JPH08502730A

JPH08502730A - アポリポタンパクｅを用いた細胞増殖を阻害する方法

Info

Publication number: JPH08502730A
Application number: JP6506399A
Authority: JP
Inventors: ボーゲル、ティクバ; パネット、アモス
Original assignee: バイオ−テクノロジー・ジェネラル・コーポレーション
Priority date: 1992-08-12
Filing date: 1993-08-12
Publication date: 1996-03-26
Also published as: EP0659085A1; KR950702430A; NZ255732A; AU673543B2; AU5007293A; IL106664A0; WO1994004178A1; EP0659085A4; CA2141598A1; ZA935879B

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞を含めた活発に増殖する細胞の増殖を阻害するためのＡｐｏＥの使用を提供する。この方法は、細胞増殖を阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥと該細胞を接触することを具備する。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の名称〕アポリポタンパクＥを用いた細胞増殖を阻害する方法〔本発明の背景〕本発明は、細胞増殖を阻害する方法におけるアポリポタンパクＥの使用に関する。本出願の全体を通して、種々の刊行物を括弧内に引用した。これらの参照文献の完全な記載は、明細書の最後、即ち請求の範囲の直前に見出しうる。これらの刊行物全体に対する開示は、個々に開示され請求された本発明の日時現在の当業者に公知の分野の状態をより完全に開示するために、本出願中の参照文献によって本出願の一部をなす。〔背景技術〕正常組織において、細胞の成長およびＤＮＡ合成は、ポジティブおよびネガティブレベルの両方で作用する種々の調節因子によって密接に制御されている（We inberg et al.，1989）。正常細胞の固体腫瘍への進展のように、これは幾つかの変化を受ける（Folkman，1989; Liotta，1992）。生理学的なレベルでは、成長が刺激され、免疫性が減少され、新たな血管形成が誘導される。この新たな血管を誘導する能力、即ち血管形成および血管新生は、最も悪性な細胞の特徴であり、固体腫瘍増殖の必要条件である（D'Amore，1988;Folk-man，1976）。更に、腫瘍を穿通する新たな血管は、循環に腫瘍細胞が入り込むための定常的（freqen t）部位である。血管形成も転移性のコロニーの広がりに必要である（Aznavoorian，1991）。悪性細胞の成長に加えて、他の疾患も血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、および慢性関節リュウマチを含めた異常な血管新生によって特徴づけられる（Folkman，et al.，1989）。悪性細胞は、内皮細胞増殖および転移を刺激し、新たな毛細血管床を腫瘍モジュール内に形成させる種々の因子を産生する（D'Amore，1988; Shing，et al.， 1985）。種々の薬剤が、細胞増殖の可能なモジュレータ（これらにはヘパリンおよびヘパリン硫酸塩が含まれる（Castellot， etal.，1987; Clowes，1977）。）および成長因子、並びにこれらの阻害剤として示唆されている（Edelman， et al.，1992; Liu，1990; Schweigerer，et al.，1987）。これらのファクターのほとんどはまた、正常組織の天然成分として存在する。今日まで、研究されたほとんどの成長因子は、基本的な線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、即ち線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである（Ba-silico and Moscatelli，1992; Sc hweigerer，etal.，1987; Thomas and Gimenez-Gallego，1986）。ｂＦＧＦは強いヘパリン結合分子であり、実質的には全ての細胞に存在し、複数分裂および血管形成性の効果を有する（Thomas and Gimenez-Gallego，1986）。血管内皮細胞では、ｂＦＧＦは血管の形成および血管新生に影響を与える多くの機能を刺激する。ｂＦＧＦは、in vivoおよびinvitroの両方で最も強い血管新生誘導物質の１つであると考えられている（Folkman，1976; Folkman and Klagsb- run，1987）。最近、ｂＦＧＦの静脈内注射が、バルーン誘導された内皮の露出（balloon-induced endothelial denudation）の後、内皮の再生およびＳＭＣ増殖を刺激することが示された（Edelman，et al.，1992; Lindner and Reidy，19 91; Lindner，et al.，1990）。この研究では、ｂＦＧＦがin vivoでＳＭＣに対して血管新生性および分裂促進性であることが確認され、これら２種類の効果が対になっていることも示された。ｂＦＧＦはまた、細胞外マトリクッス（ＥＣＭ）および基底膜の両方のヘパランサルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する（Folkman，et al.，1988; Vlodavsky，et al.，1987）。従って、ｂＦＧＦはアテローム硬化性の血管障害の病因論において重要な役割を果たしうることが仮定されている。細胞成長および分化の調節におけるＨＳＰＧの役割が開示されている（Burges s and Maciag，1989; Klagsbrun and Baird，1991; Rouslahti and Yamaguchi， 1991）。多くのプロテオグリカンは、ＥＣＭまたはＦＧＦおよび他のヘパリン結合性成長因子の分子を含めた成長因子の相互作用のための低親和性細胞表面レセプターとしての機能の構成要素である。ｂＦＧＦのバインダーとしてのＨＳＰＧの役割は、分解からｂＦＧＦを保護することにあると思われ、ｂＦＧＦのマトリクッス若しくは細胞表面結合リザーバー（reservoir）を提供するということにおいて重要である。Yanon，et al.，（1991）は、ｂＦＧＦの高親和性レセプターに結合するｂＦＧＦが膜ＨＳＰＧのヘパランサルフェート側鎖または遊離のヘパランサルフェート（ヘパリン）鎖の何れかに予め結合することが必要であり、グリコサミノグリカンがｂＦＧＦのコンフォーメーションを変化し、その結果このレセプターに結合する能力を獲得しうるという推測をした。プロテオグリカンへの成長因子の結合は、ヘパリンまたはヘパランサルフェートに結合する幾つかの他の成長因子でも観測されている（Ruoslahti and Yamaguchi，1991）。プロテオグリカンがアジュバントおよび遍在する組織成分であるから、これらは、これらのほとんどの成長因子およびグリコサミノグリカンに親和性を有するサイトカインを誘引するようである。これは、成長因子およびサイトカインが、近距離間でのみこれらの標的細胞に作用することを意味し、細胞表面およびＥＣＭにおける（プロテオグリカン結合を通した）これらの固定化がその目的を達成することになる（Ruoslahti and Yamaguchi，1991）。アポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）はヘパリンおよびＨＳＰＧに対して強い親和性を有する血漿タンパク質である（Cardin，et al.，1988; Mahley，1988; Mahl ey，et al.，1979; Weisgraber，et al.，1986）。ａｐｏＥは、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）およびごく最近同定されたａｐｏＥレセプター、即ちＬＤＬレセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）を含む細胞表面レセプターとのその高親和性相互作用を通して血漿リポタンパク質代謝に関与している（Hewrtz，et al.，1988 ; Lund，et al.，1989; Yamada，et al.，1989; 1992）。ＬＤＬレセプターへの結合に応答しうるａｐｏＥのドメインはが同定されている（Dyer and Curtiss，1991; Wilson，1991）。このドメインは、ａｐｏＥ分子の残基１４０〜１６０よりなる２０のアミノ酸領域である。ＬＤＬレセプターへのＡｐｏＥの結合が脂質との組合せに依存するということが長く知られている（Innerarity，1979）。しかし、in vitroにおけるＬＤＬレセプターと結合する合成ペプチドの結果からは、ＬＤＬレセプターへのペプチドの直接の結合があると仮定されるか、またはＬＤＬレセプターが細胞の唯一の結合部位ではないことが推測されうる。高脂血漿性ウサギへのＡｐｏＥの静脈内投与が、血漿コレステロールレベルの低下を起こすことが示された（Mahley，et al.，1979; Yamada，et al.，1989）。最近（Yamada，et al.，1992）、Watanabeの遺伝性高脂血漿ウサギへＡｐｏＥの持続的な静脈内投与を行うと、アテローム硬化症の進行が顕著に阻害された。外来性のＡｐｏＥの投与は、大動脈のアテローム硬化症的な障害の数とサイズの両方に効果があった。しかし、これらの実験では、ＡｐｏＥ処理された動物と処理されていない対照動物との間の血漿コレステロールレベルの顕著な差がなかった。これらおよび他の実験を基にすれば、アテローム発生に関するＡｐｏＥの影響は、単独でもまた直接的にも血漿コレステロールレベルに関係していないであろう。ＡｐｏＥは、肝臓、腸管、副腎、腎臓、肺、脾臓、睾丸、子宮、および脳を含めた多くの組織においていたるところで合成される（Mahley ，1988）。最近、ＡｐｏＥが炎症性および非炎症性滑液の両方で見出された（Te rkeltaub，et al.，1991）。ＡｐｏＥは、局所的に脂質の再配分を調節することによって組織の修復に作用しうる（Hui，et al.，1980; Mahley，1988）。しかし、ＡｐｏＥが、コレステロールホメオスタシスに必ずしも関与しない多数の細胞によって合成され、分泌されることも観測されている（Boyles，et al.，1989 ; Hui，et al.，1980）。リポタンパク質代謝に関するその影響に加えて、ａｐｏＥはまた、脂質輸送に無関係な種々の機能も有している（Mahley，1988）。マイトジェンによるリンパ球の活性化の強い抑制およびＡｐｏＥ結合性リポタンパク質およびＡｐｏＥポリペプチドによる抗原の強い抑制が観測されている（Cardin，et al.，1988; Hui ，et al.，1980）。本発明は、幾つかの細胞タイプの増殖および転移に関するＡｐｏＥの効果を開示する。〔本発明の概要〕活発に増殖する細胞を阻害する方法が開示される。この方法は、細胞を細胞増殖を阻害するのに効果的な量でアポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）と接触させることを具備する。細胞増殖を阻害するのに効果的な量でアポリポタンパクを含有する組成物が提供される。加えて、本発明は、過度の細胞増殖に苦しんでいる患者を治療する方法であって、過度に増殖している細胞を効果的な量のアポリポタンパク質Ｅと接触させ、過度の細胞増殖を抑制することを具備した方法を提供する。