JPH06503479A - 動物体細胞の粒子−媒介トランスフォーメーション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物体細胞の粒子−媒介トランスフォーメーション関連出願の相互参照 本願は、１９８９年６月２６日に出願され、放棄された出願０７／３”Ｉｌ、８ ６９の一部継続出願である、１９９０年３月１４日に出願された出願０７／４９ ４．９３３の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、一般に遺伝子トランスフォーメーション（形質転換）技術に関し、特 に、治療的蛋白質の循環レベルを達成するための全動物の非生殖系列細胞の遺伝 子トランスフォーメーションのための技術に関する。

発明の背景 動物の遺伝子工学技術か発展し、外来ＤＮＡを動物のゲノムＤＮＡに挿入し、又 は機能的プラスミドＤＮＡとして細胞の核に導入することかできる。従来一般に このような動物の遺伝子トランスフォーメーションは、マイクロインノエクノヨ ／や、レトロウィルスヘースのトランスフォーメーションベクターを使用するこ とにより行われ、その効果は動物細胞をイノビトロ又はインビボで外来ＤＮＡで 遺伝子的にトランスフオームすることである。挿入が胚細胞に行われると外来Ｄ 　Ｎ　Ａは動物の胚のゲノムに導入され、次いで、その胚から生まれる娘細胞の それぞれのゲノムに導入される。この遺伝子トランスフォーメーションは、生物 の非生殖細胞又は生殖細胞を含む得られる全ての生物の細胞の全てに、導入され たＤＮＡを挿入する。これにより、その遺伝子持性は、正常なメンデルの法則に 従って、トランスフす−ムされた動物の子孫に確実に受け渡される。

動物細胞をその場（ｉｎ　５ｉｔｕ）でトランスフオームして、動物の生殖細胞 の遺伝子持性に影響を及ぼすことなく、動物が遺伝子構築物の遺伝子産物を有す るようにできるることか望ましい場合かある。特に、ヒトへの応用の場合、この ような体細胞トランスフォーメーションの使用により、ヒトの生殖細胞に人間か 介入することによって起こる倫理上及び哲学上の多くの問題か回避される。遺伝 子的に処理された体細胞は、正常な生物学的機能に必要な酵素や蛋白質の不活性 化又は欠失からなる遺伝した遺伝子疾壱の遺伝子矯正を可能にする能力を提供す る。このような、生殖系列細胞ではなく、体細胞の遺伝子トランスフォーメーシ ョンは、ある種の治療用途にも好ましいと考えられる。例えば、患者に対する治 療用途を有するある種の蛋白質は現在のところ、厳密に定期的に患者に注射され なければならない。しかし、大量の蛋白質を定期的に注射することは、頻繁に行 われるとしても、注射直後には過剰供給となり、次の注射の直前には過少供給と なり、注射に続いて毒性のショックをまねくおそれかあり、また次の注射の直前 には治療効果に充分な供給ができないという結果をもたらす。別の方策は、動物 又はヒトの体細胞に、望ましい蛋白質の遺伝子を処理して、動物又はヒトが生き ている間、トランスフオームされた細胞か、一定の濃度で治療的蛋白質を生産す るようにすることである。予め決められた確実な寿命を有する体細胞、例えば皮 膚細胞に、トランスフォーミング遺伝子を導入することにより、処置された動物 又はヒトに対する蛋白質投与量において時間的に制限のあるインビボの治療的生 産系を創りだすことができる。獣医学用途においては、存在時間の短くない、そ の動物の寿命期間に渡って動物とともに存在する動物の体細胞部分に、動物の改 良、治療、又は病気の防止を目的として、ホルモン、他の成長因子、又は蛋白質 を導入することか望ましい場合かある。

動物体又は動物の培養細胞のトランスフォーメーションに向けられた殆どの努力 は、マイクロインジェクション法又はレトロウィルストランス７オーメーンヨン ヘクターの使用に向けられたものであるか、本発明のトランスフォーメー７ヨ７ 法に使用する装置は、トランスフオームされた体細胞のゲノムに外来ＤＮＡをト ランスフオームするという全く異なる方法論に基ついている。本発明の装置を特 にその使用に適するようにしている特徴の幾つかを含む装置について一つの示唆 を与える先行技術がある。Ｋｌｅｉｎ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２ ７：　７０−７３　（１９８７）に記載されているように、ＤＮＡを担持する金 属の極めて小さな粒子を加速する装置は培養植物細胞のトランスフォーメーショ ンに有効であることが証明されている。

トランスフォーミングＤＮＡを、非常に小さな粒子に塗布し、この粒子を、弾道 推進体上で実際に発射することにより物理的に加速し、トランスフオームすべき 組繊内に導入する。この装置は培養植物細胞をトランスフオームするのに有用で あることが証明されているが、この粒子の衝撃力の調節ができないという欠陥か あり、トランスフオームした組織にこの粒子を挿入する広範囲にわたる運動エネ ルギーで生物体をトランスフオームするのに使用することを困難にしている。

発明の要約 本発明は、インビボで動物の体細胞をトランスフオームする方法に向けられたも のであり、動物体細胞中で発現することが望ましい蛋白質をコードし、動物細胞 中で作用するプロモーターに連結された配列を含み、該蛋白質の分泌を起こすこ とができるシグナルペプチドを含む、外来ＤＮＡ構築物を、動物細胞の生物学的 機能を損なうことなくその細胞内に進入することができるような充分に小さいサ イズの微小粒子上に車重し、標的部に動物を配置し、標的動物に該粒子を加速し て、標的動物細胞内に導入することにより、このように処置された細胞の一部を 遺伝子的にトランスフオームし、動物をインビボでトランスフオームして多数の 細胞に、外来遺伝子がコードする蛋白質を生産、分泌させる。

本発明の更なる目的は、外来ＤＮＡで処置された動物であって、その体細胞が、 発現外来遺伝子構築物と、該遺伝子構築物を担持する金属材料の非常に小さな粒 子とを含む動物を提供することである。

