PL190041B1

PL190041B1 - Zastosowanie ludzkiej komórki, cząsteczka DNA, konstrukt ekspresji, hodowana ludzka komórka, klonujący szczep komórek, klonująca linia komórek, białko, sposób wytwarzania glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, oczyszczona glikozylowana ludzkaalfa-galaktozydaza A, sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A, zastosowanie oczyszczonej glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, kompozycja terapeutyczna i sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A z próbki

Info

Publication number: PL190041B1
Application number: PL97332188A
Authority: PL
Inventors: Richard F. Selden; Marianne Borowski; Frances P. Gillespie; Carol M. Kinoshita; Douglas A. Treco; Melanie D. Williams
Original assignee: Transkaryotic Therapies
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 2005-10-31
Also published as: PL332188A1; NO991225L; DE69732129D1; AU4424497A; IL184637A; JP2007289201A; NO328443B1; KR20050084473A; JP2012019793A; JP4313381B2; JP5590788B2; ES2234032T3; HU227189B1; CA2265464C; WO1998011206A2; EP2327775A2; JP2009102321A; DK1538202T3; JP2001504324A; NO991225D0

Abstract

1. Zastosowanie ludzkiej komórki genetycznie zmodyfikowanej dla nadekspresji i sekrecji ludzkiej alfa-galakozydazy A, do leczenia pacjenta podejrzanego o niedobór a-galaktozydazy A. 4. Zastosowanie wedlug zastrz. 3, znamienne tym, ze heterologicznym peptydem sygnalowym jest peptyd sygnalowy ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) (SEKW. NR ID.:21). 10. Hodowana ludzka komórka zawierajaca czasteczke DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierajacy ludzka alfa-galaktozydaze A zwiazana z heterologicznym peptydem sygnalowym, i (b) pozwala na ekspresje polipeptydu w komórce. 14. Klonujacy szczep komórek zlozony z wielu hodowanych ludzkich komórek transfekowanych czasteczka DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierajacy ludzka alfa- -galaktozydaze A zwiazana z heterologicznym peptydem sygnalowym, i (b) pozwala na nadekspresje polipeptydu w komórkach. 28. Kompozycja terapeutyczna, znamienna tym, ze zawiera oczyszczona ludzka alfa- galaktozydaze A jak zdefiniowano w zastrz. 20 i farmaceutycznie dopuszczalna zaróbke. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ludzkiej komórki, cząsteczka DNA, konstrukt ekspresji, hodowana ludzka komórka, klonujący szczep komórek, klonująca linia komórek, białko, sposób wytwarzania glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, oczyszczona glikozylowana ludzka alfa-galaktozydaza A, sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A, zastosowanie oczyszczonej glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, kompozycja terapeutyczna i sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A z próbki.

Choroba Fabry'ego jest związaną z X dziedziczną chorobą magazynowania lizosomowego charakteryzującą się objawami takimi jak poważne upośledzenie nerek, rogowce krwawe oraz nienormalności sercowo-naczyniowe, w tym powiększenie komór i niedomykalność zastawki dwudzielnej. Choroba wpływa także na obwodowy układ nerwowy, powodując epizody męczącego, palącego bólu kończyn. Choroba Fabry jest powodowana niedoborem enzymu a-galaktozydazy A (a-gal A), co powoduje blokowanie katabolizmu obojętnych glikosfingolipidów, oraz akumulację substratu enzymatycznego, triheksozydu ceramidu, w komórkach i w krwiobiegu.

Wskutek związanego z X wzoru dziedziczenia choroby, zasadniczo wszyscy pacjenci z chorobą Fabry'ego są rodzaju męskiego. Chociaż zaobserwowano kilka silnie zaatakowanych heterozygot żeńskich, żeńskie heterozygoty są zwykle albo bezobjawowe, albo wykazują względnie łagodne objawy głównie ograniczone do charakterystycznej mętności rogówki. Nietypowy wariant choroby Fabry'ego, z niską resztkową aktywnością α-gal A i bardzo łagodnymi objawami lub brakiem innych objawów charakterystycznych dla choroby Fabry'ego, koreluje z przerostem lewej komory i chorobą serca (Nakano i in., New Engl. J. Med. 333:288-293, 1995). Przypuszcza się, że obniżenie α-gal A może być powodem takich nienormalności sercowych.

cDNA i gen kodujący ludzką α-gal A wydzielono i sekwencjonowano (Bishop i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4859, 1986; Kornreich i in., Nuc. Acids Res. 17:3301, 1988; Oeltjen i in., Mammalian Genome 6:335-338, 1995). Ludzka α-gal A ulega ekspresji jako 429-aminokwasowy polipeptyd, przy czym 31 N-terminalnych aminokwasów stanowi peptyd sygnałowy. Ludzki enzym poddano ekspresji w komórkach jajnika chińskiego chomika (CHO) (Desnick, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5356804; Ioannou i in., J. Cell Biol. 119:1137, 1992); komórkach owadów (Calhoun i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5179023); oraz komórkach COS (Tsuji i in., Eur. J. Biochem. 165:275, 1987). Opisano pilotowe próby terapii substytucyjnej α-gal A, stosując białko pochodzące z ludzkich tkanek (Mapes i in., Science 169:987 1970; Brady i in., N. Engl. J. Med. 289:9, 1973; Desnick i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5326, 1979), lecz nie ma obecnie skutecznej terapii choroby Fabry'ego.

Odkryto, że ekspresja DNA kodującego ludzką α-gal A w hodowanych ludzkich komórkach powoduje wytworzenie polipeptydu, który jest odpowiednio glikozylowany, jest więc nie tylko enzymatycznie aktywny i zdolny do działania na glikosfingolipidowy substrat, który gromadzi się w chorobie Fabry'ego, lecz jest także skutecznie intemalizowany przez komórki dzięki receptorom powierzchni komórki, które kierują go dokładnie w miejsce po190 041 trzebne w tej chorobie: przestrzeń lizosomową zaatakowanych komórek, szczególnie komórek śródblonka wyścielających naczynia krwionośne pacjenta. To odkrycie, które przedyskutowano dokładniej poniżej, oznacza, że osobnik podejrzany o niedobór α-gal A, taki jak w chorobie Fabry'ego, może być leczony (1) ludzkimi komórkami, które zmodyfikowano genetycznie dla nadekspresji i wydzielania ludzkiej α-gal A, lub (2) oczyszczoną ludzką α-gal A otrzymaną z hodowanych, genetycznie zmodyfikowanych ludzkich komórek.

Terapia pierwszą drogą, to jest samymi zmodyfikowanymi komórkami, obejmuje genetyczną manipulację ludzkimi komórkami (np., pierwotnymi komórkami, wtórnymi komórkami lub nieśmiertelnymi komórkami) in vitro lub ex vivo dla indukowania ekspresji i sekrecji znacznych ilości ludzkiej α-gal A, następnie implantację komórek do ciała pacjenta, jak ogólnie opisuje Selden i in., publikacja WO 93/09222 (dołączana niniejszym jako odnośnik).

Gdy komórki mają być genetycznie modyfikowane dla celów leczenia choroby Fabry'ego metodą terapii genowej lub terapii zastępowania enzymu, cząsteczka DNA zawierająca cDNA α-gal A lub genomową sekwencję DNA może być zawarta w konstrukcie ekspresyjnym i wprowadzana do pierwotnych lub wtórnych ludzkich komórek (np., fibroblastow, komórek nabłonka, w tym komórek sutków i jelitowych komórek nabłonka, komórek śródblonka, uformowanych elementów krwi, w tym limfocytów i komórek szpiku kości, komórek glejowych, hepatocytów, keratynocytów, komórek mięśni, komórek nerwowych lub prekursorów tych typów komórek) standardowymi sposobami transfekcji obejmującymi między innymi mediowaną liposomami, polibrenem lub dekstranem DEAE transfekcję, elektroporację, strącanie z fosforanem wapnia, mikrowstrzykiwanie lub rozpędzone mikropociski („biolistyka”). Alternatywnie, można stosować układ, który dostarcza DNA wirusowym wektorem. Wirusy przydatne do przenoszenia genów obejmują adenowirusy, wirusa pokrewnego adenowirusom, wirusa opryszczki, wirusa świnki, wirusa polio, retrowirusy, wirusa Sindbis oraz wirusa krowiej ospy takiego jak wirus ospy kanarków. Chociaż kultury komórek pierwotnych lub wtórnych są korzystne w sposobach terapii, można także stosować nieśmiertelne komórki ludzkie. Przykłady nieśmiertelnych ludzkich linii komórek przydatnych w niniejszych sposobach obejmują między innymi komórki czerniaka Bowesa (numer dostępu ATCC CRL 9607), komórki Daudi (numer dostępu ATCC CCL 213), komórki HeLa i pochodne HeLa (numery dostępu ATCC CCL 2, CCL 2.1 i CCL 2.2), komórki HL-60 (numer dostępu ATCC CCL 240), komórki HT1080 (numer dostępu ATCC CCL 121), komórki Jurkata (numer dostępu ATCC TIB 152), komórki raka KB (numer dostępu ATCC CCL 17), komórki białaczki K-562 (numer dostępu ATCC CCL 243), komórki raka piersi MCF-7 (numer dostępu ATCC BTH 22), komórki MOLT-4 (numer dostępu ATCC 1582), komórki Namalwa (numer dostępu ATCC CRL 1432), komórki Raj i (numer dostępu ATCC CCL 86), komórki RpMI 8226 (numer dostępu ATCC CCL 155), komórki U-937 (numer dostępu ATCC CRL 1593), podlinia 2R4 komórek WI-38VA13 (numer dostępu ATCC CLL 75.1) oraz komórki raka jajnika 2780AD (Van der Blick i in., Cancer Res. 48:5927-5932, 1988) jak też heterohybrydomowe komórki wytwarzane przez fuzję ludzkich komórek i komórek innych gatunków. Można także stosować szczepy wtórnych ludzkich fibroblastów, takie jak Wl-38 (numer dostępu ATCC CCL 75) i MRC-5 (numer dostępu ATCC CCL 171).

Postępując metodami inżynierii genetycznej ludzkich komórek z cząsteczką DNA kodującą α-gal A (lub metodami innej odpowiedniej genetycznej modyfikacji, jak opisano poniżej) z utworzeniem komórki wykazującej nadekspresję i sekrecję α-gal A, można wytworzyć klonujący szczep komórek złożony zasadniczo z wielu genetycznie identycznych hodowanych pierwotnych ludzkich komórek, lub, gdy komórki są nieśmiertelne, klonującą linię komórek złożoną zasadniczo z wielu genetycznie identycznych nieśmiertelnych ludzkich komórek. Korzystnie, komórki klonującego szczepu komórek lub klonującej linii komórek są fibroblastami.

Genetycznie zmodyfikowane komórki można następnie wytworzyć i wprowadzić w pacjenta odpowiednimi sposobami, np. jak opisano u Seldena i in., WO 93/09222.

Zastosowanie, genetycznie zmodyfikowanych ludzkich komórek, według wynalazku daje szereg korzyści przy terapii zastępowania enzymu enzymem pochodzącym z tkanki ludzkiej lub zwierzęcej. Np., zastosowanie według wynalazku nie zależy od ewentualnej niespójnej dostępności źródeł odpowiednich tkanek, a więc jest handlowo żywotnym środkiem leczenia niedoboru α-gal A. Stanowi to względnie małe ryzyko w porównaniu z terapią zastępowania

190 041 enzymu enzymem pochodzącym z ludzkich tkanek, które można zainfekować znanymi lub nieznanymi wirusami i innymi czynnikami infekcyjnymi. Ponadto, terapia genowa daje pewne korzyści względem ogólnej terapii zastępowania enzymu. Na przykład zastosowanie według wynalazku (1) daje korzyść długoterminowej strategii, która eliminuje potrzebę dziennych zastrzyków; (2) eliminuje silne fluktuacje stężeń białka leczniczego w osoczu i tkance, co zwykle towarzyszy konwencjonalnemu podawaniu farmakologicznemu; i (3) może być mniej kosztowne niż zastępowanie enzymu, ponieważ wytwarzanie i oczyszczanie białka do częstego podawania jest niekonieczne.

Jak opisano powyżej, osoby z niedoborami α-gal A można także potraktować oczyszczonym α-gal A (to jest terapią zastępowania enzymu). Pierwotne, wtórne lub nieśmiertelne ludzkie komórki genetycznie zmodyfikowane dla nadekspresji ludzkiego α-gal A będą także przydatne do wytwarzania białka in vitro, w celu wytworzenia białka, które może być oczyszczone dla celów terapii zastępowania enzymu. Wtórne lub nieśmiertelne ludzkie komórki można wybrać spośród opisanych powyżej i mogą być one genetycznie modyfikowane przez transfekcję lub transdukcję, także opisane powyżej. Po genetycznej modyfikacji, komórki hoduje się w warunkach pozwalających na nadekspresję i sekrecję α-gal A. Białko wydziela się z hodowanych komórek przez zebranie pożywki, w której hoduje się komórki, i/lub lizując komórki dla uwolnienia ich zawartości, a następnie stosując standardowe techniki oczyszczania białka. Jedna taka technika obejmuje przepuszczenie pożywki kultury, lub dowolnej próbki zawierającej ludzką α-gal A, przez hydrofobową aktywną żywicę, taką jak Butyl Sepharose® lub inna żywica mająca grupę funkcyjną, która obejmuje grupę butylową. Przepuszczanie próbki nad taką żywicą może stanowić pierwszy etap chromatografii. Jeśli konieczne jest dalsze oczyszczanie, substancję zawierającą α-gal A eluowaną z hydrofobowej aktywnej żywicy można przepuścić przez kolumnę zawierającą drugą żywicę, taką jak unieruchomiona żywica heparynowa taka jak Heparin Sepharose®, hydroksyapatyt, anionowymienna żywica taka jak Q Sepharose®, lub ekskluzyjna żywica taka jak Superdex® 200. Korzystnie, protokół oczyszczania będzie obejmował zastosowanie każdego z powyższych typów żywic. Alternatywnie, można stosować jedną lub kilka z tych żywic przed lub zamiast hydrofobowej żywicy aktywnej.

Dotychczasowe sposoby wytwarzania α-gal A o dość wysokiej czystości zależały od stosowania chromatografii powinowactwa, zużyciem kombinacji lektynowej chromatografii powinowactwa (concanavalin A (Con A) Sepharose) i chromatografii powinowactwa opartej na wiązaniu α-gal A do podłożowego analogu N-6-aminoheksanoilo-α-D-galaktozyloaminy sprzężonej z matrycą Sepharose (Bishop i in., J. Biol. Chem. 256:1307-1316, 1981). Zastosowanie białkowych lektynowych żywic powinowactwa i podłożowych analogów żywic jest typowo związane z ciągłym wypłukiwaniem czynnika powinowactwa ze stałego nośnika (por. Marikar i in., Anal. Biochem. 201:306-310, 1992), co powoduje zanieczyszczenie oczyszczonego produktu czynnikiem powinowactwa wolnym w roztworze lub związanym z eluowanym białkiem. Takie zanieczyszczenia powodują, że produkt nie nadaje się do stosowania w farmaceutycznych preparatach. Związane analogi podłoży i lektyny mogą także mieć znaczący negatywny wpływ na enzymatyczne, funkcjonalne i strukturalne właściwości białek. Ponadto, takie żywice powinowactwa są typowo kosztowne w wytwarzaniu, co powoduje, że takie żywice są mniej odpowiednie do produkcji na skalę przemysłową niż bardziej konwencjonalne żywice chromatograficzne. Tak więc opracowanie protokołu oczyszczania z użyciem konwencjonalnych żywic chromatograficznych, które są łatwo dostępne w ilości i jakości odpowiedniej do wielkoskalowego przemysłowego zastosowania, jest znaczącą korzyścią z niniejszego wynalazku.

Osobnik podejrzewany o niedobór α-gal A może być leczony przez podawanie farmaceutycznie dopuszczalnej, oczyszczonej ludzkiej α-gal A dowolnymi standardowymi sposobami, w tym między innymi w postaci zastrzyku dożylnego, podskórnego lub domięśniowego, lub jako stałego implantu. Oczyszczone białko można skomponować w leczniczą kompozycję złożoną z roztworu wodnego zawierającego fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, np. nośnik taki jak albumina ludzkiej surowicy, przy pH 6,5 lub poniżej.

