JPH07503120A - 細菌からの組換えアポリポタンパク質ｅの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌からの組換えアポリポタンパク質Ｅの精製アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ　 （ＡｐｏＥ）　）は、種々のコレステロールおよび脂質含有粒子に関連して血流 中に見出されるタンパク質である。Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ　５ｃｉｅｎｃｅ、２ ４０：　６２２−６３０（１９８８）により代謝におけるアポＥの役割が再検討 され、Ｒａ１ｌｅｆ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、２５７　（８）：　 ４１７１−４１７８　（１９８２）によりヒトアポＥの完全アミノ酸配列が決定 されている。

アポＥの、リポタンパク質受容体、すなわちＬＤＬ受容体およびカイロミクロン 受容体によるリポタンパク質結合および取込みを介在する能力により、血漿アポ Ｅ　（ｐ−アポＥ）は、血漿リポタンパク質代謝の調節およびコレステロールホ メオスタシスの維持における重要な機能を有している。さらなる疫学研究は、血 液−コレスチロールの高いレベルと、遺伝および環境因子の両者に影響されるア テローム硬化性斑の形成による心臓発作との相関を強く示している（Ｍ、　Ｓ、 　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄｌ、Ｌ、Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２ 　：　３４　（１９８６）　）　ｏ外回性アポＥの投与は、血清脂質およびコレ ステロールレベルの調節、並びにアテローム硬化症の予防の助けになり得る。

加えて、アポＥは、損傷しかつ再生しつつある末梢神経の領域において、高レベ ルで産生され、蓄積されている（Ｍ、　Ｊ。

８３：　１１３０　、　Ｐ、＾、Ｄａｗｓｏｎ　亡ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６１：　５６８１（１９８６））。アポＥは、脂質の移動および可 能な再利用、またはミニリンおよび軸索膜の修復、成長並びに維持に深く関わっ ている可能性がある（Ｔ、Ｖｏｇｅｌ　亡１　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　８６９６　（１９８５）　）。

アポＥを含むアポリポタンパク質は、また、免疫調節活性を有することも示され ている（Ｒ，Ｗ、Ｍｘｈｌｅ７　ｅｊ　１１．、Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、２５ ：　１２７７　（１９８４）　；ＲｌＷｏＭａｈｌｅｙ　＆　Ｔ、　Ｌ、　Ｉｎ ｎｅｒａｒｉｔｙ。

Ｂｉｏｃｈｒｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　７３７　、　１９７　（１９８３ ））　、低密度リポタンパク質と同様に、アポＥ含！リポタンパク質は、抗原誘 発性およびマイトゲン誘発性ニリンパ球の活性化並びに増殖を阻害もしくは刺激 する能力を有している（Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌｅ７゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　： 　６２２−６３０　（１９８８））。

しかしながら、アポＥに関連し得る有益な治療効果を試験するに足る量の天然ア ポＥをヒト血液から得ることは不可能である。したがって、動物並びに臨床試験 を実施し、調剤の上で広範囲に利用するに足る量の高純度アポＥを生成する実用 的手段を提供する必要がある。

この発明は、高純度で生物学的に活性な組換えアポリポタンパク質Ｅ　（ｒ−ア ポＥ）を大量に生成する新規精製方法を提供する。この方法は、とりわけ、（１ ）アポＥの凝集および分解、（２）アポＥの活性および不活性型の分離、および （３）内毒素の除去に関わる問題を解決するための、いくつかの新しい特徴を含 む。

三菱化成株式会社に譲渡された欧州特許公報ＥＰ　２０５，７１５には、Ｅ、ｃ ｏｌｉ、酵母およびＣＨＯ細胞におけるアポＥのクローニングが開示されている 。しかしながら、この開示には、極少出のアポＥが産生されたことが示されるの みであり、精製方法は含まれていない。

バイオテクノロジー・リザーチ会パートナーズ社（Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇ７ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐａｒｌｎｅｓ　Ｌｔｄ、　）に譲渡されたＰＣＴ公開Ｗ Ｏ８７０２０６］には、薬剤搬送のためのアポＥの受容体認識ドメインを含む融 合タンパク質の発現が開示されている。この公開は、完全な長さのアポＥ類似タ ンパク質の生成もしくは精製方法を開示してはいない。

バイオテクノロジー・リサーチ・パートナーズ社に譲渡されたＰＣＴ公開ＷＯ８ ７０２０５９には、（アポＥを含む）アポタンパク質の多形とアテローム硬化症 との相関が開示されているが、アポＥを生成もしくは精製する方法は開示されて いない。

三菱化成株式会社に譲渡された日本特許出願ＪＰ　６１０９６９８８には、アポ リポタンパク質Ａ−１アナログのクローニングおよび発現が開示されている。

日本新薬株式会社に譲渡された日本特許出願ＪＰ　６０１６３８２４には、アポ Ｅを含む血清リポタンパク質の静注用薬物担体としての使用が開示されている。

ＪＰ　６０１６３８２４におけるアポＥは、組換え体である源に由来するもので はない。

共に譲渡され、共に係続している米国特許出願８９６．７５０（１９８６年８月 １４日出願）並びに０８５．６５１　（１９８７年８月１４日出願（米国特許出 願８９６．７５０の一部係続出願））には、アポＥの小規模の精製を指向する方 法が開示されている。これらの方法によって製造された組換えアポＥアナログは 非常に純粋ではあるが、工業的生産にスケールアップする適切な方法を開発する 必要があった。さらに、従来製造されたものよりも少ないレベルの内毒素しか含 まないアポＥアナログを製造することが望まれた。特に、米国特許出願８９６． ７５０に開示される方法では、純度が９０％をこえるものの５００．０００〜１ 、０００．０００　ｐ　ｇ／ｍ　ｇの範囲の内毒素レベルを有するアポＥアナロ グが製造される。

米国特許出願０８５．６７５に開示される方法では、全体を通して尿２溶液が用 いられ、フェニル−セファロース、ヘパリン−セファ０−スおよびＤＥＡＥ−セ ファロースカラムを用いるバッチクロマトグラフィーが含まれる。得られるアポ Ｅアナログは純度が９５％を越え、ｍｇ当り２．　ｏｏｏｐ　ｇ未満の内毒素を 含む。尿素を使用することにより、クロマトグラフィ一工程は４℃〜１０°Ｃで 行なう必要がある。これは、尿素が不安定であり、かつ実験を低温で行なわない 限りはアポＥアナログが分解し、凝集する傾向にあるためである。

加えて、米国特許出願０８５６５７におけるクロマトグラフィー法は、夜通しの 撹拌、スケールアップを非常に困難にする条件を含むバッチ法である。得られる アナロ゛グの内毒素レベルは依然高い。

ここに開示される新規方法、すなわち、スキームＩおよびスキーム１１は、アポ Ｅを分解および凝集から保護するためにトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　） を用いる。トリトンＲは、限外濾過およびカラムクロマトグラフィーを室温で行 なうことを可能にする。加えて、このプロセスはバッチ工程を必要としない。し たがって、この方法はスケールアップに適している。

さらに、トリトン１は酸性ｐＨ条件の利用を可能にする。

トリトンＲがない場合には酸性ｐＨ条件ではアポＥアナログが析出するので、こ れは別の利点である。トリトン１を加えることにより、酸性ｐＨ抽出工程によっ てアポＥを増量させ、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用することが可能に なる。

ここに開示される方法によって製造されるアポＥアナログは、非常に純粋であり 、内毒素レベルが非常に低く、すなわち約２５ｐｇ／ｍｇである。したがって、 得られるアポＥアナログは、動物試験に利用することができる。得られるアポＥ アナログは凍結乾燥することができ、次の溶解の際にも依然としてその生物学的 活性を保持している。我々は、凍結乾燥アポＥか非常に安定であることを示して いる。

５ｕｐｅｒｏｓｅ６カラム（ＨＲ１０／３０．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用い る高速（ｌａｓｔ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）サイズ排除クロマトグラフィーに より、アポＥ分子量、純度、および凝集状態を測定した。ｒ−アポＥおよびｐ− アポＥの概要の比較がこの図に示される。パネルＡおよびＢは、２つの異なるｒ −アポＥ２製品、バッチＯ１および０２をそれぞれ表わす。これらのバッチは、 ２種の異なる発酵から生成され、例３に記述される通りに精製した。パネルＣは ｐ−アポＥ調製品を表わし、パネルＤはバッファコントロールを表わす。例３に 記述される通りに調製されたｒ−アポＥの両バッチおよびｐ−アポＥの保持時間 は、それぞれ４１．０．４１．３７、および４１．４０分であった。６７ＫＤ　 （ＢＳＡ）　、３２ＫＤ（ジスムターゼ過酸化物）および２１ＫＤ　（ヒト成長 ホルモン）を含むＭＷ標準検量線から、両ｒ−アポＥおよびｐ−アポＥのＭＷは ダイマー型を示す約６５ＫＤであると確定された。バッチ０１（パネルＡ）に見 られる高ＭＷ　（約５％）のさらなるピークは、この調製品おけるわずかな凝集 を表わしているのかもｒ−アポＥバッチ０１　（Ａ）およびバッチ０２（Ｂ）の ＵＶスペクトルをｐ−アポＥと比較した。３５０−２００　ｎ　ｍの範囲でＵＶ 吸収をａ定し、スペクトルが同一であることが見出された。

図３ニブラスミドｐＴＶＲ５９０−４の生成ｍｅｔ−アポアポナログを熱誘発的 に発現するプラスミドｐＴＶＲ５９０−４がこの図に示され、かつ例１に記述さ れる。

各調製品からの試料を１２．５％ポリアクリルアミド−８ＤＳゲルに塗布した。

レーンＡおよびＡ′はｒ−アポＥ（バッチ０１）を示す；レーンＢおよびＢ′は ｒ−アポＥ（バッチ０２）を示す・；レーンＣおよびＣ′はｐ−アポＥを示す。

Ｃ′を除く全てのし−ンには約２５μｇを載せ、Ｃ−には６μｇを載せた。レー ンＡ、ＢおよびＣは２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を含有する緩衝液を用 いて調製した；レーンＡ−１Ｂ−およびＣ−は２ＭＥを用いずに調製した。電気 泳動の後、ゲルをクーマシーブルー試薬で染色した。ｒ−アポＥおよびｐ−アポ Ｅの主要バンドは、同じような動き方をした。主要バンドの直下に見られる「− アポＥ　（Ａ、、Ｂ）の低分子ｊｉ　（ＭＷ）バンドは、開裂産物を表わす。レ ーンＡ−１Ｂ′およびＣ−（２ＭＥを用いずに塗布した物質）に見られる高ＭＷ バンドは、アポＥのスルフィドリル結合したマルチマー（ｍｕＨｉｍｅｔ）を表 わしている可能性がある。ｐ−アポＥ　（Ｃ）は、主要バンドのわずかに上に、 血漿タンパクのグリコジル化体を表わすさらなるバンドを示す。

発明の要約 この発明は、細菌細胞からのアポＥもしくはそれらのアナログの精製方法であっ て、精製プロセスの間のタンパク凝集および分解が最小である方法を提供する。

この発明の好ましい態様は、細胞ペレットからアポＥもしくはそれらのアナログ を抽出する方法であって、（ａ）アポＥもしくはアナログを産生ずる細菌細胞を 培養し；（ｂ）マグネシウムイオンを含有する緩衝液中でこの細菌細胞の細胞壁 を破壊して溶解物を生成させ；（Ｃ）細胞デブリと溶解物からの不溶性析出物を 分離してアポＥもしくはアナログを含有するペレットを得；（ｄ）分離したアポ Ｅもしくはアナログを含有するペレットを非イオン性清浄剤を含有する溶液で溶 解して可溶化アポＥもしくはアナログを得；（ｅ）アポＥもしくはアナログを濃 縮し、かつ精製するために、可溶化アポＥもしくはアナログを非イオン性清浄剤 の存在下で処理し：および（ｆ）得られた濃縮、精製アポＥもしくはそれらのア ナログを回収することを具備する方法を提供する。

この発明はまた、細菌細胞抽出上清からアポＥもしくはそれらのアナログを精製 する方法を提供する。さらに、この発明は、培養培地に中和脂肪酸、脂肪酸前駆 体、トリグリセリド、トリグリセリド前駆体またはアセテートを添加することに より、細菌ホストにおけるアポＥもしくはそれらのアナログの産生を増加させる 方法を提供する。