本発明の他の目的は、動物の皮膚体細胞をトランスフオームして、該皮膚細胞か 生物学的に正常に脱皮するまでの限定された時間、蛋白質を動物体内で生産する ようにする方法を提供することである。

本発明の他の目的、効果、特徴は、以下の明細書の説明並びに添付した図面から 明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の方法を実施するのに使用する装置の分解透視図である。

第２図は、第１図の装置の放電室の平面図である。

第３図は、以下の実施例の一つで使用したプラスミドｐＷＲＧ１６０１の概略説 明図である。

好ましい実施態様 本発明は、動物又はヒトの体細胞の形質転換に関するものである。本願明細書で 使用される体細胞とは、形質転換した場合において、生物の胚細胞（ｇｅｒｍ　 ｃｅｌｌＳ）又は配偶子細胞（ｓｅｘ　ｃｅｌｌｓ）の遺伝的特性又は性質を同 等変化させず、したがって、通常の生物学的生殖影響を介してその動物又はヒト を復製する場合、導入された外来性遺伝物質は、その生物の生物学的子孫に受け 継がれないような動物又はヒトの細胞を記述することを意図するものである。分 泌シグナルペプチト配列を含むタンパク質をコードする遺伝子で体細胞を遺伝子 的に形質転換することにより、長期間、治療性タンパク質か循環するレベルを達 成することができる。

形質転換された動物体細胞は、標的とする動物の適当な組織タイプのものとする ことができる。そのうち好ましい標的とする組織には、皮膚、筋肉組織及び内臓 組織があり、そのすべてがインビボで形質転換し得る。動物で通常露出されてい ない組織の体細胞、すなわち、内蔵は、短期間の形質転換操作を行う間、一時的 、かつ外科的に露出させてもよい。また、体細胞の形質転換を行える適当な標的 臓器には、肝臓、膵臓、膵臓、心臓、腎臓、脳、骨髄、乳房、生殖器、甲状腺、 胃腸系の組織、白血球のような循環性細胞がある。

本発明は、外来性の、しばしばキメラの、遺伝子構造物を動物性体細胞に導入す ることに関するものである。このような外来性遺伝子構築物は、同一種であるか 又は異なる種の、他の生物から得られたＤＮＡを含むものであって、形質転換さ れる生物の細胞に遺伝子を人為的に導入することにより、人為的操作を介して形 質転換される生物に導入されるものである。この外来性ＤＮＡ構築物は、転写生 成物又は対象とされているタンパク質をコードする配列とともに、通常、生物の 形質転換細胞においてコード配列によりコードされているタンパク質または転写 生成物の発現に有効なフランキング制御配列を含んでいる。フランキング制御配 列の例には、転写の開始に有効なプロモーター配列、及び転写又は翻訳の終結の いずれにかによって、遺伝子によりコード化された遺伝子生成物を終結させるの に有効なターミネータ−配列がある。適当な転写エンハンサ−または翻訳効率の エンハンサ−を外来性遺伝子構築物に含ませることができ、形質転換細胞で得ら れる全形質転換過程及びタンパク質の発現の効率を、さらに補助することができ る。また、イントロンを遺伝子構築物に含めて転写を容易にし、かつ転写ＲＮＡ の適切なプロセシング及び運搬をもたらすことかできる。また、タンパク質以外 の他の遺伝子生成物を、導入した遺伝子構築物によって発現することかできる。

例えば、導入された構築物は、ちとからある遺伝子の発現を抑制するか、又は濃 密の病状を阻止するのに有効な負のＲＮＡＩｍを発現することかできる。遺伝子 生成物の一時的のみの発現か好ましい場合には、導入された構築物は、ＤＮＡに 対する代替物となる、ＲＮＡ自体とすることができる。

特に興味を集める他の制御配列として、分泌／グナルペプチトかある。このシグ ナルペプチド配列は、タンパク質コード化ＤＮＡ配列の５゛末端又は上流に位置 するタンパク質コード化ＤＮＡ配列である。このノブナルペプチド自体は、細胞 における各種の区画に対するタンパク質の分類、及び生成されるタンパク質の翻 訳時及び翻訳後プロセシングに関連する、未成熟タンパク質のアミノ末端部分で ある。通常、この過程は、細胞膜を横切るタンパク質の輸送を伴う。分泌／グナ ルベプチ１は、内部の細胞膜区画を通り、細胞から最終的に細胞外分泌液に送ら れるタンパク質の分泌を条件付けるシグナルペプチドである。哺乳類の細胞で有 効な多くの分泌シグナルペプチドが同定されており、このノグナルベプチトは、 発現されるタンパク質と本来的に関連するものであるか、又は外来性タンパク質 と結合した異種シグナルペプチドである。大成長ホルモン（ＨｕＧＨ）から得ら れる適当な／グナルペプチドか、後記のＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　＋　１に記載さ れている。

一般的に２種のタイプの分泌経路、期間的に調節された分泌と構造的な分泌かあ る。前者においては、分泌タンパク質は、分泌顆粒と呼ばれる中間的小胞に貯え られており、分泌を促す刺激（ｓｅｃｒｅｔｏｇｏｇｕｅ）に応答して、分泌顆 粒の膜及び原形質膜の融解によって放出される。構造的な分泌においては、分泌 顆粒かみられず、分泌タンパク質か、明らかに各種細胞膜を横切って、細胞の外 部に出ているけれとも、どの様にして起るのか明らかでない。分泌ホルモンであ るインンユリノ及び成長ホルモンは、それぞれ小細胞及び前部下垂体といったそ れらの正常な部位で産生された場合には、調節経路によって正常に分泌される。

しかしながら、この調節経路はタンパク質と同様に細胞のタイプに従属しており 、その結果、皮脂腺以外の皮膚細胞は通常、調節された分泌を示さないという理 由から、皮膚細胞におけるヒト成長ホルモンは構造的経路に従うであろうと予想 される。