Niniejszy wynalazek daje więc środek uzyskiwania dużych ilości odpowiednio glikozylowanej, a więc terapeutycznie przydatnej ludzkiej α-gal A. To powoduje, że terapia zastępo190 041 wania enzymu przy niedoborze α-gal jest handlowo przydatna, jak też względnie pozbawiona ryzyka w porównaniu z terapią enzymem pochodzącym z tkanek ludzkich lub zwierzęcych.

Specjaliści zauważą, że sekwencję DNA ludzkiej α-gal A (cDNA lub genomowego DNA), lub sekwencje różniące się od niej wskutek zmian milczących kodonów lub zmian kodonów powodujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, można stosować do genetycznego modyfikowania hodowanych ludzkich komórek, aby dawały nadekspresję i sekrecję enzymu. Jest także możliwe, że pewne mutacje w sekwencji DNA α-gal A będą kodować polipeptydy zachowujące lub wykazujące polepszoną enzymatyczną aktywność α-gal A (co można stwierdzić przez ekspresję zmutowej cząsteczki DNA w hodowanych komórkach, oczyszczenie zakodowanego polipeptydu i zmierzenie katalitycznej aktywności, jak opisano tutaj). Np., można by się spodziewać, że konserwatywne podstawienia aminokwasowe mają niewielki lub żaden wpływ na biologiczną aktywność, szczególnie jeśli reprezentują mniej niż 10% łącznej liczby reszt w białku. Konserwatywne podstawienia typowo obejmują substytucje następującymi grupami: glicyną, alaniną; waliną, izoleucyną, leucyną; kwasem asparaginowym, kwasem glutaminowym; asparaginą, glutaminą; seryną, treoniną; lizyną, argininą; oraz fenyloalaniną, tyrozyną.

Wytwarzanie α-gal A przez komórki można podwyższyć pewnymi genetycznymi manipulacjami. Na przykład cząsteczka DNA kodująca α-gal A może także kodować heterologiczny peptyd sygnałowy, taki jak peptyd sygnałowy ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), erytropoetyna, czynnik VIII, czynnik IX, glukagon, receptor niskiej gęstości lipoproteiny (LDL) lub lizosomowy enzym inny niż α-gal A. Korzystnie, peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym hGH (SEKW. NR ID.:21), i znajduje się na końcu N zakodowanego białka. Sekwencja DNA kodująca peptyd sygnałowy może zawierać intron, taki jak pierwszy intron genu hGH, co daje sekwencję DNA takąjak SEKW. NR ID.:27 (patrz także fig. 10). Ponadto, cząsteczki DNA mogą także zawierać nietranslowaną sekwencję 3' (UTS), która ma długość co najmniej 6 nukleotydów (-w przeciwaeństwie do mRNA α-gal A znajdowanego u ludzi, który nie ma 3' UTS, wymaganego miejsca poliadenylacji w tej samej sekwencji kodującej). UTS mieści się w kierunku 3' do kodonu terminacji sekwencji kodującej i obejmuje miejsce poliadenylacji. Ma korzystnie długość co najmniej 6 nukleotydów, korzystniej co najmniej 12, i najkorzystniej co najmniej 30, a we wszystkich przypadkach zawiera sekwencję AATAAA lub spokrewnioną sekwencję, która służy do wzmacniania poliadenylacji. Cząsteczka DNA jak opisano, to jest kodująca peptyd sygnałowy hGH związany z α-gal A i zawierający 3' UTS obejmujący miejsce poliadenylacji, i korzystnie obejmujący sekwencje kontroli ekspresji, mieści się także w zakresie wynalazku. Także w zakresie wynalazku jest cząsteczka DNA kodująca białko obejmujące peptyd sygnałowy hGH związany z α-gal A lub dowolny inny heterologiczny polipeptyd (to jest, dowolny polipeptyd inny niż hGH lub analog hGH). Heterologiczny polipeptyd jest typowo białkiem ssaka, np. dowolnym leczniczo pożądanym ludzkim polipeptydem.

Termin „genetycznie zmodyfikowany” stosowany tutaj w odniesieniu do komórek, ma obejmować komórki, które dają ekspresję konkretnego produktu genowego po wprowadzeniu cząsteczki DNA kodującej produkt genowy i/lub elementy regulacyjne kontrolujące ekspresję kodującej sekwencji. Wprowadzenia cząsteczki DNA można dokonać przez nakierowanie genu (to jest, wprowadzenie cząsteczki DNA do konkretnego miejsca genomu); ponadto homologiczna rekombinacja pozwala na zastąpienie samego uszkodzonego genu (uszkodzony gen α-gal A lub jego część może być zastąpiony własnymi komórkami pacjentów z chorobą Fabry z pełnymi genami lub ich częścią).

Termin „α-gal A” stosowany tutaj oznacza α-gal A bez peptydu sygnałowego, to jest, SEKW. NR iD.:26 (fig. 9). Istnieją pewne wskazania, że reszty 371 do 398 lub 373 do 398 SEKW. NR ID.:26 (fig. 9) można usunąć z lizosomu; jednakże usunięcie tego próbnego propeptydu ma nie wpływać na aktywność enzymu. Sugeruje to, że dowolna część próbnego propeptydu może być wycięta bez wpływu na aktywność. Tak więc termin „α-gal A” stosowany tutaj pokrywa także białko mające sekwencję odpowiadającą SEKW. NR ID.:26 poza brakiem reszt do 28 na końcu C tej sekwencji.

Przez „niedobór α-gal A” rozumie się dowolny niedobór w ilości lub aktywności enzymu u pacjenta. Niedobór może indukować ostre objawy, jak typowo obserwowane u męż8

190 041 czyzn cierpiących na chorobę Fabry, lub może być tylko częściowy i indukować względnie łagodne objawy, jakie można zauważyć u heterozygotycz.nych żeńskich nośników uszkodzonego genu.

Stosowany tutaj termin „pierwotna komórka” obejmuje komórki obecne w zawiesinie komórek wydzielanych z tkanek kręgowców (przed umieszczeniem na płytkach, to jest, związaniem z podłożem kultury tkankowej takim jak szalka lub kolba), komórki obecne w eksplancie pochodzącym z tkanki, przy czym oba wymienione typy komórek umieszczone na płytkach pierwszy raz, oraz zawiesiny komórkowe pochodzące z tych umieszczonych na płytkach komórek.

„Wtórne komórki” odnoszą się do komórek na wszystkich następnych etapy w hodowli. Oznacza to, że przy pierwszym razie, gdy umieszczoną na płytkach pierwotną komórkę usuwa się z podłoża kultury i ponownie umieszcza na płytce (pasażuje), określa się ją jako wtórną komórkę, jak wszystkie komórki w kolejnych pasażach.

„Szczep komórek” składa się z wtórnych komórek, które pasażowano jeden lub więcej razy; wykazują skończoną liczbę średniego zdwajania populacji w kulturze; wykazują właściwości inhibitowanego przez kontakt, zależnego od zamocowania wzrostu (poza komórkami propagowanymi w zawiesinie kultury); i nie są nieśmiertelne.

Przez „nieśmiertelną komórką” rozumie się komórkę z ustalonej linii komórkowej wykazującą widocznie nieograniczony czas życia w kulturze.

Przez „peptyd sygnałowy” rozumie się sekwencję peptydu kierującą nowo zsyntetyzowany polipeptyd z miejsca wiązania do siateczki śródcytoplazmatycznej do dalszego potranslacyjnego przetwarzania i/lub dystrybucji.

Termin „heterologiczny peptyd sygnałowy” stosowany tutaj w kontekście α-gal A, oznacza peptyd sygnałowy nie będący ludzkim peptydem sygnałowym α-gal A (to jest, zakodowanym przez nukleotydy 36-128 SEKW. NR ID.: 18). Jest to typowo peptyd sygnałowy pewnego białka ssaka innego niż α-gal A.

Termin „pierwszy etap chromatografii” odnosi się do pierwszego podania próbki na kolumnę chromatograficzną, (wszystkie etapy związane z wytwarzaniem próbki są wykluczone).

Wynalazek został zilustrowany na rysunku na którym:

Figura 1 jest reprezentacją sondy 210 par zasad użytej do wydzielania α-gal A z biblioteki cDNA ludzkich fibroblastów (SEKW. NR ID.: 19). Sekwencja pochodzi z eksonu 7 genu α-gal A. Sondę wydzielono z ludzkiego genomowego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Regiony podkreślone na figurze odpowiadają sekwencjom starterów wzmacniania.

Figura 2 przedstawia sekwencję fragmentu DNA kończącą koniec 5' klonu cDNA α-gal A (SEKW. NR ID.:20). Ten fragment wzmocniono z ludzkiego genomowego DNA metodą PCR. Regiony podkreślone korespondują z sekwencjami starterów wzmacniania. Pokazano także położenia miejsc endonukleaz restrykcyjnych NcoI i SacII, których użyto do subklonowania, jak opisano w przykładzie IA.

Figura 3 przedstawia sekwencję cDNA α-gal A, w tym sekwencję kodującą peptyd sygnałowy (SEKW. NR ID.: 18).

Figura 4 jest schematyczną mapą pXAG-16, konstruktu ekspresyjnego α-gal A obejmującego promotor CMV (cytomegalowirusa) i intron, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy hGH i pierwszy intron, cDNA α-gal A (to jest, pozbawioną sekwencji peptydu sygnałowego α-gal A) i 3' UTS hGH.

Figura 5 oznacza schematyczną mapę pXAG-28, konstruktu ekspresyjnego α-gal A obejmującego promotor kolagenu Iu2, intron β-aktyny, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy hGH i pierwszy intron, cDNA α-gal A (to jest, bez sekwencji peptydu sygnałowego α-gal A) i 3' UTS hGH.

Figura 6 jest chromatogramem α-gal A etapu oczyszczania z użyciem żywicy Butyl Sepharose®. Pokazano absorbancję przy 280 nm (zwykła linia) i aktywność α-gal A (linia kropkowana) wybranych frakcji.

Figura 7 jest liniowym wykresem pokazującym internalizację fibroblastów Fabry ludzkiej α-gal A wytworzonej według wynalazku. Wewnątrzcząsteczkową aktywność α-gal A i łączne stężenie białka zmierzono po inkubacji komórek przy rosnących stężeniach ludzkiego

190 041 α-gal A wytworzonego według wynalazku. Pokazano wpływ potencjalnych inhibitorów internalizacji fosforanu mannozy-6 (M6P; otwarte romby) i mannanu (otwarte okręgi).

Figura 8 jest schematycznym diagramem eksperymentalnego paradygmatu zaprojektowanego dla zbadania fibroblastów po internalizacji α-gal A. Aktywność α-gal A komórek Fabry mierzy się po wystawieniu na normalne lub dające nadekspresję α-gal A ludzkie fibroblasty hodowane w insertach Trans well™. „M6P” = fosforan mannozy-6; „Untrf HF” = nietransfekowane ludzkie fibroblasty; „BRS11” = transfekowany, dający nadekspresję α-gal A szczep fibroblastów.

Figura 9 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiej α-gal A (SEKW. NR ID.:26).

Figura 10 przedstawia sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy hGH i zawierającą pierwszy intron hGH (podkreślone) (SEKW. NR ID.:27).

Figura 11 przedstawia sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy hGH bez intronu (SEKW. NR ID.:22).

Figura 12 przedstawia sekwencję aminokwasową peptydu sygnałowego hGH (SEKW. NR ID.:21).

Figura 13 przedstawia sekwencję cDNA kodującą ludzką α-gal A (bez peptydu sygnałowego) (SEKW. NR ID. :25). . ,

Lizosomowe enzymy, takie jak α-gal A, są nakierowane na lizosomową część komórki przez oddziaływanie z receptorem fosforanu mannozy-6 (M6P), który wiąże się z resztami M6P obecnymi w ugrupowaniach oligosacharydowych enzymów skierowanych do części lizosomowej (Kornfeld, S. i Mellman, I, Ann. Rev. Cell Biol. 5:483-525, 1989). Pierwotne oddziaływanie zachodzi w Golgi, gdzie enzymy związane z receptorami Golgi M6P są segregowane do transportu do lizosomów. Wtórny typ oddziaływania ma zachodzić pomiędzy zewnątrzkomórkowymi receptorami α-gal A i M6p na powierzchni komórki. Zewnątrzkomórkowe substancje internalizowane przez komórki są transportowane przez cytoplazmę w endocytowych pęcherzykach, które łączą się z pierwotnymi lizosomami i wprowadzają zawartość do lizosomów. W tym procesie receptory powierzchni komórki M6P są także włączane w endocytowe pęcherzyki i transportowane do lizosomów.

Dowolny α-gal A obecny w zewnątrzkomórkowy środowisku może, jeśli niesie resztę M6P, wiązać z receptorami powierzchni komórki M6P i ulegać przeniesieniu do lizosomowej części wraz z receptorami. Po dostaniu się do lizosomowej części dzięki temu działaniu wymiatającemu, enzym może przenieść swoją odpowiednią funkcję. Tak więc nawet jeśli komórka jest genetycznie pozbawiona wytwarzania swojego α-gal A, istnieje mechanizm egzogennego poboru wytworzonego enzymu, jeśli tylko (a) enzym jest odpowiednio glikozylowany i (b) pozbawiona go komórka ma receptory M6P.

W chorobie Fabry'ego komórki śródbłonka naczyniowego nerek i serca okazały się wykazywać silne histopatologiczne nieprawidłowości i dawać wkład do klinicznej patologii choroby; te komórki, które nie niosą receptorów M6P, są szczególnym celem zastrzeganego wynalazku. α-gal A wytworzony według wynalazku można podawać miejscowo lub układowo uszkodzonym komórkom, metodą terapii genowej (to jest, dzięki genetycznie modyfikowanym komórkom, które dają ekspresję i sekrecję glikozylowanego enzymu w pacjencie), lub konwencjonalnymi farmakologicznymi drogami podawania, α-gal A, w której występuje M6P w związanych z N oligosacharydach, ma więc wielkie znaczenie dla terapii według wynalazku.

Ponadto stopień, w którym związane z N oligosacharydy α-gal A są zmodyfikowane przez sialilowanie, jest także bardzo ważny. W nieobecności odpowiedniego sialilowania α-gal A będzie gwałtownie usuwany z obiegu wskutek wiązania z wątrobowymi receptorami asialoglikoproteiny, po czym nastąpi internalizacja i degradacja przez hepatocyty (Ashwell i Harford, Ann. Rev. Biochem. 51:531-554, 1982). To zmniejsza ilość α-gal A dostępnego w obiegu do wiązania receptorów M6P na komórkach, które dają wkład do klinicznej patologii choroby Fabry, takich jak komórki śródbłonka naczyń nerek i serca. Zaskakująco, zgłaszający stwierdzili, że α-gal A wydzielany przez trwale transfekowane ludzkie komórki ma właściwości glikozylacji, które są odpowiednie do leczenia choroby Fabry przez terapię genową lub konwencjonalne farmaceutyczne podawanie oczyszczonego wydzielonego białka. Dzieje się tak w przeciwieństwie do sytuacji dla najlepiej zbadanego lizosomowego enzymu, glukocerebrozydazy, gdzie dostarczanie enzymu oczyszczonego z ludzkiego łożyska lub wydzielo10

190 041 nego z transfekowanych komórek CHO do klinicznie odpowiednich komórek w ciele wymaga złożonej enzymatycznej modyfikacji enzymu po oczyszczaniu (por. Beutler, New Engl.

J. Med. 325:1354-3.360, 1991).

Terapia może być prowadzona w dwu ogólnych drogach: przez wprowadzenie w pacjenta leczniczo skutecznej ilości oczyszczonej ludzkiej α-gal A otrzymanej z hodowanych ludzkich komórek genetycznie modyfikowanych dla nadekspresjii sekrecji enzymu, lub przez wprowadzenie nadekspresyjnej komórki do pacjenta. Techniki dokonywania koniecznych genetycznych modyfikacji przedyskutowano poniżej, jak też sposoby oczyszczania, komponowania i zastosowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej komórki do leczenia pacjenta podejrzanego o niedobór α-galaktozydazy A opisano poniżej.

