JP4001925B2 - α―ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ及びα−ガラクトシダーゼ欠損症の治療に関する。
ファブリー病はＸ−連鎖で遺伝的に受け継がれるリソソーム蓄積症であって、それは重篤な腎障害、角化血管腫、及び心室拡張や僧帽弁不全などの心血管異常のような症状に特徴がある。またこの疾患は末梢神経系にも影響を及ぼし、激痛、即ち極限状態の強烈な痛みを引き起こす。ファブリー病は酵素のα−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌ Ａ）が欠乏することに原因があり、結果的に中性のグリコスフィンゴ脂質の異化作用が妨害されるとともに、細胞内や血流において酵素基質であるセラミドトリヘキサイドの蓄積が起こる。
この疾患はＸ−連鎖で遺伝的に受け継がれるパターンであるため、必然的に全てのファブリー病患者は雄性である。厳格に影響を受けた雌性の異型接合体もわずかながら観察されているが、雌性の異型接合体は一般に、無症候性かあるいは角膜の特徴的な不透明性にほとんど限定されたかなり緩和な症候が見られるかのいずれかである。低量の残留α−ｇａｌ Ａ活性を示し、そしてかなり緩和な症候しか示さないかまたはファブリー病に特徴的な他の症候を明らかに示さないような、ファブリー病では典型的とは言えない場合には、左心室肥大や心疾患が関連している（NakanoらのNew Engl. J. Med. 333: 288-293, 1995）。α−ｇａｌ Ａの減少がこのような心臓異常の原因であるかもしれないと推測されている。
ヒトα−ｇａｌ ＡをコードするｃＤＮＡと遺伝子が単離され、配列決定されている（BishopらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4859, 1986、KornreichらのNuc. Acids Res. 17: 3301, 1988、OeltjenらのMammalian Genome 6: 335-338, 1995）。ヒトα−ｇａｌ Ａは４２９個のアミノ酸ポリペプチドとして発現し、そのN末端の３１個のアミノ酸はシグナルペプチドを構成している。ヒトの酵素は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（Desnickの米国特許第5,356,804号、IoannouらのJ. Cell Biol. 119: 1137, 1992）、昆虫細胞（Calhounらの米国特許第5,179,023号）、及びＣＯＳ細胞（TsujiらのEur. J. Biochem. 165: 275, 1987）で発現している。α−ｇａｌ Ａ置換治療の予備試験について報告されており、それはヒトの組織から誘導された蛋白質を用いている（MapesらのScience 169: 987 1970、BradyらのN. Engl. J. Med. 289: 9, 1973、DesnickらのProc, Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326, 1979）が、現時点でファブリー病の有効な治療法はない。
発明の概要
培養されたヒトの細胞でヒトα−ｇａｌ ＡをコードするＤＮＡを発現させると、適当にグリコシル化されたポリペプチドを、酵素的に活性であって、ファブリー病で蓄積するグリコスフィンゴ脂質の基質に作用する能力があるだけでなく、この疾患で必要とされているところ、即ち作用細胞、特に患者の血管の内層の内皮細胞のリソソーム区画に正確にターゲティングさせる細胞表面の受容体を経て細胞によって効率的に中に取り入れられるように生成することが判明している。この知見については下記により詳細に説明されているが、ファブリー病のようなα−ｇａｌ Ａ欠損症であることが疑われる個体を、（１）ヒトα−ｇａｌ Ａを過剰発現して分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞、または（２）遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる純粋なヒトα−ｇａｌ Ａのいずれかを用いて治療することができる。
初めのルートによる治療、即ち修飾された細胞自体を用いる治療には、ヒトの細胞（例えば一次細胞、二次細胞、または不死化細胞）を、高いレベルのヒトα−ｇａｌ Ａを発現し分泌するように誘導すべくインビトロまたはエクスビボで遺伝子操作すること、続いてSeldenらのWO 93/09222（参照文献として本明細書に組み入れられる）において一般的に記載されているように患者にその細胞を移植することが含まれる。
遺伝子治療または酵素置換治療によってファブリー病の治療を行う目的のために細胞を遺伝的に修飾すべき場合、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子は発現構築物に含まれていて、ヒトの一次細胞または二次細胞（例えば、繊維芽細胞、乳房や腸管の上皮細胞などの上皮細胞、リンパ球や骨髄細胞などの血液の要素を構成する内皮細胞、神経膠細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、神経細胞、またはこれらの細胞型の前駆体）に、トランスフェクションの標準的な方法、即ちこれらに限定するわけではないが、リポソーム媒体トランスフェクション、ポリブレン媒体トランスフェクション、もしくはＤＥＡＥデキストラン媒体トランスフェクション法、エレクトロポレーション、燐酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、または速度推進型微粒子投射法（「バイオリスティックス」）といった方法によって導入されるようになっている。また、ウイルスベクターによってＤＮＡを渡すシステムを用いてもよい。遺伝子トランスファーに有用であると知られているウイルスには、アデノウイルス類、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス類、シンドビスウイルス、及びカナリーボックスウイルスのようなワクシニアウイルスが挙げられる。一次細胞または二次細胞培養物は本発明の治療方法にとって好適であるが、不死化されたヒトの細胞を用いることもできる。本発明の方法で有用なヒト不死化細胞系の例には、ヒト細胞と別の種の細胞とを融合させて作成したヘテロハイブリドーマ細胞はもちろんのこと、Bowesメラノーマ細胞（ATCC寄託番号CRL 9607）、Daudi細胞（ATCC寄託番号CCL 213）、Hela細胞及びHela細胞の誘導体（ATCC寄託番号CCL 2、CCL 2.1、及びCCL 2.2）、HL-60細胞（ATCC寄託番号CCL 240）、HT1080細胞（ATCC寄託番号CCL 121）、Jurkat細胞（ATCC寄託番号TIB 152）、KB癌細胞（ATCC寄託番号CCL 17）、K-562白血病細胞（ATCC寄託番号CCL 243）、MCF-7乳癌細胞（ATCC寄託番号BTH 22）、MOLT-4細胞（ATCC寄託番号1582）、Namalwa細胞（ATCC寄託番号CRL 1432）、Raji細胞（ATCC寄託番号CCL 86）、RPMI 8226細胞（ATCC寄託番号CCL 155）、U-937細胞（ATCC寄託番号CRL 1593）、WI-38VA13サブライン2R4細胞（ATCC寄託番号CCL 75.1）、及び2780AD卵巣癌細胞（Van der BlickらのCancer Res. 48: 5927-5932, 1988）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
α−ｇａｌ Ａを過剰発現して分泌する細胞を形成するためにα−ｇａｌ ＡをコードするＤＮＡ分子を用いてヒト細胞を遺伝子操作したあとで（または下記に説明したように別の適当な遺伝子的修飾法を行ったあとで）、複数の遺伝的に同一の培養された一次ヒト細胞から本質的になるクローン細胞株、またはその細胞が不死化されている場合は複数の遺伝的に同一の不死化ヒト細胞から本質的になるクローン細胞系を発生させることができる。好ましくはクローン細胞株またはクローン細胞系の細胞は繊維芽細胞である。
続いて遺伝的に修飾された細胞を調製し、適当な方法、例えばSeldenらのWO 93/09222に記載されているような方法によって患者に導入すればよい。
本発明に係る遺伝子治療は、ヒトまたは動物の組織から誘導された酵素を用いて酵素置換治療を行う場合の多くの利点を所有している。例えば本発明の方法は、適当な組織の供給源についてのとても一致しそうにない入手可能性に依存しているのではなく、そのためα−ｇａｌ Ａ欠損症を治療する商業的に存続可能な方法である。それはヒト組織から誘導された酵素を用いる酵素−置換治療法に匹敵するほど比較的にリスクがなく、公知のウイルスまたは未知のウイルスを用いて、また他の感染性の薬剤を用いて感染させることができる。そのうえ本発明に係る遺伝子治療法は、一般的に酵素置換治療法を行った場合の多くの利点を所有している。例えば本発明の方法は、（１）毎日注入する必要性を減少させるといった長期間治療計画についての利点を提供するし、（２）簡便な薬理学的供給に通常付随して起こる、治療用蛋白質の血清濃度及び組織濃度の極端な変動を減少させるし、そして（３）頻繁に投与するために蛋白質を生成し精製することが不必要であるため、酵素置換治療法よりも安価になると考えられる。
上記に記載したようにα−ｇａｌ Ａ欠損症のヒトは精製したα−ｇａｌ Ａを用いて治療することもできる（即ち酵素置換治療法）。またヒトα−ｇａｌ Ａを過剰発現するように遺伝的に修飾された一次、二次、または不死化されたヒト細胞は、インビトロで蛋白質を製造する際にも有用であり、酵素置換治療法を行うために精製されているとよい蛋白質を作成することができる。二次または不死化されたヒト細胞は上記に記載した細胞の中から選択してもよいし、また上記に記載したトランスフェクション法または形質導入法によって遺伝的に修飾してもよい。遺伝的に修飾したあとでその細胞を、α−ｇａｌ Ａを過剰発現し分泌することが可能な条件下で培養する。この蛋白質は、細胞が増殖している培地を収集したり、内容物が遊離するように細胞を溶解したりしてから、次に標準的な蛋白質精製法を適用することで培養細胞から単離する。このような一つの方法には、培養培地、即ちヒトα−ｇａｌ Ａを含む何らかのサンプルが、ブチル基などの機能的部分を持っているブチルセファロース（Butyl Sepharose：登録商標）または他の樹脂のような疎水性の相互作用樹脂を通過する工程を含む。サンプルをこのような樹脂に通す工程は、第１クロマトグラフィー工程で構成することができる。更に精製することが必要であれば、疎水性の相互作用樹脂から溶出したα−ｇａｌ Ａ含有材料を、ヘパリンセファロース（Heparin Sepharose：登録商標）のような固定化ヘパリン樹脂、ハイドロキシアパタイト、Ｑセファロース（Q Sepharose：登録商標）のようなアニオン交換樹脂、またはスーパーデックス（Superdex：登録商標）２００のようなサイズ排除樹脂などの第２の樹脂を含むカラム上を通過させるとよい。精製プロトコールに、それぞれ上記のタイプの樹脂を使用することが含まれると好ましい。また疎水性の相互作用樹脂の前またはその樹脂に代えて、後者の樹脂の一つまたはそれ以上を用いてもよい。
比較的高い純度のα−ｇａｌ Ａを調製する以前の方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー（コンカナバリンＡ（Con A）セファロース）とセファロースマトリックスに結合した基質アナログであるＮ−６−アミノヘキサノイル−α−Ｄ−ガラクトシルアミンへのα−ｇａｌ Ａの結合性に基づいた親和性クロマトグラフィーとの組合せを利用している親和性クロマトグラフィーを使用することに依存していた（BishopらのJ. Biol. Chem. 256: 1307-1316, 1981）。蛋白質のレクチン親和性樹脂と基質アナログ樹脂とを使用すると通常、固体支持体からの親和剤の連続的な浸出が関わってくるため（cf. MarikarらのAnal. Biochem. 201: 306-310, 1992）、その結果精製した生成物の親和剤による不純物混入が溶液に遊離状態になっているか溶出した蛋白質に結合しているかのいずれかで起こる。このような不純物混入により、生成物が薬学的調製物として使用するに好ましくないものとなってしまう。また結合した基質アナログ及びレクチンも、蛋白質の酵素的、機能的、及び構造的性質に対し実質的にネガティブな影響を持っている可能性がある。さらにこのような親和性樹脂は通常、合成するには高価であり、そのことがそのような樹脂の利用を従来のクロマトグラフィー樹脂以上の商業的規模で製造するには適当ではないようにしてしまう。したがって、大規模の商業的利用に適当な供給及び質の点で容易に入手可能な従来のクロマトグラフィー樹脂を用いる精製プロトコールの開発が本発明の重要な利点である。
α−ｇａｌ Ａ欠損症になっていると推測されるヒトは、薬学的に許容される精製ヒトα−ｇａｌ Ａを標準的な方法、即ち次の方法に限定するわけではないが、静脈内注入、皮下注入、もしくは筋肉内注入、または固体の移植物としての方法によって投与することで治療できると考えられる。この精製蛋白質は、生理学的に許容される賦形剤、例えばヒト血清アルブミンのようなキャリアを含むｐＨ６．５またはそれ以下の水性溶液からなる治療用組成物として処方してもよい。
本発明はしたがって、適当にグリコシル化されていて、そのため治療上利用できるヒトα−ｇａｌ Ａを大量に得るための方法を提供する。これによって、α−ｇａｌ Ａ欠損症に対する酵素置換治療が商業的に存続可能なものとなり、もちろんヒトまたは動物の組織から誘導された酵素を用いる治療法に匹敵するほど相対的にリスクもない。
熟練された技術者であれば、ヒトα−ｇａｌ ＡのＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ）、またはサイレントコドンの変化もしくはアミノ酸の同類置換をもたらすようなコドンの変化のいずれかがあるためにそれとは異なっている配列を、培養されたヒト細胞を遺伝的に修飾することによって酵素を過剰発現して分泌するように用いることができる点を認識できるであろう。また、α−ｇａｌ ＡのＤＮＡ配列においてある種の突然変異が起こって、良好になったα−ｇａｌ Ａの酵素的活性（本明細書に記載したように、培養された細胞において突然変異ＤＮＡ分子を発現させること、コードされたポリペプチドを精製すること、及び触媒活性を測定することによって明らかとされるように）を保持している、即ち示すようなポリペプチドをコードできる可能性もある。例えば、特定すると同類のアミノ酸置換が蛋白質における残基の総量の１０％未満に現れている場合に、生物活性にほとんど影響がないか全く影響のない同類のアミノ酸置換が起こっていると予測できる。同類置換には通常、次のグループ内の置換が含まれる。即ち、グリシンとアラニン、バリンとイソロイシンとロイシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン、リジンとアルギニン、及びフェニルアラニンとチロシンである。
細胞によるα−ｇａｌ Ａの産生は、ある遺伝子操作によって最大にできる。例を挙げるとα−ｇａｌ ＡをコードするＤＮＡ分子は、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、グルカゴン、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体、またはα−ｇａｌ Ａ以外のリソソームの酵素のシグナルペプチドのような異型のシグナルペプチドをコードすることもできる。好ましくはシグナルペプチドはｈＧＨシグナルペプチド（配列番号：２１）であって、コードされた蛋白質のN末端である。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列はｈＧＨ遺伝子の第１イントロンのようなイントロンを含んでいてもよく、その結果、配列番号：２７のようなＤＮＡ配列になる（図１０も参照のこと）。さらにまた、ＤＮＡ分子は少なくとも６個のヌクレオチド長の３’非翻訳配列（ＵＴＳ）を含んでいてもよい（３’ＵＴＳ、即ちコード配列にある必須のポリアデニル化部位を持たないヒトで見られるα−ｇａｌ ＡのｍＲＮＡとは対照的である）。このＵＴＳはコード配列の終結コドンの３’に隣接して存在しており、ポリアデニル化部位を含んでいる。好ましくは少なくとも６個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１２個、そして最も好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド長であり、どの場合も配列ＡＡＴＡＡＡまたはポリアデニル化を促進するようにはたらく関連配列を含んでいる。記載したようなＤＮＡ分子、即ちα−ｇａｌ Ａに結合したｈＧＨシグナルペプチドをコードしていてポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＳを有し、そして好ましくは発現調節配列を含むようなＤＮＡ分子も本発明に入る。また、α−ｇａｌ Ａに結合したｈＧＨのシグナルペプチドまたは何らかの他の異種ポリペプチド（即ち、ｈＧＨ以外のどれかのポリペプチド、またはｈＧＨのアナログ）を含む蛋白質をコードするＤＮＡ分子も本発明の範囲内に入る。異種ポリペプチドは、通常は哺乳動物の蛋白質、例えば何らかの医学的に望ましいヒトポリペプチドである。
本発明の他の特徴や利点は、次の詳細な説明から、また請求の範囲から明かとなると思われる。
細胞に関して本明細書で用いられる「遺伝的に修飾された」という用語は、特定の遺伝子産物および／またはコード配列の発現をコントロールする調節要素をコードするＤＮＡ分子を導入したあとで、その特定の遺伝子産物が発現する細胞が包含されていることを意味する。ＤＮＡ分子の導入は遺伝子の標的化（即ち、特定のゲノム部位へのＤＮＡ分子の導入）によって成し遂げられ、更に相同組換えによって欠損遺伝子自体の置換が可能になる（欠損したα−ｇａｌ Ａ遺伝子またはその一部分が、ファブリー病の患者自身の細胞において、遺伝子全体またはその一部分と置き換えられうる）。
本明細書で用いられる「α−ｇａｌ Ａ」という用語は、シグナルペプチドを持たないα−ｇａｌ Ａ、即ち配列番号：２６（図９）を意味する。配列番号：２６（図９）の残基３７１から３９８または３７３から３９８がリソソームにおいて除去される可能性があること、しかしながらこの推定されている除去前のペプチドが除去されても酵素の活性に影響を与えないと考えられていることについていくらかの表示がある。このことは、推定されている除去前のペプチドのある部分が活性に影響を与えることなく欠失できることを示唆している。したがって本明細書で用いられる「α−ｇａｌ Ａ」という用語は、その配列のＣ末端で２８残基までを欠いている以外は配列番号：２６に対応する配列を持つ蛋白質もカバーする。
「α−ｇａｌ Ａ欠損症」とは、ある患者においてこの酵素の量または活性が欠乏していることを意味する。この欠損症は、ファブリー病を患っている男性で典型的に観察されるような重篤な症候を誘導する可能性があり、また一部のみを誘導したり、欠損遺伝子の異型接合体の女性のキャリアで見ることのできるような比較的緩和な症候を誘導したりする可能性がある。
本明細書で用いられる「一次細胞」という用語は、脊椎動物の組織供給源から（それらを移植する、即ち皿やフラスコのような組織培養基板に付着させる前に）単離された細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織から誘導された組織片に存在する細胞、初回に移植された二つの前のタイプの細胞、そしてこれらの移植された細胞から誘導される細胞懸濁液を含む。
「二次細胞」とは、培養における全ての次の段階の細胞のことを言う。即ち初回に植え付けられた一次細胞が培養基質から除去されて、再移植される（継代した）と、それは続く継代に存在する全ての細胞も同じく二次細胞と言われる。
「細胞株」は、一回またはそれ以上継代を行った二次細胞からなっていて、培養により有限数の平均的な固体群倍増を示すとともに、接触−阻害される固定法依存で成長する性質（懸濁液培養で増殖させた細胞は除く）を示し、また不死化されていない。
「不死化された細胞」とは、培養の際に明らかに際限のない寿命を示す確立された細胞系から得られる細胞を意味する。
「シグナルペプチド」とは、さらなる翻訳後処理および／または分布のために小胞体に付着した新しく合成されたポリペプチドに指向するペプチド配列を意味する。
α−ｇａｌ Ａについての前後関係で本明細書で用いられているような「異種シグナルペプチド」という用語は、ヒトα−ｇａｌ Ａシグナルペプチドではないシグナルペプチド（即ち、配列番号：１８のヌクレオチド３６〜１２８によってコードされているペプチド）を意味する。それは通常、α−ｇａｌ Ａ以外の何らかの哺乳動物の蛋白質のシグナルペプチドである。
「第１クロマトグラフィー工程」という用語は、クロマトグラフィーカラムへのサンプルの最初の適用を意味する（サンプルの調製に関与する全ての工程は除く）。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーからα−ｇａｌ Ａを単離するために用いた２１０ｂｐのプローブの表示である（配列番号：１９）。この配列はα−ｇａｌ Ａ遺伝子のエキソン７からのものである。プローブはヒトゲノムのＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離した。この図のアンダーラインをつけた領域は、増幅プライマーの配列に対応する。
図２は、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡクローンの５’末端を完成させるＤＮＡフラグメントの配列の表示である（配列番号：２０）。このフラグメントはＰＣＲによってヒトゲノムのＤＮＡから増幅した。アンダーラインをつけた領域は増幅プライマーの配列に対応している。実施例ＩＡに記載されているようにサブクローニングする際に用いられるＮｃｏＩ及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の位置も示されている。
図３は、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡの配列の表示であり、それはシグナルペプチド（配列番号：１８）をコードする配列を含んでいる。
図４は、ｐＸＡＧ−１６、即ちＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターとイントロン、ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列と第１イントロン、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡ（即ちα−ｇａｌ Ａシグナルペプチド配列を欠いている）、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含むα−ｇａｌ Ａ発現構築物の概略地図である。
図５は、pXAG-28、即ちコラーゲンＩα２プロモーター、β−アクチンイントロン、ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列と第１イントロン、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡ（即ちα−ｇａｌ Ａシグナルペプチド配列を欠いている）、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含むα−ｇａｌ Ａ発現構築物の概略地図である。
図６は、ブチルセファロース（登録商標）樹脂を用いるα−ｇａｌ Ａの精製工程のクロマトグラムである。選択したフラクションの２８０ｎｍにおける吸光度（単純な線）とα−ｇａｌ Ａ活性（ドットをつけた線）が示されている。
図７は、本発明により準備したヒトα−ｇａｌ Ａのファブリー繊維芽細胞によるインターナリゼーションを図示している線グラフである。細胞内のα−ｇａｌ Ａ活性と全蛋白質濃度は、本発明により準備したヒトα−ｇａｌ Ａの濃度を増加させて細胞のインキュベートを行ったあとで測定した。潜在的なインターナリゼーション−インヒビター、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ；白いひし形）とマンナン（白丸）の効果が示されている。
図８は、α−ｇａｌ Ａのインターナリゼーションのあとでファブリーの繊維芽細胞を調べるべく設計された実験の典型の外略図である。ファブリー細胞のα−ｇａｌ Ａ活性は、正常のヒト繊維芽細胞かトランスウェル（Transwell：商品名）挿入物で培養したα−ｇａｌ Ａを過剰発現するヒト繊維芽細胞かいずれかにさらした後で測定する。「Ｍ６Ｐ」＝マンノース−６−ホスフェート。「Ｕｎｔｒｆ ＨＦ」＝トランスフェクトされていないヒト繊維芽細胞、「ＢＲＳ１１」＝トランスフェクトしたα−ｇａｌ Ａ−過剰発現繊維芽細胞株。
図９は、ヒトα−ｇａｌ Ａアミノ酸配列（配列番号：２６）の表示である。
図１０は、ｈＧＨシグナルペプチドをコードし、第１ｈＧＨイントロン（アンダーライン）を含むＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２７）。
図１１は、イントロンを持たないｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２２）。
図１２は、ｈＧＨシグナルペプチドのアミノ酸配列の表示である（配列番号：２１）。
図１３は、ヒトα−ｇａｌ Ａ（シグナルペプチドを持たない）をコードするｃＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２５）。
詳細な説明
α−ｇａｌ Ａのようなリソソームの酵素は、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）受容体、即ち、リソソームの区画のためと運命づけられた酵素のオリゴサッカライド部分に存在するＭ６Ｐ残基に結合する受容体との相互作用により細胞のリソソーム区画を標的として指向する（Kornfeld, S. and Mellman, I, Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483-525, 1989）。一次の相互作用はゴルジ体で起こり、そこではゴルジのＭ６Ｐ受容体に結合した酵素がリソソームに移行するために分離される。二次的なタイプの相互作用は、細胞表面にて細胞外のα−ｇａｌ ＡとＭ６Ｐとの間で起こると考えられている。細胞によってインターナリゼーションされた細胞外の基質はエンドサイトーシス小胞において細胞質を通って移行し、それは最初のリソソームと融合し、そのリソソームに内容物を移す。この過程で細胞表面のＭ６Ｐ受容体もエンドサイトーシス小胞に導入され、リソソームに移される。
細胞外環境に存在するα−ｇａｌ Ａは、それがＭ６Ｐ残基を運搬している場合には細胞表面のＭ６Ｐ受容体に結合し、そのためその受容体とどもにリソソームの区画に移行することができる。このスキャベンジャーの結果として一旦リソソームの区画に入ると、酵素は適当な機能を挙行できる。したがって、仮に細胞がそれ自身のα−ｇａｌ Ａを産生する場合に遺伝子的欠陥があったとしても、（ａ）酵素が適当にグリコシル化されていること及び（ｂ）欠陥のある細胞がＭ６Ｐ受容体を運搬することによって、外因性で製造された酵素を取り上げるための機構が存在する。
ファブリー病では、腎臓及び心臓の血管内皮細胞が重篤な組織病理学上の異常を示すこと、そしてその疾患の臨床上の病理学に関わることがわかっており、Ｍ６Ｐ受容体を運搬しているこれらの細胞は、本明細書で主張している本発明の特定のターゲットである。本発明によって製造されたα−ｇａｌ Ａは、影響を受けている細胞に局所的または全身的のいずれかで遺伝子治療によって（即ち、患者の体内でグリコシル化酵素を発現しかつ分泌するように遺伝的に修飾された細胞によって）、または従来の薬学的投与経路によって供給することができる。したがってＭ６ＰがＮ−結合オリゴサッカライドに存在する場合のα−ｇａｌ Ａは、本発明による治療法にとって非常に重要である。
さらにα−ｇａｌ ＡのＮ一結合オリゴサッカライドがシアリル化によって修飾されている程度も非常に重要である。適当なシアリル化がなされていない場合α−ｇａｌ Ａは、肝臓のアシアロ糖蛋白質受容体によって結合されることに起因して循環系から急速に一掃され、その後インターナリゼーションされてから肝細胞によって分解を受ける（Ashwell及びHarfordのAnn. Rev. Biochem. 51: 531-554, 1982）。これによって、腎臓及び心臓の血管内皮細胞のようなファブリー病の臨床的病理学に寄与する細胞のＭ６Ｐ受容体に結合するために循環系で利用されるα−ｇａｌ Ａの量が減少する。驚くべきことに出願人は、安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって分泌されるα−ｇａｌ Ａが、遺伝子治療によってか精製した分泌蛋白質の従来の薬学的投与法によってファブリー病の治療を行うために適切なグリコシル化の性質をもっていることを見いだした。このことは、最も研究の進んだリソソームの酵素であるグルコセレブロシダーゼについての状況、即ちヒトの胎盤から精製されるかまたは体内で臨床的に関連する細胞にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から分泌された酵素を供給するには、複雑な酵素の酵素的修飾、それに続く精製が必要であるという状況（cf. Beutler, New Engl. J. Med. 325: 1354-1360, 199１）と対照的である。
本発明の治療法は二通りの一般法、即ち酵素を過剰発現し分泌するように遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる精製ヒトα−ｇａｌ Ａの治療上の有効量を患者に導入することによって、またはその患者に過剰発現する細胞自体を導入することによっての二通りの一般法のいずれかで行うことができる。必要な遺伝的修飾を達成する手法については、精製、配合、及び治療の方法として下記に記載されている。
実施例Ｉ．α−ｇａｌ Ａを輸送し発現するように設計された構築物の調製及び利用
二つの発現プラスミドであるｐＸＡＧ−１６及びpXAG-28を構築した。これらのプラスミドには、α−ｇａｌＡ酵素の398のアミノ酸をコードしているヒトα−ｇａｌＡ酵素（α−ｇａｌ Ａシグナルペプチドを欠いている）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の第１イントロンによって割り込まれたｈＧＨシグナルペプチドのゲノムＤＮＡ配列、及びポリアデニル化のシグナルを含むｈＧＨ遺伝子の３’非翻訳配列（ＵＴＳ）が含まれる。プラスミドｐＸＡＧ−１６はヒトサイトメガロウイルスの即時型−初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーターおよび第１イントロン（非コードエクソン配列に隣接）を有しており、これに対してpXAG-28はコラーゲンＩα２プロモーターによって推進され、またβ−アクチン遺伝子の第１イントロンを持つβ−アクチン遺伝子の５’ＵＴＳも含んでいる。
Ａ．完全なα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡのクローニング及びα−ｇａｌ Ａ発現プラスミドｐＸＡＧ−１６の構築
ヒトα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡは、次のように構築したヒト繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。Ｐｏｌｙ−Ａ⁺ｍＲＮＡは全ＲＮＡから単離し、ｃＤＮＡの合成は製造指示書にしたがってラムダザップＩＩ（Iambda Zap II：登録商標）システムの試薬を用いて行った（Stratagene Inc., LaJolla, CA）。簡単に述べると「第１鎖」のｃＤＮＡは、内部ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴーｄＴプライマーの存在下で逆転写を行うことで生成した。続いてＲＮａｓｅ Ｈを用いて処理し、そのｃＤＮＡを二本鎖のｃＤＮＡを生成するためにＤＮＡポリメラーゼＩを用いてニック−トランスレーションした。このｃＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端を形成し、ＥｃｏＲＩアダプターに連結した。この連結の生成物をＴ４ＤＮＡキナーゼで処理してからＸｈｏＩを用いて切断した。そのｃＤＮＡをセファクリルー４００（Sephacryl-400：登録商標）クロマトグラフィーによってフラクションに分けた。大量で中間の大きさのフラクションを集め、そのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ−切断性のラムダザップＩＩ（lambda ZapII）アームに連結した。次にこの連結反応の生成物を包装し、力価を測定した。主なライブラリーは力価が１．２×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌであり、平均的な挿入物の大きさは９２５ｂｐであった。
ヒトα−ｇａｌ Ａ遺伝子のエキソン７から得られる２１０ｂｐのプローブ（図１の配列番号：１９）を、ｃＤＮＡを単離するために用いた。このプローブ自体は次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣ−３’（オリゴ１；配列番号１）及び５’−ＴＣＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＧ−３’（オリゴ２；配列番号：２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによってゲノムＤＮＡから単離した。続いてこのＰＣＲ生成物を繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用い、ポジティブのクローンを単離してからさらに特徴を明らかにした。一つのポジティブなクローンであるファージ３Ａを、ラムダザップＩＩ（lambda ZapII：登録商標）システム摘出プロトコール（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）に、その製造指示書に従ってかけた。この方法によってプラスミドｐＢＡＳＡＧ３Ａが得られ、それはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（商品名）プラスミドバックボーンにα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡ配列を含んでいる。ＤＮＡの配列決定によってこのプラスミドはｃＤＮＡ配列の完全な５’末端を含まないことが明かとなった。したがって５’末端は、ヒトゲノムのＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントを用いて再構築した。これを達成するために、２６８ｂｐのゲノムＤＮＡフラグメント（図２の配列番号：２０）を次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＡＴＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴ−３’（オリゴ；配列番号：３）及び５’−ＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴ−３’（オリゴ４；配列番号：４）を用いて増幅した。このフラグメントを「ＴＡ」クローニングプラスミド（Invitrogen Corp., San Diego, CA）にサブクローニングすることでプラスミドｐＴＡＡＧＥＩを生成した。プラスミドｐＢＳＡＧ３Ａはα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡ配列の大部分を含んでおり、またｐＴＡＡＧＥＩはα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡの５’末端を含んでいて、その両方をそれぞれＳａｃＩＩ及びＮｃｏＩを用いて切断した。増幅したＤＮＡフラグメント内のＳａｃＩＩ及びＮｃｏＩ部位に関連した位置が図２に示されている。ｐＴＡＡＧＥＩから得られる０．２ｋｂのＳａｃＩＩ−ＮｃｏＩフラグメントを単離して、同等に切断したｐＢＳＡＧ３Ａに連結した。このプラスミド、ｐＡＧＡＬは完全なα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡ配列を含んでいて、それにはα−ｇａｌ Ａシグナルペプチドをコードする配列が含まれている。このｃＤＮＡは完全に配列決定され（α−ｇａｌ Ａシグナルペプチド、配列番号：１８を含んでいて図３に示されている）、ヒトα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡについて公開されている配列（Genebank sequence HUMGALA）と同一であると判明した。
このプラスミドｐＸＡＧ−１６は、次のような数種の中間体を経て構築した。まず第一にｐＡＧＡＬをＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩを用いて切断し、平滑末端にした。第二にこの完全なα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡの末端をＸｂａＩリンカーに連結してから、ＸｂａＩで切断したｐＥＦ−ＢＯＳにサブクローニングし（MizushimaらのNucl. Acids Res. 18: 5322, 1990）、ｐＸＡＧ−１を作成した。この構築物は、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の３’ＵＴＳと、α−ｇａｌ Ａにα−ｇａｌ ＡのシグナルペプチドをプラスしてコードしたｃＤＮＡをフランキングするヒト延長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターとを含んでおり、それによってα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡの５’末端がＥＦ−１αプロモーターに融合できるようになっている。ＣＭＶ ＩＥプロモーターと第１イントロンを用いて構築物を形成するために、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡとＧ−ＣＳＦの３’ＵＴＳを２ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＸＡＧ−１から除去した。このフラグメントを平滑末端化してＢａｍＨＩリンカーに連結し、ＢａｍＨＩ切断したｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏ（下記に記載したように構築した）に挿入した。この方針は、α−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡの５’末端がＣＭＶ ＩＥプロモーター領域に融合するようになっている。
ｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏは次のように作成した。ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーターフラグメントは鋳型としてのＣＭＶのゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ−３’（配列番号：２３）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：２４）とを用いてＰＣＲを行って増幅した。得られた産物（１．６ｋｂのフラグメント）をＢａｍＨＩを用いて切断し、ＣＭＶプロモーターを含み結合性のＢａｍＨＩ−切断した末端を持つフラグメントを得た。この新しく発現したユニットを、１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミドｐＭＣｌｎｅｏｐＡ（Stratagene Inc., La Jolla, CA）から単離した。このＣＭＶプロモーターを含み新生のフラグメントを、ＢａｍＨＩ−、ＸｈｏＩ−切断プラスミド（ｐＵＣ１２）に挿入した。注目すべきことにｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏは、ヌクレオチド５４６で始まりヌクレオチド２１０５で終わる（Genebank sequence HS5MIEPについて）ＣＭＶ ＩＥプロモーター領域と、このＣＭＶ ＩＥプロモーターフラグメントに直接５’が結合するヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes Simplex Virus：ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター（ＴＫｎｅｏ遺伝子）によって推進されるネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。新生遺伝子の転写の方向は、ＣＭＶプロモーターフラグメントの方向と同じである。この中間構築物はｐＸＡＧ−４と言われた。
ｈＧＨ３’ＵＴＳを追加するために、ＧＣＳＦ３’ＵＴＳをＸｂａＩ−ＳｍａＩフラグメントとしてｐＸＡＧ−４から除去し、ｐＸＡＧ−４の末端を平滑化した。ｈＧＨ３’ＵＴＳは、０．６ｋｂのＳａｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＸＧＨ５（SeldenらのMol. Cellular Biol. 6: 3173-3179, 1986）から除去した。このフラグメントを平滑末端化した後でそれを、ｐＸＡＧ−４の平滑末端化したＸｂａＩ部位のすぐ後でｐＸＡＧ−４に連結した。この中間体はｐＸＡＧ−７と言われた。ＴＫｎｅｏフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメントとしてこのプラスミドから除去し、そのプラスミドの末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで「充填（filling-in）」することによって平滑化した。ＳＶ４０初期プロモーターによって推進されるネオマイシン耐性遺伝子は、ｐｃＤＮｅｏ（ChenらのMol. Cellular Biol. 7: 2745-2752, 1987）の切断物由来の平滑化ＣｌａＩ−ＢｓｍＢＩフラグメントとして連結し、α−ｇａｌ Ａ転写物ユニットとして同じ方向に新しい転写ユニットが位置づけられる。この中間体はｐＸＡＧ−１３と言われた。
２６個のアミノ酸ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列及びｈＧＨ遺伝子の第１イントロンを持っているｐＸＡＧ−１６を完成させるために、ｐＸＡＧ−１３の２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを初めに除去した。このフラグメントはα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡとｈＧＨの３’ＵＴＳを含んでいた。この大きなフラグメントを３個のフラグメントと置き換えた。第１番目のフラグメントはｐＸＧＨ５の０．３ｋｂのＰＣＲ産物からなり、それはｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列を含んでいて、Ｋｏｚａｋ共通配列のすぐ上流側に位置している合成のＢａｍＨＩ部位からｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列の末端までであった。次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡ−３’（オリゴＨＧＨ１０１；配列番号：５）及び５’−ＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＴＴＧＡＡ−３’（オリゴＨＧＨ１０２；配列番号：６）を、このフラグメント（フラグメント１）を増幅するために用いた。第２番目のフラグメントは、３９８アミノ酸のα−ｇａｌ Ａ酵素（即ち、α−ｇａｌ Ａシグナルペプチドを欠く）をコードするｃＤＮＡの開始部からＮｈｅＩ部位までに対応する配列を含む０．２７ｋｂのＰＣＲ産物からなっていた。次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣ−３’（オリゴＡＧ１０；配列番号：７）及び５’−ＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＴＣＣ−３’（オリゴＡＧ１１；配列番号：８）は、このフラグメント（フラグメント２）を増幅するために用いた。第３番目のフラグメントはｈＧＨ３’ＵＴＳと同様に、残っているα−ｇａｌ Ａ配列を含むｐＸＡＧ−７のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントからなっていた（フラグメント３）。
フラグメント１（ＢａｍＨＩとＮａｅＩを用いて切断されている）、フラグメント２（ＰｖｕＩＩとＮｈｅＩを用いて切断されている）、及びフラグメント３を、新生遺伝子とＣＭＶ ＩＥプロモーターを含むｐＸＡＧ−１３の６．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと混合し、プラスミドｐＸＡＧ−１６（図４）を生成するために一緒に連結した。
Ｂ．α−ｇａｌ Ａ発現プラスミドpXAG-28の構築
ヒトコラーゲンＩα２プロモーターを次のようにα−ｇａｌ Ａ発現構築物pXAG-28で利用すべく単離した。ヒトコラーゲンＩα２プロモーターの部分を含むヒトゲノムのＤＮＡからなる４０８ｂｐのＰＣＲフラグメントを次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＡ−３’（オリゴ７２；配列番号：９）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣ−３’（オリゴ７３；配列番号：１０）を用いて単離した。
このフラグメントは、ＥＭＢＬ３（Clontech Inc., Palo Alto, CA）においてヒト白血球ライブラリーをスクリーニングするために用いた。３．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含む一つのポジティブなクローン（ファージ７Ｈ）を単離し、ＥｃｏＲＩ部位（ｐＢＳ／７Ｈ．２を形成する）でｐＢＳＩＩＳＫ＋（Stratagene Inc., La Jolla, CA）にクローニングした。ＡｖｒＩＩ部位を、ｐＢＳＩＩＳＫ＋ポリリンカーで開裂するＳｐｅＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて「充填」し、さらにオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡＧＴＣＣＴＡＧＧＡ−３’（配列番号：１１）を挿入することによってｐＢＳＩＩＳＫ＋に導入した。ｐＢＳＩＩＳＫ＋のこの変形物をＢａｍＨＩ及びＡｖｒＩＩを用いて切断し、上記に記載した初めの４０８ｂｐコラーゲンＩα２プロモーターＰＣＲフラグメントの１２１ｂｐからなるＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントに連結してｐＢＳ／１２１ＣＯＬ．６を作成した。
このプラスミドｐＢＳ／１２１ＣＯＬ．６を、ｐＢＳＩＩＳＫ＋ポリリンカー配列で開裂するＸｂａＩを用いて切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで「充填」してからＡｖｒＩＩを用いて切断した。ｐＢＳ／７Ｈ．２の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントを単離し、ＢａｍＨＩ部位をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理することによって平滑末端化した。続いてこのフラグメントをＡｖｒＩＩを用いて切断し、ＡｖｒＩＩ−切断ベクターに連結することによってコラーゲンプロモータープラスミドｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８を作成した。
次にこのコラーゲンプロモーターを、ヒトβ−アクチン遺伝子の第１イントロンを含むヒトβ−アクチン遺伝子の５’ＵＴＳに融合した。この配列を単離するために２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＴ−３’（オリゴＢＡ１；配列番号：１２）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＧＣＣ−３’（オリゴＢＡ２；配列番号：１３）を用いてヒトゲノムのＤＮＡから単離した。
このフラグメントをＢａｍＨＩ及びＢｓｉＨＫＡＩで切断することによって、β−アクチンの５’ＵＴＳ及びイントロンを含む０．８ｋｂのフラグメントを開放した。それから３．６ｋｂのＳａｌＩ−ＳｒｆＩフラグメントをコラーゲンプロモータープラスミドｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８から次のように単離した。ｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８をＢａｍＨＩ（ＢａｍＨＩ部位は、コラーゲンＩα２プロモーターフラグメントの５’末端に位置する。）を用いて部分的に切断し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いて処理することによって平滑末端を作り、続いてＳａｌＩリンカー（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＣ−３’）に連結することによって、コラーゲンＩα２プロモーターの上流にＳａｌＩ部位を位置づける。それからコラーゲンのプラスミドをＳａｌＩ及びＳｒｆＩ（このＳｒｆＩ部位はコラーゲンのＩα２プロモーターＣＡＰ部位の１１０ｂｐ上流に位置している）を用いて切断し、３．６ｂｐのフラグメントを単離した。この０．８ｋｂと３．６ｋｂのフラグメントを、ＳａｌＩ−切断及びＢａｍＨＩ−切断のｐＢＳＩＩＳＫ−（Stratagene Inc., La Jolla, CA）で結合し、次の４つのオリゴヌクレオチドからなるフラグメントを一緒にアニール化した（平滑末端とＢｓｉＨＫＡＩ末端を持つフラグメントを形成している）。５’−ＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＧＴＡＴ−３’（オリゴＣＯＬ−１；配列番号：１４）、５’−ＡＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ−３’（オリゴＣＯＬ−２；配列番号：１５）、５’−ＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣ−３’（オリゴＣＯＬ−３；配列番号：１６）、及び５’−ＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＣ−３’（オリゴＣＯＬ−４；配列番号：１７）。これらの４つのオリゴヌクレオチドはアニール化すると、コラーゲンプロモーターのＳｒｆＩ部位で始まり、β−アクチンプロモーターのＢｓｉＨＫＡＩ部位を通って続く領域に対応している。得られたプラスミドは、ｐＣＯＬ／β−アクチンと称した。
pXAG-28の構築物を完成させるために、コラーゲンＩα２プロモーターとβ−アクチン５’ＵＴＳを含むｐＣＯＬ／β−アクチンのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントをｐＸＡＧ−１６（実施例１Ａ及び図４参照）から得られる二つのフラグメント、即ち（１）６．０ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（新しい遺伝子、プラスミドバックボーン、３９８アミノ酸α−ｇａｌ Ａ酵素をコードするｃＤＮＡ、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含む）、及び（２）０．３ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌフラグメント（ｐｃＤｎｅｏ由来のＳＶ４０ポリＡ配列を含む）に連結した。pXAG-28は、ヒトβ−アクチン５’ＵＴＳに融合したヒトコラーゲンＩα２プロモーター、ｈＧＨシグナルペプチド（ｈＧＨ第１イントロンによって割り込まれている）、α−ｇａｌ Ａ酵素をコードするｃＤＮＡ、及びｈＧＨの３’ＵＴＳを含む。完成した発現構築物のpXAG-28の地図が図５に示されている。
Ｃ．α−ｇａｌ Ａ発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションを行った繊維芽細胞のトランスフェクション及びセレクション
繊維芽細胞においてα−ｇａｌ Ａを発現させるために、公開された方法にしたがって二次の繊維芽細胞を培養し、トランスフェクションした（SeldenらのWO 93/09222）。
プラスミドｐＸＡＧ−１３、ｐＸＡＧ−１６及びpXAG-28をエレクトロポレーションによってヒトの包皮の繊維芽細胞にトランスフェクションすることで、安定してトランスフェクトされたクローン細胞株を発生させることができ、そして得られたα−ｇａｌ Ａの発現レベルを実施例ＩＤにおいて記載したようにモニターした。正常の包皮繊維芽細胞によるα−ｇａｌ Ａの分泌は２〜１０ユニット／１０⁶細胞／２４時間の範囲内であった。対照的にトランスフェクトされた繊維芽細胞は、表１に示されているような平均の発現レベルを示した。

