CN100387618C - 无细胞百日咳疫苗和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
通过多个步骤从博德特氏杆菌菌株,尤其是百日咳博德特氏杆菌菌株中制备菌毛凝集原制剂,包括从细胞匀浆中提取菌毛凝集原,浓缩和纯化提取物。菌毛凝集原制剂可与其它百日咳抗原一起配制无细胞百日咳疫苗,其中其它百日咳抗原包括百日咳毒素或其类毒素,69kDa蛋白和丝状血凝素和其它博德特氏杆菌抗原。该疫苗可使易感人群的至少70%获得保护。
Description
发明领域
本发明涉及无细胞百日咳疫苗,它们的组分及它们的制备方法。
相关申请的说明
本申请是1995年5月4日申请的共同未决的美国专利申请号08/433,646的部分继续申请。
本发明的背景技术
百日咳是一种由百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)造成的严重的高传染性上呼吸道传染病,世界卫生组织估计每年有6千万例百日咳,50万至1百万例相关的死亡(参考文献1。在本说明书中,各种较全面描述本发明所涉及的现有技术状况的参考文献参照括号中所列。每次引用的全部文献信息可在说明书末尾,紧接权利要求书处找到。这些参考文献的公开在此被本发明公开引作参考)。在未接种的人群中,在小于5岁的儿童中观察到高达80%的百日咳发病率(参考文献2),虽然百日咳通常被认为是儿童疾病,但在青年和成年人中临床的和无症状疾病越来越多见(参考文献3,4和5)。
在1940年采用由化学和热灭活的百日咳博德特氏杆菌菌体组成的全细胞疫苗显著降低了由百日咳博德特氏杆菌造成的百日咳的发病率。根据具体病例,全细胞疫苗的有效率估计高达95%(参考文献6),虽然感染百日咳博德特氏杆菌可具有终生免疫,但有越来越多的证据表明在用全细胞疫苗免疫后,有微弱的保护作用(参考文献3),一些涉及全细胞百日咳疫苗,致反应性和严重副作用之间的相互关系的报道导致了疫苗越来越不能接受,结果该病重新流行(参考文献7)。最近已开发了具有确定组分的百日咳疫苗。
确定组分百日咳疫苗的抗原
已开发各种无细胞百日咳疫苗,包括百日咳博德特氏杆菌抗原,百日咳毒素(PT),丝状血凝素(FHA),69kDa外膜蛋白(pertactin)和菌毛凝集原(见后文表1。表格在说明书末尾)。
百日咳毒素
百日咳毒素是一种外毒素,为具有ADP-核糖基转移酶活性的A.B族细菌毒素的一员(参考文献8)。这些毒素的A部分显示ADP-核糖基转移酶活性,B部分介导毒素与宿主细胞受体结合并将A转位到它的作用位点。PT还可促进百日咳博德特氏杆菌对纤毛上皮细胞的粘附(参考文献9)。并且也在百日咳博德特氏杆菌对巨噬细胞的侵袭中起作用(参考文献10)。
所有无细胞百日咳疫苗均包括被认为是主要毒力因子和保护性抗原的PT (参考文献11,12)。百日咳博德特氏杆菌的自然感染引起对PT的体液和细胞免疫应答(参考文献13-17)。婴幼儿具有母体经胎盘传来的抗PT抗体(参考文献16,18),包含抗PT抗体的人初乳在对鼠抗气雾剂感染的被动保护中起作用(参考文献19)。在用无细胞疫苗免疫接种后已证实对PT各亚基产生了细胞介导免疫(CMI)应答(参考文献20),而在全细胞疫苗免疫接种之后产生对PT的CMI应答(参考文献13)。在动物模型和人中全细胞或成分疫苗中的化学灭活的PT具有保护性(参考文献21)。而且,亚基S1特异性的单克隆抗体对百日咳博德特氏杆菌的感染有保护作用(参考文献22和23)。
PT主要的病理生理作用是源于它的ADP-核糖基转移酶活性。PT催化来自NAD的ADP-核糖转移到G1鸟嘌呤核苷酸结合蛋白中,从而打乱细胞腺苷酸环化酶调节系统(参考文献24)。PT还阻止巨噬细胞和淋巴细胞迁移至发炎部位并影响中性粒细胞介导的吞噬作用,以及杀细菌作用(参考文献25)。许多体外和体内测定被用于评估S1和/或PT的酶活性,包括牛转导素的ADP-核糖基化作用(参考文献26),中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分群鉴定(参考文献27),组胺致敏作用(参考文献28)白细胞增多法和NAD葡萄糖水解酶。当遇PT时,CHO细胞产生特征性的分群形态学。这一现象取决于PT的结合,随后的移位还取决于S1的ADP-核糖基转移酶活性,因此CHO细胞分群分析广泛用于检测PT全毒素的完整性和毒性。
丝状血凝素
丝状血凝素为大的(220kD)、无毒性多肽,它在细菌定居时介导百日咳博德特氏杆菌与上呼吸道纤毛细胞粘附(参考文献9,29)天然感染诱导抗-FHA抗体和细胞介导免疫(参考文献13,15,17,30和31)。在人初乳中发现了抗FHA抗体并且它可经胎盘传递给胎儿(参考文献17,18和19)。用全细胞或无细胞百日咳疫苗进行疫苗接种可产生抗-FHA抗体,含FHA的无细胞疫苗还可诱导对FHA的CMI应答(参考文献20,32)。在主动或被动免疫之后的小鼠呼吸道攻菌模型中FHA为保护性抗原(参考文献33,34)。然而,在小鼠脑内攻菌能力测定中仅有FHA不能起保护作用
69kDa外膜蛋白(pertactin)
69kDa蛋白为一种最初从支气管败血性博德特氏杆菌鉴定出的外膜蛋白(参考文献35)。它是抗支气管败血性博德特氏杆菌的保护性抗原,后来又在百日咳博德特氏杆菌和副百日咳博德特氏杆菌中分离出,69kDa蛋白直接与真核细胞结合(参考文献36)并且百日咳博德特氏杆菌的天然感染可诱导抗-P.69的体液免疫应答(参考文献14),P.69还诱导细胞免疫应答(参考文献17,37,38)。用全细胞或无细胞疫苗进行疫苗接种可诱导抗-P.69抗体(参考文献32,39),无细胞疫苗还可诱导P.69CMI(参考文献39)。perlactin保护小鼠对抗百日咳博德特氏杆菌的气雾剂攻击(参考文献40),pertactin与FHA结合可在抗百日咳博德特氏杆菌的脑内攻击测试中起保护作用(参考文献41)。多克隆或单克隆抗-P.69抗体的被动转移也保护小鼠抗气雾剂攻击(参考文献42)。
凝集原
通过百日咳博德特氏杆菌的凝集菌毛来确定它们的血清型。WHO建议全细胞疫苗包括1,2和3型凝集原(Aggs),因为它们不产生交叉保护(参考文献43)。Agg1为非菌毛,可在所有百日咳博德特氏杆菌菌株中找到,而血清型2和3具菌毛。天然感染或用全细胞或无细胞疫苗进行免疫可诱导产生抗-Agg抗体(参考文献15,32)。在小鼠中可通过Agg 2和Agg 3的气雾剂感染产生特异性的细胞免疫应答(参考文献17)。Agg 2和Agg 3在小鼠抗呼吸道攻菌试验中具有保护作用,含抗凝集原抗体的人初乳在这个测试中也起保护作用(参考文献19,44,45)。
无细胞疫苗
开发的第一个无细胞疫苗是Sato等人的两组分PT+FHA疫苗(JNIH 6)(参考文献46)。该疫苗通过从百日咳博德特氏杆菌菌株Tohama的培养上清液中同时纯化PT和FHA抗原,接着用福尔马林处理成类毒素来制备。自从1981起,来自各生产商的含有各种组分的无细胞疫苗已被成功地用来免疫日本儿童以防治百日咳,结果发病率显著降低(参考文献47)。在1986年,JNIH 6疫苗和单组分PT类毒素疫苗(JNIH 7)在在瑞典进行的大量临床试验中得到检测。最初的结果表明它比已报道的全细胞疫苗的功效低,但后来的研究表明它对于血清学方法诊断出的轻度疾病更为有效(参考文献48,49,50,51)然而,有证据表明这些疫苗中福尔马林灭活的PT的毒性会恢复。这些疫苗还被发现对非传染疾病有保护作用。
目前正在评估许多新的无细胞百日咳疫苗,它包括PT,FHA,P.69和/或凝集原的组合物,这些列在表1中。一些化学脱毒技术已被用于处理PT,包括用福尔马林(参考文献46),戊二醛(参考文献52),过氧化氢(参考文献53)和四硝基甲烷(参考文献54)灭活。
因此,目前商业可购得的无细胞百日咳疫苗可能未包括能致敏的适宜抗原的合适制剂,所以在百日咳易感人群中达不到所需的有效水平。
希望提供有效的无细胞百日咳疫苗以及它们的制备方法,其中疫苗包括经仔细挑选的选定相对量的几种抗原。
发明概述
本发明涉及无细胞百日咳疫苗制剂,其组分,制备该疫苗和其组分的方法以及其使用方法。
根据本发明的一个方面,提供一种从博德特氏杆菌菌株中制备凝集原制剂的方法,包括步骤:
(a)提供博德特氏杆菌菌株的细胞匀浆;
(b)从细胞匀浆中选择性提取菌毛凝集原以产生含有凝集原的第一上清液,和第一次剩余沉淀;
(c)将第一次剩余沉淀与第一上清液分离;
(d)在一定温度下将第一上清液保温一段时间以产生含有菌毛凝集原的澄清上清液和含非凝集原污染物的第二次沉淀;
(e)浓缩澄清上清液以产生含有菌毛凝集原的粗溶液;
(f)从粗菌毛溶液中纯化凝集原以产生凝集原制剂。
博德特氏杆菌菌株可为百日咳博德特氏杆菌。可将第一上清液保温在约50℃-约100℃的温度范围内,包括约75℃约85℃,优选约80℃,保温时间可为约10分钟-约60分钟,优选约30分钟。可通过将细胞匀桨分散在包含约1M-约6M尿素的缓冲液中而从细胞匀浆中选择性提取菌毛凝集原。在一个特定实例中,先浓缩第一上清液再在一定温度下保温一段时间以产生澄清上清液。
澄清上清液可通过任何方便的方法浓缩,包括从澄清上清液中沉淀菌毛凝集原,再将沉淀的菌毛凝集原与此上清液分离,并溶解沉淀的菌毛凝集原。可通过向澄清的上清液中加入聚乙二醇,例如分子量为约8000的聚乙二醇来进行沉淀作用。在该沉淀作用中采用的聚乙二醇浓度可为约3%-约5%,优选约4.3%-约4.7%,以从澄清上清液中沉淀上述菌毛凝集原。
可通过柱层析从粗菌毛溶液中纯化菌毛凝集原,柱层析可包括凝胶过滤,例如用Sephadex 6B和/或PEI硅石柱层析。在本发明一个特定方面,以除菌凝集原制剂的形式提供凝集原,例如对来自柱层析纯化的流出物进行过滤除菌。在一个特定实例中,无菌菌毛凝集原制剂被吸附至某种矿物盐佐剂上,该矿物盐佐剂可以是矾。
在本发明一个特别的方面,提供一种来自博德特氏杆菌菌株的菌毛凝集原制剂,它包含菌毛凝集原2(Agg 2)和菌毛凝集原3(Agg 3),而基本上无凝集原1。由于凝集原1被报道是百日咳博德特氏杆菌的具有反应原性的脂寡糖(LOS),因此确保菌毛凝集原基本上无LOS,就可降低它引起的反应。在该菌毛凝集原制剂中,Agg 2与Agg 3的重量比可为约1.5∶1-约2∶1。在本发明一个特定的实施例中,提供用本文提出的方法制备的菌毛凝集原制剂。
在本发明另一个方面,提供包含本文提供的菌毛凝集原制剂的致免疫组合物。该致免疫组合物可被配制成疫苗用于体内,以保护经它免疫的宿主免于由博德特氏杆菌造成的疾病,而且该组合物可包含至少一种其它博德特氏杆菌抗原。该抗原可为丝状血凝素,69kDa外膜蛋白腺苷酸环化酶,博德特氏杆菌脂寡糖,外膜蛋白和百日咳毒素或其类毒素,包括其遗传脱毒类似物。
在本发明的另一个方面,本文提供的致免疫组合物可包含至少一种非博德特氏杆菌免疫原。该非博德特氏杆菌免疫原可为白喉类毒素,破伤风类毒素,嗜血杆菌的荚膜多糖,嗜血杆菌的外膜蛋白,乙型肝炎病毒表面抗原,脊髓灰质炎病毒,流行性腮腺炎病毒,麻疹病毒和/或风疹病毒。
本文提供的致免疫组合物可进一步包含佐剂,该佐剂可为磷酸铝,氢氧化铝,Qui1A,QS21,磷酸钙,氢氧化钙,氢氧化锌,糖脂类似物,氨基酸的十八(烷基)酯或脂蛋白。
根据本发明的一个特殊方面,提供一种用于保护易感人群免于百日咳博德特氏杆菌感染引起的疾病的疫苗组合物,它包含百日咳类毒素,丝状血凝素,pertactin和凝集原,均以纯化形式选定比例提供,以使易感人群的至少约70%得到保护。
该疫苗组合物可包含约5-约30μg氮的百日咳类毒素,约5-约30μg氮的丝状血凝集素,约3-约15μg氮的pertactin以及约1-约10μg氮的凝集原。
