JP2703893B2 - 外来遺伝子物質を発現する上皮細胞 - Google Patents

外来遺伝子物質を発現する上皮細胞

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 表皮細胞 皮ふは人体における最大の器官であつて、２つの成
分、すなわち表皮と真皮からなる。真皮は、コラーゲン
と他のマトリツクス物質からなる比較的不活性な製造で
ある。表皮は真皮の上に位置し、基底膜によつて真皮と
分れている。 表皮は一定の細胞再生を行い、約26日毎に再生され
る。表皮の大部分を構成する細胞は、ケラチン合成細胞
であつて、表皮の中でも生じる非ケラチン合成細胞（た
とえば、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル
細胞および種々の免疫細胞）のための環境を供給する。
ケラチン合成細胞は、ケラチン、すなわち不溶性繊維状
蛋白質であつて、重層扁平上皮を形成する。体の中の他
の細胞の様に、ケラチン合成細胞はすべての遺伝物質の
全補体を含む。ケラチン合成細胞に含まれる遺伝子の小
部分のみが生物学的に機能性であるレベルで発現され
る；すなわち、ケラチン合成細胞の中の遺伝子のほとん
どが全く発現されないかあるいはそれらがコードしてい
るポリペプチドが未検出量あるいは濃度（生物学的に機
能性あるいは有意である）で生産するような低レベルで
発現される。表皮のように、角膜上皮および結膜上皮は
重層扁平上皮であつて、これらの各組織中の大部分の細
胞はケラチン合成細胞である。ケラチンは表皮の機械的
保護作用を大部分担つている。さらに、表皮は毒物と微
生物が皮ふに入るのを防止し、水分と電解質が失われる
のを防ぐ。 表皮は主たる２つの層からなる。最も外側のものは角
質層であつて、無核角化細胞の葉状層である。次は生存
しうる内部細胞層の連続したもの、すなわち、角化細胞
が生じるマルビーギ層と称されるものである。該マルピ
ーギ層は基底細胞層、すなわち有棘層と顆粒層である。
基底膜に隣接して横たわる基底細胞層は大部分の細胞分
裂が生じる胚葉層である。有棘層は特徴的ケラトヒアリ
ン顆粒を有する扁平有核細胞の層である。顆粒層は有棘
層と角質層との間にあり、前者の有核細胞と後者の無核
細胞との間の遷移的なものと考えられている。 基底層の中で細胞が分裂するにつれて、該細胞は上に
動き、他の表皮層まで進行する。該細胞が進行するにつ
れて、ケラチン合成細胞は形と細胞質構造に変化をきた
す。これらの変化により、生存し得る代謝上活性な細胞
が角層の無核角化細胞に形質転換され、これらの細胞は
架橋した蛋白質膜によつて囲まれたケラチン繊維からな
る。この進行性形質転換はケラチン化と称される。 表皮細胞は増殖単位または列として生じるものと考え
られる。各列の基底は基底細胞群であり、これは該基底
細胞が列の末梢あるいは中央にあるか否かによつて末梢
か中央として分類される。中央の基底細胞は分裂し、そ
の一方、得られた娘細胞のいくつかは分裂し末梢基底位
置に迄動く。次いで末梢基底細胞は連続的表皮層を通し
て上に進む。これらの細胞はケラチン化扁平細胞に形質
転換され、最終的にはがれ落ち、体から脱落する。しか
し、中央の基底細胞は幹細胞である。これらの幹細胞の
子孫は個々の寿命を通じて死滅しないであろう。これら
の基底細胞は不死であつて、分裂する毎に不死の娘細胞
が生じる。他の娘細胞は上述の如く、分化した細胞とな
り、最終的には脱落する。表皮は一定の細胞再生を受け
る体のいくつかの組織の１つであつて、該組織とは小腸
の内層および骨髄のような他の上皮である。 最近発展した方法を使用して種内遺伝子組換えを行う
ことができる。全く異なる生物学的分類のものから得ら
れた遺伝子は複写でき選択された微生物中で発現でき
る。したがつて、外来遺伝子を特定をウイルスまたはプ
ラスミドのレプリコンに結合させることにより他のクラ
スの微生物の特性を有する代謝または合成機能（たとえ
ば、ホルモン合成、蛋白質合成、窒素固定）を規定する
微生物遺伝子に導入できる。 1970年代の後半から、クローン化されたDNA配列を哺
乳類の細胞に導入する一般的な方法の開発に進歩がみら
れた。しかし、今日では、遺伝物質を上皮細胞に導入し
通常は発現しない遺伝子材料を発現させることができる
効果的方法が必要とされている。 本発明は、組換え外来遺伝子、または上皮細胞におい
て生物学的に有意の濃度で通常発現しない遺伝物質を上
皮細胞に導入することにもとづいている。 本発明の上皮細胞は組換え外来性遺伝物質を組み込ん
でおり、組み込まれた組換え外来遺伝子を発現する。外
来遺伝物質は上皮細胞にはないDNAまたはRNA;上皮細胞
の中で生じるが生物学的に有意であるレベル（すなわ
ち、該DNAまたはRNAがコードしているポリペプチドの正
常な生理学的作用を生ぜしめるに充分なレベル）で発現
されないDNAまたはRNA;上皮細胞で生じ、上皮細胞中で
発現されるように修飾されているDNAまたはRNA;および
上皮細胞中で発現されるように修飾できるDNAまたはRN
A、の単独またはそれらの組合せであり得る。さらに、
本発明の上皮細胞は、外来遺伝物質を発現する細胞が確
認できる選択マーカーをコードする遺伝子物質を発現で
きる。 詳しくは、レトロウイルス性ベクターを使用して外来
遺伝物質および上記選択マーカーをコードしている遺伝
物質を上皮細胞、特にケラチン合成細胞に組み込んだ。
外来遺伝子を他の上皮細胞、たとえば角膜、結膜、胃腸
管の内壁、膣壁および気管および骨髄細胞に導入するこ
とも可能である。上記遺伝子が組み込まれたケラチン合
成細胞によるこれらの遺伝子の発現も示された。組換え
染色体を有するレトロウイルス性ベクターを使用して２
つのタイプの遺伝物質を上皮細胞に導入する方法も本発
明の対象である。 本発明の上皮細胞には多くの利点があり、該細胞を非
常に有用にしている。たとえば、本発明のケラチン合成
細胞を有する表皮は実際本発明に従つて組込まれた遺伝
物質によつてコードされたポリペプチド（たとえばホル
モン、酵素、薬物）を合成する。表皮はこのように上記
ポリペプチドにとつて連続的な放出システムとして役立
つ。このように、ホルモンや他のポリペプチドが絶えず
拡散されるので前述の療法で患者がしばしば遭遇する問
題が回避されよう。さらに、ポリペプチドの長くかか
り、しばしば高価な精製を必要としない。インシユイン
のような単離されたポリペプチドを注射できるようにな
る前は、該ポリペプチドは手間をかけて精製し、特性を
しらべた。しかし、本発明の方法で修飾したケラチン合
成細胞を有する上皮を使用する場合、一たん遺伝子を単
離すれば、それを上記細胞に導入でき、通常産生される
ようにポリペプチドホルモンを産生するであろう。（イ
ンシユリンの場合、たとえばすい臓の中で通常産生され
るように産生されよう。） 本発明のケラチン合成細胞を有する移植片の使用によ
る他の利点は、移植片のサイズをコントロールすること
により体内に放出されるポリペプチドの量がコントロー
ルできることである。さらに、皮ふ移植片であるため、
ポリペプチドをもはや産生する必要がなくなつた場合に
切除できることである。たとえば、ポリペプチド（ホル
モン、酵素または薬物）の放出が特異的期間のみ必要な
場合、処置がもはや必要でなくなつた時点で遺伝子操作
した移植片を切除できる。 本発明の結果として可能な放出システムの重要な利点
は、該システムが連続放出システムであるので、ポリペ
プチドホルモンが非常に短い半減期を有するという事実
が欠点ではないということである。たとえば、HGHの半
減期は約19分であつて、生来のインシユリン（純粋なイ
ンシユリン）の場合約３〜４分である。 遺伝子はレトロウイルス性ベクターを使用してケラチ
ン合成細胞に導入できるので、レトロウイルス性ベクタ
ーコントロールに“オン”（付す）でき；そのような場
合、目的とする遺伝子はレトロウイルスのプロモーター
から転写される。プロモーターは、RNA合成を開始するR
NAポリメラーゼ分子によつて確認される特異的ヌクレオ
チド配列である。該遺伝子の転写を行うプロモーター成
分（組換えレトロウイルスに組み込まれたプロモーター
の外に）を有するレトロウイルス性ベクターをつくるこ
とは可能である。たとえば外部因子または刺激（cue）
によつてモジユレートされた別のプロモーターが存在し
て該外部因子または刺激を活性化することによつてケラ
チン合成細胞によつて産生されているポリペプチドのレ
ベルをコントロールする造成物（contruct）をつくるこ
とができる。たとえば、熱シヨツク蛋白質は上記プロモ
ーターが温度によつて調節されている遺伝子によつてコ
ードされている蛋白質である。金属含有蛋白質メタロチ
オニンをコードする遺伝子のプロモーターは、Cd++イオ
ンに反応性である。このプロモーターまたは外部キュー
によつて影響される他のプロモーターを組み込むと、遺
伝子操作したケラチン合成細胞あによるポリペプチドの
産生を調節することも可能になる。 図面の簡単な説明 第１図は典型的なネズミ白血病ウイルス（レトロウイ
ルス性）感染体の概略図であり； 第２図はneo遺伝子が組み込まれた組換えレトロウイ