これらのデータは、三種すべての発現構築物がトランスフェクトされていない繊維芽細胞の発現の多数倍もα−ｇａｌ Ａの発現を増加させる能力があることを示している。α−ｇａｌ Ａシグナルペプチドに結合したα−ｇａｌ ＡをコードしているｐＸＡＧ−１３を用いて安定してトランスフェクトされた繊維芽細胞による発現は、シグナルペプチドがｈＧＨシグナルペプチドである点だけが異なっていてそのコード配列がｈＧＨ遺伝子の第１イントロンによって割り込まれているようなｐＸＡＧ−１６を用いてトランスフェクトした繊維芽細胞による発現よりも実質的に低い。
トランスフェクトした細胞を継代させる度ごとに分泌されたα−ｇａｌ Ａの活性を測定し、その細胞を計数して細胞密度を計算した。植え付けた細胞数とα−ｇａｌ Ａの分泌が可能になった時間に基づいてα−ｇａｌ Ａの特定の発現速度を測定し、２４時間あたり１０⁶個の細胞につき分泌されるユニット（α−ｇａｌ Ａ）として表２及び３に報告されている。遺伝子治療を行う際、またはα−ｇａｌ Ａの精製用の材料の産出において利用する際に好適な細胞株は、数回の継代にわたって安定した成長と発現を示さなくてはならない。α−ｇａｌ Ａ発現構築物ｐＸＡＧ−１６を用いて安定してトランスフェクトされた、表２及び３に示された細胞株から得られるデータは、α−ｇａｌ Ａの発現が数回の継代にわたって安定して維持されているという事実を示している。