Przykład I. Wytwarzanie z zastosowaniem konstruktów zaprojektowanych do dostarczania i ekspresji α-gal A

Zbudowano dwa plazmidy ekspresyjne, pXAG-16 ipXAG-28. Te plazmidy zawierają cDNA ludzkiego α-gal A kodujący 398 aminokwasów enzymu α-gal A (bez peptydu sygnałowego α-gal A); sekwencja genomowa DNA peptydu sygnałowego ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), która jest przerywana pierwszym intronem genu hGH; oraz nietranslowaną sekwencją 3' (UTS) genu hGH, która zawiera sygnał poliadenylacji. Plazmid pXAG-16 ma ludzki rKitychmiastowy-wczesny promotor cytomegalowirusa (CMV IE) i pierwszy intron (flankowany niekodującymi eksonowymi sekwencjami), podczas gdy pXAG-28 jest napędzany promotorem kolagenowym Ia2 i także zawiera 5' UTS genu β-aktyny, który zawiera pierwszy intron genu β-aktyny.

A. Klonowame kompletnepo cDNA α-gal α- i konsinikcja plazmidu eJid^resyi α-gai A pXAG-16

Ludzki cDNA α-gal klonowano z biblioteki cDNA ludzkich flbrkblastów, która została skonstruowana jak następuje. Poli-A* mRNA wydzielono z całości RNA, i syntezę cDNA przeprowadzono stosując reagenty dla systemu lambda ZapII® według zaleceń wytwórcy (Stratagene Inc., L^olla, CA). Krótki, „pierwszej nici” cDNA generowano metodą odwrotnej transkrypcji w obecności startera oligo-dT zawierającego wewnętrzne miejsce endonukleazowej restrykcji XhoI. Po potraktowaniu RNase H, cDNA poddano translacji w przerwie polimerazą DNA I dla wytworzenia dwuniciowego cDNA. Ten cDNA otrzymał lepkie końce przy pomocy polimerazy DNA T4 i ligowano go z adapterami EcoRI. Produkty tego ligowania potraktowano kinazą DNA T4 i trawiono XhoI. cDNA frakcjonowano metodą chromatografii na Sephaan4-400®). Frakcje dużych i średnich rozmiarów połączono i cDNA ligowano do trawionych EcoRI i XhoI ramion Lambda ZapII. Produkty tego ligowania opakowano następnie i miareczkowano. Pierwotna biblioteka miała miano 1,2 x 107 pfu/ml i średnią wielkość insertu 925 par zasad.

Sondę 210 par zasad z eksonu 7 ludzkiego genu α-gal A (fig. 1, SEKW. NR ID.: 19) użyto do wydzielenia cDNA. Samą sondę wydzielono z reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) gecemowego DNA stosując następujące oligonukleotydy:

5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1; SEKW. NR ID.: 1) i

5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEKW. NR ID.:2).

Produkt PCR użyto następnie do selekcji flbroblajtowej biblioteki cDNA, i pozytywne klony wydzielono i następnie zbadano. Jeden pozytywny klon, fag 3A, poddano protokołowi wycinania lambda ZapII® (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), według zaleceń wytwórcy. Ta procedura dała plazmid pBSAG3A, który zawiera sekwencję cDNA α-gal A w rdzeniu plazmidu pBluesaπptSK’^TM. Sekwencjonowanie DNA wyjawiło, że ten plazmid nie zawierał pełnego końca 5' sekwencji cDNA. Tak więc koniec 5' zrekonstruowano stosując fragment PCR wzmacniany z ludzkiego genomowego DNA. Dla wykonania tego, fragment genomowego DNA o 268 par zasad (fig. 2, SEKW. NR ID.:20) wzmocniono stosując następujące oligonukleetydy:

5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEKW. NR ID.: 3) i

5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3 ' (Oligo 4; SEKW. NR ID.:4).

Ten fragment subkionowano do plazmidu klonowania „TA” (Invitrogen Corp., San Diego, CA) dla wytworzenia plazmidu pTAAGEI. Plazmid pBSAG3A, który zawiera większość sekwencji cDNA α-gal A, oraz pTAAGEI, który zawiera koniec 5' cDNA α-gal A, tra190 041 wiono Sacll i Neoł. Położenie odpowiednich miejsc SacII i Ncol we wzmacnianym fragmencie DNA pokazano na fig. 2. Fragment 0,2 kb SacII-NcoI z pTAAGEI wydzielono i ligowano do podobnie trawionego pBSAG3A. Ten plazmid, pAGAL, zawiera cDNA kompletnej sekwencji α-gal A, w tym sekwencję kodującą peptyd sygnałowy α-gal A. cDNA całkowicie sekwencjonowano (fig. 3 z peptydem sygnałowym α-gal A; SEKW. NR ID.: 18) i stwierdzono identyczność z opublikowaną sekwencją ludzkiego cDNA α-gal A (sekwencja Genbank HUMGALA).

Plazmid pXAG-16 skonstruowano poprzez kilka związków pośrednich, jak następuje. Najpierw pAGAL trawiono SacII i XhoI i stworzono lepkie końce. Po drugie, końce kompletnego cDNA α-gal A ligowano do linkerów XbaI i subklonowano do XbaI trawionego pEFBOS (Mizushima i in., Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990), tworząc pXAG-I. Ten konstrukt zawiera 3' UTS ludzkiego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF) i ludzki promotor czynnika wydłużenia 1α (ΕΤ-1α) flankujący cDNA kodujący α-gal A plus peptyd sygnałowy α-gal A, takie, że koniec 5' cDNA α-gal A jest złączony z promotorem ΐϋ’-1α. Dla wytworzenia konstruktu z promotorem CMV IE i pierwszym intronem, cDNA α-gal A i 3' UTS G-CSF usunięto z pXAG-I jako fragment 2 tys. par zasad XbaI-BamHI. Fragmentowi utworzono lepkie końce, ligowano do linkerów BamHI i wstawiono do trawionego BamHI pCMVflpNeo (który skonstruowano jak opisano poniżej). Orientacja była taka, że koniec 5' cDNA α-gal A był sklejony z regionem promotora CMV IE.

pCMVflpNeo utworzono jak następuje. Fragment promotora genu CMV IE wzmocniono metodą PCR stosując genomowy DNA CMV jako wzorzec i oligonukleotydy:

5'_TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (SEKW. NR ID.:23) i 5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEKW. NR ID.:24). Powstały produkt (fragment 1,6 tys. par zasad) trawiono BamHI, uzyskując fragment zawierający promotor CMV z spójnymi trawionymi BamHI końcami. Jednostkę ekspresji neo wydzielono z plazmidu pMCineopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) jako fragment 1,1 tys. par zasad XhoIBamHI. Fragmenty zawierające promotor CMV i neo wstawiono do trawionego BamHI, XhoI plazmidu (pUC12). Należy zauważyć, że pCMVflpNeo zawiera region promotora CMV IE, rozpoczynający się od nukleotydu 546 i kończący na nukleotydzie 2105 (sekwencja Genbank HS5MIEP), i gen oporności na neomycynę napędzany przez promotor kinazy tymidyny wirusa Herpes Simplex (HSV) (gen TKneo) w pozycji 5' względem fragmentu promotora CMV IE. Kierunek transkrypcji genu neo jest taki sam jak fragmentu promotora CMV. Ten konstrukt pośredni nazwano pXAG-4.

Aby dodać 3' UTS hGH, 3' UTS GCSF usunięto z pXAG-4 jako fragment XbaI-SmaI i końce pXAG-4 uczyniono lepkimi. 3' UTS hGH usunięto z pXGH5 (Selden i in., Mol. Cellular Biol. 6:3173-3179, 1986) jako fragment 0,6 tys. par zasad SmaI-EcoRI. Po zakończeniu lepkimi końcami tego fragmentu ligowano go zpXAG-4 zaraz za lepkimi końcami miejsca XbaI pXAG-4. Ten związek pośredni nazwano pXAG-7. Fragment TKneo usunięto z tego plazmidu jako fragment HindIII-ClaI i końce plazmidu uczyniono lepkimi przez „wypełnienie” fragmentem Klenowa polimerazy DNA I. Gen oporności na neomycynę napędzany wczesnym promotorem SV40 ligowano jako lepki fragment Clal-BsmBI z trawienia pcDNeo (Chen i in., Mol. Cellular Biol. 7:2745-2752, 1987), umieszczając jednostkę transkrypcji neo w tej samej orientacji jak jednostka transkrypcji α-gal A. Ten związek pośredni nazwano pXAG-13.

Dla ukończenia pXAG-16, który miał 26 aminokwasów sekwencji kodującej peptyd sygnałowy hGH i pierwszy intron genu hGH, najpierw usunięto fragment 2,0 tys. par zasad EcoRI-BamHI pXAG-13. Ten fragment obejmował cDNA α-gal A i 3' UTS hGH. Ten duży fragment zastąpiono 3 fragmentami. Pierwszy fragment składał się z produktu PCR 0,3 tys. par zasad pXGH5, który zawiera sekwencję hGH kodującą peptyd sygnałowy i obejmuje sekwencję pierwszego intronu hGH, z syntetycznego miejsca BamHI z.araz powyżej sekwencji zgodności Kozaka do końca sekwencji kodującej peptyd sygnałowy hGH. Następujących oligonukleotydów użyto do wzmocnienia tego fragmentu (fragment 1):

5'_TttTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH101; SEKW. NR ID.:5) i ₅'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEKW. NR ID.:6).

190 041

Drugi fragment składał się z produktu PCR 0,27 tys. par zasad zawierającego sekwencje odpowiadające startowi cDNA kodującego 398 aminokwasów enzymu α-gal A (to jest, bez peptydu sygnałowego α-gal A) do miejsca NheI. Następujących oligonukleotydów użyto do wzmacniania tego fragmentu (fragment 2): 5'-TTTTCAGCTGGACAAT’GGAITGGC-3' (Oligo AG10; SEKW. NR ID.:7) i 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEKW. NR ID.:8). Trzeci fragment składał się z fragmentu NheI-EcoRI pXAG-7 zawierającego pozostałą sekwencję α-gal A, jak też 3' uTs hGH (fragment 3).

Fragment 1 (trawiony BamHI i NaeI), fragment 2 (trawiony PvuII i NheI), oraz fragment 3 zmieszano z fragmentem 6,5 tys. par zasad BamHI-EcoRI pXAG-13 zawierającym gen neo i promotor CMV IE i ligowano ze sobą dla wytworzenia plazmidu pXAG-16 (fig. 4).

B. Konstrukcja plazmidu ekspresji α-gal A pXAG-28

Promotor ludzkiego kolagenu Id2 wydzielono do stosowania w konstrukcie ekspresyjnym α-gal A pXAG-28 jak następuje. Fragment PCR 408 par zasad ludzkiego genomowego DNA zawierającego część promotora ludzkiego kolagenu I(i2 wydzielono stosując następujące oligonukleotydy:

5'-TTIT’GGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3'(01igo 72; SEKW. NR ID.:9) i 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEKW. NR ID.: 10).

Ten fragment użyto do selekcji ludzkiej leukocytowej biblioteki w EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Jeden pozytywny klon (fag 7H) zawierający fragment 3,8 tys. par zasad EcoRI wydzielono i klonowano do pBSIISK+ (Stratagene Inc., La Jolla, CA) w miejscu EcoRI (tworząc pBS/7H.2). Miejsce Avril wprowadzono wpBSIISK+ trawiąc Spel, co przecina polilinker pBSIISK+, „wypełniając” fragmentem Klenowa polimerazy DNA I i wstawiając oligonukleotyd 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEKW. NR ID.: 11). Ten wariant pBSIISK+ trawiono BamHI i AvrII i ligowano do fragmentu 121 par zasad BamHI-AvrII oryginalnego fragmentu PCR 408 par zasad promotora kolagenu fa2 opisanego powyżej, tworząc PBS/121COL.6.

Plazmid pHS/121COL.6 trawiono XbaI, co przecina w sekwencji polilinkera pBSIISK+, „wypełniono” fragmentem Klenowa polimerazy DNA I i trawiono AvrII. Fragment 3,8 tys. par zasad BamHI-AvrII pBS/7H.2 wydzielono i miejscu BamHI nadano lepkie końce traktując enzymem Klenowa. Fragment trawiono następnie AvrII i ligowano do trawionego AvrII wektora, tworząc w ten sposób plazmid kolagenowego promotora pBS/121bpCOL7H.18.

Następnie kolagenowy promotor sklejono z 5' UTS ludzkiego genu β-aktyny, który zawiera pierwszy intron ludzkiego genu β-aktyny. Dla wydzielenia tej sekwencji fragmentu PCR o 2 tys. par zasad wydzielono z ludzkiego genomowego DNA stosując następujące oligonukleotydy:

5'-mTT}AGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1; SEKW. NR ID.: 12) i

5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEKW. NR ID.: 13).

Ten fragment trawiono BamHI i BsiHKAI dla uwolnienia fragmentu 0,8 tys. par zasad zawierającego 5' UTS β-aktyny i intron. Fragment 3,6 tys. par zasad SalI-SrfI wydzielono następnie z plazmidu promotora kolagenu pBS/121bpCOL7H.18 jak następuje. pBs/121bpCOL7H.18 częściowo trawiono BamHI (miejsce BamHI leży na końcu 5' fragmentu promotora kolagenu fa2), wytworzono lepkie końce traktując fragmentem Klenowa i ligowano do linkera SalI (5'-GGTCGACC-3'), umieszczając miejsce SalI w górę od promotora kolagenu Ζα2. Ten plazmid trawiono następnie SalI i SrfI (miejsce SrfI leży 110 par zasad w górę od promotora kolagenu Σα2 CAP) i wydzielono fragment 3,6 tys. par zasad. Fragmenty 0,8 i 3,6 tys. par zasad połączono z trawionym SalI i BamHI pBSIISK- (Stratagene Inc., La Jolla, CA), i fragment złożony z następujących czterech oligonukleotydów zgrzanych ze sobą (tworząc fragment z lepkim końcem i końcem BsiHKAI):

5'-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3' (Oligo COL-1; SEKW. NR ID.: 14),

5'-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (Oligo COL-2; SEKW. NR ID.: 15),

5'-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGC CTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (Oligo COL-3; SEKW. NR ID.: 16), i

190 041

5'-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' (Oligo COL-4; SEKW. NR ID.: 17).

Te cztery oligonukleotydy, po zgrzaniu, odpowiadają regionowi rozpoczynającemu się w miejscu Srf promotora kolagenu i przechodzącemu przez miejsce BsiHKAI promotora β-aktyny. Powstały plazmid oznaczono pCOL/p-aktyna.

Dla zakończenia konstrukcji pXAG-28, wydzielono fragment Sall-BamHI pCOL/β-aktyna, zawierający promotor kolagenu Ια2 i 5' UTS β-aktyny. Ten fragment ligowano do dwu fragmentów z pXAG-16 (patrz przykład 1A i fig. 4): (1) fragment 6,0 tys. par zasad BamHI (zawierający gen neo, rdzeń plazmidu, cDNA kodujący 398 aminokwasów enzymu α-gal A, i 3' UTS hGH); oraz (2) fragment 0,3 tys. par zasad BamHI-XhoI (który zawiera sekwencję SV40 poli A z pcDneo). pXAG-28 zawiera ludzki promotor kolagenu fa2 sklejony z ludzkim 5' UTS β-aktyny, peptyd sygnałowy hGH (który jest przerywany przez pierwszy intron hGH), cDNA kodujący enzym α-gal A, oraz 3' UTS hGH. Mapę pełnego konstruktu ekspresyjnego pXAG-28 pokazano na fig. 5.

C. Transfekcja i selekcja fibroblastow elektroporowanych plazmidami ekspresji α-gal A

W celu ekspresji α-gal A w fibroblastach, wtórne fibroblasty hodowano i transfekowano według opublikowanych procedur (Selden i in., publikacja WO 93/09222).

Plazmidy pXAG-13, pXAG-16 i pXAG-28 transfekowano przez elektroporację do ludzkich fibroblastow napletka dla wytworzenia trwale transfekowanych szczepów klonowanych komórek, a powstałe poziomy ekspresji α-gal A śledzono jak opisano w przykładzie ID. Sekrecja α-gal A przez normalne fibroblasty napletka mieści się w zakresie 2-10 jednostek/10⁶ komórek/24 godziny. Przeciwnie, transfekowane fibroblasty wykazały średnie poziomy ekspresji pokazane w tabeli 1:

	Tabela 1 średnie poziomy ekspresji α-gal A (+/- standardowe odchylenie)
pXAG-13:	420 +/- 344 U/106 komórek/dzień N=26 klonujących szczepów (zakres 3 - 1133 U/106 komórek/dzień)
pXAG-16:	2,051 +/- 1253 U/106 komórek/dzień N=24 klonujące szczepy (zakres 422 - 5200 U/106 komórek/dzień)
pXAG-28:	141 +/- 131 U/106 komórek/dzień N=38 klonujących szczepów (zakres 20-616 U/106 komórek/dzień)

Te dane pokazują, że wszystkie trzy konstrukty ekspresyjne mogą zwiększać ekspresję α-gal A wielokrotnie w porównaniu z nietransfekowanymi fibroblastami. Ekspresja w fibroblastach trwale transfekowanych pXAG-13, który koduje α-gal A związany z peptydem sygnałowym α-gal A, była zasadniczo niższa niż ekspresja w fibroblastach transfekowanych pXAG-16, różniących się tylko tym, że peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym hGH, którego sekwencja kodująca jest przerywana pierwszym intronem genu hGH.