ルスの染色体の概略図であり； 第３図は優性の選択マーカー（neo遺伝子）をケラチ
ン合成細胞に導入するのに使用される方法の１つの具体
例のブロツクダイヤグラムであり； 第４図はneo遺伝子とヒト成長ホルモン（HGH）をコー
ドしている遺伝子を有する組換えレトロウイルスの染色
体の概略図であり； 第５図は、ケラチン合成細胞が外来遺伝物質と優性の
選択マーカーをコードする遺伝物質を有する上皮シート
をつくり、はがし、移植するのに使用される方法の一具
体例の絵入り略図であり； 第６図は決められた時間内に分泌された甲状腺ホルモ
ンの量を示す実施例４によつてつくられたグラフであ
る。 上皮細胞の該細胞の中で発現できる外来遺伝物質を組
み込むことが可能である。この外来遺伝物質は上皮細胞
の中で生じないDNAまたはRNA;上皮細胞の中で生じるが
生物学的に有意であるレベル（すなわち、該DNAまたはR
NAがコードしているポリペプチドの正常な生理学的作用
を生ぜしめるに充分なレベル）で発現されないDNAまた
はRNA;上皮細胞で生じ、上皮細胞中で発現されるように
修飾されているDNAまたはRNA;および上皮細胞中で発現
できるように修飾できるDNAまたはRNA、の単独あるいは
それらの組合せであり得る。たとえば、ホルモンをコー
ドする外来遺伝物質を、該外来遺伝物質を有する組換え
染色体を有する感染性ウイルスを産生する供給細胞層と
ともにケラチン合成細胞を培養することによつてケラチ
ン合成細胞に導入できる。組換え染色体は優性の選択マ
ーカーをコードする遺伝子物質をも有する。特に、ケラ
チン合成細胞はPsi am細胞とともに培養でき、ヒト成長
ホルモンをコードする遺伝物質を有する組換え染色体を
有する感染性ウイルスを産生する。結果として、neo遺
伝子およびHGHをコードする外来遺伝子物質を発現する
ケラチン合成細胞をつくることができる。すなわち本発
明の結果、主たる選択可能マーカーおよびそのような細
胞では通常生物学的に有意のレベルで発現されないポリ
ペプチドを発現するケラチン合成細胞をつくることがで
きる。 ２つのタイプの遺伝物質を発現するケラチン合成細胞
を全面生長させることができ；生育させた培養容器から
上皮シートとしてとり出し；体に適用できる。このよう
にして適用された上皮シートはケラチン合成細胞によつ
てつくられたホルモン、酵素または薬物を連続的供給が
可能になる。たとえばそれらの産生に影響を与える外部
刺激または因子を使用することによつて；適用された上
皮シートのサイズをコントロールすることにより；また
は上皮シートをとり出すことによりこのようにホルモ
ン、酵素または薬物の供給量を変化させあるいは調節す
ることができる。 培養された表皮細胞 ヒトケラチン合成細胞は注意深く調節された条件下に
組織培養できる。グリーン（Green）および協同研究者
達は、ヒト表皮細胞または他のケラチン合成細胞を培養
物中増殖できないように処理しておいた線維芽細胞とと
もに生育させることができる技術を開発した。線維芽細
胞産生物（線維芽細胞培養物より得られた倍地から供給
された）の存在は、グリーン（Green）らによつて、ケ
ラチン合成細胞の生育を本質的に支持することがわかつ
た。線維芽細胞濃度がこれらの培養物においてコントロ
ールされて表皮細胞コロニーの形成させ成長させる。グ
リーンらにより開発された上記方法により、ヒト表皮細
胞を連続的に培養させて第１培養物に存在する数を非常
に増大せしめることができる。これらの培養方法は米国
特許第,016,036（1977）;4,304,866（1981）；グリーン
（Green）ら、グロース・オブ・カルチヤード・ヒユー
マン・エピデルマル・セルズ・イントら、マルテイプル
・エピテリア・スイタブル・フオー・グラフテイング
（Growth of cultured human epidermal cells into mu
ltiple epithelia suitable for grafting）、プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proceedings of the National Academ
y of Sciences,USA）7:5665−5668（1979）；レインワ
ールド（Rheinwald）、J.GおよびH.グリーン（Gree
n）、エピデルマル・グロース・フアクター・エンド・
ザ・マルチプリケーシヨン・オブ・カルチヤード・ヒユ
ーマン・エピデルマル・ケラチノサイツ（Epidermal gr
owth factor and multiplicotion of Cultured human e
pidermal Keratinocytes）ネーチヤー（Nature）、26
5、421−424（1977）に開示されており、その教示内容
は本明細書において文献として記載されている。 簡単には、ケラチン合成細胞の培養のための特定の方
法は、酵素（トリプシン）によつて表皮をケラチン合成
細胞に離解し、該細胞を、致死量の放射線を照射された
線維芽細胞の供給細胞層があるペトリ皿の上に塗ること
からなる。該線維芽細胞はペトリ皿に付着してケラチン
合成細胞の生育に必要な因子を提供できるが、それ自体
複製できない。上記の共培養は10％牛胎児血清、アデニ
ン、コレラトキシン、ハイドロコーチゾン、トランスフ
エリン、インシユリンおよび上皮生長因子を含有するダ
ブルベツコの変性イーグル培地で行なわれる。 このように培養された個々のケラチン合成細胞はコロ
ニーを形成し、該コロニーは拡大し生長してより大きな
コロニーになり、互いにくつついて上皮を形成する。こ
の上皮はヒト表皮の特性に似た重要な特性を有する。た
とえば、単一の細胞で始まつた各コロニーは重層上皮を
形成する。基底細胞（皿の底に隣接した細胞）の層にお
いて細胞分裂が生じる。これらの基底細胞はすべての細
胞増殖の原因であり、基底細胞を離れる細胞は最終的に
分化する。さらに、培養された細胞に存在する大量のケ
ラチン蛋白質がある。この方法で培養された表皮細胞は
ケラチン合成細胞の主たる細胞学的特徴を有し、培養で
生育された細胞は当然表皮に似てくる。 グリーンらは彼らの方法を小さな表皮バイオプシー
（約2cm2の大きさ）で開始して比較的短時間で大量の培
養上皮を形成できるものに発展させた。約１ケ月のうち
に、約２平方メートル、すなわち、全身の表面をおおう
に充分な表皮を産生することができる。これらの細胞は
実験室で驚くべき増殖能力を有し、大変うまく培養でき
るため非常に価値の高い系である。たとえば培養細胞は
重度の熱傷の治療においてオートローガス移植片として
使用されてきた。オコーナーN.E.ら、グラフテイング・
オブ・バーンズ・ウイズ・カルチヤード・エピテリウム
・プリペアード・フロム・オートローガス・エピデルマ
ル・セルス、ザランセツト、75−78（1981）（Ｏ′Conn
or,N.E.,et al.Grafting of burns with cultured epit
helium prepared from autologous epidermal Cells,Th
e,Lancet,75−78（1981）） レトロウイルス性ベクター レトロウイルスはRNAウイルスであり、該ウイルスの
ゲノムはRNAである。このゲノムのRNAはDNA中間体へと
逆転写され、感染した細胞の染色体DNAに非常に効果的
に融合される。この融合されたDNA中間体はプロウイル
スと称される。第１図に示されるように、レトロウイル
スのゲノムおよびプロウイルスのDNAは、３つの遺伝
子；gag，polおよびenvであつて２つの長い末端の繰返
し（LTR）配列によつてフランキングされているものを
有する。gag遺伝子は内部構造（ヌクレオキヤプシド）
蛋白質であり；pol遺伝子はRNA−支持DNAポリメラーゼ
（逆転写酵素）をコードし；env遺伝子はウイルスエン
ベロプ糖蛋白質をコードする。５′および３′LTRはビ
リオン（virion）RNAの転写とポリアデニレーシヨンを
促進する役目をする。 ５′LTRに隣接して上記ゲノム（tRNAプライマー結合
部位）の逆転写およびウイルス性RNAの粒子（theまたは
Psi部位）への有効なエンカプシデイシヨン（encapsida
tion）のために必要な配列がある。ムリガン、R.C.コン
ストラクシヨン・オブ・ハイリイトランスミツシブル・
マンマリアン・クローニング・ベーヒクルズ・デリーブ
ト・フロム・ミユーリン・レトロウイルスイズ、イン：
エクスペリメンタル・マニピユーレシヨン・オブ・ジー
ン・エクスプレシヨン、M.イノウエ（ed）、155−173
（1983）；マン、Ｒ、ムリガンR.C.およびバルチモア,
D,コンストラクシヨン・オブ・ア・レトロウイルス・パ
ツケージング・ミユータント・エンド・イツツ・ユース
・トウ・プロデユース・ヘルパーフリーデフエクテイブ
・レトロウイルス、セル、33:153−159（1983）ウイリ
アムス、D.A.ら、イントロダクシヨン・オブ・ニユー・
ジエネテイツク・マテリアル・イントウー・プルーリポ
テント・ヘマトポエテイツク・ステム・セルズ・オブ・