発明の詳細な説明 この発明は、組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生ずる、 遺伝学的に処理された細菌細胞から、精製組換えアポＥもしくはそれらのポリペ プチドアナログを得る方法を提供する。この発明の好ましい態様は、組換えアポ Ｅもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生ずる、遺伝学的に処理された細 菌細胞から、精製組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを得る方 法であって、（ａ）組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生 ずるように遺伝学的に処理された細菌細胞を培養し；（ｂ）不溶性組換えアポＥ もしくはそれらのポリペプチドアナログを含有する溶解物を得るために、マグネ シウムイオンの存在下でこの細菌細胞を処理し；（Ｃ）この溶解物から不溶性組 換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを含む不溶性物質を回収し； （ｄ）回収した不溶性物質を非イオン性清浄剤を含有する溶液で処理して可溶化 組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを得；（ｅ）組換えアポＥ もしくはそれらのポリペプチドアナログを濃縮し、かつ精製するために、可溶化 組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを処理し；および（ｆ）得 られた濃縮、精製組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを回収す ることを具備する方法を提供する。

以下、この発明をさらに例示する。

１、アポＥアナログを産生ずる細菌細胞ここで用いられるように、アポＥのアナ ログは天然アポＥと実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、天然アポＥの生物 学的活性を保ちながら１以上のアミノ酸の追加、欠損または置換によってそれと は異なっている。

細菌細胞は、組換えＤＮＡ技術によってアポリポタンパク質Ｅもしくはそれらの アナログをコードするＤＮＡ配列が導入されているいかなる細菌であってもよい 。この細菌は、このＤＮＡ配列を発現し、タンパク産物を生成することか可能で なければならない。

細菌は、栄養要求、原栄養および溶菌（ｌｙｆｉｃ　）株、Ｆ＋およびＦ−株、 λプロファージのｃＩ　リプレッサー配列を有する株およびｄｅｏリプレッサー もしくはｄｅｏ遺伝子が欠失している株を含むいかなる株であってもよい。

野生型Ｅ、ｃｏｌｉ株の例としては、原栄養体ＡＴＣＣＮｏ、　１２４３５およ び栄養要求体ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣＮｏ、　６７３６１　）が挙げられる。

は、プラスミドｐＴＶＲ２７９−８を有する栄養要求体Ａ１６４５（ＡＴＣＣＮ ｏ、　５３２１６　）　、プラスミドＩ）ＴＶ１０４　（２）を有すルＡ１６３ ７　（ＡＴＣＣＮｏ、　３９２８４　）およびプラスミドｐｓＯＤｃｒ２を有す るＡ２０９７　（ＡＴＣＣＮｏ、　３９７８６　）　；並びにプラスミドｐＨ０ ４４（ＡＴＣＣＮｏ、　５３２１８　）を有する原栄養体Ａ４２００　（ＡＴＣ ＣＮｏ、　５３２１８）およびプラスミドｐＨＧ４４を有するビオチン独立Ａ４ ３４６　（ＡＴＣＣＮｏ、　５３２１８　）が挙げられる。

溶菌Ｅ、ｃｏｌｉ株の例としては、プラスミドｐＨ０４４を有するＡ４０４８　 （ＡＴＣＣＮｏ、　５３２１７　）が挙げられる。

Ｆ−株の例と１．ては、ＡＴＣＣＮｏ、　６７７０３として寄託されているプラ スミドｐ　Ｍ　Ｆ　５５３４を有するＳφ９３０　（Ｆ）およびＡＴＣＣＮｏ、 　６７７０６として寄託されているプラスミドｐＥＦＦ９２０を７３２　（ＡＴ ＣＣＮｏ、６７３６２　）　、プラスミドｐＪＢＦ５４０１を有するＳφ５４０ 　（ＡＴＣＣＮｏ、６７３５９　）およびプラスミドｐＥＦＦ９２０を有するＳ φ９３０　（ＡＴＣＣＮｏ、６７７０６　）を挙げることができる。

よって記載されるエチジウムブロマイド法によって、それらが有するプラスミド を“矯正”することができる。

細菌細胞は、プラスミドのようなベクターＤＮＡ分子本体にアポＥもしくはアナ ログをコードするＤＮＡ配列を有していてもよい。ベクターもしくはプラスミド は、アポＥをコードする配列が分子の適切な位置に組み込まれるように組換えＤ ＮＡ技術によって構築される。

アポＥアナログ産生に用いられるプラスミドは、λプロモーターもしくはｄｅｏ プロモーターのような種々のプロモーターを有していてもよい。

アポＥアナログの産生に用いることができるプラスミドの中には、以下のものが 含まれる： Ａ、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１２４３５　（ＡＴＣＣＮｏ、　６７３６０　）に保存 されているプラスミドｐＴＶＲ５９０−４、 Ｂ、　Ｅ、ｃｏｌｉＡＩ６４５　（ＡＴＣＣＮｏ、　５３２１６　）に保存され ているプラスミドｐＴＶＲ２７９−８、 Ｃ，Ｅ、　ｃｏｌｉＡ１６４５　（ＡＴＣＣＮｏ、　３９７８７　）に保存され ている、上記プラスミドもしくはプラスミドｐＡｐｏＥ−Ｅｘ２由来のあらゆる プラスミド、 Ｄ、アポＥを発現する他のプラスミド。

２、アポＥアナログを発現する細胞の発酵状々は、アポＥアナログを発現する細 菌細胞が、アポＥ誘発の直後に、細胞の溶解を引き起こす“毒効果”を受けるこ とを見出した。我々は、（１）脂肪酸類、例えばプロピオン酸ナトリウム、ｎ− 酪酸（中和）、β−ヒドロキシ酪酸（中和）およびグリセロース；　（ｉｉ）　 ）リグクセリド類、例えばト°リセチン、トリプトリンおよびトリカブリリン； 　（ｉｉｉ）　）リグリセリド前駆体、例えばｌ−モノ−ミリストール−１ａｅ −グリセロース、■−モノパルミチルーＩａｃ−グリセロールおよびＤＬ−α− ヒドロキシイソバレル酸および（ｖｉ）脂肪酸前駆体酢酸ナトリウムを含む中和 脂肪酸、トリグリセリドもしくはグリセリド前駆体のようなアポＥもしくはそれ らのアナログのタンパク分解性消化の阻害剤を培養培地に添加することにより、 この“毒効果″からのホスト細菌細胞の保護が達成されることを発見した。酪酸 、β−ヒドロキシ酪酸、プロピオン酸および酢酸ナトリウムが好ましく、酢酸ナ トリウムが特に好ましい。

上述のホスト細胞の保護は、出願人が、以前に開示された（共に譲渡され、共に 係続している米国出願０８５．６５１を参照）短い（１５分）誘導期間の代わり に４２℃で長い（３時間）誘導期間を用いることを可能にし、工業生産のための 発酵プロセスのスケールアップを容易にした。

理論によって結び付けられることを望むものではないが、我々はこれらの結果を 説明するために以下の原理を提示する。

アポタンパク質は、脂質および脂質含有成分と相互作用することが知られている 。′毒効果”は、アポＥと細菌細胞膜との相互作用、または膜束合成に重要な前 駆体の結合によって説明することができる。この理由付けが正しいのであれば、 脂肪酸、脂肪酸前駆体、トリグリセリドもしくはグリセリド前駆体のような化合 物は細胞に侵入し、アポＥもしくは他の細胞成分と結合し、その結果アポＥ毒性 を妨げると仮定する胞は保護される。

我々はまた、前述の化合物およびＥＤＴＡにより、タンパク分解消化からアポタ ンパク質が保護されることも見出した。

３、細胞破壊 驚いたことに、我々は、培地への脂肪酸の添加が細胞性タンパク質分解酵素によ る分解からアポＥアナログを保護することを見出した。これは、例７に記載され る通りのイン・ビトロ・インキュベーション研究によって確認され、これにより 、細胞を破壊する間、このような物質を緩衝液に添加することが決定された。β −ヒドロキシ酪酸、酪酸またはｎ−カプロン酸（全て中和されたもの）がアポＥ アナログのタンパク分解の阻害剤として好ましく、コストおよび簡便さの理由か らβ−ヒドロキシ酪酸塩（ナトリウム塩）が特に好ましい。

組換えアポＥアナログを有するＥ、ｃｏｌｉ細胞を回収し、二価陽イオン、好ま しくはマグネシウムイオン（１０〜ＩＱＯｍＭ）および濃度０，１〜１％のβ− ヒドロキシ酢酸塩のようなアポＥのタンパク分解の阻害剤を含有する緩衝液中で 破壊した。

あらゆる細胞破壊法、例えば、超音波、ガラスピーズ粉砕（Ｄｙｎｏｍｉ　ｌ　 ｌ）または圧力による破裂（Ｇａｕｌｉｎ　ホモジナイザー）を用いることがで きる。これらの条件下において、上記アポＥアナログは細胞デブリと共に析出し 、遠心分離により大部分の可溶性細胞質成分から分離される（スキームＩおよび 例３参照）。

これに代わるこの発明の側面では、上清からのアポＥアナログの生成が記述され る。緩衝液がマグネシウムイオンを含有しないことを除いて、上述の通りに細胞 を破壊する；その代わり、緩衝液にはＥＤＴＡのようなキレート剤が含まれる。

４、アポＥの抽出 アポＥアナログを含有するベレットを非イオン性清浄剤を含有する緩衝液に懸濁 する。好ましくは、非イオン性清浄剤は、エマルフオゲンＲ（Ｅｍｕｌｐｈｏｇ ｅｎＲ）　−ＢＣ７２０（Ｓｉｇｍａ　）またはトリトン”　Ｘ−１００（Ｍｅ ｒｃｋ　）　、以下トリトン又と称する、の商品名で市販されているｐ　Ｅ　Ｇ 　（９−１０）　ｐ−トオクチルフェノールである。トリトン又は、濃度０．０ ５〜１％、好ましくは０．３％、ｐＨ３，０ないし９．０、好ましくは３．０な いし５．０で用いられる。これらの条件下で、アポＥアナログはベレットから選 択的に抽出され、分解および凝集の形成から保護される。この抽出物をｐＨ７， ５に中和し、限外濾過する。

限外濾過に先立ち、上清溶液を濾過して濁りを除去する任意の工程がある。これ は、特に、多量の試料（１５Ｋｇ細菌ケイク）で行なわれる。好ましいフィルタ ーは、Ｃｕｎｏ　Ｉｎｃ、。

Ｉｎｄｕｓｊｒｉａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　４００　Ｒ１５ｅ ａｒｃｈ　？ｒｋｗａ７゜Ｍｅｒｉｄ！ｎ、　ＣＴ　０６４５０．　Ｕ、Ｓ、Ａ 、の０．１〜１．０ミクロン深さのフィルターｕｆａ　ｐｌｕｓ　５０　ＳＰで ある。

５、限外濾過 アポＥアナログにフィルターを通過することを許さない約１００にのカットオフ ポイントを有する適当な限外濾過法をアポＥアナログの分画に用いることができ る。そのような方法の例として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのペリコン争カセット・シ ステム（？１ｌｉｃｏｎ　ｃｘｓｓｅＮｅ　ｓｙｓｔｅｍ）　（好ましイシステ ム）マタハ＾ｍ１ｃｃｎの中空ファイバーシステムを挙げることができる。

以下の全ての精製工程において、非イオン性清浄剤、例えば、エマルフォゲン　 もしくはトリトンＲ１好ましくはトリトン１が０．０５〜１％の濃度で新規に加 えられる。トリトン８の存在下では、アポＥは膜を横切らない。これは、低分子 量成分から分離され、次の精製工程の平衡緩衝液に対して透析される。

この工程においてはいかなる弱陰イオン交換クロマトグラフィー法をも用いるこ とができるが、ＤＥＡＥ−セファロース・ファースト・フロー（Ｐｈａｒｍａｃ 目）が好ましい。弱陰イオン交換カラムは、通常、官能基として第三アミン（ジ アミノエチル）を有しているが、アミノエチルもまた可能である。

