KR102426041B1

KR102426041B1 - 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법

Info

Publication number: KR102426041B1
Application number: KR1020170097716A
Authority: KR
Inventors: 안동호; 최기섭; 문재훈; 전형진; 박종관; 김혜련; 최보미
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2017-08-01
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2037-08-01
Also published as: WO2019027168A9; MX2020001304A; JP2020529989A; JP7186215B2; BR112020002232A2; AU2018310071A1; WO2019027168A3; CN111194321B; WO2019027168A2; AU2018310071B2; KR20190013296A; CN111194321A

Abstract

본 발명은 PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증가시킬 수 있는 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 PRN 단백질 수득 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 우레아 처리 전 펠렛을 냉동하고, 냉장 온도에서 서서히 해동할 경우, 다른 조건의 실험군들에 비해 PRN 단백질의 추출량이 효과적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 방법을 적용한 대량생산 규모에서도 PRN 추출량이 효과적으로 증가하였다. 따라서, 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 전처리 과정은 백일해 백신을 위한 PRN 대량 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법{METHOD FOR OBTAINING BORDETELLA PERTUSSIS RELATED PROTEIN COMPRISING PROCESSES OF FREEZING AND THAWING}

본 발명은 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 PRN 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

백일해는 주로 영유아에게 발병하고 2주 이상의 기침을 특징으로 하는 급성 호흡기 질환이다. 그람 음성의 짧은 호기성 간균인 백일해균(Bordetella pertussis)이 백일해의 원인으로 보고된 바 있다. 백일해균은 인간을 유일한 숙주로 이용하고, 주로 호흡기를 통하여 감염된다. 또한, 백일해균은 호흡기관 점막에 서식하며, 인체에 질환을 야기시킨다. 1930년대 세포 백일해 백신이 개발되어 백일해 예방 효과가 증명되었다. 또한, 백일해 백신은 1940년대 파상풍 및 디프테리아 불활화 사백신과 혼합하여 사용되었으나 전세포 백일해 백신(whole-cell pertussis vaccine)의 부작용(발작, 부종, 발열 등)이 보고되어, 안전성이 확보된 백일해 백신의 개발이 요구되었다.

1950년대 이르러 백일해균에 의한 발병 기전에 대한 연구가 진행되었고, Pertussis toxin (PT), Filamentous hamagglutinin (FHA), Pertactin (PRN), Fimbriae (FIM) 등과 같은 구성 성분이 항원으로 보고되었다. 그 후 이들 단백질을 분리, 정제한 무세포성 백일해 백신(acellular pertussis vaccine)에 대한 개발이 진행되었고, 1980년대 이후 정제된 백일해 백신이 일본에서 처음으로 개발되어 접종되었다.

무세포성 백일해 백신을 제조하기 위해서는 PT, FHA, 및 PRN과 같은 단백질을 정제해야 한다. 전통적으로 황산암모늄 침전법과 밀도 구배 원심분리 방법을 반복하여 항원을 동시 정제하였으나, 이러한 방법은 불순물이 많고 정제공정을 컨트롤하기 어려운 단점이 있다. 다른 방법은 물리, 화학적 방법을 조합하여 각 항원을 개별적으로 정제하는 것이다. 대한민국 공개공보 제2015-0124973호에서는 PT, FHA, 및 FIM 2형 및 3형을 포함하는 무세포 백일해 백신 조성물에 대해 개시하고 있다.

한편, 3개 또는 4개의 구성요소를 혼합하여 생산하는 백일해 백신 생산 방법은 1개의 구성요소라도 생산성이 떨어질 경우, 전체 생산기간이 증가하는 문제가 있다.

따라서, 백일해 백신을 효율적으로 제조하기 위해 PRN 단백질을 효율적으로 대량생산하기 위한 방법이 모색되고 있는 실정이다.