更に、本発明は、腫瘍に悩まされている患者を治療する方法であって、該腫瘍を化学療法剤と共に効果的な量のアポリポタンパクと接触させ、腫瘍細胞の増殖を抑制することを具備した方法を提供する。加えて、本発明は、腫瘍に悩まされている患者を治療する方法であって、該腫瘍を所定量の照射と共に効果的な量のアポリポタンパク質と接触させ、腫瘍細胞の増殖を抑制することを具備した方法を提供する。加えて、本発明は、高められた血管新生を含む疾患に苦しんでいる患者を治療する方法を提供する。この方法は、血管新生を正常化するのに効果的な量のアポリポタンパクＥを患者に投与することを具備する。〔図面の簡単な説明〕図１：ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）ＤＮＡに［³Ｈ］チミジンを取り込ませたヘパリン結合性分子の効果を、プロトコルＭ２を用いて、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（１％および２．５％）のみ［対照（ｃｔｒ）］の存在下、または基底（ basic）線維増殖因子（ｂＦＧＦ）を加えて、例１および２に開示されているように試験した。（全ての他のサンプルは１０ng/mlを用いて試験した。）指示される場合には、０．０５または０．５μＭのｍｅｔ−アポリポタンパクＥ（それぞれ＋Ｅ．０５または＋Ｅ０．５）または組換えトロンボスポンジン（thrombos pondin）（ｒＴＳＰ）１８ＫｄがＦＣＳおよびｂＦＧＦを含むウェルに加えられる。有糸分裂誘発のアッセイを４２時間後に終わらせた。図２：ＢＡＥＣＤＮＡへの［³Ｈ］チミジンの取り込みの時間経過を観測した。ＤＮＡ合成を、有糸分裂誘発のプロトコルＭ２（例１の方法参照）に従って新たに付着された細胞培養物で試験した。細胞を、ｂＦＧＦ（１０ng/mlおよび、１％ＦＣＳのみ（ｃｔｒ）若しくは０．５μＭの指示分子（indicated molecule s）［（ｒＴＳＰ）１８Ｋｄ）組換えフィブロネクチン（ｒＦＮ）３３ｋｄまたはｍｅｔ−ａｐｏＥ］と一緒のものを含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）にプレート化した。図３：予め付着されたＢＡＥＣ培地への［³Ｈ］チミジンの取り込みを、０．５％ＦＣＳのみ若しくはｂＦＧＦ（１０ng/ml）と一緒のものの何れかでプロトコルＭ１に従って試験した。指示された濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥをプレート化後５日に細胞に加え、［³Ｈ］チミジンの取り込みを、細胞に５時間適用した後、次の日にプロトコルＭ１で示されるように試験した。図４：予め付着され、密集したＢＡＥＣの培養物を、予めプレート化された培養物中で試験した。０％若しくは０．５％ＦＣＳ（それぞれ０および．５）をｂＦＧＦ、１０ng/ml（それぞれ０Ｆおよび．５Ｆ）と共に用いるか、または０．５μＭのｍｅｔ−ａｐｏＥ（それぞれ０ＦＥおよび．５ＦＥ）を使用して、有糸分裂誘発をプロトコルＭ１に従って試験した。有糸分裂誘発のアッセイを４０時間で終わらせた。図５：ＢＡＥＣ培養物への［³Ｈ］チミジンの取り込みを、時間ゼロ（０〜４０としてデザインされた）またはプレート化後１５時間若しくは２２時間（それぞれ１５〜４０時間および２２から４０時間としてデザインされた）で新たにプレート化された培養物に加えられるｂＦＧＦ（１０ng/ml）および、ＦＣＳ単独（対照）若しくはｍｅｔ−ａｐｏＥ（０．５μＭ）と一緒のものの（図に示されているように）二種類の濃度の１つの存在下に試験した。［³Ｈ］チミジンも、Ｍ２プロトコルに示されるようにゼロ時に全てのウエルに加え、アッセイを４０時間後に終わらせた。取り込みは、ＡｐｏＥの存在しない場合の同じ時間の［³ Ｈ］チミジンでラベルされた対照に対するパーセントとして表した。図６：ＡｐｏＥによる抑制に関するｂＦＧＦの影響を試験した。増殖アッセイを、５％ＦＣＳ単独（ｃｔｒ）若しくは２０ng/mlのｂＦＧＦを含んだものの存在下でプロトコルＰ１に示されるように、ＢＡＥＣ−１の培養物で行った。指示された場合は、種々の濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥを細胞のプレート化の後１日で加えた。該細胞数をプロトコルＰ１で示されたようにモニターした。図７：ウシ角膜内皮細胞（ＣＢＥＣ）培養物への［³Ｈ］チミジンの取り込みを、指示されたように（０％、１％、または２％）種々の濃度のＦＣＳ（ｃｔｒ）を用いて試験した。これに成長因子を単独で（ｂＦＧＦ［１０ng/ml］若しくはＥＧＦ［５０ng/ml］）、またはｍｅｔ−ａｐｏＥ（Ｅ、０．５μＭ）若しくはＦＮ３３Ｋｄ（ＦＮ、０．５μＭ）と共に加えた。有糸分裂誘発アッセイをプロトコルＭ２に示されたように行い４４時間後に終わらせた。図８：増殖アッセイを、ＦＣＳ並びにｂＦＧＦ単独（対照）の存在下において、それぞれ５％および１０ng/mlで、プロトコルＰ２に示されているようにＣＢＥＣの培養物で行った。指示される場合は、種々の濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥ若しくはＦＮ３３（ｒＦＮ３３Ｋｄ）を時間ゼロで該細胞に加えた。全く同じ３つのサンプルの平均の吸光性（absorvancy）を計算し、対照に対するパーセントとして表した。図９：ＡｐｏＥ抑制の可逆性を試験した。１％ＦＣＳおよび１０ng/mlｂＦＧＦ中のＣＢＥＣ培養物を、プロトコルＭ２（対照）を用いて標識の４０時間後の［³Ｈ］チミジンの取り込みに対して試験した。同様な（parallel）培養物に対して、ｍｅｔ−ａｐｏＥを指示された濃度でゼロ時に加え、全標識期間（０〜４０）または２２時間のみ（０〜２２）放置した。全ての試験培養物に対して、２２時間後に培地を、出発の濃度のＦＣＳ、ｂＦＧＦ、および［³Ｈ］チミジンを含む適切な組合せで置き換えた。例１０：Ａ２０５８ヒトメラノーマ細胞の培養物への［³Ｈ］チミジンの取り込みを、プロトコルＭ２に開示されているように、および、０．５％ＦＣＳ並びにｂＦＧＦ（１０ng/ml）単独（ｃｔｒ）または、０．５μＭおよび１．５μＭのｍｅｔ−ａｐｏＥ（それぞれ０．５Ｅおよび１．５Ｅ）、０．５μＭＳＰ１８Ｋｄ（０．５Ｔ１８）、０．５μＭＴＳＰ２８Ｋｄ（０．５Ｔ２８）、若しくは０．５μＭＦＮ３３Ｋｄ（０．５ＦＮ３３）を含むものの存在下で試験した。アッセイは３２時間後に終わらせた。図１１：ヒト乳房腫瘍（mammary tumor）（ＭＤＡ−４３５）細胞の培養物への［³Ｈ］チミジンの取り込みをプロトコル２に従って、および０．５％ＦＣＳおよびｂＦＧＦ（１０ng/ml）単独（ｃｔｒ）の存在下、または０．５μＭのｍｅｔ−ａｐｏＥ（Ｅ）またはＴＳＰ１８Ｋｄを加えて、または７５μｇ／mlヘパリン（Ｈｅｐ）を加えて行った。アッセイを４２時間後に終わらせた。図１２：平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を、０．５％若しくは５％ＦＣＳ単独（ｃｔｒ）、またはｂＦＧＦ（＋Ｆ，２０ng/ml）と組み合わせたものの存在下で、プロトコルＰ１に示されたように行った。指示される場合は、ｍｅｔ−ａｐｏＥ（Ｅ）（４μＭ）をゼロ時に培養物に加えた。図１３：³⁵Ｓ−メチオニンの取り込みを、公表されている方法（D．Blake 199 0）を僅かに変更して試験した。手短に言えば、ＣＢＥＣ細胞を６−ウェルの組織培養皿に１０５細胞／ウェルでＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳでプレート化した。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、培地をＤＭＥＭマイナスメチオニン（メチオニンの消耗に対して）のみまたはｍｅｔ−ａｐｏＥ（０．５μｍ）を含むものに変化させた。１時間後に、０．２５μＣｉ［³⁵Ｓ］メチオニン（１２６８Ｃｉ／mmol、Amersham）を加え、培養物を３７℃／５％ＣＯ₂で６時間インキュベートした。細胞を、１０mMＥＤＴＡおよび１mMフェニル−メチル−スルホニルを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで同じバッファーに懸濁した。細胞を２０mMの水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ ＯＨ）で溶解し、該細胞溶解物のアリコートを５倍容積の２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させた。氷中で１０分後、ＴＣＦ溶液を、ガラスミクロフィルター（ＧＦ／Ｃ、ワットマン）で濾過し、フィルターを５％冷ＴＣＡで３回、７０％エタノールで１回洗浄した。ＴＦＡに不溶な［³⁵Ｓ］メチオン標識されたタンパク質の放射活性をβ線をカウントすることによってモニターした。図１４：ｂＦＧＦに対するＢＡＥＣの走化性を、５μｍポアサイズのポリカーボネートのＰＶＣを含まないヌクレオポアフィルター（nucleopore filters）を用いて、先に開示されているように（Taraboletti，1990）、修正されたＢｏｙｄｅｎチャンバー中で行った。半集密化した細胞をトリプシン化し、１０％ＦＣＳで洗浄し、室温において２時間１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ中で振蓋しながら平衡にさせ、次いでペレット化し、０．１％ＢＳＡを含有する培地に再懸濁した。細胞を１０⁶／mlの濃度ですぐに使用し、０．１％ＢＳＡ単独のグラジェント（ｃｔｒ）若しくはｂＦＧＦ（３３ng/ml）を含むものに対して、単独若しくはｍｅｔ−ａｐｏＥ（Ｅ）の指示された濃度で移動をチェックした。全く同じ３つのサンプルで移動した細胞を３７℃で４．５時間インキュベートした後モニターし、０．１％ＢＳＡ（ｃｒｔ）に対する移動のパーセントとして表した。図１５：この図はプラスミドｐＴＶＲ５９０−４を示す。このプラスミドはＡＴＣＣアクセッシヨンナンバー６７３６０でＥ．ｃｏｌｉＷ１４８５として寄託された。プラスミドｐＴＶＲ５９０−４は、例１に示されるように^λＰ_Lプロモータの制御下でｍｅｔ−ａｐｏＥのよい発現体である。（Ｅ．ｃｏｌｉＷ１４８５は、アクセッションナンバー１２４３５で、ＡＴＣＣから自由に利用できる。）図１６：アミノ酸１−２１７を含有するＡｐｏＥをコードするプラスミドｐＥ２−５の構成が開示されている。プラスミドｐＴＶ１９４−８０（相互に掲げられている米国特許第５，１２６，２５２で開示されている、図２２）を制限酵素ＢｓｓＨＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。大きなフラグメントを単離し、図で示される合成リンカーに結紮した。得られたプラスミドをｐＥ２−５と表した。図１７：アミノ酸１−２１７を有するＡｐｏＥを発現するプラスミドｐＴＶＲ６−２の構成が開示されている。ｄｅｏＰ１プロモーター配列部分の制御下で^λ ＣＩ遺伝子を含有する１２００ｂｐフラグメントを、プラスミドｐＦＳＡＬ−Ｂ２７（ＡＴＣＣアクセッションナンバー６７０７１；またヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．３０３，９７２）のＣｌａＩ消化物から単離した。次に、１２００ｂｐフラグメントをＣｌａＩ消化されたプラスミドｐＥ２−５（図１６）を結紮した。得られたｐＴＶＲ６−２と表されるプラスミドは、ＡｐｏＥ構造遺伝子および^λ ＣＩ抑制因子遺伝子の両方を含み、従って、これは^λＣＩ抑制因子を含んでいるホストでの使用に制限されない独立のプラスミドであるが、非常に多くのホストでＡｐｏＥポリペプチドフラグメントを発現することができる。