マトリックスは、無機化合物、合成樹脂、多糖、もしくはを機ポリマーをベース とすることができる。可能な物質は、アガロース、セルロース、トリサクリル、 デキストラン、ガラスピーズ、オキシランアクリルビーズ、アクリルアミド、ア ガロース／ポリアクリルアミド共重合体（Ｕｌｊｒｏｇｅｌ）もしくは親水性ビ ニルポリマー（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　）である。

前工程からの残留溶液を、ｐＨ７〜８の範囲、好ましくはｐＨ７，５の緩衝液、 好ましくはトリス緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥセファロースカラムを用いるクロ マトグラフィーにかける。塩溶液、好ましくは塩化ナトリウム溶液でアポＥアナ ログがＤＥＡＥカラムから溶出する。

ＤＥＡＥカラムから溶出したアポ８画分は、同じ条件下で分析した場合、ヒト血 漿からのアポＥと同じ分子量を有している。この両分を、次のカラムの充填に用 いられる緩衝液で、第４セクシヨンにおいて上述した通り　１００Ｋメンプラン を用いる限外濾過透析により、透析して平衡にする。

Ｂ）Ｑ−セファロース この工程においては、いかなる強陰イオン交換（例えば、第四アミン）法をも用 いることができるが、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　）が好ましい。このイオン交換カラムの官能基は第四アミノエチルのような いかなる第四アミノ基でもよく、マトリックスはバラグラフ（Ａ）で挙げられた いかなるマトリックスでもよい。前工程からの透析した試料を、０．１〜０．５ ％の濃度範囲のトリトン１、好ましくは０．２％トリトン１を含有するトリス緩 衝液で平衡にしたＱ−セファロースカラムに載せる。低塩濃度（ｌｏＯｍＭＮａ Ｃ，Ｑまで）で、血漿アポＥと同じｐＩを有する低レベルの内毒素を含む活性ア ポＥ画分が溶出し、これをより高い塩濃度（超２００ｍＭ　ＮａＣΩ）で溶出す るアポＥの不活性画分から分離する。

溶出したアポＥの活性画分を、第４セクシヨンにおいて上述した通り　１００Ｋ メンプランを用いる限外濾過透析により、次のカラムの充填に用いる平衡緩衝液 に対して透析する。

Ｃ）ＣＭ−セファロース この工程においては、いかなる陽イオン交換（例えば、カルボキシメチル）法を 用いることもできるが、ＣＭ−セファロース・ファースト争フロー（Ｐｈａｒｍ ａｃ目）クロマトグラフィーが好ましい。官能基は、カルボキシメチル、ホスホ 基もしくはスルホプロピルのようなスルホン基であってもよい。

可能なマトリックスは、上記バラグラフ（Ａ）で列挙されている。透析された試 料を、０．２％トリトン１を含有するｐＨ４，０〜６．０、好ましくはｐＨ４， ８〜５．２の酢酸ナトリウム緩衝液で平衡にしたＣＭ−セファロースカラムを用 いるクロマトグラフィーにかけ、次いで０．０５％トリトンＲを含有する緩衝液 で洗浄し、溶出する。この工程は、アポＥから内毒素を除去し、非常に低い内毒 素レベル、アポＥアナログｍｇ当り内毒素１１００ｐ未満、通常ｍｇ当り約２０ ないし５０ｐｇとすることを可能にする。加えて、この工程は、トリトン１の濃 度を０，０５％に減少させる。

トリトン１は、　１００にメンプランを用いる限外濾過透析により上述の試料か ら除去される。上述のように、１００Ｋのカットオフポイントを有する限外濾過 法を用いることができる。

アポＥ濃度０．５ｍｇ／ｍｌないし２ｍｇ／ｍｌおよび臨界ミセル濃度未満のト リトン　濃度で、トリトンＲを含有しない緩衝液に対して透析を行なう。

トリトンＲ除去工程中、支配的でなければならない３つの条件がある。詳細は例 ３Ｇに記載されている。これらの条件は、アポＥを非凝集形態に保ちながらトリ トン１を素早く除去することを可能にする。その後、精製されたアポＥアナログ を凍結乾燥し、次に再溶解した際に生物学的活性を完全に回復することが可能で ある。

上述の方法の工程（ａ）の好ましい態様において細菌細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌｉであるが、他の細菌細胞を用いることもできる。さらに、同じ好 ましい態様において、工程（ｂ）では細胞壁を機械的に破壊する。さらにまた、 工程（ｃ）における溶解物からの細胞デブリおよび不溶性析出物の分離は遠心を 含むが、他の分離法を用いることもできる。加えて、上述の好ましい態様におい て用いられる非イオン性清浄剤はトリトン１であるが、他の非イオン性清浄剤を 用いることもできる。

上述の方法の工程（ｄ）の好ましい態様において、アポＥもしくはアナログの濃 縮および精製に用いられる処理工程には限外濾過が含まれるが、これは硫酸アン モニウム沈殿、透析、凍結乾燥または遠心のような他の濃縮および濾過方法で置 き換えるか、あるいは補うことができる。さらに、限外濾過では、分子ｆｉｌＸ １０５ダルトン未満の成分が除去される。さらにまた、工程（ｅ）の処理の好ま しい態様にはクロマトグラフィーが包含され、最も好ましくはイオン交換クロマ トグラフィーである。最も好ましい態様には、樹脂に結合した第三アミンリガン ドを含むイオン交換クロマトグラフィーが包含される。クロマトグラフィ一工程 の後、得られた濃縮、精製アポＥもしくはアナログを透析し、残留物を保存する 。得られた濃縮、精製アポＥもしくはアナログを含有するこの残留物は、他のク ロマトグラフィ一工程、好ましくは樹脂に結合した第四アミンリガンドを含むク ロマトグラフィーを用いてさらに濃縮、精製される。クロマトグラフィ一工程に 続いて、得られた濃縮、精製アポＥもしくはアナログを透析し、残留物を保存す る。

得られた濃縮、精製アポＥもしくはアナログを含有する残留物は、樹脂に結合し たカルボキシメチルリガンドを含むイオン交換クロマトグラフィーによってさら に濃縮、精製する。

好ましい方法の工程（ｆ）における濃縮、精製アポＥｂしくはアナログの回収に は限外濾過が包含される。この限外濾過は、分子ｆＩＬｌ×１０５ダルトン未満 の分子を除去する。

この発明はさらに他の方法を提供する。この方法は、遺伝学的に処理された細菌 細胞から精製された組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを得る 方法であって、（ａ）組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産 生ずるように遺伝学的に処理された細菌細胞を培養し；（ｂ）可溶性組換えアポ Ｅもしくはそれらのポリペプチドアナログを含有する溶解物を得るために、ＥＤ ＴＡの存在下でこの細菌細胞を処理し；（Ｃ）この溶解物から可溶性組換えアポ Ｅもしくはそれらのポリペプチドアナログを含む溶液を回収し；（ｄ）回収した 溶液を非イオン性清浄剤を含有する溶液で処理して可溶化組換えアポＥもしくは それらのポリペプチドアナログを含有する第２の溶液を得；（ｅ）組換えアポＥ もしくはそれらのポリペプチドアナログを濃縮し、かつ精製するために、組換え アポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを含有する第２の溶液を処理し： および（１）得られた濃縮、精製組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドア ナログを回収することを具備する方法である。

上清からのアポＥアナログの抽出は、ペレットからの抽出のための記述に類似し ているが、以下の点に注意すべきである： １）トリトンＲを用いる抽出は、好ましいｐＨが４．０〜４．５であることを除 いて同様である。

１１）限外濾過は上述の通りであり、同じ機能を果たす。

酉ｉ）　Ｄ　Ｅ　Ａ　ＥセファロースクロマトグラフィーＤＥＡＥセファロース （弱陰イオン）クロマトグラフィーはアポＥアナログを２つの画分に分離する。

低塩濃度（約８０ｍＭＮａＣΩまで）では、血漿アポＥと同じｐＩを有する低レ ベルの内毒素を含む活性アポＥ画分が溶出し、高塩濃度（約１５０ｍＭ　ＮａＣ Ω）で溶出する高レベルの内毒素を含むアポＥアナログの不活性画分から分離さ れる。このため、弱陰イオンＤＥＡＥ−クロマトグラフィ一工程は、スキーム１ ！において、スキーム■におけるＱ−セファロース工程と同この工程においては 、アポＥに結合する官能基を用いるいかなるアフィニティ交換りロマトグラフィ ー法をも利用することができ、例えば硫酸デキストランもしくは硫酸コンドロイ チンがあるがヘパリンが好ましい。使用されるマトリックスは、ペレットからア ポＥを精製するための上記第６セクシヨンに列挙したマトリックスのいずれであ ってもよい。しかしながら、セファロースが好ましいマトリックスである。トリ トン１を含有する緩衝液は、６．５ないし９．５のｐＨ範囲であればよいが、ア ポＥアナログのより高いローディングキャバンティ（ｌｏａｄｉｎｇ　Ｃａｐａ ｃｉｆｙ）が得られるという理由から約７．０のｐＨが好ましい。この工程は、 ）：、ｃｏｌｉタンパク不純物および内毒素を除去して、内毒素を非常に低いレ ベル（約６０ｐ　ｇ／ｍ　ｇ）にする。

これらの工程は、ペレットからのアポＥの精製の好ましい態様と同様の目的およ び同様の条件下での操作を有する。

細菌細胞上清からのアポＥもしくはそれらのアナログを精製するための上記方法 の好ましい態様において、工程（３）における細菌細胞は好ましくはＥｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉであるが、他の細菌を用いることもできる。工程（ｂ） において、細胞壁は例えば機械的に破壊される。さらに、工程（Ｃ）における細 胞上清からの細胞デブリおよび不溶性沈殿の分離は遠心を包含するが、他の分離 法を用いることもてきる。加えて、細菌細胞上清からのアポＥもしくはそれらの アナログを精製する方法全体を通して利用される非イオン性清浄剤は、好ましく はトリトン１である；その代わりの非イオン性清浄剤はエマルフォゲンＲである 。さらに、工程（ｄ）においてアポＥもしくはアナログを濃縮し、精製する処理 は、好ましくは限外濾過を包含するが、他の濃縮および濾過方法を用いることも できる。限外ａ過は、分子ｆｊｋ　ｌＸＩＯ３ダルトン未満の分子を除去する。

さらに、工程（Ｓ）における処理の好ましい態様にはクロマトグラフィーが包含 され、最も好ましくはイオン交換クロマトグラフィーが包含される。最も好まし いイオン交換体（ｅｘｃｈａｎｇｅｒ　）は、樹脂に結合した第三アミンリガン ドである。クロマトグラフィ一工程に続いて、得られた濃縮、精製アポＥもしく はアナログを透析し、残留物を保存する。得られた濃縮、精製アポＥもしくはア ナログを含有する残留物は、好ましくは、最も好ましいアフィニティ交換体が樹 脂に結合したヘパリンリガンドであるアフィニティ交換クロマトグラフィーによ ってさらに濃縮および精製される。得られた濃縮、精製アポＥもしくはアナログ を透析し、残留物を再び保存する。より濃縮され、精製されたアポＥもしくはア ナログを含有する残留物を、好ましくは、最も好ましい陽イオン交感体が樹脂に 結合したカルボキシメチルリガンドである陽イオン交換クロマトグラフィーによ ってさらに濃縮、精製する。さらにまた、工程（ｆ）における濃縮され、精製さ れたアポＥもしくはアナログの回収には、分子ｉｌ×１０５ダルトン未満の分子 を除去する限外濾過が包含されるが、他の濃縮および濾過方法を用いることもで きる。

加えて、この発明は、上記方法によって生成されたアポＥもしくはそれらのアナ ログおよび適切な担体を含む組成物を提供し、また、化学療法剤もしくは放射線 療法剤もしくは放射線診断剤に物理的に結合しているか、あるいはこれらを含有 するアポＥと適切な担体とを含む組成物を提供する。

さらに、この発明は、アテローム硬化症に罹患した患者の治療法であって、この 患者に、アテローム硬化症と戦うに有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログ を投与することを包含する方法を提供する。ここで用いられる場合には、アテロ ーム硬化症は、脂質、炭水化物複合体、血液および血液産物、線維組織、および カルシウム沈積の巣状蓄積からなり、内側の変化に関連する動脈内膜における変 化の種々の組み合わせを意味する。