ザ・マウス・ネイチヤー、310;476−480（1984）（Mull
igan,R.C.,Construction of Highly Transmissible Mam
malian Cloning Vehicles Derived from Murine Retrov
iruses,In;Experimental Manipulation of Gene Expres
sion,M.Inouye（ed）,155−173（1983）;Mann,R.,Mulli
gan R.C.and Baltimore,D.,Construction of a retrovi
rus packaging mutant and its use to produce helper
−free defective retrovirus,Cell,33:153−159（198
3）;Williams,D.A.et al.,Introduction of new geneti
c material into pluripotent haematopoietic stem ce
lls of the mouse,Nature，310:476−480（1984））。 エンカプテシデイシヨン（すなわちレトロウイルス性
RNAを感染性ビリオンに封入すること）に必要な配列が
ウイルスのゲノムから失なわれているときは、結果はゲ
ノム性RNAのエンカプシデイシヨンを妨げるシス欠損で
ある。しかし、得られた突然変異体はまだすべてのビリ
オン蛋白質の合成を指令することができる。ムリガン
（Mulligan）らはこれらの（Psi）配列が除かれたレト
ロウイルス性ゲノム染色体に安定して取り込まれた突然
変異体を含む細胞株を報告している。 ムリガン,R.C.コンストラクシヨン・オブ・ハイリイ
トランスミツシブル・マンマリアン・クローニング・ベ
ーヒクルズ・デリープト・フロム・ミユーリン・レトロ
ウイルスイズ、イン：エクスペリメンタル・マニピユレ
ーシヨン・オブ・ジーン・エクスプレシヨン、M.イノウ
エ（ed）,155−173（1983）：マン、R,ムリガンR.C.お
よびバルチモア,D,コンストラクシヨン・オブ・ア・レ
トロウイルス・パツケージング・ミユータント・エンド
・イツツ・ユース・トウ・プロジユース・ペルパーフリ
ーデフエクテイブ・レトロウイルス、セル、33:153−15
9（1983）；ウイリアムス、D.A.ら、イントロダクシヨ
ン・オブ・ニユー・ジエネテイツク・マテリアル・イン
トウ・プルーリポテント・ヘマトポエテイツク・ステム
・セルズ・オブ・ザ・マウス、ネイチヤー、310:476−4
70（1984）（Mulligan,R.C.,Construction of Highly T
ransmissible Mammalian Cloning Vehicles Derived fr
om Murine Retroviruses,In;Experimental Manipulatio
n of Gene Expression,M.Inouye（ed）,155−173（198
3）;Mann,R.,Mulligan R.C.and Baltimore,D.,Construc
tion of a retrovirus packaging mutant and its use
to produce helper−free defective retrovirus,Cell,
33:153−159（1983）;Williams,D.A.et al.,Introducti
on of new genetic material into pluripotent haemat
opoietic stem cells of the mouse,Nature,310:476−4
80（1984））。 これらの刊行物は本明細書において参考文献として示
される。 ムリガン（Mulligan）らによつて報告されたPsi2細胞
株は、NIH3T3線維芽細胞をpMOV−Psi-（エコトロピツク
マロニーネズミ白血病ウイルス（Mo−MuLV）クローン）
でトランスフエクトすることによつてつくられた。pMOV
−Psi-はウイルス遺伝子産生物のすべてを発現するがウ
イルス性ゲノムのエンカプシデーシヨンに必要な配列
（theまたはPti配列）を欠く。pMOV−Ps-は、マウス
（および密接に関係のあるゲツ歯類）細胞のみに存在す
る受容体を認識するエコトロピツクウイルス性エンベロ
プ糖蛋白質を発現する。 他の細胞株は、Psi−２−様パツケージング細胞株で
あるNIH Psi am株である。これらのPsi−am細胞株はア
ンフオトロピツクウイルス4070Aから得られたエンベロ
プ配列でエコトロピツクエンベロプ糖蛋白質が置き換え
られている変性pMOV−Psiゲノムである。Psi−am細胞株
をつくるのに使用されたレトロウイルスは非常に広い哺
乳類宿主範囲（アンフオトロピツクホスト範囲）を有
し、ヒト細胞を感染させるのに使用できる。組換えゲノ
ムがPsiパツケージングを配列を有する限り、Psi−am細
胞株は組換えレトロウイルス性ゲノムを感染性レトロウ
イルス性粒子にパツケージできる。 レトロウイルス性ゲノムは、新しい遺伝子を細胞に導
入できるベクターとして使用するためにコーン（Cone）
とムリガン（Muligan）によつて修飾されてある。第２
図に示されるように、gag，polおよびenv遺伝子はすべ
て取り除かれ、neo遺伝子をコードするDNA断片がそれら
の場所に挿入されている。neo遺伝子は優性な選択マー
カーとして役立つ。組換えゲノムの一部を残すレトロウ
イルスゲノムはLTRs,tRNS結合部位およびPsiパツケージ
ング部位を含む。コーン、R.およびムリガン,R,ハイ−
エフイシエンシー・ジーントランスフアー・イントウ・
マンマリアン・セルズ：ジエネレーシヨン・オブ・ヘル
パー・フリー・リコンビナイト・レトロウイルス・ウイ
ズ・ブロード・マンマリアン・ホスト・レンジ，プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・U.S.A.81:6349−6353（1984）（Con
e,R.and Mulligan,R.,High−efficiency gene transfer
into mammalian cells:Generation of helper−free r
ecombinant retrovirus with broad mammalian host ra
nge,Proceedings of the National Academy of Science
s，U.S.A.,81:6349−6353（1984））。 I. 優性の選択マーカーのケラチン合成細胞への導入お
よびその挿入の証明 A. neo遺伝子のケラチン合成細胞への導入 組換えゲノムを有する組換えアンフオトロピツクレト
ロウイルスを産生する細胞株を、ケラチン合成細胞とと
もに培養するのに使用した。第２図に示されるように、
組換えゲノムは２つのLTRおよび、gsg，polおよびenv配
列の代りにneo遺伝子からなる。Psi am細胞株は本来標
準的技術を使用して修飾できる3T3細胞株から得られて
組換えレトロウイルス性ゲノムを含むものであり、この
細胞株は寄託No.CRL8859としてアメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（ロツクビル、メリーランド
州）に寄託されている。 neo遺伝子は、細菌におけるネオマイシン耐性および
哺乳類細胞における抗生物質G418に対する耐性をコード
するトランスポゾンTn5から得られた細菌の遺伝子であ
る。このneo遺伝子は優性の選択マーカーとして役立
ち；哺乳類の細胞においてそれが存在すると該細胞がG4
18の存在下に生育するであろう細胞に転換する。（該遺
伝子がなければ、該細胞はG418の存在下に死滅する。）
結果として、哺乳類細胞におけるこの遺伝子の存在はG4
18を含む、培地において生育される細胞における該遺伝
子の存在についての選択によつて決定できる。この組換
えゲノムを有する組換えレトロウイルスがneoウイルス
と称される。 本発明の１つの具体例において、ケラチン合成細胞と
の共培養（cocultivation）に際して供給細胞層として
使用される線維芽細胞は比較的高い力価（たとえばml当
り104〜105neo単位）でneoウイルスを産生するPsi−am
細胞株である。該neo遺伝子はこのレトロウイルス性ベ
クターによつてケラチン合成細胞に導入され、該ベクタ
ーがケラチン合成細胞に存在することが証明される。 この具体例において、neo遺伝子は第３図に示された
方法によつてケラチン合成細胞に導入された。この方法
は実施例１に詳細に記載されている。neoウイルスを産
生するPsi am細胞株はマイトマイシンＣ（DNAを交叉結
合し細胞を分裂不可能にする抗生物質）で処理した。し
かし、これらの細胞は感染性ウイルスを産生できる。ケ
ラチン合成細胞の懸濁液を処理されたPsi am細胞を含む
皿の上に塗つた。これは感染性ウイルスを産生する供給