KR 10-2015-0124973 A

이에, 본 발명자는 백일해균의 PRN 단백질의 추출량을 증대시킬 수 있는 조건을 확보하기 위하여 노력하던 중, 백일해균을 포함하는 시료가 특정 조건의 냉동(cold-shock) 및 해동 단계를 거칠 경우, 백일해균의 PRN 단백질 추출량이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 백일해균의 PRN 단백질의 추출량을 증대시킬 수 있는 PRN 단백질 수득 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 백일해균을 포함하는 시료를 냉동하는 단계; 2) 상기 냉동된 시료를 해동하는 단계; 3) 상기 해동된 시료를 파쇄하는 단계; 및 4) 상기 파쇄된 시료를 정제하는 단계를 포함하는 PRN 단백질 수득 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 백일해균의 PRN 단백질을 수득하는 방법은 백일해균이 포함된 시료를 냉동하고, 냉장 온도에서 해동하여 PRN 단백질의 추출량을 극대화하는 것이다. 상기 조건으로 전처리를 거친 시료를 정제하여 PRN을 수득하였을 때, 이와 같은 전처리를 거치치 않은 추출방법에 비해 PRN 단백질의 추출량이 현저히 증가하였다. 또한, 상기 PRN 단백질을 수득하는 방법은 백일해 백신을 제작하기 위한 PRN 단백질 대량 생산에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 PRN 정제 공정 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 펠렛 제조 및 해동 공정과 우레아 처리 공정의 흐름도를 세부적으로 나타낸 것이다.
도 3은 제조 및 보관 조건을 달리한 각 펠렛에 우레아를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 SDS-PAGE 기법을 이용하여 비교예 1 내지 비교예 5 및 실시예 1 내지 실시예 3의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 4b는 SDS-PAGE 기법을 이용하여 비교예 6 내지 비교예 10 및 실시예 4 및 실시예 5의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 4c는 SDS-PAGE 기법을 이용하여 비교예 11 내지 비교예 16 및 실시예 6의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 5a는 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 비교예 1 내지 비교예 5 및 실시예 1 내지 실시예 3의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, PRN 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 5b는 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 비교예 6 내지 비교예 10 및 실시예 4 및 실시예 5의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, PRN 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 5c는 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 비교예 11 내지 비교예 16 및 실시예 6의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, PRN 단백질의 추출량 차이를 나타낸 것이다.
도 6은 슬러리 및 펠렛 보관 조건을 달리한 비교예 1 내지 7 및 실시예 1 내지 실시예 3의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, PRN 단백질의 추출량을 나타낸 것이다.
도 7은 펠렛 보관 조건을 달리한 비교예 15 내지 비교예 17 및 실시예 7의 방법으로 PRN 단백질 수득 시, PRN 단백질의 추출량을 나타낸 것이다.
도 8은 펠렛의 해동 조건을 달리할 경우, PRN 단백질의 추출량의 차이를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 측면으로, 1) 백일해균을 포함하는 시료를 냉동하는 단계; 2) 상기 냉동된 시료를 해동하는 단계; 3) 상기 해동된 시료를 파쇄하는 단계; 및 4) 상기 파쇄된 시료를 정제하는 단계를 포함하는 백일해균 유래 PRN 단백질을 수득하는 방법을 제공한다.

첫 번째로, 백일해균을 포함하는 시료를 냉동하는 단계를 수행한다.

본 발명에서 "백일해균"은 보르데텔라 파라백일해균이라고도 하며, 그람 음성에서 0.3 내지 1 μm 가량의 소간균으로서 편모와 아포는 없다. 백일해균의 주요 단백질 중 하나인 PRN은 퍼탁틴(pertactin)의 약어이며, 백일해를 일으키는 백일해균의 독성인자이다. 또한, PRN은 기관 상피세포에 접착하는 외막 단백질로서, 백일해균으로부터 수득되며 백일해 백신의 중요한 구성성분 중 하나이다.

