | 1995-10-17 | 1999-07-13 | Biostar Inc. | Methods for production of recombinant plasmids |
| EP2150616A4 (en) | 2007-05-10 | 2011-07-27 | Univ Arizona | REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY |
| WO2009046449A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens |
| WO2010045620A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae |
| US9163219B2 (en) | 2009-04-14 | 2015-10-20 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome |
| WO2010135563A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery |
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Cited By (2)
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