細胞層として役立つ。 ケラチン合成細胞コロニーが形成し、全面生長した。
その時点で、細胞が分離され、マイトマイシンＣで処理
されている別の供給細胞層の上に塗られた。Psi am細胞
株と同様、この供給細胞層はG418に対して耐性である
（neo遺伝子を含む操作をされているので）。一方Psi a
m細胞株と似ていない点は、該供給細胞層が感染性ウイ
ルスを産生しないことである。その結果、該ケラチン合
成細胞は選択工程における供給細胞層として役立つ。こ
れをG418供給細胞層と称する。 この分離したケラチン合成細胞をこのG418耐性供給細
胞層上に塗付し、G418を培養物に添加した。インキユベ
ーシヨン後、生育した細胞はG418に耐性であつて、対照
細胞（非感染細胞）から生育したコロニーは存在しなか
った。生きている正常ケラチン合成細胞コロニーである
と見られたG418耐性細胞は、neo遺伝子が導入されレト
ロウイルス性ベクターによつてこれらの細胞の中で発現
したことを示している。 B. ケラチン合成細胞へのneo遺伝子の導入とneo遺伝子
を有するケラチン合成細胞の特性の確認 組換えレトロウイルス（neoウイルス）の使用によつ
て、受容体ケラチン合成細胞の機能上の特性を変えるこ
となしにケラチン合成細胞の中に新しい遺伝物質を導入
することが可能である。neo遺伝子がケラチン合成細胞
に導入されており、かつ受容体細胞が実際に生きている
ケラチン合成細胞であつたということが確認された。使
用された方法はより詳細に実施例２に記載されている。 これらのG418耐性ケラチン合成細胞がneo遺伝子を含
んでいることを示すために、G418耐性ケラチン合成細胞
から抽出された断片化されたDNAについて分析した。供
給細胞から抽出されたDNAとケラチン合成細胞から抽出
されたDNAの分子量の相違にもとづいて、ケラチン合成
細胞におけるneo遺伝子を検出することが可能であり、n
eo遺伝子は非感染細胞では証明されなかつた。ケラチン
合成細胞におけるneo遺伝子は正常野性型のものであ
る。これらはいくつかの方法で示された。たとえば、感
染および非感染細胞から抽出された総細胞蛋白質は電気
泳動で分画され可視化された。感染細胞の蛋白質像はケ
ラチン合成細胞の蛋白質像とは非常に異なる。ケラチン
合成細胞には４つの主たるケラチン蛋白質（58、56、50
および46Kdの大きさ）があり、これらの質量共に正常レ
ベルで、非感染及び感染ケラチン合成細胞に存在した。
ウエスターン（Uestern）ブロツテイングによつて分析
したところインボルクリンの存在を示した。インボルク
リンは、ケラチン合成細胞における末端分化が特殊な交
叉結合したエンベロープの前駆蛋白質であつてケラチン
合成細胞の特異的末端分化マーカーである。上記G418耐
性ケラチン合成細胞は電子顕微鏡で正常ケラチン合成細
胞の外観を呈することも示された。すなわち、G418耐性
ケラチン合成細胞コロニーは５または６細胞層の厚さで
あり、ケラチン線維、トノフイラメント、および多数の
デスモソーム（これらすべては正常ケラチン合成細胞コ
ロニーの特徴である）を含んでいた。 G418−耐性ケラチン合成細胞も全面生長され無傷の上
皮としてはがされ、無胸腺すなわちヌードマウスに移植
された。この方法により表皮の分化し続ける能力が分か
るが、その過程は組織培養で部分的に証明されているに
すぎない。これは実施例３により詳しく記載される下記
方法で行なわれる。G418耐性ケラチン合成細胞がG418供
給細胞層を使用して生育され、コロニーがくつついて合
体するまで生育し続けた。表皮細胞のシートは皿からと
りはずされ、その時点で培養容器の大きさの約半分に縮
んだ。この上皮を適当な受容体（この場合は無胸腺すな
わちヌードマウス）に移植した。無胸腺すなわちヌード
マウスは胸腺がないので、移植された組織を拒絶するこ
とができない。 移植物が働いているかどうか決定するために、移植後
２週間してこの表皮の薄い切片をつくり、インボルクリ
ンの存在を測定した。これは、たとえば、上述の如くケ
ラチン合成細胞の特異的末端分化マーカーであるインボ
ルクリンに対する抗体を使用する免疫検定によつてつく
られた。その結果、新しい遺伝子物質が上述のレトロウ
イルス性ベクターによつてケラチン合成細胞に導入され
た。さらに、この情報はケラチン合成細胞によつて発現
できたことが示された。すなわち、G418に耐性のケラチ
ン合成細胞の選択はneo遺伝子の発現を示した。 II. 優性の選択マーカーおよび外来遺伝物質のケラチ
ン合成細胞への導入および外来遺伝物質の発現の評価 neo遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターも
クローニング部位を有している。これにより外来遺伝子
物質をベクターに導入し組換えレトロウイルスと共に培
養されたケラチン合成細胞によつて発現させることがで
きる。Bam H1 クローニング部位において外来遺伝物質
を挿入することが可能である。外来遺伝物質は上皮細胞
で生じないDNAまたはRNA;上皮細胞で生じるが生物学的
に有効なレベルで（すなわち、該DNAまたはRNAがコード
しているポリペプチドの正常な生理学的作用を生ぜしめ
るに充分なレベル）で発現されないDNAまたはRNA;上皮
細胞で生じ、上皮細胞中で発現されるように修飾されて
いるDNAまたはRNA;および上皮細胞中で発現できるよう
に修飾できるDNAまたはRNA、の単独あるいはそれらの組
合せであり得る。 たとえば、レトロウイルスベクターのこの部位にヒト
成長ホルモン（HGH）をコードする遺伝子のコピーをク
ローンすることができる。HGHは通常視床下部によつて
のみ分泌される約29,000ダルトンのポリペプチドであ
る。HGH遺伝子はケラチン合成細胞に存在するけれど
も、生物学的に有意なレベルでこれらの細胞において発
現されない。HGHのようなポリペプチドホルモン、ある
いは通常そのような細胞によつて生物学的に有意のレベ
ルで製造されない他の物質は個人に移植でき、ホルモン
あるいは他の物質についての連続的供給システムとして
役立つ。 この方法はヒト成長ホルモンについて記載されている
が、いかなる遺伝子もケラチン合成細胞中に導入でき、
該細胞による発現は同様にして測定された。この方法は
実施例３に詳細に記載されている。目的とする遺伝子
（ここではヒト成長ホルモン遺伝子）を有する組換えレ
トロウイルスを産生するPsi am株が構成できる。ヒト成
長ホルモンのcDNAをコードする修飾されたDNA断片を組
換えレトロウイルスゲノム（具体例として、ここではne
o遺伝子）を有するプラスミドDNAのBam H1部位に連結さ
れる。このプラスミドを単離してPsi am細胞にトラスフ
エクトする。第４図に示されたHGH−neo組換えウイヴス
構成物を産生するPsi am細胞はG418耐性コロニーとして
単離される。 HGH−neo組換えウイルス構成物を産生するPsi am細胞
は分離したケラチン合成細胞と共に培養するのに供給細
胞層として使用される。HGH−neo組換えウイルス構成物
を産生するPsi am細胞と共に培養後、ケラチン合成細胞
を全面生長させ；各ケラチン合成細胞に分離し；上述の
如くG418耐性細胞株と共に培養する。 外来遺伝物質を有する組換えゲノムを有する組換えレ
トロウイルスと共に培養されたケラチン合成細胞の外来
遺伝子発現能力をいくつかの技術によつて測定できる。
これらの技術は実施例３においてより詳しく記載されて
いる。 結果として、ケラチン合成細胞が通常ケラチン合成細
胞によつて生物学的に有意のレベルで分泌されないポリ
ペプチドホルモンを分泌でき、さらに該ケラチン合成細
胞は生理学的濃度に近い濃度でこのホルモンを分泌でき
ることが示された。ヒト成長ホルモンを分泌している上
皮をたとえば無胸腺マウスに移植して全身的作用が生じ
れに充分量を分泌できるか否かを示すのに使用できる。
新しい遺伝物質（たとえば、neo遺伝子および目的とす
るポリペプチドをコードする選択された遺伝子）が発現
されるケラチン合成細胞を有する表皮のこの移植方法は
第５図に概略してある。 受容体に移植するに適した、ケラチン合成細胞が新し
い遺伝物質を有する上皮をつくることができる。受容体
は上皮細胞源であり得、適合する供給者からの移植片を
受けることができた。第５図におけるように、表皮の切
片を個々のケラチン合成細胞に離解し、これをneo遺伝
子と目的とする遺伝子の両方を産生するPsi am株ととも
に培養する。G418耐性ケラチン合成細胞が選択され、全
面生長させ、上皮として脱離される。脱離された上皮は
続いて受容体に移植される。 現在では、遺伝子障害によつて小人である子供は毎日
注射して投与されるヒト成長ホルモンによつて処理され
る。これらの患者はヒト成長ホルモンを分泌するケラチ
ン合成細胞を有する皮ふ移植片によつて治療できた。 III. neo遺伝子およびHGH以外のポリペプチド類をコー
ド化している外来遺伝物質の導入 HGH以外のポリペプチド類をコードしている遺伝子も
また、レトロウイルスのベクターによつてケラチン合成
細胞に導入されることができる。例えば、上皮小体ホル
