JP2009102321A

JP2009102321A - α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療

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Publication number: JP2009102321A
Application number: JP2008300335A
Authority: JP
Inventors: Richard F Selden; リチャードエフ．セルデン; Marianne Borowski; マリアンボロウスキー; Frances P Gillespie; フランシスピー．ギルスピー; Carol M Kinoshita; キャロルエム．キノシタ; Douglas A Treco; ダグラスエイ．トレコ; Melanie D Williams; メラニーディ．ウィリアムズ
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: EP1538202A3; RU2179034C2; EP2374876A3; EP0935651A2; EP2327775A2; PL190041B1; DK1538202T3; HU227189B1; DE69732129T2; NZ506214A; NO20110496L; ES2234032T3; NZ334721A; JP4313405B2; TW585919B; CN1268741C; HU230275B1; NO991225L; AU4424497A; MX340738B

Abstract

【課題】ファブリー病のようなα−ガラクトシダーゼＡ欠損が疑われる個体を治療するための、ヒトα−ｇａｌＡを過剰発現し分泌するように遺伝的に修飾された移植用ヒト細胞、および精製されたヒトα−ｇａｌＡの提供。
【解決手段】（１）ヒトα−ｇａｌＡを過剰発現し分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞、または（２）遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる精製ヒトα−ｇａｌＡのいずれかを用いて治療する、治療用組成物。
【選択図】なし

Description

発明の背景
本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ及びα−ガラクトシダーゼ欠損症の治療に関する。
ファブリー病はＸ−連鎖で遺伝的に受け継がれるリソソーム蓄積症であって、それは重篤な腎障害、角化血管腫、及び心室拡張や僧帽弁不全などの心血管異常のような症状に特徴がある。またこの疾患は末梢神経系にも影響を及ぼし、激痛、即ち極限状態の強烈な痛みを引き起こす。ファブリー病は酵素のα−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）が欠乏することに原因があり、結果的に中性のグリコスフィンゴ脂質の異化作用が妨害されるとともに、細胞内や血流において酵素基質であるセラミドトリヘキサイドの蓄積が起こる。

この疾患はＸ−連鎖で遺伝的に受け継がれるパターンであるため、必然的に全てのファブリー病患者は雄性である。厳格に影響を受けた雌性の異型接合体もわずかながら観察されているが、雌性の異型接合体は一般に、無症候性かあるいは角膜の特徴的な不透明性にほとんど限定されたかなり緩和な症候が見られるかのいずれかである。低量の残留α−ｇａｌＡ活性を示し、そしてかなり緩和な症候しか示さないかまたはファブリー病に特徴的な他の症候を明らかに示さないような、ファブリー病では典型的とは言えない場合には、左心室肥大や心疾患が関連している（非特許文献１を参照）。α−ｇａｌＡの減少がこのような心臓異常の原因であるかもしれないと推測されている。

ヒトα−ｇａｌＡをコードするｃＤＮＡと遺伝子が単離され、配列決定されている（非特許文献２、３、４を参照）。ヒトα−ｇａｌＡは４２９個のアミノ酸ポリペプチドとして発現し、そのN末端の３１個のアミノ酸はシグナルペプチドを構成している。ヒトの酵素は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（特許文献１、非特許文献５を参照）、昆虫細胞（特許文献２を参照）、及びＣＯＳ細胞（非特許文献６を参照）で発現している。α−ｇａｌＡ置換治療の予備試験について報告されており、それはヒトの組織から誘導された蛋白質を用いている（非特許文献７、８、９を参照）が、現時点でファブリー病の有効な治療法はない。

Desnickの米国特許第5,356,804号 Calhounらの米国特許第5,179,023号 NakanoらのNew Engl. J. Med. 333: 288-293, 1995 BishopらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4859, 1986 KornreichらのNuc. Acids Res. 17: 3301, 1988 OeltjenらのMammalian Genome 6: 335-338, 1995 IoannouらのJ. Cell Biol. 119: 1137, 1992 TsujiらのEur. J. Biochem. 165: 275, 1987 MapesらのScience 169: 987 1970 BradyらのN. Engl. J. Med. 289: 9, 1973 DesnickらのProc, Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326, 1979

発明の概要
培養されたヒトの細胞でヒトα−ｇａｌＡをコードするＤＮＡを発現させると、適当にグリコシル化されたポリペプチドを、酵素的に活性であって、ファブリー病で蓄積するグリコスフィンゴ脂質の基質に作用する能力があるだけでなく、この疾患で必要とされているところ、即ち作用細胞、特に患者の血管の内層の内皮細胞のリソソーム区画に正確にターゲティングさせる細胞表面の受容体を経て細胞によって効率的に中に取り入れられるように生成することが判明している。この知見については下記により詳細に説明されているが、ファブリー病のようなα−ｇａｌＡ欠損症であることが疑われる個体を、（１）ヒトα−ｇａｌＡを過剰発現して分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞、または（２）遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる純粋なヒトα−ｇａｌＡのいずれかを用いて治療することができる。

初めのルートによる治療、即ち修飾された細胞自体を用いる治療には、ヒトの細胞（例えば一次細胞、二次細胞、または不死化細胞）を、高いレベルのヒトα−ｇａｌＡを発現し分泌するように誘導すべくインビトロまたはエクスビボで遺伝子操作すること、続いてSeldenらのWO 93/09222（参照文献として本明細書に組み入れられる）において一般的に記載されているように患者にその細胞を移植することが含まれる。

遺伝子治療または酵素置換治療によってファブリー病の治療を行う目的のために細胞を遺伝的に修飾すべき場合、α−ｇａｌＡのｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子は発現構築物に含まれていて、ヒトの一次細胞または二次細胞（例えば、繊維芽細胞、乳房や腸管の上皮細胞などの上皮細胞、リンパ球や骨髄細胞などの血液の要素を構成する内皮細胞、神経膠細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、神経細胞、またはこれらの細胞型の前駆体）に、トランスフェクションの標準的な方法、即ちこれらに限定するわけではないが、リポソーム媒体トランスフェクション、ポリブレン媒体トランスフェクション、もしくはＤＥＡＥデキストラン媒体トランスフェクション法、エレクトロポレーション、燐酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、または速度推進型微粒子投射法（「バイオリスティックス」）といった方法によって導入されるようになっている。また、ウイルスベクターによってＤＮＡを渡すシステムを用いてもよい。遺伝子トランスファーに有用であると知られているウイルスには、アデノウイルス類、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス類、シンドビスウイルス、及びカナリーポックスウイルスのようなワクシニアウイルスが挙げられる。一次細胞または二次細胞培養物は本発明の治療方法にとって好適であるが、不死化されたヒトの細胞を用いることもできる。本発明の方法で有用なヒト不死化細胞系の例には、ヒト細胞と別の種の細胞とを融合させて作成したヘテロハイブリドーマ細胞はもちろんのこと、Bowesメラノーマ細胞（ATCC寄託番号CRL 9607）、Daudi細胞（ATCC寄託番号CCL 213）、Hela細胞及びHela細胞の誘導体（ATCC寄託番号CCL 2、CCL 2.1、及びCCL 2.2）、HL-60細胞（ATCC寄託番号CCL 240）、HT1080細胞（ATCC寄託番号CCL 121）、Jurkat細胞（ATCC寄託番号TIB 152）、KB癌細胞（ATCC寄託番号CCL 17）、K-562白血病細胞（ATCC寄託番号CCL 243）、MCF-7乳癌細胞（ATCC寄託番号BTH 22）、MOLT-4細胞（ATCC寄託番号1582）、Namalwa細胞（ATCC寄託番号CRL 1432）、Raji細胞（ATCC寄託番号CCL 86）、RPMI 8226細胞（ATCC寄託番号CCL 155）、U-937細胞（ATCC寄託番号CRL 1593）、WI-38VA13サブライン2R4細胞（ATCC寄託番号CCL 75.1）、及び2780AD卵巣癌細胞（Van der BlickらのCancer Res. 48: 5927-5932, 1988）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。

α−ｇａｌＡを過剰発現して分泌する細胞を形成するためにα−ｇａｌＡをコードするＤＮＡ分子を用いてヒト細胞を遺伝子操作したあとで（または下記に説明したように別の適当な遺伝子的修飾法を行ったあとで）、複数の遺伝的に同一の培養された一次ヒト細胞から本質的になるクローン細胞株、またはその細胞が不死化されている場合は複数の遺伝的に同一の不死化ヒト細胞から本質的になるクローン細胞系を発生させることができる。好ましくはクローン細胞株またはクローン細胞系の細胞は繊維芽細胞である。

続いて遺伝的に修飾された細胞を調製し、適当な方法、例えばSeldenらのWO 93/09222に記載されているような方法によって患者に導入すればよい。

本発明に係る遺伝子治療は、ヒトまたは動物の組織から誘導された酵素を用いて酵素置換治療を行う場合の多くの利点を所有している。例えば本発明の方法は、適当な組織の供給源についてのとても一致しそうにない入手可能性に依存しているのではなく、そのためα−ｇａｌＡ欠損症を治療する商業的に存続可能な方法である。それはヒト組織から誘導された酵素を用いる酵素−置換治療法に匹敵するほど比較的にリスクがなく、公知のウイルスまたは未知のウイルスを用いて、また他の感染性の薬剤を用いて感染させることができる。そのうえ本発明に係る遺伝子治療法は、一般的に酵素置換治療法を行った場合の多くの利点を所有している。例えば本発明の方法は、（１）毎日注入する必要性を減少させるといった長期間治療計画についての利点を提供するし、（２）簡便な薬理学的供給に通常付随して起こる、治療用蛋白質の血清濃度及び組織濃度の極端な変動を減少させるし、そして（３）頻繁に投与するために蛋白質を生成し精製することが不必要であるため、酵素置換治療法よりも安価になると考えられる。

上記に記載したようにα−ｇａｌＡ欠損症のヒトは精製したα−ｇａｌＡを用いて治療することもできる（即ち酵素置換治療法）。またヒトα−ｇａｌＡを過剰発現するように遺伝的に修飾された一次、二次、または不死化されたヒト細胞は、インビトロで蛋白質を製造する際にも有用であり、酵素置換治療法を行うために精製されているとよい蛋白質を作成することができる。二次または不死化されたヒト細胞は上記に記載した細胞の中から選択してもよいし、また上記に記載したトランスフェクション法または形質導入法によって遺伝的に修飾してもよい。遺伝的に修飾したあとでその細胞を、α−ｇａｌＡを過剰発現し分泌することが可能な条件下で培養する。この蛋白質は、細胞が増殖している培地を収集したり、内容物が遊離するように細胞を溶解したりしてから、次に標準的な蛋白質精製法を適用することで培養細胞から単離する。このような一つの方法には、培養培地、即ちヒトα−ｇａｌＡを含む何らかのサンプルが、ブチル基などの機能的部分を持っているブチルセファロース（Butyl Sepharose：登録商標）または他の樹脂のような疎水性の相互作用樹脂を通過する工程を含む。サンプルをこのような樹脂に通す工程は、第１クロマトグラフィー工程で構成することができる。更に精製することが必要であれば、疎水性の相互作用樹脂から溶出したα−ｇａｌＡ含有材料を、ヘパリンセファロース（Heparin Sepharose：登録商標）のような固定化ヘパリン樹脂、ハイドロキシアパタイト、Ｑセファロース（Q Sepharose：登録商標）のようなアニオン交換樹脂、またはスーパーデックス（Superdex：登録商標）２００のようなサイズ排除樹脂などの第２の樹脂を含むカラム上を通過させるとよい。精製プロトコールに、それぞれ上記のタイプの樹脂を使用することが含まれると好ましい。また疎水性の相互作用樹脂の前またはその樹脂に代えて、後者の樹脂の一つまたはそれ以上を用いてもよい。

