JPH02504396A

JPH02504396A - 新規の抗菌性ペプチド、該ペプチドを含有する組成物及びその使用

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Publication number: JPH02504396A
Application number: JP1506840A
Authority: JP
Inventors: ワイルド，クレイグ・ジー．; グリフイス，ジヨージフ・イー．; マラ，マリアン・エヌ．; スコツト，ランダル・ダブリユ．
Original assignee: インサイト・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1989-05-26
Publication date: 1990-12-13
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: ATE108662T1; WO1989011291A1; EP0378641B1; AU633832B2; EP0378641A1; AU3778289A; DE68916932D1; US5032574A; JP2795286B2; EP0378641A4; DE68916932T2; CA1340379C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】の　　　ベブ　ド　・ペプ　ドを　　　る４　　　び土！Ｕ丸月− １１ユ１１顆粒球は一１菌、真菌及び寄生病原体に対する宿主耐性において重要な役割を果たす。この耐性は少なくとも２つの異なる経路を通して発揮される。酸素依存性経路において、顆粒球は侵入病原体の死滅に関与する毒性酸素代謝物を産生ずる。第２の経路は酸素非依存性であり、強力な抗菌活性を有するタンパク質の産生及び貯蔵から構成される。

これらの顆粒球防御ｍ構の重要性は、好中球減少症患者が場合によっては致死性である長期感染を異常に受は易いという事実の知見により示唆される。多数の抗菌性タンパク質及びペプチドが顆粒球中でその存在が実証されており、具体的には例えば好酸球主要塩基性タンパク質、好酸球カチオン性タンパク質、細菌透過性増加因子、並びにヒト（Ｍ。

Ｅ、　５ｅｌｓｔｅｄ他、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：　１４３６　（１９８５））、ウサギ（Ｈ，Ｅ、　５ｅｌｓｔｅｄ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０：　４５７９　（１９８５））＜１９８７））から単離されたデフエンジン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）と呼称る。

公知のヒト、ウサギ及びモルモットデフエンジンについて報告された配列を第４図に示す。更に、１９８５年９月２４日付けで発行されたＲｅｇｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏ−ｒｎｉｔ＠義の米国特許第４５４３２５２号明細書は、抗菌活性を有する約３５個までのアミノ酸のカチオン性オリゴペプチドを開示している０種々のデフエンジン配列を比較すると、６個のシスティンはヒト、ウサギ及びモルモット間で完全に保持されていることが明らかである。これらの残基は二次構造の維持に関与し得ると考えられる。更に、５つの他の残基（２個のａｒ＠、２個のｇｌｙ、　ｇｌｕ）はヒト及びウサギの全てのデフエンジンで保持され、そのうち３個はモルモットデフエンジンでも保持されている。

ヒトデフェンシン閲ではＮ末端にただ１つの相異があれば、抗菌能及び選択性に顕著な変化を生じさせるのに十分である（Ｒ，１，Ｌｅｈｒｅｒ他、Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、　４２：　１０　（１９８３））、更に、ウサギデフエンジン間では相異が大きいと、抗菌活性（Ｍ、Ｅ、　５ｅｌｓｔｅｄ他、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４５：　１５０　（１９８４））、抗カンジダ活性（Ｍ、Ｅ、　５ｅｌｓｔｅｄ他、Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、　４９：　２０２（１９８５））及び！瘍細胞崩解活性（＾、　Ｌｉｅｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、旧ｏｏｄ６８：　１４０７　（１９８６））が著しく変化する。従って、配列の保持はある種の二次構造が活性に必要であり得ることを意味するが、当然のことながら、これらの構造は活性には十分でなく、ペプチドの力価及び特異性はほとんど非保持領域中の配列によってのみ決定される。

列は３４個の位置のうちの１６個がヒト又はウサギデフエンジンと異なり、従って、活性が著しく異なることが予想される。更に、３３個の位置のうちの２２個は従来文献に記載されているヒトデフェンシンと異なる。ヒト以外のデフエンジンは望ましくない免疫応答を誘発することが予想されるので、ヒトデフェンシンは治療上より重要であると考えられる。

！ｎ　ｖｉｔｒｏ試験の結果、本発明の精製ポリペプチドは、大腸菌、５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに対する抗菌アッセイにおいて、従来文献に記載されているデフエンジンの混合物よりも著しく活性であることが判明した。