モン（PTH）およびインシユリンをコード化している遺
伝子はneo遺伝子といつしよにケラチン合成細胞に導入
された。上皮小体ホルモンは、体内のカルシウムの調節
に関係するポリペプチドである。インシユリンは、血流
中のグルコース水準を調節するポリペプチドである。HG
Hと違つて、これらのポリペプチドホルモンは各々、そ
れが活性になる前にこのポリペプチドの処理を必要とす
る。例えば、上皮小体ホルモンは、蛋白質のアミノ末端
にプレ配列（presequence）およびプロ配列（prosequen
ce）を有する。インシユリンは、ジスルフイド結合によ
つて連接している。ａおよびｂ鎖からできているペプチ
ドである。しかしながらインシユリンの前駆体は、もう
一つのペプチド、ｃペプチド、を含有している。処理中
にこのｃペプチドは活性インシュリン分子を得るために
開裂されねばならない。今日までのところ、この開裂は
膵臓細胞中で、そしておそらくはニユーロン細胞によつ
て、行なわれることが示されて来た。 IV. ポリペプチド類をコードしている遺伝物質の導入
における他の優性の選択マーカーの使用 ケラチン合成細胞内に新しい遺伝物質を導入するため
にneo遺伝子以外の優性の選択マーカーを使用すること
も可能である。例えば、His D遺伝子はこのために使用
することができる。His D遺伝子はサルモネラ属（Salmo
nella）からの細菌性遺伝子であつて、ヒスチジノール
脱水素酵素、すなわち、ヒスチジノールをヒスチジンに
変えるポリペプチド、である。ヒスチジンは必須アミノ
酸であり；ヒスチジノールはヒスチジンのアルコール類
以体であつて、適当な代謝条件下でヒスチジンに変換さ
れることができる。もし細胞が、ヒスチジノールを含有
するがヒスチジンを欠く培地中で生長させられるなら
ば、His D遺伝子を有する細胞は、ヒスチジノールをヒ
スチジンに変換することができる。ヒンスチジンはそれ
らの機能に必須のものであるので、His D遺伝子を有す
る（そしてこのようにヒンスチジンを作ることができ
る）細胞は残存し、この遺伝子を欠くものは残存しない
であろう。 His D遺伝子を有するレトロウイルスベクターは、ケ
ラチン合成細胞を感染させるために使用された。His D
遺伝子を含有するケラチン合成細胞は、これらの細胞
を、ヒスチジンを欠くがヒスチジノールを含有する培地
中で生長させることにより選択された。予定通り、His
D遺伝子を有するケラチン合成細胞はコロニーを形成し
て全面生長したが、この遺伝子を欠くものはこのように
ならなかつた。事実上、このような細胞は、neo遺伝子
が含まれているものよりもはるかに高い頻度で生じた。 この仕事の結果として、新しい遺伝子物質をケラチン
合成細胞内に導入するために独立した優性の選択マーカ
ー（例えばneo遺伝子およびHis D遺伝子）を使用するこ
とも可能である。２つの異なるサブユニツト（subuni
t）を有するポリペプチドの場合には、例えば、別々の
優性の選択マーカーを、この２つのサブユニツトをコー
ド化している遺伝子情報を導入するために使用すること
ができた。さらに、２またはそれ以上の優性の選択マー
カーは、活性になるために特定的に開裂されあるいは処
理されることを必要とするポリペプチド（例えばインシ
ユリンおよび上皮小体ホルモン）の場合に使用されるこ
とができた。必要な処理酵素をコードしている遺伝子
は、このような処理を必要とするポリペプチドホルモン
をコードしている遺伝子とともに導入されることができ
た。これによつてケラチン合成細胞はそのポリペプチド
ホルモンを処理することができたのであろう。 V. 外来遺伝物質を有するケラチン合成細胞の使用 ケラチン合成細胞および他の上皮細胞を遺伝学的に操
作しあるいは変更するためにレトロウイルス以外のビヒ
クル（vehicle）を用いることも可能である。新しい遺
伝子情報は、そのような細胞中の新しい遺伝物質を発現
することができるあらゆるウイルスによつてケラチン合
成細胞内に導入することができた。例えば、SV40、ヘル
ペスウイルス属、アデノウイルスおよびヒト乳頭腫ウイ
ルスをこの目的に使用することができた。疣をひき起こ
すヒト乳頭腫受ウイルスは、少なくとも３つの理由のた
め特に有用であろう。第一に、このウイルスは、自然に
ケラチン合成細胞に感染する。第二に、その染色体は円
形であり、形質転換された細胞中で、それは円形のまま
であり、染色体外で再現する（例えば、レトロウイルス
DNAがするように、そのDNAは形質転換された細胞の染色
体DNA中に挿入されない）。第三に、このウイルスDNAの
多数のコピー（例えば50ないし200）が、形質転換細胞
１つについて作られる。そのため形質転換された細胞が
新しい遺伝子物質（例えばホルモン、酵素、など）によ
つてコード化されたペプチドを多量に生成することがで
きるので、これは特に有用である。 本発明は、血流中に産生物（例えば凝固因子、免疫調
節因子、およびポリペプチドホルモン）を分泌すること
ができる上皮を形成することができるケラチン合成細胞
を遺伝学的に操作することを可能にする。こうして形成
された上皮は、必要な物質の定期的な投与（経口摂取、
注射など）を要する現在の養生法に取つてかわるべき連
続的な薬物放出系として役立つことができる。例えば、
それはインシユリンの連続的な放出を行なうために使用
することができたが、このインシユリンは、現在は、膵
臓から単離され、広く精製されたのちインシユリンの産
生または利用が損なわれている人々によつて体内に注射
されねばならない。このようにして、インシユリンは連
続薬物放出系を通じて体内に導入されることができ、イ
ンシユリンを毎日注射する必要がなくなるであろう。遺
伝学的に操作された表皮もまた凝固因子の産生のために
使用することができる。血友病患者は凝固に関係する第
VIII因子と呼ばれる蛋白質を欠いている。第VIII因子
は、今は注射によつて投与され；第VIII因子をコード化
している遺伝子を有するケラチン合成細胞は、上皮を作
り、第VIII因子を産生するために使用することができ；
植皮片として、組織は血流中にこの因子を分泌するであ
ろう。 遺伝学的に操作されたケラチン合成細胞を有する表皮
に対するもう一つの適用は、産児調節におけるものであ
る。受精率を調節する際に黄体形成ホルモン放出ホルモ
ン（LHRH）と呼ばれるポリペプチドホルモンを用いるこ
とについて、今試験が進行中である。LHRHの連続的投与
は結果として不妊症の個体を生じ；投与を止めたとき、
その個体は再び妊娠・出産可能となる。LHRH注射または
経口投薬をうけるよりもむしろ、同じ効果を与えるため
に連続的にLHRHを分泌する小移植片をもつことができ
た。その人が妊娠・出産可能性を再び得ることを望む場
合には、この移植片を切除することができ、ポリペプチ
ドホルモンの放出は終わるであろう。 新しい遺伝物質を有するケラチン合成細胞のもう一つ
の適用は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の治療におけ
るものである。免疫系を刺激するインターロイキン（In
terleukin）２およびインターロイキン３は、AIDSの治
療に有用である可能性があり、これらの２つのポリペプ
チド（これらは今は定期的な注射により投与されてい
る）を産生するように遺伝学的に操作されたケラチン合
成細胞を有する植皮片により放出されることができた。 遺伝学的に操作されたケラチン合成細胞のもう一つの
用途は、個体における毛髪発育パターンを変えるかまた
は移植のために培養で毛髪を発育させることである。毛
髪形成は遺伝学的に制御され、毛髪は表皮の付属物であ
るので、ケラチン合成細胞は毛髪発育を変えるのに可能
性のある用途を有する。 もう一つの用途は皮膚の一般的な性質を改良すること
である。皮膚はいくつかの重要な性質を有している。こ
れは、外面への障害を与え、非常に弾力性の構造を有
し、弾力があり、非常に優れた保護特性を有する。この
発明の組換え型のレトロウイルスベクターは、皮膚内
に、その硬度（consistency）を改良し、あるいは皮膚
の基本機能を改良するであろう遺伝子を導入するために
使用できた。例として、足の裏および踵および手のひら
上に見られる表皮は、体の他の領域に見られる表皮より
もはるかに厚い。その上、その表皮は独特の分子量のケ
ラチン蛋白を含有している。一度この遺伝子をクローン
化すると、それは、より強靭な皮膚が望ましい領域に置
かれた皮膚移植片中に導入できる。例えば、これは、褥
瘡が重大な問題である固定された患者の場合に有用とな
るであろう。植皮片は、褥瘡が起こる領域（例えば背中
の臀部、脚）に生じる皮膚よりもはるかに強靭で弾力の
あるように操作されることができ；その適用はその患者
に保護を与えることができた。皮膚の特性を変えること
を必要とするもう一つの可能な用途は、重い熱傷を負つ
た被害者の治療におけるものである。この場合には、感
染などを予防するために皮膚が非常に急速に生長する必
要がある。このベクター系を用いると、重い熱傷を負つ
た人にははるかに適するであろう皮膚または表皮を操作