本願明細書において使用されているように、用語”形質転換（トランスフォーメ ーション）”を、遺伝的形質転換、即ち生きている細胞への外来性遺伝子の導入 と、外来性遺伝子によってコード化されているタンパク質又は他の遺伝子生成物 の細胞内での発現の工程を記述するために使用する。本願明細書で使用されてい る該用語“形質転換′は、時折同様に゛形質転換°と呼ばれることがある、細胞 又は細胞系による有害な活性の始まりを記述することを意図しない。

本発明では、小粒子上に被覆されたＤＮＡの、動物体細胞の遺伝子物質への取り 込みを、物理的に加速させる気体衝撃波を作りだす調節可能な放電を用いる装置 の特別な使用を行う。本発明で使用する適当な装置を図１に記載する。この装置 は、約１〜２ｍｍの間隔で離された２本の電極１４を内部に設けたスパーク放電 室１２からなる。このスパーク放電室は、上部末端の外側に２箇所の開口部１６ 及び１８を有し、水平面上に延びた矩形のものである。一方の開口部１８は、近 接プレート２０で覆われている。電極１４の反対側に位置する他の開口部は、キ ャリヤーシート２２によって覆う。この電極１４は、適当な調節可能な放電電圧 発生装置と結ばれている。このような放電電圧発生装置は、１〜２マイクロフア ラドのサイズ範囲のコンデンサーと結ばれた適当な電気的スイッチングを含んで おり、例えば自動転換装置の使用により、例えば１〜５０．０００ボルトの範囲 で、コンデンサーに誘導する電荷の電圧の量を調整することが可能である。適当 なスイッチ操作を行うことにより、コンデンサーが、使用者に安全で便利な、電 極１４を介する放電を提供する。

スパーク放電室１２の開口部１８を覆うキャリアシート２２は、マイラー（ｌＹ ｌａｒ）で被覆したアルミ化サラン（ｓａｒａｎ）のシートであることか好まし いが、他の軽く、強く、耐久性のあるシート材料も使用できる。放電室の開口部 の上方、その約５〜１軸ｍ上に置かれているのは保持シート２４である。標的表 面２６を保持スクリーン上方約５〜２５ａｏａに置く。その使用において、動物 の体細胞を形質転換させる外来性遺伝子構築物を、当業者に周知の適当なりＮＡ 調製技術によって調製し、それを、金のような耐久性のある高密度物質の小さな 粒子上に被覆する。なお、この粒子は、一般にサイズを１〜３ミクロンとする。

表面をＤＮＡで被覆されたキャリヤー粒子をスパーク放電室の上部に入れられた キャリヤーノート２２の上に置く。

次いで、生存し、かつ麻酔かかＣすられている動物のような標的とする組織を、 標的表面２６に近接するように置く。次にサイズが約２〜４ミクロンの水の小滴 を、電橋１４の末端を橋架けするように置く。近接プレートカバー２０を放電室 １２の頂部を覆うように置く。この時点で、キャリアー／−１−２２と標的の間 の雰囲気を、装置と標的を閉鎖し、かつ封入物に、雰囲気ガスのほとんどを置き 換えるのに十分な量のヘリウムを導入することにより、ヘリウムでほとんど置き 換える。

この時点で、電極間の火花放電は、好適な電子的切替え手段により開始されても よい。電気放電力は、電極１４の間の火花放電キャップに電弧を形成し、この間 に置かれた水の少量の小滴を即座に気化する。水の気化力は、火花放電チャンバ −１２内部において、外向に向くあらゆる方向に放射されるガスの衝撃波を作成 する。キャリヤーシート２２上の衝撃波の衝撃は、キャリヤーシート２２を非常 に早い速度で上に進ませる。上の方に移動するキャリヤーシート２２は、保持（ ｒｅｔａｉ旧Ｄｇ）スクリーン２４と接触するまで上方向に加速する。ヘリウム の存在は、キャリヤーシート及びキャリヤー粒子の飛行に対してより小さな抗力 を生じ、標的に伝わるより小さい衝撃波の力を与える。保持スクリーン２４にキ ャリヤーシートは保持され、あらかじめそれに施されたＤＮＡコーティング粒子 は、キャリヤーシートから飛散し標的表面に自由に移動する。その粒子は、標的 表面に進み、細胞に入る。それらが、標的の生体又は組織の表面に衝突する際の 、粒子の運動量は、電極１４に加えられた初期電気放電の電圧に基づいて調節で きる。従って、電極１４の間に放電される電気エネルギー量の変化により、標的 に衝突する粒子の速度を調節することができ、また、標的組織への粒子の侵入の 深さを電極１４間を通しての電気放電の調節範囲にわたって連続的に調節するこ とができる。キャリヤー粒子上のＤＮＡの適用の割合及びキャリヤー／−ト上の コーティングしたキャリヤー粒子の適用の割合を調節して、異なる細胞及び組織 の型について装置の機能を最適にすることができる。

図１の装置は、培養における細胞の塊及び成長する生体の全体を含む種々の形態 において分化又は未分化の組織の形質転換に有用であることを前に示したもので ある。ここで論した研究を通して、この装置は培養における動物細胞の形質転換 又は様々な動物体細胞組織の細胞の形質転換用に等しく好適なことが見出された 。動物の種及び型に適当なように、動物に麻酔をかけることにより、ｉｎ　ｖｉ ｖ。

において動物全体の一部を形質転換し、その後、麻酔した動物を標的表面として 作用する平坦な表面にカットした穴上に置くことも可能である。標的表面２６に おける穴を通して暴露した動物の一部は、形質転換操作により形質転換した処理 標的組織となる。

二こで意図するように、方法が循環タンパクの治療に有意なレベルを得ることを 目的とする場合は、外因性遺伝子構築物は、その５゛末端に分泌／グナルペプチ ド配列を含むタンパクコード配列を含む。その後、遺伝子構築物のコピーは、罹 患動物の組織に、キャリヤー粒子により運ぶことができる。該組織は、表面組織 もしくは内部組織、又は外科手術により一時的に露出された生体であってもよい 。

