JP4929288B2 - Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡ干渉の仲介における前記ｄｓＲＮＡの使用、および疼痛を治療するための該ｄｓＲＮＡの使用に関する。

関連出願
本願は、２００５年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６０／７３３，８１６号；２００５年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４１，５８６号；２００６年１月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７６３，２０２号；２００６年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，４４３号；ならびに２００６年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６０／８４９，３６４号の利益を主張する。これらの先行出願の内容は、参照により全体が本願に組み込まれる。

発明の背景技術
神経障害性疼痛は、末梢性および中枢性の神経障害性疼痛として分類することができる。末梢性の神経障害性疼痛は末梢知覚神経の傷害または感染によって引き起こされ、中枢性の神経障害性疼痛はＣＮＳおよび脊髄のうち少なくともいずれか一方の損傷によってもたらされる。末梢性および中枢性いずれの神経障害性疼痛も、明白な最初の神経損傷を伴わずに生じる場合がある。

同様の定義は、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ、米国ワシントン州シアトル所在）からも与えられている。すなわち、末梢性の神経障害性疼痛は、末梢神経系における最初の病変または機能不全によって開始または誘発される疼痛であり、中枢性の神経障害性疼痛は、中枢神経系における最初の病変または機能不全によって開始または誘発される疼痛である。

末梢の病変は、末梢神経の病変（例えば糖尿病性神経障害、例えば化学療法における薬剤性神経障害）、神経根および後神経節の病変（例えばヘルペス後神経痛、神経根の引き抜き）、末梢神経、神経叢および神経根の圧迫による神経障害性のがん性疼痛などの場合がある。中枢の病変は、例えば脳幹における、梗塞による病変、圧迫性の腫瘍または膿瘍の場合もあるし、あるいは外傷または手術による脊髄傷害の場合もある（非特許文献１および２）。

末梢性および中枢性の神経障害性疼痛の上記の例は、末梢性および中枢性の神経障害性疼痛が、病変または機能不全の解剖学上の位置によってのみ区別されるのではないことを実証するとともに、末梢性および中枢性の神経障害性疼痛が、そのメカニズムによって区別されうることをも実証している（非特許文献２）。従って、薬物作用メカニズムと個々の疼痛状態における効果との間に、あるいは単一薬物の部類と様々な疼痛状態とについては、明瞭な関係はない（非特許文献３）。

オピオイドおよび非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のような一般の鎮痛剤は、効能が不十分であるかまたは副作用で用量が制限されるかのうち少なくともいずれか一方が原因で、末梢性および中枢性の神経障害性疼痛としての慢性的な異常疼痛症候群を不十分にしか改善しない。十分かつ維持された鎮痛を得るための代替治療法の探索では、コルチコステロイド、伝達ブロック、グリセロール、抗痙攣薬、不整脈治療剤、抗うつ薬、局所麻酔薬、カプサイシンのような局所薬、ガングリオシドおよび電気刺激が試みられたが、神経障害性疼痛の患者の一部しかそのような治療に応答せず、通常これらの応答者でもか
なりの疼痛が残存する。現行の治療法に伴う重大な問題点は治療濃度域である。すなわち、特定の治療は奏功する可能性を有し得るが、患者は、用量増加による副作用を制限するために「奏功するように治療」されない。

中枢性の神経障害性疼痛とは、治療が特に困難な種類の神経障害性疼痛の種類である（非特許文献４）。脊髄視床皮質路の病変により、異所性のニューロンの放電が脊髄および脳の様々なニューロンに生じる場合がある。中枢神経系の損傷域における過興奮は、中枢性の神経障害性疼痛の発生において主要な役割を果たす。中枢性の神経障害性疼痛を有する患者は、刺激とは無関係な疼痛をほとんど常に有している。さらに、例えば脊髄損傷の場合には、通常は病変より下方の皮膚領域または内臓が異痛を示すので、刺激依存性の疼痛が存在しうる。したがって、局部的な脊髄の病変が、完全な病変よりも高度の疼痛を生じる傾向があり得る。

その他の一般に認められた種類の中枢性の神経障害性疼痛または中枢性の神経障害性疼痛を伴う疾患も存在する。例を挙げると、多発性硬化症、脊髄炎または梅毒のような炎症性のＣＮＳ疾患、視床、脊髄視床路もしくは視床皮質投射における虚血、出血または動静脈奇形（例えば脳卒中後の神経障害性疼痛）、ならびに脊髄空洞症が含まれる（非特許文献５）。

Ｎａ^＋チャネルは、ニューロンおよび筋細胞のようなすべての興奮性細胞における活動電位生成の中心である。そのようなものとして、Ｎａ^＋チャネルは、疼痛のような様々な疾病状態において重要な役割を果たす（非特許文献６および７を参照）。遺伝子ファミリーのうち３つのメンバー（ＮａＶ１．８、１．９、１．５）は、公知のＮａチャネル遮断薬ＴＴＸによる遮断に対して抵抗性であり、このことはかかる遺伝子ファミリー内のサブタイプ特異性を証明している。突然変異分析から、グルタミン酸３８７がＴＴＸ結合のための重大な残基であることが確認されている（非特許文献８を参照）。

一般に、電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶ）は、正常および異常な痛覚を構成し記号化する電気的信号を伝える神経系の、興奮性組織における活動電位の迅速な立ち上がりの開始に関与する。ＮａＶチャネルのアンタゴニストはこれらの疼痛信号を減弱させることが可能であり、様々な疼痛状態、例えばこれらに限定されるものではないが急性、慢性、炎症性、および神経障害性の疼痛を治療するのに有用である。既知のＮａＶアンタゴニストには、ＴＴＸ、リドカイン（非特許文献９を参照）、ブピカイン、カルバマゼピン、メキシリテン（mexilitene）、フェニトイン（非特許文献１０を参照）、およびラモトリジン（非特許文献１１および１０を参照）が含まれる。しかしながら、副作用として、めまい、傾眠、悪心および嘔吐（非特許文献１２を参照）があり、該副作用により疼痛治療のための既知ＮａＶアンタゴニストの有用性は制限される。これらの副作用は、少なくとも部分的には、複数のＮａＶサブタイプを遮断することに起因すると思われる。ＮａＶ１．８チャネルを選択的に抑制する作用薬は、これらの既知の非選択的ＮａＶアンタゴニストよりもはるかに広い治療濃度域を提供するであろう。

侵害刺激の検出および伝達は小型の知覚ニューロンによって仲介される。免疫組織化学法、ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび電気生理学実験のいずれからも、ナトリウムチャネルＮａＶ１．８が後根神経節および三叉神経節の小型の知覚ニューロンに選択的に局在していることが示されている（非特許文献１３を参照）。実験的な神経損傷後、免疫組織化学法のデータは、神経損傷部位にＮａｖ１．８が集積し、これにＴＴＸ抵抗性のナトリウム電流のアップレギュレーションが伴うことを実証したが、このことはＮａＶ１．８を痛覚過敏の根底にあるメカニズムとすることと合致している（非特許文献１４を参照）。髄腔内注射で投与されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるＮａＶ１．８発現の減弱化により、実験的な神経損傷により誘発されるＮａｖ１．８の坐骨神
経への再分布が防止され、神経障害性疼痛（触覚性および温熱性痛覚過敏）が無効となったが、このことは神経損傷により誘発される疼痛におけるＮａｖｌ．８の因果的役割を実証するものである（非特許文献１５および１６も参照されたい）。炎症性疼痛モデルでは、ＮａＶ１．８に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの髄腔内投与の結果、ＰＧＥ_２誘発型の痛覚過敏（非特許文献１７を参照）、およびＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）誘発型の痛覚過敏（非特許文献１８）が著しく減少した。さらに、酢酸を膀胱内に注入することによって誘発される内臓痛ラットモデルにおいて、膀胱の活動亢進はＮａＶ１．８に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの髄腔内注射によって低減され、Ｎａｖ１．８が内臓痛における知覚神経の賦活に寄与することが示された（非特許文献１９）。