比較的高い純度のα−ｇａｌＡを調製する以前の方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー（コンカナバリンＡ（Con A）セファロース）とセファロースマトリックスに結合した基質アナログであるＮ−６−アミノヘキサノイル−α−Ｄ−ガラクトシルアミンへのα−ｇａｌＡの結合性に基づいた親和性クロマトグラフィーとの組合せを利用している親和性クロマトグラフィーを使用することに依存していた（BishopらのJ. Biol. Chem. 256: 1307-1316, 1981）。蛋白質のレクチン親和性樹脂と基質アナログ樹脂とを使用すると通常、固体支持体からの親和剤の連続的な浸出が関わってくるため（cf. MarikarらのAnal. Biochem. 201: 306-310, 1992）、その結果精製した生成物の親和剤による不純物混入が溶液に遊離状態になっているか溶出した蛋白質に結合しているかのいずれかで起こる。このような不純物混入により、生成物が薬学的調製物として使用するに好ましくないものとなってしまう。また結合した基質アナログ及びレクチンも、蛋白質の酵素的、機能的、及び構造的性質に対し実質的にネガティブな影響を持っている可能性がある。さらにこのような親和性樹脂は通常、合成するには高価であり、そのことがそのような樹脂の利用を従来のクロマトグラフィー樹脂以上の商業的規模で製造するには適当ではないようにしてしまう。したがって、大規模の商業的利用に適当な供給及び質の点で容易に入手可能な従来のクロマトグラフィー樹脂を用いる精製プロトコールの開発が本発明の重要な利点である。

α−ｇａｌＡ欠損症になっていると推測されるヒトは、薬学的に許容される精製ヒトα−ｇａｌＡを標準的な方法、即ち次の方法に限定するわけではないが、静脈内注入、皮下注入、もしくは筋肉内注入、または固体の移植物としての方法によって投与することで治療できると考えられる。この精製蛋白質は、生理学的に許容される賦形剤、例えばヒト血清アルブミンのようなキャリアを含むｐＨ６．５またはそれ以下の水性溶液からなる治療用組成物として処方してもよい。

本発明はしたがって、適当にグリコシル化されていて、そのため治療上利用できるヒトα−ｇａｌＡを大量に得るための方法を提供する。これによって、α−ｇａｌＡ欠損症に対する酵素置換治療が商業的に存続可能なものとなり、もちろんヒトまたは動物の組織から誘導された酵素を用いる治療法に匹敵するほど相対的にリスクもない。

熟練された技術者であれば、ヒトα−ｇａｌＡのＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ）、またはサイレントコドンの変化もしくはアミノ酸の同類置換をもたらすようなコドンの変化のいずれかがあるためにそれとは異なっている配列を、培養されたヒト細胞を遺伝的に修飾することによって酵素を過剰発現して分泌するように用いることができる点を認識できるであろう。また、α−ｇａｌＡのＤＮＡ配列においてある種の突然変異が起こって、良好になったα−ｇａｌＡの酵素的活性（本明細書に記載したように、培養された細胞において突然変異ＤＮＡ分子を発現させること、コードされたポリペプチドを精製すること、及び触媒活性を測定することによって明らかとされるように）を保持している、即ち示すようなポリペプチドをコードできる可能性もある。例えば、特定すると同類のアミノ酸置換が蛋白質における残基の総量の10％未満に現れている場合に、生物活性にほとんど影響がないか全く影響のない同類のアミノ酸置換が起こっていると予測できる。同類置換には通常、次のグループ内の置換が含まれる。即ち、グリシンとアラニン、バリンとイソロイシンとロイシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン、リジンとアルギニン、及びフェニルアラニンとチロシンである。

細胞によるα−ｇａｌＡの産生は、ある遺伝子操作によって最大にできる。例を挙げるとα−ｇａｌＡをコードするＤＮＡ分子は、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、グルカゴン、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体、またはα−ｇａｌＡ以外のリソソームの酵素のシグナルペプチドのような異型のシグナルペプチドをコードすることもできる。好ましくはシグナルペプチドはｈＧＨシグナルペプチド（配列番号：２１）であって、コードされた蛋白質のN末端である。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列はｈＧＨ遺伝子の第１イントロンのようなイントロンを含んでいてもよく、その結果、配列番号：２７のようなＤＮＡ配列になる（図１０も参照のこと）。さらにまた、ＤＮＡ分子は少なくとも６個のヌクレオチド長の３’非翻訳配列（ＵＴＳ）を含んでいてもよい（３’ＵＴＳ、即ちコード配列にある必須のポリアデニル化部位を持たないヒトで見られるα−ｇａｌＡのｍＲＮＡとは対照的である）。このＵＴＳはコード配列の終結コドンの３’に隣接して存在しており、ポリアデニル化部位を含んでいる。好ましくは少なくとも６個のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１２個、そして最も好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド長であり、どの場合も配列ＡＡＴＡＡＡまたはポリアデニル化を促進するようにはたらく関連配列を含んでいる。記載したようなＤＮＡ分子、即ちα−ｇａｌＡに結合したｈＧＨシグナルペプチドをコードしていてポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＳを有し、そして好ましくは発現調節配列を含むようなＤＮＡ分子も本発明に入る。また、α−ｇａｌＡに結合したｈＧＨのシグナルペプチドまたは何らかの他の異種ポリペプチド（即ち、ｈＧＨ以外のどれかのポリペプチド、またはｈＧＨのアナログ）を含む蛋白質をコードするＤＮＡ分子も本発明の範囲内に入る。異種ポリペプチドは、通常は哺乳動物の蛋白質、例えば何らかの医学的に望ましいヒトポリペプチドである。

本発明の他の特徴や利点は、次の詳細な説明から、また請求の範囲から明かとなると思われる。
細胞に関して本明細書で用いられる「遺伝的に修飾された」という用語は、特定の遺伝子産物および／またはコード配列の発現をコントロールする調節要素をコードするＤＮＡ分子を導入したあとで、その特定の遺伝子産物が発現する細胞が包含されていることを意味する。ＤＮＡ分子の導入は遺伝子の標的化（即ち、特定のゲノム部位へのＤＮＡ分子の導入）によって成し遂げられ、更に相同組換えによって欠損遺伝子自体の置換が可能になる（欠損したα−ｇａｌＡ遺伝子またはその一部分が、ファブリー病の患者自身の細胞において、遺伝子全体またはその一部分と置き換えられうる）。

本明細書で用いられる「α−ｇａｌＡ」という用語は、シグナルペプチドを持たないα−ｇａｌＡ、即ち配列番号：２６（図９）を意味する。配列番号：２６（図９）の残基３７１から３９８または３７３から３９８がリソソームにおいて除去される可能性があること、しかしながらこの推定されている除去前のペプチドが除去されても酵素の活性に影響を与えないと考えられていることについていくらかの表示がある。このことは、推定されている除去前のペプチドのある部分が活性に影響を与えることなく欠失できることを示唆している。したがって本明細書で用いられる「α−ｇａｌＡ」という用語は、その配列のＣ末端で２８残基までを欠いている以外は配列番号：２６に対応する配列を持つ蛋白質もカバーする。

「α−ｇａｌＡ欠損症」とは、ある患者においてこの酵素の量または活性が欠乏していることを意味する。この欠損症は、ファブリー病を患っている男性で典型的に観察されるような重篤な症候を誘導する可能性があり、また一部のみを誘導したり、欠損遺伝子の異型接合体の女性のキャリアで見ることのできるような比較的緩和な症候を誘導したりする可能性がある。

本明細書で用いられる「一次細胞」という用語は、脊椎動物の組織供給源から（それらを移植する、即ち皿やフラスコのような組織培養基板に付着させる前に）単離された細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織から誘導された組織片に存在する細胞、初回に移植された二つの前のタイプの細胞、そしてこれらの移植された細胞から誘導される細胞懸濁液を含む。

「二次細胞」とは、培養における全ての次の段階の細胞のことを言う。即ち初回に植え付けられた一次細胞が培養基質から除去されて、再移植される（継代した）と、それは続く継代に存在する全ての細胞も同じく二次細胞と言われる。

「細胞株」は、一回またはそれ以上継代を行った二次細胞からなっていて、培養により有限数の平均的な固体群倍増を示すとともに、接触−阻害される固定法依存で成長する性質（懸濁液培養で増殖させた細胞は除く）を示し、また不死化されていない。

「不死化された細胞」とは、培養の際に明らかに際限のない寿命を示す確立された細胞系から得られる細胞を意味する。
「シグナルペプチド」とは、さらなる翻訳後処理および／または分布のために小胞体に付着した新しく合成されたポリペプチドに指向するペプチド配列を意味する。

α−ｇａｌＡについての前後関係で本明細書で用いられているような「異種シグナルペプチド」という用語は、ヒトα−ｇａｌＡシグナルペプチドではないシグナルペプチド（即ち、配列番号：１８のヌクレオチド３６〜１２８によってコードされているペプチド）を意味する。それは通常、α−ｇａｌＡ以外の何らかの哺乳動物の蛋白質のシグナルペプチドである。
「第１クロマトグラフィー工程」という用語は、クロマトグラフィーカラムへのサンプルの最初の適用を意味する（サンプルの調製に関与する全ての工程は除く）。

詳細な説明
α−ｇａｌＡのようなリソソームの酵素は、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）受容体、即ち、リソソームの区画のためと運命づけられた酵素のオリゴサッカライド部分に存在するＭ６Ｐ残基に結合する受容体との相互作用により細胞のリソソーム区画を標的として指向する（Kornfeld, S. and Mellman, I, Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483-525, 1989）。一次の相互作用はゴルジ体で起こり、そこではゴルジのＭ６Ｐ受容体に結合した酵素がリソソームに移行するために分離される。二次的なタイプの相互作用は、細胞表面にて細胞外のα−ｇａｌＡとＭ６Ｐとの間で起こると考えられている。細胞によってインターナリゼーションされた細胞外の基質はエンドサイトーシス小胞において細胞質を通って移行し、それは最初のリソソームと融合し、そのリソソームに内容物を移す。この過程で細胞表面のＭ６Ｐ受容体もエンドサイトーシス小胞に導入され、リソソームに移される。

細胞外環境に存在するα−ｇａｌＡは、それがＭ６Ｐ残基を運搬している場合には細胞表面のＭ６Ｐ受容体に結合し、そのためその受容体とともにリソソームの区画に移行することができる。このスキャベンジャーの結果として一旦リソソームの区画に入ると、酵素は適当な機能を挙行できる。したがって、仮に細胞がそれ自身のα−ｇａｌＡを産生する場合に遺伝子的欠陥があったとしても、（ａ）酵素が適当にグリコシル化されていること及び（ｂ）欠陥のある細胞がＭ６Ｐ受容体を運搬することによって、外因性で製造された酵素を取り上げるための機構が存在する。