加えて、この発明は、コレステロール代謝が損なわれることにより引き起こされ る高コレステロール血症に罹患した患者の治療方法であって、高コレステロール 血症を緩和し、それにより患者を治療するために、コレステロール代謝を正常化 するに有効な墓のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含 する方法を提供する。ここで用いられる場合には、高コレステロール血症は、血 中のコレステロール過剰を意味する。

この発明は、さらに、脂質代謝が損なわれることにより引き起こされる高すポタ ンパク質血症に罹患した患者の治療方法であって、高すポタンパク質血症を緩和 し、それにより患者を治療するために、脂質代謝を正常化するに有効な量のアポ Ｅもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含する方法を提供する。

ここで用いられる場合には、高すポタンパク質血症は、血中のりボタンバク質過 剰を意味する。

加えて、この発明は、神経に損傷を受けた患者の治療方法であって、神経の成長 および再生を促進するに有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投 与することを包含する方法を提供する。

さらにまた、高レベルのＬＤＬ受容体を有する腫瘍を患う患者の治療方法であっ て、腫瘍の治療に有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与する ことを包含し、前記アポＥもしくはそれらのアナログは化学療法剤もしくは放射 線療法剤を含有するが、あるいはこれらに物理的に結合している方法を提供する 。

加えて、この発明は、患者のＬＤＬ受容体欠乏の診断方法であって、ＬＤＬ受容 体の定量に有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを 包含し、前記アポＥもしくはそれらのアナログは放射線診断剤を含有するが、も しくはこれに物理的に結合している方法を提供する。

さらに、この発明は、腫瘍が高レベルのＬＤＬ受容体を有している患者の腫瘍増 殖の一次もしくは二次部位の診断方法であって、腫瘍を可視化するに有効な量の アポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含し、前記アポＥも しくはそれらのアナログは放射線診断剤を含有するが、もしくはこれに物理的に 結合している方法を提供する。

さらにまた、この発明は、患者の自己免疫疾患の治療方法であって、患者を治療 するに有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含 する方法を提供する。

さらにまた、この発明は、免疫不全疾患を患う患者の治療方法であって、患者を 治療するに有効な量のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを 包含する方法を提供する。

加えて、この発明は、アポＥもしくはそれらのアナログを含む脂質乳剤であって 、アポＥもしくはそれらのアナログがリガンドである脂質乳剤、およびこの脂質 乳剤の薬物搬送および標的組織への誘導（ｔｉｓｓｕｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ） への使用を提供する。

この発明は、さらに、細菌ホストにおけるアポＥもしくはそれらのアナログの産 生を、中和脂肪酸類、脂肪酸前駆体類、トリグリセリド類、トリグリセリド前駆 体類および酢酸塩からなる群より選ばれる化合物の有効量をホストが増殖する培 地に添加することにより増加させる方法を提供する。この発明の好ましい態様に おいて、中和脂肪酸は、プロピオン酸ナトリウム、ｎ−酪酸、β−ヒドロキシ酪 酸またはグリセロールである。この発明の他の好ましい態様において、トリグリ セリドはトリアセチン、トリプトリンまたはトリカプリリンである。この発明の さらに好ましい態様において、トリグリセリド前駆体は、１−モノミリストール −Ｉａｃ−グリセロール、１−モノパルミチルー１ａｃ−グリセロールまたはＤ Ｌ−α−ヒドロキシイソ吉草酸である。この発明の最も好ましい態様において、 添加される化合物は、濃度的０．１％〜１％、好ましくは約０．５％の酢酸塩、 好ましくは酢酸ナトリウムである。培養物における脂肪酸、トリグリセリドもし くはグリセリド前駆体の好ましい濃度は約０．１％〜０．５％であり、好ましい 濃度は約０．２％である。

最後に、この発明は、溶液中のアポＥタンパク質を、この溶液に中和脂肪酸類、 脂肪酸前駆体類、トリグリセリド類、トリグリセリド前駆体類、酢酸塩およびＥ ＤＴＡからなる群より選択される化合物の有効量を添加することにより、分解か ら保護する方法を提供する。この発明の一態様において、溶液に添加された有効 量の化合物は、溶液中の化合物濃度を約０．１％ないし０．５％、好ましくは約 ０．２％とする。

この発明の方法は、以下の実験および実施例を参照することによりさらに理解さ れるであろう。これらの実験および実施例は、説明を目的として提供されるもの であり、いかなる意味においても、請求の範囲によって規定されるこの発明の範 囲を限定するものとして解釈されるものではない。

アポＥアナログｍｅｔ−アポＥの生産に使用される好ましいホストベクターシス テムは、プラスミドｐＴＶＲ５９０−４を宿しているＥ、ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣＮ ｏ、　１２４３５であり、図３に示されるこのホストベクターシステムはＲｏｃ ｋｙｉｌｌｅ、　Ｍａ【ｙｌａｎｄにあるアメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ寄託番号６７３６０の下に寄託されている。

下記に記載されているプラスミドｐＴＶＲ５９０−４の構築は、共同譲渡共同係 続特許出願、ＥＰＯ公報番号３０３，９７２　（実施例１１および図２７）に完 全に記載されている。プラスミドｐＴＶＲ５９０−４は下記の要素を包含してい る。

ａ）複製起源 ｂ）反時計方向のＡｍｐＲ遺伝子 Ｃ）時計方向および５′から３′の順に、先端切除型」二Ｐ１プロモータ配列お よびラムダＣ１８５７温度感応性リプレッサコード配列。

ｄ）反時計まわり方向、および５′から３′の順にラムダプロモータ、ベータラ クタマーゼプロモーターリポソーム結合部位、コード配列、アポＥアナログ、お よびＴ、Ｔ、転写終止配列 このプラスミドは、構成的に発現される、やはりプラスミド上に位置するＣ１８ ５７温度感応性リプレッサによって温度誘導で制御されるバクテリオファージ　 ラムダの左方向の強力プロモータ（ＰＬ）の制御下で、アポＥアナログ蛋白を高 度に発現する。本プラスミドからのアポＥアナログ蛋白の生産は４２℃での熱誘 導によってのみ起こる。

ラムダ７８５７遺伝子がホストＥ、ｃｏｌｉ染色体に予め挿入されていることと は無関係に、プラスミドは温度に誘導されてｍｃｆ−アポＥアナログを生産でき るので、これはいわゆる「ホストインデペンデント」発現システムである。それ ゆえ、このプラスミドは、広範多種のホストバクテリア細胞をトランスフオーム する為に使用される。記載したホストＡＴＣＣＮｏ、　１２４３５は、ＡＴＣＣ コレクションから自由に得られるＥ、ｃｏｌｉの原栄養野生株である。

の製造 Ｅ、ｃｏｌ肋＜製造するアポＥアナログの発酵についての下記記載は、アポＥア ナログを含む細胞ケイクの製造にとって好ましい具体例である。

１、シードフラスコ開発 Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃｃ　Ｎｏ、　１２４３５　／ｐＴＶＲ５９０−４（実施例１ ）を含む凍結バイアルの内容物を使用して、下記培地を含むシードフラスコに播 種する。

燐酸第二水素カリウム　９ｇ 燐酸二水素カリウム　１ｇ 塩酸ナトリウム　５ｇ リン酸マグネシウム・７Ｈ２００，２ｇ塩化アンモニウム　１ｇ クエン酸鉄アンモニウム　０．０１ｇ 微量成分溶液　１ｍｌ 微量成分ストック溶液： 硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ１ｇ 硫酸亜鉛・７Ｈ２０２，７８ｇ 塩化コバルト−６Ｈ２０２ｇ 四酸化モリブド二ナトリウム　２ｇ 塩化カルシウム　３ｇ 硫酸銅　１．８５　ｇ オルト硼酸　０．５　ｇ 濃縮塩酸　１００ｍＬ 脱イオン水　９００ｍＬ 他の培地成分をオートクレーブした後、滅菌した濃縮貯蔵溶液からグルコースお よびアンピシリンが加えられる。培地はロータリーシェーカーで２５０ｒｐｍで 一晩、３０℃でインキュベーションし、Ｏ，Ｄ、６６０３．５−５．５に到達す る。

２、シード発酵器 シードフラスコの内容物を使用して、リットル当り下記成分を含む２５−３ＯＬ の生産培地を含んでいる５０Ｌのシード発酵器に播種する。

燐酸第二水素カリウム　８ｇ 燐酸二水素カリウム　２ｇ クエン酸鉄アンモニウム　０．０２ｇ 塩化カルシウム−２Ｈ２００，０４ｇ 硫酸第二カリウム　０．　６　ｇ 微量成分溶液（セクション１に準ず）３ｍＬ消泡剤（５ｉｌｉｃｏｌａｐｓｅ　 ５０００）　２　ｒｎＬ滅菌後添加（培地１リットル当り） 硫酸マグネシウム・７Ｈ２００，４ｇ アンピシリンナトリウム　０．１　ｇ グルコースはバッチで播種時に添加される；成育の間、ｐＨ制御（設定ポイント はｐＨ−７，０）のためにアンモニアが自動的に添加される。

生育のため、培地は３０℃で１５−２０時間で培養され、この間に、０．　Ｄ、 　６６０は通常２０−３０に到達する。これは７．５−１２ｇ／Ｌの乾燥細胞重 量（ＤＣＷ）に相当する。

３、生産発酵器 シード発酵器について記載したように（ただしアンピシリンは除いて）、シード 発酵器の内容物を使用して、約３６ＯＬの生産培地を含む７５０Ｌの（額面Ｊｉ ）の発酵器に播種する。

１培地は３０℃で０．０．　ｂｂｏ値１０が得られるまで培養される。発酵器の 温度を４２℃にあげることで、アポＥアナログ発現が誘導される。誘導の際、下 記の物が発酵器に添加される。

ＤＬ−メチオニン　０．６ｇ／培地り 酢酸ナトリウム　５　ｇ／培地り 酢酸ナトリウム（０，１％−１％）が、アポＥアナログによって惹起される「毒 性効果」から細胞を保護するために添加される。

発酵温度は３時間４２℃に保持され、３時間後に細胞が採取される。採取時の細 胞懸濁液の０．　Ｄ、　ｂｂｏ値は通常１６−２０で、その容量が４００−４３ ＯＬ　、　ＤＣＷは５．０−６．５　ｇ／Ｌである。

４．細胞の採取 細胞懸濁液がＣＥＩ’＾１０１管状ボウル遠心分離機で、供給速度２５ＯＬ／ｌ ｕで、１４．０００＋ｐｍ　（１６，０００ｇ）で遠心分離され、１０Ｋｇ細胞 ケイクが生産され、保存される。あるいは細胞懸濁液を５０ＯＬ／ｌｕで、Ｗｅ ｓｌｆａｌｉａ　Ｃ３Ａ−１９連続遠心分離機中で遠心分離する。スラッジはす ぐに粉砕されるかまたは凍結される。

両方とも、上澄液は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される 検出可能なアポＥアナログを含んでいない。

下記方法は工業的利用のためのスケールアップに適し、非常に純粋なアポＥアナ ログを生産する。流下工程（スキーム１）の一般的概要は下記のように工程Ａか らＧより構成される。

Ａ、マグネシウムイオン存在下での細胞破砕Ｂ、トリトン２による細胞ペレット の抽出Ｃ，１００Ｋ　限外濾過 り、ＤＥＡＥクロマトグラフィ Ｅ、Ｑ　セファロース　りロマトグラフィＦ、ＣＭ　セファロース　りロマトグ ラフイＧ、１００Ｋ限外濾過−トリトン１除去アポＥアナログ精製工程の詳細を 述べた下記例は、３Ｋｇ細胞細胞ライク用している例である。更に、下記に述べ る方法を使用して、使用される装置規模のスケールアップをはかることを含めた 変更をほんの少し施して、１５Ｋｇの細胞ケイクを成功裡にプロセスした。

工程ＡからＤはバクテリアのケイク、各々１．５Ｋｇ２バツチ、で行われた。工 程りの後、２バツチは併合され、工程ＥからＧまで１バツチで処理された。工程 Ａ、Ｂ、Ｃ，は、他に指示のない限り４−１０℃で行われた。他の全ての操作は 室温で１．５Ｋｇの湿った細胞ケイクを、５０　ｍＭ　ｔｒｉｓ／ｌ［ｃｌ、３ ０　ｍＭＭｇＣｈ　、０．２５％ベータヒドロキシ酪酸ナトリウム塩、ｐＢ−７ ，５（ベータヒドロキシ酪酸ナトリウム塩はプロテアーゼ阻害剤として添加する ０例７参照）からなる６Ｌの緩衝液Ａに懸濁させた。次に、これをＫｉｎｅｍａ ｌｉｃａホモジナイザを使用してホモジネートし、７．５Ｌのホモジネートを作 成した。次ぎに、Ｄｙｎｏｍｉｌｌ　ＫＤＬ　ビーズミル破砕機（Ｗｉｌｌｙ　 Ａ、Ｂａｃｈｏｆｅｎ。