Ｄ．α−ｇａｌ Ａ発現の定量化
α−ｇａｌ Ａ活性を、水溶性の基質である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクロピラノシド（4-MUF-gal; Research Products., Inc.）を用い、Ioannouら（J. Cell Biol. 119:1137-1150, 1992）により記載されたプロトコールの変形法によって測定した。この基質は、基質緩衝液（０．１Ｍのクエン酸塩−燐酸塩、ｐＨ４．６）に溶解して濃度を１．６９ｍｇ／ｍｌ（５ｍＭ）にした。典型的には、１０μｌの培養液の上清を７５μｌの基質溶液に添加した。そのチューブを覆い、３７℃の水浴中、６０分間インキュベートさせた。このインキュベーションの終わりに２ｍｌのグリシン−炭酸塩緩衝液（１３０ｍＭのグリシン、８３ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．６）を用いることによって、その反応を止めた。それぞれのサンプルの相対蛍光度を、３６５ｎｍの固定励起波長を持っていて４６０ｎｍの固定放出波長を検出するモデルＴＫ０１００蛍光度測定計（Hoefer Scientific Instruments）を用いて測定した。サンプルの判断は、１μＭのメチルウンベリフェロン（Sigma Chemical Co.）のストックから準備した標準と比較し、加水分解された基質の量を計算した。α−ｇａｌ Ａの活性はユニットで表し、即ち１ユニットのα−ｇａｌ Ａ活性は３７℃で１時間あたりに加水分解された基質の１ナノモルに等価である。細胞発現のデータは一般に、分泌されたα−ｇａｌ Ａ活性ユニット／１０⁶個の細胞／２４時間として表した。またこのアッセイは、細胞溶菌液及び下記に記載したように種々のα−ｇａｌ精製工程から得られるサンプルにおけるα−ｇａｌ活性の量を測定するためにも用いた。
実施例ＩＩ．安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞株の条件が整えられた培地から得られるα−ｇａｌ Ａの精製
実施例ＩＩＡ−ＩＩＥには、α−ｇａｌ Ａを産生するように安定してトランスフェクトされた培養のヒト細胞株の条件付けられた培地からほとんど等質性にその酵素を精製できる点が示されている。
Ａ．α−ｇａｌ Ａの精製における第１工程としてのブチルセファロース（登録商標）クロマトグラフィーの使用
低温条件を整えた培地（１．３４リットル）を遠心分離によって不純物を除去し、ガラス繊維製のプレフィルターを用いた０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。攪拌しながら低温の濾過済み培地のｐＨを１ＮのＨＣｌを滴下して添加することによって５．６に調節し、続いて３．９Ｍの超純粋の硫酸アンモニウムのストック溶液（室温）を滴下により添加することで最終濃度が０．６６Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加えた。この培地をさらに４℃で５分感攪拌し、濾過し、次にブチルセファロース（登録商標）の４高速カラム（4Fast Flow column；カラム容積は８１ｍｌ、２．５×１６．５ｃｍ；Pharmacia, Uppsala, Sweden）、即ち０．６６Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（緩衝液Ａ）で平衡化されたカラムにかけた。このクロマトグラフィーは、全蛋白質濃度と塩濃度をそれぞれ評価するためのライン上に設けたＵＶ（２８０ｎｍ）と導電率モニターを装着したグラジーフラク（Gradi-Frac；商品名）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて４℃で行った。流速１０ｍｌ／分でサンプルを適用してからそのカラムを、カラム容積の１０倍の緩衝液Ａで洗浄した。α−ｇａｌ Ａは、緩衝液Ａ（硫酸アンモニウムを含む）から１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（硫酸アンモニウムを含まない）まで直線状の勾配をつけた１４カラム容積の溶媒を用いてブチルセファロース（登録商標）カラムより溶出した。フラクションを４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイによってα−ｇａｌ Ａ活性について評価し、適当な酵素活性を含むフラクションを集めた。図６及び精製の概要（表３）に示すように、この工程によって約９９％の不純物としての蛋白質が除去されている（カラムに通す前のサンプル＝全蛋白質は８．１４ｇ、カラムを通った後のサンプル＝全蛋白質は０．０６３８ｇ）。