することが可能である。 本発明のもう一つの用途は、酵素障害疾患の治療にお
けるものである。この場合は、ケラチン合成細胞内に導
入された遺伝子によりコードされたっ産生物（ポリペプ
チド）は（ホルモンのようには）分泌されなくて、細胞
内部に残留する酵素である。患者が特定の酵素を欠き、
種々のアミノ酸またはその他の代謝産物を代謝すること
ができない遺伝的疾患の場合が数多くある。これらの酵
素にとつての正しい遺伝子は皮膚移植片内に導入するこ
とができ；次にこの移植片はその代謝機能を実行するで
あろう。例えば、影響を受けている人々が酵素アデノシ
ンデアミナーゼを欠く遺伝子的疾患がある。この酵素は
プリン類の尿酸への崩壊に関係する。本発明を用いれ
ば、血液がその移植片が適用されている領域を通りぬけ
るとき血液を解毒するのに十分な高水準で、欠けている
酵素を産生することのできる皮膚移植片を生成すること
が可能であろう。 本発明に従つて導入された外来遺伝物質を有する上皮
細胞または、経皮的な薬剤放出系として使用されること
もできる。このような系においては、薬剤は表皮の表面
に適用されて、表皮を通つて血流中に拡散する。経皮的
に投与される薬剤の例は、乗物酔いの防止のために現在
使用されている。しかしながら、経皮的薬剤放出に対す
る重要な制限は、その薬剤が表皮の外側の層に対して透
過性でなくてはならないことであり；それはこれらの層
を透過することができ、有効であるために脂溶性でなく
てはならない。 しかしながら、この制限は本発明に従つて変更された
ケラチン合成細胞を有する表皮を用いて、排除されるこ
とができる。例えば、（その活性形において）脂溶性で
ない薬剤の場合には、その薬剤は、表皮を通過すること
のできる脂溶性−しかし不活性−の形で製造されること
ができた。その後、これは、脂溶性／不活性の薬剤を水
溶性／活性の形に変換することができるように遺伝学的
に操作したケラチン合成細胞を有する植皮片に適用され
ることができる。次にこの薬剤は血流中に通過して、所
望の効果を生ずる。 本発明はまた、獣医学的用途をも有する。これは、例
えば、動物に薬剤（例えば抗生物質）およびホルモンの
ような物質を与える際に使用されることができるが、こ
れは、もしそうでなければその飼料に混合するか、水に
加えるかまたは定期的に（例えば毎日またはそれより少
ない頻度で）注射することによつて与えられたであろ
う。本発明の変更された上皮細胞の使用は、この変更さ
れた上皮細胞で形成された組織が、動物に適用されるこ
とができ、進行している条件に基づいて多量のコード化
された蛋白質を供給し、こうしてこの物質の毎日の／定
期的投与に対する必要を除去するであろうという利点を
有する。 この発明は下記の実施例によつて具体的に説明される
であろう。 実 施 例 実施例 1. ケラチン合成細胞内へのneo遺伝子の導
入 neo遺伝子を第３図に説明された方法に従つて、ケラ
チン合成細胞内に導入した。neoウイルスを産生するPsi
am株は血清なしのダルベツコの改質されたイーグルの
倍地（Dnlbecco′s Modified Eagles Media）（DME）中
で、約37゜で約２時間、１ミルあたり５マイクロクラム
のマイトマイシＣで処理した。マイトマイシンＣは、DN
Aに架橋結合し、その結果細胞を分割できなくする抗生
物質である。しかしながら、これらの細胞はまだ、伝染
性のウイルスを産生することができる。Psi am細胞を、
10センチメートルの皿上でマイトマイシンＣで処理し
て、DMEで数回洗浄した。ケラチン合成細胞の懸濁液を
この皿上にかぶせた。結果として、使用された供給細胞
層は、感染性ウイルスを産生するものであつた。 ケラチン合成細胞コロニーは数日後形成され、全面生
長した。その時点で、細胞をトリプシン処理し（酵素ト
リプシンで処理し）て、これらを単一細胞に分離し、こ
れもマイトマイシンで処理された異なる供給細胞層上に
かぶせた。Psi am株のように、この供給細胞層はG418耐
性である（なぜならそれはneo遺伝子を含有するように
操作されたからである）。Psi am株と違つて、これは感
染ウイルスを産生しない。結果として、これは選択工程
中に供給細胞層として役立つことができる。これはG418
供給細胞層と呼ばれる。 分離させたケラチン合成細胞をこのG418耐性供給細胞
層上にかぶせ、G418を培地中の最終濃度１ミルあたり0.
5ないし1mgsで加えた。約２週間培養した後に、生長し
ている細胞はG418に対して耐性であつて；対照細胞（未
感染細胞）から生長しているコロニーはなかつた。この
G418耐性細胞は生育可能な正常なケラチン合成細胞コロ
ニーであるように見え、neo遺伝子はレトロウイルスベ
クターを通じてこれらの細胞内に導入され発現されたこ
とを示した。 実施例 2. neo遺伝子のケラチン合成細胞内への導
入の立証およびneo遺伝子を有するケラチンの合成細胞
の特性決定 組換えレトロウイルス（neoウイルス）の使用によつ
て、受容体のケラチン合成細胞の機能特性を変えること
なく新しい遺伝子物質をケラチン合成細胞内に導入する
ことは、可能である。 neo遺伝子がケラチン合成細胞内に導入されたこと、
および受容細胞が事実上生育可能なケラチン合成細胞で
あつたことが立証された。 これらのG418耐性ケラチン合成細胞がneo遺伝子を含
有することを証明するために、G418−耐性ケラチン合成
細胞から抽出されたDNAに関して、サウザーン（Souther
n）ブロツト分析を行なつた。マニアチス・テイー（Man
iatis,T.）外、イン：モレキユラー・クローニング：ア
・ラボラトリイ・マニユアル（In:Molecular Cloning:A
Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー、
ニユーヨーク（1982）、DNAは制限酵素により切断さ
れ、サウザーン（Southern）ブロツトハイブリダイゼー
シヨン分析が行なわれた。供給細胞から抽出されたDNA
とケラチン合成細胞から抽出されたDNAとの分子量の差
を基にして、ケラチン合成細胞中のneo遺伝子を検出す
ることは可能であり；neo遺伝子は未感染細胞において
は明らかではなかつた。ケラチン合成細胞中のneo遺伝
子は、供給細胞層に存在するneo遺伝子とは大きさが異
なつていた。 neo遺伝子を含有するケラチン合成細胞が正常な野性
型のものであることも示された。このことはいくつかの
方法で証明された。例えば全細胞蛋白を感染および未感
染細胞から抽出し;SDSポリアクリルアミド電気泳動によ
つて分別し；クマシーブルー染料により染色することに
より視覚化した。この感染細胞の蛋白プロフイールは、
ケラチン合成細胞のきわめて特徴的なものであつた。ケ
ラチン合成細胞中にはつの主なケラチン蛋白があり（大
きさで58、56、50および46Kd）、これらはこの未感染お
よび感染ケラチン合成細胞において質的にも量的にも正
常な水準であつた。 インボルクリンの存在も決定された。インボルクリン
は、ケラチン合成細胞における末端分化の特徴である、
架橋結合したエンブロープをもつ前駆体蛋白である。そ
のためこれはケラチン合成細胞の特徴的な末端分化マー
カーである。ウエスターン（Western）ブロツテイング
法は、インボルクリンの存在を証明した。トウビン・エ
イチ（Towbin,H）外、プロシーデイングス・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ，ユー
・エス・エイ（Proceedings of the National Academy
of Sciences,U.S.A.）、76:4350−4354（1979）。G418
耐性ケラチン合成細胞はまた、正常ケラチン合成細胞の
外観をもつことが電子鏡検法によつて示された。このEM
写真はG418耐性ケラチン合成細胞コロニーが５または６
細胞層の厚さであることを示す。これらはまた、ケラチ
ンフイラメント、トノフイラメント、および多数のデス
モソーム−−すべて正常ケラチン合成細胞コロニーの品
質証明である−−の存在を明らかにする。 G418−耐性ケラチン合成細胞はまた、全面生長させら
れ、無傷の上皮として分離され、無胸腺すなわちヌード
マウス上に移植された。この方法は、過程は組織培養に
おいて部分的にのみ明らかであるが、表皮が分化し続け
る能力を証明する。これは、次のやり方で実施された。
G418耐性ケラチン合成細胞を、G418供給細胞層を用い
て、隣接するコロニーが融合して皿がケラチン合成細胞
で覆われるまでペトリ皿上で生長させた。デイスパーズ
（Dispase）と呼ばれる酵素を用いて、グリーン（Gree
n）およびケヒンデ（Kehinde）により記載された方法を
使つて表皮細胞のシートを皿から持ち上げてはがした。
グリーン，エイチ（Green,H.）およびケヒンデ，オー
（Kehinde,O.）、米国特許第4,304,866号；グリーン，
エイチ（Green,H.）外、グロウス・オブ・カルチヤード
・エヒダーマル・セルズ・イントウ・マルチプル・エピ
テリア・シユータブル・フオー・グラフテイング（Grow