Ｂａ５ｅｌ　）を使用して５Ｌ／ｈｒ（２サイクル）で破砕が行われた。

その結果得られた懸濁液を緩衝液Ａを使用して二倍に希釈し、容Ｊｉｉ２２．５ Ｌが生産された。細胞溶解物は、約６ｇアポＥアナログ、すなわち最初のバクテ リアケイクＫｇ当り４ｇアアポアナログを含んでいた。

次に、連続ＣＥＰＡ−４１管状ボウル遠心分離機（Ｃａｒｌ　Ｐａｄｂｅｒｇ、 Ｌａｈｒ／Ｓｃｈｗａｒｚｗａｌｄ）で供給速度９　Ｌ／ｈｒ、　２０．００Ｏ ｒｐｍ（１７，０００ｇ）で遠心分離が行われた。重量的７００ｇで不溶解アポ Ｅアナログを含むペレットを採りよけて、上澄液は捨てられた。（アポＥはマグ ネシウムイオンが存在しているため不溶解性であることに注意） 抽出緩衝液６リツトル（１：　１０）をペレットに添加した（抽出緩衝液：　５ ０　ｍＭ　Ｉｒ１ｓ／ＨＣＩ、２０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３％トリトン８、ｐ Ｈを塩酸で３．０に調整）。懸濁はホモジネート０：ｉｎ＜ｍａｔｉｃａ）を使 用して低速で行われた。別の抽出緩衝液６リツトルを（最終ペレット；緩衝液の 比率１：２０）で加え、ｐＨがＩＮ水酸化ナトリウムで４．５に調整された。そ の結果得られた１２Ｌの懸濁液を室温で攪拌しながら１０分間インキュベーショ ンした。

インキュベーンジン後、懸濁液をＣＥＰＡ　４１遠心分離機で２ＯＬ／ｈ　ｒの 供給速度で遠心分離した。重！４５０　ｇのペレットを捨て、アポＥアナログを 含む上澄溶液をＩＮ水酸化ナトリウムで１ｌ＝７．５まで滴定し、保存した。

注意卦リドン１は下記の全工程に存在し、工程Ｇで除去さ本工程の目的は低分子 量の混入物を限外濾過／透析で除去することである。

１０１）ＫカッセットタイプＰＴＨＫをひとつ使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅ ｌｌｉｃｏｎ限外濾過システムを使用し、前工程の上澄液（約１２Ｌ）を約２Ｌ に濃縮した。

供給圧力は２０ｐｓｉｇで濾過流速は２ＯＬ／ｈｒであった。透析緩衝液は５０ 　ｍＭ　ｊｒｉｓ／ＢＣＩ、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％トリトン”　、ｐ ｇ−７，５であった。アポＥアナログを約’ｌ　−３ｍｇ／ｍｌ含む２Ｌの残留 物を氷で冷却状態に保持した。

残留物をＰｅ１ｌｉｃｏｎ限外濾過システムの再循環モードを使用して、透析緩 衝液の導電性に相当する濾過物の導電性が得られるまで透析した。これは透析を 終了させるために使用される精製の全体を通して使用される基準である。

Ｄ、ＤＥＡＥクロマトグラフィ 本工程の目的は、アポＥアナログを、蛋白および他の細胞性物質等の混入物から 分離することである。この工程では１．６　Ｌ　ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ 　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ｃｏｌｕｍｎ　（Ｐｈｘｒｍａｃｉａ）が使用された。

流速は１０カラム容ｆｆｉ／ｈ　ｒであった。これらの条件下でのカラムの能力 は４　ｍｇアアポ／ｍ！であると定量された。

カラムは最初にＤＥＡＥ平衡緩衝液（２０ｍＭ　ｔｒｉｓ／ｌｌＣｌ、１　ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０，５％トリトンＲ、ｐＨ・７．５）で平衡化された。

前工程からの残留物溶液（約３Ｌ）がカラムに投入され、３倍のカラム容量（Ｃ Ｖ）の平衡緩衝液で洗浄された。最初の抽出は、１２０　ｍＭ塩化ナトリウムを 含む３倍カラム容量の平衡緩衝液を使用して行われた。分画が収集され、操作の 進捗状況が２８０　ｎｍにおける抽出物の吸光度によって連続的にモニタされた 。分画はコマシープルで着色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分 析され、ピークＤ、　ＩＣＶ）の先端を採取した。

二回目の抽出は１５０　ｍＭ塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を使用して行われ た。分画か収集され、ＳＤＳゲル電気泳動で分析され、ピークＤ、　９ＣＶ）の 大部分が採取された。内毒素はυ。

Ｓ、Ｐｈａｒｍｘｃｏｐｅｉｘ　（Ｕ、Ｓ、Ｐ、）　ＸＸＩ、１１６５−１１６ ６　（１９８５）に記載のＬｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃ７ｆｅ　Ｌｙｓａｔｅ 　（ＬＡＬ）分析で測定された。内毒素の濃度は、アポＥアナログ１ｍｇにつき ３μｇであった。

ＤＥＡＥ−セファロース（処理）後の濃縮および透析最初および二番目の抽出物 からの分画を、１００にカセット一つが具備されたＰｔ１ｌｉｃｏｎ限外濾過シ ステムを使用して透析した。透析緩衝液は２０　ｍＭｆｒｉｓ／ＨＣＩ、Ｉ　ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．１％トリトン”　、ｐＢ−７，５であった。試料は２Ｌ（ 約２−３　ｍｇアアポ／ｍｌ）に濃縮され、透析された。

Ｅ、Ｑ　セファロース（ＱＳ）　クロマトグラフィ本工程の目的は不活性なアポ Ｅアナログから活性型を分離し、更に内毒素を除去することである。

本工程では、１．６　Ｌ　ＱＳ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　カラム（Ｐｈａ　ｒｍａ ｃ　ｉａ）が使用された。これらの条件下でのカラムの能力は約７　ｍｇアアポ ／［１１１で、流速は約１０　ＣＶ／ｈｒであった。

ＱＳ平衡緩衝液は２０　ｍＭ　Ｉｒ１ｓ／ＨＣＩ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０． ２％トリトンＲ、ｐＢ・７．８であった。平衡化された後、前工程の２バツチか らの残留溶液は併合され、カラムに投入された。すなわち約５ｇのアポＥアナロ グを含む約５Ｌの緩衝液全量が投入された。次ぎに、カラムが２．８倍のカラム 容量の平衡緩衝液で洗浄された。最初の抽出は２０　ｍＭ塩化ナトリウムを含む ３倍カラム容量の平衡緩衝液で行われ、二回目の抽出は４０　ｍＭ塩化ナトリウ ムを含む５．５倍カラム容量の平衡緩衝液で行われた。上記の様に、分画が収集 され、モニタされ、分析され、２．０カラム容量が併合され保存された。内毒素 の濃度は、ＬＡＬ分析で測定され、アポＥアナログ１　ｍｇにつき２５０　ｐｇ 未満であった。

７０　ｍＭ塩化ナトリウムおよび３５０　ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液を使 用し引き続き行った２回の抽出で、不活性なアポＥアナログが夫々抽出された。

Ｑ−セファロース（処理）の後の濃縮および透析ＱＳセファロースからの保存貯 蔵された分画が濃縮され、１００にカセット一つが具備されたＭｉｌｌｉｐｏｒ ｅＰｔｌｌｉｃｏｎ限外濾過システムによって透析された。

透析緩衝液は１０　ｍＭ　ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０ ．１％トリトン”　、ｐＥ＝７．５であった。試料はアポＥアナログ濃度約２− ３ｍｇ／ｍｌを維持しながら再循環モードを使用して透析された。

最終残留容量は約５００　ｍｌであった。

Ｆ、ＣＭ　セファロース　りロマトグラフィ本工程の目的は更に内毒素を除去し 、トリトン８の濃度を０．０５％に低下させることである。

本工程では、１２０　ｍｌのＣＭセファ０−スＦＭ＄Ｉ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍ ａｃｉｘ）カラムが使用された。平衡緩衝液は２０　ｍＭ酢酸ナトリウム、１　 ｍＭ　ＥＤＴＡ、０，２％トリトンＲ、ｐＢ〜４．８であった。

平衡化された後、前工程からの残留溶液がＣＭセファロースカラムに投入された 。カラムの能力は１０　ｍｇアアポ／ｍｌで、流速は約１０　ＣＭ／ｈｒであっ た。

次に、カラムが下記溶液で洗浄された＝４倍カラム容量の平衡緩衝液、続いて７ ０　ｍＭ塩化ナトリウム含む５倍カラム容量の平衡緩衝液、更に続いて２０　ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、１　ｄＥＤＴＡ、　０．０５％トリトン”　、７０　ｍＭ塩 化ナトリウム、ｐＨ−４，８の２倍カラム容量。投入工程および洗浄工程からの 抽出物は廃棄された。

次に、カラムが抽出された。抽出物は２０　ｍＭ酢酸ナトリウム、ｌ　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ　、　０．０５％トリトン”　、３００　ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＢ−５ ，０であった。抽出の進捗状況が２８０　ｎｍにおける抽出物の吸光度によって 連続的にモニタされた（抽出の間、２つの異なる基準線が使用される。一つは０ ．２％トリトンを含む高Ｕ、　Ｖ、吸光度緩衝液、もう一つは０，０５％トリト ンを含む低υ、■。

吸光度緩衝液である。約１．００Ｄ規模の感度を使用することで両方の緩衝液が チャートカラム上に現れる。（低い方は足元に、高い方は約０．５０Ｄ） アポＥアナログを含む試料は直ぐにｐＨ７，８に滴定され、保存された。この試 料中の内毒素の濃度は、ＬＡＬ分析で測定したところによると、アポＥアナログ １［［１ｇにつき５０９ｇ未満本工程の目的は、トリトン１を除去することであ る。

本工程は１００Ｋカセツトを一つ具備するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏ ｎ限外濾過システムを使用して４℃で実施され、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで一 晩予備洗浄された。流速は９−１２　Ｌ／ｈｔで人「］／圧力は５−１０　ｐｓ ｉｇであった（トリトン８が除去される時、アポＥアナログが凝集するのを防止 するためこの低流速が用いられた）。前工程からのアポＥアナログ試料（約６０ ０ｍｇアポＥアナログを含む９６０　ｍｌ　）は、１０　ｍＭ炭酸水素ナトリウ ム緩衝液、ｐＨ・７．７で０．５　ｍｇ／ｍｌに希釈された。

次に、試料は限外濾過システムで処理され、下記条件は本トリトン１除去工程全 体を通して適用された。

ａ）　トリトン８の濃度は０．０２％未満でなければならない。すなわち１００ に膜を通してトリトン１の有効除去を成功させるために臨界ミセル濃度未満でな ければならない。

ｂ）アポＥアナログは０．５　ｍｇ／ｍ１未満に希釈されてはならない。さもな いと、アポ２分子の解離が起こり、１００に膜を通過してしまう。

Ｃ）アポＥアナログは１゜５　ｍｇ／＋ｎｌを越えて濃縮されてはならない。さ もないと、アポ２分子の凝集が生じ得る。

限外濾過システムで使用される透析緩衝液は１０　ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝 液、１５０　ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＢ・７．８である。

上記条件による濃縮、希釈工程の後、一定量および一定流速で透析が行われ、透 析は２８０　ｎｍにおける濾過物の吸光度が０、Ｏ１単位になった時、完了させ た（トリトン１溶液は２８０Ωｍで吸光し、吸光度０．Ｏｌは０．０００５％の トリトン８に相当する）。