ファブリー病では、腎臓及び心臓の血管内皮細胞が重篤な組織病理学上の異常を示すこと、そしてその疾患の臨床上の病理学に関わることがわかっており、Ｍ６Ｐ受容体を運搬しているこれらの細胞は、本明細書で主張している本発明の特定のターゲットである。本発明によって製造されたα−ｇａｌＡは、影響を受けている細胞に局所的または全身的のいずれかで遺伝子治療によって（即ち、患者の体内でグリコシル化酵素を発現しかつ分泌するように遺伝的に修飾された細胞によって）、または従来の薬学的投与経路によって供給することができる。したがってＭ６ＰがＮ−結合オリゴサッカライドに存在する場合のα−ｇａｌＡは、本発明による治療法にとって非常に重要である。

さらにα−ｇａｌＡのＮ−結合オリゴサッカライドがシアリル化によって修飾されている程度も非常に重要である。適当なシアリル化がなされていない場合α−ｇａｌＡは、肝臓のアシアロ糖蛋白質受容体によって結合されることに起因して循環系から急速に一掃され、その後インターナリゼーションされてから肝細胞によって分解を受ける（Ashwell及びHarfordのAnn. Rev. Biochem. 51: 531-554, 1982）。これによって、腎臓及び心臓の血管内皮細胞のようなファブリー病の臨床的病理学に寄与する細胞のＭ６Ｐ受容体に結合するために循環系で利用されるα−ｇａｌＡの量が減少する。驚くべきことに出願人は、安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって分泌されるα−ｇａｌＡが、遺伝子治療によってか精製した分泌蛋白質の従来の薬学的投与法によってファブリー病の治療を行うために適切なグリコシル化の性質をもっていることを見いだした。このことは、最も研究の進んだリソソームの酵素であるグルコセレブロシダーゼについての状況、即ちヒトの胎盤から精製されるかまたは体内で臨床的に関連する細胞にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から分泌された酵素を供給するには、複雑な酵素の酵素的修飾、それに続く精製が必要であるという状況（cf. Beutler, New Engl. J. Med. 325: 1354-1360, 1991）と対照的である。

本発明の治療法は二通りの一般法、即ち酵素を過剰発現し分泌するように遺伝的に修飾された培養ヒト細胞から得られる精製ヒトα−ｇａｌＡの治療上の有効量を患者に導入することによって、またはその患者に過剰発現する細胞自体を導入することによっての二通りの一般法のいずれかで行うことができる。必要な遺伝的修飾を達成する手法については、精製、配合、及び治療の方法として下記に記載されている。

実施例Ｉ．α−ｇａｌＡを輸送し発現するように設計された構築物の調製及び利用
二つの発現プラスミドであるｐＸＡＧ−１６及びpXAG-28を構築した。これらのプラスミドには、α−ｇａｌＡ酵素の398のアミノ酸をコードしているヒトα−ｇａｌＡ酵素（α−ｇａｌＡシグナルペプチドを欠いている）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の第１イントロンによって割り込まれたｈＧＨシグナルペプチドのゲノムＤＮＡ配列、及びポリアデニル化のシグナルを含むｈＧＨ遺伝子の３’非翻訳配列（ＵＴＳ）が含まれる。プラスミドｐＸＡＧ−１６はヒトサイトメガロウイルスの即時型−初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーターおよび第１イントロン（非コードエクソン配列に隣接）を有しており、これに対してpXAG-28はコラーゲンＩα２プロモーターによって推進され、またβ−アクチン遺伝子の第１イントロンを持つβ−アクチン遺伝子の５’ＵＴＳも含んでいる。

Ａ．完全なα−ｇａｌＡのｃＤＮＡのクローニング及びα−ｇａｌＡ発現プラスミドｐＸＡＧ−１６の構築
ヒトα−ｇａｌＡのｃＤＮＡは、次のように構築したヒト繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。Ｐｏｌｙ−Ａ^＋ｍＲＮＡは全ＲＮＡから単離し、ｃＤＮＡの合成は製造指示書にしたがってラムダザップＩＩ（lambda ZapII：登録商標）システムの試薬を用いて行った（Stratagene Inc., LaJolla, CA）。簡単に述べると「第１鎖」のｃＤＮＡは、内部ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴ−ｄＴプライマーの存在下で逆転写を行うことで生成した。続いてＲＮａｓｅＨを用いて処理し、そのｃＤＮＡを二本鎖のｃＤＮＡを生成するためにＤＮＡポリメラーゼＩを用いてニック−トランスレーションした。このｃＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端を形成し、ＥｃｏＲＩアダプターに連結した。この連結の生成物をＴ４ＤＮＡキナーゼで処理してからＸｈｏＩを用いて切断した。そのｃＤＮＡをセファクリル−４００（Sephacryl-400：登録商標）クロマトグラフィーによってフラクションに分けた。大量で中間の大きさのフラクションを集め、そのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ−切断性のラムダザップＩＩ（lambda ZapII）アームに連結した。次にこの連結反応の生成物を包装し、力価を測定した。主なライブラリーは力価が１．２×１０^７ｐｆｕ／ｍｌであり、平均的な挿入物の大きさは９２５ｂｐであった。

ヒトα−ｇａｌＡ遺伝子のエキソン７から得られる２１０ｂｐのプローブ（図１の配列番号：１９）を、ｃＤＮＡを単離するために用いた。このプローブ自体は次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣ−３’（オリゴ１；配列番号１）及び５’−ＴＣＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＧ−３’（オリゴ２；配列番号：２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによってゲノムＤＮＡから単離した。続いてこのＰＣＲ生成物を繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用い、ポジティブのクローンを単離してからさらに特徴を明らかにした。一つのポジティブなクローンであるファージ３Ａを、ラムダザップＩＩ（lambda ZapII：登録商標）システム摘出プロトコール（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）に、その製造指示書に従ってかけた。この方法によってプラスミドｐＢＡＳＡＧ３Ａが得られ、それはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（商品名）プラスミドバックボーンにα−ｇａｌＡのｃＤＮＡ配列を含んでいる。ＤＮＡの配列決定によってこのプラスミドはｃＤＮＡ配列の完全な５’末端を含まないことが明かとなった。したがって５’末端は、ヒトゲノムのＤＮＡから増幅したＰＣＲフラグメントを用いて再構築した。これを達成するために、２６８ｂｐのゲノムＤＮＡフラグメント（図２の配列番号：２０）を次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＡＴＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴ−３’（オリゴ；配列番号：３）及び５’−ＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴ−３’（オリゴ４；配列番号：４）を用いて増幅した。このフラグメントを「ＴＡ」クローニングプラスミド（Invitrogen Corp., San Diego, CA）にサブクローニングすることでプラスミドｐＴＡＡＧＥＩを生成した。プラスミドｐＢＳＡＧ３Ａはα−ｇａｌＡのｃＤＮＡ配列の大部分を含んでおり、またｐＴＡＡＧＥＩはα−ｇａｌＡのｃＤＮＡの５’末端を含んでいて、その両方をそれぞれＳａｃＩＩ及びＮｃｏＩを用いて切断した。増幅したＤＮＡフラグメント内のＳａｃＩＩ及びＮｃｏＩ部位に関連した位置が図２に示されている。ｐＴＡＡＧＥＩから得られる０．２ｋｂのＳａｃＩＩ−ＮｃｏＩフラグメントを単離して、同等に切断したｐＢＳＡＧ３Ａに連結した。このプラスミド、ｐＡＧＡＬは完全なα−ｇａｌＡのｃＤＮＡ配列を含んでいて、それにはα−ｇａｌＡシグナルペプチドをコードする配列が含まれている。このｃＤＮＡは完全に配列決定され（α−ｇａｌＡシグナルペプチド、配列番号：１８を含んでいて図３に示されている）、ヒトα−ｇａｌＡのｃＤＮＡについて公開されている配列（Genebank sequence HUMGALA）と同一であると判明した。

このプラスミドｐＸＡＧ−１６は、次のような数種の中間体を経て構築した。まず第一にｐＡＧＡＬをＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩを用いて切断し、平滑末端にした。第二にこの完全なα−ｇａｌＡのｃＤＮＡの末端をＸｂａＩリンカーに連結してから、ＸｂａＩで切断したｐＥＦ−ＢＯＳにサブクローニングし（MizushimaらのNucl. Acids Res. 18: 5322, 1990）、ｐＸＡＧ−１を作成した。この構築物は、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の３’ＵＴＳと、α−ｇａｌＡにα−ｇａｌＡのシグナルペプチドをプラスしてコードしたｃＤＮＡをフランキングするヒト延長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーターとを含んでおり、それによってα−ｇａｌＡのｃＤＮＡの５’末端がＥＦ−１αプロモーターに融合できるようになっている。ＣＭＶＩＥプロモーターと第１イントロンを用いて構築物を形成するために、α−ｇａｌＡのｃＤＮＡとＧ−ＣＳＦの３’ＵＴＳを２ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＸＡＧ−１から除去した。このフラグメントを平滑末端化してＢａｍＨＩリンカーに連結し、ＢａｍＨＩ切断したｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏ（下記に記載したように構築した）に挿入した。この方針は、α−ｇａｌＡのｃＤＮＡの５’末端がＣＭＶＩＥプロモーター領域に融合するようになっている。

ｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏは次のように作成した。ＣＭＶＩＥ遺伝子プロモーターフラグメントは鋳型としてのＣＭＶのゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ−３’（配列番号：２３）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：２４）とを用いてＰＣＲを行って増幅した。得られた産物（１．６ｋｂのフラグメント）をＢａｍＨＩを用いて切断し、ＣＭＶプロモーターを含み結合性のＢａｍＨＩ−切断した末端を持つフラグメントを得た。この新しく発現したユニットを、１．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミドｐＭＣｌｎｅｏｐＡ（Stratagene Inc., La Jolla, CA）から単離した。このＣＭＶプロモーターを含み新生のフラグメントを、ＢａｍＨＩ−、ＸｈｏＩ−切断プラスミド（ｐＵＣ１２）に挿入した。注目すべきことにｐＣＭＶｆｌｐＮｅｏは、ヌクレオチド５４６で始まりヌクレオチド２１０５で終わる（Genebank sequence HS5MIEPについて）ＣＭＶＩＥプロモーター領域と、このＣＭＶＩＥプロモーターフラグメントに直接５’が結合するヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes Simplex Virus：ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター（ＴＫｎｅｏ遺伝子）によって推進されるネオマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。新生遺伝子の転写の方向は、ＣＭＶプロモーターフラグメントの方向と同じである。この中間構築物はｐＸＡＧ−４と言われた。

ｈＧＨ３’ＵＴＳを追加するために、ＧＣＳＦ３’ＵＴＳをＸｂａＩ−ＳｍａＩフラグメントとしてｐＸＡＧ−４から除去し、ｐＸＡＧ−４の末端を平滑化した。ｈＧＨ３’ＵＴＳは、０．６ｋｂのＳａｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＸＧＨ５（SeldenらのMol. Cellular Biol. 6: 3173-3179, 1986）から除去した。このフラグメントを平滑末端化した後でそれを、ｐＸＡＧ−４の平滑末端化したＸｂａＩ部位のすぐ後でｐＸＡＧ−４に連結した。この中間体はｐＸＡＧ−７と言われた。ＴＫｎｅｏフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメントとしてこのプラスミドから除去し、そのプラスミドの末端をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで「充填（filling-in）」することによって平滑化した。ＳＶ４０初期プロモーターによって推進されるネオマイシン耐性遺伝子は、ｐｃＤＮｅｏ（ChenらのMol. Cellular Biol. 7: 2745-2752, 1987）の切断物由来の平滑化ＣｌａＩ−ＢｓｍＢＩフラグメントとして連結し、α−ｇａｌＡ転写物ユニットとして同じ方向に新しい転写ユニットが位置づけられる。この中間体はｐＸＡＧ−１３と言われた。