最後に、１９８７年１１月２５日付は米国特許出願第１２５６８４号明細書（出願人Ｊｏｅｌｌｅ　Ｅ、　Ｇａｂａｙ及びＣａｒｌ　Ｆ、　Ｎａｔｈａｎ、譲受人Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｃｌａｔｉｏｎ及びｔｈｅ　ＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒＬｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、ヒト血液抽出物の逆相高速液体クロマトグラフィーにより得られる一連のビークを開示している。

具体的には、米国特許出願第１２５６８４号明細書の第１３区のビーク２は、本発明のポリペプチドの存在を開示している。

しかしながら、米国特許出願第１２５６８４号明細書で示されたデータは本願出願人のデータであり、本願は米国特許出願第１２５６８４号の専用実施権者に譲渡されることを理解することが重要である。更に、米国特許出願第１２５６８４号明細書は、本発明のポリペプチドを含む第１３図のビーク２が抗菌又は抗真菌活性を有することを開示しておらず、また、第１３図のビーク２のポリペプチドのアミノ酸配列又は他のいかなる特徴付けについても開示していない点に留意することが重要である。

１１へ１江本発明は約３７００ダルトンの分子量及び第１図に示すＮ末端アミノ酸配列を有する抗菌剤（ａｎｔｉｅｎｉｃｒｏｂｉａｌ　ａ８ｅｎｔ）として有用な精製ポリペプチド、又は該ポリペプチドの生物学的に活性な部分を提供するものである。ポリペプチドはダラム陰性菌及びダラム陽性菌並びに真菌に対する抗菌活性を有する。

本発明は更に、実質的に純粋なヒト顆粒球から得られる顆粒からポリペプチドを精製する段階を含む、精製ポリペプチドの製造方法も提供する。

本発明は更に、細菌を死滅又は真菌を死滅させるために有効な量の精製ポリペプチドと、医薬上許容可能なキャリヤーとを含有する医薬組成物、及び細菌又は真菌感染患者を治療するための該組成物の使用方法も提供する。

本発明は更に、医薬上許容可能なリポソーム中に導入された精製ポリペプチドを含有する医薬組成物、及び細菌又は真菌感染患者を治療するための該組成物の使用方法も提供する。

（ｒ）ｆ＝Ｌｌ単離した顆粒の酸性抽出物からの低分子量枦液を、「方法」の項に記載するように逆相クロマトグラフィーに掛けた。ビーク１及びビーク２の位置を示す。

第２区−−・ビーク１の　　゛　　果顆粒球ビーク１（第１図）の自動配列分析により残基１〜２８で同定されたアミノ酸。

第３図−ドビー　２の　　Ｓ顆粒球ビーク２（第１図）の自動配列分析により残基１〜３３で同定されたアミノ酸。

第４図−１・ビーク２とヒト　びウ　　−フェンシン些【肌１１顆粒球ピーク２に関して決定されたＮ末端配列と、ヒト、ウサギ、及びモルモットデフエンジンについて報告されている配列との比較。

第５図−１こビー　２　ヒト−フェンシン　の　ミノ」良ΔＬ１顆粒球ビーク２及びヒトデフェンシン混合物のアミノ酸組成をモル％で表わす、各アミノ酸について相似指数＝Σ（モル％の差）２を示す、１００を越える相似指数は通常、無関係のタンパク質を表わす（Ｊ、Ｊ、　Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ他、Ｃａｍｐ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３８：　６０９　（１９７１））。

第６図−１・ビー　Ｉ　　Ｉ　・ビー　２の　　Ｓ　の「方法」の項に記載するように、顆粒球ビーク１及び顆粒球ピーク２の抗菌活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏでアッセイした。５０％又は９０％死滅させるのに必要なペプチドの量を比較した。

第７図顆粒球ビーク１及び顆粒球ビーク２の抗菌活性に及ぼす界面活性剤の効果を示す。

１１へ１１１Ｌｉ本発明は約３７００の分子量及びＮ末端アミノ酸配列ｖａｌ−Ｃｙｓ−ｓｅｒ− ｃｙｓ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｖａ　トｐｈｅ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｔｈｒ− ｇ　ｌ　ｕ　−１ｅｕ−ａｒＢ−ｖａ　１−ｇ　１ｙ−ａｓｎ−ｃｙｓ−１ｅｕ −ｉ　ｌｕ−ｇｌｙ−ｇ　ｌｙ−ｖａ　ｌ　−５ｅｒ−ｐｂｅ−ｔｈｒ−ｔｙｒ −ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ａｒｇ−ｖａｌを有するポリペプチドを含有する抗菌剤として有用な精製ポリペプチドを提供するものである。