th of cultured epidermal cells into multiple epith
elia suitable for grafting）、プロシーデイングス・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ，ユー・エス・エイ（Proceedings of the Nationa
l Academy of Sciences,U.S.A.）、76:5665−5668（197
9）。この時点で、シートは皿の約半分の大きさに収納
した。上皮をワセリンガーゼ上に置き、無胸腺症または
裸のマウスに移植した。この無胸腺すなわちヌードマウ
スは胸腺を欠くので、これは移植された組織を拒絶する
ことができない。 移植片が働いたかどうかを決定するために、それが移
植されて約２週間後に、この表皮の薄切片を作製した。
ヒトの表皮の蛋白質の特徴であり、先に述べたようにケ
ラチン合成細胞の特徴的な末端分化マーカーである、イ
ンボルクリンに対する抗体を用いて、移植されたヒトの
表皮の存在を検出した。結果として、新しい遺伝子物質
は、上述したレトロウイルスベクターによつてケラチン
合成細胞内に導入されたことが証明された。さらに、こ
の情報はこのケラチン合成細胞によつて発現されること
ができたことが示された；すなわち、G418に耐性のケラ
チン合成細胞に対する選択がneo遺伝子の発現を示し
た。 実施例 3. ケラチン合成細胞へのneo遺伝子および外来性遺伝子の
導入 A. neo遺伝子およびヒト成長ホルモン（HGH）をコード
する遺伝子の導入 neo遺伝子を有する組み換えレトロウイルスベクター
はクローニング末端をも有する。このことは、ベクター
に外来性遺伝子（foreign genetic material）を導入し
たり、組み換えウイルスと共培養されたケラチン合成細
胞によつて発現することを可能ならしめる。Bam H1クロ
ーニング末端に外来性遺伝子を導入できる。例えば、レ
トロウイルスベクターのこの末端に、ヒト成長ホルモン
（HGH）をコードする遺伝子の複製をクローンすること
が可能である。HGHは、通常視床下部のみで分泌される
約29,000ダルトンのポリペプチドホルモンである。ケラ
チン合成細胞の、（HGHのような）ポリペプチドホルモ
ンあるいは通常はそのような細胞では産生されることの
ない他の物質の産生能力は、個々に移植することがで
き、ホルモンや他の物質を連続的に供給する機構として
機能することができる。 この過程は、ヒト成長ホルモンに関して記載されてい
るが、他の遺伝子もケラチン合成細胞に導入でき、細胞
による発現は同様の方法で評価しうることは理解され
る。特定の遺伝子−−ここでは、ヒト成長ホルモン遺伝
子−−をもつ組み換えレトロウイルスを生産するPsi am
株（Psi am line）は、次のような方法で作成された。
（neo遺伝子をもつ）組み換えレトロウイルスゲノムを
もつプラスミドDNAをBam H1で切断した。ヒト成長ホル
モンのcDNAをコードする修飾DNAをこの末端に結合し
た。HGH遺伝子の適当な配向をもつプラスミドを分離
し、グラハム（Graham,R）およびバンダー（Vander Eb,
A.）らのVirology,52巻,456〜467頁（1973年）に記載の
リン酸Ca++法によつてPsi am細胞にトランスフエクシヨ
ンした。HGH−neo組み換えウイルスを生産するPsi am細
胞は、第４図に示すように、G418耐性コロニーとして分
離した。 HGH−neo組み換えウイルスを生産するPsi am細胞は、
分解されたケラチン合成細胞との共培養において供給細
胞として用いられる。neo遺伝子のみの導入として予め
記載されているのと同様の方法で、ケラチン合成細胞へ
のHGH−neo構造の導入を行なつた。HGH−neo組み換えウ
イルスを生産するPsi amと共培養した後、ケラチン合成
細胞を全面生長させ、各ケラチン合成細胞に離解し、先
に述べたG418耐性を有する細胞株由来のNIH 3T3と共培
養した。 B. ケラチン合成細胞によるヒト成長ホルモン遺伝子の
発現の評価 ケラチン合成細胞は、外来性遺伝子（ここでは、ヒト
成長ホルモン遺伝子）を発現させる能力で評価した。 35Sメチオニンで標識した代謝性のケラチン合成細胞
を用いる免疫沈殿法が、培養されたケラチン合成細胞中
のHGH存在の検出に用いられた。ヒト成長ホルモンの場
合には、HGHは培地に分泌されるので、上清をアツセイ
した。HGHに対する特異抗体を培地に加え、HGHとの複合
体を形成させた。抗体HGH複合体は、それらを沈殿する
ことが知られているスタフイロコツカスアウレウスバク
テリア菌（Ssaaphylococus aureus bacteria bugo）を
用いて沈殿させた。複合体を２成分の分離するために処
理した（例えば、洗浄およびSDS緩衝液中で煮沸）。SDS
ポリアクリロアミドゲルで分画した後、乾燥し、放射活
性タンパク質をオートラジオグラフイーで可視化した。
特異的な大きさのマーカーで、倍地中に分泌されたHGH
の存在を検出することができた。すなわち、既知の分子
量をもつ標準タンパク質を用い、ゲル中の移動距離に対
して、分子量をとつた標準曲線を描き、ケラチン合成細
胞が分泌したタンパク質の分子量を求めることができ
た。高純度の125I標識HGHは、非常に優れたマーカーと
して用いられた。従つて、この結果は、HGHの同定にお
いて、非常に決定的である。HGHの分泌は、HGH−neo組
み換えウイルスをもつケラチン合成細胞に特異的にみら
れ、非感染ケラチン合成細胞やneoウイルス単独感染ケ
ラチン合成細胞では、HGHは分泌されなかつた。HGH−ne
o組み換えウイルスを有するケラチン合成細胞は、アメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Amerikan
Type Culture Collection）（Rockville,MD）に寄託番
号CRL8858として寄託されている。 ホルモンの精確な量の測定法として大変優れているラ
ジオイムノアツセイを用いて、30〜50ng HGH/ml培地以
上であると、測定することができた。このことは、HGH
が、生理的な濃度とほぼ等しいレベルでケラチン合成細
胞によつて分泌されていることを示している。（ヒト血
清は通常１〜5ng/mlのHGHを含む）。 このように、普通はケラチン合成細胞によつて分泌さ
れないポリペプチドホルモンをケラチン合成細胞が分泌
することができ、更に言えば、生理学的な濃度に近い濃
度でこのホルモンを分泌することができることを示唆し
ている。 実施例 4. 外来性遺伝子の導入および生理学的に意味のあるレベル
でコードされた物質を産生するのに必要な断片の大きさ
の決定 A. neo遺伝子および副甲状腺ホルモン（PTH）をコード
する遺伝子の導入 副甲状腺ホルモン（PTH）をコードする遺伝子の複製
を含む組み換えレトロウイルスは、実施例３で記載した
方法により生産した。所望の構造を実施例３に記載した
方法によつてヒトケラチン合成細胞に導入した。G418耐
性ケラチン合成細胞を選択し、そのような細胞群をま
き、全面生長させた。 G418耐性ケラチン合成細胞の全面生長培養物（Conflu
ent cultures）を下記の方法で合成、PTH分泌のアツセ
イを行なつた。修飾されたケラチン合成細胞を全面生長
させた75cm2フラスコを分泌されたPTHの量を測定するの
に用いた。始めに、培地を移し、新鮮な培地20mlを加え
た。４時間間隔で、培地のアリコート（aliquot）を採
り、凍結した。これらのアリコート中のPTHの量をPTHに
特異的なラジオイムノアツセイを用いて測定した。アツ
セイの結果は次の通りである。 時間 PTH/20ml （時間） （μｇ） 4 2.2 8 4.0 12 6.0 16 7.0 20 7.4 24 10.0 B. PTH分泌速度の計算および効果的なPTH産生に必要な
断片の大きさの決定 ケラチン合成細胞によるPTH分泌速度は、時間に対し
て分泌されたPTH量をプロットしたときの傾き（第６
図）から計算される。この情報をPTHを分泌する上皮の
表面積に関する情報と共に用いれば、上皮単位面積（cm
2）あたりのPTH産生速度を計算することができる。この
方法によればPTH産生速度は1.4mg/4分/cm2であつた。次
のようにして求めた。第６図に示した曲線の傾きから読
みとると、分泌速度は425ng/mlである。ジスペース（di
space）でフラスコからはずすと、上皮は約1/4の大きさ
に縮むので、75cm2フラスコ中の上皮は、20cm2に等し
い。従つて、単位表面積あたりの速度は、 425ng/時/20cm2 7ng/分/20cm2 0.35ng/分/cm2 1.4ng/4分/cm2 となる。 この情報から、生理学的に重要なレベルでPTHを産生
するのに必要な断片の大きさが決定される。例えば、PT
Hは血漿中に１〜5pg/mlの濃度で存在し、体重70kgの人
間は2730mlの血漿を有するので、総PTH量は13.6ngであ
る。血漿中のPTHの半減期は約４分である。４分毎に13.