２６個のアミノ酸ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列及びｈＧＨ遺伝子の第１イントロンを持っているｐＸＡＧ−１６を完成させるために、ｐＸＡＧ−１３の２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを初めに除去した。このフラグメントはα−ｇａｌＡのｃＤＮＡとｈＧＨの３’ＵＴＳを含んでいた。この大きなフラグメントを３個のフラグメントと置き換えた。第１番目のフラグメントはｐＸＧＨ５の０．３ｋｂのＰＣＲ産物からなり、それはｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列を含んでいて、Ｋｏｚａｋ共通配列のすぐ上流側に位置している合成のＢａｍＨＩ部位からｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列の末端までであった。次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡ−３’（オリゴＨＧＨ１０１；配列番号：５）及び５’−ＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＴＴＧＡＡ−３’（オリゴＨＧＨ１０２；配列番号：６）を、このフラグメント（フラグメント１）を増幅するために用いた。第２番目のフラグメントは、３９８アミノ酸のα−ｇａｌＡ酵素（即ち、α−ｇａｌＡシグナルペプチドを欠く）をコードするｃＤＮＡの開始部からＮｈｅＩ部位までに対応する配列を含む０．２７ｋｂのＰＣＲ産物からなっていた。次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣ−３’（オリゴＡＧ１０；配列番号：７）及び５’−ＴＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＴＣＣ−３’（オリゴＡＧ１１；配列番号：８）は、このフラグメント（フラグメント２）を増幅するために用いた。第３番目のフラグメントはｈＧＨ３’ＵＴＳと同様に、残っているα−ｇａｌＡ配列を含むｐＸＡＧ−７のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントからなっていた（フラグメント３）。

フラグメント１（ＢａｍＨＩとＮａｅＩを用いて切断されている）、フラグメント２（ＰｖｕＩＩとＮｈｅＩを用いて切断されている）、及びフラグメント３を、新生遺伝子とＣＭＶＩＥプロモーターを含むｐＸＡＧ−１３の６．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと混合し、プラスミドｐＸＡＧ−１６（図４）を生成するために一緒に連結した。

Ｂ．α−ｇａｌＡ発現プラスミドpXAG-28の構築
ヒトコラーゲンＩα２プロモーターを次のようにα−ｇａｌＡ発現構築物pXAG-28で利用すべく単離した。ヒトコラーゲンＩα２プロモーターの部分を含むヒトゲノムのＤＮＡからなる４０８ｂｐのＰＣＲフラグメントを次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＡ−３’（オリゴ７２；配列番号：９）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣ−３’（オリゴ７３；配列番号：１０）を用いて単離した。

このフラグメントは、ＥＭＢＬ３（Clontech Inc., Palo Alto, CA）においてヒト白血球ライブラリーをスクリーニングするために用いた。３．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含む一つのポジティブなクローン（ファージ７Ｈ）を単離し、ＥｃｏＲＩ部位（ｐＢＳ／７Ｈ．２を形成する）でｐＢＳＩＩＳＫ＋（Stratagene Inc., La Jolla, CA）にクローニングした。ＡｖｒＩＩ部位を、ｐＢＳＩＩＳＫ＋ポリリンカーで開裂するＳｐｅＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて「充填」し、さらにオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡＧＴＣＣＴＡＧＧＡ−３’（配列番号：１１）を挿入することによってｐＢＳＩＩＳＫ＋に導入した。ｐＢＳＩＩＳＫ＋のこの変形物をＢａｍＨＩ及びＡｖｒＩＩを用いて切断し、上記に記載した初めの４０８ｂｐコラーゲンＩα２プロモーターＰＣＲフラグメントの１２１ｂｐからなるＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントに連結してｐＢＳ／１２１ＣＯＬ．６を作成した。

このプラスミドｐＢＳ／１２１ＣＯＬ．６を、ｐＢＳＩＩＳＫ＋ポリリンカー配列で開裂するＸｂａＩを用いて切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで「充填」してからＡｖｒＩＩを用いて切断した。ｐＢＳ／７Ｈ．２の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントを単離し、ＢａｍＨＩ部位をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理することによって平滑末端化した。続いてこのフラグメントをＡｖｒＩＩを用いて切断し、ＡｖｒＩＩ−切断ベクターに連結することによってコラーゲンプロモータープラスミドｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８を作成した。

次にこのコラーゲンプロモーターを、ヒトβ−アクチン遺伝子の第１イントロンを含むヒトβ−アクチン遺伝子の５’ＵＴＳに融合した。この配列を単離するために２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、次のオリゴヌクレオチド、即ち５’−ＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＴ−３’（オリゴＢＡ１；配列番号：１２）及び５’−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＧＣＣ−３’（オリゴＢＡ２；配列番号：１３）を用いてヒトゲノムのＤＮＡから単離した。

このフラグメントをＢａｍＨＩ及びＢｓｉＨＫＡＩで切断することによって、β−アクチンの５’ＵＴＳ及びイントロンを含む０．８ｋｂのフラグメントを開放した。それから３．６ｋｂのＳａｌＩ−ＳｒｆＩフラグメントをコラーゲンプロモータープラスミドｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８から次のように単離した。ｐＢＳ／１２１ｂｐＣＯＬ７Ｈ．１８をＢａｍＨＩ（ＢａｍＨＩ部位は、コラーゲンＩα２プロモーターフラグメントの５’末端に位置する。）を用いて部分的に切断し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いて処理することによって平滑末端を作り、続いてＳａｌＩリンカー（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＣ−３’）に連結することによって、コラーゲンＩα２プロモーターの上流にＳａｌＩ部位を位置づける。それからコラーゲンのプラスミドをＳａｌＩ及びＳｒｆＩ（このＳｒｆＩ部位はコラーゲンのＩα２プロモーターＣＡＰ部位の１１０ｂｐ上流に位置している）を用いて切断し、３．６ｂｐのフラグメントを単離した。この０．８ｋｂと３．６ｋｂのフラグメントを、ＳａｌＩ−切断及びＢａｍＨＩ−切断のｐＢＳＩＩＳＫ−（Stratagene Inc., La Jolla, CA）で結合し、次の４つのオリゴヌクレオチドからなるフラグメントを一緒にアニール化した（平滑末端とＢｓｉＨＫＡＩ末端を持つフラグメントを形成している）。５’−ＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＧＴＡＴ−３’（オリゴＣＯＬ−１；配列番号：１４）、５’−ＡＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡ−３’（オリゴＣＯＬ−２；配列番号：１５）、５’−ＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＡＣＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣ−３’（オリゴＣＯＬ−３；配列番号：１６）、及び５’−ＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＴＣ−３’（オリゴＣＯＬ−４；配列番号：１７）。これらの４つのオリゴヌクレオチドはアニール化すると、コラーゲンプロモーターのＳｒｆＩ部位で始まり、β−アクチンプロモーターのＢｓｉＨＫＡＩ部位を通って続く領域に対応している。得られたプラスミドは、ｐＣＯＬ／β−アクチンと称した。

pXAG-28の構築物を完成させるために、コラーゲンＩα２プロモーターとβ−アクチン５’ＵＴＳを含むｐＣＯＬ／β−アクチンのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントをｐＸＡＧ−１６（実施例１Ａ及び図４参照）から得られる二つのフラグメント、即ち（１）６．０ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（新しい遺伝子、プラスミドバックボーン、３９８アミノ酸α−ｇａｌＡ酵素をコードするｃＤＮＡ、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含む）、及び（２）０．３ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌフラグメント（ｐｃＤｎｅｏ由来のＳＶ４０ポリＡ配列を含む）に連結した。pXAG-28は、ヒトβ−アクチン５’ＵＴＳに融合したヒトコラーゲンＩα２プロモーター、ｈＧＨシグナルペプチド（ｈＧＨ第１イントロンによって割り込まれている）、α−ｇａｌＡ酵素をコードするｃＤＮＡ、及びｈＧＨの３’ＵＴＳを含む。完成した発現構築物のpXAG-28の地図が図５に示されている。

Ｃ．α−ｇａｌＡ発現プラスミドを用いてエレクトロポレーションを行った繊維芽細胞のトランスフェクション及びセレクション
繊維芽細胞においてα−ｇａｌＡを発現させるために、公開された方法にしたがって二次の繊維芽細胞を培養し、トランスフェクションした（SeldenらのWO 93/09222）。
プラスミドｐＸＡＧ−１３、ｐＸＡＧ−１６及びpXAG-28をエレクトロポレーションによってヒトの包皮の繊維芽細胞にトランスフェクションすることで、安定してトランスフェクトされたクローン細胞株を発生させることができ、そして得られたα−ｇａｌＡの発現レベルを実施例ＩＤにおいて記載したようにモニターした。正常の包皮繊維芽細胞によるα−ｇａｌＡの分泌は２〜１０ユニット／１０^６細胞／２４時間の範囲内であった。対照的にトランスフェクトされた繊維芽細胞は、表１に示されているような平均の発現レベルを示した。

平均のα−ｇａｌＡ発現レベル（＋／−標準偏差）

これらのデータは、三種すべての発現構築物がトランスフェクトされていない繊維芽細胞の発現の多数倍もα−ｇａｌＡの発現を増加させる能力があることを示している。α−ｇａｌＡシグナルペプチドに結合したα−ｇａｌＡをコードしているｐＸＡＧ−１３を用いて安定してトランスフェクトされた繊維芽細胞による発現は、シグナルペプチドがｈＧＨシグナルペプチドである点だけが異なっていてそのコード配列がｈＧＨ遺伝子の第１イントロンによって割り込まれているようなｐＸＡＧ−１６を用いてトランスフェクトした繊維芽細胞による発現よりも実質的に低い。

トランスフェクトした細胞を継代させる度ごとに分泌されたα−ｇａｌＡの活性を測定し、その細胞を計数して細胞密度を計算した。植え付けた細胞数とα−ｇａｌＡの分泌が可能になった時間に基づいてα−ｇａｌＡの特定の発現速度を測定し、２４時間あたり１０^６個の細胞につき分泌されるユニット（α−ｇａｌＡ）として表２及び３に報告されている。遺伝子治療を行う際、またはα−ｇａｌＡの精製用の材料の産出において利用する際に好適な細胞株は、数回の継代にわたって安定した成長と発現を示さなくてはならない。α−ｇａｌＡ発現構築物ｐＸＡＧ−１６を用いて安定してトランスフェクトされた、表２及び３に示された細胞株から得られるデータは、α−ｇａｌＡの発現が数回の継代にわたって安定して維持されているという事実を示している。

