TW585919B

TW585919B - Pharmaceutical composition for treating alpha-galactosidase deficiency

Info

Publication number: TW585919B
Application number: TW086113342A
Authority: TW
Inventors: Richard F Selden; Marianne Borowski; Frances P Gillespie; Carol M Kinoshita; Douglas A Treco
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-09-13
Publication date: 2004-05-01
Also published as: PL332188A1; NO991225L; DE69732129D1; AU4424497A; IL184637A; JP2007289201A; NO328443B1; KR20050084473A; JP2012019793A; JP4313381B2; JP5590788B2; ES2234032T3; HU227189B1; CA2265464C; WO1998011206A2; EP2327775A2; JP2009102321A; DK1538202T3; JP2001504324A; NO991225D0

Description

585919 A7 B7 五、發明説明（7 ) 乳糖胺偶合的 Sepharose 基質（Bishop et al·，·/· 5/〇/. C/zem· 256:1307-1316，1981)。一般使用的蛋白質凝集素親合力樹脂及受質類似物樹脂都是在固態支持物中連續地通入結合劑，會導致純化產物的污染（參考Marikar et al·，4似/. 5201:306-310，1992，使得產物不適合應用在藥學準備上。結合在樹脂上的凝集素以及受質類似物也會對蛋白質的酶活性，功能/及結構等特性造成負面的影響。此外，該等結合力樹脂的製備一般都是昂貴的，使得該等樹脂較其它習知的色層分析樹不適合在商業領域使用。因此發展一種利用習知色層分析管柱的純化的程序可供大規模商業是本發明一最顯著的優點。一個被t認為具有α —半乳糖分解酶A缺失的個體，

V 可以用任何標準的方法（包括但非用以限定：腹膜給藥，皮下給藥，肌肉注射或固體植片）給予藥學上可接受的純化α —半乳糖分解酶A治療。純化的蛋白質可被配在包括有含胜理可接受輔藥（一種載體，如人類血清蛋白，在 ρΗ=6·5或更>[&)的溶液構成的治療組成裡。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，本發明提供一種獲得大量合適糖化及具療效的α —半乳糖分解酶Α的方法，使酶取代治療α —半乳糖分解酶Α的缺失可行，且與由人類或勢物組織得到酶的治療法比較下其具有相當低的風險。熟悉此技藝者認為人類α —半乳糖分解酶A的DNA 序列（互補DNA或基因組DNA)，或因#止密碼改變或因密碼改變而導致保留的胺基酸取代的不同序列，可被 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（11) 核苷酸36-128)，其一般是一些哺乳類動物的除α-gal A 外的訊號胜片段。 “第一色層分析步驟”是指將樣品第一次的通入色層分析管柱的過程（不包括所有準備樣品的步驟）。圖示之簡單說明：第1圖是代表用來由/類纖維母細胞c-DNA庫（序列ID N0:19)單離出之α-gal A的鹼基對探針，其序列是從α-gal表現子7而來，由人類基因組DNA藉PCR 放大分離。圖中的序列底下晝線的區域是代表放大的引子。第2圖是代表完成a-galAc_DNA選殖體（序列ID v NO:20)的5’端DNA片段序列，此片段是經PCR放大人類基因組DNA而得到。圖中的序列底下畫線的區域是代表放大的引子，其中Ncol及SacII所指的位置是限制酶的位置，用來進行如例1A所述之次選殖（subcloning)。第3圖代表的是編碼訊號胜（序列ID N0:18)的α-gal A c_DNA 序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先Ja讀背面<注意事項再填寫本頁) 第4圖是pXAG-16的圖譜，是一種a_gal A的表現構築，其包括有一 CMV(巨細胞病毒）巧啟動子及插入子，hGH訊號胜編碼序列及第1插入子，α-gal Ac-DNA 序列（缺少α-gal A的訊號胜），以及hGH的3’端UTS。第5圖是pXAG-28的圖譜，是一旛α-gal A的表現構築，其包括有一膠原蛋白Ια2的啟動子，一 /3-肌 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（12) 動蛋白的播入子，hGH訊號胜編碼序列及第1插入子， α-gal A c-DNA序列（缺少α-gal A的訊號胜），以及hGH 的3’端UTS。第6圖是利用丁基Sepharose®樹脂純化a _gal A的色層分析圖，顯示所選擇的區域在波長280 nm的吸收度（平滑線）及a-gal A的活性（點線）。第7圖的線段圖顯示的是根據本發明準備的Fabry 的纖維母細胞内的人類a -gal A吸收情形。細胞内的α -gal Α活性及全蛋白濃度是在細胞與隨濃度增加的根據本發明所準備的人類α-gal A —起培養後再加以測量。顯示其吸收抑制劑一甘露糖-6構酸根（M6P; open diamonds ) 及甘露聚糖（開環）的影響。第8圖顯示檢測Fabry纖維母細胞内的a -gal A的吸收情況的實驗設計圖。Fabry細胞内的a -gal A活性是在暴露的正常或a: -gal A過量表現的人類纖維母細胞於

T W 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Transwell inserts培養後再測量。”M6P”=甘露糖-6填酸根；”UntrfHF”=未轉植的人類纖維母細胞；”BRS11”=一種未經轉植的α-gal A過量表現纖維母細胞系的胺基酸序列（序列ID NO:26)。第9圖顯示的是人類a-gal A胺基酸序列（序列ID NO:26) 〇第10圖顯示的是hGH訊號胜及hGH第1插入子（底下畫線部分）的編碼序列（序列ID NO:27)。第11圖顯示的是無插入子的hGH訊號胜編碼序列 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（13) (序列 IDNO:22)。第12圖顯示的是hGH訊號胜的胺基酸序列（序列 ID N0:21)。第13圖顯示的是人類a-gal A的cDNA編碼序列（序列 IDNO:25)。詳細說明 ' 溶素體内的酶如α-gal A是由甘露糖-6磷酸根（M6P) 接受器導引到溶素體細胞内，其與存在於酶外決定酵素去向的寡糖殘基一 M6P結合，被導引到溶素體的隔間内。（Kornfeld，S. and Mellman，I，乂⑽· Ce"· 5ζ·ο/· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5:483-525，1^89)。一開始的作用發生在高基氏體，結合到高基氏體M6P接受器的酶會被分泌並輸送到溶素體。第二個步驟的作用是發生在細胞外的α-gal A及細胞膜表面的M6P接受器之間。被細胞吸收進來的細胞外物質會被細胞質内的小泡輸送，然後再與初級溶素體融合，將其内部的物質釋出到溶素體内。在此過程，細胞膜表面的M6P接受器也會被納入細胞内的小泡裡，然後運送到溶素體。存在細胞外環境的a -gal A若含有M6P殘基則可與細胞膜外的M6P接受器結合，然後經由接受器運送到溶素體的隔間内。一但經此清除劑途徑（scavenger pathway) 進入溶素體的隔間内，此酶即可行使其i|當的功能。因此，即使細胞因為基因缺失而無法製造a -gal A，只要（a) 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（I4) 酶可被適當的糖化且（b)缺失的細胞帶有M6P接受器，仍然存有一種機轉可以使用外來環境產生的酶。在Fabry疾病中，腎臟及心臟的管狀内皮細胞已經被証實因組織型態異常而導致臨床的病徵；該等帶有 M6P接受器的細胞特別是本發明專利範圍内的特徵之一。根據本發明所製造出來的α-gal A可藉由基因療法（即經基因改造過的細胞，其可在病人體内表現並分泌出糖化的酶），或傳統的藥學給藥法，經由局部或系統性地傳送到受影響的細胞内。根據本發明之一種存在於N-聯結募糖的M6P的α-gal A在治療上是特別重要的。此外，藉由sialylation修改N-聯結寡糖的M6P的 a -gal A的程度也是極重要的，若沒有適當的sialylation 則a -gal A將會因與肝asia糖蛋白接受器結合，然後被肝細胞所吸收及分解，而被迅速地清離循環過程（Ashwell and Harford，^(狀· 51:531-554，1982)。此疾經濟部中央梂準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 病中可與如腎臟或心臟的血管内皮細胞之Μ6Ρ接受器結合的α-gal Α含量減少，導致Fabry疾病在臨床上出現的病徵。令人驚訝的是本案發明人已經發現可以藉由經過穩定轉植且具有糖苷化性質的人類細胞分泌出a -gal A，然後將純化的分泌蛋白以基因療法或傳統的給藥方式治療Fabry病人。這是有關於研究最多的溶素體酶，葡萄糖苷分解酶，將由人類血漿所純化出的酶或轉植的 CHO細胞所分泌的酶傳送到體内受損的細胞内需要在酶純化後進行極複雜的酶修飾（參考Beutler，五叹/· J· 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（15)

Med. 325:1354-1360, 1991) 〇根據本發明一般有兩種進行的方法：將由經過基因改造而可大量表現及分泌酶的培養人類細胞所穫得的足夠治療量的純化的人類α-gal A導入病人體内，或將可大量表現及分泌酶的培養人類細胞本身直接導入病人體内。完成基因改造所需的技術，純化的方法，配方，以及治療方法將描述於下。例一：製備及使用用來傳送及表現α-galA的構築建立兩種表現的質體：pXAG-16及pXAG-28，該等質體包括編碼有人類α-gal A酶的398胺基酸的人類α -gal A cDN今(無人類α-gal Α訊號胜）；被hGH基因的第一插入子序列所插入的人類生長激素（hGH)訊號胜基因組DN A序列；及含有一段用以聚腺苷酸基化的訊號的 hGH基因的3’不轉譯序列（UTS)。質體pXAG-16含有人類細胞巨病毒immediate_early(CMV IE)啟動子及第一插入子（連接未編碼的表現子序列），而pXAG-28則是由膠原蛋白Ια2啟動子所驅動，且其也含有包括/3-肌動蛋白基因第一插入子的点-肌動蛋白基因5’端UTS。 Α.選殖完整的α-gal A cDNA並構築α-gal Α的表現質體pXAG-16 人類α-gal A cDNA是由人類纖維母細胞的cDNA 基因庫選殖而來，此基因庫構築之方法i下所述。聚腺苷酸訊息核糖核酸（mRNA)是由總核糖核酸中分離出來， 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面，之注意事 1· ▼項再填」裝丨I 寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585919 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W) 而cDNA的合成是利用供；l ZapII®系統使用的反應劑以及廠商的指示進行的（Stratagene Inc·，LaJolla，CA)。簡單的說，”第一股”cDNA是在含有内部的Xhol限制内核酸酶位置的〇lig〇-dT引子存在環境下，經由反轉錄而獲得。然後，再以RNAase Η處理之，此cDNA被DNA聚合酶I以缺口轉譯（nick-translated)方式製造雙股cDNA。此雙股cDNA並以T4 DNA聚合酶製成鈍端，然後再與 EcoRI轉接器（adapter)接合。此連接後的產物再以T4 DNA激酶處理，然後以 Xhol 切開。cDNA以 Sephacryl-400色層分析管柱加以分離，並收集含有大尺寸及中尺寸的分離液，然後與被EcoRI及Xhol切開的 AZapII臂相黏接。此黏接後的產物接著被包裝及滴定。原始的基因庫含有1.2xl07pfu/ml的滴定量，其平均插入的大小為925鹼基對（bp)。