本発明は更に、このポリペプチドから誘導される生物学的に活性なフラグメントも提供するが、このようなフラグメントは当業者に容易に理解されるように、慣用方法を使用してポリペプチドのフラグメントを作製することにより決定され得る。

本発明は更に、本発明のポリペプチド及び該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするＤＮＮＡ分子並びにこのようなりＮＡ分子を含む発現ベクターにも係る。

このようなりＮＡ分子は、自動ＤＮＡシンセサイザー及び遺伝子コードの周知のコドン−アミノ酸関係を使用して容易に製造され得る。あるいは、このようなりＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドプローブ及び慣用手法を使用してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮ＾として得られる。

このようなりＮＡ分子を、細菌（例えば大腸菌）、酵母細胞もしくは哺乳動物ａｍのような適当な宿主内でＤＮＡを発現してポリペプチドを産生ずるのに適する、プラスミドのような慣用の発現ベクター又は特定的に作製した発現ベクターに組み込むことができる。

本発明は更に、約３フＯＯの分子量及び上記Ｎ＄端アミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを産生するための宿主ベクター系も提供し、このベクター系は、適当な宿主中にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドから成る。

本発明は更に、約３７００の分子量及びＮ末端アミノ酸配列ｖａ　ｌ　−ｃｙｓ −ｓｅｒ−ｃｙｓ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｖａ　ｌ　−ｐｈｅ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｔｈｒ−ｇ　ｌｕ−１ｅｕ−ａｒｇ−ｖａｉｌＢ　１ｙ−ａｓｎ−ｃｙｓ −１ｅｕ−ｉ　１ｕ−（ｌｙ−ｇ　ｌｙ−ｖｔｌ−ｓｅｒ−ｐｈｅ−ｔｈｒ−ｔｙｒ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｔｈｒ−ａｒｇ−ｖａｌを有するポリペプチド、又は該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントの製造方法も提供する。この方法は、ポリペプチドを産生できる適当な条件下でポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクター！から成る宿主ベクター系を増殖するａｊｉと、産生されたポリペプチドを宿主から取り出す段階とを含む。

本発明の精製ポリペプチドの別の製造方法も提供される。

この方法は、ａ）ヒト血球を処理し゛て個々に顆粒球を得る段階と、　ｂ）得られた顆粒球を処理して顆粒を取り出す段階と、−ｃ）こうして取り出した顆粒を約４以下のｐｌ’ｌの抽出剤で処理し、顆粒から個々に可溶性タンパク質を得る段階と、　ｄ）こうして分離された可溶性タンパク質を取り出す段階と、ｅ）こうして取り出した可溶性タンパク質を処理し、精製ポリペプチドを得る段階とを含む。

本発明の所定の実施態様によると、可溶性タンパク質の処理は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又は逆相高速液体クロマトグラフィーを含む、もっとも、当業者には理解されることであるが、可溶性タンパク質を処理し、ポリペプチドを精製することは、いずれも本発明により予想される当業者に公知の多くの方法により実現することができる。更に、本発明の１実施態様によると、顆粒を取り出すための顆粒球の処理は密度勾配遠心法を含む。

本発明は更に、細菌又は真菌を死滅させるために有効な量の精製ポリペプチドと、適当なキャリヤーとを含有する組成物も提供する。このような組成物は、当該技術分野で周知のキャリヤーを使用して例えば家庭用又は実験室用殺菌剤に配合し、細菌又は真菌を駆除するために多くの方法で使用され得る。

本発明は更に、ヒト細菌又は真菌感染を治療するために有効な量の本発明の精製ポリペプチドと、医薬上許容可能なキャリヤーとを含有する、ヒト細菌又は真菌感染の治療用医薬組成物も提供する。

本発明の組成物は、多様な微生物、例えば真菌、ＳＳ菌（グラム陰性菌及びグラム陰性菌の両方）、原生動物及びウィルスのような微生物に対する活性を有することを理解すべきである。