본 명세서에서 "백일해균을 포함하는 시료"는 백일해균을 배양한 배양액, 연속원심분리를 통해 상기 배양액에서 분리한 슬러리(slurry), 또는 고속원심분리를 통해 상기 슬러리로부터 수득한 펠렛일 수 있고, 바람직하게는 펠렛일 수 있다. 이때, 펠렛은 수득한 슬러리를 바로 원심분리하여 수득할 수 있다. 그러나, 수득한 슬러리는 1일 내지 5일이 지난 후에 원심분리하여 펠렛을 수득할 수 있다. 이때, 슬러리는 0℃ 내지 25℃에서 보관할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 백일해 균주를 MSS(modified stainer scholte) 배지에서 35℃의 온도로 배양하고 상기 세포 배양액을 상온에서 2시간 동안 연속원심분리하여 이로부터 수득된 슬러리를 2℃ 내지 8℃에서 50분 동안 7,000 rpm의 속도로 고속원심분리함으로써 펠렛을 제조하였다.

두 번째로, 냉동된 시료를 해동하는 단계를 수행한다.

상기 백일해 균주를 포함하는 시료를 냉동하는 단계에서 냉동 온도는 -1℃, -2℃, -5℃, -10℃, -20℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃, -70℃, -80℃, -90℃일 수 있으며, -1℃ 내지 -90℃, -5℃ 내지 -85℃, -15℃ 내지 -75℃, -30℃ 내지 -60℃일 수 있다. 냉동 시간은 0.5시간, 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 20시간, 30시간, 40시간일 수 있으며, 0.5시간 내지 40시간, 1시간 내지 30시간, 2시간 내지 20시간, 5시간 내지 10시간일 수 있다.

또한, 상기 냉동된 시료는 냉장보관하여 서서히 해동시킨다. 이때, 해동을 위한 냉장 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 7℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃일 수 있으며, 1℃ 내지 25℃, 2℃ 내지 18℃, 5℃ 내지 15℃, 7℃ 내지 10℃일 수 있다. 냉장 시간은 0.1시간, 1시간, 5시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간일 수 있으며, 0.1시간 내지 60시간, 1시간 내지 55시간, 5시간 내지 50시간, 12시간 내지 48시간일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 펠렛을 -30℃ 이하에서 2시간 동안 냉동 보관하였으며, 냉동된 펠렛을 상온 또는 1℃ 내지 7℃의 냉장 온도에서 해동하였다.

이때, 냉동과 해동하는 단계는 1번 이상 반복하여 수행될 수 있다.

세 번째로, 해동된 시료를 파쇄하는 단계를 수행한다.

상기 해동된 시료는 파쇄 단계를 거치게 된다. 이때, 파쇄는 예를 들어 우레아 처리, 열처리, 구아니딘 처리, 또는 요오드 처리를 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 파쇄방법이 적용될 수 있다.

우레아를 처리하여 시료를 파쇄할 경우, 우레아 농도는 0.1 M, 0.5 M, 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M, 10 M일 수 있으며, 0.1 M 내지 10 M, 1 M 내지 8 M, 3 M 내지 7 M, 4 M 내지 5 M일 수 있다. 우레아 처리 시간은 5분, 10분, 20분, 50분, 80분, 120분, 180분, 240분, 360분일 수 있으며, 5분 내지 360분, 20분 내지 240분, 50분 내지 180분일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 해동된 펠렛에 5.0 M의 우레아 버퍼를 펠렛 무게의 4배만큼 처리하고, 3시간 동안 교반함으로써 펠렛 내의 백일해균의 외막을 파쇄하였다.

네 번째로, 파쇄된 시료를 정제하는 단계를 수행한다.

