JPH08508165A - ウシ好中球由来の新規な抗微生物性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウシ好中球から単離され、ここでβ−デフェンシンと命名された新しい一群のシステインに富むペプチドを提供する。精製した血液好中球の顆粒に富む細胞質画分から、１３の構造的に相同性のペプチドを均質に精製した。これらの抗微生物性化合物は、ヒトおよび獣医医療において、また農業、食品科学および工業的用途における薬剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ウシ好中球由来の新規な抗微生物性ペプチド この発明は、国立衛生研究所により与えられた登録番号ＡＩ−２２９３１号の 下で政府支援によりなされたものである。政府は、この発明において所定の権利 を有する。 この出願全体に渡って、技術の状態をより十分に開示するために、括弧内にて 種々の刊行物に言及する。これらの参考文献の開示を、援用して本文の一部とす る。 発明の背景 この発明は、一般に抗微生物性ペプチドに関し、更に詳しくは、β−デフェン シン（β−defensin）ペプチドおよびその使用に関する。 多形核白血球（好中球、ＰＭＮ）の細胞質顆粒は、これらの細胞に備えられて 、取込んだ微生物標的を不活性化する多数の抗微生物性ポリペプチドを含んでい る。これらの顆粒蛋白質は抗微生物性の「武器庫」を構成しており、これにはフ ァゴリソゾームの融合の際にファゴソーム中に放出される、広いスペクトルの抗 生物質作用を有する一群のペプチドであるデフェンシン（defensins）が含まれ ている。 ウシ好中球の大きな顆粒は、デフェンシンとは構造的に別個である有効な抗微 生物性のペプチドを含むことは既に示されている。これらには、バクテネシン（ bactenecins）と命名された３つのアルギニンに富むペプチドが含まれ、これら は試験官内で幾つかのグラム陽性およびグラム陰性細菌を効率的に殺傷する。最 近、ウシ好中球からの新規なトリデカペプチドアミドの単離および特徴解析が報 告された。インドリシジン（indolicidin）と命名されたこの陽イオン性ペプチ ドは、通常よりもトリプトファンに富み、E．coliおよびS．aureusに対して有効 な殺細菌活性を有することが示されている。 特にカビ性およびウイルス性の病原体に対する新しい治療法を開発する能力の 重要性は自明である。両種類の新しい薬剤の発見は、既存の薬剤が極めて毒性が 高く数も非常に少ないため、緊急の優先課題である。 ウシ好中球におけるデフェンシンの存在および生物学的役割の検討中に、新し い抗微生物性ペプチドを発見した。デフェンシンの幾つかの特徴、すなわちそれ と類似するサイズ、陽イオン性、および３つの分子内ジスルフィドの存在がある にも拘らず、このウシペプチドは、デフェンシンとは構造の点で有意に相異する ため、新しい種類の宿主防御ペプチドを代表するものである。これらを古典的な デフェンシンと区別するために、この新規な一群のペプチドをβ−デフェンシン と命名する。 発明の要旨 本発明は、抗微生物剤として有用なポリペプチドを提供するものである。ウシ 好中球の顆粒に富む亜細胞画分から１３のペプチドを精製し、特徴を調べた。こ れらの分子は、可及的に低い０．５μｇ／ｍｌの濃度で、広いスペクトルの抗微 生物活性を有する。ペプチドの共通の特徴には、その陽イオン性および複数のシ ステイン残基の存在が含まれる。これらのペプチドは、ヒトまたは獣医医療にお ける抗微生物性化合物として、または農業、食品科学または工業的用途における 薬剤として有用である。 図面の簡単な説明 図１：ウシ好中球顆粒抽出物のゲルろ過クロマトグラフィ。「材料と方法」に 記載するように、１．３×１０¹⁰の好中球からの顆粒濃縮画分の酢酸抽出物を、 バイオゲル（Bio-Gel）P-60カラム上でクロマトグラフィに供した。ピークＥに 対応する画分を凍結乾燥し、図２に示すように更に精製した。 図２：ピークＥ画分の逆相ＨＰＬＣ。ピークＥ（図１）由来のプールした画分 の１０分の１を、０．１％ＴＦＡ／水（溶剤Ａ）で平衡化した１×２５ｃｍのバ イダック（Vydac）C-18カラムに、３．０ｍｌ／分の流速で装填した。０．１％ ＴＦＡを含有するアセトニトリル（２０％〜４５％）（溶剤Ｂ）の直線勾配を、 毎分０．３３％の割合で泳動した。ファルマシア（Pharmacia）Frac-200フラク ションコレクターのピークカットモードを使用し、画分を集めた。それぞれのピ ークに溶出する１または複数のβ−デフェンシンの同定は、表１および図５での 命名に対応する番号１〜１３によって示す。 図３：精製したβ−デフェンシンの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ。１．０ｍｌ／分の 流速で操作する０．４×２５ｃｍのVydac C-18カラムに対して、０．５〜１μｇ のそれぞれの精製したペプチドを注入した。溶剤は図２と同じである。勾配条件 ：２５分で１０％Ｂ〜５０％Ｂ。 図４：精製したβ−デフェンシンの酸−尿素ゲル。それぞれのペプチドの２μ ｇのサンプルを１２．５％酸−尿素ポリアクリルアミドゲルに装填し、これを２ ５０Ｖで４時間電気泳動した。ウシ好中球顆粒（Ext.、抽出物）由来の粗酸抽出 物１００μｇのサンプルを平行して流した。１５％ホルマリン含有クーマシーブ ルーを用いて染色した。 図５：ウシ好中球β−デフェンシンのアミノ酸配列。ＢＮＢＤ１〜１３の一次 構造を一文字コードで示す（配列番号：１〜１３）。配列を整列させ、最も保存 されたアミノ酸を枠で囲って示す。残基の番号付けは、最も長いβ−デフェンシ ンペプチドを指標とする。 図６：ウシ気管抗微生物性ペプチド（ＴＡＰ）（配列番号：１５）およびβ− デフェンシン共通部（配列番号：１４）のアミノ酸配列。β−デフェンシン共通 部は、２７残基位置よりなり、ここではアミノ酸が完全に保存されているか（１ １残基）、または保存性もしくは限定された置換が生じている（１６残基）。ｈ ：疎水性（＝Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅ）、Ｓ／Ｔ：ＳｅｒまたはＴ ｈｒ、Ｐ／Ｒ：ＰｒｏまたはＡｒｇ。ＢＮＢＤ−１２（参照３１）で決定したジ スルフィド結合も示す。 図７：精製したβ−デフェンシンの抗細菌活性。E．coli ML35（●）またはS ．aureus 501A（○）を接種した栄養寒天プレートを使用し、ウサギデフェンシ ンＮＰ−１、バクテネシンドデカペプチド、およびインドリシジンに加えて、１ ３の好中球β−デフェンシンの抗細菌活性を評価した。活性は、示した濃度で５ μｌのペプチドを適用した結果生じた透明部分（clearing）（ｍｍ）の直径とし て示す。 図８：ＢＮＢＤ−１２におけるジスルフィド結合パターンの決定戦略。無処理 のＢＮＢＤ−１２（配列番号：１６）を、「材料と方法」に記載するようにトリ プシンによる消化に供した。断片（一括した命名法により特定）（配列番号：１ ７〜２０）を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（図９〜１１）、特徴を調べた。Ｔ −２の代替的な構造は一本線の枠に入れたものである。二本線の枠を付した断片 は、無処理のＢＮＢＤ−１２に存在するジスルフィドを含む（図の下方）。 図９：無処理のＢＮＢＤ−１２のトリプシン消化物のＲＰ−ＨＰＬＣ。約７． ５ｎｍｏｌのトリプシン消化ＢＮＢＤ−１２を、Vydac C-18カラム上での勾配溶 出により精製した。流速は毎分０．１ｍｌとし、溶剤Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液 とし、溶剤Ｂは０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液とした。勾配条件：０〜４０ ％（８０分）。主要なトリプシン消化断片は、Ｔ−１、Ｔ−２、およびＴ−３と 標識した。８０分で溶出するピークは、消化されていないＢＮＢＤ−１２である と決定された。Ｔ−３′と標識したピークは、アミノ酸分析によって特徴付けし 、ｄｅｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＬｙｓのＴ−３断片であると決定された。 図１０：トリプシン消化ペプチドＴ−３の過ギ酸酸化の生成物のＲＰ−ＨＰＬ Ｃによる精製。６ｎｍｏｌのＴ−３を過ギ酸により処理し、反応生成物をVydac C-18カラム上で精製した。溶剤および流速は図９に示す通りとした。勾配条件： ０〜４０％Ｂ（６０分）。 図１１：トリプシン消化ペプチドＴ−２のエドマン分解の生成物のＲＰ−ＨＰ ＬＣ。単一工程のエドマン分解の後、水相の生成物をVydac C-18カラム上で分離 した。溶剤および流速は図９に示す通りとした。勾配条件：０〜２５％Ｂ（６０ 分）、２５％〜５０％Ｂ（１０分）。 図１２：β−デフェンシンおよびデフェンシンの共有結合構造の比較。デフェ ンシン（配列番号：２２）およびβ−デフェンシン（配列番号：２１）の共通配 列を一文字アミノ酸コードで示す。Ｔ／ＳおよびＰ／Ｒは、２つのみの代替的な 残基が現れるβ−デフェンシンの共通配列中の位置を示す。システイン連結部分 は実線として示す。Ａは、カルボキシル末端のＣｙｓ−Ｃｙｓジペプチドを指標 とした整列。Ｂは、β−デフェンシン共通配列のカルボキシル末端付近に３残基 のギャップ、およびデフェンシン共通配列のアミノ末端付近に５残基のギャッ プを挿入することにより生成した最大化した整列。 図１３は、S．aureasに対するＢＮＢＤ３、４、１１および１３の殺細菌活性 を示す。 図１４は、E．coliに対するＢＮＢＤ３、４、１１および１３の殺細菌活性を 示す。 図１５は、Candida albicansに対するＢＮＢＤ３、４、１１および１３の殺カ ビ活性を示す。 