追加のＮ−末端メチオニンが存在するか否かは現在知られていない。プラスミドｐＴＶＲ６−２を、Ｅ．ｃｏｌｉ４３００として、American Type Calture Collec-tion，12301 Parklawn Drive，R ockville，Mary-landに、アクセッションナンバー６９３６４で１９９３年７月２６日に寄託した。図１８：培養物中のマウス内皮腫ＥＮＤ２の増殖に関するＡｐｏＥの影響を試験した。ＥＮＤ２細胞の増殖アッセイをウェル当たり２０，０００の細胞を用い、０．５％ＦＣＳおよび指示された濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥの存在下で例７のように行った。図１９：ＢＡＥＣおよびＣＨＯ細胞の増殖に関するＡｐｏＥの影響を試験した。ＢＡＥＣおよびＣＨＯ細胞の増殖は、例２に示されるように０．５％ＦＣＳおよび指示された濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥの存在下で、３０，０００細胞／mlで行った。図２０：ＢＡＥＣおよび神経芽腫細胞の増殖に関するａｐｏＥの影響を試験した。ＢＡＥＣおよび神経芽腫Ｎ１８ＴＧ２の増殖を、例２で説明したように０．５％ＦＣＳおよび指示された濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥ（２０Ａ）およびＡｐｏＥｐｅプチド３４８（２０Ｂ）の存在下で、１ｍｌ当たり２０，０００の細胞で行った。図２１：ＡｐｏＥの抗増殖活性の熱安定性を試験した。ＢＡＥＣ細胞（３０，０００細胞／ml）の増殖を、例２で説明したように、０．５％ＦＣＳおよび指示された濃度の熱処理されていないｍｅｔ−ａｐｏＥ若しくは熱処理された（１００℃で１時間）ｍｅｔ−ａｐｏＥの存在下で試験した。図２２：ｍｅｔ−ａｐｏＥの抗増殖活性に関する血清濃度の影響を試験した。ＢＡＥＣ細胞の増殖を０．５％および２．５％ＦＣＳにおいて、および指示された濃度のＡｐｏＥの存在下で、外来性の成長因子を加えずに測定した。ｍｅｔ− ａｐｏＥは例２で示されるように高血清濃度で低度の抑制を示した。図２３：ＥＮＤ−２細胞の増殖に関するａｐｏＥ６−２と命名したＡｐｏＥの影響を試験した。ＥＮＤ−２の増殖を、例８で説明されるように、０．５％ＦＣＳおよびプラスミドｐＴＶＲ６−２（図１７）によってコードされる指示された量のＡｐｏＥポリペプチドフラグメントの存在下で、図１８に示されるように測定した。図２４：ＡｐｏＥポリペプチドの抗増殖活性に関する血清濃度の影響を試験した。ＢＡＥＣ細胞の増殖を、例８で説明したように、０．５％および２．５％ＦＣＳおよび指示された濃度のＡｐｏＥポリペプチドａｐｏＥ６−２で測定した。図２５：ＡｐｏＥによるヘパリン活性の逆転を試験した。ＡｐｏＥはヘバリンに対して高い親和性を有しており、ＡｐｏＥのこの特性は、ヘパリン、抗トロンビンIIIおよびトロンビンよりなる複合体に関するｍｅｔ− ａｐｏＥの影響によって研究された。該複合体へのＡｐｏＥの添加は、ヘパリンの抗トロンビン活性の抑制で起こるヘパリン活性を逆転させる。ペプチド１８５と命名された非反応性の短いペプチドをネガティブな対照として使用した。第２のネガティブな対照［ｃｏｎｔ（−）］は何れのＡｐｏＥも含んでいない。ポジテイブな対照［ｃｏｎｔ（＋）］はヘパリンを含んでいない。結果は、トロンビン活性の５０％が阻害されるＡｐｏＥの濃度でヘパリン：ＡｐｏＥの比が約３：１であること、即ちＡｐｏＥの各々の分子に２〜３分子のヘパリンが結合することを示している。〔本発明の詳細な説明〕本発明は、活発に増殖する細胞を阻害する方法であって、活発に増殖する細胞を増殖を、阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥと接触することを具備した方法を提供する。増殖の阻害は、該細胞の増殖の速度の減少を意味する。該細胞は、平滑筋細胞、内皮細胞、例えば大動脈若しくは角膜内皮細胞、または腫瘍細胞、例えばヒトメラノーマ細胞、乳房腫瘍細胞、ヒト肉腫細胞若しくはカルチノーマ細胞でありうる。当業者に知られた他の活動的な増殖細胞のタイプも本発明の方法に含まれる。活発に増殖する細胞の増殖を阻害するためのアポリポタンパクＥおよび適切な担体を含有する組成物も提供される。加えて、過度の細胞増殖に苦しめられている患者を治療する方法であって、過度の細胞増殖を阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥを該患者に投与することを具備した方法を提供する。このような方法は、化学療法剤または照射治療のような他の治療手段と組み合わせてアポリポタンパクＥを投与すること、即ち他の治療方法の前、治療中、若しくは後にＡｐｏＥを投与することを含みうる。アポリポタンパクＥと組み合わせて使用するための他の治療手段は、当業者に公知であり、本発明の手段にも包含される。過度の増殖を阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥおよび薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物が提供される。一つの態様では、過度の細胞増殖は腫瘍である。ここで使用されるアポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）の語は、由来、例えば天然に存在するもの若しくは遺伝子組換えによるものにかかわりなく何れのポリペプチドも包含する。該ポリペプチドには細胞の増殖を阻害する生物活性に必要な天然由来のａｐｏＥの配列および突然変異体（この配列は、細胞の増殖を阻害する生物活性をこのような突然変異体に与える１以上、典型的には１０以下のアミノ酸によって変化する。）が含まれる。天然に存在するａｐｏＥは、当業者に公知の方法で血漿若しくは血清から得られ、更に例えばCalbiochem cat．no．178466から商業的に入手しうる。組換えＡｐｏＥは一般に、組換えＡｐｏＥを産生する処理細胞（ｅngineered cells）から得ることができる。該細胞は、この細胞がＤＮＡ配列を発現し得、組換えＡｐｏＥポリペプチドを産生する限り、組換えＡｐｏＥをコードするＤＮＡ配列が組換えＤＮＡ技術で導入された任意の系（stra-in）でありうる。該細胞は、プラスミドのようなベクターＤＮＡ分子中に組み換えＡｐｏＥをコードするＤＮＡ配列を含有しうる。該ベクターＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ技術で構築され、組換えＡｐｏＥをコードする配列が該ベクター中の適切な位置に組み込まれうる。該細胞は好ましくは細菌細胞若しくは他の単細胞微生物であるが、酵母、昆虫若しくは哺乳類細胞のような真核生物細胞も組換えＡｐｏＥを産生するのに使用しうる。一つの態様では、ＡｐｏＥは、必須でない１以上、典型的には１０以下のアミノ酸残基の付加、欠失、若しくは置換による、天然に存在するポリペプチドと異なった組換えａｐｏＥの突然変異体であるが、生じるポリペプチドはａｐｏＥの細胞増殖阻害活性を維持しているものである。当業者は、公表された周知の手順を用いて、どのアミノ酸残基が付加され、欠失され、または（どのアミノ酸がこのような置換を受けうるかを含めて）置換されたかを容易に決定することができる。該周知の手段には、例えば目的のポリペプチドの突然変異体の細菌による発現をコードするＤＮＡ配列のデザインおよび形成、部位特異的突然変異誘発によるｃＤＮＡおよびゲノム配列の修飾、組換えタンパク質および発現ベクターの構築、並びに従来の生化学的アッセイを用いるポリペプチドの生化学的活性の決定のための従来の方法が含まれる。ａｐｏＥの突然変異体の例は、天然に存在するａｐｏＥの全てのアミノ酸残基よりも少ない残基を含有する欠失変異株であり、置換変異株は１以上の残基が他の残基で置換されているものであり、付加変異株は１以上のアミノ酸残基がポリペプチドに加えられているものである。全てのこのような変異株は天然に存在するａｐｏＥの細胞増殖阻害活性を有している。天然に存在するアポリポタンパクＥと実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸残基のＮ末端で４つよりも少ないアミノ酸を付加若しくは欠失したものでありうる。ポリペプチドの細胞増殖を阻害する生物学的活性を失わない配列で追加の置換および／または欠失が起こりうる。このような置換および欠失は当業者に公知である。置換は、Lehninger，Biochemistr y ，2nd ed．Worth Pub.，N．Y．（1975）; Creighton，Protein Structure，a P ractrical Approach ， IRL Press at Oxford Univ．Press，Oxford，England（1 989）;およびDayhoff，Atlas of Protein Sequence and Structure 1972，Natio nal Biomedical Research Foundation，Maryland（1972）によって開示されている相同の若しくは等価のグループに従って約１０残基まででなされうる。特別の態様では、ＡｐｏＥは組換えａｐｏＥ、例えばＮ末端で追加のメチオニンを有する天然に存在するａｐｏＥの配列を含有する組み換えポリペプチドである。「アポリポタンパクＥ」の語には、組換えＡｐｏＥおよび天然に存在するａｐｏＥのポリペプチドフラグメントであって、ＡｐｏＥの細胞増殖阻害活性を示すものが包含される。このようなフラグメントの１つの例は、１９９３年１月５に発行された米国特許第５，１７７，１８９に開示されている１５−ｍｅｒ−フラグメントである。このようなポリペプチドフラグメントの追加の例としては、天然に存在するａｐｏＥのアミノ酸１−２１７または１−１８５がある。天然に存在するａｐｏＥのアミノ酸１−２１７を有するＡｐｏＥポリペプチドの特別な態様は、プラスミドｐＴＶＲ６−２（図１７）によってコードされる。該プラスミドは、アクセッションナンバー６９３６４で１９９３年７月２６日にＥ．ｃｏｌｉ４３００として、American Type Culture Collection，12301 Perklawn Drive，Rockville，M arylandに寄託された。他のフラグメントは、天然に存在するａｐｏＥまたは組換えｍｅｔ−ａｐｏＥのトロンビン消化によって生成される２２ＫＤのＮ末端ＡｐｏＥポリペプチドである。同様のａｐｏＥポリペプチドは、上記の何れのプラスミドを基にして構築されるプラスミドから当業者によって得ることができ、これらの使用は本発明で定義したクレームによって含まれる。このようなプラスミドを構築するためおよびこのようなポリペプチドを得るための手順は、当業者に周知であり、多数の刊行物に開示されている。この刊行物には、Smab-rook，Fritsch and Maniatis，Molec ular Cloning: A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Labor atory Press，USA （1989）が含まれる。要するに、本発明の方法は、天然に存在するａｐｏＥと少なくとも実質的に同様の細胞増殖阻害活性を有する何れのＡｐｏＥでも実施しうる。更に、本発明は、増殖細胞のＤＮＡ合成を阻害するinvivo法を提供する。この方法は、ＤＮＡ合成を阻害するのに効果的な量で該細胞とＡｐｏＥを接触させることを具備する。本発明はまた、内皮細胞の走化性応答を阻害するinvitro法を提供する。この方法は、走化性応答を阻害するのに効果的な量で細胞とＡｐｏＥを接触させることを具備する。