在一个特定实施方案中,疫苗可包含博德特氏杆菌的百日咳类毒素,丝状血凝素,69kDa外膜蛋白和菌毛凝集原,它们的重量比为约10∶5∶5∶3,如在单个人剂量中,为约10μg百日咳类毒素,约5μg丝状血凝素,约5μg69kDa蛋白和约3μg菌毛凝集原。在另一个特定实施方案中,疫苗可包含重量比为约20∶20∶5∶3的百日咳类毒素,丝状血凝素,69kDa蛋白和菌毛凝集原,在单个人剂量中为约20μg百日咳类毒素,约2μg丝状血凝素,约5μg69kDa蛋白和约3μg菌毛凝集原。在另一个特定实施方案中,疫苗可包含重量比为约20∶10∶10∶6的百日咳类毒素,丝状血凝素,69kDa蛋白和菌毛凝集原,在单个人剂量中为约20μg百日咳类毒素,约10μg丝状血凝素,约10μg 69kDa蛋白和约6μg菌毛凝集原。
本发明疫苗组合物提供的对易感人群的保护范围是,对于持续至少21天的阵发性咳嗽并且经培养证实为细菌感染的情况可至少保护约80%,优选约85%。对于咳嗽持续至少一天的轻度百日咳,可保护至少约70%。
疫苗的凝集原组分优选包含菌毛凝集原2(Agg 2)和菌毛凝集原3(Agg 3),基本上没有凝集原1。Agg 2与Agg 3的重量比可为约1.5∶1至约2∶1。
本文提供的疫苗可与破伤风类毒素和白喉类毒素联合成DTP疫苗,在一个实例中,该疫苗包含约15Lfs白喉类毒素和约5Lfs破伤风类毒素。
此外,疫苗还可包含佐剂,尤其是矾。
在该特定实例中,致免疫组合物提供对其中包含的每一种抗原的免疫应答。总应答基本上与由全细胞百日咳疫苗产生的相同。
在本发明的另一个方面,提供一种免疫接种宿主以抵抗由博德特氏 杆菌导致的疾病的方法,包括对宿主给以免疫有效量的本文提供的致免疫组合物或疫苗,其中宿主可为人类。
在本发明的另一个方面,提供一种免疫接种易感人群以抵抗由百日 咳博德特氏杆菌导致的疾病的方法,它包括以免疫有效量的本文提供的疫苗组合物对易感人群的成员给药,以为易感人群成员的至少约70%提供保护。
本发明的优点包括用以制备适宜于包含在无细胞百日咳疫苗中以增加该疫苗功效的致免疫凝集原制剂的方法简单。
本发明提供的凝集原制剂可用于配制无细胞多组分疫苗以保护它所免疫的宿主免于由博德特氏杆菌,包括百日咳博德特氏杆菌造成的疾病。尤其是,本文提供的包含凝集原制剂的致免疫组合物已被美国政府的变态反应和传染性疾病国立研究所(NIAID)挑选来评价双盲,对人功效临床试验,从而为本领域专业技术人员建立充分的根据,即该组合物在一定程度上能有效防止所述疾病(百日咳)。这一试验至该美国专利申请的申请日止仍在进行。试验的对象(为本文提供的疫苗)符合了合理预测效用所要求的条件。
附图简要说明
通过下面的详细说明和实施例并参考附图将进一步理解本发明,其中;
图1为根据本发明的一个方面从博德特氏杆菌菌株中分离凝集原制剂的方法的简单流程图。
发明的详细说明
在一个方面,本发明提供可用于从博德特氏杆菌菌株中制备凝集原制剂的新技术。参看图1,它图示了从博德特氏杆菌菌株制备凝集原制剂的方法的简要流程图。由图1可见,将含有凝集原的博德特氏杆菌细胞匀桨,例如百日咳博德特氏杆菌细胞匀浆用诸如含尿素的缓冲液,如10mM磷酸钾,150mM NaCl和4M尿素进行抽提,以从细胞匀桨中选择性提取凝集原,由此产生含有凝集原的第一上清液(sp1)和第一剩余沉淀(ppt1)。第一上清液(sp1)通过诸如离心的方式与第一残余沉淀(ppt1)分离。弃去剩余沉淀(ppt1)。可接着浓缩澄清上清液(sp1)并再使用例如100-300KDa NMWL薄膜滤器对如10mM磷酸钾/150mMNaCl/0.1%TritonX-100进行透滤。
随后将第一上清液在一定温度下保温一段时间以产生含有凝集原的澄清上清液(sp2)和含非凝集原污染物的第二弃去沉淀(ppt2)。适宜温度包括约50℃-约100℃,其中包括约75℃-约85℃,适宜保温时间包括约1-约60分钟。通过例如加入分子量为8000的聚乙二醇(PEG 8000)至最终浓度为约4.5±0.2%并轻轻搅拌最少约30分钟来浓缩澄清上清液,以产生可经离心收集的第三沉淀(ppt3)。弃去剩余的上清液sp3。
用例如含有10mM磷酸钾/150mM NaCl的缓冲液提取该第三沉淀(ppt3),以提供含菌毛凝集原的粗溶液。可将1M磷酸钾加入到粗菌毛溶液中,使其中磷酸钾为约100mM。另一方面,可不用沉淀而通过使用凝胶,如Sepharose CL6B进行凝胶过滤层析来纯化热处理的菌毛凝集原的澄清上清液。随后通过柱层析,如通过PEI硅石柱纯化粗溶液中的菌毛凝集原以在流出物中产生菌毛凝集原制剂。
可进一步浓缩该含菌毛凝集原的流出物并使用100-300KDaNMWL膜对含例如10mM磷酸钾/150mM NaCl的缓冲液透滤。可通过从≤0.22μm的薄膜滤器过滤来对凝集原制剂除菌,以提供含有菌毛凝集原2和3的最终纯化的菌毛凝集原制剂。
本发明涉及来自博德特氏杆菌菌株中的凝集原制剂,其中它包含菌毛凝集原2(Agg2)和菌毛凝集原(3)(Agg3),并基本上没有凝集原1。Agg2与Agg3的重量比可为约1.5∶1~约2∶1。这些菌毛凝集原制剂可通过本文提供并在下面详细描述的方法产生。本发明还涉及致免疫组合物(包括疫苗),它包含本文提供的菌毛凝集原制剂。该疫苗可含有其它博德特氏杆菌免疫原,包括丝状血凝素,69kDa外膜蛋白和百日咳毒素或其类毒素,包括在例如参考文献68中描述的遗传减毒的PT类似物,疫苗还可含有非博德特氏免疫原,包括白喉类毒素,破伤风类毒素,嗜血杆菌荚膜多糖,嗜血杆菌的外膜蛋白,乙型肝炎病毒表面抗原,脊髓灰质炎病毒,流行性腮腺炎病毒,麻疹病毒和/或风疹病毒。每一种博德特氏杆菌抗原各自被吸附到佐剂上(例如,矾),以方便和快速地产生如本文提供的含有选定比例抗原的疫苗。
在选定的实例中,本发明提供具有以下特征的疫苗(本文使用的蛋白质的μg数依据是在纯化浓度上进行的凯氏定氮试验结果,并以蛋白质氮的μg数来表示),所有疫苗均可通过肌肉内注射给药:
(a)CP 10/5/5/3 DT
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的一种制剂被称为CP10/5/5/3DT。每0.5mL人用剂量的CP10/5/5/3DT被配制成包含约:
10μg 百日咳类毒素(PT)
5μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
3μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧乙醇作为保存剂
(b)CP 20/20/5/3 DT
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的另一种制剂被称为CP20/20/5/3DT。每0.5mL人用剂量的CP20/20/5/3DT被配制成包含约:
20μg 百日咳类毒素(PT)
20μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
3μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
(c)CP 10/5/5 DT
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的一种制剂被称为CP10/5/5DT。每0.5mL人用剂量的CP10/5/5被配制成包含约:
10μg 百日咳类毒素(PT)
5μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
(d)CP 20/10/10/6 DT
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的另一种制剂被称为CP20/10/10/6DT。每0.5mL人用剂量的CP20/10/10/6DT被配制成含约:
2μg 百日咳类毒素(PT)
1μg 丝状血凝素(FHA)
10μg 菌毛凝集原2和3FIMB)
6μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
其它博德特氏杆菌免疫原,百日咳毒素(包括其遗传减毒类似物,如在转让给受让人的,原为Klein等人的美国专利号5,085,862中所述,它被本文用作参考),FHA和69kDa蛋白可通过如下所述的各种方法制备:
PT的纯化
可使用常规方法从百日咳博德特氏杆菌菌株的培养物上清液中分离PT。例如可使用Sekura等(参考文献55)的方法进行PT的分离。首先将培养物上清液吸附到含有染料-配体凝胶基质的Affi-GelBlue(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)柱上。用高盐,例如0.75M氯化镁将PT从该柱中洗脱并且在脱盐后,将其通过由与溴化氰活化的Sepharose连接的胎球蛋白组成的胎球蛋白-Sepharose亲和柱。使用4M镁盐将PT从胎球蛋白柱中洗脱。
或者可使用Irons等的方法(参考文献56)。将培养物上清液吸附到CNBr-活化的Sepharose 4B柱上,其中触珠蛋白首先与柱共价结合。pH6.5时PT与吸附剂结合,使用0.1M Tris/0.5M NaCl缓冲液,让pH逐步变化为pH10从而将PT从柱中洗脱。
另外,可使用1987年11月10日授权Scott等人的美国专利号4,705,686中描述的并被本文引作参考的方法。在此方法中,将百日咳博德特氏杆菌的培养物上清液或细胞提取物通过足够容量的阴离子交换树脂柱以吸附内毒素,但允许博德特氏杆菌抗原流出或以另一种方法与内毒素分离。
另外,可使用珍珠岩层析纯化PT,如转让给受让人并被本文引作参考的欧洲专利号336 736中描述的方法。
对PT的脱毒处理
将PT脱毒以除去期望不出现的可导致最终疫苗副反应的活性。可使用各种常规化学脱毒方法的任一种,例如用甲醛、过氧化氢,四硝基甲烷或戊二醛处理。
例如,可使用Munoz等(参考文献57)所述的戊二醛脱毒程序改进法将PT脱毒。在此脱毒过程中,将纯化的PT在含有0.01M磷酸缓冲盐水的溶液中保温。该溶液中戊二醛配制为0.05%,将该混合物在室温下保温2小时,接着用L-赖氨酸将其配制为0.02M。将该混合物再在室温下保温2小时随后对0.01M PBS透析2天。在一个特定实例中,可使用欧洲专利号336736中的脱毒方法。简单地说可如下用戊二醛将PT脱毒。
纯化的PT溶于含有0.22M氯化钠的75mM磷酸钾,pH8.0,用等体积甘油稀释,以使蛋白质浓度为约50-400μg/ml。将溶液加热到37℃,通过加入戊二醛至0.5%的终浓度(w/v)来脱毒。将混合物在37℃静置4小时,接着加入天冬氨酸(1.5M)至终浓度为0.25M。室温下将混合物保温1小时,用10倍体积的含0.15M氯化钠和5%甘油的10mM磷酸钾透滤以减少甘油并除去戊二醛。将PT类毒素通过0.2μM膜过滤除菌。
如果用重组技术制备无或弱毒性的PT突变型分子以用作类毒素化分子,化学脱毒作用则不是必需的。
FHA的纯化
可基本上如Cowell等(参考文献58)所述从培养物上清液中纯化FHA。可使用生长启动子,如甲基化的β-环糊精来增加培养物上清液中的FHA的产量将培养物上清液上样到羟基磷灰石柱上。FHA吸附到柱上,而PT不吸附。用Triton X-100充分洗涤柱以除去内毒素。使用含0.5M NaCl的0.1M磷酸钠溶液洗脱FHA,如果需要则再通过胎球蛋白-Sepharose柱以除去残余的PT。其它纯化法可包括通过Sepharose CL-6B柱。
另外,可使用针对FHA抗原的单克隆抗体纯化FHA,其中抗体被固定到CNBr-活化的亲和柱中(参考文献59)。
另外,可使用如上面提到的欧洲专利336736中描述的珍珠岩层析来纯化FHA。
69kDa外膜蛋白(pertactin)的纯化
可通过如已公布的欧洲专利号484 621中所述并被本文引作参考的方法用抑菌剂,例如硫柳汞首先灭活细胞,以从细菌细胞中提取69kDa外膜蛋白(69K或pertactin),将灭活的细胞悬浮于含水介质如PBS(pH7-8)中,并加温(45-60℃),接着冷却至室温或4℃如此重复进行提取。提取物释放细胞内的69K蛋白。经沉淀作用和过Affi-gel Blue柱收集含69K蛋白的物质。用高浓度的盐,例如0.5M氯化镁洗脱69K蛋白。透析后,将其通过层析聚焦载体。