最終残留物の全容量は７７０　［０１で、濾過物の容量は９゜５Ｌであった。

次に、アポＥアナログを含む溶液は、濾過され（０，２ミクロンフィルタ）−７ ０℃にて８０　ｍｌのガラス瓶中に貯蔵された。

全生産量 高度に精製されたアポＥアナログ０．３ｇが３　Ｋｇのバクテリアケイクから回 収された。約９７％純粋のアポＥアナログは、ゲル浸透分析の同様の条件下で試 験された時、血漿ＡｐｏＥと同じ凝集状態であった。アポＥアナログ試料は、内 毒素５０ｐｇ／ｍｇ蛋白未満を含んでいた。

凍結乾燥 もしアポＥアナログが凍結乾燥されるとしたら、トリトン８除去工程における透 析緩衝液は２　ｍＭ　炭酸水素ナトリウム緩衝液、９１１−７．８で、凍結乾燥 後、アポＥアナログの試料は−２ア０℃で貯蔵される。

凍結乾燥後、アポＥアナログは再溶解することができ、通常の生物学的活性を保 持している。凍結乾燥アポＥアナログは少なくとも一年間は非常に安定である。

この方法は、細胞上清から高度に精製されたアポＥアナログを製造するためのプ ロセスである。工程の一般的スキーム（スキーム■）は、次のＡ−〜Ｇ′からな っている。

Ａ−細胞破壊・・・マグネシウムイオン不存在Ｂ−）リドン１を用いた上清の抽 出 Ｃ−１００に限外濾過 Ｄ−ＤＥＡＥクロマトグラフィー Ｅ′　ヘパリン／セファロース赤りロマトグラフィ−Ｆ″　ＣＭセファロース・ クロマトグラフィーＧ−１００に限外濾過・・・トリトン１除去以下に述べる上 清からのアポＥ精製工程の詳細な例は、１．５Ｋｇの細胞ケーキを含む例である 。ここに説明する方法は、少し変形するだけでスケールアップにも適する。

−以上の発酵から得た重さ１．５ｋｇのバクテリアのケーキが工程Ａ″〜Ｇ′に より加工された。工程Ａ＝、Ｂ−，Ｃ−及びＧ′は、他に指示した場合を除き、 ４℃〜ｌｏ℃で行なわれた。他の操作は室温で行なわれた。

Ａ−０細胞破壊： １．５Ｋｇの湿潤細胞ケーキ（約６ｇのアポＥアナログを含む）を６Ｌの緩衝液 ＥＢ中に懸濁させた。なお、緩衝液ＥＢは、５０　ｍＭ　Ｉｒ１ｓ／ＥＣＩ、１ ０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２５％βヒドロキシブチレートのナトリウム塩、Ｐ ｌ］＝７．５である。

この懸濁液を、キネマチ力（Ｘｉｎｅｍａｊｉｃａ）ホモジエナイザーを用いて ホモジエナイズし、７．５Ｌのホモジネートを得た。

次いで、ガラスピーズ粉砕（ＫＤＬ　Ｄｙｎｏｍｉｌｌ）を用いることにより、 ５Ｌ／時で破壊（２サイクルで）を行なった。得られた懸濁液を緩衝液ＥＢで３ 倍に稀釈することにより、容量を２２．５Ｌにした。

次いで、この溶解液の遠心を、連続式ＣＥＰＡ−４１管状ボール遠心機中におい て、９Ｌ／時の供給速度で行なった。形成された重さ略６００ｇのペレットを廃 棄し、可溶性のアポＥアナログを含有する上清（約２２Ｌ）を保存した。

前の工程で得た上清にトリトン８を添加して、最終濃度を０．３％とした。次い で、得られた懸濁液をＨＣＩを用いてｐＨ＝４．０まで酸性化し、ソーパル（Ｓ ｏｒ、ｖｇｌ）遠心機を用いて５分ヘパリン／セファロース後の濃縮およヒ透析 貯蔵されたサンプルを解凍し、次いで一つの１００　Ｋカセットを用いたミリポ ア・ペリコンシステムでの限界濾過により、濃縮および透析した。

透析緩衝液は、１０　ｍＭ　ｔｒｉｓ／ｌｌＣｌ、Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０． １％トリト、Ｒ ン、ｐｉｌｌ・７．５であった。このサンプルを濃縮し、繰り返し稀釈により透 析し、続いてアポＥて濃度を２−３　ｍｇ／ｍｌに維持するために濃縮した。最 終的な得られた量の濃縮液を保存した。

Ｆ−、ＣＭセファロース・クロマトグラフィｍ：この工程の目的およびその操作 条件は、スキームエの工程Ｆにおけると同様であり、残留内毒素を除去すること 、並びにトリトンＲの濃度を０．０５％にまで低下させることである。

この工程では、１２０　ｍｌ　ＣＭセファロース高速流カラム（ファルマシア社 製）が用いられた。平衡化緩衝液は、２０　ｍＭ酢酸Ｎ　ａ、１　ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、０．２％トリトンＲ，ｐＨ−４，８であった。平衡化の後、前の工程で得ら れた濃縮溶液はｐＥ＝４．８に産生化され、ＣＭセファロースカラムに掛けられ た。該カラムの能力は、セファロース１ｍｌ当たりアポＥアナログｔｏｍｇであ り、流速は１ｏｃｋ／ｈｒであった。

次いて、該カラムは次の溶液で洗浄された。即ち、３　ＣＶの塀恋羽化溶液に、 次いで７０　ｍＭ　ＮａＣ１を含む６．６ＣＶの平衡化緩衝液、続いて５Ｃｖの ２０［［１Ｍ酢酸Ｎａ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５％次に、該カラムを溶出 させた。次の工程では、採取されたアポＥ画分を１ｍｇ／１ｌ１１１以下に稀釈 しないことが重要である。

溶出液は、約６　ＣＶの２０　ｍＭ酢酸Ｎａ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５ ％トリトンＲ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＢ・５．０であった。該溶出液（アポ Ｅアナログを含有する）は、直ちにｐＥ−７，５に滴定されて保存され、−２０ °Ｃで貯蔵された。該サンプル中の内毒素量は、アポＥアナログ１ｍｇ当たり３ ０　ｐｇ未満であることが分かった。

この工程の目的はトリトンＲの除去にあり、スキームＩの工程Ｇ（例３）と同じ で、同様の条件で行なわれる。

この工程は、０．５　Ｍ　Ｎａ０Ｅで一晩前洗浄された一つの１００にカセット を備えたミリポア・ペリコン限外濾過システムを用いて行なわれた。

流速は１０　Ｌ／ｈｒであり、入り口圧は５　ｐｓｉｇであった。このような低 い流速が用いられるのは、トリトンＲが除去されるときにアポＥアナログの凝集 を防止するためである。稀釈緩衝液は１０　［ＤＭ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ−７， ８である。

該サンプルは次いで限外濾過システム中で処理され、このトリトン１除去工程を 通して、スキームＩの工程Ｇで述べたのと同じ三つの条件が適用された。この限 外濾過システムで用いた透析緩衝液は、２　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ−７，８ であった。

上記条件に従う濃縮および稀釈の後、２８０　ｎｍでの濾液の吸光度が０．０１ ６になったときに、透析が行なわれ完結された。

この濃縮液は、約０．５　ｍｇ／ｍｌのアポＥアナログを含んでいた。

次いで、このアポＥを含有する溶液を濾過した。

全体の収率：　１．５Ｋｇのバクテリアケイクから、０．９ｇの高度に精製され たアポＥアナログが回収された。該アポＥアナログ（純度的９３％）は、同じゲ ル浸透分析条件下において、血漿アポＥと同じ凝集状態であり、１ｍｇ当たり３ ０　ｐｇ未満の内毒素を含んでいた（内毒素は例３に記載したようにして分析し た）。

該アポＥアナログサンプルは凍結乾燥され、−２０℃で貯蔵された。細胞懸濁液 から調製されたこのアポＥアナログは、凍結乾燥の後、細胞ペレットから調製さ れたアポＥアナログと同様の挙動を示した。これは水中に再溶解することができ 、その正常な生物学的活性を保持していた。

例５ 改良法により製造されたアポＥの特徴付は異なる二つの発酵によって製造され、 スキームＩ（例３）で説明したのと同じ方法で精製されたアポＥアナログの二つ のバッチ（０１及び０２）が分析され、ヒト血漿から製造された天然型アポＥと 比較された。

Ａ、精製および均質性： ｒ−アポＥの純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー青染色および銀染色から見 積もられた全タンパクの９７％であった。

アポＥと同定された全タンパクの９７％を占めるタンパクには、主バンドに加え て、アポＥ主バンドの直ぐ下に出現する、全タンパクの略１０−１５％のバンド が含まれている。このバンドは、ウェスタンプロット及びＮ末端アミノ酸配列分 析（セクションＢ、５を参照のこと）による測定で、特別に開裂したアポＥと同 定された。

残りのＤＮＡおよびＲＮＡは、ｐ−アポＥを標準物質に用い、アポＥサンプルに おける２８０−２６０　ｎｍでの吸光度比を測定することによって見積もられた （表１）。

ｒ−アポＥ（バッチ０１）　１．７４ ｒ−アポＥ（バッチ０２）　１．７８ 上記Ａ２８ｏ／Ａ２６ｏ比の値は、核酸による汚染が検出限界以下であることを 示している。

毒性 バクテリア由来内毒素のレベルは充分に、確立された限界の範囲内であった。繰 り返しＬＡＬ試験に従う精製プロセスによって、こいれは２５　ｐｇ／ｍｇ　Ａ ｐｏＥにまで低下した。

バッチ０１、バッチ０２およびｐ−アポＥのサンプルを、図４に示す用に、２− メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在および不存在化において１２．５％ポ リアクリルアミド−３ＤＳゲルにかけた。当該図の説明を参照されたい。ｒ−ア ポＥおよびｐ−アポＥの主バンドの移動は同一であった。ｐ−アポＥの低分子量 バンドＤ２ＫＤ）は、完全なタンパク（３４ＫＤ）の開裂生成物を示している。

２−ＭＥ無しで適用されたサンプル中に出現する高い分子量バンドは、アポＥの スルフヒドリル結合したオリゴマーを示す。

２、ウェスタンプロット上での免疫反応：ｒ−アポＥの抗原性の同定は、ウェス タンプロットによって測定することができる。このウェスタンプロットの条件及 びサンプル調製は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図４）の場合と同様である。電気泳動 の後、該ゲルをニトロセルロース上にプロットし、ヒト血漿アポＥに対して特異 的なウサギ・ポリクロ・−ナル抗血清で現像する。主バンドの直ぐ上の追加のバ ンドは、該血漿プレバレージョン中では認められるが、ｒ−アポＥプレバレージ ョンには見られない。この高分子量バンドは多分、ｐアポＥのグリコジル化され た形を示している。

ｒ−アポＥプレバレージョンにおいて、低分子量バンド０２ＫＤ）は抗血清と反 応し、従って当該分子の開裂生成物を示している（後述のセクション５を参照の こと）。

２ＭＥで処理されていないウェスタンプロット上で全てのアポＥプレバレージョ ンに現れるこの高分子量バンドは、多量体を示しているかも知れない。

３、サイズ排除クロマトグラフィーによる分子量：アポＥの分子量および凝集状 態は、スーパーロース６カラム（ＨＲ１０／３０、ファルマシア社）上での高速 サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された。ｒ−アポＥおよびｐ−アポ Ｅのスーパーロース６カラム溶出の比較か、図１に示されている。ｒ−アポＥお よびｐ−アポＥの両者の分子量は図１の説明中に記載したようにして算出された 。その値は略６５ＫＤであり、これは二量体用あることを示している。

４、紫外線吸収スペクトルニ アポＥのバッチ０１（図２Ａ）及びバッチ０２（図２Ｂ）の、３５０ｎｍ〜２０ ０ｎｍの領域におけるＵＶ吸収を測定することによって、ｒ−アポＥおよびｐ− アポＥの性質および純度が比較された。これらスペクトルは、ｐ−アポＥのスペ クトル（図２Ａおよび図２Ｂ）と同一であった。

５、アミノ酸分析： ｒ−アポＥアナログの二つのバッチ（０１及び０２）と、ｐ−アポＥとのアミノ 酸組成分析は略同−であった。ｐ−アポＥと比較したときの主要な相違は、ｒ− アポＥアナログの二つのサンプルが追加のメチオニン残基を含んでいる点である 。

Ｖｏｇｅｌ　ｅｆ　ａｌ、、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　８２：　８６７６−８７００ （１９８５）を参照のこと。