ここで使用される走化性応答は、刺激に対する応答で細胞が移動することを意味する。本発明は、成長因子にさらされることによって移動を誘発された細胞が、ＡｐｏＥと移動した細胞を接触することによって阻害される方法を提供する。走化性応答を阻害するのに効果的な量は、増殖因子に応答して刺激された細胞の移動を阻害するのに効果的な任意の量である。ＡｐｏＥが大動脈および角膜内皮細胞並びに乳癌細胞を含めた種々の哺乳類細胞、メラノーマ、並びに平滑筋細胞の増殖を阻害することが、ここで開示される。ここで使用されるカルチノーマは、悪性上皮腫瘍をいう。更に、ＡｐｏＥは大動脈内皮細胞を阻害するので血管新生を阻害するようである。血管新生、即ち新たな血管の形成がない場合では、細胞は活発に増殖することができない。腫瘍細胞の場合は、血管新生の抑制は増殖の阻害を起こし、これによって腫瘍の増殖が抑えられる。結果として、ＡｐｏＥの投与は、腫瘍細胞の成長および転移の阻害を付随した新たな血管成長の形成（血管形成）の阻害のための新たな治療である。従って、間接的には血管形成の阻害によって、直接にはＡｐｏＥによってメラノーマ、肉腫、リンパ腫および白血病細胞を含めた広範囲の腫瘍細胞の増殖が阻害される。ＡｐｏＥが平滑筋細胞の増殖を阻害することがここで開示される。異常な血管新生によるプラークおよび転移組織の形成および進行には、プラークまたは転移組織の部位への平滑筋細胞の移動が付随する。平滑筋細胞の増殖の阻害は、プラークおよび転移組織の形成の進行を妨げうる。更に、平滑筋細胞の異常な血管新生は肉腫の形成を導く。ここで使用される肉腫は軟組織腫瘍を意味する。従って、平滑筋細胞の増殖を阻害するためのＡｐｏＥによる治療も提供され、これによってプラーク、転移組織、および肉腫の腫瘍の形成および進行を調節するための治療が構築される。ＡｐｏＥが、異常な血管新生によって特徴づけられる疾患に悩まされている患者の治療のために血管形成の阻害剤として治療に使用されうることを更に提供する。異常な血管新生とは、高められ増強された血管を形成する能力を意味する。異常な血管新生の例には、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、慢性関節リュウマチ（Folkman et al.，1989）および血管腫のような疾患が含まれる。哺乳動物の体において、細胞は活発に増殖しうる。これは、細胞が癌細胞であるか、または外来性若しくは天然に存在する成長因子、或いは血清因子によってまたは他の応答に対して刺激されるためである。好ましくはＡｐｏＥは、薬学的に許容しうる担体として投与される。薬学的に許容しうる担体には、無菌溶液、錠剤、コートされた錠剤およびカプセルのような標準の薬学的担体のどれでも含まれる。典型的には、このような担体には、澱粉、ミルク、砂糖、幾つかのタイプのクレイ（clay）、ゼラチン、ステンジン酸（stensicacid）、タルク、植物脂肪若しくはオイル、ゴム、グリコールまたは他の公知の賦形剤のような賦形剤が含まれる。このような担体はまた、香味剤、および着色添加剤、並びに他の成分を含有しうる。このような担体を含有する組成物は周知の従来の方法によって製剤化される。しかし、活発に増殖する細胞の増殖を阻害するのに効果的な量でＡｐｏＥを含有する組成物は以前には知られていない。本発明の方法において、ＡｐｏＥを含有する組成物の投与は、経口、静脈内、筋肉内、および皮下投与を含めた（しかしこれらには限定されない。）何れの周知の方法によっても効果があり得る。本発明の方法の実施において、組成物中に含まれるアポリポタンパクＥの量は大きく変化する。細胞の増殖を阻害するのに効果的なＡｐｏＥの量は０．１mg〜１ｇのＡｐｏＥである。正確な量および投与量の投与頻度は、製剤の特徴、患者の体重および症状、腫瘍のサイズ、投与の経路と頻度、並びに使用される個々のＡｐｏＥの特徴に基づいて当業者によって容易に決定されるであろう。〔実施例〕本発明は、以下の例によって例示される。これらの例は特別な具体例を提供し、本発明の理解を助けるために示されているが、以下の請求の範囲に示される本発明の何れの方法も制限することを意図するものではなく、また制限すると考えるべきではない。例１．方法と材料Ａ．細胞増殖を測定するのみ使用される方法と材料細胞増殖を、異なった増殖条件下で、³Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定することによるＤＮＡ合成（有糸分裂誘発）を含めた種々の方法によって評価し、更に、細胞数に関連した酵素活性によって直接に細胞数を定量することにより増殖を評価した。ポリペプチド組換えｍｅｔ−ａｐｏＥは、Ｎ末端メチオニンを有するヒトＡｐｏＥ３異性型（isoform）のアミノ酸配列を含んでおり（Vogel，et al.，PNAS 1985）、以下のセクションＢで説明されるように生成される。血漿性のａｐｏＥは、S．Eiesengerg（Laboratory of Lipids，Hadassa Medic al School，Ein Kerem，Jerusalem）によって好意的に提供された。これは、Ｅ３異性型に対して同型接合性の健康な人ボランティアから先に示されているように誘導される血漿リポタンパク質から単離される（Rall S.C． et al.，Methods In Enzymology128:273（1986））。ａｐｏＥのアミノ酸１−２１７にわたるＡｐｏＥ６−２と命名されたＡｐｏＥは、例８に示されたように生成される。ペプチド３４８と命名されたＡｐｏＥ、ａｐｏＥのアミノ酸１４１−１５５にわたるタンデムな二量体ペプチドは、例２に示されたように生成される。Ｃ末端を除去したａｐｏＥのトロンビン消化によって生産されるＡｐｏＥは、例８に示されたように生産される。組換えＴＳＰ１８は１８Ｋｄのポリペプチドフラグメントであり、組換えＴＳＰ２８は２８Ｋｄポリペプチドフラグメントであり、これらの両方とも、それぞれヒトトロンボスポンジンのアミノ酸１〜１７４および１〜２４２を含むヘパリンドメインを含有する。ｒＦＮ３３は、アミノ酸１３２９〜１７２２を含有するヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインから成る３３ｋＤの組換えポリペプチドフラグメントであるが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠いている。３３ｋＤのポリペプチドフラグメントをコードするｐＦＮ１３７−２と称されるプラスミドは、共に関連する１９８８年１２月２９日に提出された米国特許出願番号第２９１，９５１に開示され、ＡＴＣＣアクセッションナンバー６７９１０としてEscherichia coli株Ａ４２５５として寄託されている。先にリストされた組換えポリペプチドは−７０℃で凍結乾燥され保存された。ｍｅｔ−ａｐｏＥは、まず２mg／mlの濃度で蒸留水に溶解され、次いで０．１倍容量の１０ＸＰＢＳを加えることによって再構成された。ｒＦＮ３３を３．５〜５mg／mlの濃度で蒸留水に溶解した。ｒＴＳＰ１８及び２８を、まず０．５ mg／mlで蒸留水に溶解し、１０mMの重炭酸ナトリウムｐＨ９．５で平衡化したＰＤ１０カラムで脱塩し、次いで同じバッファーで溶出した。次に１０ＸＰＢＳの溶液の１０分の１の容量を加えた。ポリペプチドサンプルを、−２０℃で少量のアリコートに保存し、１カ月以内に使用した。ヘパリン（ナトリウム、注射ＵＳＰ、１０００Ｕ／ｍ１０、６．２５mg／ml）をリリー（Lilly）で供給した。細胞系と試薬ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）は、Dr．E．Gallin（AFRY，Bethesda，MD）から好意的に提供され、５〜１０継代で使用された。ＢＡＥＣ培養物を、通常の方法で１０％ＦＣＳ、４mMグルタミン、０．５mg／mlアスコルビン酸並びに５００u／mlペニシリン及び５００u／mlストレプトマイシン（Biofluids Inc.，Rock ville，MD）を含有する低グルコースＤＭＥＭに維持された。ウシ角膜内皮細胞（ＣＢＥＣ）は、Dr．D．Blake（Ma-harry Medical Collleg e，Nashville，TN）によって好意的に提供され、２〜８継代で使用された。ＣＢＥＣ培養物を、通常の方法で１０％ＦＣＳ、4mMグルタミン、５００u／mlペニシリン、５００u／mlストレプトマイシン及びフンギゾン（Fungison ）（BioFluids，Rockville，MD，20850）を含有する低グルコースＤＭＥＭに維持された。培地を２〜３日ごとに交換した。ヒトメラノーマ細胞系Ａ２０５８細胞（Todaro，et al．Proc．Natal．Acad． Sci．U.S.A.，77，5258-5262，1980）及びヒト乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ４３５（Coill-ean，et al.，（1978）In Vitro 14，911-915）を、１０％ＦＣＳ、４mMグルタミン、並びにBiofluids Inc.，Rockville，MD 20850，USAから購入した５００u／mlペニシリン及び５００u／mlストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭに維持した。ヒト平滑筋線維芽細胞（ＳＭＣ）を、National Ca ncer Institute，National Institute of Health，Bethesda，MarylandのDr．Ph ilip Browningから得た。該細胞を、１０％ＦＣＳ、４mMグルタミン、５００u／mlペニシリン及び５００u ／mlストレプトマイシン（Biofluidsから購入）を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。ミドル−Ｔ（Middle-T）抗原を発現するマウス内皮腫細胞（ＥＮＤ２）（Will iams et al.，Cell 57:1053（1989））は、I．Voldavsky（Hadassa Medical Sch ool，Ein Kerem Jerusalem）によって提供された。ＥＮＤ２細胞を、通常の方法で１０％ＦＣＳ、４mMグルタミン、各５００U／mlずつのペニシリン及びストレプトマイシンを含有する低グルコースＤＭＥＭに維持した。ＥＮＤ２細胞を５〜８日間培養した後、通常７０〜８０％の集密度（confluen cy）で使用した。培地の成分をKibbutz Beit Haemek，Israelから得た。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及び神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２細胞（Z．Vogel，Weizmann Institu-te）を、通常の方法で１０％ＦＣＳ、２mMグルタミン、各５００U／mlずつのペニシリン及びストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭに維持した。培地の成分を、Kib-butz Beit Haemek，Isra elから得た。アッセイＡｐｏＥ及びｂＦＧＦは両方とも、該細胞表面及びＥＣＭの両方でヘパリン及びＨＳＰＧに対して高い親和性を示すヘパリン結合性分子である。ｂＦＧＦで刺激された成長に関するＡｐｏＥの影響を、２つの分離した系において幾つかの細胞タイプで試験した。これは、有糸分裂誘発−ＤＮＡへの［³Ｈ］チミジンの取り込みを追跡することによる；及び増殖−培養物中の実際の細胞数を測定することによるものである。１．有糸分裂誘発の阻害プロトコルＭ１：予め接着された密培養物（dense cul-ture）２４−ウェル組織培養プレートのインナープレートにおいて、１０％ＦＣＳを補充した０．