另外,正如以本文中受让人名义申请并公布的PCT申请WO91/15505中所述的并被本文引作参考的方法那样,可从百日咳博德特氏杆菌培养物的上清液中纯化69kDa蛋白。
另一种从百日咳博德特氏杆菌中纯化69kDa外膜蛋白的适宜方法描述在1984年1月4日授予Gotto等人的美国专利号5,276,142和1992年3月31日授予Burns的美国专利5,101,014中,如本文所述对人进行了许多临床试验,以建立安全,不产生其他反应,可应用的组分疫苗,它包含如本文所述制备的菌毛凝集原,对百日咳有保护作用。尤其是使人获得了对包含在疫苗中的各种抗原(例如如下表3所示)的免疫应答。在易感人群中进行大型安慰剂对照,多中心,双向随机临床试验分析了一个具体的无细胞百日咳疫苗CP10/5/5/3DT,以估测疫苗抗典型百日咳的功效。
典型百日咳疾病的病例定义为:
21天或更长时间的阵发性咳嗽,
和以下任一种情况
培养证实有百日咳博德特氏杆菌感染
或
在双份血清的ELISA中抗FHA或PT的IgG或IgA抗体100%增加,此为博德特氏杆菌特异性感染的血清学证据。
或
如果缺乏血清学证据。则
在受试儿童开始咳嗽之前或之后,已与家庭中开始咳嗽28天,并证实感染了百日咳博德特氏杆菌的病人接触过。
该研究结果表明CP10/5/5/3DT在预防如上述典型百日咳病例定义中所定义的百日咳时,有效率为约85%。在同样研究中,仅含有PT和FHA两组分的百日咳无细胞疫苗的有效率为约58%,全细胞百日咳疫苗的有效率为约48%(见下文表4)。此外,CP10/5/5/3DT疫苗预防定义为至少1天咳嗽期的轻微百日咳的有效率为约77%。尤其是所获总的免疫力基本上与用被报道为对百日咳具有高功效的全细胞百日咳疫苗免疫后获得总免疫力相同。
疫苗制备和应用
因此,适宜于用作疫苗的致免疫组合物可如本文所示用博德特氏杆菌免疫原制备。该疫苗在个体中引发免疫应答,产生可能为调理性或杀菌性的抗体。如果接种个体被百日咳博德特氏杆菌攻击,该抗体与细菌结合并灭活细菌,而且,调理性或杀菌性抗体还可通过另外的机制提供保护。
包括疫苗的致免疫组合物可被制成注射用液体溶液或乳剂。可将博德特氏杆菌免疫原与相容的药用赋形剂混合。这些赋形剂可包括水,生理盐水,葡萄糖,甘油,乙醇和它们的混合物。致免疫组合物和疫苗可进一步包含辅助物质,例如润湿剂或乳化剂,pH缓冲剂,或佐剂以增强其效果。致免疫组合物和疫苗可通过皮下或肌肉内注射来进行胃肠外给药。致免疫制剂和疫苗根据不同的给药方式配以相应的剂量,用这样的剂量可达到有效治疗,免疫和保护机体的目的。给药量取决于受治疗个体,包括如个体免疫系统合成抗体的能力,以及,如果需要产生细胞介导免疫反应的能力。给药要求的活性成分的精确用量取决于医生的判断。然而,适宜的剂量范围是本领域技术人员容易确定的,免疫原可为微克级。初始给药和加强免疫剂量的适宜方案也有多种,但可包括初始给药,接着再给药。剂量还取决于给药的方法,并将随着个体的大小而变化。
在根据本发明的致免疫组合物中,免疫原的浓度通常为约1-约95%。包含仅一种病原菌的抗原物质的疫苗为单价疫苗。包含几种病原菌的抗原物质的疫苗为联合疫苗,并且也属于本发明。该联合疫苗包含,例如来自各种病原菌的物质或来自相同病原菌的各种菌株的物质,或来自各种病原菌的物质的联合。
如果抗原与佐剂一起给药,则将显著提高致免疫性,佐剂通常在磷酸缓冲盐水中制成0.005-0.5%的溶液,佐剂增强抗原的致免疫性,但它们自身不必有致免疫性。佐剂可使抗原局限于靠近给药位点的局部,从而使抗原缓慢,持续释放,对免疫系统的细胞产生累加的刺激作用。佐剂还可吸引免疫系统的细胞到抗原储存处并刺激这些细胞产生免疫应答。
免疫刺激剂或佐剂多年来被用于提高宿主对例如疫苗的免疫应答。内源性佐剂,如脂多糖通常是作为疫苗的死细菌或减毒细菌的成分。外源性佐剂为通常以非共价连接到抗原上的免疫调节剂,用来增强宿主免疫应答。因此,佐剂就是能提高对胃肠外运输的抗原的免疫应答的物质。然而这样的佐剂中一部分具有毒性,并且可导致不希望有的副作用,使它们不适用于人和许多动物。事实上,仅氢氧化铝和磷酸铝(通称为矾)被常规地用作人和兽用疫苗中的佐剂。已很好地证实了矾在增强对白喉和破伤风类毒素的抗体应答中的效能,并且最近一种HBsAg疫苗也以矾为佐剂。虽然已很好地证实了矾在一些应用中的有用性;但它有局限。例如,矾对于流感疫苗接种无效,并且另行引发细胞介导免疫应答。由矾辅佐的抗原产生的抗体在小鼠中主要是IgG1型,它对于某些疫苗试剂所要提供的保护可能不是最佳类型的抗体。
很多外源性佐剂可激发对抗原的强烈免疫应答。这包括与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激复合物),伴矿物油的普卢兰尼克聚合物,矿物油中的死分枝杆菌,弗氏完全佐剂,细菌产物,例如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS),以及脂质A和脂质体。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导免疫(CMI),通常将免疫原乳化在佐剂中。许多佐剂有毒性,包括引起肉芽肿,急性和慢性炎症(如弗氏完全佐剂即FCA),细胞溶解(如皂苷和普卢兰尼克聚合物)和致热性,动脉炎和前眼色素层炎(LPS和MDP)。虽然FCA是极好的佐剂并广泛用于研究中,但由于它的毒性,它未被批准用于人或兽用疫苗中。
理想佐剂的预期特点包括:
(1)无毒性;
(2)激发长时间持续的免疫应答的能力;
(3)制备简单及长期贮存的稳定;
(4)同时引发对各种途径给药的抗原的CMI和HIR;
(5)与其它佐剂协同作用;
(6)选择性地与不同种抗原呈递细胞(APC)相互作用的能力;
(7)特异性地引发相应的TH1或TH2细胞特异性免应答的能力;和
(8)选择性增加抗原的同型抗体的水平(例如,IgA)的能力。
1989年8月8日授权并被本文引作参考的Lockhoff等的美国专利号4,855,283指出糖脂类似物,包括N-糖基酰胺,N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯可作为免疫调节剂或佐剂,它们每一种均是糖残基被氨基酸所取代。因此,Lockhoff等(美国专利号4,855,283和参考文献60)报道与天然产生的糖脂,例如糖鞘脂和糖甘油脂具有类似结构的N-糖脂类似物用在单纯疱疹病毒疫苗和假型狂犬病病毒疫苗中能引发强烈的免疫应答。已从长链烷基胺和脂肪酸(均通过异头碳原子直接与糖相连)合成了一些糖脂,以模拟天然存在的脂残基的作用。
授权给Moloney并转让给受让人,又在本文被引作参考的美国专利号4,258,029指出当与破伤风类毒素和福尔马林灭活的I,II和III型脊髓灰质炎病毒疫苗混合时,十八烷基酪氨酸盐酸盐(OTH)起佐剂的作用。而且Nixon-George等(参考文献61)报道与重组乙型肝炎病毒表面抗原混合的芳香族氨基酸的十八烷基酯增强了宿主对乙型肝炎病毒的免疫应答。
实施例
上面所公开的内容一般性地描述了本发明。通过参考下面具体实施例可获得更全面的理解。描述这些实施例完全是为了举例说明,并不打算限制本发明的范围。视情况需要或在更便利的情况下改变形式或以同等物替代也在发明范围之内。虽然本文采用特定的术语,这些术语意在描述而非用来限制本发明。
在本文中使用了蛋白质生物化学,发酵和免疫学方法但没有对其进行清楚地描述,这些实例在科技文献中有详细报道,并完全在本领域技术人员的能力范围内。
实施例1
本实施例描述百日咳博德特氏杆菌的生长
总菌种:
将百日咳博德特氏杆菌菌株的总菌种培养物分批冷冻干燥,保存在2℃-8℃。
工作菌种:
冻干培养物在Hornibrook培养基中复苏并接种Bordet-Gengou琼脂(BGA)平板。Hornibrook培养基具有下列组成;
成分 1升中
酪蛋白水解产物(活性碳处理) 10.0g
烟酸 0.001g
氯化钙 0.002g
氯化钠 5.0g
六水氯化镁 0.025g
氯化钾 0.200g
磷酸二氢钾 0.250g
淀粉 1.0g
蒸馏水 加至1.0升
用1%碳酸钠溶液将pH调至6.9±0.1。将培养物分装到试管中,经高压灭菌器中蒸汽蒸20分钟并在121℃-124℃下高压灭菌20分钟来灭菌。菌种转种两次第一次在BGA平板上接着在合成百日咳琼脂(CPA)上.合成百日咳琼脂(CPA)具有下列组成:
NaCl 2.5g/L
KH2PO4 0.5g/L
KCl 0.2g/L
MgCl2(H2O)6 0.1g/L
Tris碱 1.5g/L
酪蛋白氨基酸 10.0g/L
谷氨酸氢钠 10.0g/L
浓盐酸 调至pH7.2
琼脂 15.0g/L
生长因子(CPGF) 10.0mL/L
组分百日咳生长因子(CDGF)-100X具有下列组成:
L-半胱氨酸盐酸盐 4.0g/L
烟酸 0.4g/L
抗坏血酸 40.0g/L
谷胱甘肽,还原型 15.0g/L
Fe2SO4(H2O)7 1.0g/L
二甲基-β-环糊精 100g/L
CaCl2(H2O)2 2.0g/L
将最终培养物悬浮于百日咳菌种悬浮缓冲液(CPSB)中,分装成2-4mL的等分试样并在-60℃~-85℃下冷冻贮存。百日咳菌种悬浮缓冲液(PSSB)具有下列组成:
酪蛋白氨基酸 10.0g/L
Tris碱 1.5g/L
无水甘油 100mL/L
浓盐酸 调至pH7.2
这些甘油悬浮物提供用于制备工作菌种的起始原料。
培养方法:
34℃~38℃下,让工作菌种在合成百日咳琼脂Roux瓶中繁殖4-7天,培养后,用合成百日咳肉汤发酵液(CPB)将细胞从琼脂中洗脱下来。通过革兰氏染色观察样品的培养物纯度和混浊度。
将细胞转移到装有CPB的4升锥形瓶中并在34℃~38℃下振荡培养20-26小时。通过革兰氏染色观察样品并检查培养物的纯度,集中各锥形瓶中的液体,将此悬浮液用于接种两个含有CPB(起始OD600为0.1-0.4,体积为10升)的发酵罐。让接种物生长至最终OD600为5.0-10.0,通过革兰氏染色检测样品的培养物纯度,通过抗原特异性ELISAs检测是否无杂菌。
实施例2
本实施例描述的是从百日咳博德特氏杆菌细胞培养物中纯化抗原。
肉汤培养和细胞浓缩;
在34℃-37℃下,让细菌悬浮液在两个生产发酵罐中生长35-50小时。从发酵罐中取样以进行培养基无菌检测。将悬浮液进行连续流动圆盘堆积离心(12,000×g)以从发酵液中分离细胞。收集细胞以待提取菌毛成分。将澄清液体通过≤0.22μm薄膜滤器。用10-30kDa标称分子量限制(NMWL)膜超滤,浓缩过滤液。贮存浓缩液以待分离和纯化百日咳毒素(PT),丝状血凝素(FHA)和69kDa(pertactin)各组分。
发酵液成分的分离:
通过基本上如上所述的欧洲专利号336736和已公布的PCT申请号WO91/15505中描述的珍珠岩层析和选择性分步洗脱方法分离和纯化发酵液组分(69kDa,PT和FHA)。如下所述进行特异性纯化操作。
百日咳毒素(PT):
用50mM Tris,50mM Tris/0.5%Triton X-100和50mM Tris缓冲液洗涤珍珠岩柱。用50mM Tris/0.12M NaCl缓冲液将PT级分从珍珠岩柱上洗脱下来。
将来自珍珠岩层析的PT上样至羟基磷灰石柱上并接着用30mM磷酸钾缓冲液洗涤。将PT用75mM磷酸钾/225mM NaCl缓冲液洗脱。将柱用200mM磷酸钾/0.6M NaCl洗涤以获得前一步所放弃的FHA级分。将甘油加入到纯化的PT中至终浓度50%,在一周内将混合物贮存于2℃-8℃下直至脱毒完成。
丝状血凝素(FHA):