驚くべきことに、罹患動物の血流における循環タンパク質の有意なレベルは、動 物の無傷表皮に対する粒子加速処理により達成することができる。表皮に対する そのような処置は、おそらく永久的ではないが、一定の時間のタンパク質生成及 び循環を生ずる。もしかすると永久的な、又は少なくとも長期間の１タンパク質 の発現を達成するために、皮膚組織層は一時的に暴露されていてもよく、形質転 換衝撃（ｂｌｕｓｈ）は下側の皮膚層、即ち真皮に適用されてもよい。皮膚組織 層を暴露するために比較的簡単な方法で、皮膚を外科的に下層の筋肉層から分離 する。

この分離は、皮膚組織層の下側、即ち真皮を暴露し、その後、その真皮は粒子加 速により処理されてもよい。そのような処理は、少なくとも長期間の遺伝子発現 をもたらすことが見出された。

！！■ ａ）使用したベクター 第一の実施例では、抗生物質クロラムフェニコール耐性を与える酵素クロラムフ ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が動物内で発現するように構 成されたキメラ発現ベクターのペアを使用した。両方のキメラ遺伝子発現プラス ミドが、動物におけるトランスフェクションの研究に有効であることが以前より 記載され、示されてきた。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔは、ボルマン（Ｇｏｒｍａ ｎ）らにより、Ｍ。

１、ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、２＋１０４４−１０５１（１９８２年）に記載され、 発現ベクターｐＲ５Ｖｃａｔは、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）らによりＮａＬｕ ｒｅ、　３０６：５５７−５６１（１９８３年）に記載された。プラスミドｐｓ Ｖ２ｃａｌは、／ミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、プラスミ ドｐＢＲ３２２〜Ｔｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼコード領域、Ｓ■−４０Ｔ−抗原イントロン及びｐＢＲ３２２ヘクターに運ば れたＳＶ４０初期ポリアデニル化領域を含むキメラｃａｔ遺伝子構築物である。

該プラスミドは、完全なＳＶ４０ウィルス性ゲノムを含まず、かつ感染性ではな い。プラスミドｐＲ３Ｖｃａｔは、キメララウス肉１ウィルス（Ｒ５Ｖ）末端反 復長配列及びプロモーター断片、Ｔｎ９由来のｃａｔコート領域、マウスのヘー ターグロブリ／遺伝子からのイントロン及びＳＶ４０初期転写ユニット由来のポ リアデニル化領域を含むｐＢＲ３２２ベースプラスミドである。このプラスミド も、完全なウィルス性ゲノムを含まず、かつ感染性ではない。使用した関連のプ ラスミドは、ｐＲ３ＶＮＰＴＩ＋と指称し、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、 ネオマイシンホスホトランスフエラーゼＩ＋遺伝子のコード領域、抗生物質力ナ マインン及び６４１８に耐性のコード領域、及びＳＶ４０由来のポリアデニル化 領域を含むものである。このプラスミドも完全なウィルス性ゲノムを含まず、か つ感染性ではない。

下記の実施例に用いた他のベクターは、ｐＷＲＧ１６０１といい、これを図３に 示した。

ベクターｐＷＲＧ１６０１は、逆方向の（ｏｐｐｏｓｉｔｅｌｙ　ｏｒｉｅｎｔ ｅｄ）ファージプロモーター、発現カ七ノド（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓ ｅｔｔｅ）において、サイトメガウィルス隣接初期（１ｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａ ｒｌｙ）プロモーター（ｐＣＭＶｉｅＰ）及びその後のヒト成長ホルモン（Ｈｕ ＧＨ）の転写及び３°フラ／キング領域を含んでおり、それは、セルトン（Ｓｅ ｌｄｏｎ）ら著、’、１ｏｌｅｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　６：３１？３−３ １７９（１９８６年）、プツト（Ｄｅｎｏｔｏ）ら著、Ｎｕｃ　ｌ　八ｃｉｄ@ Ｒ ｅｓ、　、　９：３７１９−３７３０（１９８１年）、及びノーハルグ（Ｓｅｅ ｂｕｒｇ）著、ＤＮＡ　、ｌ：２３９−２４９（１９８２年）に記載されている 。ＨｕＧＨタンパクコート配列には、その５゛末端に分泌ノグナルペブチトをコ ードする配列を含んでいる。３３７ヌクレオチドのＤＮＡ配列を、ＳＥＱ　１０ 　ＮＱ、　：ｌとして示した。それは、２６アミノ酸シグナルペプチトを一緒に コートする二つのエクソン及び）ＩｕＧ）Ｉ遺伝子のイントロンＡを含むもので ある。

ｐＷＲＧ１６０２を、以下のようにしてプラスミドのＥＢＶ領域を含む旧ｎｄ　 Ｉｌｌ断片の欠失によりｐＷＲＧ１６０１から誘導した。ｐＷＲＧ１６０１を、 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、製造した断片の末端はＫｌ ｅｎｏｗ　ＤＮ＾ＮＱメラーゼ及び４種全部のデオキシヌクレオチドトリホスフ エートの処理により平滑にする。合成Ｓａｌ　Ｉオリゴヌクレオチドリンカーを 分子の末端に加え、これらを次にＳａｌ　！で消化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで 結合することにより断片を環状化した。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換 し、アンピシリン耐性形質転換株を選択することにより回収した。ｐＷＲＧ１６ ０２の構造を図４に示した。ｐＷＲＧ１６０２には、ＣＭＶ−ＨｕＧＨ遺伝子及 びｐＷＲＧ１６０１由来の９０２Ｍ３領域か含まれるか、ＥＢＶ領域は欠失して いる。