一個由人類a -gal A cDNA表現子7而來的含210 個鹼基對的探針被用來分離此cDNA。此探針本身是由基因組DNA藉PCR所製備，其所用的引子為5、 CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3’(01ig〇l ;序列 ι〇 ΝΟ:1)及 5，-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3’。此 PCR 產物被用來篩選纖維母細胞cDNA基因庫，正性的純群化細胞（clone)分離出來後要經過進一步的特性分析。一個正性的純群化細胞嗜菌體3A，是根據廠商的指示以入 ZapII® 系統切除步驟（Stratagene Inc·，LaJolla，CA)處理之，根據此步驟所獲得的質體PBSAG3A是含有α-gal A 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I I I I IIT- {請先闊讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 585919 A7 _B7___ 五、發明説明（17)

cDNA序列的pBluescriptSK_TM質體骨架。此質體的DNA 序列並不含有完整的5’端的cDNA序列。因此，需利用 PCR由人類的基因組DNA放大片段再次構築5’端，利用弓丨子 5，-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3，（〇lig〇 3)及 5，-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3，（01igo 4)完成放大後便可得到一段含268個鹼基對的基因組片段（圖2，序列 ID NO20)。此片段接著被^欠複殖於”TA”選殖質體内 (Invitrogen Corp·，Saan Diego，CA)，並得到一質體一 pTAAGEI。含有大部份a -gal A cDNA序列質體的

pBSAG3A，及包含α-galAcDNA的5’端序列的pTAAGEI 每一個皆以限制酶SacII及Ncol切除。放大後DNA片段内的Sacil及Ncol的切除位置如第2圖所示。由 v pTAAGEI所切下的0.2 Kb SacII-NcoI片段分離後’與切過的PBSAG3A黏接。質體pAGAL含有完整α-gal A cDNA序列，包括編碼有a-gal A訊號胜的序列。此序列是完整的序列（如第3圖所示，包括a -gal A訊號胜；序列ID NO: 18)，且與公佈的人類a-gal A cDNA序列 (Genbank序列HUMGALA)完全相同。質體pXAG-16是藉由許多如下所述的媒介所構築。首先，pAGAL是以SacII及Xho切除，形，成鈍端；其次，含完整α-gal A cDNA序列的尾端與Xbal連接段黏接，然後次複殖於Xbal切過的pEF_BOS質體中（Mizushima et al·，#wc/· 心心义 18:5322, 1990)，建立 'pXAG-1 質體。此構築包含有人類顆粒細胞群落刺激因子（G-CSF)的 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） I--------0^------1T------0 (請先聞讀背面I之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 585919 A7 ___B7_ 五、發明説明（18) 3’UTS，以及旁邊編碼有a -gal A以及a -gal A訊號胜 cDNA的人類延長因子1 a(EF-l α)的啟動子，如α-gal A cDNA的5’端與EF-la啟動子相融合。為了建立一個帶有CMV IE啟動子及其第一插入子的構築，a -gal A cDNA 及G-CSF的3’UTS被由pXAG_l去除，以作為2 Kb的 Xbal-BamHI片段。此片段是鈍端，與BamHI連接段相黏接，然後被插入BamHI切除過的pCMVflpNeo質體内 (由如下所述之方法所構築），其方位如a -gal A cDNA5 ’ 端是被融合於CMV IE啟動子的區域内。

pCMVflpNeo質體是以如下所述之方法構築。一 CMV IE基因的啟動子片段是以CMV基因組DNA當作模板，以 5’-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3, (序列 IDNO:23)及 5，-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGA03,(序列ID NO:24)當作引子，經過PCR被放大。得到的產物 (一個1.6 Kb的片段）以BamHI切除後，得到一段與 BamHI切除端互補相連接的含CMV啟動子的片段。該 neo 表現單元是由 pCMVflpNeo 質體（Stratagene Inc.，La Jolla，CA)所分離出來的一段大小為1.1 Kb的Xhol-BamHI片段。然後，含CMV啟動子及neo的片段被插入於經BamHI及Xhol切過的質體（pUC12)中。值得注意的是含有CMV啟動子IE區域的pCMVflpNeo質體開始於核苷酸546,終止於核苷酸21〇5(屬於Genbank序列 HS5MIEP)，而由肝複合病毒（HSV)胸腺嘧啶激酶啟動子 (Tkneo基因）所驅動的抗neomycine的基因立即與CMV 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央揉準局員工消费合作社印製 585919 A7 B7 _ 五、發明説明（19) IE啟動子片段的5’端相連。Neo基因的轉錄方向與CMV 啟動子片段相同。此中間構築稱為pXAG-4。為了加入 hGH 3，UTS，GCSF 3’端的 UTS 由 pXAG-4質體被移除，成為一 Xbal-Smal片段，並使pXAG-4 質體成為鈍端。hGH 的 3’UTS 由 pXGH5(Selden et al·，她/. 6:3173-3179, 1986)被移除，成為一段大小為0.6 Kb的Smal-Ecorl片段。使該片段形成純端後，立即與pXAG-4的Xbal的純端相黏接，形成一中間物 PXAG-7cTkneo片段被移出此質體後，形成一 Hindlll-Clal片段，且以DNA聚合酶I的Kleno片段進行填入 (filling-in)，使此質體的尾端形成鈍端。而由SV40前期啟動子所驅,的抗neomycine的基因與由pcDNeo質體 (Chen et al·，Mo/· Ce//w/ar 价〇/· 7:2745-2752，1987)所切下的鈍端Clal-BsmBI片段相黏接，將neo轉錄單元以同於a -gal A轉錄單元的方向安置，此中間構築稱為 pXAG-13。為了完成pXAG-16，含有26個胺基酸的hGH訊號胜的編碼序列及hGH基因的第一插入子，pXAG-13上的一段2.0 Kb的EcoRI-BamHI片段必須被移除。此片段包括α-gal A的cDNA及hGH的3’UTS。此大片段是被3個小片段所置換：第一個片段是由pXGH5的0.3Kb 的PCR產物所組成，包含有hGH訊號胜的編碼序列及 hGH基因的第一插入子序列’由位在Kozak上游的 consensus序列之合成的BamHI位置到hGH訊號胜的編 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠] ---------------IT------φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印裝 585919 A7 B7 五、發明説明（20) 碼序列的尾端。下列的寡核苷酸是用來放大此片段（片段 l).5，-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3，(01igo hGHlOl ;序列 ID N0:5) 及 5，-TTTTGCCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3,（Oligo hGH102 ; 序列ID NO:6)。第二個片段是由包含α-gal A c-DNA之開始398個胺基酸到Nhel位置之PCR產物所組成（缺乏α-gal A訊號胜），其大小為027 Kb。下列的寡核苷酸是用來放大此片段（片段 2): 5’- TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3，(01igo AGIO ;序列 ID NO: 7)及 5，-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3,（Oligo AG11 ;序列IDNO: 8)。第3段是由含剩餘的α-gal A序列及hGH 3 ’UTS之質體一pXAG-7的Nhel-EcoRI片段所組成（片段3)。片段1(以BamHI及Nael切離），片段2(以PvuII及 Nhel切離），片段3與6.5Kb之含neo基因及CMV IE啟動子的pXAG-13的BamHI-EcoRI片段混合，經黏接後得到 pXAG-16。 B.構築α-gal A的表現質體pXAG-28 人類膠原Ια-2起動子是被分離出來以用來構築α-gal Α的表現質體pXAG-28。一段408鹼基對的含部份人類膠原Ια-2起動子的人類基因組DNA的PCR片段是以下列的募核苷酸序列分離出來：5’- TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3’(01igo 72;序列 Π) NO: 9)及 5，-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3,（Oligo 73 ; 序列 ID NO: 10)。 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁) 罗裝·

-、1T 585919 A7 __ B7_ 五7發明説明（21 ) 〜 ~ 此片段是用來篩選在EMBL3的人類白血球基因庫 (Clontech Inc.，Palo Alto，CA)。一個含有一段 3 8 Kb 大小的EcoRI正性聚落（phage 7H)經分離及純群化後，被複殖於 pBSIISK+質體（Stratagene Inc·，La J〇lia，CA)内的

EcoRI位置（在PBS/7H.2下建立）。一個Avrm位置被導入以 Spel 在 pBSIISK+polylinker 處切過的 pBsiISK+内，並利用DNA聚合酶I的Klenow片段填補，然後插入 5’-CTAGTCCTAGGA_3’（序列 ID NO: 11)。此變異的 pBSIISK—以BamHI及Avrll切割，然後與如前所述之原本含408個鹼基對的膠原蛋白Ια 2啟動子的PCr片段中的121個鹼基對的BamHI-AvrII片段黏接，建立 pBS/121COLv.6。經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 4· 此 pBS/121COL.6 接著以 Xbal 在 pBSIISK+的 polylinker序列切割，並利用DNA聚合酶I的Klenow 片段填補，然後再用Avrll切割。3·8 Kb大小之PBS/7H.2 的BamHI- Avrll片段分離出來後，該BamHI位置以Kleno 片段處理後形成鈍端。之後，將此片段以Avrll切割然後黏接，形成Avrll切割過的質體；然後，建立一含有膠原蛋白啟動子的質體一pBS/121bpC0L07H.18。下一步，膠原蛋白啟動子與含人類,谷_肌動蛋白第一插入子的人類冷-肌動蛋白基因的5’端的UTS相融合。為了分離出此序列，使用下列的寡核苷酸序列：5’-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3，(01igo BA1 广序列 ID NO:12)， 5,-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3, (Oligo BA1 ； 24 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 __B7_：_ 五、發明説明（22) 序列ID N0:12)，由人類基因組DNA分離出一段大小為 2 Kb的片段。此片段以BamHI及BsiHKAI切割，以釋放出一段大小為0·8 Kb且含有/5-肌動蛋白基因的5’端的UTS的片段。一段大小為3.6 Kb的Sall-SrfI片段是由含膠原蛋白啟動子的質體一pBS/121bpCOL07H.18中分離出來。 pBS/121bpC0L07H.18 特別用 BamHI(此 BamHI 位在膠原蛋白Ια2啟動子的5’端）加以切割，然後以Klenow片段處理以製備鈍端，之後再以 Sail連接者（5、 GGTCGACC-3’）黏接，於膠原蛋白Ια2啟動子的上游置放一 Sail位置。此質體接著以Sail及SrfI(此Srfl位置是位在膠原蛋白Ια2啟動子的CAP位置的上游110鹼基對處），將3.6 Kb大小的片段分離出來。0.8和3.6 Kb 大小的片段與 Sall-BamHI 切過的 pBSIISK(Stratagene Inc·， La Jolla，CA)結合，並與下列四種核苷酸所組成的片段黏接在一起(形成一個具有鈍端及BsiHKAI尾端的片段》5’GGGCCCCCAGC CCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGG GCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3,（Oligo COL-1 ;序列 ED NO:14)，經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5，- AAATAGGGC AGATCCGGGCTTTATTATTTTAGC ACC A CGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3X〇ligo COL-2 ；序列 IDNO:15)，5，-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTT CCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCCAATGGG AGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3,（Oligo COL-3 ;序列 ID NO:16)， 5,-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGT-3, 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 585919 A7 B7 五、發明説明（24 ) 纖維母細胞的α-gal A分泌量之範圍約為2-10 units/106 cells/24 hours。比較之下，轉植的纖維母細胞的平均表現含量則顯示於表一：表一平均α-gal A的表現含量（土標準偏差） pXAG-13 420±344U/106 cells/day，N=26 可純群化系（範圍 3-1133 U/106 cells/day) pXAG-16 2,051± 1253U/106 cells/day，N=24 可純群化系（範圍 422-5200 U/106 cells/day) pXAG-28 141 ±131U/106 cells/day，N=38 可純群化系（範圍 20-616 U/106 cells/day) (請先鬩讀背面r之注意事項再填寫本頁) 此數據顯示這三個表現構築都比未轉植的纖維母細胞增加數倍的α-gal A表現含量。以編碼有連接訊號胜的α-gal A之pXAG-13穩定轉植的纖維母細胞之表現含量比以pXAG-16轉植的纖維母細胞較低，其差異處在於訊號胜是hGH的訊號胜，而其編碼序列是被hGH基因的第一插入子所終斷。經濟部中央梂準局貝工消费合作社印製轉植有質體的細胞經過每次的覆殖後，都偵測其分泌α-gal A的活性，計算細胞數，以及細胞密度。根據所收集的細胞數目及分泌a -gal A所花的時間，偵測α -gal Α的特一表現率，以（a -gal Α的）分泌單位/106 cells/24 hours方式報告於表二.及表三中。所描述之用以基因治療或獲得純化a-gal A的材料的細胞應該可以穩定的成 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919

7 B 五、發明説明（25 ) 長，且經過數代後仍可表現。由以a -gal A表現質體 pXAG-16穩定轉植過的細胞系戶斤獲得的數據顯示於表二及表三，其顯示α-gal A的表現在經過數代的連續複殖後仍可穩定的維持。表二：含α-gal A表現質體pXAG_16的BRS-11細胞的成長及表現 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表三··含a_gal A表現質體pXAG_16的HF503-242細胞的成長及表現. HF503-242 代數表現（units/106/cells/24 hr) 細胞密度（cells/cm2) 5 4069 2.8〇χ104 6 7585 3.55χ104 7 5034 2048χ104 D. a -gal A表現含量的定量 a -gal A 的活性是利用水溶性受質：4-methylumbelliferyl-a-D-galactopyranoside (4-MUF_gal ; 28 • BRS-11 代表現（units/106/cells/24 hr) 細胞密度數 (cells/cm2) 13 2601 4.8χ104 14 1616 4.8xl04 15 V 3595 4.8χ104 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠）經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 585919 A7 ____ B7_ 五、發明説明（26 )