総括すると、これらのデータは炎症性および神経障害性疼痛の検出および伝達におけるＮａＶ１．８の役割を支持するものである。
最近、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節メカニズムで遺伝子発現を阻止することが示された。特許文献１（ファイア（Fire）ら）は、線虫（C . elegans）においてＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制
するために少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡを使用することを開示している。ｄｓＲＮＡはまた、他の生物、例えば植物（例えばウォーターハウス（Waterhouse）らの特許文献２；およびハイフェッツ（Heifetz）らの特許文献３を参照）、ショウジョウバ
エ（例えば非特許文献２０を参照）、および哺乳動物（リマー（Limmer）の特許文献４およびクロイツァー（Kreutzer）らの特許文献５を参照）などにおいて標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然のメカニズムは今や、遺伝子の制御異常もしくは望ましくない制御を原因とする病気を治療するための、新しい種類の医薬品の開発の焦点となっている。
国際公開公報第９９／３２６１９号パンフレット 国際公開公報第９９／５３０５０号パンフレット 国際公開公報第９９／６１６３１号パンフレット 国際公開公報第００／４４８９５号パンフレット ＤＥ １０１ ００ ５８６．５明細書 Jain K K, Emerging Drugs, 2000, 5:241-257 McQuay, 2002, European Journal of Pain 6 (Suppl. A): 11-18 Sindrup S H, Jensen T S, Pain 1999, 83:389-400 Yezierski and Burchiel, 2002 Koltzenburg, Pain 2002--An Updated Review: Refresher Course Syllabus; IASP Press, Seattle, 2002 Waxman, S. G., S. Dib-Hajj, et al. (1999) "Sodium channels and pain" Proc Natl Acad Sci USA 96(14): 7635-9 Waxman, S. G., T. R. Cummins, et al. (2000) "Voltage-gated sodium channels and the molecular pathogenesis of pain: a review" J Rehabil Res Dev 37(5): 517-28 Noda, M., H. Suzuki, et al. (1989) "A single point mutation confers tetrodotoxin and saxitoxin insensitivity on the sodium channel II" FEBS Lett 259(1): 213-6 Mao, J. and L. L. Chen (2000) "Systemic lidocaine for neuropathic pain relief" Pain 87(1): 7-17 Jensen, T. S. (2002) "Anticonvulsants in neuropathic pain: rationale and clinical evidence" Eur J Pain 6 (Suppl A): 61-8 Rozen, T. D. (2001) "Antiepileptic drugs in the management of cluster headache and trigeminal neuralgia" Headache 41 Suppl 1: S25-32 Tremont-Lukats, I. W., C. Megeff, and M. M. Backonja (2000) "Anticonvulsants for neuropathic pain syndromes: mechanisms of action and place in therapy" Drugs 60:1029-1052 Akopian, A. N., L. Sivilotti, et al. (1996) "A tetrodotoxin-resistant voltage-gated sodium channel expressed by sensory neurons" Nature 379(6562): 257-62 Gold, M. S., D. Weinreich, et al. (2003) "Redistribution of Nav1.8 in uninjured axons enables neuropathic pain" J. Neurosci. 23: 158-166 Lai, J., M. S. Gold, et al. (2002) "Inhibition of neuropathic pain by decreased expression of the tetrodotoxin-resistant sodium channel, NaV1, 8" Pain 95(1-2): 143-52 Lai, J., J. C. Hunter, et al. (2000) "Blockade of neuropathic pain by antisense targeting of tetrodotoxin-resistant sodium channels in sensory neurons" Methods Enzymol 314: 201-13 Khasar, S. G., M. S. Gold, et al. (1998) "A tetrodotoxin-resistant sodium current mediates inflammatory pain in the rat" Neurosci Lett 256(1): 17-20 Porreca, F., J. Lai, et al. (1999) "A comparison of the potential role of the tetrodotoxin-insensitive sodium channels, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat models of chronic pain" Proc. Nat'l. Acad. Sci. 96: 7640-7644 Yoshimura, N., S. Seki, et al. (2001) "The involvement of the tetrodotoxin-resistant sodium channel Nav1.8 (PN3/SNS) in a rat model of visceral pain" J. Neurosci. 21: 8690-8696 Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200

ＲＮＡｉの分野における著しい進歩および疼痛治療における進歩にもかかわらず、高い生物活性および生体内での安定性の両方を有する、細胞自身のＲＮＡｉ機構を使用してＮａｖ１．８遺伝子を選択的かつ効率的にサイレンシングすることが可能である作用薬であって、かつ疼痛治療において使用するために標的Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を有効に抑制することができる作用薬が、依然として必要とされている。

発明の要約
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにそのようなｄｓＲＮＡを使用して細胞または哺乳動物のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。本発明はさらに、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現、例えば神経障害性および炎症性疼痛の疼痛信号の伝播における発現を原因とする病的状態および疾患を治療するための、組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、長さ３０ヌクレオチド未満でＮａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。

１つの実施形態では、本発明はＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有する。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、Ｎａｖ１．８をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有し、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満である。該ｄｓＲＮＡは、Ｎａｖ１．８を発現する細胞と接触させると、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。

例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１、４および６のセンス配列から成る群から選択される、ｄｓＲＮＡの第１の配列を有するものでよく、第２の配列は表１、４および６のアンチセンス配列から成る群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドからなるものでもよいし、あるいは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドなどを含むものでもよい。あるいは、修飾ヌクレオチドは、次の群、すなわち２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含むヌクレオチド、から選択されうる。好ましくは、前記ｄｓＲＮＡの第１の配列は、表１、４および６のセンス配列から成る群から選択され、第２の配列は、表１、４および６のアンチセンス配列から成る群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡのうちの１つを含む細胞を提供する。該細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞であることが好ましい。
別の実施形態では、本発明は、１以上の本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む、生物体におけるＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞内のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための、下記工程（ａ）および（ｂ）を含む方法を提供する。
（ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有する、工程。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、Ｎａｖ１．８をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含み、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、ｄｓＲＮＡは、Ｎａｖ１．８を発現する細胞と接触させると、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。

（ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、Ｎａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する工程。

別の実施形態では、本発明は、疼痛を治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の１つ以上の本発明のｄｓＲＮＡを投与することからなる方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された調節配列を有するベクターを提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するためのベクターを含む細胞を提供する。該ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された調節配列を有する。

発明の詳細な説明
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに該ｄｓＲＮＡを使用して細胞または哺乳動物のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供
する。本発明はさらに、ｄｓＲＮＡを使用してＮａｖ１．８遺伝子の発現を原因とする哺乳動物の病的状態および疾患を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通じて、ｍＲＮＡの配列特異的な分解を導く。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む種々様々な生物において生じる。

本発明のｄｓＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満でありＮａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡを使用することにより、哺乳動物の疼痛応答に関与する遺伝子のｍＲＮＡを標的とした分解が可能である。細胞アッセイおよび動物アッセイを使用して、本発明者らは、非常に低用量の上記ｄｓＲＮＡが特異的かつ効率的にＲＮＡｉを仲介する結果、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を顕著に抑制することができることを実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、疼痛の治療に有用である。

以降の詳細な説明は、標的Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するためにｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ含有組成物を製造および使用する方法、ならびに神経障害性および炎症性疼痛のようなＮａｖ１．８の発現を原因とする疾患および障害を治療するための組成物および方法を開示する。本発明の医薬組成物は、長さが３０ヌクレオチド未満でＮａｖ１．８遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを、薬学的に許容可能な担体と一緒に含む。

従って、本発明のある態様は、本発明のｄｓＲＮＡを薬学的に許容可能な担体と一緒に含む医薬組成物、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するために該組成物を使用する方法、およびＮａｖ１．８遺伝子の発現を原因とする疾患を治療するために該医薬組成物を使用する方法を提供する。