ｂ）哺乳動物体細胞（インビボ） マウスをクロロホルムで麻酔にかけた。各マウスの脇腹の面積約１ｃｍ２の毛を 剃った。そして、該マウスを、窓を有するペトリ皿の上に該毛を剃った部分かそ の窓を覆うように載せた。

次いで、ｐＲ３ＶｃａｔのＤＮＡを、金ミリグラム当たり０．１マイクログラム の割合で、１〜３ミクロンの金粒子の上に被覆した。該ＤＮＡは、最終濃度か０ ６ＭになるようにＣａＣｌｘを添加して、６％ポリエチレングリコール（分子量 ３．０００）を有する２５ｍＭスペルミジンと沈殿させることによって金に適用 した。次いで、該ＤＮＡｍｆｆ金ビーズを１００％エタノールで濯ぎ、エタノー ル性懸濁液として、０．０５ｍｇ／ｃｍ’キャリアーンートの乾爆金被覆ビーズ の１度でキャリアーシートに適用した。

マウスを載せたベトリ皿を嘩的表面として第１図及び第２図の装置に載せた。

電気スパークを放つ前に、キャリアーシートと該標的の間の面をヘリウム（４リ ツタ一／分）で１５秒間フラッノユして、マウスに対するキャリアーシート上の 空気中の影響物及び何らかの存在し得る衝撃波ダメージを減少させた。

形質転換操作の後、全てのマウスは害されておらずそれらは完全に回復したよう であった。試験動物には傷または出血は見られなかった。２４時間後にマウスを 殺し、該皮膚部分を切除してＣＡＴ活性を分析した。この分析は、放射線ラヘル したクロラムフェニコールでアセチル化活性を試験することによって行われた。

次いで、アセチル化された生成物の放射性の減衰を形質転換された酵素活性の指 標として使用することかできた。

使用した種々の放電レベル及びコントロールについて得られた結果を以下の表に 纒める。

条　件　５０μｍ当たり　総蛋白　蛋白５０μｇのＣＰＭ　μｇ／μｍ　当たり の数 １２ＫＶ１４圧　＋６．６８６　４．４　３７９２１ミクロン ＋６ＫＶ電圧　６．２８１　５．６　１１２１１ミクロン １２ＫＶ電圧　１５．９３７　５．６　２８５４１ミクロン １２ＫＶ電圧　１４．９６９　３．５　４２７６１ミクロン ＤＮＡ十カオリン　１２３　４．３　２８（ＤＮＡ含浸コントロール） ＤＮＡ＋ＤＭＳＯ１１７２，３５０ （ＤＮＡ含浸コントロール） ＤＮＡなしくコントロール’）　１１９　５．６　２１これらの結果は、バック グランドレベルの少なくとも１００倍のＣＡＴ活性かあることを示している。従 って、外来遺伝子はマウスへの害または損傷の形跡なしに体細胞中に送り込まれ て発現した。

Ｃ）両性動物体細胞（インビボ） 蛙（キセノバス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）　）を４℃に冷やして麻酔にかけた。該蛙も ベトリ皿に開けた窓の上に載せて蓋をし、マウスの場合と同し方法で第１図及び 第２図の形質転換装置中に配置した。

以下を除いては蛙についてもマウスについて使用した条件及び操作を繰り返した 。即ち、使用したＤ　Ｎ　ＡはｐｓＶ２ｃａｔであった。ＤＮＡ被覆被覆−ビー ズ１ｍｇ／ｃｍ”の密度でキャリアーシートの上に載せた。

同じく形質転換工程の後、蛙は全く害されていなかった。また、同しく蛙（こ（ ま傷または出血は見られなかった。２４時間後に蛙を殺し、処理した１ｃｍ’の 皮膚部分を切除してＣＡＴ活性を分析した。その結果を以下の表に纒める。

条　件　５０μｍ当たり　総蛋白　蛋白５０μｇのＣＰＭ　μｇ／μｍ　当たり の数 １２ＫＶ（ａ部）　ｌ　３．１４９　２．１　６２６１１６ＫＶ（背中’）　１ ７．５７０　４．０　４３９２コントロール（腹部）　１５３　１．４　１０９ コントロール（背中）　１４５　４．１　３２このように、この例ではＣＡＴ活 性のレベルはバックグランドの５０倍を越えて大きいことが観察された。従って 、外来遺伝子のこの送り込み及び発現は、蛙への如何なる明かな損傷または外傷 なしに体細胞中で行われた。

ｄ）両性動物体細胞（インビボ）−全身生成物キセノパスについての第２の実験 において、１匹の蛙を上記と同様の条件で処理したが、その回数は同じ蛙に２回 としたく背中に１６ＫＶ、腹部に１２ＫＶ）。

この場合、０．１ｍｇ／ｃｍ”の代わりに０．０５ｍｇ／ｃｍ”　ＤＮＡ被覆ビ ーズを使用した。２０時間後にその蛙を殺し、形質転換された皮膚部分を試料に した。

更に、形質転換されていない皮膚部分（放電の際には遮蔽した）をＣＡＴ活性分 析用の試料にした。その結果を以下の表に纏める。

結　果　ＣＰＭ１５０μｌ　総蛋白　蛋白５０μｇμｇ／μｍ　当たりの数 １２ＫＶ（腹部）　２．０８５　７．５　２７８１６ＫＶ（背中’）　９．３４ ３　８．６　１．０８６同じ蛙の他の箇所　１．３０１　５．１　２５５からの 未処理皮膚 形質転換された皮膚部分における総活性は、より低いビーズ被覆割合により減少 するか、形質転換されていない皮膚試料は明らかに、先の実験におけるように、 形質転換されていない動物の皮膚よりも少なくとも２倍の上昇を示しており、こ れは、形質転換された皮膚部分において生成した酵素の全身的蓄積を示している 。