図１６は、Cryptococcus neoformansに対するＢＮＢＤ３、４、１１および１ ３の殺カビ活性を示す。 図１７〜３１は、β−デフェンシンの抗カビ活性を示す。 発明の詳細な説明 この発明は、β−デフェンシンと命名した小さいペプチド分子を提供するもの である。これは広い範囲の抗微生物活性を示し、この理由により有用な抗微生物 剤である。 ここで使用するように、「β−デフェンシン」という用語は、一般に約３８〜 ４２のアミノ酸を有し、＋４〜＋１０の実行電荷（net charge）を有する鎖を構 成するペプチドに言及するものである。例示的な配列を図５に示す。これらは、 概して保存された様式でペプチド鎖に分布したその半システイン（half-cystein e）残基の含有量によって更に特徴付けられる。第１および第２の半システイン は６つの介在残基によって分離され、第２および第３の半システインは４つの介 在残基によって分離され、第３および第４の半システインは９つの介在残基によ って分離され、第４および第５の半システインは６つの介在残基によって分離さ れ、第５および第６の半システインは隣接している。更に、システイン残基は、 ジスルフィド結合を介して特徴的な様式で対合する。即ち、第１のシステインは 第５のシステインと、第２のシステインは第４のシステインと、第３のシステイ ンは第６のシステインと対合する。幾つかのβ−デフェンシンは、アミノ末端の ピログルタメート（pyroglutamate）残基を特徴とし、これによりこれらの分子 は大半のアミノペプチダーゼに対して耐性となる。更にβ−デフェンシンは、そ の広 い範囲の抗微生物活性を特徴とする。 ペプチドの抗微生物活性を減少させることなく、β−デフェンシンのアミノ酸 配列に対して種々の修飾を行うことができることを理解すべきである。アミノ酸 の付加、欠失または置換を含むこの種の修飾を表すペプチドは、この発明の範囲 内であることを意図する。 この発明によれば、β−デフェンシンペプチドに対応するアミノ酸配列をコー ドする単離された核酸分子が提供される。この種の核酸の例には、限定されるも のではないが、ＢＮＢＤ−１〜−１３をコードする核酸が含まれる。この発明は 、これらのアミノ酸配列をコードする核酸分子のものとは異なるが、同じ表現型 の効果を生ずる核酸分子をも包含する。これらの変更されてはいるが表現型的に は等価な核酸分子は、「等価な核酸」として言及する。またこの発明は、前記し た核酸分子と比較した場合に、生成されるポリペプチドの表現型を変化させない 、非コード領域における変更により特徴付けられる核酸分子をも包含する。更に この発明は、本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を包含する。ここ で使用するように、「核酸」という用語は、ＲＮＡ並びに一本鎖および二本鎖Ｄ ＮＡ並びにｃＤＮＡを包含する。加えて、ここで使用するように、「ポリペプチ ド」という用語は、全ゆる天然に存在するその対立遺伝子性変種、並びに人工の 組換え体を包含するものである。 ペプチドまたは蛋白質の修飾語として、本明細書および請求の範囲で「実質的 に純粋」という記載を使用するのは、このように指定したペプチドまたは蛋白質 が、生体内の細胞環境から分離されていることを意味する。分離および精製の結 果、実質的に純粋なペプチドおよび蛋白質は、分離されていない不純なペプチド または蛋白質では有用でない場合に有用なものとなる。 ここで使用するように、「実質的に同じ配列」という用語は、同一であるか、 または例えば図５に示すように配列ＢＮＢＤ−１乃至ＢＮＢＤ−１３との相当な 相同性を有するペプチド配列に言及するものである。増強された機能をもたらす 限定された修飾を、ペプチドに対して行うことができることが理解される。同様 に、ペプチドの生物学的機能を破壊することなく、限定された修飾を行うことが でき、活性に影響を与えるには全一次構造の一部のみが必要たり得ることも理解 される。例えば、活性を完全に破壊しないこれらの配列の小さな修飾も、この定 義に該当し、このように請求の範囲に記載した化合物の定義に該当する。修飾は 、例えばアミノ酸残基の付加、欠失または置換、アミノ酸構造または機能を模倣 する化合物による置換、並びにアミノ基およびアセチル基のような化学的部分の 付加を包含する。修飾は、意図的なものとすることができ、または抗微生物活性 を示すβ−デフェンシンペプチドを生成する宿主における変異によるもののよう な偶然的なものとすることができる。ペプチドがその抗微生物活性を保持する限 り、これらの修飾は全て包含される。 ここで使用するように、「抗微生物活性」という用語は、微生物の生育を阻害 するか、または不可逆的に阻止する化合物の能力に言及するものである。この種 の阻害または阻止は、殺微生物作用または微生物静止阻害を介するものとし得る 。したがって、ここで使用するように「殺微生物阻害」という用語は、標的生物 を殺傷するか、または取り返しのつかないように損傷を与える抗微生物性化合物 の能力に言及するものである。ここで使用するように「微生物静止阻害」という 用語は、死亡を伴わない標的生物の生育に言及するものである。殺微生物または 微生物静止阻害は、現時点で微生物の生育を示す環境（すなわち治療処置）、ま たはこの種の生育を支持する危険性のある環境（すなわち予防または防御）のい ずれにも適用することができる。 ここで使用するように、「微生物の生育を支え得る環境」という用語は、微生 物の生育が生じ得るか、または微生物が存在し得る流体、物質または生物に言及 するものである。この種の環境は、例えば動物の組織または体液、水および他の 液体、食品、食品製品または食品抽出物、穀物およびある種の無生命物とするこ とができる。環境が微生物の生育を促進するものである必要はなく、その生存を 許容するのみでよい。 ここでは次の省略形を使用する。ＤＦＰ：ジイソプロピルフルオロリン酸、Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィ、ＴＧＡ：トリフルオロ酢酸、 ＨＦＢＡ：ヘプタフルオロ酪酸、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、ＤＴＴ：ジ チオスレイトール、ＰＴＨ：フェニルチオヒダントイン、ＴＳＢ：トリプチカー ゼソイブロス（trypticase soy broth）、ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電 気泳動、ＢＮＢＤ：ウシ好中球β−デフェンシン、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、 ＴＰＣＫ：トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン、ＰＩＴＣ： フェニルイソチオシアネート。 本発明のβ−デフェンシンペプチドは、当業界で周知の方法、例えば自動ペプ チド合成装置の使用を介して、組換え法により、またはペプチド合成の周知のマ ニュアル的な方法によって合成することができる。更に、これらは天然の供給源 、例えば白血球細胞、および可能性としては脊椎動物、好ましくは哺乳動物起源 の種々の上皮から精製することができる。この種の細胞または組織は、当業者に 周知の手段によってヤギ、ヒツジ、バイソンおよび他のこの種の反芻動物から取 得することができる。 ここで使用するように、β−デフェンシンペプチドは、天然に存在する形態並 びに組換え形態、すなわち非天然存在形態の蛋白質およびポリペプチドであって 、天然に存在するβ−デフェンシンペプチドと十分に同一性があり、同様な生物 学的活性を持つことができるポリペプチドを包含する。この種のポリペプチドの 例には、ＢＮＢＤ−ｌ−ＢＮＢＤ−１３と命名されたポリペプチドが含まれるが 、これらに限定されるものではない。この種の蛋白質およびポリペプチドは、誘 導体およびアナログを含む。 またこの発明によって提供されるものは、β−デフェンシンペプチドをコード する核酸配列、ベクター、およびこれらを含む宿主細胞、並びに発現の方法であ る。 この発明のペプチドが単離された後に、このペプチドをコードする核酸を当業 界で周知の方法によって単離する（後記）。これらの単離した核酸をベクターに 連結し、発現のために適切な宿主細胞に導入することができる。連結および細胞 内での核酸の発現の方法は当業界で周知であり、Maniatisら（1989）（Molecula r Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spri ng Harbor，NY）を参照のこと。なお、この文献を援用して、本部の一部にして いる。 幾つかの種類のベクターが利用可能であり、この発明を実施するのに使用する ことができる。例えば、プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター、バキ ュロウイルスベクター、並びに酵母で使用するベクターである。ベクターがプラ スミドである場合、当業者に公知のように、これは一般にプロモーター、シグナ ル配列、表現型選択遺伝子、複製部位の開始点、および他の必要な構成部分を含 む種々の構成部分を含んでいる。 原核ベクターで最も普通に使用されるプロモーターには、lac Ｚプロモーター 系、アルカリ性ホスファターゼpho Ａプロモーター、バクテリオファージλＰＬ プロモーター（温度感受性プロモーター）、tacプロモーター（lacリプレッサー により制御されるハイブリッドtrp-lacプロモーター）、トリプトファンプロモ ーター、およびバクテリオファージＴ７プロモーターが含まれる。 この発明を実施するのに使用されるベクターの他の有用な構成部分の１つはシ グナル配列である。