세포 용해물 또는 세포 배양물을 원심분리한 후 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 이용하여 불필요한 세포 조각(cell debris) 등을 제거할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 또는 친화성 크로마토그래피 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 파쇄된 펠렛을 정제하는 단계에서 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography, IEX), 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC), 및 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography, GFC)를 수행하여 PRN 단백질을 수득하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이온교환 크로마토그래피"는 음이온들이나 양이온들이 교환수지라고 하는 정지상에 공유결합되어 있는 이온교환수지를 이용할 수 있다. 이동상에 있는 반대 전하의 용질 이온들은 정전기적 인력으로 정지상에 이끌린다. 이온교환 크로마토그래피는 이온 또는 전기적으로 전하를 띄는 화합물이 정전기적인 힘에 의해 이온교환수지(ion exchanger)에 흡착되어 평형을 이루는 것에 기초한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 이온교환 크로마토그래피 컬럼에 음이온 교환수지를 이용하였으며, 평형버퍼로서 Tris-HCl 용액, 세척 버퍼로서 NaCl 용액이 포함된 Tris-HCl 용액, 및 용출 버퍼로서 NaCl 용액이 포함된 Tris-HCl 용액을 사용하여 PRN 단백질을 용출하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "소수성 상호반응 크로마토그래피"는 소수성 기능기를 갖는 지지체(matrix)와 어떤 분자간의 소수성 상호작용을 이용하여 분리하는 방법이다. 지지체는 친수성(hydrophilic)이고 불활성인 아가로오스를 변형시켜 소수성 기능(hydrophobic functionality)을 갖도록 한다. 알킬아민을 BrCN으로 활성화시킨 아가로오스와 반응시켜 변형된 아가로오스를 많이 이용한다. 소수성 상호반응 크로마토그래피는 단백질 순수 분리과정에 많이 이용된다. 또한, 소수성 상호반응 크로마토그래피에서 단백질의 용리를 위해 이온세기를 감소시키거나 pH를 증가시킬 수 있으며, 극성을 감소시키는 지방족 아민(aliphatic amine), 알콜, 또는 비이온성 세척제(예를 들어, Tween-20, Triton X-100 등)를 사용하기도 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 평형버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액, 세척버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액, 및 용출버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 사용하여 PRN 단백질을 용출하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "겔 여과 크로마토그래피"는 정지상에 분자체를 사용하는데 이들은 세파덱스(sephadex), 폴리아크릴아마이드 또는 아가로오스 겔로서 친수성이므로 물을 흡수할 수 있고 팽윤된다. 시료 분자의 크기가 팽윤된 겔의 최대 구멍(pore)보다 클 때, 그 분자는 겔 입자를 통과하지 못하므로 정지상 입자의 공간을 통해서 컬럼 밖으로 나오게 된다. 보다 작은 분자는 겔 입자의 열린 구멍 속에 들어가나 그 크기와 모양에 따라서 통과하는 속도가 다르다. 따라서, 분자의 크기가 감소하는 순서로 용출된다. 겔 크로마토그래피에서는 시료의 크기, 점성도, 이온의 세기, 흐름 속도 등이 고려된다.

본 발명의 일 실시예에서는, 평형 버퍼로서 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨을 사용하여 PRN 단백질을 용출하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. PRN 수득 공정

PRN 수득 공정은 펠렛의 제조 및 해동, 우레아(urea) 처리, 컬럼 크로마토그래피 (IEX, HIX, 및 SEC), 농축 및 버퍼교환(UF/DF), 및 불순물이 제거된 PRN 단백질을 정제하는 과정으로 수행하였다. 상기 PRN 수득 공정 흐름도를 도 1에 나타내었다.

실시예 1.1. 백일해균의 배양

백일해균(국립보건원)을 MSS배지에서 35℃의 온도로 4일 동안 배양하였으며, 배양 기간은 구체적으로 종배양 1일, 1차 증균배양 1일, 2차 증균배양 1일, 및 본배양 1일이 소요되었다.

실시예 1.2. 펠렛 제조

상기 세포 배양액을 상온에서 2시간 동안 flow rate 100L/h 및 9,500 rpm의 조건으로 연속원심분리하여 배양상청액과 슬러리(slurry)로 분리하였다. 상기 분리된 슬러리를 5℃±3℃에서 50분 동안 7,000 rpm으로 고속원심분리하여 펠렛을 제조하였다. 하기 실시예에서 슬러리를 3일 보관하는 경우, 5℃의 냉장 온도에서 3일간 보관하였으며, 이후 고속원심분리하여 펠렛을 제조하였다.