ｒ−アポＥアナログの二つのバッチのＮ末端配列分析（１９サイクル）によって 、該Ｎ−配列は、追加のＮ末端メチオニンを有スる基準ｐ−アポＥの最初の１８ アミノ酸に対応することが明らかになった。Ｎ末端メチオニンをもたない第二配 列のｒ−アポＥには証拠がない。

アポＥの主バンド（３４ＫＤ）の直ぐ下に出現する３２ＫＤのバンドが単離され 、そのＮ末端配列が分析された。１４サイクルの結果によって、この化合物のＮ 末端はｐ−アポＥの残基１２−２５に対応し、従って上記３２ＫＤのバンドはＮ 末端の最初の１１アミノ酸残基を欠失したアポＥに対応することが示された。

更に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタンプロット分析、ゲル 濾過およびＵＶスペクトル分析の試験において、凍結乾燥の前および後のｒ−ア ポＥアナログサンプルが比較され、その挙動は相互に実質的に同一であり、且っ 基準ｐ−アポＥに類似していることが示された。

Ｔ、　Ｌ、　１ｎｎｃｒａｒｉｆｙ　ｔｌ　ａｔ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２５４：　４１８６−４１９０（１９７９）に記載されたようにして 、ｒ−アポＥアナログおよびシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ） のリン脂質複合体を調製し、単離した。

Ｔ、Ｌ、　Ｉｎｎｅｒａｒｉ１７　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　１７：　１４４０−１４４７　（１９７８）に記載されたよう にして、リポタンパク受容体結合試験が行なわれた。ヨードビーズ（ピアス社） を用い、製造者の指示に従って、０．１０ＭのＮＨＨＣＯ３中でアポＥのヨード 化が行なわれた。

アポＥ−ＤＭＰＣ複合体の受容体結合性を比較することによって、ｒ−ＰｐｏＥ 類縁該は基準アポＥ　（ｐ−アポＥ）と同様の結合性を有していることが示され た。これらの実験において、スキームＩおよび■（夫々例３および例４）により 調製されたアポＥのサンプルがｐ−アポＥと比較された。表■は、培養遷移芽細 胞上のアポＥ、Ｂ受容体に結合した！２５Ｉ−ＬＤＬ（低密度リポタンパク−Ｌ ＤＬ−受容体としても知られる）を用いた、−組の拮抗研究の結果を示している 。

凍結乾燥後のアポＥアナログを用いた試験によって、凍結乾燥は生物学的活性に 影響しないことが示された。

表■ ｐ−アポＥ　Ｏ，０５０ ｒ−アポＥ（スキームＩ　）　０．０３３ここで用いたアプローチは、　■−リ ポタンパクを含む培養系（ヒト皮膚繊維芽細胞およびＨｅｐ　Ｇ−２細胞）に、 外因性の組換または血漿性アポＥ（アポＥ−３）を補充することである。アポＥ を添加しなけば、ＶＬＤＬ画分Ｉ、ＩＩ及び■の細胞性代謝（結合、細胞会合（ ｃｅｌｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び分解）は無視し得、またＩＤＬではＬ ＤＬの約５０％であった。外因性の組換アポＥアナログ（凍結乾燥の前または後 ）は、ＬＤＬ代謝に何等の影響も与えることなく、ＶＬＤＬの代謝を数倍増大さ せた。

結論 アポＥ精製の改良法によって、血漿から単離された天然型アポＥに極めて類似し た性質および特性をもった、組換アポＥアナログが得られる。

例３および例４では、薬剤学的、獣医学的および診断学的な多くの可能な用途を 有する新規なアポＥアナログの精製を説明した。例３または例４で説明したよう に調製された、新規アポＥについて予想される用途の幾つかを以下に説明する。

我々は、血中のコレステロールまたはりボタンバクのレベルを低下することによ って、食事的または遺伝的理由によるアテローム性動脈硬化を治療するために、 例３および例４で精製され且つ適切に製剤化されたアポＥアナログの投与を想定 する。我々は、アポＥアナログの使用が、抹消血管障害、アテローム性動脈硬化 、心臓発作および脳血管障害に対する防止効果および治療効果を有し得ることを 確信している。

アポＥアナログの他の可能な用途は、心筋梗塞後の患者の治療である。成る患者 においては、アポＥアナログを外部から投与することによって、血管形成術また は他の技術による治療を受けた心筋梗塞患者の略３０％に起きる動脈の再閉塞を 防止し得る。

また、アテローム性動脈硬化を防止するためのアポＥの予防的投与も考えられる 。これは、特に高リスク患者のために考慮される得る。このような患者の例は、 リポタンパク（ＬＤＬ）受容体に対する結合性の乏しいアポＥの異常変種または アポＥの欠失（または殆ど完全な欠失）に起因した、遺伝性の高リポタンパク血 漿の患者である。

２、神経損傷の治療 我々は、例３または例４で精製され且つ適切に製剤化されたアポＥアナログを、 損傷した神経組織の治療における、神経の発育および再生を促進するための治療 剤として投与することを想定している。

３、高レベルのＬＤＳを発現する腫瘍の治療我々は、例３または例４で精製され 且つ適切に製剤化されたアポＥアナログを、高レベルのＬＤＬ受容体を有する腫 瘍の治療のための薬剤組成物に使用することを想定している。

このアポＥは、標的指向性の治療組成物を製造するための化学療法剤または放射 性治療剤を含有し得、或いはこれらに対して物理的または科学的に結合され得る 。

４、ＬＤＬ受容体欠損の診断 例３または例４で精製され、且つラベルされたアポＥを含有する脂質エマルジョ ンは、ＡｐｏＢ、Ｅ　（ＬＤＳ）受容体の数をＪｌ定し、また該ラベルされたア ポ２粒子の取り込み分布を測定するために使用され得る。これは、甲状腺機能の 測定に用いられる技術に類似したシンチスキャン技術によって行なわれ得る。こ れら測定は、もし成功すれば、ＦＨ（家族性高コレステロール血症、即ちＬＤＬ 受容体の欠失またはその異常を有する疾患）の患者を、該遺伝性疾患をもたない 高コレステロール血症患者から区別するための診断法として用いることができる 。

５、腫瘍増殖の一次部位および二次部位の診断状々は、例３および例４に記載し たようにして精製されたアポＥアナログを、腫瘍増殖の一次部位および二次部位 の診断剤として使用することを想定している。特に、我々は高しベルのＬＤＬ受 容体をもった腫瘍の位置を特定し、診断するために、ラベルされたアポＥを含有 するエマルジョンの使用を想定している。これは、シンチスキャン技術によって なさ我々は、例３または例４に記載したようにして精製されたアポＥアナログを 外部から投与することによって免疫調節的作用が得られ、自己免疫症状または免 疫不全を含む疾患の治療に用いられ得ると信じている。

７、リガンドとしてアポＥを含む脂質エマルジョン脂質エマルジョンはアポＥに 対して高い親和性を有している。我々は、アポＥアナログと種々の脂質エマルジ ョンおよびリポソーム型粒子との相互作用を研究しようと思っている。

この情報は、ドラッグデリバリ−や、プロスタグランジン前駆体またはロイコト リエン前駆体のような成る種の脂質成分の特異的組織ターゲツティングの分野に 適用され得る。リポソームの脂質組成を変化させることは、組織ターゲツティン グに有効である；同様に、我々は例３または例４に記載したように精製されたア ポＥアナログを添加することによって、アポＥ含量の変更を想定している。

例フ イン・ビトロにおけるタンパク分解からのアポＥの保護的３５ＫＤの分子量を有 するアポＥは、（バクテリア細胞の破壊の後に）イン・ビボ及びイン・ビトロの 両方でタンパク分解を受け易い。バクテリア細胞抽出物の存在下におけるイン− ビトロでの開裂によって、約１４ＫＤおよび２１ＫＤの分子量を有する二つのポ リペプチドが形成される。

我々は、驚くべきことに、精製ｒ−アポＥを含有する試験混合物中に短鎖脂肪酸 のような化学物質を添加すると、イン・ビトロでのアポＥのタンパク分解が劇的 に減少することを見出した。また、ＥＤＴＡもこのタンパク分解活性を減少させ る。

バクテリア細胞を含まない抽出物のアポＥに対するイン・ビトロタンパク分解活 性が、下記の成分を含有する５００ｍ１の試験混合物を用いて測定された。

・１００μｍの精製アポＥ（２５μｇ）・１０−５０μｍのバクテリア細胞を含 まない抽出液・５０μｌの、酪酸、β−ヒドロキシブチレート若しくはヘキサン 酸（全部中和された）のような化学物質、又はトラシロール（アプロチニン）又 はＥＤＴＡのようなプロテアーゼ阻害剤剤 ・３００μｌのＯ，１Ｍ）リス／アセテート緩衝液（ｐＨ＝６．７） 該バクテリア細胞を含まない抽出液は、３０℃で増殖され且つ４２°Ｃで２時間 熱シヨツクを与えられたプラスミドを含まないホストＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養物 から調製された。２ｍｌの０．１Ｍトリス／アセテート緩衝液（ｐｔｌ−６，７ ）中で、１００Ｄ６６０の細胞が音波破砕された。

この反応混合物は４２°Ｃで９０分間インキュベートされた。その後、２０μｍ の混合物を取出し、０．１Ｍｔ−リス／アセテート緩衝液（ｐＨ・８．０）で１ ００μｍとし、５０μｍの３ＸＳＤＳゲル・サンプル緩衝液を添加した。なお、 ＳＤＳゲル・サンプル緩衝液は、１８７．５　ｍＭ　Ｉｒ１ｓ／ＢＣＩ　ｐＥ’ ６．８．２．　ｌ　Ｍβ−メルカプトエタノール１９％ＳＤＳ、３０％Ｗ／Ｖグ リセロール及び０．５％ブロモフェノール青を含有する。１００℃で１０分間の 熱処理に続き、得られた混合物２０μｍを１２．５％ポリアクリルアミドゲルの スロットに添加した。

電気泳動に続き、このゲルをクーマシー青で染色した。可視化されたバンドの強 度をスキャナーで評価した。

バクテリア抽出液または化学剤を含まないサンプルのＳＤＳゲル上でのアポＥ　 （３４ＫＤ）バンドが対照に用いられ、処理されたサンプルのバンドと比較され た。タンパク分解消化の結果として生じた１４ＫＤおよび２１ＫＤのバンドは、 両者共に抗アポＥ抗体と反応した。しかし、これら１４ＫＤおよび２１ＫＤのバ ンドは、有効量の上記化学物質の存在下では発生しなかった。

表■には、バクテリア細胞を含まない抽出物のアポＥに対するタンパク分解活性 について、種々の化学物質の影響が纏められている。この表は、脂肪酸およびＥ ＤＴＡが、細胞抽出液によるアポＥの分解を阻害することを明瞭に示している。

ＨＥＫＩ　５ＡＮＮ酸（カプロン酸）　、ＥＤＴＡ、酪酸およびβ−ヒドロキシ ブチレー１・（全て中和された）は全て、阻害活性を増大させるための、該タン パク分解活性の好ましい阻害剤である。

他の脂肪酸、脂肪酸前駆体、トリグリセリド及びトリグリセリド前駆体もまた、 アポＥ分解を阻害するために使用され得ることが予想される。

費用および便利さの理由から、細胞破壊時のプロテアーゼ阻害剤としてβ−ヒド ロキシブチレート（すトリウム塩）を選択することが決定された（例３Ａおよび ４Ａ）。また、スキーム■（例４Ａ）の別法ではＥＤＴＡも添加された。細胞破 壊時における上記プロテアーゼ分解阻害剤の好ましい濃度は約０．１〜１％であ り、最も好ましい濃度は約０．２％である。