Ｂ．α−ｇａｌ Ａの精製のための工程として、ヘパリンセファロース（登録商標）クロマトグラフィーの利用
ブチルセファロース（登録商標）カラムのピークフラクションを、１０ｍＭのＭＥＳ−トリス（４リットル）、ｐＨ５．６（一度交換）に対して４℃で透析した。透析物の導電度を、必要に応じてＨ₂ＯまたはＮａＣｌを添加することによって４℃で１．０ｍＭＨＯに調節した。その後でサンプルを、９ｍＭのＮａＣｌを含んだ１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（緩衝液Ｂ）で平衡化したヘパリンセファロース（登録商標）６高速のカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden; ２９ｍｌのカラム容積、２．５×６ｃｍ）にかけた。これは１０ｍｌ／分の流速で４℃にて行った。ライン上のＵＶ（２８０ｎｍ）と導電度モニターによって全蛋白質と塩の濃度を測定した。そのサンプルを適用した後でそのカラムを１０カラム容量の緩衝液Ｂで洗浄し、続いて３カラム容量の８％緩衝液Ｃ／９２％緩衝液Ｂ（ここでの緩衝液Ｃは、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６である）までの線形勾配をつけた溶媒、さらに１０カラム容量の８％の緩衝液Ｃを用いて洗浄した。この後、１．５カラム容量の２９％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｃを用いて、続いて１０カラム容量の３５％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｃを用いてα−ｇａｌ Ａの溶出を行った。フラクションはα−ｇａｌ Ａ活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。
Ｃ．α−ｇａｌ Ａを精製するための工程として、ハイドトキシアパタイトの利用
ヘパリンのプールを濾過し、１ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０（緩衝液Ｄ）で平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトＨＣ（４０μｍ；American International Chemical, Ntick, MA; １２ｍｌのカラム容量、１．５×６．８ｃｍ）からなるカラムに直接かけた。そのクロマトグラフィーは、ライン上にＵＶ（２８０ｎｍ）と導電度モニターを装着したハイブリッドグラジーフラク（Gradi-Frac：商品名）／ＦＰＬＣ（登録商標）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて室温で行った。サンプルを適用した（５ｍｌ／分）後でそのカラムを１０カラム容量の緩衝液Ｄで洗浄した。α−ｇａｌ Ａを７カラム容量の４２％緩衝液Ｅ／５８％緩衝液Ｄ（ここでの緩衝液Ｅは、２５０ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０である）までの線形勾配をつけた溶媒、さらに１０カラム容量の５２％までの勾配をつけた緩衝液Ｅを用いて溶出した。フラクションはα−ｇａｌ Ａ活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。
Ｄ．α−ｇａｌ Ａを精製するための工程として、Ｑセファロース（登録商標）アニオン交換クロマトグラフィーの利用
ハイドロキシアパタイトのプールをＨ₂Ｏを用いて約１．５倍に希釈して、最終的な導電度が室温で３．４〜３．６ｍＭＨＯにした。濾過してからそのサンプルを、１０％の緩衝液Ｇ／９０％の緩衝液Ｆで平衡化したＱセファロース（登録商標）ＨＰ（Pharmacia, Uppsala, Sweden；５．１ｍｌのカラム容量、１．５×２．９ｃｍ）からなるカラムに直接かけた。ここで緩衝液Ｆは２５Ｍの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０であり、また緩衝液Ｇは２５ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２５０ｍＭのＮａＣｌである。このクロマトグラフィーは、グラジ−フラク（Gradi-Frac：商品名）／ＦＰＬＣ（登録商標）ハイブリッドシステム（Pharmacia,Uppsala,Sweden）にて室温で行い、全蛋白質と塩の濃度をライン上に設けたモニターで測定した。そのサンプルに５ｍｌ／分の流速を適用してから、次の工程を行った。即ち、（１）１０％の緩衝液Ｇで５カラム容量の洗浄、（２）１２％の緩衝液Ｇで７カラム容量の洗浄、（３）３カラム容量の５０％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｇ、（４）１０カラム容量の５３％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｇ、（５）３カラム容量の１００％までの勾配をつけた緩衝液Ｇ、及び（６）１０カラム容量の１００％の緩衝液Ｇで洗浄工程。α−ｇａｌは工程３及び４の間におもに溶出した。適当な活性を含むフラクションを集めた（「Ｑプール」）。
Ｅ．α−ｇａｌ Ａを精製するための工程として、スーパーデックス（登録商標）−２００ゲル濾過クロマトグラフィーの利用
ＱプールをCentriprep（登録商標）−１０遠心濃縮機ユニット（Amicon, Beverly, MA）を用いて約５倍に濃縮し、スーパーデックス（登録商標）２００（Pharmacia, Uppsala, Sweden；１８９ｍｌのカラム容量、１．６×９４ｃｍ）からなるカラムにかけた。このカラムを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いて平衡化し、溶出した。このクロマトグラフィーは、蛋白質の溶出を追跡するためにライン上のＵＶモニター（２８０ｎｍ）を用いたＦＰＬＣ（登録商標）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて室温で行った。そのカラムにかけたサンプルの容量は≦２ｍｌ、流速は０．５ｍｌ／分、そしてフラクションの量は２ｍｌであった。多数回カラムの作動を遂行し、フラクションをα−ｇａｌ Ａ活性についてアッセイして適当な活性を含むフラクションを集めた。
このスーパーデックス（登録商標）２００カラムから得られるプールされたフラクションをCentriprep−１０ユニットを用いて濃縮し、アリコートにしてからスナップ冷凍し、−８０℃で短期間保存した。α−ｇａｌ Ａの精製についてこの実施例の要約が表３に示されている。α−ｇａｌ Ａの最終収率は出発物質の活性の５９％であり、また精製した産物の比活性は２．９２×１０⁶ユニット／ｍｇ蛋白質であった。得られた産物は、４〜１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で還元条件にして電気泳動を行った後に高いレベルの純度を示し、続いて銀染色を行った。
実施例ＩＩＩ．精製されたα−ｇａｌ Ａの配合及び保存
高度に精製したα−ｇａｌ Ａは、精製された蛋白質（≦１ｍｇの蛋白質／ｍｌ）の希釈溶液として保存した場合、長い期間は安定していない。したがって配合剤を長く保存する間、即ち数週間から少なくとも数カ月間不変のまま保存を行う間、安定性を改善できるように工夫した。精製された酵素を、遠心濃縮機（２５ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び１５０ｍＭのＮａＣｌからなる酵素緩衝液中で）を用いて少なくとも１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ブミネート（Buminate：登録商標、Baxter-Hyland）を添加して最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌにした。それからこの蛋白質溶液を、シリンジに取り付けた０．２μｍの酢酸セルロースフィルター（Schleicher and Schuell）を用いて滅菌濾過した。α−ｇａｌ Ａ溶液を、滅菌した発熱体フリーのガラス溶液に分配し、テフロン製の蓋で密閉し、スナップ冷却を行ってから−２０℃で保存した。
α−ｇａｌ Ａ活性の安定性は、４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイを用いて３カ月間にわたって評価した。表５に示されたデータは、テストした期間にわたって酵素活性の喪失が起こらなかったことを証明している。配合剤が酸性ｐＨ（＜６．５）であることは、高度に精製した酵素の安定性にとって重要である。