異なる組成物は興なる生物に対して異なる活性度を有する１本発明のペプチドは、タンパク質を細菌分解から保護するための防腐剤として作用するために、他のタンパク質と組み合わせることもできる。あるいは、本発明のポリペプチド又は組成物を多様な配合物（例えばコンタクトレンズ溶液、軟膏、シャンプー、薬剤、食品等）中で防腐剤及び殺菌剤として使用することもできる０組成物中で使用されるポリペプチドの量は、他の成分の種よ、必要な保護の程度及び組成物の使用目的に依存して選択され得る。

ポリペプチドを抗菌剤として使用する場合、種々の塩及びｔｉＷＩ液を含むＭ微水性溶媒中で調製することができる。

塩は大概においてアルカリ及びアルカリ出頭のハロゲン化物、リン酸塩及び硫酸塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム又は硫酸ナトリウム）である。クエン酸塩、リン酸塩、ＢＥＰＥＳ、　Ｔｒｉｓ等のような種々の緩衝液を、このような緩衝液が治療される宿主に医薬上許容可能な程度まで使用することができる。

後で溶液として使用するように化合物を凍結乾燥粉末として処方する場合には、種々の賦形剤又は他の添加剤を使用することができる９賦形剤は種々のポリオール、不活性粉末又は他の増量剤を含み得る。

調剤及び宿主の種類に依存して、本発明の化合物は種々の方法で投与され得る。

調剤は局所投与、注射（例えば静脈内、腹腔内等）、鼻咽頭投与等により投与され得る。

本発明は更に、細菌又は真菌を有効量の上記組成物と接触させる段階を含む、細菌又は真菌を死滅させるための方法も提供する。有効量は当業者により容易に決定され得る。

本発明は更に、有効量の上記医薬組成物を患者に投与する段階を含む、細菌又は真菌Ｓ染患者の治堡方法も提供する。

本発明の別の態様によると、細菌又は真菌を死滅させるために有効な量の本発明の精製ポリペプチドと、適当なキャリヤーとを含有する組成物、及びヒト細菌又は真菌感染を治療するために有効な量の本発明の精製ポリペプチドと、医薬上許容可能なキャリヤーとを含有するヒト細菌又は真菌感染の治療用医薬組成物は、更に界面活性剤を含有し得る。このような組成物に界面活性剤を加えることは、本発明の新規ポリペプチドの抗菌性又は抗真菌性を増進させるために有用である。適当なものであればどのような界面活性剤も使用することができるが、現在好適な界面活性剤はＴｗｅｅｎ２０又は１％ＮＰ４０のような非イオン界面活性剤である。

本発明は更に、医薬上許容可能なリポソーム中に導入された、ヒト細菌又は真菌感染を治療するために有効な量の本発明の精製ポリペプチドを含有するヒト細菌又は真菌感染の治療用医薬組成物も提供する。

当業者には容易に理解されることであるが、本発明のポボソームであればどのようなものも使用することができる。

このようなリポソーム組成物は、上記に詳述したような本発明の他の組成物の活性に類似する、種々の微生物に対する活性を有する。更に、これらの組成物は、同じく上記に詳述したような種々の従来周知の方法で投与され得る。

以下の実験の詳細な説明の項は本発明の理解を助けるためのものであって、如何なる点においても文末の請求の範囲に記載した本発明を制限する意区はなく、また、そのように解釈されるべきでない。

の・４ｆ・Ｌ直毘Ｕ亙− 地方血液銀行（ｌｏｃａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｂａｎｋ）からパフィコートを入手し、ハンクスの平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）に希釈し、３０ｚ１の希釈ｍ胞をＥＩＢＳＳ中の６４％パーコール２０１１と共に遠心（２０００ｒｐｍ、２０分間）して顆粒球を単核細胞から分離した。単核細胞を上清と共に吸引し、顆粒球を含むペレットから低張溶解によって混在している赤血球を除去した。顆粒球を遠心（１０００ｒｐｍ、１０分間）によって集め、ｐＨ７，ｏのＰＢＳに再懸濁させた。