Przy każdym pasażu transfekowanych komórek, określano aktywność wydzielanego α-gal A, komórki zliczano i obliczano gęstość komórek. W zależności od liczby zebranych komórek i czasu pozostawionego na sekrecję α-gal A, określano właściwą szybkość ekspresji α-gal A i podawano w tabelach 2 i 3 jako jednostki poddane sekrecji (α-gal A) na 106 komórek na 24 godzin. Szczepy komórek pożądane do terapii genowej lub stosowania w wytwarzaniu substancji do oczyszczania α-gal A powinny wykazywać trwały wzrost i ekspresję po kilku pasażach. Dane ze szczepów komórek pokazanych w tabelach 2 i 3, które były trwale transfekowane konstruktem ekspresji α-gal A pXAG-16, ilustrują fakt, że ekspresja α-gal A trwale utrzymuje się podczas kolejnych pasaży.

190 041

Tabela 2
Wzrost i ekspresja komórek BRS-11 zawierających konstrukt ekspresyjny BRS-11	α-gal A pXAG-16,
Pasaż	Ekspresja (jednostki/106 komórek/24 godziny	Gęstość komórek/cm²)
13	2601	4,80 x 10⁴
14	1616	4,40 x 104
15	3595	4,40 x 104

Tabela 3

Wzrost i ekspresja komórek HF503-242 zawierających konstrukt ekspresyjny α-gal A pXAG-16.

HF503-242
Pasaż	Ekspresja (jednostki/^ komórek/24 godziny	Gęstość komórek/cm2)
5	4069	2,80 x 104
6	7585	3,55 x 104
7	5034	2,48 x 104

D. Kwantyfikacja ekspresji α-gal A

Aktywność α-gal A mierzono stosując rozpuszczalne w wodzie podłoże 4-metyloumbelliferylo-α-D-galaktopiranozyd (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) w modyfikacji protokołu opisanego przez Ioannou i in. (J. Cell Biol. 119:1137-1150, 1992). Podłoże rozpuszczono w buforze podłoża (0,1 M cytrynian-fosforan, pH 4,6) do stężenia 1,69 mg/ml (5 mM). Typowo, 10 pl supernatantu kultury dodano do 75 pl roztworu podłoża. Probówki przykryto i pozostawiono do inkubacji na łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 60 minut. Na koniec okresu inkubacji 2 ml buforu glicyna-węglan (130 mM glicyny, 83 mM węglanu sodu, przy pH 10,6), użyto do zatrzymania reakcji. Względną fluorescencję każdej próbki mierzono stosując fluorometr model TK0100 (Hoefer Scientific Instruments) o stałej długości fali pobudzającej 365 nm i wykrywaniu fali emisyjnej o stałej długości 460 nm. Odczyty próbek porównano ze wzorcami wytworzonymi z 1 pM roztworu podstawowego metyloumbelliferonu (Sigma Chemical Co.) i obliczono ilość zhydrolizowanego podłoża. Aktywność α-gal A wyraża się w jednostkach; jedna jednostka aktywności α-gal A jest równoważna jednemu nanomolowi podłoża hydrolizowanemu na godzinę w temperaturze 37°C. Dane ekspresji komórek wyrażano ogólnie jako jednostki aktywności α-gal A wydzielonej/10⁶ komórek/24 godziny. Tę próbę zastosowano także do pomiaru ilości aktywności α-gal w lizatach komórek i w próbkach z różnych etapów oczyszczania α-gal, jak omówiono poniżej.

Przykład II. Oczyszczanie α-gal A z kondycjonowanej pożywki trwale transfekowanych szczepów ludzkich komórek

Przykłady IIA-IIE pokazują, że α-gal A można oczyścić prawie do jednorodności z kondycjonowanej pożywki hodowanych szczepów ludzkich komórek trwale transfekowanych na wytwarzanie enzymu.

A. Zastosowanie chromatografii na Butyl Sepharose® jako pierwszego etapu w oczyszczaniu α-galA

Zimną kondycjonowaną pożywkę (1,34 l) klarowano przez odwirowanie i przesączono przez sączek z octanu celulozy 0,45 pm stosując wstępne filtry z włókna szklanego. Nie przerywając mieszania odczyn pH zimnej, przesączonej pożywki ustawiono na 5,6 dodając kroplami 1 N HCl, i dodano siarczan amonu do końcowego stężenia 0,66 M dodając kroplami roztwór podstawowy (temperatura pokojowa) 3,9 M bardzo czystego siarczanu amonu. Pożywkę mieszano przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 4°C, przesączono jak przedtem i podano na kolumnę Butyl Sepharose® 4 Fast Flow (objętość kolumny 81 ml, 2,5 x 16,5 cm;

190 041

Pharmacia, Uppsala, Szwecja) zrównoważoną w 10 mM MES-Tris, pH 5,6, zawierającą 0,66 M siarczan amonu (bufor A). Chromatografię przeprowadzono w temperaturze 4°C na Gradi-Frac™ System (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) wyposażonym we wbudowany czujnik UV (280 nm) i mierniki przewodności do oceny łącznego stężenia białka i soli, odpowiednio. Po podaniu próbki przy natężeniu przepływu 10 ml/min, kolumnę przemyto 10 objętościami kolumny bufora A. α-gal A eluowano z kolumny Butyl Sepharose® 14 objętościami kolumny liniowego gradientu od buforu A (zawierającego siarczan amonu) do 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (bez siarczanu amonu). Frakcje zbadano na aktywność α-gal A w próbie 4-MUF-gal, i te wykazujące znaczną aktywność enzymu połączono. Jak widać na fig. 6 i podsumowaniu oczyszczania (tabela 3), ten etap usuwa około 99% zanieczyszczającego białka (próbka przed kolumną =8,14 g łącznego białka; próbka po kolumnie =0,0638 g łącznego białka).

Tabela 4

Oczyszczanie α-gal A z kondycjonowanej pożywki trwale transfekowanych ludzkich fibroblastów

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	Aktywność α-gal A (x10⁶ jedn.)	Łączne białko (mg)	Aktywność właściwa (x106 jedn./mg)	Krotność oczyszczania (zbiorczo)	% odzyskania
Supernatant kultury	1340	14,6	8140	0,0018	=1	= 100
Butyl Sepharose	417	14,1	63,8	0,221	123	96,6
Heparin Sepharose	134	12,1	14,6	0,829	436	82,9
Hydroksyapatyt	47	9,73	4,46	2,18	1220	66,6
Q Sepharose	31,5	8,91	3,31	2,69	1503	61,0
Superdex® 200	10	8,58	2,93	2,92	1634	59,0

B. Zastosowanie chromatografii na Heparin Sepharose® jako etapu oczyszczania α-gal A Frakcje pików z kolumny z Butyl Sepharose® dializowano w temperaturze 4°C wobec (4 1) 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (raz wymieniane). Przewodność dializatu ustawiono na 1,0 mM HO w temperaturze 4°C przez dodanie H₂ O lub NaCl w zależności od potrzeby. Następnie próbkę nałożono na kolumnę z Heparin Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; objętość kolumny 29 ml, 2,5 x 6 cm) zrównoważoną wcześniej w 10 mM MES-Tris, pH 5,6, zawierającym 9 mM NaCl (bufor B). Przeprowadzono to w temperaturze 4°C przy natężeniu przepływu 10 ml/min. Wbudowany detektor UV (280 nm) i mierniki przewodności mierzyły stężenie łącznego białka i soli. Po podaniu próbki kolumnę przemyto 10 objętościami kolumny buforu B, następnie 3 objętościami kolumny liniowego gradientu do 8% buforu C/92% buforu B (gdzie bufor C oznacza 10 mM MES-Tris, pH 5,6, zawierający 250 mM NaCl) i 10 objętościami kolumny płukanki z 8% buforu C. Następnie eluowano α-gal A 1,5 objętościami kolumny liniowego gradientu do 29% buforu C i kolejnymi 10 objętościami kolumny liniowego gradientu do 35% buforu C. Frakcje sprawdzano na aktywność α-gal A, i te zawierające znaczną aktywność połączono.

C. Zastosowanie chromatografii na hydroksyapatycie jako etapu oczyszczania α-gal A Połączone próbki heparynowe przesączono i podano bezpośrednio na kolumnę z Ceramic Hydroxyapatite HC (40 pm; American International Chemical, Natick, MA; objętość kolumny 12 ml, 1,5 x 6,8 cm) zrównoważoną wcześniej w 1 mM fosforanie sodu, pH 6,0 (bufor D). Chromatografię przeprowadzono w temperaturze pokojowej na hybrydowym Gradi-Frac™/FPLC® System (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) wyposażonym we wbudowany detektor UV (280 nm) i mierniki przewodności. Po podaniu próbki (5 ml/minutę), kolumnę

190 041 przemyto 10 objętościami kolumny buforu D. α-gal A eluowano 7 objętościami kolumny liniowego gradientu do 42% buforu E/58% buforu D (gdzie bufor E oznacza 250 mM fosforan sodu, pH 6,0) następnie 10 objętościami kolumny gradientu do 52% buforu E. Frakcje badano na aktywność gal A i frakcje wykazujące znaczną aktywność połączono.

D. Zastosowanie anionowymiennej chromatografii na Q Sepharose® jako etapu oczyszczania α-gal A

Połączone próbki hydroksyapatytowe rozcieńczono około 1,5-krotnie H₂O do końcowej przewodności 3,4-3,6 mMHO w temperaturze pokojowej. Po przesączeniu próbkę podano na kolumnę z Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; objętość kolumny 5,1 ml, 1,5 x 2,9 cm) równoważonej w 10% buforu G/90% buforu F, gdzie bufor F oznacza 25 M fosforan sodu, pH 6,0, i bufor G oznacza 25 mM fosforan sodu, pH 6,0, 250 mM NaCl. Chromatografię przeprowadzono w temperaturze pokojowej na układzie hybrydowym Gradi-Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja), i łączne stężenia białka i soli obserwowano na wbudowanych miernikach. Próbkę podano przy natężeniu przepływu 5 ml/min, następnie przeprowadzono następujące etapy: (i) przemycie 5 objętościami kolumny przy 10% buforu G, (2) przemycie 7 objętościami kolumny przy 12% buforu G, ((3) przemycie 3 objętościami kolumny liniowego gradientu do 50% buforu G, (4) przemycie 10 objętościami kolumny liniowego gradientu do 53% buforu G, (5) przemycie 3 objętościami kolumny gradientu do 100% buforu G, oraz (6) przemycie 10 objętościami kolumny przy 100% buforu G. α-gal A eluowano głównie podczas etapów 3 i 4. Frakcje wykazujące znaczną aktywność połączono („pula Q”).

E. Zastosowanie chromatografii żelowo-filtracyjnej na Superdex®-200 jako etapu oczyszczania α-gal A

Pule Q zatężono około 5-krotnie stosując jednostki zatężacza odśrodkowego Centriprep®-10 (Amicon, Beverly, MA) i podano na kolumnę Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; objętość kolumny 189 ml, 1,6 x 94 cm). Kolumnę zrównoważono i eluowano 25 mM fosforanem sodu, pH 6,0, zawierającym 150 mM NaCl. Chromatografię przeprowadzono na układzie FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w temperaturze pokojowej stosując wbudowany detektor UV (280 nm) śledzący elucję białka. Objętość próbki nałożonej na kolumnę wynosiła <2 ml, natężenie przepływu wynosiło 0,5 ml/min, a rozmiar frakcji wynosił 2 ml. Przeprowadzono wielokrotne przebiegi na kolumnach; frakcje badano na aktywność α-gal A i frakcje wykazujące znaczną aktywność połączono.

Zebrane frakcje z kolumny Superdex® 200 zatężono stosując jednostki Centriprep-10, rozdzielono na porcje, szybko zamrożono i trzymano w temperaturze -80°C przez krótkie okresy. Podsumowanie tego przykładu oczyszczania α-gal A pokazano w tabeli 3. Końcowa wydajność α-gal A wynosiła 59% aktywności substratu, a aktywność właściwa oczyszczonego produktu wynosiła 2,92 x 10⁶ jednostek/mg białka. Powstały produkt wykazywał wysoki poziom czystości po elektroforezie w warunkach redukujących na 4-15% SDS-żel poliakryloamidowy, następnie zabarwionym srebrem.

Przykład III. Komponowanie i przechowywanie oczyszczonej α-gal A

Wysoce oczyszczona α-gal A nie jest trwała przez dłuższe okresy przy przechowywaniu jako rozcieńczony roztwór oczyszczonego białka (<1 mg białka/ml). Tak więc zaprojektowano kompozycję polepszającą trwałość podczas dłuższego przechowywania, to jest przechowywania trwającego kilka tygodni do co najmniej kilku miesięcy. Oczyszczony enzym zatężono do co najmniej 1 mg/ml stosując wirówkowy zatężacz (w buforze enzymatycznym złożonym z 25 mM fosforanu sodu (pH 6,0) i 150 mM NaCl). Albuminę ludzkiej surowicy (HSA; Buminate®, Baxter-Hyland) dodano do końcowego stężenia 2,5 mg/ml. Roztwór białka przesączono następnie sterylnie stosując sączek z octanu celulozy 0,2 pm (Schleicher i Schuell) przymocowany do strzykawki. Roztwór α-gal A rozmieszczono w sterylnych, apirogennych szklanych fiolkach, zamknięto korkami z Teflonu, szybko zamrożono i przechowywano w temperaturze -20°C.

Stabilność aktywności α-gal A oceniono w okresie trzech miesięcy stosując próbę 4-MUF-gal. Dane przedstawione w tabeli 5 wykazują, że nie było utraty aktywności enzymu w okresie testu. Kwaśne pH preparatu (< 6,5) jest krytyczne dla trwałości wysoce oczyszczonego enzymu.

190 041

Tabela 5

Trwałość preparatu α-gal A w temperaturze -20°C

Próbka	Aktywność właściwa (jednostek/mg łącznego białka)
czas 0	2,24 x 10⁶ +/- 0,33 x 10⁶
tydzień 1	2,40 x 106+/- 0,25 x 106
tydzień 2	2,42 x 106 +/- 0,21 x 106
tydzień 3	2,37 x 106+/- 0,05 x 106
miesiąc 1	2,39 x 106+/- 0,16 x 106
miesiąc 2	2,31 x 10⁶ +/- 0,26 x 106
miesiąc 3	2,29 x 10⁶+/- 0,17 x 10⁶

Przykład IV. Przydatność α-gal A wytworzonej przez szczepy ludzkich komórek do leczenia niedoboru α-gal A

Strukturalne i funkcjonalne właściwości oczyszczonej ludzkiej α-gal A wytworzonej według wynalazku zbadano w celu wykazania, że cząsteczki DNA opisane tutaj i odpowiednie ekspresyjne gliekprkteiny wytwarzane przez transfekowane szczepy ludzkich komórek można stosować w terapii substytucyjnej genu lub enzymu, odpowiednio.

A. Rozmiar α-gal A wytwarzanego przez trwale transfekowane ludzkie komórki w kulturze

Masę cząsteczkową α-gal A oceniono metodą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Te wyniki pokazują, że masa cząsteczkowa dimeru wynosi 102353 Da, podczas gdy masa monomeru wynosi 51002 Da. Spodziewana masa cząsteczkowa monomeru, oparta na składzie uminoewajowym, wynosi 45400 Da. Tak więc można wnioskować, że zawartość węglowodanu w enzymie odpowiada za 5600 Da masy cząsteczkowej.

Wyniki standardowej analizy amireewujowej przeprowadzonej na oczyszczonym białku są spójne z wnioskiem, że białko wytwarzane przez transfekowane ludzkie komórki jest identyczne z białkiem oczyszczonym z ludzkich tkanek na poziomie aminokwasowym.