この配列は、典型的にはペプチドをコードする核酸に対して すぐ５′側の位置にあるため、融合蛋白質のアミノ末端で転写され得る。しかし ながら、ある種の場合では、シグナル配列は、分泌されるべき蛋白質をコードす る遺伝子に対して５′側以外の位置に位置することが示されている。この配列は 、それが付着した蛋白質を標的として細菌細胞の内膜を横切らせるものである。 シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するペプチドをコードす るいずれかの核酸から制限エンドヌクレアーゼ断片として取得することができる 。適切な原核シグナル配列は、例えばLam ＢまたはOmp Ｆ（Wongら、Gene 68：1 93（1983））、Mal Ｅ、Pho Ａ、Omp Ａをコードする遺伝子、および他の遺伝子 から取得することができる。この発明を実施するのに好適な原核シグナル配列は 、Changら、Gene 55：189（1987）に記載されているように、E．coliの熱安定性 エンテロトキシンＩＩ（STII）である。 この発明を実施するのに使用されるベクターの他の有用な構成部分は、表現型 選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、宿主細胞に対して抗生物質耐 性を与える蛋白質をコードするものである。例として、アンピシリン耐性遺伝子 （amp）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）を、この目的のために容易 に用いることができる。 前記した構成部分、並びに所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含む適切 なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手順を使用して行うことができる。 組合せてベクターを形成する単離したＤＮＡ断片を開裂させ、調整し、特定の順 序および方向性で互いに連結して所望のベクターを生成する。 適切な緩衝液中で適切な１または複数の制限酵素を使用してＤＮＡを開裂させ る。一般に、約０．２〜１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２０μｌの 緩衝液溶液中で、約１〜２単位の適切な制限酵素と共に使用する。適切な緩衝液 、ＤＮＡ濃度並びにインキュベート時間および温度は、制限酵素の製造業者によ って特定されている。一般に、３７℃で約１または２時間のインキュベート時間 が適切であるが、幾つのかの酵素はより高い温度を必要とする。インキュベート の後、フェノールおよびクロロホルムの混合物を用いて消化溶液を抽出すること により、酵素および他の夾雑物を除去し、エタノールを用いた沈殿によって、Ｄ ＮＡを水性画分から回収する。 ＤＮＡ断片を互いに連結して機能性のベクターを形成するには、ＤＮＡ断片の 末端は互いに適合性でなければならない。幾つかの場合では、エンドヌクレアー ゼ消化の後に、末端が直接適合性となる。しかしながら、エンドヌクレアーゼ消 化によって共通に生成された付着末端を平滑末端に最初に変換し、これらを連結 のために適合性とする必要があり得る。末端を平滑化するには、４つのデオキシ ヌクレオチド三リン酸の存在下で、１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ ）のクレノウ断片を用い、適切な緩衝液中で１５℃で少なくとも１５分間ＤＮＡ を処理する。その後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によ ってＤＮＡを精製する。 開裂したＤＮＡ断片をサイズにより分離し、ＤＮＡゲル電気泳動を使用して選 択する。アガロースまたはポリアクリルアミドマトリックスを介してＤＮＡを電 気泳動する。マトリックスの選択は、分離すべきＤＮＡのサイズに依存し得る。 電気泳動の後、電気溶出によって、または低融点アガロースをマトリックスとし て使用した場合はアガロースを融解させこれからＤＮＡを抽出することによって 、ＤＮＡをマトリックスから抽出する。 互いに連結すべきＤＮＡ断片（連結すべきそれぞれの断片の末端が適合性とな るよう、適切な制限酵素を用いて予め消化したもの）を、略等モル量で溶液に入 れる。溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびリガーゼ、例えば０．５μｇの ＤＮＡ当り約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼをも含有するものとなる。ＤＮＡ断 片をベクターに連結すべき場合は、適切な１または複数の制限エンドヌクレアー ゼを用いて切断することにより、ベクターを最初に直鎖状とする。その後、アル カリ性ホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼを用いて、直鎖状としたベク ターを処理することができる。リン酸化により、連結工程の際のベクターの自己 連結が阻止される。 連結の後、今や外来遺伝子を有するベクターを、適切な宿主細胞にトランスフ ォームする。適切な原核宿主セルラインには、E．coli株JM101、E．coli K12株2 94（ATCC番号31,446）、E．coli株W3110（ATCC番号27,325）、E．coli X1776（A TCC番号31,537）、E．coli XL-1 Blue（ストラタジーン（Stratagene））、およ びE．coli Bが含まれるが、HB101、NM522、NM538、NM539のような多くの他のE． coliの株、および原核生物の多くの他の種および属も使用することができる。前 記列記したE．coliに加えて、Bacillus subtillisのようなバチルス属、Salmone lla typhimuniumまたはSerratia marcesansのような腸内細菌、および種々のPse udomonas種は全て宿主として使用することができる。 原核細胞のトランスフォームは、当業者に周知の塩化カルシウムまたは他の方 法を使用して容易に行われる。エレクトロポーレーション（Neumannら、EMBO J. 1:841（1982））を使用してこれらの細胞をトランスフォームすることもできる 。トランスフォームした細胞は、抗生物質、通常はベクター上のtetおよび／ま たはamp耐性遺伝子の存在により耐性となったテトラサイクリン（tet）またはア ンピシリン（amp）上での生育によって選択する。 トランスフォームした細胞の選択の後、これらの細胞を培養により生育させ、 その後にプラスミドＤＮＡ（または挿入した外来遺伝子を有する他のベクター） を単離する。プラスミドＤＮＡは、当業界で公知の方法を使用して単離すること ができる。その後、この精製したプラスミドＤＮＡを、制限マッピングおよび／ またはＤＮＡ配列決定によって解析する。 前記概説した手順の後、哺乳動物のセルライン、例えばミエローマ（P3-653） 、ハイブリドーマ（SP2/0）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、ミドリザル 腎臓（COS1）、およびネズミ繊維芽細胞（L492）を、ポリペプチド発現のための 適切な宿主細胞とする。これらの「哺乳動物」ベクターは、プロモーター、エン ハンサー、ポリアデニル化シグナル、シグナル配列、およびゲネチシン（ネオマ イシン耐性）、マイコフェノール酸（キサンチン・グアニン・ホスホリボシルト ランスフェラーゼ）またはヒスチジノール（ヒスチジノール脱水素酵素）のよう な選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含むことができる。 哺乳動物宿主細胞中で使用するのに適切なプロモーターには、限定されるもの ではないが、Igκ、Igγ、サイトメガロウイルス（CMV）超初期（immediate ear ly）、ラウスサルコーマウイルス（RSV）、シミアンウイルス40（SV40）初期、 マウス乳腫瘍（MMTV）ウイルス、およびメタロチオネインが含まれる。適切なエ ンハンサーには、限定されるものではないが、Igκ、Ig重鎖、CMV初期およびSV4 0が含まれる。適切なポリアデニル化配列には、Igκ、Igγ、またはSV40ラージ Ｔ抗原が含まれる。適切なシグナル配列には、Igκ、Ig重鎖、およびヒト成長ホ ルモン（HGH）が含まれる。 ベクターがバキュロウイルスである場合、適切なプロモーターおよびエンハン サー配列には、限定されるものではないが、AcMNPVポリヘドリン、AcMNPV ETL、 およびAcMNPV p10配列が含まれる。特に適切なポリアデニル化シグナルの１つは ポリヘドリンAcMNPVである。Igκ、Ig重鎖およびAcMNPVは、適切なシグナル配列 の例である。これらのベクターは、SF9、SF21およびHigh 5の昆虫セルラインに おいて有用である。 或いは、PS23-6A、W301-18A、LL20、D234-3、INVSC1、INVSC2、YJJ337のよう な酵母株でポリペプチドを発現させることができる。gallおよびpEFT-1のような プロモーターおよびエンハンサー配列が有用である。Vra-4も適切なエンハンサ ー配列を提供する。機能性の「複製開始点」として有用な配列には、ars1および 2μ環状プラスミドが含まれる。 更にこの発明によれば、組換えによって製造されるペプチドが提供される。組 換えによりペプチドを製造する方法は、この発明の範囲内である。この方法は、 核酸が転写されかつ／または翻訳されるような適切な条件下で、ペプチドをコー ドする核酸を含む宿主細胞を生育させ、このようにして製造されたペプチドを単 離することを含む。 