Research Pro duct, Inc·)以如 Ioannou et al·，所述的改良步驟〇/· CW/·万Μ/· 119:1137-1150，1992)加以測量。此受質是溶於濃度1·69 mg/ml(5 mM)的受質緩衝液中（〇·ΐ Μ檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH 4.6)。一般是取10//1的培養液上清液加到75"1的受質溶液中，然後在有蓋子的管子裡於37°C的水浴環境下培養60分鐘。然後在培養末期加入2 ml的苷胺酸-碳酸鹽緩衝液（130 mM苷胺酸，83 mM碳酸鈉，pH 10.6)終止其反應。每個樣品的相對螢光強度是以型號 ΤΚ0100 螢光儀（Hoefer Scientific Instruments)加以測量，其激發波長固定在365 nm，而放射波長固定在460 nm ;樣品的讀值與一個1 // Μ的 methylumbelliferone(Sigma Chemical Co.)標準液比較，然後計算水解的受質含量。a -gal A的活性是以units加以表示；一 unit的a -gal A活性等於1 nM的受質在37 °C環境下每小時的水解量。細胞表現的數據一般是以分泌的a-gal A活性單位/106細胞/24小時來表示；此分析也用來測量被分解的細胞内的α-gal A活性及如下所述之經由不同α-gal A純化步驟所獲得的樣品。例II.純化培卷液中的穩定轉植過的人類細胞系的α-gal A 例IIA-IIE顯示可由純化培養液中的穩定轉植過且可製造此效素的人類細胞系中純化近乎同質性的a -gal Α 〇 Α·使用丁基Sepharose®色層分析管作為純化a -gal 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) >裝· 訂經濟部中央標準局員工消费合作社印装 585919 A7 B7 五、發明説明（27 ) A的步驟低溫的培養液（1.34 L)先經過離心後再使用連接一玻離纖維組成之預過濾器的〇·45//πι孔洞大小的纖維醋酸鹽過濾器過濾雜質。然後，邊授拌邊逐滴加入1Ν的 HC1，調整低溫過濾液的ΡΗ值，並且逐滴加入3.9 Μ超及純的硫酸胺溶液（室溫）所構成的標準溶液，直到最後之濃度為〇·66 Μ。此培養液益於4°C下攪拌培養5分鐘，再以前面所述之方法過濾之。然後，將過濾液施加於已經以含有〇·66Μ的硫酸胺（緩衝液A)之pH 5.6，10 mM MES-Tris平衡過的丁基Sepharose^快速流動管柱（81 ml 管柱體積），2·5 X 16.5cm ; Pharmacia，Uppsala，Sweden) 〇此色層分析#柱是在Gradi-Frac™系統中，並搭配分別用以偵測全蛋白質濃度及鹽濃度的線上UV(280 nm)及傳導監視器，在4°C環境下進行。在樣品以低速10ml/min 施加時，此管柱以10倍於管柱體積的緩衝液A沖洗之。 a-gal A由帶有14份管柱體積由緩衝液A(含硫酸胺）到 10mM MES-Tris，pH 5·6(無硫酸胺）構成線性梯度的丁基 Sepharose®4快速流動管柱中被沖堤出來。分離液接著以 4-MUF-gal分析法分析a -gal A的活性，提昇其中所含的可鑑識效素的活性。如第6圖所示，及表四的純化結果總結，經過此純化步驟後，可去除99%的汙染蛋白質（預過濾管柱樣品=8.14g全蛋白；後過濾管柱樣品=〇.〇638 g 全蛋白）。 ' 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面 r之注意事項再填寫本頁) ►裝- 訂 585919 A7 B7 發明説明（28 ) 表四：由特定狀況的培養液中的經穩定轉植過的人類纖純化步驟體綱全蛋白專一活純祕數 --- 回覆百分比 (XltAmits) (mg) (X 10\iniistog) (累積量） (%)_ 培養上清液 1340 14.6 81.40 0.0018 =1 = 100_ 丁基-Sepharose® 417 14.1 63.8 0.221 123 —----- 96.6_ 肝素-Sepharose® 134 12.1 14.6 0.829 436 -------- 對氫氧基磷灰石 47 9.73 4.46 2.18 1220 66.6 一 Q Sepharose® 31.5 8.91 3.31 2.69 1503 6lA_- Superdex® 10 8.58 2.93 2.92 1634 59jl〇__ ϋΊϋ 1_= Ϊ · - II1 II —ϋ —ϋ— I (請先閱讀背面乏注意事項存填寫本頁) B·使用Heparin Sepharose®色層分析營作為純化α-gal Α的步驟丁基Sepharose®色層分析管波峰的分離液於4°C環境下透析，對抗4L的10 mM MES-Tris，ρΗ5·6(改變〆次）。透析液的透析度視需妻可在4°C環境下以加入Η2〇或NaCl方式，調整在1.0 mMHO。然後，將樣品施加於已經以含有9mMNaCl(緩衝液B)之10mMMES_Tris ， pH 5·6之平衡過的Heparin Sepharose®6快速流動管枉 (Pharmacia，Uppsala，Sweden ; 29ml 管柱體積，2.5X6 cm)。此色層分析管柱是在Gradi-Fracfi^^統搭配分別用以偵測全蛋白質濃度及鹽濃度的線上的UV(280 nm)及傳導的監視器，在4°C環境下，以1〇 ml/min流速進行。在樣品被施加於管柱後，此管柱以倍於管柱體積的緩衝液B沖洗之，接著再以3份管柱體積的線性梯度到8% 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）訂經濟部中央標準局員工消费合作社印製 585919 A7 ____B7_ 五、發明説明（29 ) 緩衝液C/92%緩衝液B (其中緩衝液C是1〇 mM的 MES-Tris，pH 5.6，含 250 mM NaCl)，及 10 倍管柱體積的8%緩衝液C沖洗之。然後，以ΐ·5倍於管杈體積線性梯度到29%緩衝液A及後續的10倍體積線性梯度到 35%緩衝液將a-gal A沖堤出來。分離液接著分析a_gal A 的活性，提昇分離液中所含酶的可鑑識活性。 C·使用Heparin Sepharose®色層分析管作為祕jb gal Α的步驟經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Heparin池被用來過濾及直接施加於已經以imM磷酸鈉，pH 6·0(緩衝液D)平衡過的Ceraamic對氫氧基磷灰石 HC 管 _ 裡（40 " m; American International Chemical， Natick，MA ; 12ml的管柱體積，Ι·5χ6·8 cm)。此色層分析管柱是在室溫的配備有線上UV(280 nm)及傳導監視器的雜父 Gradi-FracTM/FPLC(g^ 統中（Pharmacia，Uppsala， Sweden)進行的。在樣品以低速10ml/niin施加時，此管柱以10倍於管柱體積的緩衝液D沖洗之。a-gal A由帶有7份管柱體積線性梯度到42❶/❶的緩衝液E/58〇/。缓衝液 D(其中緩衝液e是250 mM磷酸鈉，pH 6.0)，及後續的 10倍管柱體積到10mM梯度到52%的轉衝液E所沖堤出來。接著分析分離液中的〇： -gal A的活性，提昇分離液中所含酶的可鑑識活性。 Q Sepharose^险離子交換樹脂’色層分也fcil 為純化a -gal A的步驟 32 本紙張;^適用中國國家榡準（CNS )八4胁（2i〇x297公瘦） 585919 A7 _____B7 五、發明説明（30) 對氫氧基磷灰石池在室溫下經水適當的稀釋1.5 倍，使其最後導電度為3.4-3.6 mMHO。過濾後，樣品被施加到已經以10%的緩衝液G/90°/〇緩衝液F平衡過的Q Sepharose®HP管柱中，其中緩衝液F是25 Μ的磷酸鈉， pH 6.0,而緩衝液G為25 Μ的磷酸鈉，pH 6.0,及250 mM NaCl。此色層分析管柱是在室溫，配備有線上UV(280 nm) 及傳導監視器的雜交 Gradi-FracTM/FPLC®系統中 (Pharmacia，Uppsala，Sweden)進行的，全蛋白的濃度及鹽濃度是以線上螢幕加以監控。此樣品以低速5 ml/min 施加時，然後以下列的步驟加以進行：（1)以5倍於管柱體積的10%緩衝液G沖洗，（2)以7倍於管柱體積的12% 緩衝液G沖洗，（3)3倍於管柱體積線性梯度到50%的緩衝液G，（4) 10倍於管柱體積線性梯度到53%的緩衝液 G，（5) 3倍於管柱體積線性梯度到100%的緩衝液G，（6)10 倍於管柱體積線性梯度到100%的緩衝液G。α-gal A主要是在步驟3及4中被沖堤出來。提昇分離液中所含酶的可鑑識活性（“Q池”）。經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁) E.使用Superdex®-200膠質過濾的色層分妍瞢作為、純化> a -gal A的步驟使用 Centriprep®· 10 離心機（Americon，Brverly，ΜΑ) 將Q池適當地離心濃縮約5倍，然後施加到已經以含有 150mMNaCl的25 Μ的磷酸鈉，pH 6.0平衡及沖堤過的 Superdex® 200管柱。此色層分析管柱是在室溫，配備有線上UV(2870 nm)及傳導監視器的雜交Gradi-FracTM/FPLC® 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐] " 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 585919 A7 B7 五、發明説明（31 ) 系統中（Pharmacia，Uppsala，Sweden)進行的，全蛋白的濃度及鹽濃度是以線上螢幕加以監控。施加到管柱的體積小於2m卜其流速為〇.5ml/min，部份分離液的體積為 0.5ml/min。進行多段式管柱的循環。部份分離液是用以分析a-gal A的活性，提昇分離液中所含酶的可鑑識活性。參以Centriprep-ΙΟ將由Superdex®200管柱所得到的分離液離心濃縮，並將濃縮液訊速冷凍，並在-80°C的環境下短暫儲存。關於α-gal A純化例子之結論顯示於表 3中。α-gal A最後的產率約為啟始原料活性的59%，且純化產物的專一活性為2·92 X 106 units/mg蛋白質。所得的產物在p原的環境下，經過4-15%的SDS-PAGE電泳，及後續的銀染後，顯示具有高純度。

例III配方及儲存純化的a -gal A 高度純化的a -gal A當以純化蛋白質的稀釋溶液（$ 1 mgprotein/ml)方式儲存時，並不適合延長儲存。因此，一種在延長儲存時可改善穩定度的配方被發展出來，如延長儲存時間數周到至少數個月。純化的酶使用離心機 (在25 mM的磷酸鈉所組成的酶緩衝液J濃縮到至少1 mg/ml;然後加入人類血清白蛋白，其最後濃度約為2.5 mg/ml。然後以連接於針筒的0·2//ιη孔洞大小的纖維醋酸過濾器（Schleicher and Schuell)過滤蛋^質溶液。此α _ gal Α溶液分佈於滅菌的無pyrogen存在的儲存管裡，並 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - (請先聞讀背面乏注意事項再填寫本頁)