実施例ＩＶ．ヒト細胞株によって産生したα−ｇａｌ Ａは、α−ｇａｌ Ａ欠損症を治療するのに適当である。
本発明により調製した精製ヒトα−ｇａｌ Ａの構造的及び機能的特徴を、この明細書に記載されたＤＮＡ分子とトランスフェクトしたヒト細胞株によって産生された対応する発現糖蛋白質とがそれぞれ遺伝子治療または酵素置換治療で利用可能であることを証明するために調べた。
Ａ．培養中の安定してトランスフェクトされたヒト細胞により産生したα−ｇａｌ Ａのサイズ
α−ｇａｌ Ａの分子質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定法で見積った。これらの結果から、ダイマーの分子質量が１０２，３５３Ｄａであり、これに対してモノマーの分子質量が５１，００２Ｄａであることが証明された。アミノ酸組成に基づいてモノマーについて予測された分子質量は４５，４００Ｄａである。したがって、酵素の炭水化物含有量は５，６００Ｄａまでの分子量であるとの計算が推測できる。
精製した蛋白質に対して行った標準的なアミノ酸分析の結果は、トランスフェクトしたヒト細胞によって産生された蛋白質がヒト組織から精製した蛋白質にアミノ酸レベルで同一であるという推断と一致している。
Ｂ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌ ＡのN末端処理
ヒトα−ｇａｌ ＡのｃＤＮＡヌクレオチド配列は４２９個のアミノ酸をコードする。３１個のN末端アミノ酸はシグナルペプチド配列を構成し、それは形成されつつある蛋白質が内部細胞質の網状質を通過するように開裂する（LeDonneらのJ. Biol. Chem. 262: 2062, 1987）。α−ｇａｌ Ａが異型のシグナルペプチド配列（例えば、ヒト成長ホルモンのシグナル配列）と関連していて、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞において発現する場合にα−ｇａｌ Ａが適当に処理されることを確認するために、分泌された蛋白質の１０個のN末端アミノ酸をミクロシークエンシングした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、１０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１．０）、１０％のメタノール緩衝液システムを用いてプロブロット（ProBlott：登録商標、ABI, Foster City, CA）に転写した。プロブロット上の蛋白質はクマージー染色によって可視化し、そして適当サイズ（５０ｋＤａ）のバンドを削り取った。N末端の配列は、自動化エドマン分解を行うアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）パルス−液相アミノ酸配列同定装置を用いて得た。得られたN末端配列、ＬＤＮＧＬＡＲＴＰＴ（配列番号：２８）は、シグナルペプチドの適切な開裂と一致しており、分泌された蛋白質に対して予測されているN末端配列と適合する。
Ｃ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌ ＡのＣ末端アミノ酸
本発明により産生された分泌α−ｇａｌ ＡのＣ末端アミノ酸残基は、自動化ヒューレットパッカードＣ末端配列決定装置（Hewlett Packard C-terminal sequencer）を用いて同定した。この結果はＣ末端がロイシン残基であることを示しており、それはこのＤＮＡ配列によって予言されたＣ末端アミノ酸と一致している。
Ｄ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌ Ａの炭水化物の修飾
本発明により産生されたα−ｇａｌ Ａのグリコシル化パターンも評価した。適当にグリコシル化されることは、α−ｇａｌ Ａがインビボで最適な活性を示すために重要である。即ち非グリコシル化システムで発現したα−ｇａｌ Ａは不活性であったりまたは不安定であったりする（HantzopolousらのGene 57: 159, 1987）。またグリコシル化は、α−ｇａｌ Ａが目的とする標的細胞にインターナリゼーションされるためにも重要であり、インビボでの酵素の循環血中半減期に影響を与える。α−ｇａｌ Ａのそれぞれのサブユニットには、アスパラギンに結合する炭水化物鎖の付加にとって役立つ４つの部位があり、そのうち３つの部位だけが占められている（DesnickらのIn The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, pp2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995）。
安定してトランスフェクトされた細胞によって産生したα−ｇａｌ Ａのサンプルを、A. urafaciensから単離したノイラミニダーゼで処理すること（Boehringer-Mnnheim, Indianapolis, IN）によりシアリル酸を除去した。この反応は、５μｇのα−ｇａｌ Ａを１０ｍＵのノイラミニダーゼとともに室温で一晩、全体で１０μｌの酢酸緩衝塩溶液（ＡＢＳ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で処理することによって進行させた。
安定してトランスフェクトされた細胞によって産生した精製α−ｇａｌ Ａも、アルカリホスファターゼ（子ウシ小腸のアルカリホスファターゼ、Boehringer-Mnnheim, Indianapolis, IN）を用いて脱リン酸化したが、それは５μｇのα−ｇａｌ Ａを、ＡＢＳ（１ＭのトリスでｐＨを７．５に上昇させた）中に入れた１５Ｕのアルカリホスファターゼを用いて室温で一晩処理することによって行った。
このサンプルを、α−ｇａｌ Ａ特異性抗体を用いたウエスターンブロットにより分析した。用いた抗体はウサギのポリクローナル抗ペプチド抗体であり、それは免疫原としてα−ｇａｌ Ａのアミノ酸６８〜８１を表すペプチドを用いて産生させた。その後この蛋白質をＰＶＤＦ（Millopore, Bedford, MA）に移してからその膜を、抗血清が２．５％のブロット（脱脂したドライミルクの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．５、０．０５％のトウィーン−２０）中に含まれる１：２０００希釈液を用いてプローブした。この後で、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（Organon Teknika/Cappel, Durham, NC; 1:5000希釈液）に複合化したヤギ抗ウサギＩｇＧとＥＣＬ化学ルミネセンスキット（Amersham. Arlington Heights, IN）の試薬を用いて検出した。
ノイラミニダーゼを用いてα−ｇａｌ Ａを処理すると分子質量にわずかなシフト（約１５００〜２０００ダルトンまたは４〜６シアリル酸／モノマー）が起こるが、これはシアリル酸によりα−ｇａｌ Ａが広範囲に修飾されたことを示唆している。参考のために言うと、α−ｇａｌ Ａの血しょうの形態にはモノマー１個あたり５〜６個のシアリル酸残基があり、また胎盤の形態にはモノマー１個あたり０．５〜１．０個のシアリル酸残基がある（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1307, 1981）。
α−ｇａｌ Ａのシアリル酸とマンノース−６−燐酸による修飾を調べるために用いられる別の方法としては等電点分離法（ＩＥＦ）があり、それではサンプルが等電点（ＰＩ）または正味の電荷に基づいて分離される。こうしてα−ｇａｌ Ａから得られるシアリル酸や燐酸のようなチャージした残基が除去されると、ＩＥＦシステムにおいて蛋白質の移動度が変わって来ると予測される。
ＩＥＦ実験を行うためには本発明により産生したα−ｇａｌ Ａのサンプルを、２×Novexサンプル緩衝液（８Ｍのウレアを用いている、ｐＨ３．０〜７．０）とともに１：１で混合したノイラミニダーゼ及びアルカリホスファターゼを用いて処理し、ファルマライト（Pharmalyte：登録商標、Pharmacia, Uppsala, Sweden、ｐＨ３．０〜６．５、Pharmalyte（登録商標）４〜６．５及び２．５〜５．５、ゲルあたりそれぞれ０．２５ｍｌ）を用いて作った６ＭウレアのＩＥＦゲル（５．５％ポリアクリルアミド）にかけた。等電点の標準物質（Bio-Rad）も含ませた。電気泳動を行ったあとでそのゲルをＰＶＤＦに移し取り、ウエスターンブロット分析を上記に記載したように行った。
安定してトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によって産生したα−ｇａｌ Ａは、約４．４〜４．６５の範囲のｐＩを持つ三種の主要なイソ型からなる。これらの値はα−ｇａｌ Ａの血しょうの型及び胎盤の型のｐＩと同じである（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1307, 198１）。酵素のノイラミニダーゼ処理によって三種すべてのイソ型のｐＩが増加したが、このことは全てがサリチル酸によってある程度修飾されていることを示している。これらのデータは、安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌ Ａが望ましい血しょう半減期を持っているに違いないことを示唆しており、そのことはこの材料が薬学的利用するのに充分ふさわしいことを示している。さらに、ノイラミダーゼ処理したα−ｇａｌ Ａをアルカリホスファターゼ処理すると、蛋白質の部分のｐＩが約５．０〜５．１にまでさらに増加したが、このことは酵素が一つまたはそれ以上のマンノース−６−ホスフェート残基を運搬していることを示している。この修飾は、標的細胞によってα−ｇａｌ Ａの効率のよいインターナリゼーションが起こるために必要である点で重要である。
Ｅ．安定したトランスフェクトを行った繊維芽細胞から精製されたα−ｇａｌ Ａの比活性
精製されたα−ｇａｌ Ａの能力または比活性を、酵素の触媒活性（４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイを用いて）と、蛋白質濃度の両方を測定することによって計算する。蛋白質濃度は、ＢＣＡシステム（Pierce）を用いるようなどれかの標準法によって、または２８０ｎｍでの吸収を測定し、吸光度係数２．３ｍｇ／ｍｌ（アミノ酸分析から決定した）を用いて値を計算することによって決定することができる。これらの手法を用いると、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞の条件を整えた培地から精製されたα−ｇａｌ Ａの比活性は２．２〜２．９×１０⁶ユニット／蛋白質のｍｇであり、それはヒト組織から精製されるα−ｇａｌ Ａの比活性に匹敵する（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1301, 1981）。
Ｆ．マンノースまたはマンノース−６−ホスフェートが仲介するα−ｇａｌ Ａのインターナリゼーション
安定したトランスフェクトがなされた細胞によって産生されるα−ｇａｌ Ａがα−ｇａｌ Ａ欠損症の有効な治療薬となるためには、その酵素は影響を受けた細胞によってインターナリゼーションされなくてはならない。α−ｇａｌ Ａは生理学的なｐＨレベルでは活性でなく、また血液や小腸液では有効となりそうではない。リソソームの酸性環境でインターナリゼーションされる場合にのみ、蓄積した脂質基質は最適に代謝される。このインターナリゼーションは、細胞表面に現れていて、エンドサイトーシス経路によってリソソームにそのα−ｇａｌ Ａを供給するマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）受容体にα−ｇａｌ Ａが結合することによって仲介される。Ｍ６Ｐ受容体はいたるところに現れており、ほとんどの体細胞はそれをある程度まで発現する。糖蛋白質上にある露出したマンノース残基に特異的なマンノース受容体はほとんど行き渡ってはいない。後者の受容体は一般に、マクロファージ及びマクロファージ様の細胞にのみ見られるもので、これらの細胞型にα−ｇａｌ Ａが入る別の手段を提供する。
Ｍ６Ｐ−仲介型のα−ｇａｌ Ａのインターナリゼーションを証明するために、ファブリー病の患者から得られる皮膚の繊維芽細胞（NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository）を、増加させた濃度の本発明の精製α−ｇａｌ Ａが存在するところで一晩培養した。そのサンプルのいくつかは５ｍＭの可溶性Ｍ６Ｐを含んでおり、それはマンノース−６−ホスフェート受容体への結合を競合的に阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを競合的に阻害した。他のサンプルは３０μｇ／ｍｌのマンナンを含んでおり、それはマンノース受容体への結合を阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを阻害した。インキュベーションを行ってからその細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのPefabloc（商品名、Boehringer-Mannheim, Indeanapolis, IN）及び１％のＮＰ−４０）に削り落とすことによって採集した。次にその溶解したサンプルを蛋白質濃度とα−ｇａｌ Ａ活性についてアッセイした。結果はα−ｇａｌ Ａ活性ユニット／細胞の蛋白質ｍｇとして表した。ファブリー細胞は用量−依存性の態様でα−ｇａｌ Ａをインターナリゼーションしていた（図７）。このインターナリゼーションはマンノース−６−ホスフェートによって阻害されたが、マンナンでは阻害されなかった。したがって、ファブリー繊維芽細胞におけるα−ｇａｌ Ａのインターナリゼーションはマンノース−６−ホスフェート受容体によって仲介されるが、マンノース受容体によっては仲介されない。
またα−ｇａｌ Ａは、内皮細胞、即ちファブリー病の治療で重要な標的となる細胞によってもインビトロでインターナリゼーションされる。ヒトの臍の緒の血管の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、７５００ユニットのα−ｇａｌ Ａとともに一晩培養した。ウェルのいくつかはＮ６Ｐを含んでいた。インキュベート期間を終えてから細胞を採集し、上記に記載したようにα−ｇａｌ Ａをアッセイした。α−ｇａｌ Ａのみとともにインキュベートした細胞は、コントロール（α−ｇａｌ Ａとともにインキュベートしなかった）の細胞の酵素レベルのほとんど１０倍もの酵素レベルであった。Ｍ６Ｐはα−ｇａｌ Ａの細胞内の蓄積を阻害するが、このことはＨＵＶＥＣによるα−ｇａｌ ＡのインターナリゼーションがＭ６Ｐ受容体によって仲介されることを示唆している。したがって本発明のヒトα−ｇａｌ Ａは、臨床的に関連する細胞によってインターナリゼーションされる。
マンノース受容体を発現することがわかっている培養ヒト細胞株はほとんどない。しかしながらマンノース受容体を運搬するが、マンノース−６−ホスフェート受容体があるならばほんの少しだけ運搬するマウスのマクロファージ様細胞系（Ｊ７７４．Ｅ）を、本発明の精製α−ｇａｌ Ａがマンノース受容体を経てインターナリゼーションされるかどうかを調べるために用いることができる（DimentらのJ. Leukocyte Biol. 42: 485-490, 1987）。Ｊ７７４．Ｅ細胞を１０，０００ユニット／α−ｇａｌ Ａのｍｌが存在するところで一晩培養した。選択したサンプルも２ｍＭのＭ６Ｐを含んでいたが、他のものは１００μｇ／マンナンのｍｌを含んでいた。その細胞を洗浄してから上記に記載したように収集し、それぞれのサンプルの全蛋白質とα−ｇａｌ Ａの活性を決定した。その結果が表６に示されている。Ｍ６Ｐはこれらの細胞によるα−ｇａｌ Ａの取り込みを阻害しないが、マンナンは蓄積されたα−ｇａｌ Ａのレベルを７５％まで減少させた。しがたって本発明のα−ｇａｌ Ａは、マンノース受容体、即ちこの特定の細胞表面受容体を発現する細胞型にあるマンノース受容体によってインターナリゼーションされるらしい。