５mlの培地に細胞を１０⁵／ウェルでまいた。３日後、該細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＣＳを含有する０．５mlの培地を供給し、４８時間この培地中でそのままにしておいた（飢餓条件）。次に、試験される成長因子を含有する血清を含まない培地を該ウェルに加え、２２時間後に該細胞を［メチル −³Ｈ］チミジン（８６．１Ｃｉ/mmol、ＮＥＮ；２．５μＣｉ／ウェル）で５時間標識した。有糸分裂誘発アッセイを停止するために、該細胞を２回１mlのＰＢＳで洗浄し、メタノール／酢酸（３：１）溶液０．３mlで固定し、０．５mlのエタノール（８０％）で２回洗浄し、空気乾燥した。該細胞を、３００μｌのトリプシン／ＥＤＴＡでインキュベートし（３７℃で１時間及び室温で３０分）、１００μｌの１％ＳＤＳを加えることによってウェルから抽出した。抽出物の放射活性は、シンチレーションカウンターで測定した。プロトコルＭ２：新たに付着された培地−密培養物Ｔ−１５０ｃｍ²のフラスコ中の細胞の集密単層をＰＢＳで一回洗浄し、次いで０．５％ＦＣＳを含有する培地で４８時間インキュベートした（飢餓条件）。細胞をトリプシン化し、１０％ＦＣＳ含有培地で洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有する培地に再懸濁し、種々の濃度のＦＣＳ、成長因子、及び［³Ｈ］チミジン（プロトコルＭ１で示された濃度で）の存在下において２×１０⁴細胞／ウェルで２４−ウェルプレートにまいた。異なった時間点（図の解説で示されている）で有糸分裂誘発をプロトコルＭ１で説明したように停止した。２．増殖の阻害プロトコルＰ１：１０⁵の細胞を３５mmの培養皿にプレート化し、１０％ＦＣＳ含有培地中において２４時間付着させ、次いで５％ＦＣＳ及び試験される成長エフェクターを含有する培地を再度供給した。７２時間後、細胞をトリプシン化することによってプレートから剥がし、これらの数をコールターカウンターでモニターした。プロトコルＰ２：本プロトコルを、Danizot et al.，J．Immunol．Meth．89:2 71（1986）に開示された方法を基にして、細胞力価９６ＴＭ非放射活性細胞検定法（cell titer 96TM nonradioactive cell assay）（Promega ＃G4000）を用いて行った。５〜３０×１０³細胞を、５％ＦＣＳと共に指示された濃度の成長エフェクターを含有する培地において、９６−ウェルの培養皿の各々のウェルにプレート化した。７２時間後、１５μｌの色素溶液を各々のウェルに加え、該プレートを更に４時間インキュベートした。次に、１００μｌの可溶化溶液を加え、２４時間後ウェルに保持された色素の量を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、５７０nmでの吸光性（absorbancy）を記録することによって試験した。３．ＥＮＤ２血管腫モデル上記のように成長されたＥＮＤ２細胞を、培養中で５日後、中間の集密度でトリプシン化することによって取り出した。次に細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭに懸濁し、遠心し、血清を含まない基底ＤＭＥＭに６×１０⁶細胞／ml （または指示された別の方法によって）で再懸濁し、氷上で保存した。次に該細胞を細胞外基質組成物（Matrigel，H．Kleinman，Dental Institute，National Insti- tutes of Health）で１：１に希釈した。０．１mlのアリコートを、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ）の後ろ足に注射した。９日目に該マウスを殺し、注射した足の腫瘍の発達を観測した。この腫瘍は、紫がかった血腫様の塊として現れており、その大きさは最初に注射された細胞の数に相関して変化する。完全なサイズの腫瘍は、１０⁶の細胞の注射の後に発生したが、このサイズは、１０⁵の細胞を注射した場合により著しく小さくなり、３×１０⁴の細胞で注射を行った場合は、非常に小さな腫瘍が発生したことがわかった。従って、試験は３×１０⁵ 細胞／マウスで通常行った。４．トロンビン活性トロンビン活性は、基本的にはLotenberg（BBA，142:556（1983））で開示された着色化合物を放出する色素産生性基質の加水分解によって測定されうる。手短に言えば、トロンビンは、合成基質Tos-Gly-Pro-Arg-パラニトロアニリンを開裂し、パラニトロアニリン（ＰＮＡ）を放出させる。該パラニトロアニリンの濃度は４０５nmの吸光度から決定しうる。Ｂ．ＡｏＥの産生Ｉ．組換えＡｏＥの発現のためのホスト−ベクター系ｍｅｔ−ＡｐｏＥの産生に使用される好ましいホスト−ベクター系は、プラスミドｐＴＶＲ５９０−４を内部に有している（harboring）Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ１４８５（ＡＴＣＣNo．１２４３５）であり、該ホストベクター系は、American Type Colture Collection（ATCC）in Rockville，MarylandにＡＴＣＣアクセッシヨンNo．６７３６０として寄託されている。以下に開示されるプラスミドｐＴＶＲ５９０−４の構成は、相互に関連した継続中の特許出願ＥＰＯ公開第３０３，９７２で完全に開示されている（図１５参照）。プラスミドｐＴＶＲ５９０−４は、以下の要素を含有する。ａ）複製の源ｂ）反時計回りの方向のＡｍｐ^R遺伝子ｃ）時計回りの方向で５’から３’の順で、不完全なｄｅｏＰ１プロモーター配列及びｌａｍｂｄａｃＩ ⁸⁵⁷温度感受性抑制因子コード配列ｄ）反時計回りで及び５’から３’の順で、ｌａｍｂｄａプロモーター、ベータラクラマーゼプロモーターリボソーム結合部位、ＡｐｏＥのコード配列及びＴ ₁Ｔ₂転写末端配列。このプラスミドは、プラスミド上にも位置している構成要素として発現されたｃＩ⁸⁵⁷温度感受性抑制因子によって熱誘導可能に制御されるバクテリオファージｌａｍｂｄａ（ＰＬ）の強力なレフトワードプロモーター（leftward pro-mot er）の制御下で、ＡｐｏＥの高レベルの発現因子である。このプラスミドからのＡｐｏＥの産生は、４２℃での熱誘導で起こる。これは、該プラスミドが、ホストＥ．ｃｏｌｉ染色体にｌａｍｂｄａｃＩ⁸⁵ ⁷ 遺伝子を予め挿入することとは独立にｍｅｔ−ＡｐｏＥを熱誘導可能に産生しうるので、いわゆる「ホストに独立な」発現系である。従って、このプラスミドは、非常に広範囲のホスト細菌細胞を形質転換するのに使用しうる。開示されたホスト、Ｅ．ｃｏｌｉＷ１４８５は、アクセッシヨンNo．１２４３５でＡＴＣＣから自由に得られる原栄養菌性の野生型のＥ．ｃｏｌｉ系である II．Ｅ．ｃｏｌｉＷ１４８５を隠し持っているプラスミドｐＴＶＲ５９０−４の成長及びＡｏＥを含有する細菌ケーキの製造Ｅ．ｃｏｌｉＷ１４８５を内部に有しているプラスミドｐＴＶＲ５９０−４の発酵の以下の説明は、ＡｐｏＥを含有する細胞ケーキを製造するための好ましい態様でるある。１．シードフラスコ（seed flask）での発達Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣNo．１２４３５／ｐＴＶＲ５９０−４）を含有する冷凍したバイアルの内容物を、以下の培地を含有するシードフラスコに接種するために使用した。Ｋ₂ＨＰＯ₄ ９ｇＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇＮａＣｌ５ｇＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ０．２ｇＮＨ₄Ｃｌ１ｇＦｅＮＨ₄クエン酸塩０．０１ｇ追跡要素（trace element）溶液１ｍｌビオチン０．５mg グルコース５ｇアンピシリン、ナトリウム塩０．１ｇ脱イオン化水１Ｌ追跡要素の保存溶液：ＭｎＳＯ₄．Ｈ₂Ｏ１ｇＺｎＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ２．７８ｇＣｏＣｌ₂．６Ｈ₂Ｏ２ｇＮａ₂ＭｏＯ₄．２Ｈ₂Ｏ２ｇＣａＣｌ₂．２Ｈ₂Ｏ３ｇＣｕＳＯ₄．５Ｈ₂Ｏ１．８５ｇＨ₃ＢＯ₃ ０．５ｇ濃ＨＣｌ１００mL 脱イオン化水９００mL グルコースとアンピシリンを、培地の他の成分を圧熱滅菌した後の無菌の濃縮した保存溶液に加えた。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍにおいて回転振蓋器で一夜インキュベートし、３．５〜５．０のＯＤ₆₆₀を得た。２．シード物の発酵器シードフラスコの内容物を、２５〜３０Ｌの以下の培地（１リットル当たりの含量）を含有する５０Ｌのシード物発酵器に接種するために使用した。Ｋ₂ＨＰＯ₄ ８ｇＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇクエン酸ナトリウム２ｇＮＨ₄Ｃｌ２ｇＦｅＮＨ₄クエン酸塩０．０２ｇＣａＣｌ₂．２Ｈ₂Ｏ０．０４ｇＫ₂ＳＯ₄ ０．６ｇ追跡要素溶液（セクション１と同様）３ml 消泡剤（Silicolapse 5000）２mL 無菌化の後に加えられるもの（培地１リットル当たり）ＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ０．４ｇナトリウムアンピシリン０．１ｇグルコース４０〜６０ｇＮＨ₃（２５〜２８％水溶液）約４０mL グルコースを接種時にバッチ式で加え、アンモニアを、成長の間ｐＨの制御（設定点ｐＨ＝７．０）のために自動的に加えた。培養物を、成長を行うために１５〜２０時間３０℃でインキュベートし、通常この時間の間にＯＤ₆₆₀が２０〜３０に達した。これは７．５〜１２ｇ／Ｌの乾燥細胞重量（ＤＣＷ）に等しい。３．生成物発酵器シード物発酵器の内容物を、シード物の発酵器で説明した約３６０Ｌの製造培地（但し、アンピシリンを除く。）を含有する７５０Ｌ（名目上の容積）に接種するために使用した。培養物をＯＤ660が１０になるまで３０℃でインキュベートした。次に、発酵器の温度を４２℃まで上げることによってＡｐｏＥの発現の誘導が達成された。誘導が起こった時点で以下の発酵剤を加えた。ＤＬ−メチオニン培地１Ｌ当たり０．６ｇ酢酸ナトリウム培地１Ｌ当たり５ｇ酢酸ナトリウム（０．１％〜１％）を、ＡｐｏＥアナローグによって引き起こされる「毒性効果」から細胞を護るために添加した。発酵器の温度を３時間４２℃に維持し、この時間で細胞を収穫した。収穫した時点での細胞懸濁液のＯＤ₆₆₀は通常１６〜２０であり、その容積は４００〜４３０Ｌであり、ＤＣＷは５．０〜６．５ｇ／Ｌである。４．細胞の収穫細胞懸濁液を、２５０Ｌ／時間の供給速度でＣＥＰＡ１０１管状ボール遠心器において１４，０００ｒｐｍ（１６，０００ｇ）で遠心し、約１０ｋｇの重量の細胞ケーキを製造し、供給した。他の方法として、細胞懸濁物を、Westfalia CS A-19連続遠心器において、５００Ｌ／時間で遠心した。沈殿物をすぐに粉砕（disrupt）するか、若しくは冷凍した。両方の場合、懸濁物には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での測定で検出しうるＡｐｏＥは含まれていなかった。 III．組換えＡｏＥの精製以下の方法は、工業的に応用するために適切であり、非常に純粋なＡｐｏＥを与える。一般的スキーム（スキーム１）は以下のステップＡからＧより成る下方に向かうプロセスである。Ａマグネシウムイオンの存在下での細胞の粉砕Ｂトリトン（登録商標）（TRIRON^R）での細胞ペレットの抽出Ｃ１００Ｋの限外濾過ＤＤＥＡＥクロマトグラフィーＥＱセファロースクロマトグラフィーＦＣＭセファロースクロマトグラフィーＧ１００Ｋの限外濾過−トリトン（登録商標）除去以下のＡｐｏＥの精製における該ステップの詳細な例を３Ｋｇの細胞ケーキで行った。