用50mM Tris/0.6M NaCl从珍珠岩柱上洗脱FHA级分。通过羟基磷灰石层析纯化丝状血凝素,将来自珍珠岩柱的FHA级分上样到羟基磷灰石柱上,接着依次用30mM磷酸钾(含有0.5%Triton X-100)和30mM磷酸钾缓冲液洗涤。用85mM磷酸钾缓冲液洗脱PT级分并弃去。接着将FHA级分用200mM磷酸钾/0.6M NaCl洗脱并在一周内贮存在2℃-8℃下,直至脱毒完成。
69kDa(pertactin):
将发酵浓缩液经注射用水(WFI)稀释以达到3-4mS/cm的传导率并以0.5-3.5mg蛋白/ml珍珠岩的上样量上样到珍珠岩柱上,用10-30KDa NMWL膜超滤浓缩流出物(69kDa成分级分)。向流出浓缩物中加入硫酸铵至35%±3%(w/v),并将得到的混合物在2℃-8℃下贮存4±2天或立即离心(7,000×g)。倒掉过量上清液,通过离心(7,000×g)收集沉淀。69kDa沉淀物既可冻存于-20℃~-30℃下,也可溶解在Tris或磷酸缓冲液中并立即使用。
从浓缩的珍珠岩流出物中用35%(w/v)硫酸铵沉淀所得的69kDa外膜蛋白被用于纯化。将硫酸铵(100±5g/升)加入69kDa级分中并且在2℃-8℃下将混合物搅拌至少2小时。将混合物离心(7,000×g)以回收上清液。将硫酸铵(100-150g/升)加入到上清液中并在2℃-8℃下,将混合物搅拌至少2小时。离心(7,000×g)混合物以回收沉淀,该沉淀被溶解在10mM Tris,HCl,pH8中。将溶液的离子强度调节到与含15mM硫酸铵的10mM Tris HCl(pH8)相等。
将69kDa蛋白上样到与Q-Sepharose柱串联连接的羟基磷灰石柱上。在流出物中收集69kDa蛋白,用含15mM硫酸铵的10mM Tris,HCl(pH8)将其从柱中冲洗下来,并与流出物中的69kDa蛋白合并,将收集的69kDa蛋白用100-300kDa NMWL膜对6-10倍体积的包含0.15M NaCl的10mM磷酸钾(pH8)透滤。收集超滤液,其中的69kDa蛋白已被浓缩。
将69kDa蛋白溶剂换成10mM Tris HCl(pH8),并附吸到Q-Sepharose上,用10mM Tris HCl(pH8)/5mM硫酸铵洗涤,将69kDa蛋白用50mM磷酸钾(pH8)洗脱。将69kDa蛋白用10-30kDa NMWL膜对6-10倍体积的含0.15M NaCl的10mM磷酸钾(pH8)透滤。将69kDa蛋白通过≤0.22μm滤器过滤除菌,将除菌物贮存于2℃-5℃,在三个月内进行吸附作用。
菌毛凝集原:
从发酵液中分离细胞匀浆再从中纯化凝集原。将细胞匀浆用包含10mM磷酸钾,150mM NaCl和4M尿素的缓冲液稀释至细胞级分为0.05体积并将其混合30分钟。通过离心(12,000×g)澄清细胞裂解物,接着使用100-300kDa NMWL薄膜滤器对10mM磷酸钾/150mM NaCl/0.1%Triton X-100进行透滤浓缩。
在80℃下将浓缩物加热处理30分钟,随后通过离心(9,000×g)将其重新澄清。将PEG 8000加入到澄清的上清液中以使最终浓度为4.5%±0.2%,轻轻搅拌最少30分钟。产生的沉淀通过离心(17,000×g)收集,将沉淀物用10mM磷酸钾/150mM NaCl缓冲液提取而得到粗菌毛凝集原溶液。将菌毛凝集原通过PEI硅石柱纯化。使用1M磷酸钾缓冲液使粗液的磷酸钾浓度为100mM,并将其通过PEI硅石柱。
将来自柱的流出物使用100-300kDa NMWL薄膜滤器对10mM磷酸钾/150mM NaCl缓冲液浓缩透滤。将除菌流出物贮存于2℃-8℃下,在三个月内进行吸附作用。菌毛凝集原制剂包含重量比为约1.5~约2∶1的菌毛Agg2和菌毛Agg3并发现基本不含Agg1。
实施例3
本实施例描述纯化的百日咳博德特氏杆菌抗原,PT和FHA的脱毒处理。
如实施例2中所述制备的纯PT通过将溶液中戊二醛浓度调至0.5%±0.1%并在37℃±3℃下保温4小时。使PT成为类毒素。通过加入L-天冬氨酸至0.21±0.02M来终止反应。随后将混合物置于室温下1±0.1小时并接着置于2℃-8℃下1-7天。
将产生的混合物在30kDa NMWL薄膜滤器中对10mM磷酸钾/0.15MNaCl/5%甘油缓冲液透滤,并随后通过≤0.22μm薄膜滤器除菌。将除菌物贮存在2℃-8℃,在三个月内完成吸附。
通过将L-赖氨酸和甲醛的溶液分别调至47±5mM和0.24±0.05%并在35℃~38℃保温6周而将如实施例2所述制备的纯FHA级分处理成毒素。接着将混合物使用30kDa NMWL薄膜滤器对10mM磷酸钾/0.5M NaCl透滤并通过薄膜滤器除菌。将此除菌物贮存于2℃-8℃,在三个月内完成吸附。
实施例4
本实施例描述纯化的百日咳博德特氏杆菌抗原的吸附。
为了将PT,FHA,Agg和69kDa分别吸附到磷酸铝(矾)上,将磷酸铝贮存液配制成18.75±1mg/mL的浓度。准备适宜的容器,将每一种抗原无菌操作分装到这样的容器中。无菌操作加入2-苯氧基乙醇至0.6%±0.1%v/v的终浓度并搅拌直至均匀。将适宜体积的磷酸铝无菌操作加入到容器中。加入适宜体积的无菌蒸馏水使终浓度为3mg磷酸铝/mL。密封容器并贴上标签。让其在室温下摇动4天。接着保存容器等待最后配制。
实施例5
本实施例描述混合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的配制。将如前面实施例中所过制备的百日咳博德特氏杆菌抗原与白喉和破伤风类毒素配制成多组分百日咳(CP)疫苗。
如上面实施例1-4中详细描述,从深层培养的百日咳博德特氏杆 菌中制备百日咳疫苗成分。在生长完成后,通过离心将培养肉汤液和细菌细胞分开。分别纯化各种抗原。通过在珍珠岩和羟基磷灰石上的连续层析从肉汤中纯化百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)。用戊二醛对PT进行脱毒,用甲醛将出现在FHA级分中的任何残余PT(约1%)脱毒。从细菌细胞中制备菌毛凝集原(2+3)(AGG)。用尿素和热处理使细胞破裂,并通过聚乙二醇沉淀和聚乙烯亚胺硅石层析纯化菌毛凝集原。通过硫酸铵沉淀从珍珠岩层析步骤(实施例2)的流出物中分离69kDa蛋白(Pertactin),并通过羟基磷灰石和Q-Sepharose连续层析纯化。将所有成分通过0.22μm薄膜滤器过滤来除菌。
通过标准方法从深层培养的白喉棒状杆菌制备白喉类毒素。白喉类毒素的产生被分为五个阶段,即工作菌种的保存,白喉棒状杆菌的生长,白喉毒素的收获,白喉毒素的脱毒和白喉类毒素的浓缩。
白喉类毒素的制备
(I)工作菌种
将白喉棒状杆菌菌株以分批冻干菌种保存。35℃±2℃下,让复苏的菌种在Loeffler斜面上生长18-24小时,再转移到含有白喉培养基的瓶中。随后检测培养物的纯度和Lf量。剩余的菌种用于接种发酵罐。
(II)白喉棒状杆菌的生长
将培养物保温在35℃±2℃下并在发酵罐中搅拌,向培养物中加入预定量的硫酸亚铁,氯化钙和磷酸盐溶液,通过实验确定每批培养基中各种溶液(磷酸盐,硫酸亚铁,氯化钙)的实际含量。选择的水平为产生最高Lf含量的那些。在生长周期末(30-50小时)取样测定培养物的纯度和Lf含量。
用碳酸氢钠调节pH,在35℃±2℃的恒定温度下用0.4%甲苯将培养物灭活1小时。接着进行无菌检验以证明不存在活的白喉棒状杆菌。
(III)收获白喉毒素
将来自一个或多个发酵罐的甲苯处理的培养物收集到一个大桶中,加入约0.12%碳酸氢钠,0.25%活性炭和23%硫酸铵,测试pH。
将混合物搅拌约30分钟。加入硅藻土并将混合物泵入深度滤器中。滤液再循环直至澄清,收集并取样进行Lf含量测定。向滤液中再次加入硫酸铵至40%的浓度。还加入硅藻土。2℃-8℃下,让该混合物静置3-4天以使沉淀物沉积。收集沉淀的毒素并溶于0.9%生理盐水中。通过过滤除去硅藻土并将毒素对0.9%生理盐水透析以除去硫酸铵。收集透析的毒素并取样用于Lf含量和纯度的测定。
(IV)白喉毒素的脱毒
透析后立即进行脱毒。为了脱毒,将毒素稀释使最终溶液含有:
a)1000±10%Lf/ml的白喉毒素
b)0.5%碳酸氢钠
c)0.5%福尔马林
d)0.9%w/v L-赖氨酸单盐酸盐
用生理盐水将溶液加至所需体积,并将pH调至7.6±0.1。
将类毒素滤过纤维素硅藻土填充滤器和/或薄膜预滤器和0.2μm薄膜滤器进入收集容器中,并在34℃下保温5-7周,取样用于毒性检验。
(V)纯化类毒素的浓缩
收集类毒素,再经超滤浓缩,并收集到适宜容器中。取样用于Lf含量和纯度检测。加入保存剂(2-苯氧基乙醇)至终浓度0.375%,pH调至6.6-7.6。
将类毒素通过预滤器和0.2μm薄膜滤器(或等同物)过滤来除菌并收集。接着从除菌的类毒素中取样检测类毒素Lf含量的不可逆性,保存剂含量,纯度(氮含量),无菌性和毒性。将无菌浓缩的类毒素贮存于2℃-8℃直至最终配制。
破伤风类毒素的制备
从深层培养的破伤风梭状芽孢杆菌制备破伤风类毒素(T)。
破伤风类毒素的制备可分为五个阶段,即工作菌种的保存,破伤风 梭状芽孢杆菌的生长,破伤风毒素的收获,破伤风毒素的脱毒和破伤风类毒素的纯化。
(I)工作菌种
将用于产生破伤风毒素并转化为破伤风类毒素的破伤风梭状芽孢杆 菌菌株以冷冻干燥的形式保存。将种子接种到巯基乙醇酸盐培养基中并在35℃±2℃下让其生长约24小时。取一次样做培养物纯度检测。
(II)破伤风梭状芽孢杆菌的生长
将破伤风培养基装入发酵罐中,热处理并冷却。接着接种发酵罐并在34℃±2℃下,让培养物生长4-9天。取样用于培养物纯度和Lf含量检测。
(III)破伤风毒素的收集
通过纤维素硅藻土填塞过滤分离毒素,再用薄膜滤器对澄清的毒素过滤除菌。取样用于Lf含量和无菌检测。用孔大小为30,000道尔顿的超滤浓缩毒素。
(IV)破伤风毒素的脱毒
在脱毒之前,先对毒素取样检测Lf含量。通过加入0.5%w/v碳酸氢钠,0.3%v/v福尔马林和0.9%w/v L-赖氨酸单盐酸盐并用生理盐水补加至所需体积来脱毒浓缩的毒素(475-525Lf/ml)。将pH调至7.5±0.1,37℃下将混合物保温20-30天。取样用于无菌性和毒性检测。
(V)类毒素的纯化
将浓缩的类毒素通过预滤器,接着通过0.2μm薄膜滤器进行除菌。取样用于无菌性和Lf含量检测。
硫酸铵的最佳浓度根据从类毒素取样测定的分级分离的“S”曲线而定。将第一浓度加入到类毒素中(稀释为1900~2100Lf/mL)。在20℃~25℃下,将混合物静置至少1小时,收集上清液,弃去含有高分子量级分的沉淀。
将第二浓度的硫酸铵加入上清液中进行第二次分级分离,以去除低分子量的杂质。在20℃~25℃下,将混合物静置至少2小时,接着可在2℃~8℃下静置最多3天。通过离心和过滤收集沉淀即为纯化的类毒素。
用Amicon超滤膜(或等同物)在PBS中透滤纯化的类毒素以去除硫酸铵,直至类毒素溶液中再也测不出硫酸铵为止。将pH调至6.6-7.6,加入2-苯氧基乙醇至0.375%的最终浓度经膜过滤对类毒素除菌,并取样用于检测(类毒素的毒性不可逆性,Lf含量,pH,保存剂含量,纯度,无菌性和毒性)。
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的一种制剂被称为CP10/5/5/3DT。每0.5ml人用剂量的CP10/5/5/3DT被配制成包含:
10μg 百日咳类毒素(PT)
5μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
3μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的另一种制剂被称为CP10/5/5DT。每0.5mL人用剂量的CP10/5/5DT被配制成包含:
10μg 百日咳类毒素(PT)
5μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的又一种制剂被称为CP20/20/5/3DT。每0.5mL人用剂量的CP20/20/5/3DT被配制成包含:
20μg 百日咳类毒素(PT)
20μg 丝状血凝素(FHA)
5μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
3μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
联合有白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗的第四种制剂被称为CP20/10/10/6DT。每0.5mL人用剂量的CP20/10/10/6DT被配制成包含:
20μg 百日咳类毒素(PT)
1μg 丝状血凝素(FHA)
10μg 菌毛凝集原2和3(FIMB)
6μg 69kDa外膜蛋白
15Lf 白喉类毒素
5Lf 破伤风类毒素
1.5mg 磷酸铝
0.6% 2-苯氧基乙醇作为保存剂
实施例6:
本实施例描述根据本发明制备的组分无细胞百日咳疫苗的临床评价。
(a)成年人中的研究
对成年人和16-20个月大的儿童的研究表明包含菌毛凝集原的多组分疫苗是安全的并具有致免疫性(表2)。
用五组分百日咳疫苗(CP10/5/5/3DT)对Calgary,Alberta的17和18个月大的婴儿进行临床I期研究,并报道了有害反应,33个婴儿接受该疫苗,另外35个婴儿接受了不含69kDa外膜蛋白的相同疫苗。
少见局部反应。不管给予何种疫苗在约一半的研究参与者中出现全身性有害反应,主要是过敏反应。通过酶免疫分析测得抗PT、抗FHA、抗菌毛凝集原和抗69kDa IgG抗体水平显著升高,经CHO细胞中和试验也测得抗PT抗体水平显著升高。接受四组分(CP10/5/5DT)或五组分(CP10/5/5/3DT)疫苗的婴儿的抗体应答除抗69kDa抗体外未测出差别。接受了包含69kDa蛋白的五组分疫苗的婴儿的抗69kDa抗体水平明显较高。
在加拿大Winnipeg,Manitoba对四组分疫苗进行剂量反应研究。用到两种组分疫苗制剂:CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT。全细胞DPT疫苗作为对照。
本研究是对91个17至18个月的婴儿在他们进行百日咳加强剂量免疫时,进行的双盲研究。CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT均被婴儿很好地接受。在接受不管哪种组分疫苗后有任何局部反应或全身性反应的婴儿人数被证实没有差异,相形之下,接受了全细胞疫苗的婴儿其局部和全身性反应明显多于接受CP20/10/10/6DT组分疫苗的那些婴儿。
婴儿中的研究
临床II期
在Calgary,Alberta和Brltish Columbia,Canada对CP10/5/5/3DT疫苗进行研究。在本研究中,432位婴儿在2,4和6个月大时接受了组分百日咳疫苗或全细胞对照疫苗DPT。这些婴儿对CP10/5/5/3DT疫苗的耐受性很好。在每次服药后,组分疫苗的局部反应较全细胞疫苗少见。
经证实接种组分百日咳疫苗后对所有抗原出现明显的抗体应答。接受全细胞疫苗者对菌毛凝集原,D和T具有强烈的抗体应答。在7个月时,82%-89%的组分疫苗接受者和92%的全细胞疫苗接受者对菌毛凝集原的抗体效价增加4倍或更多。相形之下,对FHA的抗体应答在组分疫苗接受者中为75%-78%,而在全细胞疫苗接受者中为31%。在90%-93%的组分疫苗接受者和75%的全细胞疫苗接受者中可见到抗69kDa抗体效价增加4倍。经酶免疫分析,抗PT抗体效价增加4倍的现象可在40%-49%的组分疫苗接受者和32%的全细胞疫苗接受者中见到;通过CHO中和试验测得PT抗体效价增加4倍的现象在55%-69%的组分疫苗接受者和6%的全细胞疫苗接受者中见到(表2)。
临床IIB期:
在100个2,4和6个月大的婴儿中以D15PT为对照,对CP20/20/5/3DT和CP10/10/5/3DT两种疫苗进行随机盲性研究,其中D15PT的白喉类毒素含量由原制剂的25Lf降低至15Lf。在两种组分制剂之间未检测到有害反应出现率有不同;两者的致反应性明显小于全细胞疫苗对照。随抗原含量的增加,CP20/20/5/3DT疫苗接受者的抗PT抗体(酶免疫分析和CHO中和试验所测)和抗FHA抗体效价也增高。在7个月时,抗FHA抗体的几何平均效价在CP20/20/5/3DT接受者中为95.0,在CP10/5/5/3DT接受者中为45.2,在D15DT接受者中仅为8.9%。通过免疫分析的抗PT效价分别为133.3,58.4和10.4,通过CHO中和试验测得的抗PT效价分别为82.4,32.7和4.0(表2)。
本研究证明联合有已经吸附的白喉和破伤风类毒素的组分百日咳疫苗在增加抗原含量时在婴儿中是安全的并具有致免疫性,抗原含量的增加不增加致反应性但可加强对所制备抗原(PT和FHA)的免疫应答。
NIAID,II期美国比较试验:
由变态反应和传染病国立研究所(NIAID)主办,作为进行大规模无细菌百日咳疫苗功效试验的序曲,在美国进行了II期研究,联合有被吸附的白喉和破伤风类毒素的本发明的一种组分百日咳疫苗(CP10/5/5/3)与其它12种无细胞疫苗和2种全细胞疫苗被包括在该试验中。在137位在2,4和6个月用CP10/5/5/3DT组分疫苗免疫的儿童中报道了安全结果。
如前面研究中所见,发现组分疫苗是安全,低致反应性并且对疫苗的耐受性好。
在7个月时抗PT抗体,抗FHA抗体,抗69kDa抗体和抗菌毛凝集原抗体均高于或等于用全细胞疫苗免疫后所获得的抗体水平(参考文献71和表2)。在随机分配接受CP20/20/5/3DT或CP10/5/5/3DT疫苗制剂的儿童中进行双盲试验。在美国和加拿大总共登记了2050名婴儿:1961名婴儿完成了该试验。两种疫苗制剂在这些婴儿中均为安全,低致反应性和具有致免疫性。在292名婴儿组成的小组中评价致免疫性。两种疫苗制剂均引起对疫苗中所含所有抗原的抗体增多。CP20/20/5/3DT制剂诱导较高抗体效价是针对FHA而不是PT。CP10/5/5/3制剂引发对菌毛的较高抗体效价和较高的凝集原效价。
在法国进行了另一个安全性和致免疫性试验。除了是在2,3和4个月时接种疫苗外,试验设计类似于上面所述的在北美的试验。局部和全身性反应总的来说较少。总之,该疫苗很好地被使用这种给药方式的法国试验参加者所接受。
在10,000名婴儿中对两种无细胞百日咳疫苗和一种全细胞疫苗的安慰剂
-对照功效试验:
根据美国NIAID的II期比较试验结果,选择了两组分和五组分无细胞疫苗进行多中心,有对照,双向随机安慰剂-对照功效试验。在具有百日咳高发病率的瑞典进行临床试验。两组分疫苗包含戊二醛和福尔马林灭活的PT(25μg),福尔马林处理的FHA(25μg)和17Lf的白喉类毒素和10Lf的破伤风类毒素。五组分百日咳疫苗为CP10/5/5/3DT,为了试验,用出生登记,在14个地理区域的试验地点招收了一万名婴儿,他们代表瑞典的这个年龄组的婴儿的约一半。
将1992年1月和2月出生的儿童随机编入一个3处理组试验中。在家长同意后,三分之二的婴儿在2,4和6个月龄时接受了两种百日咳-破伤风-无细胞百日咳疫苗制剂中的一种。对照组仅接受了DT。在1992年5月,引入了美国许可批准的商业上可购得的全细胞DTP疫苗,1992年3月至12月出生的儿童被随机编入4种处理组组成的试验中。在家长同意后,四分之三的婴儿在2,4和6个月龄时分别接受了三种DTP制剂中的一种。对照组仅接受了DT。
每种疫苗给予约2,500名儿童。将疫苗以三种剂量进行免疫,第一种剂量在2个月龄,最迟不晚于三个月时给予。随后以8周间隔提供后续剂量。疫苗通过肌肉内注射来提供。
随访儿童和其家属30个月。如果怀疑患百日咳,收集临床数据,对鼻吸出物利用细菌培养和聚合酶链反应(PCR)的实验室检验诊断。收集急性期和恢复期血样用于血清学诊断。
在此研究之前,在易感人群(尤其是新生儿)中本发明的组分百日咳疫苗中pertactin的水平是未知的。尤其是,各种博德特氏杆菌组分及它们在百日咳疫苗中所选择的相对量对疫苗功效的影响是未知的。
本试验的主要目的是评价无细胞百日咳疫苗和全细胞疫苗与安慰剂对照相比保护机体抵抗典型百日咳的能力。
第二个目的是测试疫苗抵抗已被证实的各种严重程度的百日咳感染的功效。
疫苗功效被定义为相对于未接种疫苗的儿童,接种疫苗的儿童感染百日咳的可能性降低的百分数。
两个接种组中的患百日咳的相对危险性表示为两组中疾病可能性的比例。
可以不同方式评价感染百日咳的可能性,也称发病率。在样本大小的计算中,指定试验组中感染百日咳的可能性通过试验组中患百日咳的儿童人数与直至随访研究终止时仍未患病的儿童人数之比来评价。
本试验中,组分疫苗CP10/5/5/3DT在预防典型百日咳中的功效示于表4中,为约85%。在同一试验中,仅包含PT和FHA的两组分百日咳无细胞疫苗功效为约58%,全细胞疫苗功效为约48%。CP10/5/5/3DT在预防轻度百日咳中也有效,有效率估计为约77%。
本文概要
总结本申请,本发明提供新的百日咳博德特氏杆菌的菌毛凝集原制剂和它们的生产方法。菌毛凝集原可与其它博德特氏杆菌和非博德特氏 杆菌抗原一起配制产生许多多组分百日咳疫苗。这些疫苗在人类为安全,非致反应性的,并具有致免疫性和保护性。在本发明的范围内可进改动。
表4-无细胞百日咳疫苗的功效
疫苗 功效%
A B
CP10/5/5/3DT 84.7(80.3→88.5)1 77
PT25·FHA25DT 58(49.8→64.8)1
DPT2 47.9(37.1→56.9)1
A:病例定义: 21天阵发性咳嗽并且培养物为阳性
B:病例定义: 至少咳嗽一天的轻百日咳
注1:置信界限
注2:全细胞百日咳疫苗
参考文献
1.Muller,A.S.Leeuwenburg,J.and Pratt,D.S.(1986)百日咳:流行病学和控制。Bull WHO 64:321-331。
2.Fine,P.E.M.and Clarkson,J.A.(1984)。在英格兰和威尔士人口中百日咳免疫性的分布,卫生学杂志,92:21-26。
3.Mortimer,E.A.Jr.(1990)。百日咳和它的预防:家庭的事件,传染病杂志。161:473-479。
4.Addiss,D.G.,Davis,I.P.,Meade,B.D.,Burstyn,D.G.Meissner,M.,Zastrow,J.A.,Berg,J.L.,Drinka,P.,andPhillips,R.(1991)。在威斯康星州一家私立医院中百日咳的爆发。传染病杂志。164:704-710。
5.Halperin,S.A.and Marrie,T.J.(1991a)。成年人中的百日咳脑病病例报道和综述:传染性疾病综述。13:1043-1047。
6.Onorato,I.M.,Wassilak,S.G.and Meade,B.(1992)。在美国全细胞百日咳疫苗在学龄前儿童中的功效。JAMA 267:2745-2749。
7.Miller,D.L.,Ross,E.M.,Alderslade,R.,Bellman,M.H.,and Brawson,N.S.B.(1981)。儿童中的百日咳免疫和严重急性神经性疾病,英国医学杂志。282:1595-1599。
8.Tamura,M.,Nogimori,K.,Murai,S.,Yajima,M.,Ito,K.,Katada,T.,Ui,M.,and Ishii,S.(1982)。islet活化的蛋白,百日咳毒素的亚基结构与A-B模型一致。生物化学21:5516-5522。
9.Tuomanen,E.and Weiss,A.(1985)。对百日咳博德特氏杆菌中可吸附人纤毛呼吸上皮细胞的两种粘附素的鉴别。传染病杂志。152:118-125。