B. Przetwarzanie N-terminalne α-gal wytwarzanego przez trwale transfekowane ludzkie komórki

Sekwencja nuk^^dowa cDNA ludzkiego α-gal A koduje 429 aminokwasów. 31 N-terminalnych aminokwasów stanowi peptydową sekwencję sygnałową, którą odcina się, gdy powstające białko przekracza błonę siateczki jródaytoplazmatycznej (LeDonne i in., Arch. Biochem. Biophys. 224:186, 1983; Lemansky i in., J. Biol. Chem. 262:2062, 1987). W celu potwierdzenia, że α-gal A jest poprawnie przetwarzana przy związaniu z sekwencją heterologicznego peptydu sygnałowego (np., sekwencją sygnałową ludzkiego hormonu wzrostu) i ulega ekspresji w transfekowanych ludzkich fibroblastach, 10 N-terminalnych aminokwasów pojekrecyjnego białka mlkrojekwenajonewuno. Próbki poddano elektroforezie metodą SDS-PAGE i przeniesiono na ProBlott® (ABI, Foster City, CA) stosując system buforowy 10 mM CAPS (pH 11,0), 10% metanolu. Białko na ProBlott® uwidoczniono przez zabarwienie barwnikiem Ckomassie i odcięto odpowiednich rozmiarów (50 kDa) pasmo. N-terminalną sekwencję otrzymano stosując pulsacyjny sekwencer aminokwasów w fazie ciekłej Applied Biosystems wykonujący automatyczną degradację Edmana. N-terminalna sekwencja otrzymana, LDNGLARTPT (SEKW. NR ID.:28), jest spójna z właściwym odcinaniem peptydu sygnałowego i pasuje do N-terminalnej sekwencji przewidzianej dla białka po jekreaji.

C. C-terminalny aminokwas α-gal A wytwarzanego przez trwale transfekowane ludzkie komórki

C-terminalną resztą aminokwasową pejekrecyjnegk α-gal A wytworzonego według wynalazku zidentyfikowano stosując zautomatyzowany sekwencer C-terminalny Hewlett Packard. Wyniki wskazały na resztę leucyny na końcu C, co zgadza się z C-terminalnym aminokwasem przewidzianym przez sekwencję DNA.

190 041

D. Modyfikacja węgaowodorowa r^-^d wytwaryanego praez trwałe transfekowEme ludzkie komórki

Określana też wzór glikozylowania α-gal A wytwarzanego według wynalazku. Właściwe glikozydzie jest ważne dla optymalnej aktywności in vivo α-gal A; α-gal A z ekspresji w nieglikazylujących układach jest nieaktywna lub nietrwała (Hantzopolous i in., Gene 57:159, 1987). Glikozylowanie jest także ważne dla internalizacji α-gal A do żądanych komórek docelowych i wpływa na czas póhrwania obiegu enzymu in vivo. Na każdej podjsdnostce α-gal A występują cztery miejsca dostępne do addycji związanych z asparaginą łańcuchów węglowodanowych, z których tylko trzy są zajęte (Desnick i in., w The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, str. 2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995).

Próbkę α-gal A wytwarzanej przez trwale transa-kowan- komórki potraktowano neuraminidazą, którą wydziela się z A. ukaaacisns (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) dla usunięcia kwasu sialowago. Tę reakcję przeprowadzono przez potraktowanie 5 pg α-gal A przez noc 10 mU neuraminiCazy w temperaturze pakojawaj w łącznej objętości 10 pl solanki buforowanej octanem (ABS, 20 mM octanu sodu, pH 5,2, 150 mM NaCl).

Oczyszczoną α-gal A wytwarzaną przez trwale etansfekawane komórki defosfotylowano także stosując zasadową fosfatazę (jelitowa cielęca zasadowa fosfataza, BoshringsrMannheim, Indianapolis, IN), traktując 5 pg α-gal A przez noc w temperaturze pakojowsj 15 U zasaCawsj fosfatazy w ABS (pH podwyższone do 7,5 1 M Tris).

Próbki zanalizowano metodą hybrydyzacji Western ze specyficznym wobec α-gal A przeciwciałem. Przeciwciałem użytym było królicze paliklanalne anty-paptydowa przeciwciało, które wytworzono stosując peptyd reprezentujący aminokwasy 68-81 α-gal A jako immuzagen. Po przeniesieniu białka na PVDF (Millipore, Bedford, MA), membranę sondowano rozcieńcoszism 1:2000 antysurowicy w 2,5% blotto (odtłuszczone mleko w proszku w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,05% Tween-20). Następnie wykrywano przy pomocy koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanu (Organon Taknika/Cappel, Durham, NC; toocieńcosnis 1:5000) i reagentów z zestawu do chsmiluminescencji ECL (Amersham, Atlingtaz Heights, IN).

Traktowanie α-gal A neuraminidazą daje niewielkie przesunięcie w masie cząsteczkowej (okała 1500-2000 Da lub 4-6 kwasy sialows/monomer), sugerując, że następuje daleka modyfikacja α-gal A kwasem sialowym. Dla porównania, postać osoczowa α-gal A ma

5-6 reszt kwasu sialowego na monomer, a forma łożyskowa ma 0,5-1,0 reszt kwasu sialowago na monamst (Bishop i in., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981).

Innym sposobem użytym do badania modyfikacji kwasem sialowym i fosforanem mannozyd α-gal A było ogniskowanie izoslektfyczns (IEF), gdzie próbki oddziela się na bazie ich punktu izaslsketycznsga (pI) lub wypaCkawsgo ładunku. Tak więc usunięcie naładowanej reszty takiej jak kwas sialowy lub fosforan z α-gal A może zmienić mobilność białka w systemie IEF.

Dla Cakazania eksperymentu IEF, próbki α-gal A wytworzonego według wynalazku potraktowano nsutaminidazą i zasadową fosfatazą, zmieszano 1:1 z buforem do próbek 2x Novsx (z 8 M mocznika, pH 3,0-7,0), i załadowano na żel IEF z 6 M mocznika (5,5% poliakryloamid) wytworzony z użyciem Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Szwecja; pH 3,0-6,5; Pharnalyte® 4-6,5 i 2,5-5,5, 0,25 ml każdego na żel). Wprowadzono także wzatce punktu izaslskerycznego (Bio-Rad). Po elektroforezie żel przeniesiono na PVDF i przsprawadzazo analizę Western jak opisano powyżej.

α-gal A wytwarzana przez trwale transf-kowan- ludzkie fibroblasty składała się z trzech głównych ioaaatm z zakresem pI około 4,4-4,65. Te wartości są podobne do pI form osoczowych i ślsCziazawych α-gal A (Bishop i in., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981). Traktowanie enzymu z-utaminidazą zwiększyło pI wszystkich trzech izofofm, wskazując, że wszystkie były zmodyfikowane do pewnego stopnia przez kwas sialowy. Te dane sugerują, żs α-gal A wytwarzana przsz trwale transaskawana ludzki- komórki powinna miać pożądany czas półtrwania w osoczu, wskazując, że ta substancja dobrze nadaj- się do użytku farmakologicznego. Ponadto, traktowanie potraktowanej n-ukaminiCazą α-gal A alkaliczną fosfatazą dodatkowo podwyższyło pI części białka do akała 5,0-5,1, wskazując, że enzym niesie jadną lub kilka

190 041 reszt fosforanu mannozy-6. Ta modyfikacja jest znacząca ponieważ jest konieczna do fosforanu mannozy-6 skutecznej internalizacji α-gal A przez docelową komórkę.

E. Aktywność właściwa α-gal A oczyszczonej z trwale transfekowanych fibroblastów.

Moc lub właściwą aktywność oczyszczonej α-gal A oblicza się mierząc katalityczną aktywność enzymu (próbą d-MUF-gal), i stężenie białka. Stężenie białka można określić dowolnym standardowym sposobem, takim jak w układzie BCA (Pierce), lub mierząc absorbancję przy 280 nm i stosując współczynnik ekstynkcji 2,3 mg/ml (określony z analizy aminokwasów) dla obliczenia wartości. Stosując te techniki określa się aktywność właściwą α-gal A oczyszczonego z kondycjonowanej pożywki transfekowanych ludzkich fibroblastów na 2,2-2,9 x 10¹⁵ jednostek/mg białka, co jest porównywalne z aktywnością właściwą α-gal A oczyszczonej z ludzkich tkanek (Bishop i in., J. Biol. Chem. 256:1301, 1981).

F. Internalizacja mediowana mannozą lub fosforanem mannozy-6 α-gal A

Aby α-gal A wytwarzana przez trwale transfekowane komórki była skutecznym leczniczo środkiem na niedobory α-gal A, enzym musi być internalizowany przez dotknięte komórki, α-gal A nie jest aktywna na fizjologicznych poziomach pH, i nie będzie raczej skuteczna we krwi lub płynach śródmiąższowych. Metabolizuje zakumulowane lipidowe substraty optymalnie tylko gdy jest internalizowana w kwasowym środowisku lizosomu. Ta internalizacja jest mediowana przez wiązanie α-gal A do receptorów fosforanu mannozy-6 (M6P), które ulegają ekspresji na powierzchni komórki i dostarczają enzym do lizosomu poprzez drogę endocytotyczną. Receptor M6P ulega ekspresji powszechnie; większość somatycznych komórek daje jego ekspresję w pewnym stopniu. Receptor mannozy, który jest specyficzny dla odsłoniętej reszty mannozy na glikoproteinach, jest mniej pospolity. Te ostatnie receptory ogólnie znajduje się tylko na makrofagach i podobnych do makrofagów komórkach i stanowią one dodatkowy sposób wejścia α-gal A do tych typów komórek.

W celu wykazania mediowanej M6P internalizacji α-gal A, fibroblasty skóry z cierpiącego na chorobę Fabry pacjenta (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) hodowano przez noc w obecności rosnących stężeń oczyszczonego α-gal A według wynalazku. Pewne próbki zawierały 5 mM rozpuszczalnego M6P, który współzawodniczące inhibituje wiązanie, i w ten sposób, internalizację, poprzez receptor fosforanu mannozy-6. Inne próbki zawierały 30 pg/ml mannanu, który inhibituje wiązanie, i w ten sposób, internalizację, poprzez receptor mannozy. Po inkubacji komórki przemyto i zebrano przez zdrapanie do buforu lizy (10 mM Tris, pH 7,2, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM Pefabloc™ (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) i 1% NP-40). Lizowane próbki badano następnie na stężenie białka i aktywność α-gal A. Wyniki wyrażono jako jednostki aktywności α-gal A/mg białka komórki. Komórki Fabry internalizowały α-gal A w sposób zależny od dawki (fig. 7). Tę internalizację hamował fosforan mannozy-6, lecz nie występowała inhibicja mannanem. Tak więc internalizacja α-gal A w fibroblastach Fabry jest mediowana receptorem fosforanu mannozy-6, lecz nie receptorem mannozy.

α-gal A ulega także internalizacji in vitro do komórek śródblonka, ważnych docelowych komórek przy leczeniu choroby Fabry. Ludzkie komórki śródblonka żyły pępkowej (HUWEC) hodowano przez noc z 7500 jednostkami α-gal A; pewne z dołków zawierały M6P. Po okresie inkubacji komórki zebrano i zbadano na α-gal A jak opisano powyżej. Komórki inkubowane tylko z α-gal A miały poziomy enzymu prawie 10-krotne powyżej poziomu w komórkach kontrolnych (bez inkubacji z α-gal A) . M6P inhibitował wewnątrzcząsteczkową akumulację α-gal A, sugerując, że internalizacja α-gal A przez HUVEC jest mediowana receptorem M6P. Tak więc ludzki α-gal A według wynalazku jest internalizowany przez klinicznie stosowne komórki.

Niewiele hodowanych ludzkich linii komórek daje ekspresję receptora mannozy. Jednakże linia mysich makrofagopodobnych komórek (J774.E), która niesie receptory mannozy, lecz niewiele, jeśli w ogóle, receptorów fosforanu mannozy-6, można stosować do określenia, czy oczyszczona α-gal A według wynalazku jest internalizowana poprzez receptor mannozy (Diment i in., J. Leukocyte Biol. 42:485-490, 1987). Komórki J774.E hodowano przez noc w obecności 10000 jednostek/ml α-gal A. Wybrane próbki zawierały także 2 mM M6P, i inne zawierały 100 pg/ml mannanu. Komórki przemyto i zebrano jak opisano powyżej, i określano ilość łącznego białka i aktywność α-gal A każdej próbki. Wyniki pokazano w tabeli 5.

190 041

M6P nie hamuje poboru α-gal A przez te komórki, podczas gdy mannan obniża poziomy zakumulowanej α-gal A o 75%. Tak więc α-gal A według wynalazku może być internalizowana przez receptor mannozy w typach komórek, które dają ekspresję tego konkretnego receptora na powierzchni komórki.

Tabela 6

Internalizacja α-gal A przez komórki J774.E. Aktywność α-gal A (jednostek/mg łącznego białka)

	Bez dodatków	+ α-gal A	+ α-gal A + M6P	+β-gal A + mannan
J774.E	409±25	6444±554	6297±674	16541323

[mannan] = 100 pg/ml [M6P] = 2 mM lub 660 pg/ml

Te eksperymenty wykazują, że α-gal A wytwarzana przez trwale transfekowane ludzkie komórki może być internalizowana przez komórki poprzez receptor mannozy lub fosforanu mannozy-6.

G. Korekcja fibroblastów Fabry przez ludzkie fibroblasty dające ekspresję α-gal A

Dla celów terapii genowej implant naturalnych komórek wytwarzających α-gal A musi wytwarzać enzym w postaci zmodyfikowanej odpowiednio dla „korygowania” niedoboru α-gal A w docelowych komórkach. Dla oceny wpływu wytwarzania α-gal A przez transfekowane ludzkie fibroblasty na komórki Fabry, fibroblasty zebrane od pacjentów z chorobą Fabry (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) hodowano wspólnie z wytwarzającym αgal A szczepem komórek (BRS-11) w Transwells® (Costar, Cambridge, mA). Schemat eksperymentu zilustrowano na fig. 8. Komórki Fabry hodowano w 12-dołkowych szalkach na kultury tkankowe, z których pewne zawierały inserty (T^^an^s^^el^s®, rozmiar porów 0,4 pm) o powierzchni, na której można hodować komórki. Matryca wzrostowa insertu jest porowata i pozwala makrocząsteczkom przejść z górnego do dolnego środowiska. Jeden zestaw insertów zawierał normalne ludzkie fibroblasty napletka (HF), które dają sekrecję minimalnych ilości α-gal A, podczas gdy inny zestaw zawierał trwale transfekowany ludzki szczep fibroblastów, BRS-11, który daje sekrecję wielkich ilości α-gal A. W dołkach współdzielonych z komórkami produkującymi α-gal A, α-gal A może wejść w pożywkę omywającą komórki Fabry i potencjalnie być intemalizowanąprzez komórki Fabry.

Dane w tabeli 7 pokazują, że komórki Fabry internalizowały wydzielony α-gal A. Wewnątrzcząsteczkowe poziomy α-gal A obserwowano przez trzy dni. Te komórki hodowane same (bez insertu) lub w obecności nietransfekowanych fibroblastów napletka (insert HF) wykazywały bardzo niskie wewnątrzcząsteczkowe poziomy aktywności α-gal A. Jednakże komórki Fabry hodowane z komórkami wytwarzającymi α-gal A (insert BRS-11) wykazywały poziomy enzymu podobne do poziomów normalnych komórek na koniec dnia 2 (normalne fibroblasty mają 25-80 jednostek białka α-gal A/mg). Fakt, że korekcję można przypisać α-gal A rozpuszczonemu poprzez receptor M6P, wykazuje się poprzez jego inhibicję fosforanem mannozy-6 (insert BRS-11 + M6P).