Ｉ．定義
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される一定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分におけるある用語の使用法と、本項に示された該用語の定義との間に明白な矛盾がある場合、本項の定義が優先されるものとする。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含んでいるヌクレオチドを表わす。しかしながら、当然のことであるが、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分をも意味しうる。当業者には良く知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の構成部分で置換し、そのような置換部分を有するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を本質的に変化させないでおくことができる。例えば、限定するものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含んでいるヌクレオチドと塩基対形成することができる。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中において例えばイノシンを含んでいるヌクレオチドで置換される場合がある。そのような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。

本明細書で使用されるように、「Ｎａｖ１．８」は、イオンチャネルの発生または維持に関連する任意のＮａｖ１．８タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。用語「Ｎａｖ１．８」はまた、任意のＮａｖ１．８タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列も指す。実施例については、使用したＮａｖ１．８ ｍＲＮＡ配
列は、ヒト（ＮＭ＿００６５１４）、マウス（ＮＭ＿００９１３４）、ラット（ＮＭ＿０１７２４７）およびイヌ（ＮＭ００１００３２０３）のｍＲＮＡ配列であった。

本明細書で使用されるように、「標的配列」は、Ｎａｖ１．８遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した一部分、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシング生成物であるｍＲＮＡなどを指す。

本明細書で使用されるように、用語「配列を有する鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して示された配列によって記述されるヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書で使用されるように、かつ別途記載のない限り、用語「相補的」は、第１のヌクレオチド配列について第２のヌクレオチド配列との関連において記述するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとともに、ある条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、このことは当業者には当然のことである。そのような条件は、例えばストリンジェントな条件であってよく、ここでストリンジェントな条件としては：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間の後に洗浄、が挙げられる。その他の条件、例えば生物体内で遭遇しうるような生理学的に関連のある条件なども当てはまる。当業者であれば、２つの配列の相補性を、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に従って試験するための、最も適した条件一式を決定することができるであろう。

これは、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列全長にわたる塩基対形成を含んでいる。このような配列は、本明細書においては互いに関して「完全に相補的」ということができる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に関して「ほぼ相補的」という場合は、その２つの配列は完全に相補的であってもよいし、あるいはその２つの配列が、該配列の最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１つ以上、好ましくは４つ、３つまたは２つ以下のミスマッチな塩基対を形成してもよい。ただし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に１以上の一本鎖突出部を形成するように設計されている場合、そのような突出部は相補性の測定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、一方の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドともう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとからなるｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうのオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を有するものは、本発明の目的に関してはこの場合も「完全に相補的」とされうる。

「相補的な」配列はまた、本明細書で使用されるように、該配列のハイブリダイズする能力に関して上記の必要条件が満たされる限り、非ワトソンクリック型の塩基対、または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成された塩基対のうち少なくともいずれか一方を含んでもよいし、あるいは完全に前記塩基対から形成されてもよい。

本明細書中の用語「相補的」、「完全に相補的」および「ほぼ相補的」は、該用語の使用の前後関係から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、あるいはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基の対応に関して使用されうる。

本明細書で使用されるように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部にほぼ相補的」なポリヌクレオチドとは、対象のｍＲＮＡ（例えばＮａｖ１．８をコードするもの）の連続した一部分にほぼ相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、配列がＮａｖ１．８をコードするｍＲＮＡの連続した一部分にほぼ相補的である場合、そのポリヌクレオチドはＮａｖ１．８ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用されるように、リボ核酸分子、またはリボ核酸分子の複合体であって、２つの逆平行かつ（上記定義のように）ほぼ相補的な核酸鎖からなる二重鎖構造を有するものを指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、個別のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つの大きな分子の一部であり、したがって、２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端との間の連続したヌクレオチド鎖で接続されている場合、この接続しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端との間の連続したヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この接続構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同数を有してもよいし、異なる数のヌクレオチドを有してもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１以上のヌクレオチド突出部を含んでもよい。

本明細書で使用されるように、「ヌクレオチド突出部」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、あるいはその逆である場合に、該ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する非対合ヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、非対合ヌクレオチドがｄｓＲＮＡの末端に存在しない、すなわちヌクレオチド突出部がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖構造である、すなわち該分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出部がないｄｓＲＮＡである。

用語「アンチセンス鎖」は、ｄｓＲＮＡの鎖であって標的配列にほぼ相補的な領域を含むものを指す。本明細書で使用されるように、用語「相補領域」は、本明細書で定義されるように、配列（例えば標的配列）にほぼ相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、かつ、存在する場合は、好ましくは末端領域に、例えば５’または３’末端のうち少なくともいずれかから６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。

用語「センス鎖」は、本明細書で使用されるように、ｄｓＲＮＡの鎖であってアンチセンス鎖のある領域にほぼ相補的な領域を含んでいるものを指す。
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を伴わない拡散プロセスまたは細胞の能動的プロセスを通じて為されてもよいし、あるいは補助的な薬剤またはデバイスによって為されてもよい。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されるものではなく；ｄｓＲＮＡは、生体の一部である細胞について「細胞に導入される」場合もある。そのような場合は、細胞への導入は、生体への送達を含むことになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達については、ｄｓＲＮＡが組織部位に注入されてもよいし、あるいは全身投与されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当分野で既知の方法が挙げられる。

用語「サイレンシングする」および「発現を抑制する」は、該用語がＮａｖ１．８遺伝子に関するものである限り、本明細書では、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を少なくとも部分
的に抑制することを指し、該抑制は、Ｎａｖ１．８遺伝子の転写が行われる第１の細胞または細胞群であってＮａｖ１．８遺伝子の発現が抑制されるように処理されたものから単離可能な、Ｎａｖ１．８遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって第１の細胞または細胞群と本質的に同一であるが上記処理が為されていないもの（対照細胞）と比較して減少していることによって明らかにされるようなものである。抑制の程度は通常、
［（対照細胞のｍＲＮＡ）−（処理細胞のｍＲＮＡ）］／（対照細胞のｍＲＮＡ）・１００％
で表される。

別例として、抑制の程度は、Ｎａｖ１．８遺伝子の転写に機能的関連を有するパラメータ、例えば、細胞によって分泌される、Ｎａｖ１．８遺伝子にコードされたタンパク質の量、あるいは一定の表現型（例えばアポトーシス）を示す細胞の数など、の減少という観点で与えられる場合もある。原則として、Ｎａｖ１．８遺伝子のサイレンシングは、構成的にあるいはゲノムの工学操作により標的を発現する任意の細胞において、任意の適切なアッセイによって測定可能である。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡがＮａｖ１．８遺伝子の発現を一定の度合いで抑制するか、したがって本発明に包含されるかどうかを判断するために参照が必要な場合、以下の実施例において提供されるアッセイはそのような参照として有用であろう。

例えば、ある例では、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される。好ましい実施形態では、Ｎａｖ１．８遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。より好ましい実施形態では、Ｎａｖ１．８遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。最も好ましい実施形態では、Ｎａｖ１．８遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約９８％、９９％またはそれ以上抑制される。

用語「治療する」、「治療」などは、疼痛知覚の軽減または緩和、例えば、与えられた刺激（例えば圧力、組織傷害、低温など）に応答して対象が経験する疼痛（例えば灼熱感、ピリピリ感、電気ショック様の感覚など）の強度または持続時間のうち少なくともいずれか一方の軽減または緩和、を指す。疼痛知覚の軽減または緩和は、疼痛の強度または持続時間についての任意の検知できる減少であってよい。治療は、疼痛状態に苦しんでいるか、または本発明によって治療することが可能な疼痛関連障害の１つ以上の症状を有する対象（例えばヒトまたはコンパニオン・アニマル）に為されてもよいし、あるいは、本明細書に記載の神経障害性疼痛のＳＮＬラットモデルまたは慢性的疼痛のＣＦＡラットモデルのような疼痛の動物モデルにおいて為されてもよいし、あるいは疼痛の別の動物モデルにおいて為されてもよい。本発明の文脈において本発明が本明細書中以下に示す任意のその他の（疼痛以外の）状態に関する限り、用語「治療する」、「治療」などは、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和すること、またはそのような状態の進行を遅延または逆行させることを意味する。