α−ｇａｌＡ発現構築物のｐＸＡＧ−１６を含むＢＲＳ−１１細胞の成長及び発現

α−ｇａｌＡ発現構築物のｐＸＡＧ−１６を含むＨＦ５０３−２４２細胞の成長及び発現

Ｄ．α−ｇａｌＡ発現の定量化
α−ｇａｌＡ活性を、水溶性の基質である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクロピラノシド（4-MUF-gal; Research Products., Inc.）を用い、Ioannouら（J. Cell Biol. 119:1137-1150, 1992）により記載されたプロトコールの変形法によって測定した。この基質は、基質緩衝液（０．１Ｍのクエン酸塩−燐酸塩、ｐＨ４．６）に溶解して濃度を１．６９ｍｇ／ｍｌ（５ｍＭ）にした。典型的には、１０μｌの培養液の上清を７５μｌの基質溶液に添加した。そのチューブを覆い、３７℃の水浴中、６０分間インキュベートさせた。このインキュベーションの終わりに２ｍｌのグリシン−炭酸塩緩衝液（１３０ｍＭのグリシン、８３ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．６）を用いることによって、その反応を止めた。それぞれのサンプルの相対蛍光度を、３６５ｎｍの固定励起波長を持っていて４６０ｎｍの固定放出波長を検出するモデルＴＫ０１００蛍光度測定計（Hoefer Scientific Instruments）を用いて測定した。サンプルの判断は、１μＭのメチルウンベリフェロン（Sigma Chemical Co.）のストックから準備した標準と比較し、加水分解された基質の量を計算した。α−ｇａｌＡの活性はユニットで表し、即ち１ユニットのα−ｇａｌＡ活性は３７℃で１時間あたりに加水分解された基質の１ナノモルに等価である。細胞発現のデータは一般に、分泌されたα−ｇａｌＡ活性ユニット／１０^６個の細胞／２４時間として表した。またこのアッセイは、細胞溶菌液及び下記に記載したように種々のα−ｇａｌ精製工程から得られるサンプルにおけるα−ｇａｌ活性の量を測定するためにも用いた。

実施例ＩＩ．安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞株の条件が整えられた培地から得られるα−ｇａｌＡの精製
実施例ＩＩＡ−ＩＩＥには、α−ｇａｌＡを産生するように安定してトランスフェクトされた培養のヒト細胞株の条件付けられた培地からほとんど等質性にその酵素を精製できる点が示されている。

Ａ．α−ｇａｌＡの精製における第１工程としてのブチルセファロース（登録商標）クロマトグラフィーの使用
低温条件を整えた培地（１．３４リットル）を遠心分離によって不純物を除去し、ガラス繊維製のプレフィルターを用いた０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターを通して濾過した。攪拌しながら低温の濾過済み培地のｐＨを１ＮのＨＣｌを滴下して添加することによって５．６に調節し、続いて３．９Ｍの超純粋の硫酸アンモニウムのストック溶液（室温）を滴下により添加することで最終濃度が０．６６Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加えた。この培地をさらに４℃で５分感攪拌し、濾過し、次にブチルセファロース（登録商標）の４高速カラム（4 Fast Flow column；カラム容積は８１ｍｌ、２．５×１６．５ｃｍ； Pharmacia, Uppsala, Sweden）、即ち０．６６Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（緩衝液Ａ）で平衡化されたカラムにかけた。このクロマトグラフィーは、全蛋白質濃度と塩濃度をそれぞれ評価するためのライン上に設けたＵＶ（２８０ｎｍ）と導電率モニターを装着したグラジ−フラク（Gradi-Frac；商品名）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて４℃で行った。流速１０ｍｌ／分でサンプルを適用してからそのカラムを、カラム容積の１０倍の緩衝液Ａで洗浄した。α−ｇａｌＡは、緩衝液Ａ（硫酸アンモニウムを含む）から１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（硫酸アンモニウムを含まない）まで直線状の勾配をつけた１４カラム容積の溶媒を用いてブチルセファロース（登録商標）カラムより溶出した。フラクションを４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイによってα−ｇａｌＡ活性について評価し、適当な酵素活性を含むフラクションを集めた。図６及び精製の概要（表３）に示すように、この工程によって約９９％の不純物としての蛋白質が除去されている（カラムに通す前のサンプル＝全蛋白質は８．１４ｇ、カラムを通った後のサンプル＝全蛋白質は０．０６３８ｇ）。

安定してトランスフェクトされたヒト繊維芽細胞の条件を整えた培地から得られるα−ｇａｌＡの精製

Ｂ．α−ｇａｌＡの精製のための工程として、ヘパリンセファロース（登録商標）クロマトグラフィーの利用
ブチルセファロース（登録商標）カラムのピークフラクションを、１０ｍＭのＭＥＳ−トリス（４リットル）、ｐＨ５．６（一度交換）に対して４℃で透析した。透析物の導電度を、必要に応じてＨ_２ＯまたはＮａＣｌを添加することによって４℃で１．０ｍＭＨＯに調節した。その後でサンプルを、９ｍＭのＮａＣｌを含んだ１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６（緩衝液Ｂ）で平衡化したヘパリンセファロース（登録商標）６高速のカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden; ２９ｍｌのカラム容積、２．５×６ｃｍ）にかけた。これは１０ｍｌ／分の流速で４℃にて行った。ライン上のＵＶ（２８０ｎｍ）と導電度モニターによって全蛋白質と塩の濃度を測定した。そのサンプルを適用した後でそのカラムを１０カラム容量の緩衝液Ｂで洗浄し、続いて３カラム容量の８％緩衝液Ｃ／９２％緩衝液Ｂ（ここでの緩衝液Ｃは、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＭＥＳ−トリス、ｐＨ５．６である）までの線形勾配をつけた溶媒、さらに１０カラム容量の８％の緩衝液Ｃを用いて洗浄した。この後、１．５カラム容量の２９％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｃを用いて、続いて１０カラム容量の３５％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｃを用いてα−ｇａｌＡの溶出を行った。フラクションはα−ｇａｌＡ活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。

Ｃ．α−ｇａｌＡを精製するための工程として、ハイドトキシアパタイトの利用
ヘパリンのプールを濾過し、１ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０（緩衝液Ｄ）で平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトＨＣ（４０μｍ；American International Chemical, Ntick, MA；１２ｍｌのカラム容量、１．５×６．８ｃｍ）からなるカラムに直接かけた。そのクロマトグラフィーは、ライン上にＵＶ（２８０ｎｍ）と導電度モニターを装着したハイブリッドグラジ−フラク（Gradi-Frac：商品名）／ＦＰＬＣ（登録商標）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて室温で行った。サンプルを適用した（５ｍｌ／分）後でそのカラムを１０カラム容量の緩衝液Ｄで洗浄した。α−ｇａｌＡを７カラム容量の４２％緩衝液Ｅ／５８％緩衝液Ｄ（ここでの緩衝液Ｅは、２５０ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０である）までの線形勾配をつけた溶媒、さらに１０カラム容量の５２％までの勾配をつけた緩衝液Ｅを用いて溶出した。フラクションはα−ｇａｌＡ活性についてアッセイし、適当な活性を含むフラクションを集めた。

Ｄ．α−ｇａｌＡを精製するための工程として、Ｑセファロース（登録商標）アニオン交換クロマトグラフィーの利用
ハイドロキシアパタイトのプールをＨ_２Ｏを用いて約１．５倍に希釈して、最終的な導電度が室温で３．４〜３．６ｍＭＨＯにした。濾過してからそのサンプルを、１０％の緩衝液Ｇ／９０％の緩衝液Ｆで平衡化したＱセファロース（登録商標）ＨＰ（Pharmacia, Uppsala, Sweden；５．１ｍｌのカラム容量、１．５×２．９ｃｍ）からなるカラムに直接かけた。ここで緩衝液Ｆは２５Ｍの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０であり、また緩衝液Ｇは２５ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２５０ｍＭのＮａＣｌである。このクロマトグラフィーは、グラジ−フラク（Gradi-Frac：商品名）／ＦＰＬＣ（登録商標）ハイブリッドシステム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて室温で行い、全蛋白質と塩の濃度をライン上に設けたモニターで測定した。そのサンプルに５ｍｌ／分の流速を適用してから、次の工程を行った。即ち、（１）１０％の緩衝液Ｇで５カラム容量の洗浄、（２）１２％の緩衝液Ｇで７カラム容量の洗浄、（３）３カラム容量の５０％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｇ、（４）１０カラム容量の５３％までの線形勾配をつけた緩衝液Ｇ、（５）３カラム容量の１００％までの勾配をつけた緩衝液Ｇ、及び（６）１０カラム容量の１００％の緩衝液Ｇで洗浄工程。α−ｇａｌは工程３及び４の間におもに溶出した。適当な活性を含むフラクションを集めた（「Ｑプール」）。

Ｅ．α−ｇａｌＡを精製するための工程として、スーパーデックス（登録商標）−２００ゲル濾過クロマトグラフィーの利用
ＱプールをCentriprep（登録商標）−１０遠心濃縮機ユニット（Amicon, Beverly, MA）を用いて約５倍に濃縮し、スーパーデックス（登録商標）２００（Pharmacia, Uppsala, Sweden；１８９ｍｌのカラム容量、１．６×９４ｃｍ）からなるカラムにかけた。このカラムを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いて平衡化し、溶出した。このクロマトグラフィーは、蛋白質の溶出を追跡するためにライン上のＵＶモニター（２８０ｎｍ）を用いたＦＰＬＣ（登録商標）システム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）にて室温で行った。そのカラムにかけたサンプルの容量は≦２ｍｌ、流速は０．５ｍｌ／分、そしてフラクションの量は２ｍｌであった。多数回カラムの作動を遂行し、フラクションをα−ｇａｌＡ活性についてアッセイして適当な活性を含むフラクションを集めた。

このスーパーデックス（登録商標）２００カラムから得られるプールされたフラクションをCentriprep−１０ユニットを用いて濃縮し、アリコートにしてからスナップ冷凍し、−８０℃で短期間保存した。α−ｇａｌＡの精製についてこの実施例の要約が表３に示されている。α−ｇａｌＡの最終収率は出発物質の活性の５９％であり、また精製した産物の比活性は２．９２×１０^６ユニット／ｍｇ蛋白質であった。得られた産物は、４〜１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で還元条件にして電気泳動を行った後に高いレベルの純度を示し、続いて銀染色を行った。

実施例ＩＩＩ．精製されたα−ｇａｌＡの配合及び保存
高度に精製したα−ｇａｌＡは、精製された蛋白質（≦１ｍｇの蛋白質／ｍｌ）の希釈溶液として保存した場合、長い期間は安定していない。したがって配合剤を長く保存する間、即ち数週間から少なくとも数カ月間不変のまま保存を行う間、安定性を改善できるように工夫した。精製された酵素を、遠心濃縮機（２５ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び１５０ｍＭのＮａＣｌからなる酵素緩衝液中で）を用いて少なくとも１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ブミネート（Buminate：登録商標、Baxter-Hyland）を添加して最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌにした。それからこの蛋白質溶液を、シリンジに取り付けた０．２μｍの酢酸セルロースフィルター（Schleicher and Schuell）を用いて滅菌濾過した。α−ｇａｌＡ溶液を、滅菌した発熱体フリーのガラス溶液に分配し、テフロン（登録商標）製の蓋で密閉し、スナップ冷却を行ってから−２０℃で保存した。

α−ｇａｌＡ活性の安定性は、４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイを用いて３カ月間にわたって評価した。表５に示されたデータは、テストした期間にわたって酵素活性の喪失が起こらなかったことを証明している。配合剤が酸性ｐＨ（<６．５）であることは、高度に精製した酵素の安定性にとって重要である。

配合されたα−ｇａｌＡの−２０℃における安定性

実施例ＩＶ．ヒト細胞株によって産生したα−ｇａｌＡは、α−ｇａｌＡ欠損症を治療するのに適当である。
本発明により調製した精製ヒトα−ｇａｌＡの構造的及び機能的特徴を、この明細書に記載されたＤＮＡ分子とトランスフェクトしたヒト細胞株によって産生された対応する発現糖蛋白質とがそれぞれ遺伝子治療または酵素置換治療で利用可能であることを証明するために調べた。