、粗球の細　下　画（ｓｕｂｅｅｌ！ａｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎリン！［［塩水溶液中の単離顆粒球（２Ｘ１０’細胞／凝りを５−のジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）で４℃で１５分間処理した。　ＤＦＰ処理した細胞を１３０Ｘｙで４℃で１０分間遠心し、得られたベレットを、１００ｍＭのＫＣｌと３１１ＩＮのＮａＣｌと１イ台の＾ＴＰ（Ｎｉ２）２と３．５１ＭのＨｇＣＲ２と１０ｍＭのＰｉｐｅｓ、ｐＨ７，３とを含む氷冷した緩衝液（Ｍ和ｗＬ＠液（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ））に再懸濁させた。細胞浮遊液をボンベ（ｆ’ａｒｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｍｏ１ｉｎｅ、　１１１ｉｎｏｉｓ）の内圧３５０ｐｓｉで４℃で２０分間窒素キャビテーション（ｎｉｇｒｏｇｅｎ　ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）によって破壊し、得られたキャビテート（ｃａｖｉｔａｔｅ）を最終濃度１．５ｍＭの二価カチオンキレート化剤ＥＧＴ＾、ｐＨ７，４中に採気した。核及び非破壊細胞を４℃ で５００Ｘｙで１０分間遠心してペレット化した（ｐｉ）、核分Ｗ！後（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ）の上清（Ｓｌ）を、交歓に記載されたアズール好性顆粒の単離方法（Ｎ、　Ｊ、　Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ、　Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、亀７：５２（１９８３））に従い、不連続パーコール密度勾配で２０．ＯＯＯｒｐｍ（ＳＳ　３４０−ター）で１５分間遠心した。４℃で約１ｉｆの両分を採取した。　Ｓｌ　４１０−ター中で３５．ＯＯＯｒｐｍ（１８０，０ＯＯＸ　ｇ）で２時間遠心してアズール好性顆粒画分のプールからパーコールを除去した。密に詰まったバーコールの上方に沈降した層を緩和緩衝液に再懸濁させ、アリコートとして一７０℃で保存した。

罠１」１雌禿ｍアズール好性顆粒に対応するパーコール勾配からの画分をプールし、上記のごとく遠心してパーコールを除去した。

顆粒調製物を緩和緩衝液に再懸濁させ、−７０℃で保存した。

０．０５Ｍのグリシン−１１Ｃｆ緩衝液（ｐＨ２，０）に入れ、２５℃で４０分間激しく攪拌して単離顆粒を抽出した。酸抽出物を３０，０ＯＯＸ１で２０分間遠心して可溶性画分を得た。このように得られた可溶性画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０ユニツト（＾−１ｃｏｎ）内で遠心によって濃縮した。Ｐ液をクロマトグラフィー精製の出発物質として使用しな。

１１乙Ｌ１Ｌ常用の試験方法を用い、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｅ’ｏｌｉ　Ｋ１２（ＭＣ４１００）、ストレプトコッカス・フェカリス１肋ゴ」１旦見免（コじ工ｆｉｅｃａ１ｉｓ（＾ＴＣＣ寄託番号２９２１２）及びカンジダ・アルビカンスＣａｎｄｉｄｉ　ａｌｂｉｃａｎｓ（臨床単離物）に対する抗菌活性を試験した。

寒天平板上の単一コロニーからの微生物を液体培地に接種し３７℃で１晩培養した。１晩培養物のアリコートを新しい栄養源ブロスに接種し、対数増殖期となるまで増殖させた０次に培￥Ｉ物を試験培地で適当な濃度まで希釈した。

抗菌活性を試験すべき逆相液体クロマトグラフィーからのサンプルを、Ｔｍｍｕｌｏｎ　Ｉマイクロタイタープレート中で５０Ｉ１１の０．１％ＢＳ＾の存在下に真空遠心によって乾燥した。乾燥サンプルを０．１％の酢酸に再懸濁させ、真空遠心によって再度乾固させた０次にサンプルをアッセイバッファに再懸濁させ適当な種々の濃度に希釈してがち、試験微生物をウェルに添加して３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。

特に指示がない限り、全微生物の抗菌試験は２０＋ｅｌ！のリン酸塩（ｐｉｌｅ）と０．２５Ｍノグルコースと０．０２％（７）Ｔｗｅｅｎ２０とを用いて行なった。対照アッセイ中の微生物２００〜３００に対応する量のアッセイ混合物をトリフティカーゼ（ｔｒｙｐｔ　１ｅａｓｅ）大豆寒天平板（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及び５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）またはサブロー・グルコース寒天平板（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）上に拡散させた。３７℃で１晩インキユベーシヨン後、手動または自動計数によってコロニー形成単位を測定した。