加えて、我々は、使用した装置の大きさのスケールアップを含めたマイナーな変更のみで、以下に説明する方法を用いて１５Ｋｇの細胞ケーキを加工処理することに成功した。ステップＡからＤを、２バッチの細菌ケーキ（それぞれ１．５Ｋｇの重量）で行った。ステップＤの後、この２バッチを併せ、１バッチとしてステップＥからＧを進めた。ステップＡ、Ｂ、Ｃは、他の方法が示されている以外、４℃〜１０ ℃で行った。全ての他の活性を室温で行った。Ａ．マグネシウムイオンの存在下での細胞の粉砕１．５Ｋｇの湿った細胞ケーキを６ＬのバッファーＡ（これは、５０mMのトリス／ＨＣｌ、３０mMのＭｇＣｌ₂、０．２５％のベータヒドロキシブチレートのナトリウム塩、ｐＨ＝７．５より成る。）に懸濁した。（ベータヒドロキシブチレートはプロテアーゼ阻害剤として添加された。）次に、これをKinematicaのホモジネーターを用いて均質化し、７．５Ｌの均質物を得た。次に、Dynomill KDLビーズミル粉砕器（ Willy A．Bachofen，Basel）を用いて５Ｌ／時間で粉砕を行った。得られた懸濁液をバッファーＡで３倍希釈し、２２．５Ｌの容積を得た。この溶解産物は、６ｇのＡｐｏＥ、即ち初めの細菌ケーキの１Ｋｇ当たり約４ｇのＡｐｏＥを含有する。次に遠心を、連続CEPA-41管状ボール遠心器（Carl Padberg，Lahr/Schwarzwal d）において９Ｌ／時間の供給速度を用い、２０，０００ｒｐｍ（１７，０００ｇ）で行った。約７００ｇの重量で不溶性のＡｐｏＥを含有するペレットを貯え、上清を捨てた。（ＡｐｏＥがＭｇ⁺⁺の存在によって不溶になることに注意。）Ｂ．トリトン（登録商標）を用いる細胞ペレットの抽出６リットル（１：１０）の抽出バッファーを該ペレットに加えた。（抽出バッファ：５０mMトリス／ＨＣｌ、２０mMＥＤＴＡ、０．３％トリトン（登録商標）、ｐＨをＨＣｌで３．０に調節した。）懸濁物を低速度でホモジナイザー（Kine matica）を用いて得た。次に別の６Ｌの抽出バッファを加え（１：２０のペレツト：バッファの最終比を与える。）、１ＮＮａＯＨでｐＨを４．５に調節した。得られた１２Ｌの懸濁液を室温で撹拌しながら１０分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液をＣＥＰＡ４１遠心器で、２０Ｌ／時間の供給速度で遠心した。約４５０ｇの重量のペレットを粉砕し、ＡｐｏＥを含有する上清溶液を１ＮＮａＯＨでｐＨ＝７．５にタイトレーションし（titrat-ed）、貯蔵した。注：トリトン（登録商標）は以下の全てのステップに存在し、ステップＧで除かれる。Ｃ．１００Ｋ限外濾過このステップの目的は、限外濾過／透析によって低分子量の不純物を取り除くことにある。１つの１００ＫカセットタイプのＰＴＨＫを用いるMil-lipore Pelliconの限外濾過システムを、先のステップの上清（約１２Ｌ）を約２Ｌに濃縮するために使用した。供給圧力は２０psigであり、濾過流速は２０Ｌ／時間であった。透析バッファーは５０mMトリスＨＣｌ、１０mMＥＤＴＡ及び０．１％トリトン（登録商標）、ｐＨ＝７．５である。約２〜３mgのＡｐｏＥ／mlを含有する２Ｌの保持物（ret-entate）を氷で冷却させた。保持物を、Pellicon限外濾過システムの再循環モードを使用して、濾液の伝導率が透析バッファーの伝導率と等しくなるまで透析した。これを、透析を停止するための、精製全体で使用される基準とした。Ｄ．ＤＥＡＥクロマトグラフィーこのステップの目的は、タンパク質及び他の細胞性物質のような不純物からＡｐｏＥを分離することである。このステップでは、１．６ＬのＤＥＡＥセファロースファーストフロー（Seph arose Fast Flow）カラム（ファルマシア）を使用した。流速は１０カラム容積／時間であった。これらの条件でのカラムの許容量は、４mgＡｐｏＥ／mlであると決定された。該カラムは第一に、ＤＥＡＥ平衡化バッファー（２０mMトリス／ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、０．５％トリトン（登録商標）、ｐＨ＝７．５）で平衡にされた。次に、先のステップからの保持物溶液（約３Ｌ）をカラムに導入し、３カラム容積（ＣＶ）の平衡化バッファーで洗浄した。最初の溶出を、１２０mMＮａＣｌを含有する３ＣＶの平衡化バッファーを用いて行った。画分を集め、進行の状況を、２８０nmで抽出物の吸光度を連続的に追跡することによってモニターした。該画分を、コーマーシーブルー（Coomassie Blue）で染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ピーク（３．１ＣＶ）のけん引エッジ部（tr ailing edge）を貯蔵した。第二の溶出を１５０mMのＮａＣｌを含有する平衡化バッファーを用いて行った。画分を集め、ＳＤＳゲル電気泳動で分析し、ピークのほとんど（３．９ＣＶ）を貯蔵した。エンドトキシンを、U．S．Pharmacopeia（U．S．P）XXI，1165-116 6（1985）。リムルスアメーバ様（ＬＡＬ）細胞の細胞分解産物試験（Limulus A mebocyte Lysate（LAL） assay）で測定した。エンドトキシンのレベルは、ＡｐｏＥ当たり３μｇである。ＤＥＡＥセファロース後の濃縮と透析第一及び第二の溶出物から指示された画分を、１つの１００Ｋカセットを取り付けたPellicon限外濾過システムを用いてプールし、透析した。透析バッファーは２０mMトリス／ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、０．１％トリトン（登録商標）、ｐＨ＝７．５である。サンプルを２Ｌ（約２〜３mgＡｐｏＥ／ml）に濃縮し、透析した。Ｅ．Ｑ−セファロース（ＱＳ）クロマトグラフィーこのステップの目的は、不活性なＡｐｏＥから活性なものを分離し、更にエンドトキシンを除去することである。このステップでは、１．６ＬのＱＳファーストフローカラム（ファルマシア）を使用した。これらの条件下でのカラムの許容量は約７mgＡｐｏＥ／mlであり、流速は約１０ＣＶ／時間であった。ＱＳ平衡化バッファーは、２０mMトリス／ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、０．２％トリトン（登録商標）、ｐＨ＝７．８であった。平衡化の後、先のステップの２つのバッチからの保持物溶液、即ち約５ｇのＡｐｏＥを含有する約５Ｌのバッファーの全容積を併せ、カラムに導入した。このカラムを次に２．８ＣＶの平衡化バッファーで洗浄した。第一の溶出を、２０mMのＮａＣｌを含有する３ＣＶの平衡化バッファーで行い、第二の溶出を４０mMのＮａＣｌを含有する約５．５ＣＶの平衡化バッファーで行った。上記のように画分を集め、モニターして分析し、２．０ＣＶを併せ、貯蔵した。エンドトキシンのレベルは、ＬＡＬアッセイで測定し、そのときには２５０pg/mgＡｐｏＥ以下であった。７０mMのＮａＣｌ及び３５０mMのＮａＣｌをそれぞれ含有するバッファーを用いる２つの引き続きの溶出は、不活性なＡｐｏＥを溶出した。Ｑ−セファロース後の濃縮と透析ＱＳ−誘導され、貯蔵、プールされた画分を、１つの１００Ｋカセットを使用したMillipore Pellicon限外濾過システムを通して限外濾過することによって濃縮及び透析した。透析バッファーは１０mMトリス／ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、０．１％トリトン（登録商標）、ｐＨ７．５である。サンプルを、２〜３mg／mlのＡｐｏＥの濃度を維持しながら再循環モードを用いて透析した。最終の保持物の容積は約５００mlであった。Ｆ．ＣＭ−セファロースクロマトグラフィーこのステップの目的は更にエンドトキシンを除去すること、トリトン（登録商標）を０．０５％まで下げることにある。このステップでは、１２０mlのＣＭ−セファロースファーストフロー（ファルマシア）カラムを使用した。平衡化バッファーは２０mMＮａＣｌ、１mMＥＤＴＡ、０．２％トリトン（登録商標）、ｐＨ＝４．８である。平衡化の後、先のステップで得た保持物溶液をＣＭ−セファロースカラムに導いた。カラムの許容量は、１０mgＡｐｏＥ／mlであり、流速は１０ＣＶ／時間であった。次に、カラムを以下の溶液で洗浄した。４ＣＶの平衡化バッファー、次いで５ＣＶの７０mMＮａＣｌを含有する平衡化バッファー、次いで２ＣＶの２０mM酢酸ナトリウム、１mMＥＤＴＡ、０．０５％トリトン（登録商標）、７０mMＮａＣｌ、ｐＨ＝４．８。導入及び洗浄ステップで得た溶出物を捨てた。次にカラムを溶出した。溶出液は、８ＣＶの２０mM酢酸ナトリウム、１mMＥＤＴＡ、０．０５％トリトン（登録商標）、３００mMＮａＣｌ、ｐＨ＝５．０である。溶出の進行は２８０nmの溶出物の吸光度を連続的に追跡することによってモニターした。（２つの異なったベースラインを溶出の間に使用した。１つは、０．２％トリトンを含有する高Ｕ．Ｖ．吸光度のバッファーであり、もう一方は０．０５％トリトンを含有する低Ｕ．Ｖ．吸光度のバッファーである。約１．０のＯＤの感度のスケールを使用すると、両方のバッファーを（最下部で低い方を、また約０．５ＯＤで高い方を）チャートカラムに表すことができる。）ＡｐｏＥを含有するサンプルをｐＨ７．８にすぐにタイトレーションし、保存した。このサンプルのエンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイによる測定で、ＡｐｏＥ１mg当たり５０pg以下であった。このステップを、０．５ＭＮａＯＨで一夜前洗浄し、１つの１００Ｋカセットを含むMillipore Pellicon限外濾過システムを用いて４℃で行った。流速は９〜１２Ｌ／時間であり、挿入／圧力は５〜１０psigであった。（この低流速を使用し、トリトン（登録商標）が除去されるにつれＡｐｏＥが集まるのを防止する。）先のステップで得られたＡｐｏＥサンプル（約６００mgのＡｐｏＥを含有する９６０ml）を１０mMＮａＨＣＯ₃バッファー、ｐＨ＝７．７で０．５mg／mlに希釈した。次に、該サンプルを、限外濾過システムで処理し、以下の条件をこのトリトン（登録商標）除去ステップ全体に渡って適用した。ａ）トリトン（登録商標）の濃度を０．０２％より低くしなければならない。即ち、１００Ｋ膜を通して効果的なトリトン（登録商標）の除去を達成するために、トリトン（登録商標）の濃度をその臨界のミセル濃度以下にしなければならない。ｂ）ＡｐｏＥを０．５mg/ml以下に希釈してはならない。即ち、ＡｐｏＥ分子の解離が起こり、これは１００Ｋ膜を越えていく。ｃ）ＡｐｏＥは１．５mg/ml以上に濃縮されてはならまい。即ち、ＡｐｏＥ分子の集合が起こりうる。限外濾過システムで使用される透析バッファーは、１０mMＮａＨＣＯ₃、１５０mMＮａＣｌ、ｐＨ＝７．８である。上記条件に従った濃縮及び希釈の後、透析を一定容積及び一定流速で行い、該透析を濾液の２８０nmでの吸光度が０．０１ユニットとなったとき完了させた。（トリトン（登録商標）は２８０nmで吸収があり、０．０１の吸光度は０．０００５％トリトン（登録商標）に等しい。）最終保持物の全容積は７７０mlであり、濾液の全容席は９．５Ｌであった。次いで、ＡｐｏＥを含有する溶液を濾過し（０．２ミクロンフィルター）、８０mlのガラス容器に−７０℃で保存した。総収率０．３ｇの高純度ｍｅｔ−ａｐｏＥを３kgの細菌ケーキから回収した。ＡｐｏＥ（約９７％純度）は、同じゲル濾過分析の条件下で試験した場合、血漿のａｐｏＥと同じ集合状態であった。ＡｐｏＥサンプルは５０pgよりも少ないエンドトキシン／mg蛋白質を含有する。