本明細書で使用されるように、語句「治療上有効な量」および「予防上有効な量」とは、疼痛または明白な疼痛症状の治療、予防、または管理に治療上の利点を提供する量を指す。治療上有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、また当分野で周知の要因、例えば疼痛のタイプ、患者の病歴および年齢、疼痛の程度、ならびに他の抗疼痛剤の投与などに依存して変化しうる。

本明細書で使用されるように、「医薬組成物」は薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡと薬
学的に許容可能な担体とを含む。本明細書で使用されるように、「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効な量」とは、意図される薬理学的、治療上、または予防上の結果を生じるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床治療が、疾患または障害に関連した測定可能なパラメータに少なくとも２５％の低下があれば有効であると考えられる場合、その疾患または障害の治療のために治療上有効な薬の量は、そのパラメータを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。

用語「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬を投与するための担体を指す。そのような担体には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。該用語は細胞培養培地を明確に除外している。経口投与される薬物については、薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、薬学的に許容可能な添加剤、例えば不活性の賦形剤、崩壊剤、結着剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤および保存剤などが挙げられる。適切な不活性の賦形剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、およびラクトースがあり、またトウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結着剤にはデンプンおよびゼラチンを挙げることができ、潤滑剤は一般に、存在する場合にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望の場合には、胃腸管への吸収を遅らせるために錠剤をモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような材料でコーティングしてもよい。

本明細書で使用されるように、「形質転換細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞である。
ＩＩ．二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物においてＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡはＮａｖ１．８遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補領域は長さが３０ヌクレオチド未満であり、前記ｄｓＲＮＡは、前記Ｎａｖ１．８遺伝子を発現している細胞と接触すると、前記Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を少なくとも２０％抑制する。該ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列にほぼ相補的、好ましくは完全に相補的な相補領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は該アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２つの鎖が適切な条件の下で組み合わせられた時にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するようになっている。好ましくは、二重鎖構造は長さが１５〜３０、より好ましくは１８〜２５、さらにより好ましくは１９〜２４、最も好ましくは２１〜２３塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さが１５〜３０、より好ましくは１８〜２５、さらにより好ましくは１９〜２４、最も好ましくは２１〜２３ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出部をさらに含んでもよい。ｄｓＲＮＡは、以降にさらに議論するように当分野で周知の標準的な方法によって、例えば、バイオサーチ（Biosearch）、アプライドバイオ
システムズ社（Applied Biosystems, Inc.）などから市販されているような自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成することができる。好ましい実施形態では、Ｎａｖ１．８遺伝子はヒトのＮａｖ１．８遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１、４および６のアンチセンス配列を有し、もう一方の配列は、表１、４および６のセンス配列から成る群から選択される。

さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１、４および６に提供された配列群から選択された少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択された少なくとも２つの配列を有し、少なくとも２つの配列のうち一方は少なくとも２つの配列のもう一方に相補的であり、少なくとも２つの配列のうちの１つは
、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現で生成されるｍＲＮＡの配列にほぼ相補的である。好ましくは、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、一方のオリゴヌクレオチドは表１、４および６に記載されているものであり、もう一方のオリゴヌクレオチドも表１、４および６に記載されている。

当業者には周知のように、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を引き起こすのに特に有効なものとして評価されている（Elbashir
et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、より短いｄｓＲＮＡや長いｄｓＲＮＡも同様に有効となりうることが他の研究者によって見出されている。上述の実施形態では、表１、４および６に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質から、本発明のｄｓＲＮＡは長さが最小２１ヌクレオチドの鎖を少なくとも１つ含むことができる。表１、４および６の配列のうちの１つであって一端または両端からわずか数個のヌクレオチドが差し引かれたものを含む短いｄｓＲＮＡが、上述のｄｓＲＮＡと比較して同じように有効かもしれないことを期待するのは合理的と思われる。従って、表１、４および６の配列のうちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上連続したヌクレオチドである部分配列を有し、かつ、本明細書中以降に記載のようなＦＡＣＳ分析においてＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する能力が、完全な配列を有するｄｓＲＮＡと高々５、１０、１５、２０、２５、または３０％（抑制）しか違わないｄｓＲＮＡが、本発明によって企図されている。

本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つ以上のミスマッチを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが含むミスマッチは３つ以下である。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含んでいる場合、ミスマッチ部分が相補領域の中央に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含んでいる場合、該ミスマッチはいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補領域の５’または３’末端のいずれかから５、４、３、２、または１ヌクレオチドに限られることが好ましい。例えば、Ｎａｖ１．８遺伝子のある領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖については、該ｄｓＲＮＡは、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にはミスマッチを全く含まないことが好ましい。標的配列に対するミスマッチを含んでいるｄｓＲＮＡがＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するのに有効かどうか判断するために、本発明に記載の方法を使用することができる。特にＮａｖ１．８遺伝子中の特定の相補領域が、集団内で配列多型の変異を有することが知られている場合、ミスマッチを備えたｄｓＲＮＡの、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現抑制における有効性を考慮することは重要である。

１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には、１〜４ヌクレオチド、好ましくは１〜２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出部がある。少なくとも１つのヌクレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは、予想外なことに、対応する平滑末端のｄｓＲN
Ａよりも優れた抑制特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチド突出部の存在が、ｄｓＲＮＡの全体的な安定性に影響することなくｄｓＲＮＡの干渉活性を強化することを発見した。突出部を１つだけ有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ならびに様々な細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定かつ有効であることが分かった。好ましくは、一本鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端に位置し、あるいは別例としてセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、平滑末端を有していてもよく、該平滑末端は好ましくはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。そのようなｄｓＲＮＡは安定性および抑制活性が改善されており、よって、低用量（すなわち１日につき被投与者の体重１ｋｇあたり５ｍｇ未満）での投与が可能になる。好ましくは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’末端にヌクレオチド突出部を有し、５’末端が平滑末端である。別の実施形態では、突出部中の１つ以上のヌクレオチドがヌクレオシドチオホスフェートで置換されている。

さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性増強のために化学修飾される。本発明の核酸は、参照により本願に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley and Sons, Inc., placeCityNew York, StateNY, USAに記載のような当分野で確立された方法によって合成かつ／または修飾されうる。化学修飾には、限定するものではないが、２’修飾、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸エステル結合のチオリン酸エステル結合による置換、が挙げられる。この実施形態では、二重鎖構造の完全性は少なくとも１つ、好ましくは２つの化学結合により強化される。化学結合は、様々なよく知られた技法のうち任意のものによって、例えば、共有結合、イオン結合、もしくは水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用もしくはスタッキング相互作用；金属イオン配位、またはプリンアナログの使用、によって達成されうる。好ましくは、ｄｓＲＮＡの修飾に使用することができる化学基には、限定するものではないが、メチレンブルー；二機能性化学基、好ましくはビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。１つの好ましい実施形態では、リンカーはヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは固相合成によって作製され、ヘキサエチレングリコールリンカーは標準的な方法（例えば、Williams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）によって
組込まれる。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がヘキサエチレングリコールリンカーによって化学的に連結される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドはホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端での化学結合は、三重らせん結合によって形成されることが好ましい。表１は、本発明の修飾ＲＮＡｉ剤の例を提示している。

ある実施形態では、化学結合は１つまたはいくつかの結合基によって形成されてもよく、そのような結合基は好ましくはポリ（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはポリエチレングリコール鎖である。他の実施形態では、化学結合は、プリンの代わりに二本鎖構造に導入されたプリンアナログによって形成される場合もある。さらなる実施形態では、化学結合は二本鎖構造に導入されたアザベンゼンユニットによって形成されうる。さらに別の実施形態では、化学結合は、ヌクレオチドの代わりに二本鎖構造に導入された分岐状のヌクレオチド類似体によって形成されうる。ある実施形態では、化学結合は紫外線によって導入される場合もある。