１　　ロマ　　−フ　−に　　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　　　（７）Ｌｌ！ｊｌｉＣｅｎｔｒｉｅｏｎ　ＩＯＦ液にトリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）を０．１％まで添加し、サンプルをＶｙｄａｃ　ｗｉｄｅ　ｐｏｒｅ　Ｃ４（２５０％４ｗｎ）の逆相カラムに入れ、以下の勾配で処理した。溶媒Ａは０．１％ＴＦ＾水溶液であり、溶媒ＢはＢＰＬＣグレードのアセトニトリル中の０．１％ＴＦ＾であった。

以下の勾配を使用した。

０〜２分　　　０％２〜７分　　　０〜１５％７〜６７分　　　　　１５〜５０％６７〜７２分　　５０〜１００％７２〜７５分　　１００％Ｖｙｄｉｃ　ｗｉｄｅ　ｐｏｒｅ　Ｃ４（２５０ｘ　４ｍｍ）逆相カラムと２つの１１０Ｂポンプと４２１＾コントローラーと２１０＾インジエクターと２ｗｌのサンプルループと１６３可変波長検出器と２１１２ＲｅｄｉｒａｅフラクシヨンコレクターとＫｉｐｐ　＆　Ｚｏｎｅｎ　ＢＤ　４１チヤートレコーダーとから成るＢｅｃｋ−ａＤＨＰＬＣ装置を使用した。検出器の設定値を２１４ｎ論とし、吸光度単位のフルスクール（＾υＦＳ）を〇〜２．０＾υＦＳとして、ピーク画分を手作業で採取した。

ピー　１　びピー　２のペラ　ドの逆相ＨＰＬＣで精製したピーク１及びピーク２を５ｐｅｅｄ　Ｖａｃで５ｏｐｌに濃縮し、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａパルス液相アミノ酸配列分析装置に導入した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｍｅｓ　Ｍｏｄｅ１１２０＾ＰＴＥ　Ａｎａｌｙｚｅｒを使用しフェニルチオチヒダントイン（ＰＴＩＩ）分析をオンラインで実施した。

ピー　１　びピー　２の　ミノＢｅｃｋｍａｎ　ＨＰＬＣ装置を備えたＷａｔｅｒｓ　ＰｉｃｏｔａＢシステムを使用し、６．ＯＮのＲＣＩで１５０℃で１時間加水分解することによってポリペプチドのＰＴＣアミノ酸分析が得られた。

直ｌ「方法」の項に記載のごとく、パフィコートから顆粒球を単離し、パーコールで精製した顆粒画分からタンパク質を抽出した。このタンパク質抽出物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０ユニツト（＾−１ｃｏｎ）内で限外−過によって濃縮すると、得られたｒ液は、抽出物中の低分子量タンパク質／ペプチド部分を含んでいた。

「方法」の項に記載のごとく、この炉液をＶｙ＋ｄａｅ　Ｃ４カラムで高速逆相液体クロマトグラフィーによって分析した。これらの条件下に２１４ｎｍの吸光度で２つの主要なピークが検出された（第１図）。

「方法」の項に記載のごとくアミノ酸配列分析を行なうと、最初の溶出ピーク（ピーク１）は３つの既知のヒトデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）の混合物であることが判明した（第２図）。

配列決定の際のＮ末端の収量から推定すると、混合物の約７％がＨＮＰ３であり、残りはほぼ等しい割合のＨＮＰＩ　（４４％）及びＢＮＰ２　（４９％）から成る。配列分析によれば、後の溶比ビーク（ビーク２）が第３図に示す単一配列２含むことが判明した。

ＮｅｅｄｌｅｍａｎＪｌｕｎｓｅｈ法を使用し相同性に基づ＜　５ｗ１ｓｓ　Ｐｒｏデータベース（Ｉｎｔｅｌｌｉ６ｅｎｅｔｉｅｓ）のコンピュータ調査によれば、ビーク２とヒトデフェンシンのシスティン主鎖との類似性が確認された（Ｓ、　Ｂ、　ＮｅｅｃｌｌｅＩＩｌａｎ　＆　Ｄ、　Ｄ、　Ｗｕｎｃｓｈ、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３（１９７０））、このシスティン主鎖の外部の配列は、発表されているデフエンジン配列とは極端に異なっている。コンピュータ調査では他のいかなる既知のタンパク質に対しても有意な相同性を確認することはできなかった。ビーク１及びビーク２のアミノ酸組成の比戦く第５図）は、ビーク２とビーク１との間の主要な違いを証明する。

Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ、５ｔｒｅ　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｅａｌｉｓ及びＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓに対する逆相ビークのアリコートのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗菌活性を「方法」の項に記載のごとく試験した。サンプル中のタンパク質濃度をアミノ酸組成分析によって決定した。

結果（第６区）は、ビーク２のペプチドがデフエンジン（ビーク１）よりもはるかに大きい抗菌活性と有することをはっきりと示す。ダラム陽性菌５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓに対してはビーク２が高い特異的活性を有することが特に明らｔ）であり、表示した殺菌レベルを達成するために必要な濃度はビーク１の約１７１００である。ビーク２のペプチドの活性が上回っていることはダラム陰性菌Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ日（１５〜３０倍）及び真菌Ｃａｎｄｉｄａ　ａ！ｂｉｃｓｖｓ（約５倍）の場合にも観察される。ビーク２とデフエンジンとの配列の違いが抗菌力価及び抗真菌力価の違いの主因であることは明らかである。

更に、ビーク１及びビーク２の活性に対する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０及びＮＰ４０の効果を試験した（第７区）。これらの界面活性剤は細菌に対する両方のビークの活性を増進し、また程度は低いがＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに対する活性も増進した。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．分子量約３，７００を有し及びＮ末端アミノ酸配列【配列があります】を有する抗菌剤として有用な精製ポリペプチドまたは該ポリペプチドから誘導された生物学的に活性なフラグメント。
２．請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
３．請求項２に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
４．請求項３に記載のプラスミド。
５．分子量約３，７００を有し及びＮ末端アミノ酸配列【配列があります】を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントを産生するための宿主ベクター系であって、請求項４に記載のプラスミドを適当な宿主中に含むことを特徴とする宿主ベクター系。
６．分子量約３，７００を有し及びＮ末端アミノ酸配列【配列があります】を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントの産生方法であって、ポリペプチドを産生し得る適当な条件下に請求項５に記載の宿主ベクター系を増殖させ、得られたポリペプチドを取り出す段階を含むことを特徴とする方法。
７．分子量的３，７００ダルトンを有し及びＮ末端アミノ酸配列【配列があります】を有する精製ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）ヒト血球を処理して顆粒球を得、（ｂ）得られた顆粒球を処理して顆粒を取り出し、（ｃ）前記のごとく取り出された顆粒をｐＨ約４以下の抽出剤で処理して顆粒から可溶性タンパク質を分離し、（ｄ）前記のごとく分離された可溶性タンパク質を取り出し、（ｅ）前記のごとく取り出された可溶性タンパク質を処理して精製ポリペプチドを得ることを特徴とする方法。
８．可溶性タンパク質の処理がサイズ排除クロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
９．可溶性タンパク質の処理がイオン交換クロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
１０．顆粒を取り出すための顆粒球の処理が密度勾配遠心法を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
１１．可溶性タンパク質の処理が逆相高速液体クロマトグラフィーを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
１２．殺菌または殺真菌に有効な量の請求項１に記載の精製ポリペプチドと適当な担体とを含むことを特徴とする組成物。
１３．ヒトの細菌感染または真菌感染の治療に有効な量の請求項１に記載の精製ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含むことを特徴とするヒトの細菌感染または真菌感染の治療用医薬組成物。
１４．有効量の請求項１２に記載の組成物を細菌または真菌に接触させることを特徴とする殺菌または殺真菌方法。
１５．有効量の請求項１３に記載の医薬組成物を患者に投与することを特徴とする細菌または真菌感染患者の治療方法。
１６．更に、界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載の組成物。
１７．界面活性剤が非イオン性であることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
１８．ヒトの細菌感染または真菌感染の治療に有効な量の請求項１に記載の精製ポリペプチドと医薬上許容されるリボソームとを含むことを特徴とするヒトの細菌感染または真菌感染治療用の医薬組成物。