실시예 1.3. 냉동 및 해동

상기 제조된 펠렛을 -30℃ 이하에서 2시간 동안 보관한 후, 상온(RT)에서 1일 동안 보관하여 펠렛을 해동하였다. 이후, 하기 실시예 1.4 내지 실시예 1.7의 과정을 수행하여 PRN 단백질을 수득하였다. 또한, 슬러리의 보관 조건, 및 냉동 및 해동 조건을 달리하여 하기 표 1의 실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 16과 같이 실험을 진행한 후, 하기 실시예 1.4 내지 실시예 1.7의 과정을 수행하여 PRN 단백질을 수득하였다.

실험 번호

비교예 1

실시예 1

비교예 2

실시예 2

실시예 3

비교예 3

비교예 4

비교예 5

비교예 6

비교예 7

비교예 8

슬러리 0일
보관

펠렛
보관
조건

cold-
shock

X

O

X

O

X

보관
조건

X

상온(RT)

냉장(Cold room)

냉동1
(F1, -30℃)

냉동2
(F2, -70℃)

보관
일수

X

1

3

1

3

1

3

1

3

실험 번호

비교예 9

실시예 4

비교예 10

실시예 5

실시예 6

비교예 11

비교예 12

비교예 13

비교예 14

비교예 15

비교예 16

슬러리 3일
보관

펠렛
보관
조건

cold-
shock

X

O

X

O

X

보관
조건

X

상온(RT)

냉장(Cold room)

냉동1
(F1, -30℃)

냉동2
(F2, -70℃)

보관
일수

X

1

3

1

3

1

3

1

3

실시예 1.4. 우레아 처리

해동된 펠렛에 5.0 M 우레아 버퍼를 펠렛 무게의 4배만큼 넣고, 마그네틱바를 이용하여 280 rpm의 속도로 3시간 동안 교반하였다. 3시간 동안 교반된 우레아 처리액은 7,000 rpm(12230 RCF)의 속도로 1.5시간 동안 5℃±3℃의 조건에서 고속원심분리를 수행하였다. 원심분리 후, 세포 조각을 제거하고 상청액을 회수하였다. 회수된 상청액은 0.22 ㎛의 필터로 여과하였다. 상기 실시예 1.2 및 1.3의 펠렛 제조 및 해동과 우레아 처리의 세부적인 공정 흐름도는 도 2에 나타내었다.

실시예 1.5. IEX 컬럼 정제

IEX 레진(resin)이 충전된 컬럼에 증류수(distilled water, DW)를 100 cm/hr로 3 CV로 흘려 보관용액을 제거한 후, 1N NaOH 용액을 40 cm/hr로 1시간 동안 흘려 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 Tris-HCl 용액을 3 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, 농축 및 버퍼교환 1 공정액을 IEX 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 3 CV로 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 5 CV로 흘려 세척을 시행하였다. 세척이 완료된 후, 용출버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 5 CV로 흘려 PRN 단백질을 용출하였다.

실시예 1.6. HIC 컬럼 정제

HIC 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 100 cm/hr, 3 CV로 흘려 보관용액을 제거한 후, 1N NaOH 용액을 40 cm/hr로 1시간 동안 흘려 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 3 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, IEX 컬럼 정제 공정을 통해 수득한 용출액과 3.6 M NaCl을 1:1로 혼합한 용액을 HIC 컬럼에 흘려 흡착시키고, 평형버퍼를 3 CV로 흘려 컬럼에 남아있는 용액을 제거하였다. 이후, 세척버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 5 CV로 흘려 세척을 시행하였다. 세척이 완료된 후, 용출버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 Tris-HCl 용액을 5 CV로 흘려 PRN 단백질을 용출하였다.