これらの実験は、安定してトランスフェクトしたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌ Ａがマンノースまたはマンノース−６−ホスフェート受容体を介して細胞によってインターナリゼーションされるらしいことを証明している。
Ｇ．α−ｇａｌ Ａを発現するヒト繊維芽細胞によるファブリー繊維芽細胞の修正
遺伝子治療では、α−ｇａｌ Ａを産生する自家細胞の移植片が適当に修飾された形態でその酵素を産生することによって、標的細胞のα−ｇａｌ Ａ欠損症を「修正」できなくてはならない。ファブリー細胞におけるトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によるα−ｇａｌ Ａの産生の効果を評価するために、ファブリー病の患者から採集した繊維芽細胞（NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository）を、トランスウェルズ（登録商標、Costar, Cambridge, MA）でα−ｇａｌ Ａ−産生細胞株（ＢＲＳ−１１）とともに共培養した。その実験スキームが図８に図示されている。ファブリー細胞は１２ウェルの組織培養皿にて培養し、そのうちのいくつかは、細胞が成長できる表面を持つインサート（トランスウェルズ（Transwells、登録商標、０．４μｍの孔径）を含んでいた。このインサートの成長マトリックスは多孔性であり、巨大分子が上方から下方の環境へと通ることを可能にする。１セットのインサートは、最小レベルのα−ｇａｌ Ａを分泌するヒトの包皮（ＨＦ）の繊維芽細胞を含んでおり、これに対して別のセットは大量のα−ｇａｌ Ａを分泌する安定にトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞株、ＢＲＳ−１１を含んでいた。α−ｇａｌ Ａ−産生細胞とともに共培養したウェルでは、α−ｇａｌ Ａがファブリー細胞を浸している培地に入ることができ、ファブリー細胞によってインターナリゼーションされる可能性を秘めている。
表７のデータは、ファブリー細胞が分泌されたα−ｇａｌ Ａをインターナリゼーションしたことを示している。α−ｇａｌ Ａの細胞内レベルを３日間モニターした。単独で（インサートなしで）培養するか、トランスフェクトされていない包皮の繊維芽細胞（ＨＦインサート）の存在下で培養したこれらの細胞は、α−ｇａｌ Ａ活性の細胞内レベルが非常に低かった。しかしながらα−ｇａｌ Ａ−産生（ＢＲＳ−１１インサート）細胞とともに培養したファブリー細胞は、二日目の終わりまでには正常細胞の酵素レベルと同じくらいの酵素レベルを示した（正常の繊維芽細胞は、α−ｇａｌ Ａが２５〜８０ユニット／蛋白質のｍｇである）。この修正が、Ｍ６Ｐ受容体を介して取り上げられるα−ｇａｌ Ａに起因していることは、マンノース−６−ホスフェート（ＢＲＳ−１１インサート＋Ｍ６Ｐ）を用いてそれが阻害されることによって証明される。