Ａ．培養中の安定してトランスフェクトされたヒト細胞により産生したα−ｇａｌＡのサイズ
α−ｇａｌＡの分子質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定法で見積った。これらの結果から、ダイマーの分子質量が１０２，３５３Ｄａであり、これに対してモノマーの分子質量が５１，００２Ｄａであることが証明された。アミノ酸組成に基づいてモノマーについて予測された分子質量は４５，４００Ｄａである。したがって、酵素の炭水化物含有量は５，６００Ｄａまでの分子量であるとの計算が推測できる。
精製した蛋白質に対して行った標準的なアミノ酸分析の結果は、トランスフェクトしたヒト細胞によって産生された蛋白質がヒト組織から精製した蛋白質にアミノ酸レベルで同一であるという推断と一致している。

Ｂ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌＡのN末端処理
ヒトα−ｇａｌＡのｃＤＮＡヌクレオチド配列は４２９個のアミノ酸をコードする。３１個のN末端アミノ酸はシグナルペプチド配列を構成し、それは形成されつつある蛋白質が内部細胞質の網状質を通過するように開裂する（LeDonneらのJ. Biol. Chem. 262: 2062, 1987）。α−ｇａｌＡが異型のシグナルペプチド配列（例えば、ヒト成長ホルモンのシグナル配列）と関連していて、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞において発現する場合にα−ｇａｌＡが適当に処理されることを確認するために、分泌された蛋白質の１０個のN末端アミノ酸をミクロシークエンシングした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、１０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１．０）、１０％のメタノール緩衝液システムを用いてプロブロット（ProBlott：登録商標、ABI, Foster City, CA）に転写した。プロブロット上の蛋白質はクマージー染色によって可視化し、そして適当サイズ（５０ｋＤａ）のバンドを削り取った。N末端の配列は、自動化エドマン分解を行うアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）パルス−液相アミノ酸配列同定装置を用いて得た。得られたN末端配列、ＬＤＮＧＬＡＲＴＰＴ（配列番号：２８）は、シグナルペプチドの適切な開裂と一致しており、分泌された蛋白質に対して予測されているN末端配列と適合する。

Ｃ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌＡのＣ末端アミノ酸
本発明により産生された分泌α−ｇａｌＡのＣ末端アミノ酸残基は、自動化ヒューレットパッカードＣ末端配列決定装置（Hewlett Packard C-terminal sequencer）を用いて同定した。この結果はＣ末端がロイシン残基であることを示しており、それはこのＤＮＡ配列によって予言されたＣ末端アミノ酸と一致している。

Ｄ．安定してトランスフェクトされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌＡの炭水化物の修飾
本発明により産生されたα−ｇａｌＡのグリコシル化パターンも評価した。適当にグリコシル化されることは、α−ｇａｌＡがインビボで最適な活性を示すために重要である。即ち非グリコシル化システムで発現したα−ｇａｌＡは不活性であったりまたは不安定であったりする（HantzopolousらのGene 57: 159, 1987）。またグリコシル化は、α−ｇａｌＡが目的とする標的細胞にインターナリゼーションされるためにも重要であり、インビボでの酵素の循環血中半減期に影響を与える。α−ｇａｌＡのそれぞれのサブユニットには、アスパラギンに結合する炭水化物鎖の付加にとって役立つ４つの部位があり、そのうち３つの部位だけが占められている（DesnickらのIn The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, pp2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995）。

安定してトランスフェクトされた細胞によって産生したα−ｇａｌＡのサンプルを、A. urafaciensから単離したノイラミニダーゼで処理すること（Boehringer-Mnnheim, Indianapolis, IN）によりシアリル酸を除去した。この反応は、５μｇのα−ｇａｌＡを１０ｍＵのノイラミニダーゼとともに室温で一晩、全体で１０μｌの酢酸緩衝塩溶液（ＡＢＳ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で処理することによって進行させた。

安定してトランスフェクトされた細胞によって産生した精製α−ｇａｌＡも、アルカリホスファターゼ（子ウシ小腸のアルカリホスファターゼ、Boehringer-Mnnheim, Indianapolis, IN）を用いて脱リン酸化したが、それは５μｇのα−ｇａｌＡを、ＡＢＳ（１ＭのトリスでｐＨを７．５に上昇させた）中に入れた１５Ｕのアルカリホスファターゼを用いて室温で一晩処理することによって行った。

このサンプルを、α−ｇａｌＡ特異性抗体を用いたウエスターンブロットにより分析した。用いた抗体はウサギのポリクローナル抗ペプチド抗体であり、それは免疫原としてα−ｇａｌＡのアミノ酸６８〜８１を表すペプチドを用いて産生させた。その後この蛋白質をＰＶＤＦ（Millopore, Bedford, MA）に移してからその膜を、抗血清が２．５％のブロット（脱脂したドライミルクの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．５、０．０５％のトウィーン−２０）中に含まれる１：２０００希釈液を用いてプローブした。この後で、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（Organon Teknika/Cappel, Durham, NC; 1:5000希釈液）に複合化したヤギ抗ウサギＩｇＧとＥＣＬ化学ルミネセンスキット（Amersham. Arlington Heights, IN）の試薬を用いて検出した。

ノイラミニダーゼを用いてα−ｇａｌＡを処理すると分子質量にわずかなシフト（約１５００〜２０００ダルトンまたは４〜６シアリル酸／モノマー）が起こるが、これはシアリル酸によりα−ｇａｌＡが広範囲に修飾されたことを示唆している。参考のために言うと、α−ｇａｌＡの血しょうの形態にはモノマー１個あたり５〜６個のシアリル酸残基があり、また胎盤の形態にはモノマー１個あたり０．５〜１．０個のシアリル酸残基がある（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1307, 1981）。

α−ｇａｌＡのシアリル酸とマンノース−６−燐酸による修飾を調べるために用いられる別の方法としては等電点分離法（ＩＥＦ）があり、それではサンプルが等電点（ＰＩ）または正味の電荷に基づいて分離される。こうしてα−ｇａｌＡから得られるシアリル酸や燐酸のようなチャージした残基が除去されると、ＩＥＦシステムにおいて蛋白質の移動度が変わって来ると予測される。

ＩＥＦ実験を行うためには本発明により産生したα−ｇａｌＡのサンプルを、２×Novexサンプル緩衝液（８Ｍのウレアを用いている、ｐＨ３．０〜７．０）とともに１：１で混合したノイラミニダーゼ及びアルカリホスファターゼを用いて処理し、ファルマライト（Pharmalyte：登録商標、Pharmacia, Uppsala, Sweden、ｐＨ３．０〜６．５、Pharmalyte(登録商標)４〜６．５及び２．５〜５．５、ゲルあたりそれぞれ０．２５ｍｌ）を用いて作った６ＭウレアのＩＥＦゲル（５．５％ポリアクリルアミド）にかけた。等電点の標準物質（Bio-Rad）も含ませた。電気泳動を行ったあとでそのゲルをＰＶＤＦに移し取り、ウエスターンブロット分析を上記に記載したように行った。

安定してトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によって産生したα−ｇａｌＡは、約４．４〜４．６５の範囲のｐＩを持つ三種の主要なイソ型からなる。これらの値はα−ｇａｌＡの血しょうの型及び胎盤の型のｐＩと同じである（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1307, 1981）。酵素のノイラミニダーゼ処理によって三種すべてのイソ型のｐＩが増加したが、このことは全てがサリチル酸によってある程度修飾されていることを示している。これらのデータは、安定したトランスフェクトがなされたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌＡが望ましい血しょう半減期を持っているに違いないことを示唆しており、そのことはこの材料が薬学的利用するのに充分ふさわしいことを示している。さらに、ノイラミダーゼ処理したα−ｇａｌＡをアルカリホスファターゼ処理すると、蛋白質の部分のｐＩが約５．０〜５．１にまでさらに増加したが、このことは酵素が一つまたはそれ以上のマンノース−６−ホスフェート残基を運搬していることを示している。この修飾は、標的細胞によってα−ｇａｌＡの効率のよいインターナリゼーションが起こるために必要である点で重要である。

Ｅ．安定したトランスフェクトを行った繊維芽細胞から精製されたα−ｇａｌＡの比活性
精製されたα−ｇａｌＡの能力または比活性を、酵素の触媒活性（４−ＭＵＦ−ｇａｌアッセイを用いて）と、蛋白質濃度の両方を測定することによって計算する。蛋白質濃度は、ＢＣＡシステム（Pierce）を用いるようなどれかの標準法によって、または２８０ｎｍでの吸収を測定し、吸光度係数２．３ｍｇ／ｍｌ（アミノ酸分析から決定した）を用いて値を計算することによって決定することができる。これらの手法を用いると、トランスフェクトしたヒト繊維芽細胞の条件を整えた培地から精製されたα−ｇａｌＡの比活性は２．２〜２．９×１０^６ユニット／蛋白質のｍｇであり、それはヒト組織から精製されるα−ｇａｌＡの比活性に匹敵する（Bishopらの、J. Biol. Chem. 256: 1301, 1981）。

Ｆ．マンノースまたはマンノース−６−ホスフェートが仲介するα−ｇａｌＡのインターナリゼーション
安定したトランスフェクトがなされた細胞によって産生されるα−ｇａｌＡがα−ｇａｌＡ欠損症の有効な治療薬となるためには、その酵素は影響を受けた細胞によってインターナリゼーションされなくてはならない。α−ｇａｌＡは生理学的なｐＨレベルでは活性でなく、また血液や小腸液では有効となりそうではない。リソソームの酸性環境でインターナリゼーションされる場合にのみ、蓄積した脂質基質は最適に代謝される。このインターナリゼーションは、細胞表面に現れていて、エンドサイトーシス経路によってリソソームにそのα−ｇａｌＡを供給するマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）受容体にα−ｇａｌＡが結合することによって仲介される。Ｍ６Ｐ受容体はいたるところに現れており、ほとんどの体細胞はそれをある程度まで発現する。糖蛋白質上にある露出したマンノース残基に特異的なマンノース受容体はほとんど行き渡ってはいない。後者の受容体は一般に、マクロファージ及びマクロファージ様の細胞にのみ見られるもので、これらの細胞型にα−ｇａｌＡが入る別の手段を提供する。

Ｍ６Ｐ−仲介型のα−ｇａｌＡのインターナリゼーションを証明するために、ファブリー病の患者から得られる皮膚の繊維芽細胞（NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository）を、増加させた濃度の本発明の精製α−ｇａｌＡが存在するところで一晩培養した。そのサンプルのいくつかは５ｍＭの可溶性Ｍ６Ｐを含んでおり、それはマンノース−６−ホスフェート受容体への結合を競合的に阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを競合的に阻害した。他のサンプルは３０μｇ／ｍｌのマンナンを含んでおり、それはマンノース受容体への結合を阻害し、結果的にその受容体によるインターナリゼーションを阻害した。インキュベーションを行ってからその細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのPefabloc（商品名、Boehringer-Mannheim, Indeanapolis, IN）及び１％のＮＰ−４０）に削り落とすことによって採集した。次にその溶解したサンプルを蛋白質濃度とα−ｇａｌＡ活性についてアッセイした。結果はα−ｇａｌＡ活性ユニット／細胞の蛋白質ｍｇとして表した。ファブリー細胞は用量−依存性の態様でα−ｇａｌＡをインターナリゼーションしていた（図７）。このインターナリゼーションはマンノース−６−ホスフェートによって阻害されたが、マンナンでは阻害されなかった。したがって、ファブリー繊維芽細胞におけるα−ｇａｌＡのインターナリゼーションはマンノース−６−ホスフェート受容体によって仲介されるが、マンノース受容体によっては仲介されない。