실시예 1.7. GFC 컬럼 정제

GFC 레진이 충전된 컬럼에 증류수를 15 cm/hr, 3 CV로 흘려 보관용액을 제거한 후, 1N NaOH 용액을 15 cm/hr로 1시간 동안 흘려 세척을 시행하였다. 평형버퍼인 NaCl 용액을 포함하는 인산나트륨을 3 CV로 흘려 평형화하였다. 평형이 완료된 후, 농축 및 버퍼교환 2 공정액을 GFC 컬럼에 흘려 PRN 단백질을 용출하였다.

실험예 1. 펠렛 제조 및 보관 조건에 따른 PRN 추출량의 차이 확인

PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증대시키는 조건을 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 PRN 수득 공정에서 펠렛의 제조 및 보관 조건을 달리하여 실험을 진행하였다. 펠렛의 제조 및 보관 조건은 상기 실시예 1.3의 표 1과 같고, 각 조건에 따른 실험과정 및 결과를 하기 실험예 1.1 내지 1.5에 나타내었다.

실험예 1.1. 슬러리 및 펠렛 보관 조건별 우레아 처리에 따른 상층액 색깔 변화

상기 실시예 1.3의 표 1과 같이 제조 및 보관 조건을 달리한 펠렛에 우레아 버퍼를 처리하여 교반한 후, 이를 원심분리하였다. 원심분리를 통해 수득된 상청액을 필터로 여과하였고, 각 보관 조건에 따른 상청액의 색깔 차이를 확인하였다. 상기 과정을 실시예 1.4에 구체적으로 기재하였으며 실험결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 펠렛을 냉동 보관 후 냉장 보관을 한 조건(실시예 2 및 3, 및 실시예 5 및 6)에서 진한 노란색을 나타내었다. 이는 냉동 및 냉장 해동 후 우레아를 처리하였을 때 많은 펠렛이 깨지게 됨을 의미한다.

실험예 1.2. 펠렛 보관 조건에 따른 단백질 추출량의 차이 확인

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 펠렛의 보관 조건에 따른 PRN 단백질의 추출량 차이를 확인하였다. 이때, 웨스턴 블롯 기법에서 Guinea Pig anti-PRN(영인프론티어) 및 Biotin-labeled Guinea Pig anti-PRN(영인프론티어)을 항체로 사용하였다. 이를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 펠렛을 냉동 보관 후 실온 또는 냉장 보관을 한 조건(실시예 1 내지 6)에서 많은 양의 PRN 단백질을 수득하였다.

실험예 1.3. 슬러리 및 펠렛 보관 조건에 따른 PRN 단백질의 추출량 확인

ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기법을 이용하여 슬러리 및 펠렛 보관 조건에 따른 PRN 단백질의 추출량 차이를 확인하였다. 이를 도 6에 나타내었다. 이때, 도 6에서 그래프 하단의 1번 내지 11번 각각의 펠렛 보관 조건은 하기와 같고, 보다 구체적인 조건을 하기 표 2에 나타내었다:

1: 펠렛 제조 후 바로 우레아 처리;

2: 냉동 보관 및 상온에서 1일 동안 해동;

3: 냉동 보관 없이 상온에서 1일 동안 해동;

4: 냉동 보관 및 냉장에서 1일 동안 해동;

5: 냉동 보관 및 냉장에서 3일 동안 해동;

6: 냉동 보관 없이 냉장에서 1일 동안 해동;

7: 냉동 보관 없이 냉장에서 3일 동안 해동;

8: 냉동(-30℃)에서 1일 보관;

9: 냉동(-30℃)에서 3일 보관;

10: 냉동(-70℃)에서 1일 보관; 및

11: 냉동(-70℃)에서 3일 보관.