或いは、当業者に公知の合成手順を使用して、β−デフェンシン抗微生物ペプ チドを化学的に合成することができる。好ましくは、ミリジェン（Milligen）、 モデル9050（Milligen，Milliford，MA）のような自動ペプチド合成装置を、ポ リエチレングリコール−ポリスチレン（PEG-PS）グラフト樹脂上でＮα−Fmocア ミノ酸と組合せて使用する。例えば、ペプチドアミドリンカー（PAL）のような 適切なリンカーを使用し、カルボキシアミド末端基を生成することができる。 この発明によって多数の修飾が企図される。天然の配列中の特定の残基を置換 する自明の手法の他に、他の態様は、Ｄ−アミノ酸からのペプチドの合成を伴う ものであり、これによりプロテアーゼによる潜在的な不活性化を最小とする。こ の種の手段は当業界で周知である。例えば、Wadeら、PNAS，USA87：4761-4765（ 1990）を参照することができる。 抗β−デフェンシン抗体は、当業界で慣用された方法によって作製することが できる。例えば、ウサギ、マウスまたはラットのような適切な動物中でポリクロ ーナル抗血清を生成させることができる。合成により、または天然から取得した β−デフェンシンペプチドを使用して動物を免疫化することができる。かくして 免疫原を使用し、当業者に周知の手段によって動物を免疫化する。抗β−デフェ ンシン力価が適切となるまで血清サンプルを補集する。IgGのような抗血清の種 々の画分を、当業界で周知の手段によって単離することができる。または、β− デフェンシン免疫原を使用し、同様に当業界で周知の手段によってモノクローナ ル抗体を取得することができる。例えば、HarlowとLane、Antibodies：A Labora tory Manual，（Cold Spring Harbor Laboratory，1988）を参照のこと。 β−デフェンシンの抗微生物または抗細菌活性は、種々の病原体に対して測定 することができる。微生物を適切な濃度に生育させ、アガロース−トリプチカー ゼソイ培地のような適切な培地と混合し、β−デフェンシンの溶液と接触させる 。適切なインキュベートの後、抗微生物活性は、抗微生物サンプルの周囲の透明 帯（clear zone）から明らかである。透明帯は濃度依存性である。抗β−デフェ ンシン抗体を使用し、組織学的サンプルのような生物学的サンプル中のβ−デフ ェンシンの存在を決定することができる。その後に適切な検出可能な二次抗体を 使用し、例えば視覚化によって、β−デフェンシンに付着した一次抗体を同定す る ことができる。検出手段には、放射性ヌクレオチド、またはペルオキシダーゼの ような酵素の基質を使用することが含まれる。 経口投与、好ましくは胃内放出を回避し得る徐放型の処方物を含む種々の手段 によって、天然の供給源から精製したまたは合成したβ−デフェンシンを、治療 の必要に応じて対象体に対して投与することができる。または、鼻−胃挿管法ま たは腹部挿通カテーテルを介して、これらを投与することができる。β−デフェ ンシンの個々の種を単独で投与することができ、または組合せて同時または逐次 に投与することができる。 デフェンシンは、白血球から単離された最初の抗微生物ペプチドであり、本発 明者によって報告されるまでは、保存された３つのジスルフィド構造形態を含む 唯一の公知のファゴサイト由来分子であった。古典的なデフェンシンはウシ好中 球では検出されていなかったが、これらを検索した結果、新しい種類の別ではあ るが関連したペプチド抗生物質を突き止めるに至った。β−デフェンシンは、少 なくとも１３の好中球ペプチドよりなる高度に保存された群（ファミリー）を構 成し、これらはデフェンシンファミリーのものとは異なるジスルフィド構造を特 徴とする。ここでは、ＢＮＢＤ−１２におけるジスルフィド構造の決定、および それぞれのシステイン結合の比較から明らかとなる古典的なデフェンシンとβ− デフェンシンとの間の可能な構造的関係を開示する。 遊離のアミノ末端を有する古典的なデフェンシンとは異なり、１３の内の７つ のβ−デフェンシンは、Ｎ末端グルタミンの酵素的環状化に起因するピログルタ ミル残基によりＮ末端でブロックされていることが見出された。３つのβ−デフ ェンシンは、僅かに長い対応ペプチドのアミノ末端プロセシング変種であると考 えられる。ＢＮＢＤ−２およびＢＮＢＤ−８の配列は、それぞれＢＮＢＤ−３お よびＢＮＢＤ−９と同一であるが、ただし後者の２つのペプチドは、それぞれ何 らかのピログルタミル−グリシンジペプチド伸長部分を有している。更に、ＢＮ ＢＤ−１２およびＢＮＢＤ−１３は、ＢＮＢＤ−１３がＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ −Ｓｅｒのアミノ末端テトラペプチドを有する以外は、同一の配列を有する（図 ５）。 試験官内での検討で測定したところ、ＢＮＢＤ−２および−３は、試験生物の 両者に対して等価の抗細菌活性を有している。同様に、ＢＮＢＤ−１２およびＢ ＮＢＤ−１３の抗細菌活性は略等しい。これに対して、ＢＮＢＤ−８および−９ の組は抗細菌効力において異なり、より量の多いＢＮＢＤ−９がより大きい試験 官内活性を有する（図７）。この活性の相異は、ヒトデフェンシンのＮ末端が、 抗微生物効力において所定の役割を果たし他の組織における宿主防御でも機能す るのと同様に、Ｎ末端が機能の構造的決定部位であることを明らかにするもので ある。 好適な態様では、本発明は治療用抗微生物剤を提供する。抗細菌抗生物質は多 数あるにも拘らず、抗カビ剤は数が極めて少ない。１以上のペプチドが、単独で 、または脂質小胞調製物として、抗カビ剤としての有用性を有し得る。後者の手 法は、非ペプチド性抗カビ剤であるアンホテリシンで使用されて効果を挙げてい る。特定の応用は、標的とする病原体に依存する。例えば、C．albicansはＡＩ ＤＳ患者における皮膚粘膜カビ疾患に共通する原因であり、幾つかのβ−デフェ ンシンに対して非常に感受性であるが、これらの個人において、βデフェンシン を基剤とする治療剤または既存の第１線の薬剤との組合せにより、より有効に制 御され得る。同様に、β−デフェンシンは、獣医医学において治療剤として使用 することができる。 更なる態様では、食品保存剤として、または食品製品を処理して潜在的な病原 体を除去するのに本発明を使用することができる。後者の使用は、重篤なヒトの 疾患を引き起こす腸内病原体による深刻な問題を有している貝類および飼鳥類産 業を対象とし得る。 他の態様では、β−デフェンシンは、微生物を含有しないで維持する必要のあ る全ゆる製品における使用のために、殺菌剤として使用することができる。 更なる態様では、β−デフェンシンは、食品穀物の抗微生物剤として、収穫後 の劣化を低減する薬剤として、または遺伝子を介して発現して宿主の耐性を増強 する薬剤として使用することができる。 この発明の所定の態様では、可溶性蛋白質の処理は、サイズ排除クロマトグラ フィ、イオン交換クロマトグラフィ、または逆相、高性能液体クロマトグラフィ を含む。ただし当業者であれば、ポリペプチドを精製するための可溶性蛋白質の 処理は、当業者に公知の多くの方法によって行うことができることを理解するで あろう。その全てをこの発明は企図するものである。更に、この発明の１つの態 様では、顆粒を回収するための顆粒細胞の処理は、密度勾配遠心分離を含むもの である。 本発明は、細菌またはカビを殺傷するのに有効な量の精製したポリペプチドと 、適切なキャリアとを含む組成物をも提供する。この種の組成物は、例えば当業 界で周知のキャリアを使用する家庭または実験室における抗微生物性配合物にお いて、細菌またはカビと対抗するために多数の方法で使用することができる。 この発明により、更にヒトの細菌またはカビ感染を処置するための薬学的組成 物が提供され、これは、ヒトの細菌またはカビ感染を処置するのに有効な量の本 発明の精製したポリペプチドと、薬学的に許容し得るキャリアとを含む。 本発明の組成物は、広範な種類の微生物、例えばカビ、細菌（グラム陽性およ び陰性の両者）、並びに原生動物およびウイルスに対して活性を有する。異なる 組成物は、異なる生物に対して異なる程度の活性を有し得る。本発明のペプチド を他の蛋白質と組合せて保存剤として作用させ、細菌による劣化から蛋白質を保 護することもできる。或いは、主題のポリペプチドまたは組成物は、保存剤およ び殺菌剤として、広範な種類の配合物、例えばコンタクトレンズ溶液、軟膏、シ ャンプー、薬品、食品等に使用することができる。組成物中で用いるポリペプチ ドの量は、他の成分の性状、要求される防御の程度、および組成物の意図される 使用に依存して変動し得る。 ポリペプチドを抗微生物剤として使用すべき場合、多様な塩および緩衝剤を含 有する緩衝化した水性媒体中でこれらを配合することができる。塩は、大半のも のをアルカリおよびアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩および硫酸塩、例えば 塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、 例えばクエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝剤が処置 される宿主に生理学的に許容され得る程度で使用することができる。 種々の賦形剤または他の添加物を使用することができ、この場合化合物は、溶 液中でのその後の使用のために、凍結乾燥粉末として配合する。賦形剤は、種々 のポリオール、不活性粉末または他の増量剤を含むことができる。 配合物および宿主の性状に応じて、種々の様式で本化合物を投与することがで きる。配合物は、局所的に、注射により、例えば静脈内、腹膜内等、鼻咽頭等に より施すことができる。 更に本発明により、細菌またはカビを殺傷する方法が提供され、これは細菌ま たはカビと、有効量の前記組成物とを接触させることを含む。