またα−ｇａｌＡは、内皮細胞、即ちファブリー病の治療で重要な標的となる細胞によってもインビトロでインターナリゼーションされる。ヒトの臍の緒の血管の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、７５００ユニットのα−ｇａｌＡとともに一晩培養した。ウェルのいくつかはＮ６Ｐを含んでいた。インキュベート期間を終えてから細胞を採集し、上記に記載したようにα−ｇａｌＡをアッセイした。α−ｇａｌＡのみとともにインキュベートした細胞は、コントロール（α−ｇａｌＡとともにインキュベートしなかった）の細胞の酵素レベルのほとんど１０倍もの酵素レベルであった。Ｍ６Ｐはα−ｇａｌＡの細胞内の蓄積を阻害するが、このことはＨＵＶＥＣによるα−ｇａｌＡのインターナリゼーションがＭ６Ｐ受容体によって仲介されることを示唆している。したがって本発明のヒトα−ｇａｌＡは、臨床的に関連する細胞によってインターナリゼーションされる。

マンノース受容体を発現することがわかっている培養ヒト細胞株はほとんどない。しかしながらマンノース受容体を運搬するが、マンノース−６−ホスフェート受容体があるならばほんの少しだけ運搬するマウスのマクロファージ様細胞系（Ｊ７７４．Ｅ）を、本発明の精製α−ｇａｌＡがマンノース受容体を経てインターナリゼーションされるかどうかを調べるために用いることができる（DimentらのJ. Leukocyte Biol. 42: 485-490, 1987）。Ｊ７７４．Ｅ細胞を１０，０００ユニット／α−ｇａｌＡのｍｌが存在するところで一晩培養した。選択したサンプルも２ｍＭのＭ６Ｐを含んでいたが、他のものは１００μｇ／マンナンのｍｌを含んでいた。その細胞を洗浄してから上記に記載したように収集し、それぞれのサンプルの全蛋白質とα−ｇａｌＡの活性を決定した。その結果が表６に示されている。Ｍ６Ｐはこれらの細胞によるα−ｇａｌＡの取り込みを阻害しないが、マンナンは蓄積されたα−ｇａｌＡのレベルを７５％まで減少させた。しがたって本発明のα−ｇａｌＡは、マンノース受容体、即ちこの特定の細胞表面受容体を発現する細胞型にあるマンノース受容体によってインターナリゼーションされるらしい。

Ｊ７７４．Ｅ細胞によるα−ｇａｌＡのインターナリゼーション
α−ｇａｌＡ活性（ユニット／全蛋白質のｍｇ）

これらの実験は、安定してトランスフェクトしたヒト細胞によって産生されたα−ｇａｌＡがマンノースまたはマンノース−６−ホスフェート受容体を介して細胞によってインターナリゼーションされるらしいことを証明している。

Ｇ．α−ｇａｌＡを発現するヒト繊維芽細胞によるファブリー繊維芽細胞の修正
遺伝子治療では、α−ｇａｌＡを産生する自家細胞の移植片が適当に修飾された形態でその酵素を産生することによって、標的細胞のα−ｇａｌＡ欠損症を「修正」できなくてはならない。ファブリー細胞におけるトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞によるα−ｇａｌＡの産生の効果を評価するために、ファブリー病の患者から採集した繊維芽細胞（NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository）を、トランスウェルズ（登録商標、Costar, Cambridge, MA）でα−ｇａｌＡ−産生細胞株（ＢＲＳ−１１）とともに共培養した。その実験スキームが図８に図示されている。ファブリー細胞は１２ウェルの組織培養皿にて培養し、そのうちのいくつかは、細胞が成長できる表面を持つインサート（トランスウェルズ（Transwells、登録商標、０．４μｍの孔径）を含んでいた。このインサートの成長マトリックスは多孔性であり、巨大分子が上方から下方の環境へと通ることを可能にする。１セットのインサートは、最小レベルのα−ｇａｌＡを分泌するヒトの包皮（ＨＦ）の繊維芽細胞を含んでおり、これに対して別のセットは大量のα−ｇａｌＡを分泌する安定にトランスフェクトしたヒト繊維芽細胞株、ＢＲＳ−１１を含んでいた。α−ｇａｌＡ−産生細胞とともに共培養したウェルでは、α−ｇａｌＡがファブリー細胞を浸している培地に入ることができ、ファブリー細胞によってインターナリゼーションされる可能性を秘めている。

表７のデータは、ファブリー細胞が分泌されたα−ｇａｌＡをインターナリゼーションしたことを示している。α−ｇａｌＡの細胞内レベルを３日間モニターした。単独で（インサートなしで）培養するか、トランスフェクトされていない包皮の繊維芽細胞（ＨＦインサート）の存在下で培養したこれらの細胞は、α−ｇａｌＡ活性の細胞内レベルが非常に低かった。しかしながらα−ｇａｌＡ−産生（ＢＲＳ−１１インサート）細胞とともに培養したファブリー細胞は、二日目の終わりまでには正常細胞の酵素レベルと同じくらいの酵素レベルを示した（正常の繊維芽細胞は、α−ｇａｌＡが２５〜８０ユニット／蛋白質のｍｇである）。この修正が、Ｍ６Ｐ受容体を介して取り上げられるα−ｇａｌＡに起因していることは、マンノース−６−ホスフェート（ＢＲＳ−１１インサート＋Ｍ６Ｐ）を用いてそれが阻害されることによって証明される。

α−ｇａｌＡを発現するヒト繊維芽細胞によるファブリー繊維芽細胞の修正
α−ｇａｌＡ活性（ユニット／全蛋白質のｍｇ）

Ｈ．他の細胞型の利用
他の細胞型をこの明細書に記載された方法で利用できる。この細胞はさまざまな組織から得ることができ、またそれには培養して維持できる全ての細胞型が含まれる。例えば、本発明によってトランスフェクトすることのできる一次細胞及び二次細胞には、ヒト繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞（例えば、乳房または小腸の上皮細胞）、内皮細胞、神経膠細胞、神経細胞、血液を形成する要素（例えばリンパ球や骨髄細胞）、筋肉細胞、及びこれらの体細胞型の前駆体が含まれる。繊維芽細胞は特に関心がもたれる。一次細胞は、患者の免疫システムによってそれらが拒絶されることのないように、トランスフェクトした一次または二次の細胞を投与すべき患者から得ると好ましい。しかしながら、免疫拒絶（下記に記載したような）を阻止したり抑制したりするために適当な注意が払われるならば、患者以外のヒトドナーの細胞をうまく用いることができる。このことは、標準化され、確立され、安定してトランスフェクトされた細胞系の使用を、全ての患者において可能にするであろう。

Ｉ．α−ｇａｌＡ−発現細胞の投与
上記に記載した細胞は、それらが例えば腎臓の被膜下、皮下の区画部分、中枢神経系、脊髄内空間、肝臓、腹膜腔内空間、または筋肉内などに存在するように、種々の標準化された投与経路を経てヒトに導入することができる。またこの細胞は、ヒトの血流で循環するように静脈内または動脈内に注入してもよい。一旦ヒトに移植すると、そのトランスフェクトされた細胞は治療用産物であるグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを産生しかつ分泌する。

ヒトに導入できるように遺伝的に修飾された細胞の数はいろいろ変えることができるが、技術的熟練者によって決定することができる。酵素の分配容積、半減期及び生物利用可能性、並びにインビボでの遺伝的に修飾された細胞の産生性はもちろんのこと、それぞれの患者の年齢、体重、性別及び全身状態が、用量及び投与経路を決定する際のおもに考慮すべきことに入るであろう。通常は、１日あたり１０^６個の細胞につき１００〜１００，０００ユニットの範囲の発現レベルを呈する１００万個から１０億個の細胞が用いられる。必要であればこの手法は、望ましい結果が得られるまで、例えばファブリー病が関与する症状から開放されるまで繰り返してもよいし、また修飾してもよい。

上記に記載したように用いた細胞は、それらが患者の免疫系によって拒絶されないように一般には患者特異的であり、即ちトランスフェクトされた一次細胞または二次細胞が投与されるべきヒトから得られる細胞である。しかしながらこの計画が可能でなかったり望ましくなかったりする場合には、細胞を別のヒトから入手してこの明細書に記載したように遺伝的に修飾し、そしてα−ｇａｌＡ欠損症にかかっている患者に移植すればよい。

受容者以外のヒトから得た細胞を用いると、免疫抑制剤の投与、組織適合抗原の変更、または移植した細胞の拒絶反応を抑制するためのバリア装置の利用が必要となるかもしれない。バリア装置は、分泌された産物が受容者の循環器や組織に入ることを可能にするが、移植された細胞と受容者の免疫システムとの間の接触を阻止し、それにより受容者によるその細胞に対する免疫応答（及び起こりうる拒絶反応）を阻止する材料（例えば、Amicon, Beverly, MAから得られるＸＭ−５０のような膜）からなる。遺伝子治療に関する更なるガイダンスについてはSeldenら（WO 93/09222）を参照のこと。

またこの細胞は、ハイブリッドマトリックス移植物を用いることを記載した共同者自身の文献、U.S.S.N. 08/548/002に記載されているように、あるいは親水性のゲル材料に分泌細胞をマクロカプセル封入化することについて記載しているJainらの出願（PCT出願WO 95/19430）に記載されているように、マトリックスまたはゲル材料に埋め込まれていてもよい（そのそれぞれは参照文献として本明細書に組み入れられる）。

Ｊ．α−ｇａｌＡ蛋白質を簡便に投与するための製薬配合剤
安定してトランスフェクトした（または別の方法で遺伝的に修飾した）ヒト細胞によって発現して分泌され、そして本明細書に記載したように精製されるα−ｇａｌＡ蛋白質を、α−ｇａｌＡ蛋白質産生が不十分または欠損している患者に投与することができる。この蛋白質は、薬学的に受容可能なキャリアに入れて、例えば実施例ＩＩＩに記載されたような配合剤に入れてｐＨ６．５以下で投与することができる。配合剤で含まれていてもよい賦形剤の例は、クエン酸塩緩衝液、燐酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、もしくは重炭酸塩緩衝液のような緩衝液、アミノ酸、ウレア、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミンもしくはゼラチンのような蛋白質、ＥＤＴＡ、塩酸ナトリウム、リポソーム、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）である。投与経路は例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、脳内、筋肉内、肺内、または粘膜経由であるとよい。投与のルート及び分配される蛋白質の量は、技術熟練者の評価能力に充分入るファクターによって決定することができる。さらに技術熟練者は、治療用蛋白質の投与経路及び用量を、治療用量レベルが得られるまで対象の患者において変化させるとよいことがわかっている。典型的には、α−ｇａｌＡは０．０１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの用量で投与されるであろう。この蛋白質を調節しながら繰り返し投薬することは、患者の生涯にわたって必要であろう。