ｅ）１／ビボでの形質転換 ホルノマン（Ｈｏｌｔｚｍａｎ）ラットを麻酔にかけた。次いで、該麻酔にかけ たラットの腹腔を切開しその１Ｆｌ−１を露出した。その肝臓は切除することな く露出したたけであった。次いで、該ラットの腹腔を縫合して閉した。該ラット は、手術及び形質転換操作から回復した。該ラットの処理後の肝臓からは出血は 見られなかった。次いで、肝臓をこのように露出しても生きている該ラットを、 その露出した肝臓か標的表面２６に位置するように第１図及び第２図の装置に載 せて、粒子介在形質転換操作に付した。

÷ノド肝臓形質転換操作に使用したＤ　Ｎ　Ａは、ｐＲ３Ｖｃ　ａ　ｔで、金粒 子の上にミリグラム当たり１マイクログラムの割合で被覆したものであった。こ れは、２０マイクログラムのＤＮＡ、ｌＯＯマイクロリッターの緩衝液（１５０ ｍＭＮａｃＩ、１０ｍＭ１−リス８０）、５０マイクロリツターのＣａＣ１＋　 （２，５＼１）埼び２０ミリグラムの１ミクロン金粉末を混合することによって 行った。次いて、：５混合物をキャリアー７−ト上に被覆する前に、遠心分離し 、乾燥してエタノール中に再懸濁した。キャリアーノート上への被覆割合は、平 方七／千メートル当たり０．０５　ミリグラムの乾燥被覆金となる割合であった 。

；（キャ（（アー／−トを入れ、臓器か露出しｔニラノドを適当に配置した後、 ｒ子行程の空間を大気圧下２リツター／分のヘリウムで満たした。減圧で流入さ せることはし、なかった。該ラットの肝臓を１０または１４キロボルトのスパー ク放電圧で形質転換処理に付した。

２日後に該ラットを殺し肝臓を切除した。切除した肝臓組織をＣＡＴ活性につい て分析した。該金粒子は、肝臓組織の中に３００ミクロンまで浸透していたこと か分かった。

以下はこの方法の結果をまとめたものである。ＣＡＴ活性レヘしベ触媒作用をう けた基質のパーセントによって示してあり、定義された標準ＣＡＴ活性ユニット のパーセントとしても示しである。

肝臓についてすでに述べた遺伝子トランスファーのために、肝臓にかえてマウス の腹筋組織を同様に処理した。結果を以下に示す。

すなわちこれらの例は、本トランスフオーメーショノ技術により、内部組織の一 部として存在する体細胞を、生体内で、かつその部分でトランスファーメー／３ ］することか可能であることを具体的に示すものである。トランスフォーマメト 遺伝子の一過性の活性を少なくとも工ないし４週にわたって期待でき、低レベル での安定な発現は数か月にわたり達成されうるちのである。

ｆ）分泌タンパクをコードする遺伝子による皮膚トランスフェクションこの例は 、治療可能タンパクの血中循環濃度か皮膚に遺伝子トランスファーすることによ り達成されることを具体的に示すことを企図したものである。マないし８週齢の ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（約２０グラム）を処置した。上記のヒト成長ホルモ／発 現プラスミドｐＷＲＧ１６０１を用いてマウスでＨｕＧ）Ｉを発現させた。

ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｍｅ）とランパン（Ｒｏｍｐｕｎ）の混合物（それぞれ １０ｍ１および２ｍ１）を用いて　０５ｍ１を榎膜内注射することによりマウス を麻酔した。動物の下半身を刺毛した。ナイア（Ｎａｉｒ）除毛器を用いて処置 部分に残存する体毛を除いた。

プラスミドｐＷＲＧ１６０１　ＤＮＡのコピーを金アモルファス（エンゲハート 　１７４０）担体粒子にミリグラムあたり０．５マイクログラムの割合でのせた 。ＤＮＡを上記のようにして塩化カルシウムとスペルミジンにより担体粒子上に 沈殿させた。その後に、被覆された担体粒子を担体ソート上に０．５　ｍｇ／ｃ ｍ’の割合でのせた。図１および２の放電装置を２３ＫＶの放電にセットした。

目標面積に対応させるために上部に穴か開けられた逆さカップ型の目標支持体に よって目標表面を形成し、目標の動物か保持スクリーン上で一定の高さに保たれ るように調整した。処置部が穴の上に位置するように動物を目標表面上に置いた 。カップ型支持体の内側を減圧（１５■水銀）にした後に粒子被爆を行った。

動物を処置後に検査した。いくらかの発赤と場合によってはマイラー（ｍｙｌａ ｒ）のフラグメントか観られたものの、他の点では動物は健常にみえた。

処置から２．４．５、及び７時間目に動物を殺した。殺後、処置部位の皮膚をは かし、重量をはかって１容量（ｇ／ｉｆ）のＴＥＳバッファー中に入れて、細か くなるまで切り刻んだ。固形物を濃縮してアッセイまで凍結した。心臓に穴をあ けて各動物から全血、すなわちマウスあたり７５０ミリリツトルの血液を採取し た。この血液を終夜４℃に保って凝血させ、翌日に遠心分離を行った。分析のた めに血清を凍結した。

その後、ニコルス・インスティチューｈ　（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ）製のアレグロ（Ａ１１６ｇｒｏＴ′″）ヒト成長ホルモン・ラジオイムノア ッセイ（ＲＩＡ）システムを用いて組織を分析した。アッセイを較正するために 、既知量のヒト成長ホルモンを加えた対照試料を用意した。

対照試料はトランスフオームしていないマウスの皮膚を用いて試験試料と同時に 処理を行うことにより作成した。この対照試料は平均して１７５５．５カウント であり、通常のパックグラウントレベルではなかった。マウス血清試料の対照は 平均して２１９カウントであった。

７匹の処置マウスから得た組織と血清を、処置後の種々の時間に分析した。結果 を以下の表２に示す。

表２ この結果かられかるように、ＨＧＨタン（りはブラスト後約５時間口（こ測定可 能な１度でまずその部分に発現され、その後、増加を続ける。血行タン／くりの 血中濃度は処置後７時間で検出可能である。