有効量は、当業者 によって容易に決定することができる。 更にこの発明により、細菌またはカビの感染を受けた被験者を処置する方法が 提供され、これは、前記した有効量の薬学的組成物を主体に投与することを含む 。 この発明の他の態様では、細菌またはカビを殺傷するのに有効な量の本発明の 精製したポリペプチドと適切なキャリアとを含む組成物、およびヒトの細菌また はカビ感染を処置するのに有効な量の本発明の精製したポリペプチドと薬学的に 許容し得るキャリアとを含む、ヒトの細菌またはカビ感染を処置する薬学的組成 物は、更に界面活性剤（detergent）を含むことができる。この種の組成物に界 面活性剤を添加することは、本発明の新規なポリペプチドの抗細菌または抗カビ 特性を増強するのに有用である。全ゆる適切な界面活性剤を使用することができ るが、現在のところ好適な洗浄剤は、非イオン性洗浄剤、例えばTween 20または １％NP40である。 また本発明により、ヒトの細菌またはカビ感染を処置する薬学的組成物も提供 され、これは、薬学的に許容し得るリポソームに組込まれた、ヒトの細菌または カビ感染を処置するのに有効な量の本発明の精製したポリペプチドを含むもので ある。 本発明のポリペプチドのための担体として、全ゆる適切な薬学的に許容し得る リポソームを使用し得ることは、当業者により容易に理解されよう。この種のリ ポソーム組成物は、より詳細に前述した本発明の他の組成物の活性と同様に、広 範な種類の微生物に対して活性を有する。更に、これらの組成物は、同様に一層 詳細に前述したように、多様な従来の周知の様式で投与することができる。 以下の実施例は説明を意図するものであって、この発明を限定するものではな い。 実施例Ｉ 材料と方法 ウシ好中球：多形核白血球（ＰＭＮ）を、１Ｌバッチの新鮮なクエン酸処理し たウシ血液から精製した。７００×ｇおよび３７℃で４０分間沈降させた後、赤 血球柱を７秒間低張溶解に供した後、３×リン酸緩衝塩類溶液を使用して等張性 を回復させた。その後、白血球富裕懸濁物を１２０×ｇ（４℃、１５分）で沈降 させた。この手順を１または２回繰返すことにより、残余の赤血球を溶解させた 。同種細胞法（homocytometry）および示差カウント（differential counts）に よる計量のために一部を取出した。この手順によって得られた調製物は、全血Ｌ 当り平均４×１０⁹細胞を含有し、その９７±３％が好中球であった。調製物の 半分を２ｍＭのジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ；２０）により処理した 。その後、好中球調製物を４℃に２０分間冷却し、パール・ボンベ（Parr bomb ）（２１）中にて窒素キャビテーションにより破壊した。キャビテーション処理 物を８００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、顆粒を含有する上澄を集めた。２ ７，０００×Ｇで４０分間遠心分離することにより顆粒を回収し、−８０℃で保 存した。 ＰＭＮ顆粒抽出物：１〜５×１０¹⁰ＰＭＮの凍結顆粒の調製物を、１×１０⁹ 細胞等量当り５ｍｌの氷冷した１０％酢酸を用いて抽出した。氷上で１８時間撹 拌した後、２７，０００×Ｇで２０分間４℃で遠心分離することにより懸濁物を 清浄化し、上澄を凍結乾燥して−７０℃で保存した。 サイズ排除クロマトグラフィ：凍結乾燥した顆粒抽出物を、ｍｌ当り約１×１ ０⁹細胞等量の濃度で１０％酢酸に溶解し、遠心分離によって清浄化し、５％酢 酸で平衡化したバイオゲル（BioGel）P-60の４．８×１１０ｃｍカラムに装填し た。毎時２ｃｍの溶出速度で８℃でカラムを流し、２８０ｎｍで連続的にモニタ ーしながら１５ｍｌの画分を集めた。 逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：サイズ排除カラムから溶出する低分子量成 分を、１×２５ｃｍのバイダック（Vydac）C-18カラムによるウォーターズ（Wat ers）510バイナリーシステムでＲＰ−ＨＰＬＣにより更に分別した。０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または０．１３％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ） を含有する水およびアセトニトリルを勾配溶出のために使用した。精製したペプ チドを凍結乾燥し、５００μｇ／ｍｌで０．０１％酢酸中に溶解させ、−７０℃ で保存した。 ポリアクリルアミド電気泳動：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Flingら、A nal．Biochem．155：83-88（1986））、および酸−尿素（Selstedら、Anal．Bio chem．155：270-274（1986））ゲル電気泳動を、分子量および／または蛋白質調 製物の純度を見積るために使用した（Selstedら、Infect．Immun．45：150-154 （1984））。 アミノ酸分析：無処理および過ギ酸酸化または還元およびアルキル化サンプル の６Ｎ ＨＣｌ加水分解物（２時間、１５０℃）について、それぞれのペプチド のアミノ酸組成を決定した（Bindlingmeyerら、J．Chromatogr．336：93-104（1 984））。配列解析により、およびベックマン（Bechman）DU60分光光度計による 分光学的測定により、トリプトファン含有量を決定した（Endelhoch，Biochem． 6：1948-1954（1967））。 配列解析：ＤＴＴを用いて配列解析のためのサンプルを還元し、ビニルピリジ ンまたはヨードアセトアミドを用いてアルキル化し（Henschen，Advanced Metho ds in Protein Microseq．Anal．Springer-Verlag Berlin244-255（1986））、 ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。全てのサンプルに対して２サイクルの手動エド マン分解（Klemm、後記）を行い、Ｎ末端をブロックしたペプチドを同定した。 ５０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０１Ｍ ＥＤＴＡニナトリウム、５ ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセリロール、ｐＨ８．０中で、２μｇのピログルタメー トアミノペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）を用 いて室温で５時間、３〜４ｎｍｏｌのそれぞれのＮブロックしたペプチドをイン キュベートした。その後、自動エドマン配列解析の前に、脱ブロックしたペプチ ドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。オンラインＰＴＨアミノ酸分析を装着した アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）475A装置により、自動配 列解析を行った。 カルボキシペプチダーゼＡまたはＹにより放出された残基のアミノ酸分析によ って、カルボキシル末端のアミノ酸を決定した（Ambler，Methods Enzymol．25 ：143-154（1972））。３〜６μｇのカルボキシペプチダーゼＡ（Boehringer Ma nnheim）を含有する、５０μｌの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８． ０、または０．１２５Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０中に、３７℃で２０〜 ６０分間、約１ｎｍｏｌのＳ−アルキル化ペプチドを溶解させた。ＲＰ−ＨＰＬ Ｃ上での標準トリプトファンとの同時溶出により、放出されたトリプトファンを 同定した。 質量分析：VG7070E-HF装置により、陽イオン高速原子衝撃（fast atom bombar dment）質量分析法によって無処理のペプチドの質量を決定した。５の累積走査 で５００の分解能によりデカード当り３００秒の走査速度で、３４５０〜６２０ ０ｍ／ｚに渡って走査を行った。８ｋｖの電位で加速された中性キセノン原子ビ ームにより、メタニトロールベニルアルコール（meta-nitrolbenyl alcohol）マ トリックスの衝撃によってイオンが生成された。 トリプシンおよびキモトリプシン処理：α−キモトリプシン（Boehringer Man nheim）またはトシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン処理した トリプシン（ワーシントン（Worthington））を用いて、選択されたペプチドの 蛋白質分解消化を行った。５０μｌの０．１２５Ｍ重炭酸アンモニウム中にＳ− ピリジルエチル化ペプチド（約２ｎｍｏｌ）を溶解し、０．２μｇの酵素を用い て３７℃で１〜５分間インキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣによりペプチド断片 を精製し、アミノ酸分析により特徴を調べ、場合によっては配列決定した。 抗微生物検定：Escherichia coli ML35およびStaphylococcus aureus 502Aを 、Lehrerら（J．Immunol．Meth．167-173（1991））により最近報告された半径 方向拡散検定（radial deffusion assay）に用いた。