	Slurry 0일 보관	Slurry 3일 보관
1. 펠렛 만든 후 바로 처리	비교예 1	비교예 9
2. 냉동보관( C.S ) 후 RT 1일 보관	실시예 1	실시예 4
3. RT 1일 보관	비교예 2	비교예 10
4. 냉동보관( C.S ) 후 냉장 1일 보관	실시예 2	실시예 5
5. 냉동보관( C.S ) 후 냉장 3일 보관	실시예 3	실시예 6
6. 냉장 1일 보관	비교예 3	비교예 11
7. 냉장 3일 보관	비교예 4	비교예 12
8. 냉동1 (-30℃) 1일 보관	비교예 5	비교예 13
9. 냉동1 (-30℃) 3일 보관	비교예 6	비교예 14
10. 냉동2 (-70℃) 1일 보관	비교예 7	비교예 15
11. 냉동2 (-70℃) 3일 보관	비교예 8	비교예 16

도 6에 나타난 바와 같이, 슬러리 상태로 0일 보관 후 제조한 펠렛은 냉동 상태에서 보관하는 시간이 지남에 따라 PRN 단백질의 추출량이 증가하였고(실시예 2와 3 비교), 슬러리 상태로 3일 보관 후 제조한 펠렛은 냉동 상태에서 보관하는 시간이 지남에 따라 PRN 단백질의 추출량이 감소하였다(실시예 5와 6 비교). 또한, 냉동을 거친 펠렛은 냉동 보관하지 않은 펠렛에 비해 PRN 단백질의 추출량이 증가하였다(실시예 1과 비교예 2 비교, 실시예 2와 비교예 3 비교, 실시예 3과 비교예 4 비교). 이는 PRN 단백질의 추출량을 증대시키기 위해서는 슬러리 상태로 보관하는 것보다 바로 펠렛으로 만들어 보관하는 것이 효과적임을 의미하며, 냉동 단계가 PRN 단백질의 추출량을 크게 증가시킴을 의미한다.

실험예 1.4. 펠렛의 해동 상태에 따른 PRN 단백질 추출량의 차이 확인

상기 도 6에서 냉동 보관시킨 실험군(실시예 1 및 실시예 4, 실시예 2 및 실시예 5, 실시예 3 및 실시예 6, 비교예 5 및 비교예 13, 비교예 6 및 비교예 14, 비교예 7 및 비교예 15, 및 비교예 8 및 비교예 16) 중 냉동 보관 후 해동 과정을 거친 실험군(실시예 1 및 실시예 4, 실시예 2 및 실시예 5, 및 실시예 3 및 실시예 6)에서 PRN 단백질의 추출량이 현저히 증가하였다. 따라서, 해동 상태에 따라 PRN 단백질의 추출량이 차이가 나는지 확인하기 위해, 추가 실험을 진행하였다. 이때, 펠렛의 해동은 5℃의 냉장 온도에서 48시간 동안 수행되었다. 상기 실험 결과를 표 3 및 도 7에 나타내었다.

조건 번호	PRN Conc (㎍/mL)	보관 세부 조건	우레아 처리 전 펠렛 상태
비교예 15	39.95	슬러리 3일 보관, 펠렛 1일 -70℃ 보관	냉동
비교예 16	34.68	슬러리 3일 보관, 펠렛 3일 -70℃ 보관	냉동
비교예 17	32.31	슬러리 3일 보관, 펠렛 10일 -70℃ 보관	냉동
실시예 7	99.94	슬러리 3일 보관, 펠렛 10일 -70℃ 보관	해동(5℃, 48시간)

상기 표 3 및 도 7에 나타난 바와 같이, 우레아 처리 전 펠렛이 해동 상태일 경우 냉동일 때보다 PRN 단백질의 추출량이 약 3배 증가하였다. 냉동 상태의 펠렛에 우레아를 처리한 3개의 모든 실험군에서 PRN 단백질이 낮게 추출되었다. 이는 우레아 처리 전 펠렛의 해동이 PRN 단백질 추출에 큰 영향을 미침을 의미한다. 이를 통해, PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증대시기기 위해서는 우레아 처리 전 펠렛을 해동하여야 함을 알 수 있었다.