、1T 585919 五、發明説明（32 )以鐵弗隆蓋子封口，訊速冷凍，然後儲存在-2(TC。 «-gal A活性的穩定度是在超過三個月的期限後，再以4-MUF-gal分析法加以偵測。表五中的數據顯示經過測試的期間後，酶的活性並未損失，配方酸性的pH 值（<6·5)是高度純化酶穩定度的關鍵。樣品專一性活性行（Units/mg全蛋白）時間0 2·24Χ 1〇6±〇·33 X 106 第一周 2·40Χ 1〇6±〇·25Χ 106 第二周 2·42Χ 106±0·21 X 106 Λ^Γ rpt 弟二周 2·37Χ 106±0·05Χ 106 第一個月 2.39Χ 106±0·16Χ 106 第二個月 2.31 X 106±0.26Χ 106 第三個月 2·29Χ 106±0·17Χ 106 (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁) |裝_ ,ιτ 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印裂例IV :人類細胞系產生的α _gai a適合用來治療a -gal A 缺失的病人根據本發明所製備之純化的人類α-gal A的結構及功能特性需被偵測，以證實在此所述的DNA分子及轉植過的人類細胞系所表現的糖化蛋白質分別可被用來基因治療或酶置換治療。 A.培卷的穩定棘埴過的人類細胞系產生的α-gal A 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 __B7 _ 五、發明説明（33 ) 的大小 α-gal A的分子重量是以MALDI-TOF質譜儀加以偵測，其結果顯示此分子的雙聚合物為102,353道爾吞 (Da)，然其單元聚合物為51，002(Da)。根據胺基酸組成所預估的單元聚合物重量為45,400(Da)。然而，其被推測可能是因為酶所含的碳水化合物分子量超過5600 Da。經過標準胺基酸分析後，可痛定經由轉植過的人類細胞產生且經過純化的蛋白質與經由人類組織所得到的純化蛋白質的胺基酸組成完全相同。 B.藉由穩定轉植人類細胞修飾α-gal A之N端經濟部中央標準局員工消费合作社印装 (請先鬩讀背面-之注意事項再填寫本頁) 人類a -gal A之cDNA序列編碼有429個胺基酸， N端的31，胺基酸構成訊號胜，其在原生蛋白質進入内質網膜的過程中被切除（LeDonne et al·，Arch. Biochem· Biophys. 224:186，1983;Lemansky et al·，J· Biol. Chem· 262:2062，1987)。為了確認a-gal A在非同源訊號胜（例如人類的生長激素的訊號胜）的作用下會經過適當的程序，且在轉殖的人類纖維母細胞中表現，必須微檢序 (microsequenced)分泌蛋白質的N端10個胺基酸序列。樣品經過SDS-PAGE電泳後，再利用10mM的CAPS(pH 11.0)及10 %的甲醇緩衝液系統轉移到？roBlott®(ABI， Foster City，CA)。經過孔雀藍染劑（Comassive Blue)染色後，可看到ProBlott®中的蛋白質，以及一段適當尺寸的帶被剪下來，其大小為50 KD。N端鉍胺基酸序列可利用Applied Biosystem的脈衝-液相胺基酸序列儀加以 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 585919 A7 B7_ 五、發明説明（34 ) 分析，所獲得的胺基酸序列：LDNGLARTPT(序列ID NO:28)是將訊號胜適當切除而得，其與分泌蛋白質的N 端胺基酸序列穩合。由穩定轉植人類細胞修飾a_gal A之根據本發明的所製造分泌出來的α-gal A的C端胺基酸序列是利用自動的Hewlett Packard C端序列儀加以分析，其結果顯示C端的亮胺酸殘基與根據DNA序列所推測的相穩合。 D.碳皮彳h合物倐飭由穩定轉植人類細胞所製选iLg

=^aLA 根據本發明所製造的被葡萄糖化的a -gal A被提出。適當的糖化在體内對α-gal A的活性是很重要的； a -gal A在未糖化的系統下是不具活性或不穩定的 (Hantzopolous et al_，Ge邮 57:159，1987)。糖化反應對於體内的α-gal A要送到標的細胞的過程也是重要的，而且會影響酶在體内循環過程中的半生期。每一個a-gal A 的次單元都具有四個可供天冬醯胺連接的碳水化合物鏈的加成位置，其中只有三個是被佔據的（Desnick et al·， The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, pp 2741-2780, McGraw Hill，New York，1995)。由穩定轉植人類細胞所製造的α-gal A的樣品被以由儿wrq/bcie似所分離出來的神經胺分解酶（8(^1^叫61> Mannheim，Indianapolis，In)處理，去除唾液酸。此反應 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ITAw~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 585919 A7 B7 五、發明説明（35) 是以5 // g的a -gal A及1 OmU的神經胺分解酶在總體積 10/zl的醋酸鹽緩衝生理食鹽水中（ABS，20mM醋酸鈉， pH 5.2, 150 mM氣化鈉），於室溫環境處理過夜。由穩定轉植人類細胞所製造的純化的a -Sal A也是由鹼式磷酸分解酶（牛小腸鹼式磷酸分解酶，1306111^1^^-Mannheim，Indianapolis，In)進行去麟酸反應，以 5//g 的 α-gal A與15U的鹼式鱗St!分解酶在ABS(pH值以1M 的Tris升到7.5)中，於室溫環境處理過夜。此樣品是利用專一於α-gal A的抗體，以西方墨點法加以分析。此分析用的抗體是一種兔子的多株抗胜肽的抗體，其是利用一段α-gal A胺基酸序列68-81的胜肽作為免^疫原，然後再將免疫蛋白轉移到 PVDF(Milliporee，Bedford, MA)，此膜是以 1:2000 稀釋過的2.5%墨點溶液（將脫脂奶粉溶於20mMTris-HCl， ρΗ7·5，0.05%的Tween-20)中的抗血清當作探針。接著，再以羊的抗兔子並連接有嫜菜過氧化酶免疫球蛋白 G(IgG)(Organon Teknika/Cappel，Durham，NC; 1:5000 稀釋）以及ECL化學螢光試藥組加以偵測（Amersham， Arlington Heights，IN) 〇以神經胺分解酶處理a -gal A後，會導致其分子量 f 有些微的變動（約1500-2000 Da或4-6唾液酸/單元），此結果建議唾液酸的存在與廣泛的α-gal A修飾有關。為了參考，血漿形式的a-gal A具有5-6褊唾液酸殘基/單元，而血清形式的α-gal A具有0.5-1.0個唾液酸殘基/ 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) I I I ^ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 585919 A7 B7 五、發明説明（36 ) 單元（Bishop et al·，J· Biol· Chem· 256:1307, 1981)。其它用來檢查唾液酸及甘露糖6-麟酸鹽對a-gal A 修飾的方法是等電位聚焦法（IEF)，其中樣品是根據其等電點（pi)或淨電荷加以分離。因此，從α-gal A上去除帶電的殘基如唾液酸及磷酸根將是被用來改變此蛋白質在 IEF系統中的位移度。為了進行IEF實驗，根據本發明所製造出來的a-gal A樣品先以神經胺分解酶及鹼式磷酸分解酶處理，並與 2X的Novex樣品緩衝液（帶有8M的尿素，pH 3.0-7.0) 以1:1的比例加以混合，然後充填到以Pharmalyte® (Pharmacia，Uppsala，Sweden ; ρΗ3·0·6·5 ; Pharmalyte⑧4_ 6.5及2.5-5.5，每種膠0.25 1111)製備的6]^尿素比？膠（5.5% 的聚醯胺）中，等電點的標準液（Biol-Rad)也包括在内。電泳後，此膠被轉移到PVDF，然後再以前述的西方墨點法進行分析。由穩定轉植的人類纖維母細胞所產生的α-gal A具有三種pi值範圍在4.4-4.65的主要異構物，這些值與血漿中及騰臟中的a _ gal A的pi值相同（Bishop et al.，J. Biol· Chem· 256:1307，1981)。經過神經胺分解酶處理過的酶會增加這三個異構物的pi值，顯示此三者多少都會被唾液酸所修飾。這些數據顯示由穩定轉植的人類纖維母細胞所產生的a -gal A應該具有一設定的血漿半生期’其表示此物質是極適合在藥學上使用。此外，由驗式磷酸分解酶酶處理穩定轉植人類細胞所製造的純化α · 39 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Μ規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁) ▼裝- 訂 585919 ---——-- 五、發明説明（37) g a後也會增加部份蛋白質的w值到約5m，顯 4㈣有—㈣更多的甘露糖6·錢鹽殘基。此修飾對於將心gal A送到標的細胞時具有顯著的影響。 E.穩定轉植纖維母細胞所製造的純化a_gal A的專一活性、、屯化α-gal A的專一活性是根據酶的催化活性（利用 4#MUF gal分析法）及蛋白質的濃度加以計算，蛋白質之 /辰度可利用任何標準方法加以測量，如系統 (lercce)，或藉由測1其在28〇時的吸收度，使用 mg/m^肖光係數2·3(決定於胺基酸的分析），以計算其值。利用攻些技㉟，由特定培養液中的穩定轉植纖維母細胞斤製ie純化出來的α _gai a的專一活性約為X⑺6

UnhS/mg蛋白質，與由人類組織中所純化出來之a-galA 的比活性相當（Bishop et al·，；· Bi〇1 Chem 256•㈣ 1981) 〇 ’ F·甘露糖或甘露糖-6_磷酸鹽所導引的a_gai α内部化(internalization) 為了要將穩定轉植纖維母細胞所製造純化出來的α _gal Α作為一種有效的心gal Α缺失疾病的治療藥劑，此酶必須經過内部化將其傳送到要影響的細胞。 f生理的pH值環境下不具活性，且在血漿或腸液的環境下也不可能具有活#。其只有纟内部g溶酶體的酸性環境下，才會在累積的脂質受質中代謝掉。此内部化作本紙張尺度適用中國固家標準（CNS )以祕（210χ297公着

---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -m m m 0 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 585919 A7 ---—-----£Z____— —_ 五、發明説明（3δ ) 用是由α-gal A與甘露糖6-P(M6P)接受器結合後導引，此接受器在細胞膜表面表現，經由胞嗟途徑，用以將酶傳送到溶素體，且此M6P接受器是單一表現的，大部份的體細胞都有部份表現程度。甘露糖接受器是專一於暴露的糖蛋白中的甘露糖殘基，是較不普遍的。較晚發現的接受器一般只有在巨嗟細胞及像巨嗟細胞的細胞中被發現，並提供額外的方法使α-gal A可進入這些型態的細胞内。為了要證實M6P導引a -gal A的内部化作用，由 Fabry病人身上所獲得的表皮纖維母細胞（nIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)在濃度遞增的根據本發明所獲得的純化a -gal A存在下培養過夜。一些樣品含有5 mM的可溶性M6P，會與内部化用的甘露糖接受器競爭性的抑制結合；其它的樣品中含有30 v g/ml的甘露聚糖’會與内部化用的甘露糖接受器競爭性的抑制結合。接下來的培養則是將細胞洗過後，括下並收集於分姐緩衝液中（10 mM Tris ρΗ7·2，100 mM NaCl，5mM EDTAa， 2mM Pefablco™ ， (Boehringer-Mannheim， Indianapolis，ln)以及1%的NP-40)。被分解後的樣品然後進行蛋白質濃度測量及α-gal A之活性分析，其結果是以每mg的細胞蛋白質的a -gal A活性單位來表示。 Fabry細胞的a-gal A内部化反應是劑量依附形式（第7 圖），此内部化反應會被M6P所抑制，但卻不會被甘露聚糖所抑制。因此，Fabry細胞的a -gal A内部化反應是 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 585919 A7 B7 五、發明説明（39) 由M6P接受器所導引，而不是由甘露聚糖接受器所導引。 a -gal A在活體外也可藉由在處理Fabry疾病上極重要的標的細包一内皮細胞來進行内部化反應，人類的臍帶靜脈内皮細胞（HUVECs)被以7500單位的α-gal A 處理培養過夜；該些細胞有的含有M6P。培養過後，收集細胞並以前述之方法分析A -gal A。以a -gal A —起培養的細胞只有約10倍於對照組（未以α-gal A —起培養的細胞）的酶含量。M6P抑制了細胞内累積的a -gal A含量，此結果建議HUVECs之α-gal A的内部化作用是經由M6P接受器來導引。因此，根據本發明所得到的人類 α-galA可用於臨床相關細胞的内部化作用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁) 極少已知的培養人類細胞可表現甘露糖接受器，然而一種老鼠巨噬細胞相似的細胞株（J774.E)其帶有甘露糖接受器，但卻極少數可被用來偵測根據本發明所製造的須經甘露糖接受器導引的内部化作用之純化人類〇：-gal A(Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42:485-490, 1987)。J774.E細胞在10000單位/mla-gal A存在環境下培養過夜。被選的樣品含有2mM的M6P，而其它樣品則含有100 "g/ml的甘露聚糖。此細碑接著以上述之方法清洗收集，然後測量每一樣品的全蛋白質及a-galA 活性，其結果顯示於表六。M6P並未抑制這些細胞吸收 a -gal A，然而甘露聚糖則減少75%的a _gal A累積量。因此，a -gal A的内部化作用是由在特定細胞之細胞膜 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（40 ) 上所表現的甘露糖接受器所導引。表六· a -gal A在J774.E細胞的内部化作用 — + a -gal A + a -gal A + a -gal A + M6P +甘露聚糖 J774.E 409士25 6444士554 6297土674 1654土323 請先閲讀背乏注 [甘露聚糖]=1〇〇 # g/ml [M6P]=2 mM or 660 β g/ml 上述的該些實驗證實由穩定轉植過的人類細胞所製造的a_gal A可在甘露糖或甘露糖-6-磷酸根導引下被細胞内部化。 G.由人類纖維母細胞表現的α-gal A校正^^ 維母細胞為了基因治療，自體細胞所產生之a -gal A必須y 修飾過的酶形式種植到標的細胞内，以適當的修正a_gal A缺失的細胞。為了分析轉植的人類纖維母細胞所產& 的a-gal A對Fabry細胞的效應，將Fabry病人