ｇ）皮膚トランスフエクンヨンー復数回ブラストｐＷＲＧ１６０２の一回または 複数回ブラストによりマウスを被爆させた。プラスミドＤＮＡを２μｇ　ＤＮＡ ／ｍｇ担体粒子となるように担体粒子上にのせた。被覆担体粒子を担体ンートの 上に０．５　ｍｇ／ｃ＋＋１２の量で積層した。同一の動物の異なる部分ζこ１ 回もしくは４回にわたり２２　ＫＶで粒子被爆を行った。ブラスト後２４時間で 動物の皮膚および血液を検査した。以下の表２に示されるＨｕＧＨの値は、ノく ・ツクグラウンドを引いた後のネットの値である。

表２ ｈ）皮膚トランスフェクション−経時試験ｍｇ担体粒子あたり２μｇＤＮＡの量 で担体粒子にのせたｐＷＲＧ１６０１を用し１て、これらのトランスフオーメー シヨンを行った。被覆担体粒子を担体シートの上（こ０．４　ｍｇ／ｃｏ＋２の 量でのせた。マウスを動物あたり４回にわたり皮膚から２２　Ｋｌｌて被爆させ た。所定の時間に動物を殺して）ｌｕＧＨの１度を測定した。結果を以下の表３ に示すか、結果は同しくバックグラウンドを引いたネットの値である。

表３ ｉ）分泌可能なタンパク質遺伝子の肝臓トランスフェクション 本実験も、ｐＷＲＧ１６０１を使用して行った。プラスミドＤＮＡを、２５μｇ ＤＮＡ／ｍｇ金粒子で担体粒子上に載せ、この被覆された粒子を、０．１ｍｇ／ ｃｍ”の比率で担体シート上に載せた。１６〜１８ｋＶの放電圧力において噴射 を行った。

ラットを麻酔し、腹腔部を外科的に開けた。この動物の肝臓を露出された肝臓を 照準とする粒子加速装置により処理した。処理の後に、その切断部を縫合し、そ のラットを標準動物保護方法の下に維持した。１日後に、この動物を犠牲にし、 血清と肝臓試料を採取した。２０以上のラットにおいて繰り返した実験において 、生長ホルモンを循環させるレベルは、バックグラウンドのレベル以上に達した 。３つの複製の結果を表５にまとめて示す。

表５ ＲＩＡ　の　東り吻」次 （１６時間） グループＩ ＨＧＨ３４９±７６　６ 非ＨＧＨ２００＋２９　３ グループ２ ＨＧＨ３９４±２９　２ ＨＧＨ＋１ｕｘ　３１８±６７　６ 非）（Ｇ）（２２０±２３　２ グループ３ ＨＧＨ４１８±１１３　６ 非ＨＧＨ２４２±２１　２ 最良の２つの動物は、０．１１及び０　、１．２　ｏｇ／　＋ａ！血漿のＨＧ　 Ｈの循環レベルを有していた。

ｊ）皮膚ｉｌｋ中へのトランスフェクション本実験も、プラスミドｐＷＲＧ１６ ０１を使用して行った。ラッ１−を麻酔し、腹部の皮膚毛をヘアクリッパーで除 去し７、　ナイア処理した。腹部をメス切開により開き、組織を掻き裂いて開け 、皮膚を筋肉から分離した。筋膜の内層を皮膚組織の下側から除去した。粒子加 速方法を、皮膚層の下部（真皮）において行った。形質転換方法の実施後、リン 酸塩緩衝食塩水を添加して、皮膚を縫合した。対照は、未被覆の担体粒子により 爆撃した。各データ点に対して、１ｍｌの流体を皮下組織空間から集め、この試 料１００＋ｍｌをＲＩＡによりヒト生長ホルモンについてアッセイした。２つの 複製の結果を表６に示す。

表６ 複製１ １ｋｌ二！Ｉ！ＩＩ！Ｊ　体液ＨＧＨ濃直−ロＥ圭ロー ８時間　−ＨＧＨ（２動物）　０ ＋ＨＧＨ（７動物）　８ｎｇ／ｍ１ ２４時間　−ＨＧＨ（２動物）。

＋ＨＧＨ（７動物）　１７ｎｇ／＋ａｌグループ３ ＨＧＨ４１８±１１３　６ 非ＨＧＨ２４２±２１　２ 最良の２つの動物は、０１１及び０．１２ｎｇ／ｍｌ血漿のＨＧＨの循環レベル を有していた。

ｊ）皮膚組織中へのトランスフェクション本実験も、プラスミドｐＷＲＧ１６０ １を使用して行った。ラットを麻酔し、腹部の皮膚毛をヘアクリッパーで除去し 、Ｎ空気処理した。腹部をメス切開により開き、組織を掻き裂いて開け、皮膚を 筋肉から分離した。筋膜の内層を皮膚組織の下側から除去した。粒子加速方法を 、皮膚層の下部（真皮）において行った。形質転換方法の実施後、リン酸塩緩衝 食塩水を添加して、皮膚を縫合した。対照は、未被覆の担体粒子により爆撃した 。各データ点に対して、ｌｌ１１１の流体を皮下組織空間から集め、この試料１ ００＠ｌをＲＩＡによりヒト生長ホルモンについてアッセイした。２つの複製の 結果を表６に示す。