Ｋ．酵素欠損症によって起こる他の状態の治療
α−ｇａｌＡ以外のリソソーム貯蔵酵素の欠損症によって引き起こされる他の状態は、本明細書に記載した方法に匹敵する方法による治療に影響を受けるであろうと見込まれる。これらの場合では、欠乏した酵素の機能的な型をコードするＤＮＡを、本明細書に開示された発現構築物でのα−ｇａｌＡをコードするＤＮＡと置換すればよい。確認されている酵素欠損症候群、及び本明細書に記載されたような治療に影響される可能性のある酵素欠損症候群の例が表８に示されている。この表における情報はNeufeld（Ann. Rev. Biochem. 60:257-280, 1991）から得られるものであり、それは参照文献として本明細書に組み入れられる。

Ｖ．他の態様
本明細書に記載された本発明は、トランスフェクション、即ち遺伝子産物をコードするとともに、コード配列の発現をコントロールする調節要素を持っている構築物の導入後に特定の遺伝子産物を発現する細胞を用いる治療方法によって部分的に説明した。またこれらの方法は、他の工程、即ち遺伝子の標的化及び遺伝子の活性化によって遺伝的に修飾された細胞を用いて行ってもよい（参照文献として本明細書に組み入れられるTrecoらのWO 95/31560参照、またSeldenらのWO 93/09222も参照）。

ｈＧＨシグナルペプチドは、異型の蛋白質の発現と分泌のレベルを大きくするためにα−ｇａｌＡ以外の異型の蛋白質とともに用いてもよい。このような蛋白質の例にはα−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポ蛋白質Ｅ、アポリポ蛋白質Ａ−１、血液凝固因子Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘ，及びＸＩＩＩ、骨成長因子−２、骨成長因子−７、カルシトニン、触媒性抗体、ＤＮＡｓｅ、エリスロポエチン、ＦＳＨ−β、グロビン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、免疫応答変更遺伝子、イムノグロブリン、インシュリン、インシュリノトロピン、インシュリン様成長因子、インターフェロン−β、インターフェロン−β神経成長因子、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−１受容体のアンタゴニスト、低密度リポ蛋白質受容体、Ｍ−ＣＳＦ、パラチロイドホルモン、プロテインキナーゼＣ、可溶性ＣＤ４、スーパーオキサイドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、ＴＳＨβ、チロシンヒドロキシラーゼ、及びウロキナーゼが含まれる。
他の態様は次の請求の範囲内に含まれる。

ヒト繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーからα−ｇａｌＡを単離するために用いた２１０ｂｐのプローブの表示である（配列番号：１９）。この配列はα−ｇａｌＡ遺伝子のエキソン７からのものである。プローブはヒトゲノムのＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離した。この図のアンダーラインをつけた領域は、増幅プライマーの配列に対応する。 α−ｇａｌＡのｃＤＮＡクローンの５’末端を完成させるＤＮＡフラグメントの配列の表示である（配列番号：２０）。このフラグメントはＰＣＲによってヒトゲノムのＤＮＡから増幅した。アンダーラインをつけた領域は増幅プライマーの配列に対応している。実施例ＩＡに記載されているようにサブクローニングする際に用いられるＮｃｏＩ及びＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の位置も示されている。 α−ｇａｌＡのｃＤＮＡの配列の表示であり、それはシグナルペプチド（配列番号：１８）をコードする配列を含んでいる。ｐＸＡＧ−１６、即ちＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターとイントロン、ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列と第１イントロン、α−ｇａｌＡのｃＤＮＡ（即ちα−ｇａｌＡシグナルペプチド配列を欠いている）、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含むα−ｇａｌＡ発現構築物の概略地図である。 pXAG-28、即ちコラーゲンＩα２プロモーター、β−アクチンイントロン、ｈＧＨシグナルペプチドをコードする配列と第１イントロン、α−ｇａｌＡのｃＤＮＡ（即ちα−ｇａｌＡシグナルペプチド配列を欠いている）、及びｈＧＨ３’ＵＴＳを含むα−ｇａｌＡ発現構築物の概略地図である。ブチルセファロース（登録商標）樹脂を用いるα−ｇａｌＡの精製工程のクロマトグラムである。選択したフラクションの２８０ｎｍにおける吸光度（単純な線）とα−ｇａｌＡ活性（ドットをつけた線）が示されている。本発明により準備したヒトα−ｇａｌＡのファブリー繊維芽細胞によるインターナリゼーションを図示している線グラフである。細胞内のα−ｇａｌＡ活性と全蛋白質濃度は、本発明により準備したヒトα−ｇａｌＡの濃度を増加させて細胞のインキュベートを行ったあとで測定した。潜在的なインターナリゼーション−インヒビター、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ；白いひし形）とマンナン（白丸）の効果が示されている。 α−ｇａｌＡのインターナリゼーションのあとでファブリーの繊維芽細胞を調べるべく設計された実験の典型の外略図である。ファブリー細胞のα−ｇａｌＡ活性は、正常のヒト繊維芽細胞かトランスウェル（Transwell：商品名）挿入物で培養したα−ｇａｌＡを過剰発現するヒト繊維芽細胞かいずれかにさらした後で測定する。「Ｍ６Ｐ」＝マンノース−６−ホスフェート。「ＵｎｔｒｆＨＦ」＝トランスフェクトされていないヒト繊維芽細胞、「ＢＲＳ１１」＝トランスフェクトしたα−ｇａｌＡ−過剰発現繊維芽細胞株。ヒトα−ｇａｌＡアミノ酸配列（配列番号：２６）の表示である。ｈＧＨシグナルペプチドをコードし、第１ｈＧＨイントロン（アンダーライン）を含むＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２７）。イントロンを持たないｈＧＨシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２２）。ｈＧＨシグナルペプチドのアミノ酸配列の表示である（配列番号：２１）。ヒトα−ｇａｌＡ（シグナルペプチドを持たない）をコードするｃＤＮＡ配列の表示である（配列番号：２５）。

Claims

α−ガラクトシダーゼＡ欠損症であると推測される患者を同定する段階と、ヒトα−ｇａｌＡを過剰発現し、かつ分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞を該患者に導入する段階とを含む治療方法。
細胞が、ヒトα−ｇａｌＡ（配列番号：２６）を含むポリペプチドをコードするコード配列を有するＤＮＡ分子でインビトロにてトランスフェクトされた請求項１記載の方法。
ポリペプチドが異種シグナルペプチドをさらに含む請求項２記載の方法。
異種シグナルペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）シグナルペプチド（配列番号：２１）である請求項３記載の方法。
ＤＮＡ分子が、前記シグナルペプチドをコードする配列にイントロンを含む請求項３記載の方法。
ＤＮＡ分子が、コード配列の終結コドンの３’に隣接して存在する少なくとも６個のヌクレオチドからなる非翻訳配列を含み、該非翻訳配列がポリアデニル化部位を含む請求項３記載の方法。
ｈＧＨシグナルペプチド（配列番号：２１）をコードし、イントロンを含む第１配列と、
該第１配列の３’末端に結合し、ヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードする第２配列とを含むＤＮＡ分子。
ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列をさらに含む請求項７記載のＤＮＡ分子。
請求項７記載のＤＮＡ分子を含み、ヒト細胞での発現に適当である発現構築物。
（ａ）異種シグナルペプチドに結合されたヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードし、かつ（ｂ）細胞における該ポリペプチドの発現を可能にするＤＮＡ分子を含む培養されたヒト細胞。
繊維芽細胞である請求項１０記載の細胞。
上皮細胞、内皮細胞、骨髄細胞、神経膠細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、神経細胞、またはこれらの細胞型の前駆体からなる群より選択される請求項１０記載の細胞。
シグナルペプチドが、ｈＧＨシグナルペプチド（配列番号：２１）である請求項１０記載の細胞。
（ａ）異種シグナルペプチドに結合されたヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードし、かつ（ｂ）細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされた複数の培養ヒト細胞から本質的になるクローン細胞株。
細胞が繊維芽細胞である請求項１４に記載のクローン細胞株。
（ａ）異種シグナルペプチドに結合されたヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードし、かつ（ｂ）細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするＤＮＡ分子を用いてトランスフェクトされた複数の不死化ヒト細胞から本質的になるクローン細胞系。
細胞が、Bowesメラノーマ細胞、Daudi細胞、Hela細胞、HL-60細胞、HT1080細胞、Jurkat細胞、KB癌細胞、K-562白血病細胞、MCF-7乳癌細胞、MOLT-4細胞、Namalwa細胞、Raji細胞、RPMI 8226細胞、U-937細胞、WI-38VA13（サブ系統2R4）細胞、及び2780AD卵巣癌細胞からなる群より選択される請求項１６記載のクローン細胞系。
（ｂ）ヒトα−ｇａｌＡにペプチド結合によって結合された（ａ）ｈＧＨシグナルペプチド（配列番号：２１）を含む蛋白質。
前記ＤＮＡ分子からヒトα−ｇａｌＡを発現させ、細胞の培養培地にグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡが分泌されるような条件下で請求項１１記載の細胞を培養する段階と、
該培養培地からグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを単離する段階とを含むグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを製造する方法。
請求項１９記載の方法によって製造された精製グリコシル化ヒトα−ｇａｌＡ。
サンプルが疎水性の相互作用樹脂を通過する第１クロマトグラフィー工程を含む、サンプルからヒトα−ｇａｌＡを精製する方法。
前記樹脂上の機能的部分がブチル基を含む請求項２１記載の方法。
前記ＤＮＡ分子からヒトα−ｇａｌＡを発現させ細胞の培養培地にグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡが分泌されるような条件下で請求項１６記載の細胞を培養する段階と、
前記培養培地からグリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを単離する段階とを含む、グリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを製造する方法。
固定化ヘパリン樹脂、ハイドロキシアパタイト、アニオン交換樹脂、及びサイズ排除樹脂からなる群より選択される第２樹脂にサンプルを通す段階をさらに含む請求項２１記載の方法。
α−ｇａｌＡ欠損症であると推測される患者を同定する段階と、
請求項２０記載の精製グリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを該患者に投与する段階とを含む治療方法。
薬学的に許容されるキャリア中にＮ−結合マンノース−６−ホスフェートを有する薬学的に許容される精製ヒトα−ｇａｌＡを含む治療用組成物。
請求項２０記載の精製ヒトα−ｇａｌＡと薬学的に許容される賦形剤とを含む治療用組成物。
ｐＨ６．５またはそれ以下で処方された請求項２７記載の治療用組成物。
薬学的に許容される賦形剤がヒト血清アルブミンである請求項２８記載の治療用組成物。
ｈＧＨ以外のポリペプチドに結合されたｈＧＨ（配列番号：２１）のシグナルペプチドを含む蛋白質をコードするＤＮＡ分子。
シグナルペプチドをコードする配列にイントロンを含む請求項３０記載のＤＮＡ分子。
（ａ）ヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードし、かつ（ｂ）細胞における該ポリペプチドの過剰発現を可能にするＤＮＡ分子を含む培養されたヒト細胞。
前記ＤＮＡ分子からヒトα−ｇａｌＡが発現されるような条件下で、ヒトα−ｇａｌＡを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含有するヒト細胞を培養する段階を含む、グリコシル化ヒトα−ｇａｌＡを製造する方法。
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項２６記載の治療用組成物。
機能的部分としてブチル基を含む疎水性相互作用樹脂に前記サンプルを通す段階を含む、サンプルからヒトα−ｇａｌＡを精製する方法。