凍結乾燥ＡｐｏＥを凍結乾燥する場合は、トリトン（登録商標）除去ステップの透析バッファーは２mMＮａＨＣＯ₃、ｐＨ７．８、１mMシステイン／mgａｐｏＥであり、凍結乾燥後に、ａｐｏＥのサンプルを−２０℃で保存した。凍結乾燥後に、ＡｐｏＥは再溶解され得、これは、その通常の生物学的活性を保持している。凍結乾燥されたＡｐｏＥは、少なくとも５年間非常に安定である。例２．ウシ大動脈内皮細胞培養におけるＡｐｏＥの効果Ａ． ³Ｈチミジンの取り込みに関するＡｐｏＥの影響４８時間血清を欠乏させたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の新たにプレート化された培養物をｂＦＧＦに加えることは、図１に示されるように１％及び２．５％ＦＣＳの両方で、対照培養物に比較して数倍［３Ｈ］チミジンの取り込みを刺激する。このＤＮＡ合成の刺激は、該培養物にＡｐｏＥを添加することによって著しく阻害され、この刺激は投与量及び血清依存性である。１％ＦＣＳでは、０．０５μＭ及び０．５μＭＡｐｏＥによる刺激が、それぞれ約８５％及び９８％であった。しかし、２．５％ＦＣＳでは該阻害はより低くなった（即ち、それぞれ５５％と８５％の範囲であった）。組換えＴＳＰフラグメント（ｒＴＳＰｌ８）のような他のヘパリン結合性分子の添加によって、１％ＦＣＳで、ＤＮＡ合成の阻害は更に少なくなる。２．５％ＦＣＳでは、ＡｐｏＥ及びｒＴＳＰによる阻害は同じである。Ｂ．チミジンの取り込みの時間経過におけるＡｐｏＥの影響ｂＦＧＦ及び１％ＦＣＳの両方の存在下で、新たにプレート化されたＢＡＥＣの培養物への［³Ｈ］チミジンの取り込みの時間経過におけるＡｐｏＥの影響は、図２に示されている。［³Ｈ］チミジンの取り込みは、時間依存性であり、最大容量は細胞の飢餓状態を停止させた後、４２時間付近で達成された。０．５μ ＭＡｐｏＥの存在下で、［³Ｈ］チミジンの取り込みは９５％以上まで減少された。［³Ｈ］チミジンの取り込みの残りの活性（２〜３％）も４２時間後に最大に達した。同様の（parallel）培養物においては、０．５ μＭｒＴＳＰ１８又はｒＦＮ３３では、それぞれ３０％阻害されるか、又は全く阻害されなかった。Ｃ．種々の濃度のＡｐｏＥの影響ＢＡＥＣの予め付着された培養物の［³Ｈ］チミジンの取り込みに関するＡｐｏＥの種々の濃度の影響を測定した。図３の例は、０．５％ＦＣＳおよびｂＦＧＦの存在下で５ｎＭＡｐｏＥによって得られる阻害が、約４５％であるが、ＦＣＳが単独で存在する場合は、同量のＡｐｏＥによる阻害が１０倍低い（〜４％）ことを示している。進行している実験全体に渡って、外来的に加えられたｂＦＧＦによる細胞の増殖の刺激が変化しうるということに注意すべきである。一般に、細胞が、低い血清濃度（例えば０−０．５％）で、高い［³Ｈ］チミジンの取り込みの基礎活性を示した場合、該細胞はｂＦＧＦを加えられることによって更に刺激されない。Ｄ．成長因子依存性増殖におけるＡｐｏＥの影響高密度（１０⁵／ウェル）でプレート化されたＢＡＥＣの予め付着された培養物は、０％及び０．５％ＦＣＳの両方で（図４に示されているように）非常に高レベルの［³Ｈ］チミジンの取り込みを示した。該培養物へのｂＦＧＦの添加は、［³Ｈ］チミジンの取り込みのいずれの実質的な刺激も示さなかった。しかし、外来性のｂＦＧＦを含有する培養物のみは、ＡｐｏＥを加えることによって顕著な阻害（〜６５％）を示した。０．５％ＦＣＳのみを含有する培養物にＡｐｏＥを加えた場合、ＡｐｏＥの阻害の影響は、何倍も低くなった（〜５％）。即ち、ＡｐｏＥは、これらの細胞の成長因子依存性の増殖を阻害する。Ｅ．ウシ大動脈内皮細胞へＡｐｏＥを添加する時の影響新たに付着させたＢＡＥＣ培養物をｂＦＧＦ及び０．５若しくは１％ＦＣＳの存在下で成長させた。ゼロ時でのＡｐｏＥと共にｂＦＧＦを添加することによって阻害の最大の効果が得られた。１５若しくは２２時間後のＡｐｏＥの添加では、阻害は両血清濃度でより低かった。この結果は図５に示されている。従って、成長の最初の１５時間は、ＡｐｏＥの阻害が最も効果的である。１５時間後は、ＡｐｏＥはこれらの培養物中でＤＮＡ合成を減少することに関して、おそらく影響が少ない。該細胞は、図２に示されている時間経過を基にしてＤＮＡ合成の開始の前の時間でＡｐｏＥに対して無反応になることに注意すべきである。従って、ＡｐｏＥはおそらくＳ−フェーズへの参加を阻害するが、一度これが開始されると十分にＤＮＡ合成を抑止しない。ウシ大動脈内皮細胞の成長に関するＡｐｏＥの影響を、５％ＦＣＳの存在下で測定した。成長を３日続けた後、多数の細胞をトリプシン化すること及び直接に計数することによって試験した。細胞を、ｂＦＧＦを存在させずにプレート化した場合、細胞数の全体の増加は、１０〜１５％であり、ＡｐｏＥの添加に関する細胞数の影響はなかった。しかし、ｂＦＧＦを同様の培養物に添加した場合、細胞数は、２．５倍に増加した。ＡｐｏＥと共にｂＦＧＦを添加すると、投与量依存的に成長が阻害される。ＡｐｏＥの濃度が０．５μＭ、２．５μＭ、及び５μＭのとき、細胞の成長の阻害は、それぞれ約１０％、４０％、及び５０％であった。これらの増殖の結果は、例２Ｄのチミジンの取り込みの結果と一致する。ウシ大動脈（ＢＡＥＣ）から得られる血管内皮細胞の増殖におけるＡｐｏＥの影響を外来性のｂＦＧＦを加えることなく更に試験した。この結果によって、０．１５μＭ付近にＩＣ₅₀を有する０．５％における増殖のＡｐｏＥによる阻害が示された。１００℃で６０分加熱すると、ＡｐｏＥの抗増殖活性の９５％以上が失われ、ＡｐｏＥ分子の天然型の阻害活性の依存性を示した（図２１）。ＢＡＥＣの増殖の同程度の阻害もヒト血漿から単離されたａｐｏＥで観測された。ＡｐｏＥによる阻害の特異性を、ペプチド３４８、即ちＬＤＬ−レセプター結合部位およびアミノ酸１４１−１５５に及ぶ強くヘパリンに結合するコンセンサス配列から誘導されるａｐｏＥのタンデム２量体ペプチドフラグメント（LRKL-R KRLLRDADDL）２（Dyer et al., J. Biol. Chem.266:15009 （1991））を用いて更に示し、これは、１９９３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１８９に開示されている。該ペプチド（H. C. Krutzsch (Labo-ratory of Patholo gy, NCI, NIH）によって好意的に提供された。）は、Merrifieldの標準的な固相法によって合成され、先に開示された方法（Guo et al., PNAS89:3040 （1992））によって精製された。従って、ＢＡＥＣ細胞の増殖は０．１〜０．３μＭのＩＣ₅₀（図２０Ａ）を有するｍｅｔ−ａｐｏＥによって、及び１０〜１５μＭのペプチド３４８のＩＣ₅₀ を有するペプチド３４８（図２０Ｂ）によって阻害された。ｍｅｔ−ａｐｏＥによる増殖の阻害は、細胞のタイプに対して選択性を示し、ＢＡＥＣ細胞がＣＨＯ細胞（図１９）及び神経芽腫細胞よりも阻害に敏感であるので血管内皮細胞に有利であるようである。更に、外来性のｂＦＧＦを欠く場合の内皮細胞の増殖の阻害も低及び高血清濃度で観測されていおり、これによって、ａｐｏＥの抗増殖活性が、血清中に通常存在する天然に存在する内因性の成長因子の存在下で効果的に達成されることが示される。更に、ヘパリン依存性でないＥＧＦのような他の成長因子の存在下で血清依存性の増殖の阻害を観測すると、ａｐｏＥによる増殖の阻害の他のメカニズムの存在が示唆される。他の実験で、組換えｍｅｔ−ａｐｏＥを、０．５％血清濃度においてＢＡＥＣ細胞増殖アッセイで血漿のａｐｏＥと比較した。阻害の程度は、組換えｍｅｔ− ａｐｏＥによって示される僅かに高い程度の阻害を除いて同様であった。更なる実験で、精製されたｍｅｔ−ａｐｏＥによる処理の前のＢＡＥＣ細胞増殖アッセイにおける影響を試験した。結果は、０．５％ＦＣＳでは、ＧｕＣｌ処理がｍｅｔ−ａｐｏＥの阻害活性をわずかに増加させたが、一方、５％ＦＣＳでは、ＧｕＣｌ処理が阻害の程度に大きな増加をもたらしたことを示した。例３．ウシ角膜内皮細胞におけるＡｐｏＥの影響Ａ．ＣＢＥＣが成長因子で刺激されたの場合のａｐｏＥの影響ウシ角膜内皮細胞（ＣＢＥＣ）から誘導される内皮細胞の第二のタイプの有糸分裂誘発及び増殖に関するａｐｏＥの影響を試験した。結果をそれぞれ図７及び８に示した。図７の結果は、ＣＢＥＣへの［³Ｈ］チミジンの取り込みを示しており、これは新たに付着された培養物で、血清を２日間欠乏させた後に測定された。０％ＦＣＳで［³Ｈ］チミジンの取り込みは相対的に低かった。取り込みは、ｂＦＧＦが培養物に加えられた場合には数倍刺激された。ｍｅｔ−ａｐｏＥの添加（０．５μＭ）は、このｂＦＧＦ依存性ＤＮＡ合成を劇的に減少させ、９０％以上の阻害を与えた。細胞を１％若しくは２％ＦＣＳの存在下で成長させると、これらの最初の成長が更に顕著になり、これらはｂＦＧＦの血清への添加によって剌激されない。血清の濃度が増加すると、ａｐｏＥで誘導された阻害は、１％及び２％ＦＣＳでそれぞれ約５０％及び３５％まで減少された。驚くことに、ａｐｏＥによる刺激の同様のモードが、非ヘパリン結合性成長因子であると考えられるＥＧＦで刺激されたＣＢＥＣ培養物で得られる。ここで再度、ａｐｏＥはＥＧＦ依存性の成長を阻害し（＞９０％）、更に少ない範囲まででは、血清依存性成長（１％及び２．５％ＦＣＳでそれぞれ４５％及び２５％）を阻害する。上記の結果を基にすると、ＡｐｏＥは、他の哺乳類（ヒトを含む）源からの角膜内皮細胞を、特に該細胞が活発に増殖する場合に阻害するであろう。Ｂ．ＣＢＥＣが血清で刺激される場合のＡｐｏＥの効果高濃度のＡｐｏＥは、ＣＢＥＣ培養物における血清で刺激された増殖を阻害する。ＣＢＥＣ増殖に関するｍｅｔ−ａｐｏＥの影響を測定し、図８に示した。ＣＢＣＥは、５％ＦＣＳで、及びｂＦＧＦの存在下での増殖を試験された。ｂＦＧＦによる増殖は投与量依存性で阻害され、ＩＣ₅₀は〜１．５μＭである。この場合の増殖の阻害がｂＦＧＦの存在に依存するか否かは明確でない。しかし、ＡｐｏＥが、活発に増殖する角膜内皮細胞の増殖を阻害することは明かである。Ｃ．ＡｐｏＥ阻害の可逆性ＣＢＥＣ培養物のＡｐｏＥによる［³Ｈ］チミジンの取り込みの阻害は図９に示されるように可逆的である。この可逆性は、ＡｐｏＥを培養物に与える量と時間に依存する。新たに付着されたＣＢＥＣ培養物が、１％ＦＣＳ及びｂＦＧＦの存在下において、有糸分裂誘発実験（４０時間）の全範囲において１．０及び１．５μＭのｍｅｔ−ａｐｏＥに維持された場合、阻害は、それぞれ３０％及び５０％であった。しかし、ＡｐｏＥが最初の２２時間でのみ与えられた場合、４０時間の取り込みの後の１．０及び１．５μＭによる阻害は、より低かった（例えば、それぞれ５％及び１５％のオーダーである。）。Ｄ．ＣＢＥＣのタンパク合成におけるＡｐｏＥの影響ＣＢＥＣのタンパク合成を、メチオニンを１時間欠いた後にＳ³⁵−メチオニンを添加（６時間）して、図１３に示されるように測定した。ｍｅｔ−ａｐｏＥ（０．５μＭ）を同様の２種類の培養物に加えた場合は、Ｓ³⁵−メチオニンの蛋白質への取り込みはａｐｏＥを用いない対照と同一であった。両方とも、取り込みは約６０％であった。したがって、ＡｐｏＥの添加はタンパク合成に直接影響しない。例４．メラノーマ細胞におけるＡｐｏＥの影響ヒトＡ２０５８Ｈメラノーマ細胞のＤＮＡ合成を新たに付着させた培養物で、及び０．５％ＦＣＳとｂＦＧＦの存在下で、さらにｍｅｔ−ａｐｏＥ、ｒＴＳＰ１８（ｒＴＳＰ１８）及びｒＦＮ３３の添加に続いて図１０に示されるように試験した。０．５及び１．０μＭでＡｐｏＥを添加するとそれぞれ約４０％及び７５％の阻害が起こる。このような阻害は、平行して添加された他の分子では全く観測されなかった。実際は、０．５μＭのＴＳＰ若しくはＦＮの添加で、［³ Ｈ］チミジンの取り込みが２〜２．５倍刺激される。例５．