Human Genetics Mutant Cell Repository)身上戶斤收 $ 到纖維母細胞與產生a -gal A的細胞系在

Transwell ②(Costar，Cambridge，MA)中一起培養，的步驟圖示於第8圖中。Fabry細胞培養於12孔的έ 培養皿中，其中有些含具有可供細胞生長表面的 '' 物 (Transwells，0.4 a m孔洞大小）。此插入物的生長義質β 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）項再 % % 本頁裝訂經濟部中央標準局員工消费合作社印簟 585919 A7 B7 五、發明説明（41 ) 孔狀的且允許巨型物質由上面環境經過下游環境。一組插入物含有普通的人類包皮纖維母細胞，其會分泌最少量的a -gal A，其它組則含有穩定轉植過的人類細胞系 BRS-11，其可分泌大量的a -gal A。在與產生a -gal A的細胞系中一起培養的培養皿中，a -gal A可進入Fabry 細胞所處的培養液内，並具有進入Fabry細胞内部的能力。 ’ 在表七中的數據顯示Fabry細胞將分泌的a-gal A 内部化，此細胞内部的a -gal A含量被觀測數天。該些獨自培養（未含插入物質）或在未轉植的人類包皮纖維母細胞存在下，其細胞内部的α-gal A活性極低；而與產生a -gal A吟細胞系（BRS-11插入物質）一起培養的Fabry 細胞，2天後則具有與正常細胞相同的α-gal A含量（正常的纖維母細胞具有25-80 units a -gal A/mg蛋白質）。經由M6P接受器吸收a_gal A之校正效應是由M6P的抑制加以證實（BRS-11插入物質+M6P)。 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 585919 A7 B7 五、發明説明（43 ) I·大量表現a _gal A細胞之給予如前所述之細胞可以經過不同的標準給藥程序被導入個體内’使其被定位，如腎小管，次胞器，中樞神經系統，椎管腔中，肝臟，腹膜腔，或在肌肉内。此細胞也可經靜脈注射或動脈注射進入個體的血管内。一但被種植到個體内後，這些轉植的將會製造並分泌出治療的產物一糖化的人類a -gal A。· 導入體内之經基因改造過的細胞數目是可以更動的，其可由熟悉此技藝者加以判定。年紀，體重，性別，以及每個病人的一般生理狀況，分佈的體積，可獲得生物活性之酶半生期，以及基因改造細胞的在體内的產率都是決定劑#以及計畫性給藥的主要判定考量。一般而言，使用一百萬及十億個細胞的表現量之範圍為1〇〇_ 100000單位/106細胞/每天。若需要的話，此步驟可以重覆或修改直到預定的結果，例如達到減輕Fabry疾病的病徵。如前所述，使用的細胞一般都是病人專一特性，如由個體所獲得用來轉植的主或次細胞，故該些細胞不會被病人的免疫系統所排斥。然而，若此舉是較不可行時，可由其它個體獲得基因改造的細胞，然彳年轉植到α _缺失疾病的病人身上。使用非接受者自艘的細胞時，將需要給予免疫抑制劑，以改變抗原的組織特異性，或使用障礙元件防止轉植的細胞被排斥。此障礙元件是由允許分泌的產物進入 ------IT------~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 585919 A7 B7 ________ 五、發明説明（44 ) 接受者循環系統的或組織的材質所構成（如膜，χΜ_5〇， Amiccm，Beverly，ΜΑ) ’但可其可避免轉植細胞與接受者的免疫系統接觸，故可避免接受者對該些細胞產生免疫反應（以及可能的排斥作用）。進一步的基因治療指導請參照 Selden et al.，(WO93/09222)。此細胞也可欲於基質或膠質中，如 U.S.S.N08/548/002中所述，其内容是描述使用雜交基質進行轉植，或如 Jain et al·，（PCT application W0 95/19430)) 所述，其内容是描述使用次細胞在親水性膠基質中的巨包被（macroencapsulation) 〇 J.供習知給藥方式用的a -gal A蛋白質的藥學配方 α-gal A蛋白質可在穩定轉植（或其它基因改造）的人類細胞内表現以及分泌，並利用在此所述之方法加以純化，然後施加到a-gal A蛋白質不足或缺失的個體身上。此蛋白質可在pH值6.5,被以藥學上可接受的攜帶者給予，如例III所述之配方。輔藥的例子可包括緩衝液如檸檬酸緩衝液、磷酸根緩衝液、醋酸緩衝液、以及碳酸鹽緩衝液，胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸素、磷脂、蛋白質如血清白蛋白及明膠、EDTA，以及聚乙烯苷油（如PEG-4000，PEG-6000)。給藥的方式例如為靜脈，動脈，皮下，腹膜，大腦内，肌肉内，肺内，或transucoal。給藥的週期及被傳送的蛋白質劑量是由熟悉此技藝者所決定。此外，熟悉此技藝者了解給藥的週期及被傳送的 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面乏注意事項再填寫本頁)

585919 A7 _B7_ 五、發明説明（45 ) 蛋白質劑量是可被調整的，直到最佳的治療劑量。一般而言，a -gal A的劑量約為0.01-100 mg/Kg體重。可預期的是固定且重覆的蛋白質劑量對於病人生命的延續是需要的。 K.酶缺失所引起的其它情況的治療除α-gal A酶外，可能>還有其它溶素體儲存酶缺失的情況發生，其可利用在此所述的方法處理治療。在這些例子中，編碼有具功能的缺失酶的DNA分子將取代如前所述之含編碼a-gal A DNA片段構築。酶缺失疾病的病徵確認後，便可利用如前所述之方法加以治療，其結果顯示於f 8。表中的資訊是取自E. Neufeld ⑽ 60:257-280, 1991)，其被併入參考文獻中。 (請先鬩讀背面乏注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（啟8·溶素體儲存酶失調總結經濟部中央標準局員工消费合作社印製缺失抱合脂降解失調 Fabry disease 主要缺失[次要缺失] α-半乳糖苷分解酶 Fabry disease 神經醯胺分解酶高歇氏症 Glucocerebrosidase GM1 gangliosidosis 冷-半乳糖苷分解酶 GM2 gangliosidosis 唐氏症 -己糖胺基分解效素，次己糖胺基分解效素A Sandhoff disease 己糖胺基分解效素，石-次己糖胺基分解效素A及B 活化者缺失 Krabbe disease Gm2活化者半乳糖醯化神經醯胺分解酶 Metachromatic leukodystropy 酶缺失型活化者缺失型 Arylsulfatase A Sulfatide activator/saposin Mucolipidosis IV 主要缺失未知 [Gangloside sialidase] 多重硫酸根分解酶主要缺失未知所有硫酸根分解酶缺失 Niemann-Pick disease Schindler disease 抱合髓磷脂分解酶 a -N-乙醯半乳糖胺基分解酶糖化蛋白降解失調 Aspartylglycosaminuria Fucosidosis Galactosialidosis Aspartylglycosaminidase a -L-fucosidase 保護性蛋白質/細胞自溶酶 [冷-半乳糖苷分解酶及 α-甘露糖苷分解效素缺失石-甘露糖苷分解效素缺失 α-甘露糖苷分解效素冷-甘露糖苷分解效素 (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 49 585919 A7 B7 五、發明説明（47 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印簟 (請先閲讀背面•之注意事項再填寫本頁) 胱胺酸轉運子唾液酸轉運子

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公嫠）

Sialidosis

Glycosaminoglycan 降解缺失

Hunter syndrome

Hurler and Scheie syndrome

Maroteaux-Lamy syndrome 離心性軟骨發育不良症 A-subtype B-subtype C-subtype D-subtype

Sly syndrome v 其它單一酶缺失

Pompe disease(糖原質病 II)

Wolman disease 溶素體酶生合成失調 I-cell disease and

Polydystrophy lysosomal 溶素體膜轉運子缺失胱胺酸病唾液健存及Salla disease

Sialidase

Iduroate sulfatase a -L-iduroate sulfatase

I

GalNAc4-faatase/aryl sulfatase

Gal 6-硫酸根分解酶 /5-半乳糖苷分解酶乙醯膽鹼CoA :葡萄糖胺Ν· 基轉移酶

GlcNAc 6-sulfatase 沒-尿甘酸化物酶尿甘酸化物酶酸性脂解酶 6-磷酸根-Ν-乙醯葡萄糖胺轉素[許多酶未正確定位] 585919 A7 B7 五、發明説明（48 ) V.其它實施例本發明在此已將經轉植且可表現特定基因產物細胞之方法以實例加以說明，其方法係將一編碼有產物基因及控制的產物基因表現的調控單元之構築導入細胞内。這些方法可藉由其它步驟利用基因改造過的細胞進行，包括基因標的以及基因活化（參照Treco et al·，W0 95/31560，（併入參考文獻中）；也參照Selde n et al·， WO93/09222) 〇經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) HGH訊號胜可利用除a -gal A外的非同源蛋白質，包括α-l-抗胰蛋白激素，抗凝血激素III，原生脂蛋白E，原生脂蛋白Α·1，凝血因子V、VII、VIII、IX、X及XIII，骨生長因子-2,骨生長因子-7,降鈣素，催化性抗體，DNA 分解酶，紅血球生長激素，FSH-冷，球蛋白，昇糖素， glucocerebrosidase，G-CSF，GM-CSF，生長激素，免疫感應修飾者，免疫球蛋白，胰島素，insulintropin，似膜島素生長因子，干擾素-yS，干擾素-万神經生長因子，介白素-1，介白素-2，介白素-3，介白素-4，介白素-6，介白素-11，介白素-12,介白素-2接受器，介白素-1接受器頡抗劑，低密度脂蛋白接受器，M-CSF，副甲狀腺激素，蛋白質激酶C，可溶性CD4，超氧化物分解酶 (SOD)，組織血漿活化劑，TGF-/5，腫瘤壞死因子，TSH-冷，酪胺酸氫氧化酶，以及尿激酶。其它實施例則在下列的申請專利範圍内。 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（50) (ix)通訊資訊： (A) 電話：617/542-5070 (B) 傳真：617/542-8906 (2)序列ID NO : 1的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：22個鹼基對‘ (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 1的描述：

CTGGGCTGTA GCTATGATAA (2)序列ID NO : 7的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 7的描述：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

TTTTCAGCTG GACAATGGAT TGGC (2)序列ID NO : 8的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：20個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 53 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 585919 A7 B7 五、發明説明（51 ) (D)拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 8的描述：

TTTTGCTAGC TGGCGAATCC (2)序列ID NO : 9的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：30個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 ' (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 9的描述：

TTTTGGATCC GTGTCCCATA GTGTTTCCAA (2)序列ID NO : 10的資訊 v ⑴序列特徵： (A) 長度：28個鹼基對 (B) 型態··核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 10的描述：

TTTTGGATCC GCAGTCGTGG CCAGTACC (2)序列ID NO : 11的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：12個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 ' (C) 股數：單股 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —^裝· 項再填寫木訂 585919 A7 B7 五、發明説明（52 ) (D)拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 11的描述：

CTAGTCCTAG GA (2)序列ID NO : 12的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：22個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 12的描述：

TTTTGAGGAC AGAGCCTCGC CT (2)序列ID NO : 13的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：30個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 13的描述：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