6ngのPTH（体重70kgの人間の必要量に見合う量以上であ
る）を供給するには、断片の大きさは9.7cm2必要とされ
る。この大きさの断片は、生理学的に意味のあるレベル
でPTHを供給するばかりでなく、美容的にも患者（使用
者）に許容され、都合のよい断片でもある。更に、この
大きさの断片を生産するのに必要なケラチン合成細胞の
遺伝子的修飾は合理的で容易なことである。 産業上の利用 本発明は、必要に応じ、ホルモン、酵素および人を含
む哺乳動物用医薬品の供給に工業的に応用することがで
きる。例えば、注射あるいは経口投与によつて定期的に
主薬を投与するのに代え、ホルモンを連続的に供給する
のに用いることができる。特にヒト成長ホルモンなど一
定期間継続的に必要な物質を供給する場合に有効であ
る。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭52−87291（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．, （1985），５（１），ｐ．268−272 ＰＲＯＣ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，（1984），81，ｐ．6349− 6353 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，（1984），81，ｐ．6466− 6470

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．通常は生物学的に有意であるレベルでは発現されな
    い組換え外来性遺伝物質を発現する移植可能な上皮細
    胞。 ２．細胞がケラチン合成細胞である請求項１の移植可能
    な細胞。 ３．外来性遺伝物質が、下記細胞中で天然においては生
    じないDNAまたRNA、あるいは下記細胞中で天然で生じる
    が通常は生物学的に有意であるレベルでは発現されない
    DNAまたRNAである請求項１または２の移植可能な細胞。 ４．外来性遺伝物質が、ホルモン、たとえば受精調節ホ
    ルモン、酵素または薬物をコードする請求項１または２
    の移植可能な細胞。 ５．細胞がヒトケラチン合成細胞である請求項１ないし
    ４のいずれかの移植可能な細胞。 ６．少なくとも１つの優性の選択マーカー、たとえば抗
    生物質耐性をコードする遺伝物質をさらに含む請求項
    ３、４また５のいずれかの移植可能な細胞。 ７．ケラチン合成細胞において通常は生物学的に有意で
    あるレベルではつくられないポリペプチドをコードする
    外来性遺伝物質およびneo遺伝子を発現し、該neo遺伝子
    はトランスポゾンTn5から得られる細菌の遺伝子である
    請求項２の移植可能な細胞。 ８．外来性遺伝物質が細胞内のレトロウイルスベクター
    に組み込まれている請求項１ないし７のいずれかの移植
    可能な上皮細胞。 ９．ａ）アンフォトロピックモロニーマウス白血病ウイ
    ルスに由来する長い末端反復配列、tRNA結合部位および
    Psiパッキング部位； ｂ）少なくとも１つの選択マーカー、たとえば優性な選
    択マーカーをコードする遺伝物質、たとえばneo遺伝
    子；および ｃ）外来性遺伝物質、たとえばヒト成長ホルモンをコー
    ドする外来性遺伝物質； からなる、組み換えゲノムを有する組み換えアンフォト
    ロピックレトロウイルスを組み込まれた請求項２の移植
    可能な細胞。 １０．ATCC CRL8858の培養物である請求項２の移植可能
    な細胞。 １１．身体への移植に使用してホルモン、酵素または薬
    物の放出系を提供する、シート状の請求項４の移植可能
    な細胞。 １２．ａ）ホルモン、酵素または薬物をコードする遺伝
    物質； ｂ）アンフォトロピックレトロウイルスに由来する長い
    末端反復配列、tRNA結合部位およびPsiパッキング部
    位；および ｃ）真核生物由来の少なくとも１つのプロモーター； からなる組み換えゲノムを有する組み換えレトロウイル
    スを組み込まれた請求項11のシート状の移植可能な細
    胞。 １３．ａ）組み換えゲノムがさらに，外部のキューによ
    って修飾され得る真核生物由来のプロモーターからなる
    か；または ｂ）組み換えゲノムがさらに少なくとも１つの優性な選
    択マーカーをコードする遺伝物質、たとえば抗生物質耐
    性をコードする遺伝子または宿主種の遺伝子欠陥を補う
    遺伝子からなる； 請求項12のシート状の移植可能な細胞。 １４．ａ）ケラチン合成細胞と、増殖を抑制すべく処理
    された線維芽細胞（該線維芽細胞は外来性遺伝物質を含
    む組み換えゲノムを有する感染性組み換えレトロウイル
    スを生産する）との培養物をつくり；そして ｂ）上記培養物を細胞増殖を促す条件下に維持してケラ
    チン合成細胞のコロニーを形成させる； ことからなる、外来性遺伝物質および少なくとも１つの
    優性な選択マーカーをコードする遺伝物質を発現する移
    植可能なケラチン合成細胞を製造する方法。 １５．外来性遺伝物質が通常はケラチン合成細胞におい
    て生物学的に有意であるレベルでは発現されないホルモ
    ン、酵素または薬物をコードする請求項14の方法。 １６．組み換えゲノムがさらに、少なくとも１つの優性
    な選択マーカーをコードする遺伝物質からなる請求項15
    の方法。 １７．線維芽細胞が、neo遺伝子およびヒト成長ホルモ
    ンをコードする遺伝子を組み込まれているATCC CRL8859
    である請求項16の方法。 １８．ａ）外来性遺伝物質をケラチン合成細胞に導入
    し；そして ｂ）該ケラチン合成細胞を培養して移植可能なシートを
    つくる； ことからなる外来性遺伝物質を発現するケラチン合成細
    胞より構成される上皮細胞の移植可能なシートを製造す
    る方法。 １９．ａ）培養容器中で、ケラチン合成細胞と、増殖を
    抑制すべく処理された線維芽細胞（該線維芽細胞は外来
    性遺伝物質を含む組み換えゲノムを有する感染性組み換
    えウイルスを生産する）とを培養し； ｂ）該培養物を細胞増殖を促す条件下に維持してケラチ
    ン組織のシートが上記容器の表面上に形成されるように
    し；そして ｃ）該容器の表面からケラチン組織のシートを分離す
    る； ことからなる外来性遺伝物質を発現するケラチン合成細
    胞より構成されるケラチン組織の移植可能なシートを製
    造する方法。 ２０．組み換えゲノムがさらに、少なくとも１つの優性
    な選択マーカーをコードする遺伝物質からなる請求項19
    の方法。 ２１．ケラチン組織のシートを、上記容器の表面から該
    シートを酵素により分離するのに十分な条件下で中性プ
    ロテアーゼと接触させる請求項19または20の方法。
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