さらに別の実施形態では、２つの一本鎖のうち一方または両方のヌクレオチドが、細胞内酵素、例えば限定するものではないがある種のヌクレアーゼ、の活性化を防止または阻害するために修飾される場合もある。細胞内酵素の活性化を阻害する技法は当分野で知られており、例えば限定するものではないが２’−アミノ修飾、２’−フルオロ修飾、２’−アルキル修飾、非荷電性バックボーン修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、およびホスホロアミデートが挙げられる（例えば、Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8
を参照）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基が、化学基、好ましくは２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル基によって置換される。さらに、少なくとも１つのヌクレオチドがロックされたヌクレオチドを形成するように修飾されてもよい。そのようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’位の酸素をリボースの４’位の炭素に接続するメチレン架橋またはエチレン架橋を含んでいる。ロックされたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630およびObika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導
入することにより、相補配列への親和性が改善され、融解温度が数度上昇する（Braasch,
D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7）。

ｄｓＲＮＡにリガンドをコンジュゲートすることにより、ｄｓＲＮＡの細胞内吸収を増強することができる。ある例では、細胞膜の直接的な透過を促進するために、疎水性リガンドがｄｓＲＮＡにコンジュゲートされる。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされるリガンドは、受容体依存性エンドサイトーシスの基質である。これらの手法はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を促進するために使用されてきた。例えば、コレステロールが様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた結果、非コンジュゲート型の類似物と比較して非常に高活性の化合物が生じている。M. Manoharan Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたその他の親油性化合物には、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロールおよびメントールが含まれる。受容体依存性エンドサイトーシスのリガンドの一例は葉酸である。葉酸は、葉酸受容体依存性エンドサイトーシスによって細胞に入る。葉酸を有しているｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体依存性エンドサイトーシスによって効率的に細胞内に輸送されるであろう。リ（Li）および共同研究者は、オリゴヌクレオチドの３’末端に葉酸を取り付けた結果、該オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みが８倍増加したと報告している（Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540）。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたその
他のリガンドには、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスタ、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、および送達ペプチドが含まれる。

ある種の例では、オリゴヌクレオチドにカチオン性リガンドをコンジュゲートすることにより、ヌクレアーゼに対する耐性が改善されることが多い。カチオン性リガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドが該オリゴヌクレオチド全体にわたって分散された時にｍＲＮＡに対する高い結合親和性を保持することが報告された。M. Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103
ならびに同文献に記載の参照文献を参照されたい。

リガンドがコンジュゲートされた（以降、本明細書では「リガンドコンジュゲート型」とも称する）本発明のｄｓＲＮＡは、ペンダントされた反応性官能基、例えば該ｄｓＲＮＡ上への連結分子の取り付けに由来するもの、を有するｄｓＲＮＡを使用して合成されうる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のうち任意のものを備えて合成されたリガンド、あるいは連結部分が取り付けられているリガンドと、直接反応させることができる。本発明の方法は、一部の好ましい実施形態において、リガンドと適切にコンジュゲートされており、かつ固体支持体材料にさらに取り付けられている場合もあるヌクレオシドモノマーを使用することにより、リガンドコンジュゲート型ｄｓＲＮＡの合成を促進する。任意選択で固体支持体材料に取り付けられたそのようなリガンド・ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合性リガンドを、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に配置された連結部分と反応させることによって、本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態に従って調製される。ある例では、ｄｓＲＮＡの３’末端にアラルキルリガンドが取り付けられているｄｓＲＮＡが、長鎖アミノアルキル基を介して多孔質ガラス支持体にモノマー・ビルディングブロックを最初に共有結合させることにより調製される。その後、該固体支持体に結合したモノマー・ビルディングブロックに、標準的な固相合成技術によってヌクレオチドを結合させる。モノマー・ビルディングブロックは、ヌクレオシドでもよいし、固相合成に適合したその他の有機化合物でもよい。

本発明のコンジュゲートに使用されるｄｓＲＮＡは、よく知られた固相合成法によって便利に日常的な作業で作製されうる。そのような合成のための装置は、例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在）などのいくつかの業者から販売されている。当分野で既知のそのような合成のための他
の手段も、追加として、あるいは代替として使用可能である。さらに、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技法を使用することも周知である。

特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許文献に見出すことができる。すなわち、ポリアミンをコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルのリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーについては米国特許第５，２１２，２９５号；修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号；バックボーン修飾型オリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによる該オリゴヌクレオチドの調製については米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系の修飾核酸塩基およびその合成法については米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリン系の修飾核酸塩基については米国特許第５，４５９，２５５号；キラルのリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するプロセスについては米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸については米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタムのバックボーンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチド合成の方法および材料については米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、該アルキルチオ基が、ヌクレオシドの様々な部位のうち任意の部位に取り付けられた他の部分に対するリンカーとして使用されうるヌクレオシド、については米国特許第５，５７８，７１８号；キラル純度の高いホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび関連化合物、例えば２，６−ジアミノプリン化合物、の調製プロセスについては米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４７０号；米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号はいずれもコンジュゲートされた４’−デスメチルヌクレオシド・アナログに関し；バックボーン修飾型オリゴヌクレオチド・アナログについては米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；とりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法については米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号、である。

本発明の、リガンドコンジュゲート型ｄｓＲＮＡおよびリガンド分子を有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの標準的な前駆体、あるいは、既に連結部分を有しているヌクレオチドまたはヌクレオシド‐コンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を有しているリガンド‐ヌクレオチドまたはヌクレオシド‐コンジュゲート前駆体、あるいは、リガンドを有する非ヌクレオシドのビルディングブロック、を利用して適切なＤＮＡ合成装置にて構築可能である。

既に連結部分を有しているヌクレオチド‐コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成が通常完了してから、リガンド分子を連結部分と反応させて、リガンドコンジュゲート型のオリゴヌクレオチドを形成させる。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子のような様々な分子を有するオリゴヌクレオチド‐コンジュゲートについては、以前に報告されている（Manoharan et al., PCT Application WO
93/07883を参照）。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌ
クレオシドは、リガンド‐ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホロアミダイト、ならびに標準的なホスホロアミダイトおよび市販され日常的にオリゴヌクレオチド合成で使用される非標準的なホスホロアミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。

２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アリル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基をオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに組み入れることにより、該オリゴヌクレオチドに増強されたハイブリダイゼーション特性が付与される。さらに、ホスホロチオエート・バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性が強化されている。したがって、本発明の、官能化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート・バックボーン、あるいは、２’−Ｏ−メチル基、２’−Ｏ−エチル基、２’−Ｏ−プロピル基、２’−Ｏ−アミノアルキル基、２’−Ｏ−アリル基または２’−デオキシ−２’−フルオロ基のうちいずれかまたは両方を含むように補強される場合がある。

いくつかの好ましい実施形態では、５’末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列がＤＮＡ合成装置を使用して調製され、次いで、選択されたリガンドの活性エステル誘導体との反応に供される。活性エステル誘導体は当業者にはよく知られている。代表的な活性エステルには、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、選択されたリガンドが連結基を介して５’位に取り付けられたオリゴヌクレオチドが生じる。５’末端のアミノ基は５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を利用して調製することができる。好ましい実施形態では、リガンド分子は、リガンドがリンカーを介して直接あるいは間接的に５’−ヒドロキシ基に連結されているリガンド‐ヌクレオシドホスホロアミダイトの使用により、オリゴヌクレオチドの５’位にコンジュゲートされる場合がある。そのようなリガンド‐ヌクレオシドホスホロアミダイトは、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドであって５’末端に該リガンドを有しているものを提供するために、通常自動合成手順の最後に使用される。