トリプチカーゼソイブロス （ＴＳＢ）中で対数期半ばまで細菌を生育させ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７．４により緩衝化した３ｍｇのＴＳＢを含有する１０ｍｌの加温した（４３ ℃）１％アガロース中に希釈した。５μｌのそれぞれのペプチド溶液を、４ｍｍ のコルク穴により形成した穴にピペットで移し、３７℃で３〜４時間インキュベ ートした。その後、２×ＴＳＢを含む１０ｍｌの滅菌した１％寒天でプレートを 重層した。１８〜２４時間のインキュベートの後、拡大トランスイルミネーター を使用 し、それぞれの穴の周りの透明帯の直径を測定した。 実施例ＩＩ 結果 ウシ好中球ペプチドの精製：ウシＰＭＮ顆粒の酸可溶性蛋白質の前記電気泳動 による分析により、これらの調製物は、1000〜200,000Ｄでサイズが変動する蛋 白質の複雑な混合物を含むことが示された。推定されるデフェンシンをウシ好中 球顆粒から単離するために、１〜３×１０¹⁰細胞等量の酸可溶化した顆粒蛋白質 を、BioGel P-60カラム上で分画し、プールした溶出液画分中の抗細菌活性を「 方法」に記載したように検定した。各ピーク（図１のＡ〜Ｆ）は、S．aureusお よびE．coliに対する殺細菌活性を含んでいた（データは示さない）。先の報告 に記載したように、ピークＦは、新規な１３残基の抗生物質ペプチドアミドであ るインドリシジンを主として含んでいた（Selstedら、J．Biol．Chem．267：429 2-4295（1992））。 P-60カラムによりプールした画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ピークＥで溶出 する蛋白質の大半は約５ｋＤであることが示され（データは示さない）、アミノ 酸分析により、このピーク中の材料の全体的なシステイン含有量は約１５％であ ることが示された。これらは、デフェンシンのサイズおよび組成と一致する特徴 であるため、ピークＥ画分を合せてＨＰＬＣによって更に精製した。 ピークＥ画分の最初のＲＰ−ＨＰＬＣ精製により複雑なクロマトグラム（図２ ）が得られたが、この場合大半のピークが、酸−尿素ＰＡＧＥにより決定される ２以上のペプチドを含んでいた。最も早いピークの１つ（図２において^*で示す ）は、約1500Ｄの抗細菌性ペプチドを含んでいた。自動配列解析により（データ は示さない）、このペプチドは、先にRomeoら（J．Biol．Chem．263：9573-9575 （1988））により初期に記載された環状ドデカペプチドであるバクテネシンと同 一であることが明らかとなった。ここに記載する１３ペプチドの精製における後 続する工程は、改変した勾配条件を用い、かつ／またはイオン対合剤としての０ ．１３％ＨＦＢＡを使用したものである。これらの工程により、１３の独特のペ プチドの精製が可能となり、そのそれぞれは、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（図３） および酸−尿素ＰＡＧＥ（図４）上で、その均質な挙動により純粋であることが 決定された。以下に記載するように、これらのペプチドは関連するペプチドのフ ァミリーを形成するものであり［ウシ好中球β−デフェンシン（ＢＮＢＤｓ）］ 、これらはＲＰ−ＨＰＬＣ上でのその保持時間の延長に基いて、１〜１３の番号 が付けられている（図３、表Ｉ）。図２において番号を付けていないピーク中に 溶出するペプチドを、アミノ酸分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けした が、システインを有さないか、ＢＮＢＤ１〜１３より遥かに大きいものであり、 これらのペプチドはβ−デフェンシンとは関連しないことが示された。 回収された均質なＢＮＢＤ１〜１３の量を定量し、精製の各工程での損失を補 正することにより、β−デフェンシンペプチドの細胞含有量を推定した。回収を 評価するために酸−尿素およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、約８０％の細胞含有 量のβ−デフェンシンが顆粒濃縮画分から抽出され、P-60カラムからの回収は実 質的に定量的であると推定した。ＲＰ−ＨＰＬＣの際の７５％の回収を想定する と、合せた１３のβ−デフェンシンの量は、２つの完全な精製から平均して、１ ０¹⁰の好中球当り約４．９ｍｇであった。最も量の多いβ−デフェンシンはＢＮ ＢＤ−３であり、１０¹⁰細胞当り約２．２ｍｇ存在する。残りのペプチドのそれ ぞれの量は、表Ｉにまとめるように同様に概算した。 アミノ酸分析：無処理および過ギ酸酸化またはＳ−カルボキシアミドメチル化 サンプルのアミノ酸分析により各ペプチドの組成を確定した。これらはそれぞれ 少なくとも２回分析した。それぞれのペプチドの吸光度走査を３００〜２００ｎ ｍで行い、チロシンおよびトリプトファン含有量の正確な見積りを得た（Edelho ch，Biochem．6：1948-1954（1967））。表Ｉにまとめるように、１３のペプチ ドは３８〜４２のアミノ酸を含んでおり、その６つは半システイン残基であった 。無処理のペプチドはエルマン試薬（Elman'ｓ reagent）試薬またはヨードアセ トアミドと反応せず、システインがジスルフィドとして存在する可能性が極めて 高いことが示された。高いシステイン含有量に加えて、ペプチドは概して塩基性 アミノ酸のアルギニンおよびリジンは妥当であるが、チロシンおよびアラニンは 相対的に希であった。 配列解析：２サイクルの手動エドマン分解により、６つのペプチド（ＢＮＢＤ １、２、８、１１、１２および１３）のＮ末端残基を同定した。残りの７つのペ プチドのＮ末端は、ピログルタミン酸アミノペプチターゼにより脱ブロックされ 、これらのペプチドのそれぞれのＮ末端におけるピログルタミル残基の存在が示 された。１〜５ｎｍｏｌのそれぞれのＳ−アルキル化ペプチドに対して、自動配 列解析を行った。繰返しの配列決定により、平均９３〜９７％の結果が得られ、 自動エドマン分解により５１９アミノ酸の内５１１の明白な割当てが可能となっ た。同定のために更なる工程を必要とする８つの残基には、ＢＮＢＤ１、２、３ 、６、１１、１２および１３のカルボキシル末端トリプトファン、およびＢＮＢ Ｄ−４のカルボキシル末端アルギニンが含まれる。ＢＮＢＤ−４および−６を除 いて、前記８つのペプチドのそれぞれのカルボキシル末端は、カルボキシペプチ ダーゼＡにより放出されたアミノ酸の分析によって決定された。ＢＮＢＤ−４の カルボキシル末端アルギニンは、残基３３〜４１により構成され、組成Ｇｌｙ（ １．２７）、Ａｒｇ（２．６４）、Ｐｒｏ（２．０６）、Ｖａｌ（０．９８）、 Ｃｙｓ（１．５９）を有する精製したキモトリプシン分解ペプチドのアミノ酸分 析によって確認された。この断片の全体的な組成、およびその（３）アルギニン 残基の含有量は、カルボキシル末端におけるＡｒｇ−Ａｒｇジペプチドの存在と 一致していた。 ＢＮＢＤ−６のカルボキシル末端として割当てたトリプトファンは、カルボキ シペプチダーゼＡおよびＹによって少量しか放出されなかった。Ｃ末端のトリプ トファンを確認するために、高速原子衝突質量分析により、無処理のペプチドの サンプルについてＢＮＢＤ−６の質量を決定した。ＢＮＢＤ−６のモノアイソト ープ質量は４８１４．２ａｍｕであり、理論質量の４８１６とほぼ一致し、Ｃ末 端トリプトファンの存在と一致していた。更に、紫外線スペクトル分析（Edelho ch、同）により、無処理のペプチド、および残基３３〜４２を含むカルボキシル 末端キモトリプシン分解断片の両者において、単一のトリプトファンの存在が示 された。１３のペプチドの配列は、そのそれぞれのアミノ酸組成とより一層一致 するものであった（表Ｉ）。 図５に示すＢＮＢＤ１〜１３の完全なアミノ酸配列は、このペプチドファミリ ーの一次構造の類似性の程度が高いことを明らかにするものである。デフェンシ ンと同様に、それぞれのペプチドは６つの不変のシステイン残基を特徴とし、そ の内２つは連続しているもので、ペプチドのカルボキシル末端付近に位置してい る。しかしながら、配列中の他のシステイン残基の間隔はデフェンシンとは異な り、ＢＮＢＤ−１２において決定されたジスルフィド結合性はデフェンシンのも のと異なっている（Selstedら、J．Biol．Chem．（1992）（投稿中））。 保存されたシステインに加えて、β−デフェンシンの配列は、絶対的ではない にしても高度に保存された幾つかのアミノ酸を含む（図５）。高度に保存性の置 換（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ）、および１０以上のβ −デフェンシンの一次構造でＰｒｏまたはＡｒｇのみが現れる１つの位置を整列 させることにより、２７アミノ酸の共有の共通配列が明らかとなる（図６）。 ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschulら、J．Mol．Biol．215：403-410（1990） ）を使用した配列類似性検索により、β−デフェンシンと実質的な同一性を有す る単一の蛋白質のみが明らかとなった。これは気管の抗微生物性ペプチド（ＴＡ Ｐ）であり、ウシ気管上皮からDiamondらにより単離されたペプチドである（Dia mondら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA88：3952-3956（1991））。ＴＡＰの一次 構造は、２７残基のβ−デフェンシンの共通配列を含むが、これは、ここに記載 した好中球から誘導したβ−デフェンシンのいずれとも同一ではない（図６）。 β−デフェンシンの抗微生物活性：Staphylococcus aureus 502AおよびEscher ichia coli ML35を試験生物として使用し、それぞれのβ−デフェンシンの抗細 菌活性を評価した。