カルチノーマ細胞におけるＡｐｏＥの影響ヒト乳房腫瘍（ＭＤＡ）細胞のＤＮＡ合成を、０．５％ＦＣＳ及びｂＦＧＦ中の新たに付着された培養物で図１１に示されるように測定した。０．５μＭのｍｅｔ−ａｐｏＥ又はｒＴＳＰ１８の添加によって、［³Ｈ］チミジンの取り込みを約６０％及び４５％まで阻害した。ヘパリンによるＤＮＡ合成の阻害は低かった（３０％の範囲である。）。例６．平滑筋細胞におけるＡｐｏＥの影響ヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖におけるａｐｏＥの影響を０．５％及び５％ＦＣＳで試験した。０．５％ＦＣＳ及び高濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥ（４μＭ）の存在下において、血清及びｂＦＧＦ依存性増殖の両方で強い阻害が観測された（両方の場合で約８０％の阻害）。血清濃度を５％まで増加させると、同濃度のｍｅｔ−ａｐｏＥによって得られる阻害がより低くなる（血清及びｂＦＧＦ−依存性増殖の両方に対して約３０％）。結果を図１２に示した。このように、ＡｐｏＥは、活発に増殖するヒト平滑筋細胞の増殖を阻害する。例７．マウス内皮細胞におけるＡｐｏＥの影響ＡｐｏＥの抗増殖活性及び抗血管形成活性をマウス内皮腫細胞ＥＮＤ２（Will iams， Cell 1989）を用invitro及びin vivoで更に行った。ＥＮＤ２は、ポリオーマミドルＴ−抗原で形質転換されたマウス内皮細胞であり、in vivoで紡錘型細胞を、in vitroで血管の腫瘍及び血管腫を発生する。これらの細胞は、血管形成を研究するためのモデルシステムとしてin vivoで使用される。細胞増殖を、プロトコルＰ１に従って例１で説明したようにアッセイした。ｍｅｔ−ａｐｏＥは、培養物中のＥＮＤ２細胞の増殖を、０．５％ＦＣＳで０．２５μＭＩＣ₅₀を有して阻害した（図１８）。他のＡｐｏＥによる増殖の阻害は例８に示されている。加えて、ＡｐｏＥが内皮腫モデルにおいてin vivoで血管形成由来の病巣及び血管腫の発達を阻害する。このように、８日間、１日当たり０．４mg／マウスの濃度でのｍｅｔ−ａｐｏＥの静脈内（ｉ．ｖ．）投与によって、ＡｐｏＥで処理されていない対照と比較して血管腫の大きさを４０〜６０％減少させた。１０匹のマウスから成るグループに、上記のＥＮＤ２細胞のマトリゲル（Matr igel）を用いて注射した。次に、該グループを０．２ml生理食塩水（対照グループ）又は２mg／ｍｌｍｅｔ−ａｐｏＥを含有する０．２ml生理食塩水（実験グループ）の何れかで処理した。該動物を９日目に殺し、腫瘍を０〜３（０＝腫瘍なし）のスケールに点数化した。結果を表１に示した。結果から、Wilcoxon Rank Sum Testに従つて、有意（Ｐ＜０．００５）であることがわかった。上記の結果を基にして、ＡｐｏＥがヒトの血管腫を治療するのに効果的である。例８．ＡＯＰＥフラグメント先に説明したように、ＡｐｏＥは、血漿からのリポタンパク質粒子の除去を管理するため、即ち「可逆性コレステロールヘモスタシス」を管理するために、及び肝臓へのレセプター依存性エンドサイトーシスを媒介するために、リポタンパク質粒子に結合する特異的能力を有する。血漿に含まれるリポタンパク質粒子の数が高いので、少量で腫瘍部位に運ぶことに関して、ＡｐｏＥがリポタンパク質に結合してしまい、抗増殖剤として機能させるようには利用し得ないであろう。従って、完全長さのＡｐｏＥ（例えばｍｅｔ−ａｐｏＥ）は、血清若しくは血漿の存在下で、腫瘍に大量に運ぶことによってのみ細胞の増殖を阻害しうる。この欠陥は、ａｐｏＥ配列を開裂し、カルボキシ末端に存在するタンパク結合性ドメインを除去することによって回避することができる。タンパク質分解酵素によりａｐｏＥが開裂され、カルボキシル末端脂質親和性ドメインが脱離されると、残りのアミノ酸の末端フラグメントは、もはやリポタンパク粒子へ結合するための通常の親和性を有していないが、まだヘパリン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンに容易に結合する。従って、少量のＡｐｏＥで十分に細胞増殖の阻害が得られるであろう。特別な態様では、タンパク質分解酵素を用いでカルボキシル末端を開裂し、例えばＡｐｏＥフラグメントは、アミノ末端を含有する２２Ｋフラグメントを生成することによって天然に存在するａｐｏＥの完全な配列を含むａｐｏＥから生産される（Thuren， 1992）。使用されうるタンパク質分解酵素の一例はトロンビンである。トロンビンにより組換えｍｅｔ−ａｐｏＥが消化されると、１種類の２２ｋＤフラグメント及び１種類の１０ｋＤフラグメントが得られる。該２２ｋＤフラグメントは、最初の１９１アミノ酸末端残基を有しており、マンガンヘパリン硫酸塩及びヘパリンに対する結合部位、並びに低密度リポタンパク（ＬＤＬ）レセプターに対する結合部位を有しているが、天然のリポタンパク質と相互作用する能力は減少されている。血漿中のａｐｏＥの遊離型（free form）の量の増加及び脂質粒子によるその滞留の減少を得るための改良された方法は、組換えＤＮＡ技術によってカルボキシル末端からａｐｏＥの主要な脂質結合ドメインの欠如されたＡｐｏＥフラグメントを生成することによっている。特異的な態様では、ａｐｏＥのアミノ酸１−２１７に渡るＡｐｏＥポリペプチドフラグメント、即ちＡｐｏＥ６−２がコードされ、これはプラスミドｐＴＶＲ６−２によって発現される（図１７）。この２８ＫＤＭＷＡｐｏＥも、細胞増殖に関してその影響を試験した。このＡｐｏＥの精製は、マイナーな変更を伴っているが例１で説明したｍｅｔ−ａｐｏＥの精製と同様である。このマイナーな変更の１つは、限外濾過で、１００Ｋ遮断膜の代わりに５０Ｋのものを用いることである。次に、精製されたポリペプチドを６Ｍの尿素で処理し、透析して尿素を除去した。ＡｐｏＥ６−２は、ＢＡＥＣ培養物の増殖を阻害し、０．５％及び２．５％ＦＣＳの両方で、それぞれ０．３μＭ付近にＩＤ₅₀を有する。このように、高い血清濃度で実質的な活性の減少を示すｍｅｔ−ａｐｏＥと対照的に、ＡｐｏＥ６− ２は血清の濃度の増加による影響がより少ない。このＡｐｏＥはまた、ＥＮＤ−２細胞の増殖を阻害することも見いだされた。ＥＮＤ−２の増殖を、図１８に示したように、０．５％ＦＣＳ及び指示された量のＡｐｏＥ６−２の存在下で測定した。これらの結果を基にして、このＡｐｏＥ及び同様のＡｐｏＥのフラグメントは、in vivo（血清濃度が１００％の場合。）で高い抗増殖活性及び抗血管形成活性を提供する。例９．ＡｐｏＥによるヘパリンの抗トロンビン活性の逆転この例では、ヘパリン−抗トロンビンＩＩＩ−トロンビン複合体においてヘパリンの活性に関するＡｐｏＥの影響を示す。ヘパリンは、抗トロンビンＩＩＩを活性化し、これは次にトロンビン活性を阻害する。ＡｐｏＥによってこの複合体からヘパリンを隔離することによって、抗トロンビンＩＩＩの不活性化が起こり、トロンビン活性の付随した増加が起こる。このＡｐｏＥの効果は投与量依存性である（図２５）。反応の化学両諭は、ＡｐｏＥがヘパリンに高親和性を示し、ＡｐｏＥ１モルが２〜３モルのヘパリンと結合することを示した。トロンビン活性は例１に示されているようにアッセイした。より特異的には、１４０μｌから成る全容積において、抗トロンビン（２．９U/mlで５０μｌ、シグマ）、ヘパリン（１５ μｌＥｌｉＬｉｌｌｙ１４ＫＤ、０．４USP/ml；反応において２μＭの最終濃度）及び、ｍｅｔ−ａｐｏＥ（６０μＭ溶液の指示された希釈物の１５μｌ）を３０秒間プレインキュベートした。次に、トロンビン（１０μｌ、２０U/ml 、シグマ）を加え、反応混合物を更に３０秒インキュベートし、これに続いて、染色体基質（２μＭ、シグマ）を加えた。結果を図２５に示した。使用された反応条件下では、ヘパリンによるトロンビン活性の減少は、ｍｅｔ−ａｐｏＥが６４倍に希釈されるまで観測されなかった。トロンビン活性の５０％阻害は、ＡｐｏＥの約１：１００希釈（０．６μＭ）で達成された。従って、ＡｐｏＥの１分子は、約２〜３分子のヘパリンを結合しうる。参照文献

Claims

【特許請求の範囲】１．活発に増殖している細胞の増殖を阻害するための方法であって、活発に増殖している細胞を、増殖を阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥと接触することを具備する方法。２．請求の範囲第１項に記載の方法であって、該細胞がヒト平滑筋細胞である方法。３．請求の範囲第１項に記載の方法であって、該細胞が内皮細胞である方法。４．請求の範囲第３項に記載の方法であって、該内皮細胞が大動脈内皮細胞である方法。５．請求の範囲第３項に記載の方法であって、該内皮細胞が角膜内皮細胞である方法。６．請求の範囲第１項に記載の方法であって、該細胞が腫瘍細胞である方法。７．請求の範囲第６項に記載の方法であって、該細胞がヒトメラノーマである方法。８．請求の範囲第６項に記載の方法であって、該細胞がヒト乳房腫瘍細胞である方法。９．請求の範囲第６項に記載の方法であって、該細胞がヒト肉腫細胞である方法。１０．請求の範囲第６項に記載の方法であって、該細胞がカルチノーマ細胞である方法。１１．アポリポタンパクＥ及び適切な担体を含有する活発に増殖している細胞の増殖を阻害するための組成物。１２．過度の細胞増殖に苦しんでいる患者を治療するための方法であって、過度の細胞増殖を阻害するのに効果的な量のアポリポタンパクＥを患者に投与することを具備した方法。１３．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該アポリポタンパクＥが化学療法剤と組み合わせて投与される方法。１４．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該アポリポタンパクＥが照射治療と組み合わせて投与される方法。１５．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該過度の細胞増殖が腫瘍を含有している方法。１６．請求の範囲第１５項に記載の方法であって、該腫瘍細胞がヒトメラノーマ細胞である方法。１７．請求の範囲第１５項に記載の方法であって、該腫瘍細胞がヒト乳房腫瘍細胞である方法。１８．請求の範囲第１５項に記載の方法であって、該腫瘍細胞がヒト肉腫細胞である方法。１９．請求の範囲第１２項に従った方法であって、該過度の細胞増殖が異常な血管新生を含有する方法。２０．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、該異常な血管新生が血管新生性緑内障である方法。２１．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、該異常な血管新生が糖尿病性網膜症である方法。２２．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、該異常な血管新生が慢性関節リュウマチに存在する方法。２３．請求の範囲第１９項に記載の方法であって、該異常な血管新生が血管腫である方法。２４．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該アポリポタンパクＥが静脈内的に投与される方法。２５．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該アポリポタンパクＥが皮下的に投与される方法。２６．請求の範囲第１２項に記載の方法であって、該アポリポタンパクＥが筋肉内的に投与される方法。２７．過度の細胞増殖を阻害するのに効果的な量でアポリポタンパクＥ、及び薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物。２８．請求の範囲第２７項に記載の組成物であって、該過度の細胞増殖が腫瘍である組成物。