本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの調製は、リガンド分子を構築するための適切な前駆体分子を選択することから始まる。通常、前駆体は一般に用いられているヌクレオシドが適切に保護された誘導体である。例えば、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドを合成するための合成前駆体には、限定されるものではないが、２’−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２−保護ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、ならびに３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシドであって該分子の核酸塩基部分に保護がなされている場合もあるもの、が挙げられる。このようなアミノが連結された保護ヌクレオシド前駆体の合成方法は、当業者にはよく知られている。

多くの場合、本発明の化合物の調製の際に保護基が使用される。本明細書中で使用されるように、用語「保護（された）」とは、指定部分に保護基が付加されていることを意味する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、化合物は１つ以上の保護基を含んでいる。種々様々の保護基を本発明の方法において使用することができる。一般に、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に対して不活性化し、かつ、分子の残り部分をほとんど損ねることなく該分子中のそのような官能基に付加されたり該官能基から除去されたりすることができる。

代表的なヒドロキシル保護基は、例えば、Beaucage et al., Tetrahedron, 1992, 48:2223-2311に開示されている。さらなるヒドロキシル保護基、ならびにその他の代表的な保護基は、Greene and Wuts, 撤rotective Groups in Organic Synthesis・ Chapter 2, 2d
ed., John Wiley and Sons, New York, 1991および 徹ligonucleotides And Analogues A Practical Approach・ Ekstein, F. Ed., IRL Press, N. Y, 1991に開示されている。

ヒドロキシル保護基の例には、限定するものではないが、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１‐エトキシエチル、１‐（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカーボネート、メシレートおよびトシラートが含まれる。

酸処理に安定なアミノ保護基は塩基処理で選択的に除去され、反応性アミノ基を置換のために選択的に利用可能にするために使用される。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（E. Atherton and R. C. Sheppard in 典he Peptides・ S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1）およびＮｓｃ基を例とする様々な置換スルホニルエチルカルバメート（Samukov et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35:7821; Verhart and Tesser, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 1987, 107:621）である。

さらなるアミノ保護基には、限定するものではないが、カルバメート保護基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；アミド保護基、例えばホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチル；スルホンアミド保護基、例えば２−ニトロベンゼンスルホニル；ならびに、イミンおよび環式イミド保護基、例えばフタルイミドおよびジチアスクシノイル、が挙げられる。これらのアミノ保護基の同等物も、本発明の化合物および方法に包含される。

多くの固体支持体が市販されており、当業者であれば固相合成ステップで使用される固体支持体を容易に選択することができる。ある実施形態では、万能支持体が使用される。万能支持体は、３’末端に異常ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ５００およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ＩＩは、米国２２８２５バージニア州スターリング、デイビスドライブ所在のグレン・リサーチ（Glen Research）から市販されている万能支
持体である。万能支持体に関するさらなる詳細については、Scott et al., Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis, 3rd International Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124；Azhayev, A. V. Tetrahedron 1999, 55, 787-800；およびAzhayev and Antopolsky Tetrahedron 2001, 57, 4977-4986を参照さ
れたい。さらに、より容易に塩基性加水分解を受けるｓｙｎ−１，２−アセトキシホスフェート基を介してオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合される場合は、オリゴヌクレオチドはより穏やかな反応条件下で万能支持体から切断されうることが報告されている。Guzaev, A. L; Manoharan, M. J Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2380を参照のこと。

上記ヌクレオシドは、リンを含むかまたはリンを含まないヌクレオシド間共有結合により連結される。確認しておくと、そのようなコンジュゲートされたヌクレオシドは、リガンドを有しているヌクレオシドまたはリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートと見なすことができる。ヌクレオシド配列内のヌクレオシドにアラルキルリガンドがコンジュゲートされている連結ヌクレオシドは、コンジュゲートされていないｄｓＲＮＡ化合物と比較して高いｄｓＲＮＡ活性を示すであろう。

本発明のアラルキルリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドはさらに、リンカー基の仲介を伴わずにヌクレオシドまたはヌクレオチドにリガンドが直接取り付けられているオリゴヌクレオチドおよび連結ヌクレオシドのコンジュゲートも含む。リガンドは、連結基を介して、リガンドのカルボキシル基、アミノ基、またはオキソ基で取り付けられることが好ましい場合もある。典型的な連結基は、エステル、アミドまたはカルバメート基でよい。

本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに使用するために想定される好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾バックボーンまたは非天然のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで定義されるように、修飾型のバックボーンまたはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持しているものと、バックボーンにリン原子を持たないものとが含まれる。本発明に関しては、糖の間のバックボーンにリン原子のない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。

具体的なオリゴヌクレオチド化学修飾について下記に述べる。所与の化合物中のすべての部位が一様に修飾される必要はない。逆に、２以上の修飾が単一のｄｓＲＮＡ化合物に、または該ｄｓＲＮＡ化合物の単一のヌクレオチドに組み入れられることもある。

好ましい修飾型のヌクレオシド間結合またはバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに、正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、その２’−５’結合アナログ、および隣接するヌクレオシドユニット対が３’−５’→５’−３’または２’−５’→５’−２’に連結されている逆方向のもの、が挙げられる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形のものも含まれる。

上記のリン原子を含む結合の調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，６９７，２４８号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。

好ましい修飾型のヌクレオシド間結合またはバックボーンであってその中（すなわち、オリゴヌクレオシド中）にリン原子を含んでいないものは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルの糖間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの糖間結合の混合したもの、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式の糖間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサンのバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンのバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルのバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびメチレンチオホルムアセチルのバックボーン；アルケンを
含んでいるバックボーン；スルファメートのバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノのバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドのバックボーン；アミドのバックボーン；ならびに構成部分Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２が混在するその他のもの、が挙げられる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。

他の好ましいオリゴヌクレオチドミメティックでは、ヌクレオシドユニットの糖およびヌクレオシド間結合（つまりバックボーン）の両方が、新しい基で置換される。核酸塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドミメティック）であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたものは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミドを含むバックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンで置換される。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分の原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497に見られる。

本発明のいくつかの好ましい実施形態は、ホスホロチオエート結合を備えたオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを備えたオリゴヌクレオシド、特に、上記に引用された米国特許第５，４８９，６７７号の‐ＣＨ_２‐ＮＨ‐Ｏ‐ＣＨ_２‐、‐ＣＨ_２‐Ｎ（ＣＨ_３）‐Ｏ‐ＣＨ_２‐［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる］、‐ＣＨ_２‐Ｏ‐Ｎ（ＣＨ_３）‐ＣＨ_２‐、‐ＣＨ_２‐Ｎ（ＣＨ_３）‐Ｎ（ＣＨ_３）‐ＣＨ_２‐、および‐Ｏ‐Ｎ（ＣＨ_３）‐ＣＨ_２‐ＣＨ_２‐［天然のホスホジエステルのバックボーンは、‐Ｏ‐Ｐ‐Ｏ‐ＣＨ_２‐として表される］、および上記に引用された米国特許第５，６０２，２４０号のアミドバックボーンを使用する。さらに好ましいのは、上記に引用された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。

本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、追加として、または別例として核酸塩基（当分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含む場合がある。本明細書中で使用されるように、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、その他の合成および天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル（および他のアルキル）誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル（および他のアルキル）誘導体、２−チ
オウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換型のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換型のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、が含まれる。

さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Co ncise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz,
J. L, ed. John Wiley and Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちあるものは、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。それらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており、（前掲、２７６−２７８ページ）、また現時点で好ましい塩基置換であり、２’−メトキシエチル糖修飾と併用した場合はさらに一層好ましい。

上記の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基のうち一部の調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；および同第５，８０８，０２７号；があり、これらはいずれも参照によって本願に組込まれる。