なしく対照）　なし　＋＋＋＋ ＥＤＴＡ　あり　＋＋十 酪酸　あり　＋＋＋ β−ヒドロキシ酪酸　あり　＋＋ ヘキサン酸　あり　＋＋＋　（＋） トラシロール　あり　＋ １、＋＋＋＋＝対照の約１００％ ＋＋＋　一対照の約７５％ ＋＋＝対照の約５０％ ＋　＝対照の約２５％ 図１ 保持時間ｆ＆ｌ　保持時間（分） 保持時間（分） 図　２ 波長（ｎｍ） 波長（ｎ　ｍ　） 図３ 図４ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１２月２７日Ｊ・−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生する、遺伝学的 に処理された細菌細胞から、精製された紐換えアポＥもしくはそれらのポリペプ チドアナログを得る方法であって、 （ａ）組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生するように遺 伝学的に処理された細菌細胞を培養し；（ｂ）不溶性組換えアポＥもしくはそれ らのポリペプチドアナログを含有する溶解物を得るために、マグネシウムイオン の存在下でこの細菌細胞を処理し； （ｃ）該溶解物から不溶性紐換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログ を含む不溶性物質を回収し；（ｄ）回収した不溶性物質を非イオン性清浄剤を含 有する溶液で処理して可溶化組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナロ グを得； （ｅ）組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを濃縮し、かつ精製 するために、可溶化組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを処理 し；および（ｆ）得られた濃縮、精製組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチ ドアナログを回収する ことを具備する方法。 ２．工程（ａ）における細菌細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｉである請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．工程（ｂ）における処理が機械的破壊を包含する請求の範囲第１項記載の方 法。 ４．工程（ｂ）における処理を、さらに、アポＥもしくはそれらのポリペプチド アナログのタンパク分解性消化の阻害剤の存在下において行なう請求の範囲第１ 項記載の方法。 ５．アポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログのタンパク分解性消化の阻害 剤が中和脂肪酸である請求の範囲第４項記載の方法。 ６．中和脂肪酸がβ−ヒドロキシ酪酸塩である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．工程（ｃ）における溶解物からの不溶性物質の回収が遠心を包含する請求の 範囲第１項記載の方法。 ８．非イオン性清浄剤がＰＥＧ（９−１０）ｐ−ｔ−オシチルフェノールである 請求の範囲第１項記載の方法。 ９．工程（ｅ）におけるアポＥもしくはアナログを濃縮し、かっ精製するための 処理が、限外濾過を包含する請求の範囲第１項記載の方法。 １０．限外濾過が、分子星１×１０５ダルトン未満の分子を除去する請求の範囲 第９項記載の方法。 １１．工程（ｅ）における処理がクロマトグラフィーを包含する請求の範囲第１ 項記載の方法。 １２．クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーを包含する請求の範 囲第１１項記載の方法。 １３．イオン交換クロマトグラフィーを、樹脂に結合した第三アミンリガンドを 用いて行なう請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを透析し、さらに精製され たアポＥを含有する残留物を保存する請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．さらに精製されたアポＥもしくはアナログを含有する残留物を、樹脂に結 合した第四アミンリガンドにより高度に濃縮し、かつ精製する請求の範囲第１４ 項記載の方法。 １６．高度に濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを透析し、残留物を 保存する請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．高度に濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを陽イオン交換クロ マトグラフィーによりさらに濃縮し、精製する請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．陽イオン交換クロマトグラフィーを、樹脂に結合したカルボキシメチル− リガンドを用いて行なう請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．工程（ｆ）における濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログの回収 が限外濾過を包含する請求の範囲第１項記載の方法。 ２０．限外濾過が、分子量１×１０５ダルトン未満の分子を除去する請求の範囲 第１９項記載の方法。 ２１．限外濾過が非イオン性清浄剤を除去する請求の範囲第１９項記載の方法。 ２２．紐換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生する、遺伝学 的に処理された細菌細胞から、精製された組換えアポＥもしくはそれらのポリペ プチドアナログを得る方法であって、 （ａ）組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを産生するように遺 伝学的に処理された細菌細胞を培養し；（ｂ）可溶性組換えアポＥもしくはそれ らのポリペプチドアナログを含有する溶解物を得るために、ＥＤＴＡの存在下で 該細菌細胞を処理し； （ｃ）該溶解物から可溶性組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログ を含む溶液を回収し；（ｄ）回収した溶液を非イオン性清浄剤を含有する溶液で 処理して可溶化組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを含有する 第２の溶液を得； （ｅ）紐換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを濃縮し、かつ精製 するために、組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログを含有する第 ２の溶液を処理し；および （ｆ）濃縮され、精製された組換えアポＥもしくはそれらのポリペプチドアナロ グを回収する ことを具備する方法。 ２３．工程（ａ）における細菌細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｉである請 求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．工程（ｂ）における処理が機械的破壊を包含する請求の範囲第２２項記載 の方法。 ２５．工程（ｂ）における処理を、さらに、アポＥもしくはそれらのポリペプチ ドアナログのタンパク分解性消化の阻害剤の存在下において行なう請求の範囲第 ２２項記載の方法。 ２６．アポＥもしくはそれらのポリペプチドアナログのタンパク分解性消化の阻 害剤が中和脂肪酸である請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．中和脂肪酸がβ−ヒドロキシ酪酸塩である請求の範囲第２６項記載の方法 。 ２８．工程（ｃ）における溶解物からの可溶性物質の回収が遠心を包含する請求 の範囲第２２項記載の方法。 ２９．非イオン性清浄剤がＰＥＧ（９−１０）ｐ−（−オシルフェノールである 請求の範囲第２２項記載の方法。 ３０．工程（ｅ）におけるアポＥもしくはアナログを濃縮し、かっ精製するため の処理が、限外濾過を包含する請求の範囲第２２項記載の方法。 ３１．限外濾過が、分子量１×１０５ダルトン未満の分子を除去する請求の範囲 第２２項記載の方法。 ３２．工程（ｅ）における処理がクロマトグラフィーを包含する請求の範囲第２ ２項記載の方法。 ３３．クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーを包含する請求の範 囲第３２項記載の方法。 ３４．イオン交換クロマトグラフィーを、樹脂に結合した第三アミンリガンドを 用いて行なう請求の範囲第３３項記載の方法。 ３５．第三アミンリガンドがジエチルアミノエチルである請求の範囲第３４項記 載の方法。 ３６．濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを透析し、さらに精製され たアポＥを含有する残留物を保存する請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７．濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを透析し、さらに精製され たアポＥもしくはアナログを含有する残留物を保存する請求の範囲第３６項記載 の方法。 ３８．さらに精製されたアポＥもしくはアナログを含有する残留物を、アフィニ ティクロマトグラフィーにより高度に濃縮し、かつ精製する請求の範囲第３７項 記載の方法。 ３９．アフィニティクロマトグラフィーを、樹脂に結合したヘパリンリガンドを 用いて行なう請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．高度に濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを透析し、その結果 得られる、高度に濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを含有する残留 物を保存する請求の範囲第３９項記載の方法。 ４１．高度に濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログを含有する残留物を 陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに濃縮し、精製する請求の範囲第４ ０項記載の方法。 ４２．陽イオン交換クロマトグラフィーを、樹脂に結合したカルボキシメチル− リガンドを用いて行なう請求の範囲第４１項記載の方法。 ４３．工程（ｆ）における濃縮され、精製されたアポＥもしくはアナログの回収 が限外濾過を包含する請求の範囲第２２項記載の方法。 ４４．限外濾過が、分子量１×１０５ダルトン未満の分子を除去する請求の範囲 第４３項記載の方法。 ４５．限外濾過が非イオン性清浄剤を除去する請求の範囲第４３項記載の方法。 ４６．請求の範囲第１項または第２２項に記載の方法によって生成したアポＥも しくはそれらのアナログ、および適切な担体を含む組成物。 ４７．請求の範囲第１項または第２２項に記載の方法によって生成したアポＥも しくはそれらのアナログ、および適切な担体を含む組成物であって、該アポＥも しくはそれらのアナログが、化学療法剤もしくは放射線療法剤もしくは放射線診 断剤を含有するか、あるいはそれらに物理的に結合している組成物。 ４８．１００ｐｇ／ｍｇ未満の内毒素を含有する生物学的に活性な超純粋アポＥ もしくはそれらのアナログの溶液であって、該溶液は凍結乾燥されていてもよく 、再溶解時にも生物学的な活性を保持する溶液。 ４９．アテローム硬化症に罹患した患者の治療法であって、該患者に、アテロー ム硬化症と戦うに有効な量の請求の範囲第４６項記載のアポＥもしくはそれらの アナログを投与することを包含する方法。 ５０．コレステロール代謝が損なわれることにより引き起こされる高コレステロ ール血症に罹患した患者の治療方法であって、高コレステロール血症を緩和し、 それにより患者を治療するために、コレステロール代謝を正常化するに有効な量 の請求の範囲第４６項記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与する ことを包含する方法。 ５１．脂質代謝が損なわれることにより引き起こされる高リボタンパク質血症に 罹患した患者の治療方法であって、高リボタンパク質血症を緩和し、それにより 患者を治療するために、脂質代謝を正常化するに有効な量の請求の範囲第４６項 記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含する方法。 ５２．神経に損傷を受けた患者の治療方法であって、神経の成長および再生を促 進するに有効な量の請求の範囲第４６項記載のアポＥもしくはそれらのアナログ を患者に投与することを包含する方法。 ５３．高レベルのＬＤＬ受容体を有する腫瘍を患う患者の治療方法であって、腫 瘍の治療に有効な量の請求の範囲第４７項記載のアポＥもしくはそれらのアナロ グを患者に投与することを包含する方法。 ５４．患者のＬＤＬ受容体欠乏の診断方法であって、ＬＤＬ受容体の定量に有効 な量の請求の範囲第４７項記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与 することを包含する方法。 ５５．腫瘍が高レベルのＬＤＬ受容体を有している患者の腫瘍増殖の一次もしく は二次部位の診断方法であって、腫瘍を可視化するに有効な量の請求の範囲第４ ７項記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与することを包含する方 法。 ５６．患者の自己免疫疾患の治療方法であって、患者を治療するに有効な量の請 求の範囲第４６項記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与すること を包含する方法。 ５７．免疫不全疾患を患う患者の治療方法であって、患者を治療するに有効な量 の請求の範囲第４６項記載のアポＥもしくはそれらのアナログを患者に投与する ことを包含する方法。 ５８．請求の範囲第１項または第２２項記載の方法によって生成したアポＥもし くはそれらのアナログを含む脂質乳剤であって、該アポＥもしくはそれらのアナ ログがリガンドである脂質乳剤。 ５９．請求の範囲第５８項記載の脂質乳剤の薬物搬送および標的組織への誘導へ の使用 ６０．細菌ホストにおけるアポＥもしくはそれらのアナログの産生を、中和脂肪 酸類、脂肪酸前駆体類、トリグリセリド類、トリグリセリド前駆体類および酢酸 塩からなる群より選ばれる化合物の有効量を該ホストが増殖する培地に添加する ことにより増加させる方法。 ６１．中和脂肪酸が、プロピオン酸ナトリウム、ｎ−酪酸、β−ヒドロキシ酪酸 またはグリセロールである請求の範囲第６０項記載の方法。 ６２．トリグリセリドが、トリアセチン、トリブトリンまたはトリカプリリンで ある請求の範囲第６０項記載の方法。 ６３．トリグリセリド前駆体が、１モノミリストール−１ａｃ−グリセロール、 １−モノ−パルミチル−１ａｃ−グリセロールまたはＤＬ−α−ヒドロキシイソ 吉草酸である請求の範囲第６０項記載の方法。 ６４．酢酸塩が酢酸ナトリウムである請求の範囲第６０項記載の方法。 ６５．酢酸ナトリウムの有効量が、培地の硫酸ナトリウム濃度を０．１％ないし １％とする請求の範囲第６４項記載の方法。 ６６．酢酸ナトリウムの培地濃度が約０．５％である請求の範囲第６５項記載の 方法。 ６７．脂肪酸、トリグリセリドまたはグリセリド前駆体の有効量が、培養物の最 終濃度を約０．１％ないし０．５％とする請求の範囲第６０項記載の方法。 ６８．培養物中の最終濃度が約０．２％である請求の範囲第６７項記載の方法。 ６９．溶液中のアポＥタンパク質を、該溶液に中和脂肪酸類、脂肪酸前駆体類、 トリグリセリド類、トリグリセリド前駆体類、酢酸塩およびＥＤＴＡからなる群 より選択される化合物の有効量を添加することにより、分解から保護する方法。 ７０．溶液に添加した化合物の有効量が、該溶液中における該化合物の濃度を約 ０．１％ないし０．５％とする請求の範囲第６９項記載の方法。 ７１．溶液中における化合物の濃度が約０．２％である請求の範囲第７０項記載 の方法。