Ｈ．他の細胞型の利用
他の細胞型をこの明細書に記載された方法で利用できる。この細胞はさまざまな組織から得ることができ、またそれには培養して維持できる全ての細胞型が含まれる。例えば、本発明によってトランスフェクトすることのできる一次細胞及び二次細胞には、ヒト繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞（例えば、乳房または小腸の上皮細胞）、内皮細胞、神経膠細胞、神経細胞、血液を形成する要素（例えばリンパ球や骨髄細胞）、筋肉細胞、及びこれらの体細胞型の前駆体が含まれる。繊維芽細胞は特に関心がもたれる。一次細胞は、患者の免疫システムによってそれらが拒絶されることのないように、トランスフェクトした一次または二次の細胞を投与すべき患者から得ると好ましい。しかしながら、免疫拒絶（下記に記載したような）を阻止したり抑制したりするために適当な注意が払われるならば、患者以外のヒトドナーの細胞をうまく用いることができる。このことは、標準化され、確立され、安定してトランスフェクトされた細胞系の使用を、全ての患者において可能にするであろう。
Ｉ．α−ｇａｌ Ａ−発現細胞の投与
上記に記載した細胞は、それらが例えば腎臓の被膜下、皮下の区画部分、中枢神経系、脊髄内空間、肝臓、腹膜腔内空間、または筋肉内などに存在するように、種々の標準化された投与経路を経てヒトに導入することができる。またこの細胞は、ヒトの血流で循環するように静脈内または動脈内に注入してもよい。一旦ヒトに移植すると、そのトランスフェクトされた細胞は治療用産物であるグリコシル化ヒトα−ｇａｌ Ａを産生しかつ分泌する。
ヒトに導入できるように遺伝的に修飾された細胞の数はいろいろ変えることができるが、技術的熟練者によって決定することができる。酵素の分配容積、半減期及び生物利用可能性、並びにインビボでの遺伝的に修飾された細胞の産生性はもちろんのこと、それぞれの患者の年齢、体重、性別及び全身状態が、用量及び投与経路を決定する際のおもに考慮すべきことに入るであろう。通常は、１日あたり１０⁶個の細胞につき１００〜１００，０００ユニットの範囲の発現レベルを呈する１００万個から１０億個の細胞が用いられる。必要であればこの手法は、望ましい結果が得られるまで、例えばファブリー病が関与する症状から開放されるまで繰り返してもよいし、また修飾してもよい。
上記に記載したように用いた細胞は、それらが患者の免疫系によって拒絶されないように一般には患者特異的であり、即ちトランスフェクトされた一次細胞または二次細胞が投与されるべきヒトから得られる細胞である。しかしながらこの計画が可能でなかったり望ましくなかったりする場合には、細胞を別のヒトから入手してこの明細書に記載したように遺伝的に修飾し、そしてα−ｇａｌ Ａ欠損症にかかっている患者に移植すればよい。
受容者以外のヒトから得た細胞を用いると、免疫抑制剤の投与、組織適合抗原の変更、または移植した細胞の拒絶反応を抑制するためのバリア装置の利用が必要となるかもしれない。バリア装置は、分泌された産物が受容者の循環器や組織に入ることを可能にするが、移植された細胞と受容者の免疫システムとの間の接触を阻止し、それにより受容者によるその細胞に対する免疫応答（及び起こりうる拒絶反応）を阻止する材料（例えば、Amicon, Beverly, MAから得られるＸＭ−５０のような膜）からなる。遺伝子治療に関する更なるガイダンスについてはSeldenら（WO 93/09222）を参照のこと。
またこの細胞は、ハイブリッドマトリックス移植物を用いることを記載した共同者自身の文献、U.S.S.N. 08/548/002に記載されているように、あるいは親水性のゲル材料に分泌細胞をマクロカプセル封入化することについて記載しているJainらの出願（PCT出願WO 95/19430）に記載されているように、マトリックスまたはゲル材料に埋め込まれていてもよい（そのそれぞれは参照文献として本明細書に組み入れられる）。
Ｊ．α−ｇａｌ Ａ蛋白質を簡便に投与するための製薬配合剤
安定してトランスフェクトした（または別の方法で遺伝的に修飾した）ヒト細胞によって発現して分泌され、そして本明細書に記載したように精製されるα−ｇａｌ Ａ蛋白質を、α−ｇａｌＡ蛋白質産生が不十分または欠損している患者に投与することができる。この蛋白質は、薬学的に受容可能なキャリアに入れて、例えば実施例ＩＩＩに記載されたような配合剤に入れてｐＨ６．５以下で投与することができる。配合剤で含まれていてもよい賦形剤の例は、クエン酸塩緩衝液、燐酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、もしくは重炭酸塩緩衝液のような緩衝液、アミノ酸、ウレア、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミンもしくはゼラチンのような蛋白質、ＥＤＴＡ、塩酸ナトリウム、リポソーム、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）である。投与経路は例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、脳内、筋肉内、肺内、または粘膜経由であるとよい。投与のルート及び分配される蛋白質の量は、技術熟練者の評価能力に充分入るファクターによって決定することができる。さらに技術熟練者は、治療用蛋白質の投与経路及び用量を、治療用量レベルが得られるまで対象の患者において変化させるとよいことがわかっている。典型的には、α−ｇａｌ Ａは０．０１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与されるであろう。この蛋白質を調節しながら繰り返し投薬することは、患者の生涯にわたって必要であろう。
Ｋ．酵素欠損症によって起こる他の状態の治療
α−ｇａｌ Ａ以外のリソソーム貯蔵酵素の欠損症によって引き起こされる他の状態は、本明細書に記載した方法に匹敵する方法による治療に影響を受けるであろうと見込まれる。これらの場合では、欠乏した酵素の機能的な型をコードするＤＮＡを、本明細書に開示された発現構築物でのα−ｇａｌ ＡをコードするＤＮＡと置換すればよい。確認されている酵素欠損症候群、及び本明細書に記載されたような治療に影響される可能性のある酵素欠損症候群の例が表８に示されている。この表における情報はNeufeld（Ann. Rev. Biochem. 60:257-280, 1991）から得られるものであり、それは参照文献として本明細書に組み入れられる。