10.Friedman,R-L.,Nordensson,K.,Wilson,L.,Akporiaye,E.T.,and Yocum D.E.(1992).人巨噬细胞对百日咳博德特氏杆菌的摄入及菌的胞内存活。传染性免疫学60:4578-4585。
11.Pittman,M(1979)。百日咳毒素:百日咳所致有害作用及对百日咳的长期免疫。一种假说,传染性疾病综述,1:401-402。
12.Granstrom,M.and Granstrom G.(1993)。百日咳中的血清学相关性,疫苗11:445-448。
13.Gearing,A.J.H.,Bird,C.R.,Redhead,K.,and Thomas,M.(1989)。对百日咳博德特氏杆菌的人细胞免疫应答,FEMS微生物免疫学。47:205-212。
14.Thomas,M.G.,Redhead,K.,and Lambert,H.P.(1989a)。对百日咳博德特氏杆菌感染和百日咳疫苗接种的人血清抗体应答。传染病杂志159:211-218。
15.Thomas,M.G.,Ashworth,L.A.E.,Miller,E.,andLambert,H.P.(1989b)。在感染百日咳博德特氏杆菌及用全细胞百日咳疫苗免疫后对百日咳毒素,丝状血凝素,以及凝集原2和3的血清IgG,IgA和IgM应答。传染病杂志160:838-845。
16.Tomoda,T.,Ogura,H.,and Kurashige,T.(1991)。对百日咳博德特氏杆菌感染和疫苗接种的免疫应答。传染病杂志163:559-563。
17.Petersen,J.W.,Ibsen.P.H.,Haslov,K.,Capiau,C.,and Heron,I.(1992a).经气溶胶感染百日咳博德特氏杆菌的小鼠的初级支气管淋巴结和脾淋巴细胞的增殖反应和γ干扰素和肿瘤坏死因子的产生。传染与免 疫。60:4563-4570。
18.Englund,J.A.,Reed,G.F.,Edwards,K.M.,Decker,D.,Pichichero,M.E.,Ronnels,M,B.Steinhoff,M.C.,Anderson,E.L.,Meade,B.D.,Deloria,M.A.,and the NIAID无细胞百日咳疫苗组。(1992b)婴儿接受无细胞(AC)和全细胞(WC)百日咳疫苗后,经胎盘传递的母体抗体的作用及胎儿抗百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)抗体的产生。儿 科研究。31:91A。
19.Oda,M.,Cowell,J.L.,Burstyn,D.C.,Thaib,S.,and Manclark,C.R.(1985)。人初乳中抗百日咳博德特氏杆菌抗体和它们对小鼠抵抗气雾剂感染的保护活性,传染与免疫。47:441-445。
20.Petersen,J.W.,P.H.Bentzon,M.W.,Capiau,C.,and Heron.I.(1991)。成年人中对接种无细胞和全细胞百日咳疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。FEMS微生物学通讯。76:279-288。
21.Oda,M.,Cowell.J.L.,Burstyn.,D.G.,and Manclark,C.R.(1994),在小鼠中的百日咳博德特氏杆菌的丝状血凝素和淋巴细胞增生刺激因子的保护活性,传染病杂志。150:823-833。
.22.Sato,H.,Ito,A..Chib a,J.and Sato.Y.(1984b)。抗百日咳毒素的单克隆抗体:对毒素活性和百日咳感染的影响,传染与免疫。46:422-428。
23.Sato,H.and Sato,Y.(1990)。抗百日咳毒素的小鼠单克隆抗体的保护性活性,传染与免疫。58:3369-3374。
24.Weiss,A.A and Hewlett,E.L.(1986)。百日咳博德特氏杆菌的毒力因子。微生物年评。40:661-668。
25.Munoz,J.J.(1988)。百日咳原(百日咳毒素)对宿主免疫系统的作用:见:百日咳的发病机理及免疫。A.C.Wardlaw and R.Parton,编.,John Wiley & Sons Ltd.,Toronto.pp.211-229。
26.Watkins,P.A.,Burns,D.L.,Kanaho,Y.,Liu,T-Y.,Hewlett E.L.,and Moss,J.(1985)。百日咳毒素对转导素的ADP-核糖基化作用。生物化学杂志。260:13478-13482。
27.Burns,D.L.,Kenimer,J.G.,and Manclark,C.R.(1987)。百日咳毒素的亚基在中国仓鼠卵巢细胞形态变化中的作用。传染与免疫。55:24-28。
28.Munoz,J.J.,Arai,H.,and Cole,R.L.(1981)。来自百日咳博德特 氏杆菌的百日咳原和菌毛凝集素对小鼠的保护和组胺致敏活性,传染与 免疫。32:243-250。
29.Relman,D.A.,Domenighini,M.,Tuomanen,E.,Rappuoli,R.,andFalkow,S.(1989)。百日咳博德特氏杆菌的丝状血凝素:核苷酸序列和在吸附中的关键作用。Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2637-2641。
30.Di Tommaso,A.,Domenighini,M.,Bugnoli,M.,Tagliabuc,A.,Rappuoli,R.,and De Magistris,M.T.(1991)。刺激人T-细胞应答的百日咳博德特氏杆菌丝状血凝素的亚区的鉴别,传染与免疫。59:3313-3315。
31.Tomoda,T.,Ogura,H.,and Kurashige,T.(1992)。在半封闭群体中患有百日咳的病人对丝状血凝素和百日咳毒素的免疫应答的维持时间,传染病杂志。166:908-910。
32.Edwards,K.M.,Meade,B.D.,Decker,M.D.,Reed,G.F.,Rennels,M.B.,Steinhoff,M.C.,Anderson,E.L.,Englund,J.A.,Pichichero,M.E.,Deloria,M.A.,Deforest,A.,and NIAID无细胞百日咳疫苗研究小组(1992)。13种无细胞百日咳疫苗的比较:血清学反应,儿科研究。31:91A。
33.Kimura,A.,Mountzoutos,K.T,Relman,D.A.,Falkow,S.,andCowell,J.L.(1990a)。百日咳博德特氏杆菌丝状血凝素:在小鼠呼吸道感染模型中作为保护性抗原和定居因子的评估。传染与免疫。58:7-16。
34.Shahin,R.D.,Amsbaugh,D.F.,and Leef,M.F.(1992)。丝状血凝素引起的粘膜免疫对抵抗百日咳博德特氏杆菌的呼吸系统感染的保护。传染与免疫。60:1482-1488。
35.Montaraz,J.A.,Novotny,P..and Ivanyi,J.(1985)。来自支气管败血性博德特氏杆菌的68KDa保护性蛋白抗原的鉴定。传染与免疫。161:581-582。
36.Leininger,E.,Roberts,M.,Kenimer,J.G.,Charles,I.G.,Fairweather,M.,Novotny,P.,and Brennan,M.J.(1991)。促进哺乳动物细胞粘附的Pertactin和含Arg-Gly-Asp的百日咳博德特氏杆菌表面蛋白。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:345-349。
37.Da Magistris,T.,Romano,M.,Nuti,S.,Rappuoli,R.and Tagliabue,A.(1988)。对博德特氏杆菌种的人T细胞应答的分析。实验医学杂 志。168:1351-1362。
38.Seddon,P.C.,Novotny,P.,Hall,C.A.and Smith,C.S.(1990)。对百日咳患儿的百日咳博德特氏杆菌抗原的全身性和粘膜抗体应答。血清 诊断和免疫治疗传染性疾病。3:337-343。
39.Podda,A.,Nencioni,L.,Marsili,I.,Peppoloni,S.,Volpini,G.,Donati,D.,Di Tommaso,A.,De Magistris,M.T.,and Rappuoli,R.(1991)。由遗传脱毒的百日咳毒素,联合FHA和69kDa组成的无细胞百日咳疫苗的I期临床试验。疫苗。9:741-745。
40.Roberts,M.,Tita,J.P.,Fairweather,N.F.,Dougan,G.and Charles,I.G.(1992)。重组P.69/Pertactin对小鼠的致免疫性和抵抗百日咳博德 特氏杆菌感染的保护。疫苗。10:43-48。
41.Novotny,P.,Chubb,A.P.,Cownley,K.,and Charles,I.G.(1991)。百日咳博德特氏杆菌的69kDa外膜蛋白的生物学和保护特性、无细胞疫苗的新配方。传染病杂志。164:114-122。
42.Shahin,R.D.,Brannan,M,J.,Li.Z.M.,Meade,B.D.,and Manclark.C.R.(1990b)。百日咳博德特氏杆菌的69kDa外膜蛋白的保护能力和致免疫性的鉴定,实验医学杂志。171:63-73。
43.Robinson,A.,Irons,L.l.,and Ashworth,L.A.E.(1985a)。百日咳疫苗:现状和未来前景。疫苗。3:11-22。
44.Robinson,A.,Ashworth,L.A.E.Baskerville,A.,and Irons,L.I.(1985b)。对小鼠鼻内感染百日咳博德特氏杆菌的保护。61:165-172。
45.Robinson,A.,Gorriga,A.R.,Funnell,S.G.P.,and Fernandez.M.(1989b)小鼠抵抗百日咳博德特氏杆菌感染的血清特异性保护。疫苗。7:321-324。
46.Sato,Y.,Kimura,M.,and Fukumi,H.(1984a)。日本百日咳成分疫苗的发展。柳叶刀i:122-126。
47.Kimura,M.(1991)。日本对无细胞百日咳疫苗的临床实验。Develop.Biol.Standard.73:5-9。
48.Ad Hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines(1988)。在瑞典保护性功效和不利影响试验中两种无细胞疫苗的安慰剂对照试验。柳 叶刀i:955-960。
49.Olin,P.,Storsaetar,J.,and Romanus,V.(1989)。无细胞百日咳疫苗的功效。JAMA 261:560。
50.Storsaeter,J.,Hallander,H.,Farrington.C.P.,Olin,P.,Moliby.R.,and Miller,E.(1990)。对瑞典III期试验中估测的两种无细胞百日咳疫苗的功效的第二次分析。疫苗。8:457-462。
51.Storsaeter,J.,and Olin,P.(1992)。在被动监视的三年中两种无细胞百日咳疫苗的相对功效。疫苗。10:142-144。
52.Tan,L.U.T.,Fahim R.E.F.,Jackson,G.,Phillips,K.,Wah.P.,Alkema,D.,Zobrist,G.,Herbert,A.,Boux.L,Chong,P.,Harjee.N.,Klein,M.,and Vose,J.(1991)。一种制备由百日咳毒素的非热原性类毒素和丝状血凝素组成的无细胞百日咳疫苗的方法。分子免疫学。28:251-255。