Tabela 7

Korekcja fibroblastów Fabry przez ludzkie fibroblasty z ekspresją α-gal A Aktywność α-gal A (jednostek/mg łącznego białka)

Czas	bez insertu	insert HF	insert BRS-11	insert BRS-11 +M6P
Dzień 1	2 ± 1	2 ± 1	13 ± 1	4 ± 1
Dzień 2	2 ± 1	2 ± 1	40 ± 11	6 ± 2
Dzień 3	2 ± 1	5 ± 1	85 ± 1	9 ± 1

190 041

H. Przydatność innych typów komórek

Można stosować inne typy komórek w sposobie opisanym tutaj. Komórki można otrzymać z wielu różnych tkanek i obejmują one wszystkie typy komórek, które można utrzymać w kulturze. Np., pierwotne i wtórne komórki, które można transfekować niniejszym sposobem, obejmują ludzkie fibroblasty, keratynocyty, komórki nabłonka (np. komórki nabłonka sutka lub jelit), komórki śródbłonka, komórki glejowe, komórki nerwowe, uformowane elementy krwi (np., limfocyty i komórki szpiku kości), komórki mięśni oraz prekursory tych somatycznych typów komórek. Fibroblasty są szczególnie interesujące. Pierwotne komórki korzystnie otrzymuje się z osobników, którym ma się podawać transfekowane pierwotne lub wtórne komórki, aby nie były odrzucane przez układ opornościowy pacjenta. Jednakże jeśli zwróci się dostateczną uwagę na unikanie lub supresję odrzucania immunologicznego (jak opisano poniżej), można stosować równie dobrze komórki ludzkiego donora innego niż pacjent. Pozwoli to na stosowanie komórek z normalizowanej, utrwalonej, trwale transfekowanej linii komórkowej u wszystkich pacjentów.

I. Podawanie komórek z ekspresją α-gal A

Komórki opisane powyżej można podawać osobnikowi różnymi znormalizowanymi drogami podawania, stąd będą one umieszczane w, np., kapsułce nerkowej, podskórnej przestrzeni, centralnym układzie nerwowym, przestrzeni dooponowej, wątrobie, jamie śródotrzewnowej, lub w mięśniu. Komórki mogą także być wstrzykiwane dożylnie lub dotętniczo, tak że krążą w strumieniu krwi osobnika. Po implantowąniu osobnikowi, transfekowane komórki będą wytwarzały i wydzielały leczniczy produkt, glikozylowaną ludzką α-gal A.

Liczba genetycznie modyfikowanych komórek, które będą wprowadzane do osobnika, będzie się wahać, lecz może ją określić specjalista. Wiek, masa, płeć i ogólny stan fizyczny każdego pacjenta, jak też objętość podawana, czas półtrwania i biodostępność enzymu, oraz produktywność in vivo genetycznie modyfikowanych komórek, będą pierwotnymi czynnikami rozważanymi przy określaniu dawki i drogi podawania. Typowo będzie się stosować pomiędzy jednym milionem i jednym miliardem komórek, przy poziomach ekspresji 100-100000 jednostek na 10⁶ komórek dziennie. Jeśli to konieczne, procedurę można powtórzyć lub modyfikować do żądanego wyniku, np., złagodzenia objawów związanych z chorobą Fabry.

Jak opisano powyżej, komórki użyte będą ogólnie specyficzne dla pacjenta, to jest, będą otrzymywane z osobnika, któremu będzie się podawać transfekowane pierwotne lub wtórne komórki, aby nie były odrzucane przez układ odpornościowy pacjenta. Jeśli jednakże ten scenariusz nie jest możliwy lub pożądany, komórki można otrzymać od innego osobnika, genetycznie modyfikować jak opisano tutaj i implantować pacjentowi, który cierpi na niedobór α-gal A.

Zastosowanie komórek z osobnika innego niż biorca może wymagać podawania immunosupresantu, zmiany antygenów zgodności tkankowej lub zastosowania urządzenia barierowego zapobiegającego odrzucaniu implantowanych komórek. Urządzenie barierowe będzie wykonane z substancji (np., membrany takiej jak XM-50 z Amicon, Beverly, MA) pozwalającej na przejście wydalonego produktu do krążenia lub tkanek biorcy, lecz zapobiegającej kontaktowi pomiędzy implantowanymi komórkami i układem odpornościowym biorcy, i w ten sposób zapobiegającej reakcji immunologicznej (i ewentualnemu odrzuceniu) komórek przez biorcę. Dalsze wskazówki odnośnie terapii genowej można znaleźć u Seldena i in. (publikacja WO 93/09222).

Komórki mogą być alternatywnie wprowadzone w matrycę lub substancję żelową, taką jak opisana w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/548/002 należącym do zgłaszających, które opisuje zastosowanie hybrydowe matrycowe implanty, lub u Jaina i in. (zgłoszenie PCT WO 95/19430), opisujące makrokapsułkowanie komórek wydzielających w hydrofilowej substancji żelowej (każde dołączane jako odnośnik).

J. Farmaceutyczna kompozycja do konwencjonalnego podawania białka α-gal A

Białko α-gal A ulegające ekspresji i sekrecji w trwale transfekowanych (lub inaczej genetycznie modyfikowanych) ludzkich komórkach i oczyszczone jak opisano tutaj można podawać osobnikom wytwarzającym za mało lub uszkodzone białko α-gal A. Białko można podawać w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy pH poniżej 6,5, np. w preparacie opisanym w przykładzie III. Przykłady zarobek, które można wprowadzić do preparatu, to bufory

190 041 takie jak bufor cytrynia^owy, bufor fosforanowy, bufor kctacewy i bufor wodorowęglanowy, aminokwasy, mocznik, alkohole, kwas askorbinowy, fosfolipidy, białka, takie jak albumina surowicy i żelatyna, EDTA, chlorek sodu, liposomy, peliwϊnylopirklidkn, mannitol, sorbitol, gliceryna, glikol propylenowy i poli(glikol etylenowy) (np., PEG-4000, PEG-6000). Droga podawania może być, np., dożylna, dotętnicza, podskórna, dootrzewnowa, domózgowa, domięśniowa, dopłucna lub prześluzówkowa. Drogę podawania i ilość podawanego białka będzie się określało czynnikami, mieszczącymi się w zakresie oceny specjalistów. Ponadto, specjalista wie, że drogę podawania i dawkowanie białka leczniczego można zmieniać dla danego pacjenta do uzyskania leczniczego poziomu dawki. Typowo, będzie się podawać dawki α-gal A 0,01-100 mg/kg masy ciała. Można się spodziewać, że regularnie powtarzane dawki białka będą konieczne przez całe życie pacjenta

K. Leczenie innych stanów powodowanych przez niedobory enzymów

Możliwe jest, że inne stany powodowane przez niedobory enzymów przechowywanych w lizosomuah innych niż α-gal A będą się poddawały leczeniu sposobami porównywalnymi z epijanymi tutaj. W tych przypadkach DNA kodujące funkcjonalną postać brakującego enzymu będzie podstawiane za DNA kodujący α-gal A w ekspresyjnych ujawnionych tutaj. Przykłady zidentyfikowanych objawów niedoboru enzymów, które mogą poddawać się leczeniu jak opisano tutaj, pokazano w tabeli 8. Informacja w tej tabeli pochodzi z pracy E. Neufelda (Ann. Rev. Biochem. 60:257-280, 1991), dołączanej niniejszym jako odnośnik.

Tabela 8

Podsumowanie zaburzeń przechowywania lizoskmulcegk

Zaburzenie	Pierwotny niedobór [wtórny niedobór]
1	2
Zaburzenia degradacji jficgklipidów Choroba Fabry	α-galaetkzydazu
Choroba Farbera	aerumidazu
Choroba Gauchera	glukoaerebrkzyduza
Gacglikzydoza Gmi	β-gulaetkzydazu
Gucglikzydozy G m2	β-hekjkzuminiduzu, pkdZednkjteu α
Choroba Tay-Sachsa	[hekjkzuminidazu A]
Choroba Sacdhkffa	β-hekjkzuminiduzu, pkdZednojteu β
Niedobór aktywatora	[hekjozumiciduzy A i B] Aktywator G M2
Choroba Krabbego	guluktozylkaeram idaza
Metaahromatyazca leukkdyjtrkfiu Forma z niedoborem enzymu	urylkjulfutazu A
Forma z niedoborem aktywatora	aktywator julfutydu/jupkjynu
Mukolipidoza IV	pierwotny defekt nieznany [sialidaza gucglikzydkwu]
Wielokrotny niedobór julfutuzy	pierwotny defekt nieznany [niedobór wszystkich suR-Iuz]
Choroba Niemaccu-Piaku	jficgkmielicuzu

190 041 cd. tabeli 8

1	2
Choroba Schindlera	α-N-acetylogalaktozam inidaza
Zaburzenia degradacji glikoproteiny Aspartyloglikozaminuria	aspartyloglikozaminidaza
Fukozydoza	α-L-fukozydaza
Galaktosialidoza	ochronne białko/katepsyna [ β-galaktozydaza i sialidaza]
α-Mannozydoza	α-mannozydaza
β-Mannozydoza	β-mannozydaza
Sialidoza	sialidaza
Zaburzenia degradacji glikozaminoglikanu
Zespół Huntera	sulfataza iduronianu
Zespoły Hurlera i Scheie	α-L-iduronidaza
Zespół Maroteaux-Lamy Zespół Morquio	GalNAc 4-sulfataza/arylosuifataza
podtyp A	6-sulfataza Gal
podtyp B Zespół Sanfilippo	β-galaktozydaza
podtyp A	N-sulfataza heparanu
podtyp B	α-N-acetyloglukozaminidaza
podtyp C	acetyloCoA: N-acetylo-transferaza glukozaminy
podtyp D	6-sulfataza GlcNAc
Zespół Sly Inne zaburzenia niedoboru pojedynczego enzymu	p-glukuronidaza
Choroba Pompe (glikogenoza II)	α-glukozydaza
Choroba Wolmana	kwasowa lipaza
Zaburzenia biosyntezy lizosomalnego enzymu
Choroba komórki I i polidystrofia pseudoHurlera	transferaza 6-fosfo-N-acetyloglukozaminy [zła lokalizacja wielu lizosomalnych enzymów]
Zaburzenia transportu przez lizosomalną membranę
Cystynoza	transport cystyny
Przechowywanie kwasu sialowego i choroba Salla	transport kwasu sialowego

V. Inne odmiany

Wynalazek opisany tutaj zilustrowano częściowo sposobami leczenia wykorzystującymi komórki, które dają ekspresję konkretnego produktu genowego po tr^^^jfekcji, to jest, po wprowadzeniu konstruktu kodującego produkt genowy i mającego elementy regulacyjne kontrolujące ekspresję sekwencji kodującej. Te sposoby można także realizować stosując komórki, które zostały genetycznie zmodyfikowane innymi procedurami, w tym nakierowania genu i aktywacji genu (patrz Treco i in. publikacja WO 95/31560, dołączana niniejszym jako odnośnik; patrz także Selden i in. publikacja WO 93/09222).

190 041

Peptyd sygnałowy hGH można stosować z heterologicznymi białkami innymi niż α-gal A, dla zwiększenia poziomu ekspresji i sekrecji heterologicznego białka. Przykłady takich białek obejmują α-1 antytrypsynę, antytrombinę III, apolipoproteinę E, apolipoproteinę A-1, czynniki krzepnięcia krwi V, ViI, VIII, IX, X, i XIII, czynnik 2 wzrostu kości, czynnik 7 wzrostu kości, kalcytoninę, katalityczne przeciwciała, DNAzę, erytropoetynę, FSH-β, globiny, glukagon, glukocerebrozydazę, G-CSF, GM-CSF, hormon wzrostu, modyfikatory odpowiedzi immunologicznej, immunoglobuliny, insulinę, insulinotropinę, insulinopodobne czynniki wzrostu, interferon-β, czynnik wzrostu nerwów interferonu-β, interleukinę-1, interleukinę-2, interleukinę-3, interleukinę-4, interlcukinę-6, interleukinę-11, interleukinę-12, receptor IL-2, antagonistów receptora IL-1, receptor małej gęstości lipoproteiny, M-CSF, hormon przyterczyc, kinaza białkowa C, rozpuszczalny CD4, dyzmutaza ponadtlenków, aktywator plazminogenu tkanki, TGF-R, czynnik martwicy nowotworów, TSHβ, hydroksylaza tyrozyny i urokinaza.

Inne odmiany mieszczą się w poniższych zastrzeżeniach.

190 041

LISTING SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Transkaryotic Therapies, Inc.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: TERAPIA NIEDOBORU α-GALAKTOZYDAZY

A (iii) LICZBA SEKWENCJI: 28 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Fish & Richardson, P.C.

(B) ULICA: 225 Franklin Street (C) MIASTO: Boston (D) STAN: MA (E) KRAJ: USA (F) KOD: 02110-2804 (v) POSTAĆ KOMPUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0, wersja #1.30 (vi) DANE NINIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE POPRZEDNICH ZGŁOSZEŃ:

CA) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/712614 (B) DATA ZŁOŻENIA: 13-WRZ-1996 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/AGENCIE (A) NAZWISKO: Fraser, Janis K.

(B) NUMER REJESTRU: 34819 (C) NUMER SPRAWY: 07236/003W01

190 041 (ix) IJFOEUAACJA TELEKMMUNIKACYJNA:

(A)	TLLLFOJ	: 617/542-5070
(B)	TLLLFAX	: 617/542-8906
(C)	TLLLX:	200154

(2) INFORMACJA DLA SLKW. JR (i) CHARAKTLRCSTCKA SLKWLJCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TCP: kwas nukleinowy (C) JIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. JR ID.:1:

CTGGGCTGTA GCTATGATAA AC 22 (2) INFORMACJA DLA SLKW. JR ID.:2:

(i) CHARAKTLRCSTCKA SLKWLJCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TCP: kwas nukleinowy (C) JIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. JR ID.:2:

TCTAGCTGAA GCAAAACAGT G 21 (2) INFOORMACCA DILA SEKW. NR ID.: 3:

(i) CHARAKTLRCSTCKA SLKWLJCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TCP: kwas nukleinowy (C) JIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. JR ID.:3:

ATTGGTCCGC CCCTGAGGT 19 (2) INFOFRUACCA DLA SEKW. JR ID.:4:

(i) CHARAKTLRCSTCKA SLKWLJCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad

190 041 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:4:

TGATGCAGGA ATCTGGCTCT ²⁰ (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:5:

TTTTGGATCC ACCATGGCTA ²⁰ (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:6:

TTTTGCCGGC ACTGCCCTCT TGAA ² 4 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:7:

TTTTCAGCTG GACAATGGAT TGGC 24 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

190 041 (A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:8:

TTTTGCTAGC TGGCGAATCC 20 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:9:

TTTTGGATCC GTGTCCCATA GTGTTTCCAA 30 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:10:

TTTTGGATCC GCAGTCGTGG CCAGTACC 28 (2) 'INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:11:

CTAGTCCTAG GA 12 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:12:

190 041 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:12:

TTTTGAGCAC AGAGCCTCGC CT 22 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:13:

TTTTGGATCC GGTGAGCTGC GACGAATAGGC 30 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 76 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:14:

GGGCCCCCAG CCCCAGCCCT CCCCATTGGTG GAGGCCCTTT TGGAGGCACC CTAOGGCCAG 60

GAAACTTTTG CCGTAT 76 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ti) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:15:

190 041

AAATAGGGCA GATCCGGGCT TTATTATTTT AGCACCACGG CCGCCGAGAC CGCGTCCGCC 60

CCGCGAGCA 69 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 86 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:16:

TGCCCTATTT ATACGGCAAA AGTTTCCTGG CCCTTGGGTT CCCCTAAAAG GGCCTCGACC 66

AATGGGAGGG CTGGGGCTTT GGTCCT 88 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:17:

CTTGTGGCGG ACGTTGTTTC GGTTGCTTTT GGGTCTGGAG ΑΑGGTGGGTC C GATC 55 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 1343 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:18:

CTGTGGGGGG	^TATG^^I¹	CTCGGTAGCT	GTTGAGGTGA		CCAGTGGCTAC	60
GTTTGGGTTT	TGTGTTTGTG	CATICGTTc::τ	GTTTTCCTCG	GT^T^C^C^^^C^C	ATCCCTGGGG	120
CTAGAGCACT	TTGTGGTGGG	TTTTTTGG;TT	GCTCCTGCAG		GACTCGO-AGC	110
TTTTCGTTTT	CGGCTTTGGT	TTTCAGGTGG	GGTCAGTGTT	GTITAGTAGC	CAC^AACC?^	240
TTGTGGAGGT	GGTATGTTTT	AGGGGTTCAG	GGGGGCICTA		TATGAGTACC	300