TTTTGGATCC GGTGAGCTGC GAGAATAGCC (2)序列ID NO : 14的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：76個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 55 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 585919 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（53 ) (D)拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 14的描述： GGGCCCCCAG CCCCAGCCCT CCCATTGGTG GAGGCCCTTT TGGAGGCACC CTAGGGCCAG GAAACTTTTG CCGTAT (2)序列ID NO : 15的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：69個鹼基 (B) 型態：核苷酸(C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 15的描述： AAATAGGGCA GATCCGGGCT TTATTATTTT AGCACCACGG V CCGCCGAGAC CGCGTCCGCC CCGCGAGCA (2)序列ID NO : 16的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：86個鹼基對 (B) 型態：核苷酸(C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 16的描述： ΤΌΟΟΟΆΠΤ AIAOGGCAAA AGnTOCTGG OOCIAGGGTG CCTOCAAAAG GGOCTOCAOC AATGGGAGGGCrGGGGCTGGGGGOOC (2)序列ID NO : 17的資訊 ' ⑴序列特徵： 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A7 B7 五、發明説明（54) (A) 長度：55個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO ·· 17的描述··

OGOGGGGOGGAOGOGGTCrCGGOGGOOGTCGTGClAAAArAAIAAAGOOC GGATC (2)序列ID NO : 18的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：1343個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 18的描述： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（55 )

CCGCGGGAAA ATCTGGGCTG CTAGAGCACT GCTTCATGTG TCATGGAGAT TCTGCATTGA ACCCTCAGCG TGAAGCTAGG TTGGATACTA TTGATGGTTG TGGCCCTGAA GCCCCTTTCA TTGCTGACAT ACCAGGA6AG TGATTGGCAA TCATGGCTGC CTCTCCTTCA ACCAGCTTAG GGGCTGTA6C

TTTATGCTGT 經濟部中央標準局員工消费合作社印装

CCAGAACTAC ATCCCTGGGG CACTGGGAGC GAGAAGCTCT TATGAGTACC CTTCAGGCAG A6CAAAGGAC CCTGGGAGTT CTGCTAAAAT CACATGTCCT CTTTATATGT TGGCGAAATT ACATCTTTTA GATATGTTAG CTCTGGCCTA CAAGCCAAAG AAGCAAGGGT GGCTTAGCCT ACCATCGCAG CAGCTCCTCC CKCAThMiTC AAAGACTTAC

TGACAATGCA TGGCCCTCGT 03CCTACCAT AGCCAGATTC AAGG^TGGAA AAAGAGATTC AGCTAGCTAA ATAAAACCTG TTGCTGACTG ATTTGGCAGA TGTACTCCTG TCCGACAGTA TAAAGAGTAT CAGGGGGTT6 AGCAAGTAAC ACCTCOGACA TCAATCAGGA T6TGGGAAC6 TTGGTGGACC ATCCTGCCTG GGACTTGAAG ATACAATGCA

CCGGTCACCG CTTCGCTTCC TTGGCAAGGA TGCCAGGAAG ATGGTCTCAG ATGGCTCCCC GGGATTCGCC GATGTTGGAA GCCCAGACCT AGTTTGGAAA AGAAGCATTG TATACA6AAA TGGAAAA6TA GTTGCTGGAC AGCTGGAATC ATGTCTAATG GTAATTGCCA AACTTTGAAG CGGCAGGAGA GTGGCCTGTA

GCTGAGGAAC TTCCTGGGAC GGGCTGGCTG CTGCATCAGT GGATGCAGGT A6AAGGCAGA TTATGTTCAC CGCAGGCTTC GGGAGTAGAT TGGTTATAAG TGAGTGGCCT CTGCAATCAC CTTGGACTGG GAATGACCCA TCAGATGGCC CATCAGCCCT 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1343 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GGACAATGGA CAACCTTGAC GGCAGAGCTC TGACTGTTGG CTTTCCTCAT GATTTATGCA CGACATTGAT TTACTGTGAC TAGGACTGGC AAAGCCCAAT TGATGAiTCC AATTGTTGAT CTTTGGCCTC TCCTTTATTC GGATAAGCAC AOVGGGAGAC TATGATAAAC \GTMiAGGh GMiGCThGGG TGTTTTGCTT ΑΛΛΑΑΆΑΟΤΟ ?T62kAAAG GMiGCThGGG TTCTATGi VCAGGCAC TGTTTTGCTT CAGCTAGi

ACCTCTCTCA TCGCTCTTAT CTTCATCACA GTTMiGKkGT GATGTCATTA ΤΤΤΑΑΑΑΑΛΑ

GAG 58 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919A7B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（56) (2)序列ID NO : 19的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度·· 210個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 19的描述： CTGGCCTGTA GCTATGATAA ACCGGCAGGA GATTGGTGGA CCTCGCTCTT ATACCATCGC 60 AGTTGCTTCC CTGGGTAAAG GAGTGGCCTG TAATCCTGCC TGCTTCATCA CACAGCTCCT 120 CCCTGTGAAA AGGAAGCTAG GGTTCTATGA ATGGACTTCA AGGTTAAGAA GTCACATAAA 180 TCCCACAGGC ACTGTTTTGC TTCAGCTAGA 210 (2)序列ID NO : 20的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：268個鹼基對 (B) 型態··核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 20的描述： ATTGGTCCGC CCCTGAGGTT AATCTTAAAA GCCCAGGTTA CCCGCGGAAA TTTATGCTGT 60 CCGGTCACCG TGACAATGCA GCTGAGGAAC CCA6AACTAC ATCTGGGCTG CX5CGCTTGCG 120 CTTCGCTTCC TGGCCCTCGT TTCCTGGGAC ATCCCTGGGG CTAGAGCACT GGACAATGGA 180 TTGGCAAGGA CGCCTACCAT GGGCTGGCTG CACTGGGAGC GCTTCATGTG CAACCTTGAC 240 TGCCAGGAAG AGCCAGATTC CTGCATCA 268 59 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) 585919 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 A7 ____B7_五、發明説明（57)(2)序列ID NO : 21的資訊⑴序列特徵：(A) 長度：26個胺基酸(B) 型態：胺基酸 (C) 股數：(D) 拓樸學：線型(xi)序列 ID NO : 21 的‘述： Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15 Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25(2)序列ID NO : 22的資訊 V⑴序列特徵：(A) 長度：78個鹼基對(B) 型態：核苷酸(C) 股數：單股(D) 拓樸學：線型(xi)序列ID NO : 22的描述： ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCC(2)序列ID NO ·· 23的資訊 ⑴序列特徵：(A) 長度：35個鹼基對 ~ (B) 型態：核苷酸 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先鬩讀背面乏注意事項再填寫本頁) 585919 A7 B7 五、發明説明（58) (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 23的描述： TTTTGGATCC CTCGAGGACA TTGATTATTG ACTAG (2)序列ID NO : 24的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：28個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 24的描述： TTTTGGATCC CGTGTCAAGG ACGGTGAC (2)序列ID NO : 25的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：1197個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面•之注意事項再填寫本頁) (xi)序列ID NO : 25的描述：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 585919 A7B7 五、發明説明（59 )

TGCACTGGGA GCGCTTCATG GTGAGAAGCT CTTCATGGAG GTTATGAGTA CCTC GACTTCAGGC AGAC

CTGGACAATG

TGCAACCTTG

ATGGCAGAGC

GATGACTGTT

CGCTTTCCTC

GGGATTTATG

TACGACATTG

TGTTACTGTG

AATAGGACTG CAAAAGCCC^

ATTGATGATT

AGAATTGTTG

AACTTTGGCC

GCTCCTTTAT

CAGGATAAGG

AGACAGGGAG

GCTATGATAA

CTGGGTAAAG

AGGAAGCTAG

ACTGTTTTGC

GATTGGCAAG

ACTGCCAGGA

TCATGGTCTC

GGATGGCTCC

ATGGGATTCG

CAGATGTTGG

ATGCCCAGAC

ACAGTTTGGA

GCAGAAGCAT

ATTATACAGA

CCTGGAAAAG

ATGTTGCTGG

TCAGCTGGAA

TCATGTCJTAA

ACX5TAATTGC

ACAACTTTGA

ACCGGCAGGA

GAGTGGCCTG

GGTTCTATGA

TTCAGCTAGA

GACGCCTACC

AGAGCCAGAT

AGAAGGCTGG

CCAAA6AGAT

CCAGCTAGCT ΑΑΑΤΑΛΑΑΟΟ

CTTTGCTGAC

AAATTTGGCA

TGTGTACTCC AATCC6ACA6

TATJUUVGAGT

ACCAGGGCGT ΤΟΛΟΟΑΛΘΤΑ

TGACCTCC5GA

CATCAATCAG

AGTGTGGGAA

GATTGGTGGA

TAATCCTGCC

ATGGACTTCA

AAATACAATG

ATGGGCTGGC

TCCTGCATCA

AAGGATGCAG

TCAGAAGGCA

AATTATGTTC

TGCGpAGGCT TGGGGAGTA6

GATGGTTATA

TGTGAGTGGC

TACTGCAATC

ATCTTGGACT

TGGAATGACC

ACTCAGATGG

CACATCAGCC

GACCCCTTGG

CGACCTCTCT

CCTCGCTCTT

TGCTTCATCA

AGGTTAAGAA

CAGATGTCAT

TCCCTGGGAG

ATCTGCTAAA

AGCACATGTC

CTCTTTATAT

ACTGGCGAAA

GGACATCTTT

CAGATATGTT

CCCTCTGGGC

CTCAAGCCAA

GCAAGCAAGG

CAGGCTTAGC

ATACCATCGC

CACAGCTCCT

GTCACATAAA

TAAAAGACTT

CCTGCATT

\CCCTCAG

TTTTGGATAC

ATTTGATGGT

CTTGGCCCTG

GTGGCCCTTT

TTTTGCTGAC TAACCAGGA6

AGTGATTGGC

TATCATGGCT

AGCTCTCCTT

GTACCAGCTT

CTGGGCTGTA

AGTTGCTTCC

CCCTGTGAAA

TCCCACAGGC

ACTTTAA 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1197 ---------------訂------Awl (請先闞讀背面乏注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 62 本紙張尺度適用中國國家標準1 CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（60 ) (2)序列ID NO : 26的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：398個胺基酸 (B) 型態：胺基酸 (C) 股數： (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 26的描述：經濟部中央標率局員工消費合作社印製

Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 1 5 10 15 Glu Arg Phe Met Cys Aan Leu Asp Cys Gin Glu Glu Pro Asp Ser Cys 20 25 30 lie Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys lie Asp Asp Cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gin Arg Asp Ser Glu Gly T^rg Leu Gin Ala Asp Pro Gin 65 70 75 80 Arg Phe Pro Hie Gly lie Arg Gin Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys 85 90 95 Ψ Gly Leu Lys Leu Gly lie Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp lie Asp Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Λβρ Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Aen Arg Thr Gly Arg Ser lie Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Met Trp Pro Phe Gin Lye Pro Asn Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cys 180 185 190 Aen His Trp Arg Aen Phe Ala Asp lie Asp Asp Ser Trp Lys Ser lie 195 200 205 63 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- (請先昤讀背面乏注意事項再填寫本頁) 585919 A7B7 五、發明説明（61)

Lye Ser He Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gin Glu Arg lie Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val lie Gly 225 230 235 240 Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gin Gin Val Thr Gin Met Ala Leu Trp 245 250 255 Ala lie Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His lie 260 2^5 270 Ser Pro Gin Ala Lys Ala Leu Leu Gin Asp Lys Asp Val lie Ala lie 275 280 285 Asn Gin Asp Pro Leu Gly Lys Gin Gly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Asp 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met lie Asn Arg Gin Glu lie Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr lie 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe 340r 345 350 lie Thr Gin Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser His lie Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gin Leu Glu Asn Thr Met Gin Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585919 A7 B7 五、發明説明（62) (2)序列ID NO : 27的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：338個鹼基對 (B) 型態：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線型 (xi)序列ID NO : 27的描述 ATGGCTACAG GTAAGCGCCC CTAAAATCCC TTTGGGCACA ATGTGTCCTG AGGGGAGAGG 60 CiAGCGACCTG TAGATGGGAC GGGGGCACTA ACCCTCAGGT TTGGGGCTTC TGAATGTGAG 120 TATCGCCATG TAAGCCCAGT ATTTGGCCAA TCTCAGAAAG CTCCTGGTCC CTGGAGGGAT 180 GGAGAGA6AA AAACAAACAG CTCCTGGAGC AGGGA6AGT6 CTGGCCTCTT GCTCTCCGGC 240 TCCCTCTGTT GCCCTCTGGT TTCTCCCCAG GCTCCCX5GAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG 300 GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCC 338 (請先閱讀背面乏注意事項再填寫本頁) 訂 (2)序列ID NO : 28的資訊 ⑴序列特徵： (A) 長度：10個胺基酸 (B) 型態：胺基酸 (C) 股數： (E)拓樸學：線型 (ii)分子型態：胜肽 (xi)序列ID NO : 28的描述：

Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr 1 5 10 65 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） L·. 經濟部中央橾準局員工消費合作社印裝

Claims

585919 修纖修正本 A8 B8 C8 D8 公告韦i 正日期：93.3.22 經濟部智慧財產局員工消費合作·吐印製六、申請專利範圍 1. 一種治療α -半乳糖苷分解酶A缺乏疾病的醫藥組合物，包括一醫藥上可接受人類細胞存於一醫藥上可接受之載體中，其中該細胞已以一會大量表現及分泌人類α -半乳糖苷分解酶Α之構築體（construct)轉染，該人類α -半乳糖苷分解酶Α之序列為： Leu Asp Aen Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Het Gly Trp Leu HLb Trp 1 5 10 15 Glu Arg Phe Het Cye Aen Leu Aep Cye Gin Glu Glu Pro Aep Ser Cye 20 25 30 lie Ser Glu Lye Leu Phe Het Gl^i Het Ala Glu Leu Met Val Ser Glu • 35 40' 45 ·· Gly Trp Lye Aep Ala Gly Tyr Glu Tyr Lreu Cye lie Asp Asp CyB Trp 50 55 60 Het Ala Pro Gin Arg Aep Ser Glu Gly Arg Leu Gin Ala Asp Pro Gin 65 70 75 80 Arg Phe Pro His Gly lie Arg Gin Leu Ala Aen Tyr Val His Ser Lye 85 90 95 Gly Leu Lye Leu Gly lie Tyr Ala ABp Val Gly Asn Lys Thr CyB Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp lie Asp Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Aep Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cye Tyr Cye Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala ABp Gly Tyr LyB H1b Het Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Aen Arg Thr Gly Krq Ser lie Val Tyr Ser Cye Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Het Trp Pro Phe Gin Lye Pro Aen Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cys 180 185 190 Aon Hi日 Trp Arg Asn Phe Ala Asp lie Aep A曰p Ser Trp Lys Ser lie 195 200 205 Lye Ser lie Leu A日p Tirp Thr Ser Phe Aen Gin Glu hrg lie Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Cly Gly Trp Λβπ Aep Pro Asp Met Leu Val lie Gly 225 230 235 240 Aen Phe Cly Leu Ser Trp Aen GLn Gin Val Thr Gin Het Ala I^eu Trp 245 250 255 Λ1 a lie Het Ale. Ala. Pro Leu Phe Het Ser hen Aep Lreu Arg HLb lie 260 265 270 Sex Pro Cln Ale Lye Ala Leu Leu Gin Aep Lye ABp Val Ile Ala I]_g 275 2Θ0 285 66 本紙張又度適用中@圉家標準（CNS)A4規格（2】〇χ297公？ --------^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t、申請專利範圍 Aon Cln Αβρ Pro Leu Cly Lye Cln Cly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Aep 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Lou Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met lie Aon Arg Gin Glu lie Gly Gly Pro Arg Ser'Tyr Thr lie 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lye Gly Val Ala CyB ABn Pro Ala CyE Phe 340 345 350 lie Thr Gin Leu Leu Pro Val Lys Axg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu hrg Ser Hie lie Aen Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gin Leu Glu Asn Thr Met Gin Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 , 390 395 ·_ 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該細胞是已經以一含有人類α -半乳糖昔分解酶A多胜肽編碼序列的DNA分子於活體外轉染的細胞，其中該人類α -半乳糖苷分解酶Α多胜肽編碼序列為： Leu Asp Αβπ Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 15 10 15 Glu hrg Phe Met Cys Aen Leu A曰p Cy曰 Gin Glu Glu Pro Aep Ser Cys 20 25 30 lie Ser Glu Lye Leu Phe Met Glu Ket Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys lie ABp A日p CyB Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gin hrg Aep Ser Glu Gly Arg Leu Gin Ala Aep Pro Gin 65 70 75 80 Axg Phe Pro His Gly lie Arg Gin Leu Ala Asn Tyr Val Hie Ser Lye 65 90 95 Gly Leu Lye Leu Gly lie Tyr Ala Aep Val Gly Aon Lye Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp lie Aep Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Λ.1& Ksp Trp Gly Ve.1 Ksp Leu Leu Lye Phe ABp Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公坌） --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、申請專利範圍 Ser Lreu Glu Aen Leu Ala Aep Gly Tyr Lye Hie Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Thr Gly krg Ser lie Val Tyr Ser Cye Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Het Trp Pro Phe Gin Lye Pro Aen Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cys 180 185 1 190 Aen Hie Tirp Arg Aen Phe Ala Asp lie Asp Aep Ser Trp LyB Ser lie 195 200 , 205 Lye Ser lie Leu hep Trp Thr Ser Phe Aen Gin Glu Arg He Val Aep 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Aen Asp Pro Aep Het Leu Val lie Gly 22S 230 235 240 Aon Phe Cly L〇u Ser Trp Aon Cln Cln Val Thr Cln Het AIa Lou Trp 245 250 255 Ala lie Met Ala Ala Pro Leu Phe Het Ser Aen Aep Leu Arg Hie lie 260 265 2 70 Ser Pro Gin Ala Lye Ala Lou Leu Gin Aep Lye Aep Val lie Ala lie 275 280 285 Λβπ Gin Aep Pro Deu Gly Lye Cln Cly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Aep 290 295 300 Aen Phe Glu Val Γιτρ Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Tirp Ala Val 305 310 315 . 320 Ala Het lie Aen A.rg Gin Glu lie Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr lie 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu GLy Ly曰 Gly Val Ala CyB Asn Pro Ala Cys Phe 340 345 350 lie Thr Gin Leu Leu Pro Val Lye Arg Lye Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 ， -、 . Thr Ser Arg Deu hrg Ser Hie lie hen Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gin Leu Glu A日n Thr Het Gin Het Ser I/eu LyB Asp Leu Leu 385 390 395 3.如申請專利範圍第2項所述之醫藥組合物，其中該多胜肽更包括人類生長激素（hGH)的訊號胜，具有如下序列： Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15 Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25 68 本紙張泛i適用家標準（C\S)A4規格（21CU297彡t〉 --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585919 A8 B8 C8 D8 「、申請專利範圍 4.如申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物，其中該 DNA分子包括人類生長激素（hGH)基因之第一插入子，上述人類生長激素基因序列如下： ATGOCTACAG GTAAGCGCCC CTAAAATCCC TTTGCGCACA ATCTGTCCTG AGGCGAGAGC 60 CACCGACCTG ThGhTGQQAC GGGCGCACTh ACCCTCAGCT TTGGGGCTTC TGAATGTGAG 120 TATCX；CCATG TAAGCCCAGT ATTTGGCCAA TCTCAGAA^G CTCCTOGTCC CTGOhGGGAT 180 GGAGAGAGAA AAACAAACAG CTCCTCGAGC AGGCAGAGTG CTOGCCTCTT GCTCTCCGOC 240 TCCCTCTGTT GCCCTCTGCT TTCTCCCCAG GCTCCCGCAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG 300 GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCC 338 O * 5.如申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物，其中該 DNA分子在3’端到編碼序列末端的密碼更包括一段至少6 個核苷酸的未轉譯序列，該未轉譯序列包括一個聚腺苷酸基化位置。 6· —種DNA分子，其係由以下序列組成：一第一序列，其編碼有含下列序列之人類生長激素訊號胜： Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25 ’且該第一序列包含一段插入子，以及一第二序列，其編碼有含下列序列之人類α -半乳糖苷分解酶Α多胜肽： 69 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 〗 --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作钍印製六、申請專利範圍 Leu Aep Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Het Gly Trp Leu Hie Trp 15 10 15 Glu Arg Phe Het Cy日 Asn Lreu Aep Cys Gin Glu Glu Pro Asp Ser Cys 20 25 30 lie Ser Glu Lye Leu Phe Het Glu Met Ala Glu Leu Het Val Ser Glu 35 40 45 * Cly Trp Lye Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cye He Aep Aep Cys Trp 50 55 60 Het Ala Pro Gin Arg Aep Ser Glu Gly7 Arg Leu Gin Ala Asp Pro Gin 65 70 75 80 Arg Phe Pro Hie Gly lie Arg Gin Leu Ala Asn Tyr Val Hie Ser Lye 65 90 95 Gly Leu Lye Leu Gly lie Tyr Ala Aep Val Gly Aen Lye Thr Cye Ala 100 105 110 Cly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Aep lie Aep Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Aep Trp Gly Val Aep Leu Leu Lye Phe Aep Gly Cye Tyr Cye Aep 130 135 140 Ser Leu Glu Λβπ Leu Ala Aep Gly Tyr Lye Hie Het Ser I^eu Ala Leu 1.45 150 155 160 Aen Axg Thr Gly Arg Ser lie Val Tyr Ser Oyo Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Ket Trp Pro Phe Gin Lye Pro Aen Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cyo 180 185 190 Aen Hi.e Trp Arg Aen Phe Ala Aep lie Λορ Aep Eer Trp Lye Ser lie 195 200 205 Lye Ser Ile Lou Aop Trp Thr Ser Phe Aon Gin Glu Arg lie Val Aep 210 215 220 Val AwLfl. Cly Pro Cly Cly Trp Aen Aep Pro hep Het Leu Val lie Gly 225 230 235 240 Aen Phe Cly Lou Ser Trp Aon Cln Cln Val Thr Gin Het Ala Lou Trp 2<5 250 255 Ala I le Het Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser A日 n Aep Leu Arg Hie lie 260 265 270 Ser Pro Cln Ala Lys Ala Leu Leu Gin Aep Lys Asp Val lie Ala lie 275 280 285 Aen Gin Aep Pro Lou Gly Lye Cln Cly Tyr Cln Lr〇u Arg Gin Gl_y Aop 290 295 300 Aen Phe Glu Val Trp Clu Arg Pro Lou Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 · 310 315 320 Ala Het lie Asn Arg Gin Glu lie Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Il"e 325 330 335 Ala Val Ser Leu Gly Lye Gly Val Ala Cye Aen Pro Ala Cye Phe 340 345 350 7 0 本紙張適厍中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 1_、窆） --------tr---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 t、申請專利範圍 lie Thr Gin Leu Leu Pro Val Lya Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Kirg Ser Hie lie Aen Pro Thr Gly Thr Val LrGu Leu 370 375 380 Gin Leu Glu Asn Thr Met Gin Met Ser Lreu Lye Asp Leu, Leu 385 390 395 ，連接於該第一序列的3’端。 7.—種DNA分子，其係由申請專利範圍第6項所述之 DNA分子以及一段含有polyA的3’未轉錄序列所組成。 8·—種蛋白質，其係由以下組成： (a)人類生長激素（hGH)的訊號胜： Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25 ，並以一胜肽鍵結連接（b)人類a-半乳糖苷分解酶A多胜肽： Leu Aep Aon Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu HIb Trp 1 5 10 15 Glu hrg Phe Hot Cye Aon Leu Λβρ Cye Gin Glu Glu Pro Aep Ser Cys 20 25 30 lie Ser Glu Lye Leu Phe Ket Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lye Aep AIcl Tyr Clu Tyr L^eu Cys lie Aep Aep Cye Trp 50 55 60 He t Ala Pro Gin Krq Aop Ser Glu C ly hrg Leu Gin Ala Aep Pro Gin 65 7〇 75 e〇 hrg Phe Pro Hi_o Cly lie Krg Cln Leu Ala Aen Tyr Val Hio Ser Lye B5 90 95 Gly Leu Lye Leu Cly lie Tyr Ala Aop Val Gly Aon Lyo Thr Cye Ala 100 105 HO Cly Phe Pro Cly Ser Phe Cly Tyr: Tyr Aep lie Aep Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Aop Trp Cly Val Aop Leu Leu Lye Phe Asp Gly Cye Tyir Cys 乂sp 130 135 140 ‘ 71 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297 ϋ ) --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製力、申請專利範圍 Scr I^eu Clu Acn Leu Ala Aep Gly Tyr Lyo Hin Ket Ser Leu Ala Leu 1<5 150 155 160 Asn Arg Thr Gly Azrg Ser I le Val Tyr Ser Cyo Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Het Trp Pro Phe Gin Lye Pro Aen Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cyo 180 185 '190 Aen Hie Trp Arg Αβπ Phe Ala hep lie Asp Asp Ser Trp Lys Ser lie 195 200 205 • ^ Lye Ser lie Leu Αθρ Trp Thr Ser Phe Aen Gin Glu Arg lie Val Aep 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Aon Aep Pro Aep Met Leu Val lie Gly 225 230 235 240 Aen Phe Gly Leu Ser Trp Aen Cln Gin Val Thr Gin Het Ala Leu Trp ^ 245 250 255 Ala lie Het Ala Ala Pro Lou Phe Het Ser Αβπ Asp Leu Arg lie 260 265 270 Ser Pro Gin Ala Lye Ala Leu Leu Gin Αερ Lyo Aep Val lie Ala lie 275 280 285 Aen Cln Aep Pro Leu Gly Lye Cln Gly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Asp 290 295 300 Αβπ Phe Clu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp ALa Val 305 310 315 320 Ala Het lie Αβπ Arg Gin Clu lie Gly Gly Pro Ajrg Ser Tyr Thr lie 325 330 335 Ala Val ^.la Ser Leu Gly Lye Gly Val Ala Cye Αβπ Pro Ala Cyo phe 340 345 350 lie Thr Cln Leu Leu Pro Val Lye Arg LyB Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser Hie lie hsn Pro Thr Gly Thr Val Leu Lgu 370 375 3B0 Gin Leu Glu Aon Thr Het Gin Het Ser Leu Lye Λοp Leu Deu 385 390 395 O 9· 一種糖化的人類a-半乳糖苷分解酶A的製造方法，其包括：培養一轉染之人類細胞，其會大量表現並分泌人類-半乳糖苷分解酶A: 本紙張尺度逹圬中§§家標準（CXS)A4規格（210x297 ) --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 AS B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Lou Ασρ Aen cly ku tg Thr Pro Tl'-r Het Gly Trp Leu HLg Trp IS l〇 15 Clu Rrg Phe Het Cys Aen Leu Xcp Cyc CIjd Glu Clu Pro Aep Bar Cyc 20 25 30 lie Scr Clu Lyo Leu Phc Het Glu Met Ala Glu Leu Het Val Ser Clu 35 40 45 Cly Trp Lye Asp Ala Gly Tyr Clu Tyr Lou Cye lie Aep Asp Cye Trp 50 55 60 Het Ala Pro Gin Arg Asp Ser Glu Gly /urg Leu Gin Ala. Aep Pro Gin 65 70 75 80 Arg Phe Pro Hie Gly He Arg Gin Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lye 85 90 95 Gly Leu Lye Leu Gly lie Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp lie Aep Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Aep Trp Gly Val Asp Leu Leu Lye Phe Asp Gly Cye Tyr Cye Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Lreu Ala ABp Gly Tyr Lye Hi_B Het Ser Lreu Ala Leu 145 150 155 160 Aen /\jrg Thr Gly Arg Ser lie· Val Tyr Ser* Cye Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Het Trp Pro Phe Gin Lye Pro Aen Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cye 180 185 190 Aen Hie Trp Arg Αβπ Phe Ala Asp lie Aep Aep Ser Trp Lye Ser lie 195 200 205 Lye Ser lie Leu ABp Trp Thr Ser Phe Αβπ Gin Glu Arg lie Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Aen Aep Pro Aep Het Leu Val lie Gly 225 230 235 240 Αβπ Phe Cly Leu Ser Trp Aen GLn Gin Val Thr Gin Het Ala Leu Trp 245 250 255 Ma Ile Het Ala Ala Pro Leu Phe Het Ser A日n Aep Leu Arg HIb lie 260 265 270 Ser Pro Gin Ala Lye Ala Leu Leu Gin Asp LyB ABp Val lie Ala lie 275 280 285 Aon Gin Aep pro Leu Gly Lye Cln Gly Tyr Gin Leu Arg Gin Gly Λερ 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Clu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Alfi. Trp Ala V£l1 305 ， 310 315 320 A-la Het I le Aon Arg Gin Glu lie Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr lie 325 330 325· ALa Val Ala Ser Leu Cly Lye Gly Val_ Cys Aen Pro Ala Cye Phe 340 345 350 - 73 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 ::, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I 1--I I ^ · I I I---I I 一經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585919 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍工1。Thr Gin Leu Leu Pro Val Lye Arg Lye Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr ser Arg Leu Arg Ser Hie lie Acn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gin Lou Glu 2\en Thr Met Gin Met Ser Lye Aep Leu Leu 385 390 395 ' ;以及由該細胞之細胞培養基中分離糖化的人類-半乳糖脊分解酶A。 10. —種由一樣品中純化人類α-半乳糖苷分解酶A的方法，其包括一第一色層分析步驟，其中該樣品係通過一疏水性的反應樹脂。 11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該樹脂中的功能性部位包括一丁基。 12. —種糖化的人類α-半乳糖苷分解酶A的製造方法，其包括·· 培養一細胞，其經轉染一編碼一多胜肽的DNA分子，該多胜肽包含人類α -半乳糖苷分解酶A : Lou Αθρ Aon Giy Leu Ala Arg Thr Pro Thr Het Gly Tirp Leu Hi6 Trp 1 5 10 15 Clu Krg Phe Het Cye Aon Lou Asp Cyo Cln Glu Glu Pro Acp Ser CyG 20 25 30 Ile Ser Glu Lyo Leu Phe Het Glu Het Ala Glu Leu Het Val Ser Glu 35 40 45 Cly Trp Lye Aop Ma Gly Tyr Clu Tyr Lou Cya lie Αορ Ασρ Cyc Trp 50 55 60 Het Ala Pro Gin Ajrg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gin Ala AGp Pro Gin 65 70 75 80 Arg Phe Pro Hie Gly lie Arg Gin Ix?u Ala Asn Tyr Val HiG Ser Lyc 90 95 Cly I^su Lye Leu Gly I lc Tyr Ala Asp Val Gly he n Ly g Thr Cye Ala 100 105 110 Gly Fhe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr： Tyr Acp lie hep Ala Gin Thr Phe 115 120 125 74 本紙張泛度遘用中國§家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） --------tr---------^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585919 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ala Aop Trp Gly Val Λορ Leu Leu Lye Phe Aep Gly Cye Tyr Cyg Aep 130 135 140 Ser Lou Glu Λοη I^eu Ala Aop Cly Tyr LyB HIg Met Ser Leu Ala Leu 1<5 150 155 160 Αεη Arg Thr Cly Arg Ser lie Val Tyr Ser Cye Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 ' 175 Het Trp Pj.〇 Phe Cln Lyo Pro Ann Tyr Thr Glu I le Arg Gin Tyr Cye 180 165 190 Aon Hio Trp Arg Aon Phe Ala Acp lie Aop Aop Ser Trp Ly6 Ser lie .·> 195 200 205 Lyo Sor I le Leu Aop Trp Thr Ser Phe Aon Gin Glu Arg I le Val Asp 210 215 220 Val Ala Cly Pro Cly Cly Trp Aon Λορ Pro Λερ Met Lou Val lie Gly 225 230 235 240 Aon Phe Cly Leu Scr Trp Aon Cln Cln Val Thr Cln Ket Alt Leu Trp 245 250 255 Ala lie Het Ala Ala Pro Leu Phe Met Scr hen Λορ Leu Krg Hie He 260 265 270 Scr Pro Cln ALa Lye Ala Lou Lou Cln A〇P Ly° Aop Val I Lc Ala lie 275 2Q0 285 ^〇n cln Kop rro I>eu Cly Lye CLn Cly Tyr： Cln Ixiu Arg Cln Cly Aop 290 295 300 Aon Phe Clu Val Trp Clu Arg Pro Leu Scr Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ma Het lie Aon A.rg Gin Clu lie Cly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr lie 325 330 335 ALa Val Ala Scr Leu Gly Lyo Gly Val his. Cyo hen Pro Ala Cyo Phe 340 345 350 He Thr Cln Leu Leu Pro Val Lyo Arg Lyo Lou Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Krg Ser Hio lie Αεη Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gin I>eu Glu Aon Thr Het Cln Het Ser Leu Lye Aop I>eu L^eu 3Θ5 390 395 ’連結至人類生長激素（hGH)之訊號胜： Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 CyB Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 , 25 ，並允許該多胜肽在該細胞中的大量表現；以及由該細胞之培養基中分離糖化的人類fl：-半乳糖苷分解酶Α。 75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .. --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員Η消費合作社印制衣 585919 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 13.如申請專利範圍第1〇項所述之方法，其更包括一步驟：使該樣品通過一第二樹脂，該第二樹脂係選自一固定的肝素樹脂，對氫氧基磷灰石，一陰離子交換樹脂，及一沖提樹脂所構成的族群。 14. 一種糖化的人類α -半乳糖苷分解酶A的製造方法，其包括··培養一人類細胞，其經轉染一編碼有一多胜肽之DNA分子，該多胜肽包含人類α -半乳糖苷分解酶A : L^u Acp Aen Gly l〇u Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu HIg 丁rp 1 5 10 T ^ 15 Glu Arc Phe Met Cyo A曰 n Leu A op Cyo Cln Glu Glu Pro AGp Sor Cvs 20 25 30 * lie Ser Glu Lyo Leu Phe Hot Glu Met Ala Glu Lou Het Val Ser Glu 35 40 45 Gly Trp Lys Acp Ala Gly Tyr Glu Tyr Lou Cyo lie Αορ Λερ Cvc Trp 5〇 55 60 Het Ala Pro Gin Krg Asp Ser Clu Cly Arg Lou Gin Ala Λορ Pro Cln 65 70 75 80 Phe Pro Hie Cly He Arg Cln Lou Ala Aen Tyr Val Hio SGr Lvg e5 90 95 Cly Lou Lyo Ix2u cly lie Tyr Ala Aop Val Gly Aon Lyo Thr Cys Ala 100 105 no Cly Phe Pro Cly Ser Phe Cly Tyr Tyr Λορ lie Aop Ala Cln Thr Phe 115 120 125 Ala Aop Trp Cly Val Aop !>eu Leu Ly日 Phe Aop Gly Cyo Tyr Cyo Aop 130 135 l<〇 · Ser Lou Glu Aon I>eu Ala Aop Cly Tyr Lyo Hio Met Ser Lou Ala Lgu 150 155 160 Aon Arg Thr Gly Arg Ser lie Val Tyr Ser Cyo Clu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Met Trp Pro Phe Gin Lyo Pro Aon Tyr Thr Glu lie Arg Gin Tyr Cyo 185 190 Aon Hie Trp Arg Aon Phe Ala Aop lie Aop Aop Ser Trp Lvg Ser lie 195 200 205 Lye Ser lie Leu Aop 丁rp Thr Ser Phe Aon Gin Glu hrg fie Val Acp 210 215 220 Val Ala Cly Pro Gly Gly Trp Aon Aop Pro Aop Het Lou Val lie Cly 225 230 235 240 76 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·