실험예 1.5. 펠렛의 해동 조건에 따른 PRN 단백질 추출량의 차이 확인

펠렛의 해동 방법에 따른 PRN 단백질의 추출량의 차이를 확인하기 위해, 펠렛을 냉동 보관한 후 각각 냉장(2일), 실온(1시간) 및 37℃(15분) 상태에서 보관하여 PRN 단백질의 추출량을 확인하였다. 이를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 해동 시에 높은 온도에서 급격히 해동하는 것보다 냉장에서 천천히 해동하였을 때 PRN 단백질의 추출량이 증가하였다. 또한, 37℃에서 15분 동안 해동하였을 때보다 냉장 보관에서 이틀 동안 해동하였을 때 PRN 단백질의 추출량이 약 2배 증가하였다. 이를 통해, PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증가시키기 위해서는 냉동 이후 펠렛을 냉장에서 천천히 해동시켜야 함을 알 수 있었다.

실험예 2. Scale up 가능성 확인

상기 실험예 1.1 내지 1.5에서 확인한 PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증대시키는 조건이 50 L에서도 적용 가능한지 확인하기 위해, 슬러리를 보관하지 않고 바로 펠렛으로 제조하여 냉동(-30℃)에서 1일 보관한 후 냉장(5℃)에서 이틀 동안 해동시켰다. 이후, 533 g의 펠렛을 회수하여 1,800 mL의 5.0 M의 우레아 버퍼를 처리하고, 마그네틱바를 이용하여 3시간 동안 교반하였다. 교반된 우레아 처리액은 6,300 rpm의 속도로 1.5시간 동안 원심분리하였다. 원심 분리 후, cell debris를 제거하고 1,650 mL의 상청액을 회수하여 필터로 여과하였다. 이후, 실시예 1.5 내지 1.7의 과정을 수행하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

	총 부피(mL)	PRN 농도(㎍/mL)	총 PRN 함량(mg)
PRN	176.3	701.98	123.76

표 4에 나타난 바와 같이, 상기 실험예 1.1 내지 1.5에서 확인한 PRN 단백질의 추출량을 효과적으로 증대시키는 조건이 50 L에서도 적용 가능함을 알 수 있으며, 200 L scale에서 약 300 mg 내지 400 mg의 PRN 단백질을 확보할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

1) 백일해균을 포함하는 시료를 냉동하는 단계;
2) 상기 냉동된 시료를 해동하는 단계;
3) 상기 해동된 시료를 파쇄하는 단계; 및
4) 상기 파쇄된 시료를 정제하는 단계를 포함하는 백일해균 유래 PRN 단백질 수득 방법으로서,
상기 1)의 백일해균을 포함하는 시료는 백일해균 배양액을 원심분리하여 슬러리를 수득하고, 상기 슬러리를 바로 원심분리하거나 1일 내지 3일 동안 5 ℃에서 보관한 후에 원심분리하여 수득한 펠렛이고,
상기 1)의 냉동 온도는 -30 ℃ 이하이고, 냉동 시간은 20시간 내지 10일이며,
상기 2)의 해동은 냉장에서 이루어지며, 냉장 온도는 1℃ 내지 20℃이고, 냉장 시간은 12시간 내지 60시간인, 백일해균 유래 PRN 단백질 수득 방법.

삭제

제1항에 있어서,
상기 1)의 냉동 온도가 -30℃ 내지 -85℃인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제1항에 있어서,
상기 1)의 냉동 시간이 20시간 내지 30시간인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

삭제

제1항에 있어서,
상기 2)의 냉장 온도가 1℃ 내지 10℃인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제1항에 있어서,
상기 2)의 냉장 시간이 36 내지 48시간인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제1항에 있어서,
상기 3)의 파쇄는 우레아 처리, 열처리, 구아니딘 처리, 및 요오드 처리로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제8항에 있어서,
상기 우레아 농도가 3 M 내지 7 M인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제8항에 있어서,
상기 우레아 처리 시간이 150 내지 210분인 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.

제1항에 있어서,
상기 4)의 정제가 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography, IEX), 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC), 및 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography, GFC)를 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, PRN 단백질 수득 방법.