190 041

TCTGCATTGA TGACTGTTGG ATGGCTCCCC AAAGAGATTC AGGAAGGCAGA CCTTCAGGCAG	360
ACCCTCAGCG CTTTCCTCAT GGGATTCGCC AGCTAGCTAA TTATGTTdAC AGC/AAAGGAC	422
TGAAGCTAGG GATTTATGCA GATGTTGGAA ATAAAACCTG CGCAGGCTTC CHTGGGAGTT	480
TTGGATACTA CGACATTGAT GCCCAGACCT TTGCTGACTG GGGAGTACT CTGCTTAAAAT	542
TTGATCCTTC TTACTGTGAC AGTTTGGAAA TGGTTATTAG CACCYTGTCCT	600
TGGCCCTGAA TAGGACTGGC AGAAGCATTC TCTACTCCTG TŁAGTGGCCT Cllll^T^lArf^l	600
GGCCCTTTCA AAAGCCCAAT TATACAG/AAA TCCGACAGTA CTCCCATCAC TCGCG/AAATT	722
TTGCTGACAT TGATGATTCC TGGAAAAGTA TAAAGAGTAT CTTGGACTGG ACATCTTTTA	780
ACCAGCAGAC AATTGTTGAT GTTGCTGGAC CAGGGGGTTC GGAkTGACCCA GATATGTTAG	802
TGATTGGCAA CTTTGCCCTC AGCTGGAATC AGCAGTAAC TCAGATGGCC CTCTGGGCTA	900
TCATGGCTGC TCCTTTATTC ATGTCTAATG ACCTCCCGACA CATCAGCCCT C/AAGCC/AAAG	960
CTCTCCTTCA GGATAAGCAC GTAATTCCCA TCAATCAGGA CCCCTTGGGC AAGCAAGGGT	1000
ACCAGCTTAG ACACGCAGAC AACTTTGAAG TGTGGGAACG ACCTCTCTd GCCTTAGCCT	1080
CGGCTGTAGC TATGATAAAC CGGCAGGAGA TTGGTCCAH TCGCTCTTAT ACCATCGCAG	1002
TTGCTTCCCT GCGTAAAGGA GTGGCCTGTA ATCCTCCCTC CTTCATCACA CAGCTCCTCC	1020
CTGTGAAAAG GAAGCTACGG TTCTATGAAT GGACTTGAAG GTTWAGAAGT CACATAAATC	1020
CCACAGGCAC TGTTTTGCTT CAGCTAGAAA A1iAClA^^(^ClA GATGTCCATTA AA^^lAA^l^l^iAC	1062
TTTAAAAAAA AAAAAAACTC GAG	1062
(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 210 par zasad
(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) NIĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:19:
lTGCGCTCTA dTATGATAA ACCGGOAGC CCTCGCTCTT ATACCATCGC	60
ACTTGCTTCC CTGGGTAAAG GAGTCGllTG TAATCCTGH TGCTTCATCA CAOAGCTCCT	100
lllTCTGAAA AGGAAGCTAG GGTTCTATGA ATGGACTTCA AGGTTAAGAA GTCACATAAA	100
TlCCAlAGCC ACTGTTTTGC TTCAGCTAGA	200
(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

190 041 (A) DŁUGOŚĆ: 268 par zasad (B) TCP: kwas nukleinowy (C) JIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. W ID.:20:

ATTGGTCCGC	CCCTGAGGTT	AATTTTAAAA	3CCCAGGCCT	CGATT3GAAA	tttatcgatgt	60
CCGGTCACCG	TGACAATGCA	GGTTGGGGAC	3CAGAACCTG	ACTTT3GCTG	cccgctnkg	ICC
CTTCGCTTCC	TGGCCCTCGT	TTACCAGGA.C	31000^1%	TTGGG3CACT	GιCCAGTTTA3	ICC
TTGGCAAGGA	CGCCTACCAT	GGGCTAGCCA		GCAGC3TGTG		2CA
TGCCAGGAAG	AGCCAGATTC	TTGTATTT				269

(2) INFORMACCA DLA SLKW. JR ID.:21:

(i) CHARAKTLRYSTCIA SLIWLNCYI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 aminokwasów (B) TCP: aminokwas (C) JIĆ: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TCP CZĄSTLCZKI: peptyd (xi) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. JR ID.:21:

Met	Ala	Thr	Gly	Ser	Arg	Thr	Ser	Leu	Leu Leu Ala	Phe Cly Leu Leu
1				5					10	15
Cys	Leu	Pro	Trp	Leu	Gln	Clu	Gly	Ser	Ala
			20					25

(2) INFORMACCA DLA SLKW. JR ID.:22:

(i) CHARAKTLRCSTCKA SLKWLNCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 78 par zasad (B) TCP: kwas nukleinowy (C) JIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SLKWLJCCI: SLKW. JR ID.:22:

ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTC GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG 60

CTTCAAGAGG GCAGTGCC

190 041 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI::

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi| OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:23:

TTTTGGATCC CTCGAGGACA TTGATTATTG ACTAG 35 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:24:

TTTTGGATCC CGTGTCAAGG ACGGTGAC 28 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:25:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEK^^^^,^^:

(A) DŁUGOŚĆ: 1197 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:25:

CTGGACAATG	GATTGGCAAG		ATTCCGTGCG	TGCACTGGGA	GCTCCTCTTT	60
TGCAACCTTG	ACTGCCAGGA	AGAGCCCAGT	TCCCGGATCT	T^^^CTT^CA^T^C^T	CTTCTA’TGAT	122
ATGGCAGAGC	TCATGCTCTC	AGGAASGCTTG	ATTGATCGTT	GTTATGAGTA	CCTTTTGATT	180
GATGACTGTT	GGATGGCTCC	CCWAC^GAT	TCTGCTTGCT	ΤΑί^'Ί^ασΟ	AT-C^TcC^TC^T^T,	220
CGCTTTCCTC	ATGGGATTCG	CCT^GCTAGCT	TTT'TAGGCTC	A(CTcCTTTTJG	ACTGCATCCA	300
GGGATTTATG	CAGATGTTGG	;τGcnτAAcc	TTCCGTGGCT	TCCCCGtGAG	TTTTTGC^GA^T	360
TACCACATTG	ATGCCCAGAC	CCTTGCTCGlC	TTGGGCTCAT	ATCTGCT/TAT	ATTTTATTCC	400
TGTTACTGTG	ACAGTTTGGA		TJT]^<3GCTJT[JT	AG <^C^<TC^^rT GTC	cττccccccτ	400

190 041

AATAGGACTG GCAGAAGCAT TGTGTACTCC CGTGAGTGGC CTCTTTATAT	GCGGAAATCC	S40
CAAAAGCCCA ATTATACAGA AATCTCAGAG AACTGCAATC ACTGGCGAAA	CCTTACCAAC	600
ATTGATGATT ACTGAATTTA TATTATTT.GT TTCTTGCACT	CTTACTGGAA	600
TGTATCGTTG ATATCACCAA ACTACTAGGG CGGAAAΓGACCCAGATATGTT	AGTGTCCGAC	720
TAATTTGGAC CCTGATGATA TCACTAATTAACTCAGATCGCCCTCTGGGC	TATAACCACT	780
GCTACTTTAT TAATATATTA TGAATACCAATACATCAGCA CTCAAGCCAA	AGCCCCCATT	880
CAAGATAAGG TCGCTTCCAA CACTCATTAA AA^CC(^^’^(^G(^!^AA^T^(^T^ίί	ATACCAACTT	900
AGACAGAGAG TAAAACCCGT AGTGTATAGATGACCTCTCT	ACGGGACACA	960
GCTATAATAA ACCAACAAAA GAATTTAGTA ACTCGCTCTTATACCATCGC	AATAGCTCCC	1100
ACAGGCTTTA ATATAAAACA TAATTTCACA CGCTTIAATCA CACAGCTCCT	CCACATAATT	1100
AGGTTGATTG GATTACACGA ATTTAATACAAGGTTAAGTATGTCA<AAT_JATT	CCCCACAGGC	1140
AACATTTTGC TCATAAATGA AATTTTTATT GAGATGTCAT TAWAAGACTT	TCTTCTA	1117
(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 398 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:26:

Leu

Asp

Asn

Gly

Leu

Ala

Arg

Tho

Pro

Thr

Me0

Gly

Trp

Leu

His

Trp

1

4

10

15

Glu

Arg

Phe

Met

Cys

Asn

Leu

Asp

Cys

Gln

Glu

Pro

Asp

Ser

Ccs

20

24

30

Ile

Ser

Glu

Lls

Leu

Phe

Met

Glo

Ala

Glu

Leu

Met

Val

Ser

GJ^u

35

0 0

0 5

Gly

Top

Lys

Asp

Ala

G1 y

Tyr

do

Tyr

Leu

Cyo

Ile

Asp

Cys

Trp

40

44

00

Met

Ala

Pro

Gln

Arg

Asp

Ser

Glu

Gly

Arg

Leu

Gln

Ala

Asp

Pro

Gln

04

70

12

80

Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lls

190 041

90 95

Gly

Atu

Lys

L ee 100

Gly

Ile Tyr Ala Asp 100

Vl1

Gly

Ala

Lys

Thr 111

Cys

Ala

Gly

Phe

Pro

L ly

Ser

Phe

gL y

Typ

Tyl

Asi

Air

Aal

Alt

Gin

Thr

Ala

115

110

112

Ala

Asp

Trp

G

Val

Asp

Leu

i-^s

Phe

Asp

dli

Lyi

Tyi

cys

Alp

130

135

110

Ser

Leu

Glu

Asn

Leu

Ala

Asp

Gly

Tyr

Lys

His

Met

Ser

Leu

lla

Leu

145

150

115

160

Asn

Arg

Thr

Gly

Arg

Ser

Ile

Val

Tyr

Sur

Cyi

du

Arp

Pro

Leu

Tyr

165

170

115

Met

Trp

Pro

Lhh

Gln

Lys

Pro

TAn

Tyr

Ahr

Glu

Ile

rri:g

Gln

Tyr

Cys

180

118

119

Asn

His

Trp

A rg

Asn

PhA

Al a

Asp

Tle

Asp

As p

Srs

Asp

Ltr

Ser

Aip

195

200

220

Lys

Ser

Ile

LLe

Asp

Trp

Thr

Ser

Phs

Ala

Gln

du

Arg

IIe

Val

LAp

210

215

222

Val

Ala

Gly

Pro

Gly

T rp

Asn

Asp

Pro

Aal

Met

Ltu

Val

Ile

Gly

225

230

223

220

Asn

Phe

Gly

Leu

Ser

Tri?

Asn

Gis

Gln

Val

TTh

Hn

Met

Ma

Leu

Trp

245

250

225

Ala

Ile

Melt

All

Ala

Pn

Ll u

Phh

M et

Ser

Ast

Leu

Asg

His

Ale

260

225

220

Ser

Pro

Gin

ALll

Lys

Ala

Ll u

LeA

LAt

Atu

Lys

Aal

AsL

Ile

Ala

VLu

275

2130

225

Asn

Gln

Asp

L Pr

Leu

Gly

Lys

Gln

Gly

Tyr

dn

Lat

Arg

Gln

Gly

Asp

290

295

330

Asn

Phe

Glu

u^al

Trp

Glu

Arg

Pito

Leu

Ses

d^

Atu

Ha

Trp

Ala

Val

305

310

311

320

Ala

Met

Ile

Asn

Arg

Gin

Glu

Iie

Gly

C^l^y

Ppg

Agg

Ser

Tyr

Thr

Ue

325

330

335

190 041

Ala

Val

Ala

Ser 340

Leu

Gly

Lys

Gly

Val 345

Ala

Cys

Asn

Pro

Ala 350

Cys

Phu

Ile

Thr

Gin

Lee

Lm

Pro

Val

Lys

AAg

Lys

Leu

Gly

Phh

Tyr

GGu

LTr

355

360

335

Thr

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

HiL

I le

Pro

Thr

Gly

Tlih

Val

Llu

Ilu

370

375

380

Gln

Leu

G1g

A sn

Lhr

Met

Gin

Met

Ssu

Leu

Lys

Asp

Llu

Leu

385

390

:595

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 338 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:27:

AIOGCTACAG	GTAAGCGCCC	CTAAAATCCC	TThGGGCACA	ATGhGhCChG	AGGGGAGAGG	50
CAGCGACCTG	TAGAIOGGAC	GGGGGCACTA	ACCCTCAGGT	ThGGGGChhC	TGAAhGTGAG	120
TATCGCCATG	hAAGCCCAGh	AThhGGCCAA	TC1'CAGAAAG	ChCChGGhCC	ChGGAGGGAh	180
GGAGAGAGAA	AAACAAACAG	CTCCTGGAGC	AGGGAGAGTG	CTGGCCTC1T	GCTCTCCGGC	240
TCCCTC'!^'!'	GCCCTCIOGI'	TTCTCCCCAG	GCTCCCGGAC	GTCCCGCTC	CI^GOT^IO	300
GCCTGCTCTG	CCTGCCCTGG	CTTCAAGAGG	GCAGTGCC			338

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: nie dotyczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:28:

Leu Asp Asn Gly Luu Ala Arg Thr Pro Thr

190 041

ATTGGTCCGCCCCTGAGGTTAATCTTAAAAG

SacII

CCCAGGTT ACCCG CG G AAATTTATGCTGTC

CGGTCACCGTGACAATGCAGCTGAGGAACC

CAGAACTACATCTGGGCTGCGCGCTTGCGCT

TCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATC

CCTGGGGCTAGAGCACTGGACAATGGATTG

Ncol

GCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCAC

TGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCC

AGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCA

FIG. 2

190 041

1	CCGCGGGAAA	TTTATCCTCT
61	ATCTGGGCTG	CGCGCTTGCG
121	CTAGAGCACT	GGACAATGGA
181	GCTTCATGTG	CAACCTTGAC
241	TCATGGAGAT	GGCAGAGCTC
301	TCTGCATTGA	TGACTGTTGG
361	ACCCTCAGCG	CTTTCCTCAT
421	TCAAGCTAGG	GATTTATGCA
481	TTGGATACTA	CGACATTGAT
541	TTGATGGTTG	TTACTCTCAC
601	TGGCCCTGAA	TAGGACTGGC
661	GGCCCTTTCA	AAAGCCCAAT
721	TTGCTGACAT	TGATGATTCC
781		1'lkaAi'
841	TGATTGGCAA	CTTTGGCCTC
901	TCATGGCTGC	TCCTTTATTC
961	CTCTCCTTCA	GGATAAGGAC
1021	ACCAGCTTAG	ACAGGGAGAC
1081	GGGCTGTAGC	TATGATAAAC
1141	TTGCTTCCCT	GGGTAAAGGA
12C1	CTGTGAAAAG	GAAGCTAGGG
1261	CCACAGGCAC	TGTTTTGCTT
1321	TTTAAAAAAA	AAAAAAACTC

CCGGTCACCG TGACAATGCA CTTCGCTTCC TGGCCCTCGT TTGGCAAGGA CGCCTACCAT TGCCAGGAAG AGCCAGATTC ATGGTCTCAG AAGGCTGGAA ATGGCTCCCC AAAGAGATTC GGGATTCGCC AGCTAGCTAA GATGTTGGAA ATAAAACCTG GCCCAGACCT TTGCTGACTG AGTTTGGAAA ATTTGGCAGA AGAAGCATTG TGTACTCCTG TATACAGAAA TCCGACAGTA TGGAAAAGTA TAAAGAGTAT GTTGCTGGAC CAGGGGGTTG AGCTGGAATC AGCAAGTAAC ATGTCTAATG ACCTCCGACA GTAATTGCCA TCAATCAGGA AACTTTGAAG TGTGGGAACG CGGCAGGAGA TTGGTGGACC GTGGCCTGTA ATCCTGCCTG TTCTATGAAT GGACTTCAAG CAGCTAGAAA ATACAATGCA GAG

GCTGAGGAAC CCAGAACTAC TTCCTGGGAC ATCCCTGGGG GGGCTGGCTG CACTGGGAGC CTGCATCAGT GAGAAGCTCT GGATGCAGGT TATGAGTACC AGAAGGCAGA CTTCAGGCAG TTATGTTCAC AGCAAAGGAC CGCAGGCTTC CCTGGGAGTT GGGAGTAGAT CTGCTAAAAT TGGTTATAAG CACATGTCCT TGAGTGGCCT CTTTATATGT CTGCAATCAC TGGCGAAATT CTTGGACTGG ACATCTTTTA GAATGACCCA GATATGTTAG TCAGATGGCC CTCTGGGCTA CATCAGCCCT CAAGCCAAAG CCCCTTGGGC AAGCAAGGGT ACCTCTCTCA GGCTTAGCCT TCGCTCTTAT ACCATCGCAG CTTCATCACA CAGCTCCTCC GTTAAGAAGT CACATAAATC GATGTCATTA AAAGACTTAC