585919 A8 BS C8 D8 t、申請專利範圍 Λ〇η phe Gly Lou Ser Trp Aon Gin Cln Val Thr Gin Met ^la Leu Trp 245 ' 250 255 Ala lie Met Ala Ala Pro Leu Phc Met Ser Aon Λορ Leu Arg Hie lie 260 265 21U Ser Pro Cln Ala Lyg 八la Leu Leu Cln Aop Lyo Aop Val lie Ala IIg 275 280 285 Aon Cln Aop Pro Leu C ly Lyo Gin Cly Tyr Cln Leu Arg Cln Gly Aop 290 295 300 Aon Phe Glu Val Trp G lu Arg Pro Leu Ser Gly Ixbu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met lie Aon Arg Cln Glu Ilc Gly Cly Pro Arg Ser Tyr Thr lie 325 330 335 Ala Val Ala Ser Leu Gly Lyo Gly Val Ala Cyo Aon Pro Ala Cye Phe ， 340 345 350 IIg Thr Gin Lou Leu Pro Val· Lye Arg Lyo Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Arg Ser Hie lie Acn Pro Thr Gly Thr Val· Leu Leu 370 375 380 Cln Leu Glu Aon Thr Met Gin Met Ser I^eu Lyo Λθρ Lreu Leu 385 390 395 ’且培養境允终在細胞内由該])NA分子大量表現人類 α -半乳糖苷分解酶A。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）