ある実施形態では、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに使用されるオリゴヌクレオチドは、追加として、または別例として１つ以上の置換型糖部分を含む場合がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの、すなわち：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル、あるいはＯ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル（該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニル）のうちの１つを含む。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２であり、式中、ｎおよびｍは１から約１０までである。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの、すなわち：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡを開裂する基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力
学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有するその他の置換基、のうちの１つを含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、さらに２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても知られている］（Martin et al, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）、つまりアルコキシアルコキ
シ基が挙げられる。さらなる好ましい修飾には、１９９８年１月３０日出願の米国特許第６，１２７，５３３号明細書（内容は参照により組込まれる）に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）がある。

他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の部位に、特に３’末端のヌクレオチド上または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド中の糖の３’位になされてもよい。

本明細書中で使用されるように、用語「糖置換基」または「２’−置換基」には、酸素原子とともに、または酸素原子を伴わずにリボフラノシル部分の２’位に取り付けられる基が挙げられる。糖置換基には、限定するものではないが、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾールおよび式（Ｏ−アルキル）_ｍ（ｍは１から約１０まで）のポリエーテルがある。これらのポリエーテルのうち好ましいものは、直鎖状および環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および（ＰＥＧ）含有基、例えばクラウンエーテルならびにOuchi et al., Drug Design and Discovery 1992, 9:93；Ravasio et al., J. Org. Chem. 1991, 56:4329；およびDelgardo et al., Critical Reviews
in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9:249（各々その全体が参照により本願に組み込まれる）に開示されているものである。さらなる糖修飾はCook, Anti-pain Drug Design, 1991, 6:585-607に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、およびアルキルアミノ置換は、「Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions」という発明の名称の米国特許第６，１６６，１９７号明細書（全体が参照に
より本願に組み込まれる）に述べられている。

本発明に適したさらなる糖置換基には、２’−ＳＲ基および２’−ＮＲ_２基（ここでＲはそれぞれ独立に水素、保護基または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニルあるいはアルキニルである）が含まれる。２’−ＳＲヌクレオシドは米国特許第５，６７０，６３３号（全体が参照により本願に組み込まれる）に開示されている。２’−ＳＲモノマーのシントンの組み込みは、Hamm et al., J Org. Chem., 1997, 62:3415-3420に開示され
ている。２’−ＮＲヌクレオシドは、Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281およびPolushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230に開示されてい
る。本発明に適したさらなる代表的な２’−置換基には、式ＩまたはＩＩのうちの１つを有するものが挙げられる。

上記式中、
Ｅは、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｎ（Ｑ_３）（Ｑ_４）またはＮ＝Ｃ（Ｑ_３）（Ｑ_４）であり；Ｑ_３およびＱ_４はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、係留部を備えているかまたは係留部を備えていないコンジュゲート基、固体支持体へのリンカーであるか；あるいは、Ｑ_３およびＱ_４が一緒になって、窒素保護基または環状構造であってＮおよびＯから選択された少なくとも１つの追加のヘテロ原子を任意選択で含むものを形成し；
ｑ_１は１〜１０の整数であり；
ｑ_２は１〜１０の整数であり；
ｑ_３は０または１であり；
ｑ_４は０、１または２であり；
Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ、独立に、Ｃ_４〜Ｃ_７シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１４アリールまたはＣ_３〜Ｃ_１５ヘテロシクリルであって、前記ヘテロシクリル基のヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択され；
Ｚ_４は、ＯＭ_１、ＳＭ_１、またはＮ（Ｍ_１）_２であって；Ｍ_１はそれぞれ、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ_２であり；Ｍ_２はＨまたはＣ_１〜Ｃ_８アルキルであり；
Ｚ_５は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１０ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル、Ｃ_６〜Ｃ_１４アリール、Ｎ（Ｑ_３）（Ｑ_４）、ＯＱ_３、ハロ、ＳＱ_３またはＣＮである。

代表的な式Ｉの２’−Ｏ−糖置換基は、「Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides」という発明の名称の米国特許第６，１７２，２０９号明細書（参照によってその全体が本願に組み込まれる）に開示されている。代表的な式ＩＩの環式２’−Ｏ−糖置換基は、「RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized」という発明の名称の米国特許第６，２７１，３５８号明細書（参照によってその全体が本願に組み込まれる）に開示されている。

さらに、リボシルの環の上にＯ−置換基を有する糖も本発明に適している。環のＯについての代表的な置換基には、限定するものではないが、Ｓ、ＣＨ_２、ＣＨＦ、およびＣＦ_２がある。例えば、Secrist et al., Abstract 21, Program and Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sep. 16-20, 1992を参照のこと。

オリゴヌクレオチドは、糖ミメティック、例えばシクロブチル部分をペントフラノシル糖の代わりに有していてもよい。そのような修飾糖の調製に関連した代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８
５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７、０５３１号 同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７００，９２０号；また同第５，８５９，２２１号があり、これらはいずれも参照によって本願に組込まれる。

追加の修飾が、オリゴヌクレオチド上の別の部位に、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に施されてもよい。例えば、本発明のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドに修飾を１つ追加することは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞への取り込みを増強する１つ以上の追加のリガンド以外の部分またはコンジュゲートを、オリゴヌクレオチドに化学結合させることを意味する。そのような部分としては、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4, 1053）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. NY. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg.
Med. Chem. Let, 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett.,
1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えば
ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリ
アミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923
）がある。

そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；
同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２
６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号があり、これらは各々が参照によって本願に組込まれる。

本発明はさらに、オリゴヌクレオチド内の特定の部位についてキラルに関してほぼ純粋なオリゴヌクレオチドを使用する組成物も含んでいる。キラルに関してほぼ純粋なオリゴヌクレオチドの例には、限定するものではないが、少なくとも７５％のＳｐまたはＲｐであるホスホロチオエート結合を有するもの（Cook et al., U.S. Pat. No. 5,587,361）、ならびにキラルに関してほぼ純粋な（ＳｐまたはＲｐの）アルキルホスホネート、ホスホロアミデートまたはホスホトリエステル結合を有するもの（Cook, placecountry-regionU.S. Pat. Nos. 5,212,295 and 5,521,302）がある。

ある例では、オリゴヌクレオチドは非リガンド基によって修飾される場合がある。多くの非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞への取り込みを増強するためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、そのようにコンジュゲートするための手法は科学文献から入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. NY. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪
鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ
ールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14:969）、あるいはア
ダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、あるいはオクタデ
シルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）である。そのようなオリゴヌクレオチ
ドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許文献は、上記に列挙されている。コンジュゲート実施の典型的なプロトコールは、配列の１つ以上の部位にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を要する。その後、該アミノ基を、適切なカップリング剤または活性化剤を使用して、コンジュゲートさせる分子と反応させる。コンジュゲート反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよいし、溶液相中でオリゴヌクレオチドを切断した後に実施してもよい。ＨＰＬＣによりオリゴヌクレオチドコンジュゲートを精製すると、通常純粋なコンジュゲートが得られる。

別例として、コンジュゲートさせる分子を、該分子中に存在するアルコール性基を介して、あるいはアルコール性基（ホスフィチル化されていてもよい）を有するリンカーを取り付けることによって、ホスホロアミダイトのようなビルディングブロックに変換してもよい。

重要なことは、上記手法のそれぞれが、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成に使用可能だということである。アミノが結合されたオリゴヌクレオチドは、カップリング試薬の使用により直接リガンドと接続されてもよいし、ＮＨＳまたはペンタフルオロフェノレートエステルとしてリガンドを活性化してから接続されてもよい。リガンドのホスホロアミダイトは、カルボキシル基のうちの１つにアミノヘキサノールリン
カーを取り付けてから末端のアルコール官能基をホスフィチル化することによって合成されうる。システアミンのようなその他のリンカーも、合成されたオリゴヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーにコンジュゲートするために利用可能である。

ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、神経障害性疼痛または炎症性疼痛のような、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現または活性に関連した疾患または障害を治療するのに有用である。