表６ 複製１ １藍１亘豆Ｊ　！ｌ　体液ＨＧＨ濃 Ｉ−ロ孜坐り− ８時間　−ＨＧＨ（２動物）　Ｏ ＋ＨＧＨ（７動物）　８ｎｇ／ａＬ１ ２４時間　−ＨＧＨ（２動物）　０ ＋ＨＧＨ（７動物）　１７ｎｇ／ｍｌ 複製２（１の動物） １肢皮二！１　聚を且立且遣１ １６時間　０　、３　ｎｇ／　ｍ１ ２４時間　０　、６　ｎｇ／　ｍ１ ３日　０　、４　ｎｇ／　ｍ１ ４日　０．３７　ｎｇ／ｍ１ ５日　０３ｎｇ／ｍｌ これらの結果は、挿入された遺伝子の長期間の表現及び分泌を示唆している。非 −分泌された遺伝子（ルシフェラーゼ）を使用して行われた類似のｉｎ　５ｉｔ ｕの形質転換実験は、皮膚組織中にトランスフェクションされた挿入遺伝子が、 ６月間以上にわたって、不変の有意の表現レベル（初期のレベルの少なくとも１ ０％、場合により４０〜８０％）を示したことを示唆している。このように治療 学的なタンパク質の分泌レベルは、皮膚処理により、前記時間間隔の間持続され ることができる。

本発明は、上記の特定の具体例または実施例に限定されることを意図するもので はないが、下記の請求の範囲の範囲内に属する全ての修正された態様を包含する 。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人ニスウニイン、ウィリアム　エフマーティネル、ブリアン　エフ チェノ、リアン （ｉｉ）発明の名称：動物体細胞の粒子−介在の形質転換 （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数：１ （ｉ　ｖ）通信住所 （Ａ）受信人：クエールスアンドブレイディ（Ｂ）通りニピーオーボックス２１ １３（Ｃ）都市：マディラン （Ｄ）州　ウィスコンンン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号＋　５３７０１−２１１３（Ｖ）コンピューター判読可能な形式 ：（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパティプル （Ｃ）作動システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア・パテ ントインリリース＃１０、バージョン１１．２５ （ｖｌ）最近の出願データ： （Ａ）出願番号・ＵＳ （Ｂ）出願臼：１９９１年１０月１６日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士に関する情報：（Ａ　）氏名ニジ−、ニコラス　ジ ェイ（Ｂ）登録番号：２７，３８６ （Ｃ）レファレンス／ドケット番号：１１２２９９（ｉｘ）電話通信に関する情 報： （Ａ）電話：　（６０８）２５１−５０００（Ｂ　）　７７−／　クス：　（６ ０８）　２５１−９１６６（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報（ｉ）配 列の特徴 （Ａ）長さ：３３６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｔｊｌの数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎮状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （Ｖ）フラグメントの型：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｉｘ）特徴： （Ａ）Ｎａｍｅ／ＫＥＹ　：イントロン（Ｂ）存在位置：１１．．２６６ （ｉｘ）特徴： （Ａ）Ｎａｍｅ／ＫＥＹ　：ｓｉｇ　ペプチド（Ｂ）存在位置：１．．３３６ （ｘ）刊行情報： （Ａ）著者：セルダン、 （Ｃ）ジャーナル：　ｒＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　ＢｉｏｌＪ（Ｅ）刷＝６ （Ｆ）ページ：３１７３〜３１７９ ＣＧ）日付：１９８６年 （Ｋ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中の関連残基：１〜（ｘｉ）配列の記述：Ｓ’Ｅ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ フロントページの続き （７２）発明者　マツケイプ　デニス　イーアメリカ合衆国　ウィスコンシン州 ５３５６２　ミドルトン　エアポート　ロード（７２）発明者　マーティネル　 プライアシ　エフアメリカ合衆国　ウィスコンシン州 ５３７１１　マディラン　アイリッシュ　レーアメリカ合衆国　ウィスコンシン 州 ５３７０５　マディラン　テムキン　ストリート１３１７　アパートメント　５

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．動物中のタンパク質の循環レベルを達成する方法であって、動物の細胞中で 該タンパク質を発現できるように構築され、分泌シグナルペプチドをコードする 配列を含む外来遺伝子構築物のコピーを、動物細胞のサイズに対して非常に小さ いサイズの密度の高い材料のキャリアー粒子上に被覆し、平坦なキャリアーシー ト上に前記被覆キャリアー粒子の層を形成し、動物細胞を前記キャリアーシート の移動方向に置き、キャリアーシートを動物細胞の方へ加速し、キャリアーシー トは動物細胞に当たることはないがキャリアー粒子が動物細胞中に移動し、動物 細胞に対する損傷を最小限にして前記外来遺伝子構築物が細胞中に導入されるよ うにする、各ステップからなる前記方法。
2. ２．外来遺伝子構築物が、タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、動物細胞内で の前記タンパク質の発現に有効な、有効なフランキング制御配列とを含む請求項 １記載の方法。
3. ３．動物細胞が生きた動物中の生体内のものであり、生きた動物の全体かキャリ アーシートの移動の方向に置かれる請求項１記載の方法。
4. ４．形質転換された動物細胞が、動物の皮膚にある請求項３記載の方法。
5. ５．形質転換された動物細胞が、肝細胞である請求項３記載の方法。
6. ６．キャリアーシートの最初の位置と動物細胞の間に保持スクリーンが置かれ、 キャリアーシートが動物細胞に向かって加速された後にキャリアーシートを保持 する請求項１記載の方法。
7. ７．キャリアー粒子が１〜３ミクロンの金粒子である請求項１記載の方法。
8. ８．キャリアーシートがガスの衝撃波によって加速される請求項１記載の方法。
9. ９．衝撃波が電圧放電によって発生される請求項７記載の方法。
10. １０．タンパク貧を動物の体液中に導入する方法であって、動物の細胞中での該 タンパク質の発現をコードし、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む外 来遺伝子構築物を調製し、該外来遺伝子構築物のコピーを不活性キャリアー粒子 上に被覆し、被覆キャリアー粒子を動物の皮膚中に加速し、動物の細胞の一部が 前記外来遺伝子構築物を発現して前記タンパク質を分泌するようにする、各ステ ップからなる前記方法。
11. １１．動物の皮膚を手術により露出し、キャリアー粒子を露出された皮膚の下側 に加速することをさらに含む請求項１０に記載の方法。
12. １２．シグナルペプチドがヒト成長ホルモンからのものである請求項１０記載の 方法。