53.Sekura,R.D.,Zhang,Y,Roberson,R.,Acton,B.,Trollfors,B.,Tolson,N.,Siloach,J.,Bryla,D.,Muir-Nash.J.,Koeller,D.,Schneerson,R.,and Robbins,J.B.(1988)。成年志愿者对由用过氧化氢灭活的百日咳毒素组成的试验疫苗的临床反应、代谢和抗体反应。儿科学杂志。113:807-813。
54.Winberry,L.,Walker,R.,Cohen,N.,Todd,C.,Sentissi,A.,andSiber,G,(1988),对用四硝基甲烷灭活百日咳毒素的新方法的评价。百日咳博德特氏杆菌国际专题研讨会,Rocky Mountain实验室,Hamilton,蒙特利尔。
55.Sekura,R.D.et al.(1993),生物化学杂志。258:14647-14651。
56.lrons,L.I.et al.(1979),生物化学和生物物理学报。580:175-185。
57.Munoz,J.J.et al(1981),传染与免疫。33:820-826。
58.Cowell,J.L.et al.(1980),传染病报告会。4:371-379。
59.Selmer,J.C.(1984)斯堪的纳维亚病理与微生物免疫学服C辑,92:279-284。
60.Lockhoff,O.(1991):作为免疫调节物的糖脂:合成和性质。Chem.Int.Ed.Engl.30:1611-1620。
61.Nixon-George,A.,Moran,T.,Dionne,G.,Penney,C.L.,Lafleur,D.,Bona,C.A.(1990)酪氨酸十八烷基酯对重组乙型肝炎表面抗原亚基的佐剂作用。免疫学杂志。144:4798-4802。
62.Siber,G.R.,Thakrar,N.,Yancey,B.A.,Herzog.L.,Todd,C.,Cohen,N.,Sekura,R.D.,Lowe,C.U.(1991)。过氧化氢灭活的百日咳类毒素对18个月龄的儿童的安全性和致免疫性。疫苗。9:735-740。
63.Siber,G.,Winberry,L.,Todd,C.,Samore,M.,Sentissi,A.,andCohen,N.(1988)。用四硝基甲烷灭活的百日咳类毒素在成年人中的安全性和致免疫性。在:百日咳博德特氏杆菌国际专题研讨会。RockyMountain Laboratories,Hamilton,Montana。
64.Edwards,K.M.,Bradlsy,R.B.,Decker,M.D.,Palmer,P.S.,VanSavage,J.,Taylor,J.C.,Dupont,W.D.,Hager,C.C.,and Wright,P.F.(1989)。在婴儿和儿童中对新的高度纯化的百日咳疫苗的评价,传染 病杂志。160:832-837。
65.Rutter,D.A.,Ashworth,L.A.E.,Day,A.,Funnell,S.,Lovell,F.,andRobinson,A.(1988)。在健康成年志愿者中对新的无细胞百日咳疫苗的试验。Vaccine 6:29-32。
66.Blumberg,D.A.,Mink,C.A.M,Cherry,J.D.,Johnson,C.,Garber,R.,Plotkin,S.A..Watson.B.,Ballanco,G.A.,Daum R.S.,Sullivan B.,Townsend,T.R.Brayton,J.,Gooch,W.M.,Nelson,D.B.,Congeni,B.L.,Prober,C.G.,Hackell,J.G.,Dekker,C.L.,Christenson,P.D.,and APDT疫苗研究小组(1991)。在婴儿中无细胞和全细胞百日咳成分,白喉-破伤风-百日咳疫苗的比较。儿科学杂志。119:194-204。
67.Englund,J.A.,Glezen,W.P.and Barreto,L.(1992a)。在成年人和幼儿中新的五成分无细胞百日咳疫苗的对比研究,传染病杂志,166:1436-1441。
68.Zealey,G.,Loosmore,S.,Yacoob,R.,Klein,M.,疫苗研究,卷.1,pp.413-427。
Claims (14)
1.一种从百日咳博德特氏杆菌菌株中制备包含菌毛凝集原2(Agg 2)和菌毛凝集原3(Agg 3),而基本上不含凝集原1的凝集原制备物的方法,特征在于包括步骤:
(a)产生百日咳博德特氏杆菌菌株的细胞匀浆;
(b)通过将细胞匀浆分散于10mM磷酸钾、150mM NaCl和4M尿素的缓冲液中,然后通过离心产生包含所述凝集原2和3的第一上清和第一残余沉淀来从细胞匀浆中选择性提取菌毛凝集原2和3;
(c)将第一上清与第一残余沉淀分离;
(d)在75°-85℃温度下,将第一上清保温10分钟-60分钟,然后通过离心产生包含菌毛凝集原2和3的澄清上清和包含非菌毛凝集原污染物的第二沉淀;
(e)浓缩澄清上清以产生粗菌毛凝集原溶液,方法是向澄清上清中加入聚乙二醇从澄清上清中沉淀菌毛凝集原2和3,将沉淀的菌毛凝集原2和3与产生的上清离心分离,然后将沉淀物用10mM磷酸钾/150mM NaCl缓冲液提取而溶解分离出的菌毛凝集原2和3,从而获得粗菌毛凝集原溶液;和
(f)从粗菌毛凝集原溶液中纯化菌毛凝集原2和3以产生包含菌毛凝集原2和3的菌毛凝集原制备物。
2.权利要求1所述方法,特征在于步骤(d)的温度为80℃。
3.权利要求1或2的方法,特征在于步骤(d)的时间为30分钟。
4.权利要求1或2所述的方法,特征在于在保温步骤(d)之前浓缩第一上清。
5.权利要求1或2所述的方法,特征在于通过向澄清上清中加入分子量8000的聚乙二醇至3%-5wt%浓度以使所述凝集原从澄清上清中沉淀来进行所述沉淀过程。
6.权利要求5所述方法,特征在于聚乙二醇的浓度为4.3-4.7wt%。
7.权利要求1或2所述的方法,特征在于通过柱层析将凝集原从粗菌毛凝集原溶液中纯化。
8.权利要求7所述方法,特征在于所述柱层析包括Septhadex 6B和/或PEI硅胶柱层析。
9.权利要求7所述的方法,特征在于所述纯化步骤包括对柱层析纯化的流出物除菌以提供无菌菌毛凝集原制备物。
10.权利要求9所述的方法,特征在于将所述无菌菌毛凝集原制备物吸附到矿物盐佐剂上。
11.权利要求10所述的方法,特征在于所述矿物盐佐剂为明矾。
12.一种根据权利要求1-11任一项的方法由百日咳博德特氏杆菌菌株制得的菌毛凝集原制备物,特征在于包含菌毛凝集原2(Agg2)和菌毛凝集原3(Agg 3),而基本上不含凝集原1。
13.权利要求12所述制备物,特征在于菌毛Agg 2与菌毛Agg 3的重量比为1.5∶1-2∶1。
14.一种致免疫组合物,包含权利要求12或13所述的凝集原制备物。
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Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2646776B1 (fr) * | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
ATE183194T1 (de) * | 1994-04-28 | 1999-08-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur trennung von protektiven verbindungen aus bordetella pertussis |
US6696065B1 (en) * | 1995-05-04 | 2004-02-24 | Aventis Pastuer Limited | Acellular pertussis vaccines and methods of preparation thereof |
GB9611501D0 (en) * | 1996-06-03 | 1996-08-07 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine compositions |
JP3280675B2 (ja) * | 1996-07-02 | 2002-05-13 | コノート ラボラトリーズ リミテッド | 多価dtpポリオワクチン |
JP4530317B2 (ja) * | 1998-10-21 | 2010-08-25 | 学校法人北里研究所 | 減毒化トキシンを含むワクチン製剤 |
CA2546343A1 (en) * | 2003-11-20 | 2005-06-09 | Sanofi Pasteur, Inc. | Methods for purifying pertussis toxin and peptides useful therefor |
JP5378685B2 (ja) * | 2004-12-17 | 2013-12-25 | デ スタート デール ネーダーランデン, フェルテヘンウォールディヒィト ドール デ ミニステール ファン フォルクスヘーゾンドハイド, フェルザイン アン スポルト | グラム陰性菌におけるlpsの脱アシル化 |
US8124397B2 (en) * | 2005-08-08 | 2012-02-28 | Oregon Health & Science University | Inactivating pathogens with oxidizing agents for vaccine production |
EP1867638A1 (de) * | 2006-06-16 | 2007-12-19 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Verfahren zur kovalenten Verknüpfung zweier Moleküle mittels Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf |
PL2097102T3 (pl) | 2006-09-07 | 2012-10-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Szczepionka skojarzona o zmniejszonej ilości antygenu wirusa polio |
CN100537767C (zh) * | 2007-04-29 | 2009-09-09 | 中国药品生物制品检定所 | 百日咳疫苗保护性抗原的重组表达及其应用 |
GB0822633D0 (en) * | 2008-12-11 | 2009-01-21 | Novartis Ag | Formulation |
US20100330158A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-12-30 | Innopharma, Llc | Protein-assisted drug delivery system for the targeted administration of active agents |
EP2430040A1 (en) | 2009-05-11 | 2012-03-21 | Novartis AG | Antigen purification process for pertactin antigen |