感受性半径方向拡散検定を使用し、１０〜３００μｇ／ｍｌ の範囲のβ−デフェンシン濃度を用いて、２つの細菌生物に対してそれぞれのペ プチドを試験した。図７に示すデータは、サンプル穴の周りの透明帯の大きさに より測定したものとして、それぞれのペプチドの投与量依存性の活性を明らかに している。大半の場合において、ペプチド濃度の対数は、生育排除域の直径と直 線的に相関している。ペプチドの相対的な効力は異なるにも拘らず、試験した濃 度範囲において、１３の全てがE．coliに対して活性であり、ＢＮＢＤ−１およ びＢＮＢＤ−５を除く全てがS．aureusに対して活性であった。大半の場合にお いて、透明帯は、S．aureusよりもE．coliに対する場合の方が大きかった。 β−デフェンシンの抗細菌活性を、３つの既に特徴付けられた抗微生物ペプチ ドと比較した。ウサギ好中球デフェンシンＮＰ−１（これは古典的なデフェンシ ンの最も有効なもの）、インドリシジン、および環状ドデカペプチドのバクテネ シンである。β−デフェンシンと同様に、後者の２つのペプチドは、ウシ好中球 顆粒から精製されたものである。図７に示すように、ウサギＮＰ−１の抗スタフ ィロコッカス活性（staphylococcal activity）は、試験した全ゆるペプチドの 内では最大であったが、殆ど全てのβ−デフェンシンと比較した場合は、E．col iに対するＮＰ−１の活性は中程度であった。ドデカペプチドであるバクテネシ ンの効力は、両者の細菌に対する幾つかのβ−デフェンシンのものと類似してい たが、最も活性なβ−デフェンシン（例えばＢＮＢＤ７、９、１２および１３） よりは小さかった。質量基準では、インドリシジンがE．coliに対する最も活性 なペプチドであり、これはS．aureusに対するウサギＮＰ−１とほぼ同程度に活 性であった。 実施例ＩＩＩ 材料と方法 ＢＮＢＤ−１２の精製：記載のようにしてＢＮＢＤ−１２を均質にまで精製し た（Selstedら、J．Biol．Chem．（投稿中））。 化学物質：配列等級のピリジン、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、 トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘプタン、酢酸エチル、およびＨＣｌは、ピアス ケミカル社（Pierce Chemical Co.）から購入した。配列等級の酢酸ｎ−ブチル はアルドリッヒ（Aldrich）から購入した。過酸化水素（３０％）、ギ酸（９０ ％）、並びにＨＰＬＣ等級の水およびアセトニトリルはフィシャ（Fisher）から 購入した。トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ） 処理トリプシンはWorthingtonから入手した。 トリプシン消化：ＢＮＢＤ−１２（１５ｎｍｏｌ）を、５０μ１の０．１Ｍ酢 酸ピリジン、ｐＨ６．４８中で、８μｇのＴＰＣＫ−トリプシンを用いて３７℃ で４または２４時間で消化した。ＴＦＡを用いて酸性化することにより反応を終 了させ、混合物をとってスピード・バック（Speed Vac）エバポレーター（サバ ント（Savant））中で乾燥させた。 逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ：Waters 510バイナリー勾配系によるＲＰ−ＨＰＬＣに よってトリプシン消化断片を精製した。４．６×２５０ｍｍのVydac C-18カラム にサンプルを装填し、０．１％ＴＦＡを含む水とアセトニトリルとの勾配を用い て展開した。個々のクロマトグラフィ操作の詳細は、図の記載に示す。 アミノ酸分析：アミノ酸分析の前に、サンプルを過ギ酸酸化した。凍結乾燥し たペプチドサンプル（２ｎｍｏｌ）を５０μｌの新たに調製した過ギ酸に溶解し 、室温で３０分間インキュベートした。過ギ酸を除去するために、５０μｌのＨ ＰＬＣ等級の水を用いて溶液を希釈し、凍結乾燥した後、これを２回繰返した。 １％フェノールを含む６．０Ｍ ＨＣｌの気相中で、１１０°で２４または４８ 時間真空下にサンプルを加水分解した。ＰＩＴＣを用いて誘導した後にアミノ酸 組成を決定した（Bidlingmeyerら、J．Chromatogr．336：93-104（1984））。 手動エドマン分解：手動エドマン分解の手順は、本質的にKlemm（Methods in Molecular Biology pp．243-254（HumanPress 1984））により記載されたものと した。酢酸ｎ−ブチル抽出工程の後、有機相および水相の両者を真空下で乾燥さ せ、５０μｌの１．０ＭＨＣｌに溶解し、８０℃で１０分間フェニルチオヒダン トイン（ＰＴＨ）誘導体に変換した。エドマン分解により放出されたペプチドを 含む水相をＲＰ−ＨＰＬＣに供した。有機相をＲＰ−ＨＰＬＣ（Klemm、前記） により分析し、放出されたＰＴＨ−アミノ酸の同定を図った。 実施例ＩＶ 結果 蛋白質分解消化：ＢＮＢＤ−１２におけるシステイン対合を確定するために使 用する戦略を図８に概略的にまとめる。残基の番号付けは、最も長いβ−デフェ ンシンを指標している（Selstedら、J．Biol．Chem．（投稿中））。配列を調べ た結果、トリプシンによるＢＮＢＤ−１２の消化により幾つかの蛋白質分解断片 が生成し得ることが示され、その特徴付けによりジスルフィド結合の割当てが可 能となり得る。ジスルフィドが混ぜ合せられる（シャッフルされる）可能性を減 らすために、トリプシンによる消化はｐＨ≦６．４８で行った。 １５ｎｍｏｌのＢＮＢＤ−１２をＴＰＣＫ−トリプシンを用いて４時間消化し 、消化物の半分をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した（図９）。最も遅い溶出ピーク （約８０分）は、その保持時間およびアミノ酸組成により、消化されていないＢ ＮＢＤ−１２であると決定された。３つのトリプシン消化断片（Ｔ−１、Ｔ−２ およびＴ−３）のアミノ酸組成を決定し、一次配列内でのそれらの配置を可能と した（図８）。３０分で溶出したＣ末端のＳｅｒ−Ｔｒｐジペプチド（Ｔ−１） は、アミノ酸分析におけるそのセリン含有量、そのＡ₂₈₀吸光度（図９）、およ びスペクトル走査によって決定された古典的なトリプトファニルのＵＶの特徴に よって容易に同定された（データは示さない、Edelhoch，Biochem．6：1948-195 4（1967））。 断片Ｔ−３のアミノ酸組成により、これは１組のジスルフィド結合したシステ インを含むことが明らかとなった（表１１）。アミノ酸含有量を一次配列と比較 することにより、ＢＮＢＤ−１２におけるＣｙｓ¹⁶−Ｃｙｓ³¹ジスルフィドの割 当てが可能となった（図８）。構成成分のジスルフィド結合したオリゴペプチド を分析することにより、更なる確認が得られた。Ｔ−３の６ｎｍｏｌのサンプル を過ギ酸酸化し、この結果得られる２つのシステイン酸含有ペプチド（Ｔ−３／ Ｐ．Ｏ．−１およびＴ−３／Ｐ．Ｏ．−２）をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（図 １０）、アミノ酸分析によって特徴つけた。表１１および図８にまとめるように 、Ｔ−３／Ｐ．Ｏ．−１およびＴ−３／Ｐ．Ｏ．−２の組成は、Ｃｙｓ¹⁶−Ｃｙ ｓ³¹ジスルフィドの割当てと完全に一致した。 Ｔ−２のアミノ酸組成は、４つのシステイン酸を含む１６アミノ酸のオリゴペ プチドであることを示しており（表１１）、このトリプシン消化断片は、２つの ジスルフィドを維持して含んでいることが示された。Ｔ−２の組成とＢＮＢＤ− １２の配列とを比較することにより、ペプチド鎖中の４つの割当てられていない システインを連結する２つの可能な構造が明らかとなった。図８の一本線の枠で 囲ったこのオリゴペプチドの２つの可能な構造は、４つのシステイン残基のジス ルフィド結合においてのみ異なる。代替的な結合パターンを区別するために、Ｃ ｙｓ³⁸−Ｃｙｓ³⁹ペプチド結合を開裂させ、この結果得られるジスルフィド含有 ペプチドの対合を特徴付け得ることが必要であった。これは、Ｔ−２の１０ｎｍ ｏｌのサンプルを単一サイクルの手動エドマン分解に供することにより達成され た。開裂工程およびＰＴＨ誘導体への酸変換の後に、反応混合物の水相をＲＰ− ＨＰＬＣにより分離した（図１１）。アミノ酸分析により、ＨＰＬＣで精製した 反応生成物の１つ（Ｔ−２／Ｅ−２）が、１ Ｃｙａ、１ Ｓｅｒ、１ Ｇｌｙ 、１ Ａｒｇ、１ Ｐｒｏおよび１ Ｌｅｕを含むことが明らかとなり、これら の条件下ではＰＴＨ−Ｃｙａは回収されなかった。この生成物が放出されること は、Ｔ−２の構造が、図８の一本線の枠の右側に示したものであることを示した 。他の構造が正しいとすると、Ｔ−２／Ｅ−２のアミノ酸分析により１ではなく ２のアルギニンが明らかとなる筈である。エドマン分解工程の他の生成物の特徴 付けによって、Ｔ−２の構造を更に確認した。その全てが予期した組成を有して いた。ａ）Ｔ−２／Ｅ−１は１ Ａｒｇおよび１ Ｃｙｓを含んでおり、ＰＴＨ −Ｃｙｓはアミノ酸分析では回収されなかった。ｂ）Ｔ−２／Ｅ−３は予期した ２ Ｐｒｏ、１ Ｖａｌおよび１ Ａｒｇを含んでおり、過ギ酸酸化によってメ チオニンが破壊された。ｃ）Ｔ−２／Ｅ−４は、ＰＴＨアミノ酸の分析のための ＲＰ−ＨＰＬＣ系（Klemm、同）においてＰＴＨ−Ｇｌｙであると示され、更に エドマン分解反応混合物の有機相の分析により、約８０％のＰＴＨ−Ｇｌｙがこ の相に抽出されたことが示され、他のＰＴＨアミノ酸は検出されなかった。２０ 〜５０分に溶出する多数の小さいピーク（図１１）は、Ｔ−２／Ｅ−２に類似す る組成を有していた。これらは恐らく、エドマン分解反応の際に、または後続す るサンプル処理工程において生ずる酸化生成物を示すものである。 