Ｖ．他の態様
本明細書に記載された本発明は、トランスフェクション、即ち遺伝子産物をコードするとともに、コード配列の発現をコントロールする調節要素を持っている構築物の導入後に特定の遺伝子産物を発現する細胞を用いる治療方法によって部分的に説明した。またこれらの方法は、他の工程、即ち遺伝子の標的化及び遺伝子の活性化によって遺伝的に修飾された細胞を用いて行ってもよい（参照文献として本明細書に組み入れられるTrecoらのWO 95/31560参照、またSeldenらのWO 93/09222も参照）。
ｈＧＨシグナルペプチドは、異型の蛋白質の発現と分泌のレベルを大きくするためにα−ｇａｌ Ａ以外の異型の蛋白質とともに用いてもよい。このような蛋白質の例にはα−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポ蛋白質Ｅ、アポリポ蛋白質Ａ−１、血液凝固因子Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘ，及びＸＩＩＩ、骨成長因子−２、骨成長因子−７、カルシトニン、触媒性抗体、ＤＮＡｓｅ、エリスロポエチン、ＦＳＨ−β、グロビン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、免疫応答変更遺伝子、イムノグロブリン、インシュリン、インシュリノトロピン、インシュリン様成長因子、インターフェロン−β、インターフェロン−β神経成長因子、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−１受容体のアンタゴニスト、低密度リポ蛋白質受容体、Ｍ−ＣＳＦ、パラチロイドホルモン、プロテインキナーゼＣ、可溶性ＣＤ４、スーパーオキサイドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、ＴＳＨβ、チロシンヒドロキシラーゼ、及びウロキナーゼが含まれる。
他の態様は次の請求の範囲内に含まれる。
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人： Transkaryotic Therapies, Inc.
(ii)発明の名称： α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療
(iii)配列数： 28
(iv)文書通信情報：
(A)宛名： Fish & Richardson P.C.
(B)街路名： 225 Franklin Street
(C)市名： Boston
(D)州名： MA
(E)国名： US
(F)郵便番号： 02110-2804
(V)コンピュータ読み取りフォーム：
(A)メディア形式： Diskette
(B)コンピューター： IBM Compatible
(C)運転システム： Windows95
(D)ソフトウェア： FastSEQ for Windows Version 2.0
(vi)現出願データ：
(A)出願番号： PCT/US97/16603
(B)出願日： 12-SEP-1997
(vii)親出願データ：
(A)出願番号： 08/712,614
(B)出願日： 13-SEP-1996
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)氏名： Fraser, Janis K.
(B)登録番号： 34,819
(C)参照／明細書番号： 07236/003WO1
(ix)電気通信情報：
(A)電話： 617/542-5070
(B)ファックス： 617/542-8906
(C)テレックス： 200154
(2)配列番号：１の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１：

(2)配列番号：２の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：21塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２：

(2)配列番号：３の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：19塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：３：

(2)配列番号：４の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：４：

(2)配列番号：５の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：５：

(2)配列番号：６の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：６：

(2)配列番号：７の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：24塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：７：

(2)配列番号：８の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：20塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：８：

(2)配列番号：９の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：９：

(2)配列番号：１０の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：28塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１０：

(2)配列番号：１１の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：12塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１１：

(2)配列番号：１２の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：22塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１２：

(2)配列番号：１３の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：30塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１３：

(2)配列番号：１４の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：76塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１４：

(2)配列番号：１５の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：69塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１５：

(2)配列番号：１６の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：86塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１６：

(2)配列番号：１７の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：55塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１７：

(2)配列番号：１８の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1343塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１８：

(2)配列番号：１９の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：210塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：１９：

(2)配列番号：２０の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：268塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２０：

(2)配列番号：２１の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：26アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：２１：

(2)配列番号：２２の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：78塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２２：

(2)配列番号：２３の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：35塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２３：

(2)配列番号：２４の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：28塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２４：

(2)配列番号：２５の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：1197塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：Coding Sequence
(B)存在位置：1...1194
(xi)配列の記載：配列番号：２５：

(2)配列番号：２６の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：398アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(v)フラグメント：中間部フラグメント
(xi)配列の記載：配列番号：２６：

(2)配列番号：２７の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：338塩基対
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号：２７：

(2)配列番号：２８の情報：
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：10アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列の記載：配列番号：２８：

Claims (1)

1. サンプルを以下の物質に以下の順番で通過させる工程を含む、サンプルからヒトα−ｇａｌ Ａを精製する方法：
   (a)疎水性相互作用樹脂；
   (b)固定化ヘパリン樹脂；
   (c)ハイドロキシアパタイト；
   (d)アニオン交換樹脂；および
   (e)サイズ排除樹脂。

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