WO2013043608A1 (en) * | 2011-09-20 | 2013-03-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Removal of virucidal agents from biomolecule preparations |
US20140234360A1 (en) | 2011-09-30 | 2014-08-21 | The United States of America, as represented by the Secretary, Dept.of Health and Human Services | Influenza vaccine |
CN102584958A (zh) * | 2012-02-08 | 2012-07-18 | 北京天坛生物制品股份有限公司 | 百日咳杆菌69kd外膜蛋白的纯化方法 |
CN102793915B (zh) * | 2012-07-25 | 2013-10-23 | 天津康希诺生物技术有限公司 | 一种无细胞百日咳疫苗的生产方法 |
ES2597832T3 (es) | 2013-03-08 | 2017-01-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vacuna acelular contra la tosferina |
SG10201911134QA (en) | 2015-06-05 | 2020-01-30 | Grace W R & Co | Adsorbent bioprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
CN105106947A (zh) * | 2015-07-21 | 2015-12-02 | 华兰生物工程股份有限公司 | 过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方法 |
EP3518968B1 (en) | 2016-10-03 | 2022-01-05 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use |
WO2018081832A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Peptide fragments from filoviruses and their uses |
US11235056B2 (en) | 2017-03-24 | 2022-02-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use |
KR102426041B1 (ko) * | 2017-08-01 | 2022-07-29 | 주식회사 녹십자 | 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법 |
WO2019079337A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | RECOMBINANT HIV-1 ENVELOPE PROTEINS AND THEIR USE |
WO2020061564A1 (en) | 2018-09-23 | 2020-03-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hiv-1 env fusion peptide nanoparticle carrier conjugates and their use |
US20210340188A1 (en) | 2018-10-22 | 2021-11-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion |
CN110358802B (zh) * | 2019-08-16 | 2021-06-18 | 长春百克生物科技股份公司 | 一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法 |
CN112094354B (zh) * | 2020-11-05 | 2021-02-02 | 苏州世诺生物技术有限公司 | 副鸡禽杆菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 |
WO2023015186A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection |
WO2023192835A1 (en) | 2022-03-27 | 2023-10-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1033072A (zh) * | 1987-09-04 | 1989-05-24 | 安姆根有限公司 | 重组dna产生的博德特氏菌毒素亚基类似物 |
CN1046532A (zh) * | 1989-03-31 | 1990-10-31 | 华盛顿大学 | 博德特氏菌疫苗 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4258029A (en) | 1979-04-23 | 1981-03-24 | Connaught Laboratories Limited | Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses |
DE3521994A1 (de) | 1985-06-20 | 1987-01-02 | Bayer Ag | N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln |
GB8601279D0 (en) * | 1986-01-20 | 1986-02-26 | Public Health Lab Service | Purification of pertussis antigens |
US4705686A (en) | 1986-05-09 | 1987-11-10 | American Cyanamid | Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine |
GB8727489D0 (en) | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
GB8807860D0 (en) | 1988-04-05 | 1988-05-05 | Connaught Lab | Pertussis vaccine |
US4967176A (en) * | 1988-07-15 | 1990-10-30 | Raychem Corporation | Assemblies of PTC circuit protection devices |
US5101014A (en) | 1989-02-10 | 1992-03-31 | United States Of America | Process for the purification of a 69,000 da outer membrane protein of Bordetella pertussis |
US5276142A (en) | 1989-12-11 | 1994-01-04 | American Cyanamid Company | Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis |
GB9007657D0 (en) * | 1990-04-04 | 1990-05-30 | Connaught Lab | Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69) |
EP0484621A3 (en) * | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
ATE183194T1 (de) * | 1994-04-28 | 1999-08-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur trennung von protektiven verbindungen aus bordetella pertussis |
FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
US5877298A (en) * | 1995-05-04 | 1999-03-02 | Connaught Lab | Acellular pertussis vaccines and methods of preparing thereof |
-
1996
- 1996-05-02 DK DK96911886T patent/DK0824358T3/da active
- 1996-05-02 EP EP20030078354 patent/EP1405643A1/en not_active Withdrawn
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- 1996-05-02 CA CA002220063A patent/CA2220063C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 ES ES96911887T patent/ES2180758T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 PT PT03078355T patent/PT1393744E/pt unknown
- 1996-05-02 AT AT96911886T patent/ATE228851T1/de active
- 1996-05-02 CN CN96195230A patent/CN1198099A/zh active Pending
- 1996-05-02 WO PCT/CA1996/000279 patent/WO1996034883A1/en active IP Right Grant
-
1999
- 1999-03-15 HK HK99101064.1A patent/HK1016191A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-04-21 LU LU93036C patent/LU93036I2/xx unknown
- 2016-04-27 FR FR16C0015C patent/FR16C0015I2/fr active Active
- 2016-04-28 NL NL300804C patent/NL300804I2/nl unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1033072A (zh) * | 1987-09-04 | 1989-05-24 | 安姆根有限公司 | 重组dna产生的博德特氏菌毒素亚基类似物 |
CN1046532A (zh) * | 1989-03-31 | 1990-10-31 | 华盛顿大学 | 博德特氏菌疫苗 |
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JP4589852B2 (ja) | 非細胞性百日咳ワクチンおよびその製造方法 | |
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