これらを考え併せると、データは、ＢＮＢＤ−１２におけるシステイン結合が 、Ｃｙｓ⁹−Ｃｙｓ³⁸−Ｃｙｓ¹⁶−Ｃｙｓ³¹−、およびＣｙｓ²¹−Ｃｙｓ³⁹（図 ８）であることを示している。他のシステインに富む蛋白質のファミリーについ ては、ＢＮＢＤ−１２について記載したジスルフィド構造が、全てのβ−デフェ ンシンにおいて殆ど確実に保存されている。 実施例Ｖ β−デフェンシンの殺細菌活性 E．coli ML35およびS．aureus 502Aの一夜培養物の１：５００希釈物を、トリ プチカーゼソイブロス（ＴＳＢ）中で振盪しながら３７℃で２．５〜３時間イン キュベートした。細菌を10,000ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、１０ｍＭの 冷リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、冷リン酸緩衝液に再懸濁して １×１０⁷細胞／ｍｌの濃度とした。種々の濃度のＢＮＢＤの溶液を、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中で作製した。細菌検定混合物は、３０μ ｌのリン酸緩衝液、１０μｌ（１×１０⁵細胞）の細菌保存溶液、および５０μ ｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度となる１０μｌのペプチドを含むものとした。３７ ℃で３０分間インキュベートを行い、その後に３０μｌの画分を取出し、１０、 １００および１０００倍に希釈した。それぞれの希釈物の二連の１００μｌサン プルをＴＳＢプレートに広げ、３７℃で１８時間インキュベートした。ダークフ ィールド（Darkfield）コロニーカウンター（キュベック（Quebec））を用いて コロニーを計数した。 添付図面は、５〜０μｇ／ｍｌの４つの代表的なβ−デフェンシンのそれぞれ は、S．aureusに対して同等に有効であり、３０分で投入した生物の約９９．９ ％を殺傷することを示している（図１３）。５０μｇ／ｍｌでは、E．coli懸濁 物は本質的に滅菌されているが、ＢＮＢＤ−３の効力はより低い濃度で最大とな った（図１４）。 実施例ＶＩ β−デフェンシンの殺カビ活性 Candida albicans 16820およびCryptococcus neoformans 271Aを、サバラウド デキストロースブロス（Sabouraud Dextrose Broth，SDB,ディフコ（DIFCO）） 中３７℃でそれぞれ２４時間または数日振盪しながら生育させた。対数期半ばの 生物を取得するために、１．０ｍｌの一夜培養物を５０ｍｌのＳＤＢに接種し、 振盪しながら３時間（C．albicans）または一夜（C．neoformans）インキュベー トした。培養物を10,000ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、１０ｍＭ冷リン酸 緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、冷緩衝液に再懸濁して１×１０⁷細胞／ｍｌの濃 度とした。殺カビ検定検定混合物は、３０μｌのリン酸緩衝液、１０μｌ（１× １０⁵細胞）のカビ保存懸濁物、および０〜５０μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度 となる１０μｌのペプチドを含むものとした。３７℃で６０分間インキュベート を行い、その後に３０μｌの画分を取出し、１０、１００および１０００倍に希 釈した。それぞれの希釈物の二連の１００μｌのサンプルをＳＤＢプレートに広 げ、３７℃で１８時間インキュベートした。プレートは３７℃で１または２日間 インキュベートした。ダークフィールドコロニーカウンター（キュベック）を使 用してコロニーを計数することにより、生存する生物を定量した。 添付図面に示すように、５０μｇ／ｍｌのＢＮＢＤ−３、−４および−１３に より、９９．９％以上のC．albicans細胞が６０分で殺傷された（図１５）。興 味あることに、ＢＮＢＤ−１１はこれらの濃度では完全に不活性であった。 ４つのβ−デフェンシンの内ではＢＮＢＤ−３がC．neoformansに対して最も 効力があったが、５０μｌ／ｍｌではＢＮＢＤ−４および−１３が同等に有効で あった（図１６）。比較すると、ＢＮＢＤ−１１は実質的に一層小さい活性であ った。 実施例ＶＩＩ β−デフェンシンの抗カビ活性 ０．３３％（ｗ／ｖ）サバラウドデキストロースブロス（ＳＤＢ）を含有する １０ｍｌの加温した（４２℃）１％アガロースを、１×１０⁶の対数期半ばのC.a lgicans 16820またはC．neofromans 271Aと共にインキュベートし、接種したア ガロースを９．５ｃｍの方形のペトリ皿に直ちに注いだ。固化したアガロース 中に滅菌した穴（４ｍｍ）を形成し、それぞれのペプチドの５μｌのサンプル（ ０．０１％酢酸に溶解させたもの）をマイクロピペットを用いて穴に投入した。 ペプチドの濃度は０〜３００μｇ／ｍｌで変動させた。プレートを３７℃で３時 間インキュベートし、その時間の後に１０ｍｌの加温した６％ＳＤＢ含有１％ア ガロースで重層した。２４〜４８時間後、それぞれの穴の周りの透明帯を測定し 、β−デフェンシン濃度の関数としてプロットした。両者のカビに対するβ−デ フェンシンの相対活性を添付図面にまとめる（図１７〜３２）。 配列表 （1）一般情報 （i）出願人：セルステッド、マイケル・イー クロー、ジェィムズ・エス （ii）発明の名称：ウシ好中球由来の新規な抗微生物性ペプチド （iii）配列の数：22 （iv）連絡先： （A）住所：ロビンス、バーリナー・アンド・カーソン （B）番地：201ノース・フィギュロア・ストリート （C）市 ：ロサンゼルス （D）州 ：カリホルニア （E）国 ：アメリカ合衆国 （F）ZIP ：90012 （v）コンピュータ読取り可能形式： （A）媒体種類：フロッピーディスク （B）コンピュータ：IBM PC互換 （C）操作システム：PC-D0S/MS-DOS （D）ソフトウェア：Patentin Release #1.0，Version #1.25 （vi）現行出願データ： （A）出願番号：PCT （B）出願日： （C）分類： （viii）代理人／事務所情報： （A）名前：バーリナー、ロバート （B）登録番号：20,121 （C）整理／ドケット番号：5555-208 （ix）通信情報： （A）電話番号：（213）977-1001 （B）ファクシミリ番号：（213）977-1003 （2）配列番号：１ （i）配列の性質： （A）配列の長さ：38アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：SEQ IDNO:１： （2）配列番号：２ （i）配列の性質： 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（D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：SEQ ID NO:19： （2）配列番号：20 （i）配列の性質： （A）配列の長さ：４アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：SEQ ID NO:20： （2）配列番号：21 （i）配列の性質： （A）配列の長さ：36アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）配列の特徴： （A）名前／キー：ペプチド （B）存在位置：（1，2，3，6，7，9，11，13，20，21，28，31，32） のうちの１つ （C）他の情報：／注＝「X=いずれかのアミノ酸」 （ix）配列の特徴： （A）名前／キー：ペプチド （B）存在位置：４ （C）他の情報：／注＝「Y=SerまたはThr」 （ix）配列の特徴： （A）名前／キー：ペプチド （B）存在位置：30 （C）他の情報：／注＝「Z=ProまたはArg」 （xi）配列：SEQ ID NO:21： （2）配列番号：22 （i）配列の性質： （A）配列の長さ：31アミノ酸 （B）配列の型：アミノ酸 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）配列の特徴： （A）名前／キー：ペプチド （B）存在位置：（1，2，4，6，7，8，9，11，12，13，14，16，17，19 ，21，22，23，24，25，26，27，28，29）のうちの１ つ （C）他の情報：／注＝「X=いずれかのアミノ酸」 （xi）配列：SEQ ID NO:22：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ｎ 9455−4Ｃ 37/02 ＡＤＺ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クロー、ジェイムズ エス. アメリカ合衆国 95695 カリフォルニア 州 ウッドランド ハーレー ドライブ 1215

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗微生物活性を有する、実質的に精製されたβ−デフェンシンペプチド。 ２．請求項１記載のペプチドの生物学的に活性な断片。 ３．生理的に許容し得るキャリア中に１以上のβ−デフェンシンペプチドを含 有する薬学的組成物。 ４．β−デフェンシンに特異的に結合する能力を有する抗体。 ５．前記抗体がポリクローナル起源のものである請求項４記載の抗体。 ６．前記抗体がモノクローナル起源のものである請求項４記載の抗体。 ７．請求項１記載のβ−デフェンシンペプチドをコードする核酸配列。 ８．請求項７記載の核酸によりコードされる組換えペプチド。