FIG. 3

190 041

SphI (140) _{NcoI (231)}SphI (68)\ Ąhoi (346)

EcoRi (5752)

SphI (5432

Xhol (5Ϊ07)

I (1677)

Xhol (1982)

CMV Promotor

Icol (2363)

CMV Intron

Icol (3515)

A \ BamHI (3551) T Ncol (355B) hGH peptyd sygnałowy α-gal cDNA Ncol (3926)

FIG. 4 pcDNeo

SphI (1000) Ncol (1031)

SphI (2755)

190 041 hGH α-gal cDNA

Bglll (7347)

EcoRI (8803) BstXI (8598) , 3' UTS___

Xhol (8158)

BstXI (7630)

AvrII (354)

Xhol (376) pcDNeo

Nrul (1550) hGH peptyd sygnałcw^^

EcoRI (2036)

III (2789) promotor kolagenu lot 2 •AvrII (4302) _ BstXI (44711

7» ^KXbaI (4905) /----1 ^^ńchol (4954) ¹ III (5299)

BstXI (5492) „ , _r. , . , Srfl (5567) p-aktyna5 intron _AvrU ·_(562θ,

FIG. 5

190 041 absorbancja przy 280nm

aktywność cx-Gal jednostkiAnl numer frakcji

FIG. 6

190 041

2000

1500i n te r nalizowa n a tf-gal, jednostek/ml białka komórki

10004

500-

1000 2000 3000 4000 5000 ot-gal, jednostek/ml ~t!ez dodatków

.....o -· 5 mM M6P

--o--- 30 ug/ml mannaru

6000

FIG. 7

Untrf

HF bez insertu

^Fabry

FIG. 8

190 041

Leu	Asp	Asn	Gly	Leu	Ala	Arg	Thr	Pro	Thr	Met	Gly
Trp	Leu	His	Trp	Glu	Arg	Phe	Met	Cys	Asn	Leu	Asp
Cys	Gin	Glu	Glu	Pro	Asp	Ser	Cys	Ile	Ser	Glu	Lys
Leu	Phe	Met	Glu	Met	Ala	Glu	Leu	Met	Val	Ser	Glu
Gly	Trp	Lys	Asp	Ala	Gly	Tyr	Glu	Tyr	Leu	cys	Ile
Asp	Asp	Cys	Trp	Met	Ala	Pro	Gin	Arg	Asp	Ser	Glu
Gly	Arg	Leu	Gin	Ala	Asp	Pro	Gin	Arg	Phe	Pro	His
Gly	Ile	Arg	Gin	Leu	Ala	Asn	Tyr	Val	His	Ser	Lys
Gly	Leu	Lys	Leu	Gly	Ile	Tyr	Ala	Asp	Val	Gly	Asn
Lys	Thr	Cys	Ala	Gly	Phe	Pro	Gly	Ser	Phe	Gly	Tyr
Tyr	Asp	Ile	Asp	Ala	Gin	Thr	Phe	Ala	Asp	Trp	Gly
Val	Asp	Leu	Leu	Lys	Phe	Asp	Gly	Cys	Tyr	Cys	Asp
Ser	Leu	Glu	Asn	Leu	Ala	Asp	Gly	Tyr	Lys	His	Met
Ser	Leu	Ala	Leu	Asn	Arg	Thr	Gly	Arg	Ser	Ile	val
Tyr	Ser	Cys	Glu	Trp	Pro	Leu	Tyr	Met	Trp	Pro	Phe
Gin	Lys	Pro	Asn	Tyr	Thr	Glu	Ile	Arg	Gin	Tyr	Cys
Asn	His	Trp	Arg	Asn	Phe	Ala	Asp	Ile	Asp	Asp	Ser
Trp	Lys	Ser	Ile	Lys	Ser	Ile	Leu	Asp	Trp	Thr	Ser
Phe	Asn	Gin	Glu	Arg	Ile	Val	Asp	Val	Ala	Gly	Pro
Gly	Gly	Trp	Asn	Asp	Pro	Asp	Met	Leu	Val	Ile	Gly
Asn	Phe	Gly	Leu	Ser	Trp	Asn	Gin	Gin	Val	Thr	Gin
Met	Ala	Leu	Trp	Ala	Ile	Met	Ala	Ala	Pro	Leu	Phe
Met	Ser	Asn	Asp	Leu	Arg	His	Ile	Ser	Pro	Gin	Ala
Lys	Ala	Leu	Leu	Gin	Asp	Lys	Asp	Val	Ile	Ala	Ile
Asn	Gin	Asp	Pro	Leu	Gly	Lys	Gin	Gly	Tyr	Gin	Leu
Arg	Gin	Gly	Asp	Asn	Phe	Glu	val	Trp	Glu	Arg	Pro
Leu	Ser	Gly	Leu	Ala	Trp	Ala	val	Ala	Met	Ile	Asn
Arg	Gin	Glu	Ile	Gly	Gly	Pro	Arg	Ser	Tyr	Thr	Ile
Ala	val	Ala	Ser	Leu	Gly	Lys	Gly	Val	Ala	Cys	Asn
Pro	Ala	cys	Phe	Ile	Thr	Gin	Leu	Leu	Pro	Val	Lys
Arg	Lys	Leu	Gly	Phe	Tyr	Glu	Trp	Thr	Ser	Arg	Leu
Arg	Ser	His	Ile	Asn	Pro	Thr	Gly	Thr	Val	Leu	Leu
Gin	Leu	Glu	Asn	Thr	Met	Gin	Met	Ser	Leu	Lys	Asp
Leu	Leu

FIG. 9

190 041

ATGGCTACAG GTAAGCGCCC -CTAAAATCCC TTTCGGC&CA-

ATGTGTCCTG	AGGGGAGAGG	CAGCGACCTG	TAGATGGGAC
GGGGGCACTA	ACCCTCAGGT	TTGGGGCTTC	TGAATGTGAG
TATCGCCATG	TAAGCCCAGT	ATTTGGCCAA	TCTCAGAAAG
CTCCTGGTCC	CTGGAGGGAT	GGAGAGAGAA	AAACAAACAG
CTCCTGGAGC	AGGGAGAGTG	CTGGCCTCTT	GCTCTCCGGC
TCCCTCTGTT	GCCCTCTGGT	TTCTCCCCAG	GCTCCCGGAC
GTCCCTGCTC	CTGGCTTTTG	GCCTGCTCTG	CCTGCCCTGG

CTTCAAGAGG GCAGTGCC

FIG. 10

ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG

GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCC

FIG. 11

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu

Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu

Ser Ala

FIG. 12

Ala

Gly

190 041

CTGGACAATG GATTGGCAAG GACGCCTACC TGCAACCTTG ACTCCCAGGA AGACCCAGAT ATGGCAGAGC TCATGGTCTC AGAAGGCTGG GATGACTGTT GGATGGCTCC CCAAAGAGAT

CGCTTTCCTC ATGGGATTCG CCAGCTAGCT GGGATTTATG CAGATGTTGG AAATAAAACC TACGACATTG ATGCCCAGAC CTTTGCTGAC TGTTACTGTG ACAGTTTGGA AAATTTGGCA aataggactg gcagaagcat tgtgtactcc GAAAAGCCCA ATTATACAGA AATCCGACAG ATTGATGATT CCTGGAAAAG TATAAAGAGT agaattgttg atgttgctgg ACCAGGGCGT AACTTTGGCC TCAGCTGGAA TCAGCAAGTA GCTCCTTTAT TCATGTCTAA TGACCTCCGA CAGGATAAGG ACGTAATTGC CATCAATCAG AGACAGGGAG ACAACTTTGA AGTGTGGGAA GCTATGATAA ACCGGCAGGA GATTGGTGGA CTCGGTAAAG GAGTGGCCTG TAATCCTGCC AGGAAGCTAG GGTTCTATGA atggacttca actgttttgc ttcagctaga aaatacaatg atgggctggc tgcactggga gcgcttcatg tcctgcatca gtgagaagct cttcatggag aaggatgcag gttatgagta cctctgcatt tcagaaggca gacttcaggc agaccctcag aattatgttc acagcaaagg actgaagcta TGCGCAGGCT TCCCTGGGAG TTTTGGATAC TGGGGAGTAG atctgctaaa atttgatggt gatggttata agcacatgtc cttggccctg tgtgagtggc ctctttatat gtggcccttt tactgcaatc actggcgaaa ttttgctgac atcttggact ggacatcttt taaccaggag tggaatgacc cagatatgtt agtgattggc actcagatgg ccctctgggc tatcatggct cacatcagcc ctcaagccaa agctctcctt GACCCCTTGG GCAAGCAAGG GTACCAGCTT CGACCTCTCT CAGGCTTAGC CTGGGCTGTA CCTCGCTCTT ATACCATCGC AGTTGCTTCC TGCTTCATCA CACAGCTCCT CCCTGTGAAA AGGTTAAGAA GTCACATAAA TCCCaCAGGC CAGATGTCAT TAAAAGACTT ACTTTAA

FIG. 13

190 041 (CTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGA

GATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCA

GTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTA

ATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCT

GTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGA

CTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCAC

AGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGA

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie ludzkiej komórki genetycznie zmodyfikowanej dla nadekspresji i sekrecji ludzkiej alfa-galakozydazy A, do leczenia pacjenta podejrzanego o niedobór α-galaktozydazy A.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że komórkę transfekowano in vitro cząsteczką DNA zawierającą sekwencję kodującą polipeptyd zawierający ludzką α-gal A (SEKW. NR ID.:26).
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że polipeptyd zawiera ponadto heterologiczny peptyd sygnałowy.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że heterologicznym peptydem sygnałowym jest peptyd sygnałowy ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) (SEKW. NR ID.:21).
5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że cząsteczka DNA obejmuje intron w sekwencji kodującej peptyd sygnałowy.
6. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że cząsteczka DNA obejmuje nietransłowaną sekwencję co najmniej 6 nukleotydach leżącą bezpośrednio 3' względem kodonu terminacji sekwencji kodującej, przy czym nietranslowana sekwencja stanowi miejsce poliadenylacji.
7. Cząsteczka DNA obejmująca pierwszą sekwencję kodującą peptyd sygnałowy hGH (SEKW. NR ID.:21), przy czym pierwsza sekwencja zawiera intron; oraz związaną z końcem 3' pierwszej sekwencji drugą sekwencję kodującą polipeptyd obejmujący ludzką alfagalaktozydazę A.
8. Cząsteczka DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że obejmuje ponadto nietranslowaną sekwencję 3' obejmującą miejsce poliadenylacji.
9. Konstrukt ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA jak zdefiniowano w zastrz. 7 odpowiednią dla ekspresji w ludzkiej komórce.
10. Hodowana ludzka komórka zawierająca cząsteczkę DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierający ludzką alfa-galaktozydazę A związaną z heterologicznym peptydem sygnałowym, i (b) pozwala na ekspresję polipeptydu w komórce.
11. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest fibroblastem.
12. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że wybiera się ją z grupy obejmującej komórkę nabłonka, komórkę śródbłonka, komórkę szpiku kostnego, komórkę glejową, hepatocyt, keratynocyt, miocyt, neuron lub prekursora tych typów komórek.
13. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że peptydem sygnałowym jest peptyd sygnałowy hGH (SEKW. NR ID.:21).
14. Klonujący szczep komórek złożony z wielu hodowanych ludzkich komórek transfekowanych cząsteczką DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierający ludzką alfagalaktozydazę A związaną z heterologicznym peptydem sygnałowym, i (b) pozwala na nadekspresję polipeptydu w komórkach.
15. Klonujący szczep komórek według zastrz. 14, znamienny tym, że komórkami sąfibroblasty.

190 041
16. Klonująca linia komórek złożona zasadniczo z wielu nieśmiertelnych ludzkich komórek transfekowanych cząsteczką DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierający ludzką alfa-galaktozydazę A związaną z heterologicznym peptydem sygnałowym, i (b) pozwala na nadekspresję polipeptydu w komórkach.
17. Klonująca linia komórek według zastrz. 16, znamienna tym, że komórkę wybiera się z grupy obejmującej komórkę czerniaka Bowesa, komórkę Daudi, komórkę HeLa, komórkę HL-60, komórkę HT1080, komórkę Jurkata, komórkę raka KB, komórkę białaczki K-562, komórkę raka piersi MCF-7, komórkę MOLT-4, komórkę Namalwa, komórkę Raji, komórkę RPMI 8226, komórkę U-937, komórkę WI-38VA13 (podlinia 2R4) i komórkę raka jajnika 2780AD.
18. Białko obejmujące (a) peptyd sygnałowy hGH (SEKW. NR DD.21) związany wiązaniem peptydowym z (b) ludzką alfa-galaktozydazą A.
19. Sposób wytwarzania glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, znamienny tym, że hoduje się komórkę zdefiniowaną w zastrz. 10, korzystnie fibroblast w warunkach pozwalających na ekspresję ludzkiej alfa-galaktozydazy A z tej cząsteczki DNA i sekrecję glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A do pożywki hodowli komórkowej; oraz wydziela się glikozylowaną ludzką alfa-galaktozydazę A z pożywki hodowli.
20. Oczyszczona glikozylowana ludzka alfa-galaktozydaza A wytworzona sposobem zdefiniowanym w zastrz. 19.
21. Sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A z próbki, znamienny tym, że obejmuje pierwszy etap chromatografii, w którym próbkę przepuszcza się nad hydrofobową interakcyjną żywicą.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że funkcjonalne ugrupowanie na żywicy obejmuje grupę butylową.
23. Sposób wytwarzania glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, znamienny tym, że hoduje się komórkę jak zdefiniowano w zastrz. 16 w warunkach pozwalających na ekspresję ludzkiej alfa-galaktozydazy A z cząsteczki DNA i sekrecję glikozylowanej ludzkiej α-gal A do pożywki hodowli komórkowej; oraz wydziela się glikozylowaną ludzką alfa-galaktozydazę A z pożywki kultury.
24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że ponadto przepuszcza się próbkę nad drugą żywicą wybraną z grupy obejmującej unieruchomioną żywicę heparynową, hydroksyapatyt, anionowymienną żywicę i ekskluzyjną żywicę.
25. Zastosowanie oczyszczonej glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A jak zdefiniowano w zastrz. 20, do wytworzenia leku do leczenia pacjenta podejrzanego o niedobór alfa-galaktozydazy A.
26. Kompozycja terapeutyczna, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalną ludzką alfa-galaktozydazę A, posiadającą mannozo-6-fosforan związany poprzez atom azotu, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
27. Kompozycja według zastrz. 26, znamienna tym, że obejmuje ponadto farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
28. Kompozycja terapeutyczna, znamienna tym, że zawiera oczyszczoną ludzką alfagalaktozydazę A jak zdefiniowano w zastrz. 20 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
29. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że skomponowano ją przy pH 6,5 lub niższym.
30. Kompozycja według zastrz. 28, albo 29, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka jest albuminą ludzkiej surowicy.
31. Cząsteczka DNA kodująca białko zawierające peptyd sygnałowy hGH (SEKW. NR ID.:21) związany z polipeptydem innym niż hGH.
32. Cząsteczka DNA według zastrz. 31, znamienna tym, że cząsteczka DNA zawiera intron w sekwencji kodującej peptyd sygnałowy.
33. Hodowana ludzka komórka zawierająca cząsteczkę DNA, która (a) koduje polipeptyd zawierający ludzką alfa-galaktozydazę A i (b) pozwala na nadekspresję polipeptydu w komórce.
34. Sposób wytwarzania glikozylowanej ludzkiej alfa-galaktozydazy A, znamienny tym, że stosuje się ludzką komórkę zawierającą cząsteczkę DNA kodującą polipeptyd zawie4

190 041 rający ludzką alfa-galaktozydazę A w warunkach pozwalających na ekspresję ludzkiej α-gal A z cząsteczki DNA.
35. Sposób oczyszczania ludzkiej alfa-galaktozydazy A z próbki, znamienny tym, że przepuszcza się próbkę nad hydrofobową żywicą aktywną zawierającą grupę butylową jako ugrupowanie funkcyjne.
36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że ponadto przesuwa się próbkę nad następującymi substancjami w następującym porządku:

(a) umieruchomiona żywicą heparynową;

(b) hydroksyapatytem;

(c) żywicą aninową wymienną; i (d) żywicą wybiórczą rozmiarową.