別の実施形態では、本発明は、Ｎａｖ１．８遺伝子の異なる領域を標的とするように設計された少なくとも２つのｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。この実施形態では、個々のｄｓＲＮＡは、参照によってここに組込まれる先の項に記載したように調製される。１つのｄｓＲＮＡは、Ｎａｖ１．８遺伝子の少なくとも１つの部分にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有することが可能であり；追加の、各々がＮａｖ１．８遺伝子の異なる部分にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡが調製される。複数のｄｓＲＮＡは同じ医薬組成物中で組み合わせられてもよいし、あるいは別々に製剤化されてもよい。個々に製剤化される場合は、個別のｄｓＲＮＡを含んでいる組成物は同じ担体を含んでも異なる担体を含んでもよく、同じ投与経路で投与されても異なる投与経路で投与されてもよい。さらに、個々のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、ほぼ同時に投与されても、連続して投与されても、あるいは投与日または治療期間を通じて予め設定された間隔で投与されてもよい。

本発明の医薬組成物はＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するのに十分な用量で投与される。本発明者らは、有効性が高められたことにより本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を驚くほど低用量で投与することができることを見出した。１日に被投与者の体重（キログラム）あたり５ｍｇのｄｓＲＮＡを最大用量とすると、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制または完全に抑止するのに、あるいは慢性疼痛を緩和するのに十分である。

一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日に被投与者の体重（キログラム）当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、好ましくは１日に体重（キログラム）当たり０．１〜２００マイクログラムの範囲、より好ましくは１日に体重（キログラム）当たり０．１〜１００マイクログラムの範囲、さらに好ましくは１日に体重（キログラム）当たり１．０〜５０マイクログラムの範囲、最も好ましくは１日に体重（キログラム）当たり１．０〜２５マイクログラムの範囲になるであろう。医薬組成物は１日に１回投与されてもよいし、あるいは、ｄｓＲＮＡが、その日を通じて適切な間隔で２、３、４、５または６回以上の分割用量として、または持続注入を使用して投与されてもよい。その場合、それぞれの分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは１日あたりの合計用量を達成するように相応に少なくなるはずである。投薬単位は、数日間にわたって送達されるように、例えば、数日間にわたりｄｓＲＮＡを持続的に放出する従来の徐放性剤型を使用して、調合されてもよい。徐放性剤型は当分野においてよく知られている。この実施形態では、投薬単位は１日の用量の倍数相当を含んでいる。

当業者には当然のことであるが、ある種の要因は対象を有効に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があり、該要因は、限定するものではないが、例えばその疾患または障害の重症度、事前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、ならびにその他の疾患の存在である。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療は、単回の治療であってもよいし、一連の治療を含んでもよい。本明細書中に別記されるように、本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡについての有効な投薬量およびｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の評価は、従来の方法論を用いて為されてもよいし、あ
るいは適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて為されてもよい。

マウス遺伝学の進歩により、疼痛のような様々なヒト疾患に関する研究のための多くのマウスモデルが生み出されている。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験、ならびに治療上有効な用量の決定に使用される。

本発明に包含される医薬組成物は、当分野において周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定することなく、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、硬膜外、髄腔内、脳室内、実質内（末梢神経系または中枢神経系内）、皮下、経皮、鼻腔内、気道内（エアロゾル）、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与により投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ポンプなどを用いて持続注入により髄腔内に、あるいはボーラス注射によって髄腔内に投与される。他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ポンプなどを用いて持続注入により静脈内に、あるいはボーラス注射によって静脈内に投与される。

髄腔内、脳室内、筋肉内、実質内（末梢神経系または中枢神経系内）、皮下および静脈内での使用については、本発明の医薬組成物は、一般に、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化された無菌の水性の溶液または懸濁液中に提供されることになる。適切な水性ビヒクルには、リンゲル液および等張食塩水がある。好ましい実施形態では、担体は水性緩衝液単独で構成される。この文脈において「単独で」とは、Ｎａｖ１．８遺伝子を発現する細胞へのｄｓＲＮＡの取り込みに影響を与えるかまたは該取り込みを仲介するおそれのある補助剤またはカプセル化物質が存在しないことを意味する。そのような物質としては、下記に述べるように、例えば、リポソームまたはカプシドのようなミセル構造が挙げられる。驚いたことに、本発明者らは、単に裸のｄｓＲＮＡ（該ｄｓＲＮＡはＮａｖ１．８遺伝子の発現を有効に抑制する）および生理学的に許容可能な溶媒のみを含んでいる組成物が、細胞に取り込まれることを発見した。ｄｓＲＮＡを細胞培養物に導入するためには、マイクロインジェクション、リポフェクション、ウイルス、ウイロイド、カプシド、カプソイド、またはその他の補助剤が必要であるが、驚いたことに、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｄｓＲＮＡの取り込みにはこれらの方法および薬剤は必要ではない。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントゴムのような懸濁化剤、ならびにレシチンのような湿潤剤を含みうる。水性懸濁液に適した保存剤には、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートがある。

本発明の有用な医薬組成物には、体内から急速に消失しないようにｄｓＲＮＡを保護するカプセル化製剤、例えば制御放出製剤、例えば植込剤およびマイクロカプセル化された送達システムも含まれる。生物分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明白であろう。材料も、アルザコーポレイション（Alza Corporation）およびノバ製薬会社（Nova Pharmaceuticals, Inc）から商業的に購入することができる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原
に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的設定されたリポソームを含む）も、薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、当業者に周知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０６３０９号；および欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−４３０７５号（これらの文献は参照により本願に組込まれる）に記載のようにして調製することができる。

前述の小さい干渉ＲＮＡのベクターを使用して、本発明は、小さい干渉ＲＮＡを神経系内または脳内の標的位置に送達するためのデバイス、システムおよび方法をも提供する。想定される送達経路は、埋め込み型、留置型、髄腔内、脳室内、または実質内カテーテルの使用によるものであり、該カテーテルは、本発明のｄｓＲＮＡを含んでいる少量の液体
を局所の神経または局所の脳組織に直接、あるいはこれらの組織を取り囲んでいる体液中に注入するための手段を提供する。これらのカテーテルの基端は、患者の体または頭蓋に外科的に取り付けられた埋め込み型、髄腔内、または大脳内アクセスポートに、あるいは患者の胴に配置された埋め込み型薬物ポンプに接続されうる。

別例として、埋め込み式ポンプのような移植可能な送達デバイスが使用されてもよい。本発明の範囲内の送達デバイスの例には、治験中のデバイスであるモデル８５０６（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のメドトロニック社（Medtronic, Inc.）製）があり、該デ
バイスは、身体または頭蓋上で皮下に移植可能であり、治療薬を神経または脳に送達可能なアクセスポートを提供する。送達は、定位的に埋め込まれたポリウレタンカテーテルを介して為される。モデル８５０６のアクセスポートとともに機能しうる２つのカテーテルモデルには、米国特許第６，０９３，１８０号（参照により本願に組み込まれる）に開示されている、大脳の脳室へ送達するためのメドトロニック社製のモデル８７７０脳室カテーテル、ならびに、米国特許出願第０９／５４０，４４４号および同第０９／６２５，７５１号（参照により本願に組み込まれる）に開示されている、脳組織自体へ送達（つまり実質内へ送達）するためのメドトロニック社製ＩＰＡ１カテーテルが含まれる。後者のカテーテルは、該カテーテルの通路に沿った複数の部位に治療薬を送達するために、先端に複数の出口を有している。前述のデバイスに加えて、本発明による小さい干渉ＲＮＡベクターの送達は、種々様々のデバイス、例えば、限定するものではないが、米国特許第５，７３５，８１４号、同第５，８１４，０１４号および同第６，０４２，５７９号（いずれも参照によって本願に組込まれる）を用いて達成することができる。本発明の教示を用いれば、また当業者であれば、これらおよびその他のデバイスおよびシステムが、本発明による疼痛治療のための小さい干渉ＲＮＡベクターの送達に適切でありうることを認識するであろう。

１つのそのような実施形態では、該方法は、カテーテルの基端に接続されたポンプを身体または脳の外側に移植するステップと、ポンプを操作して、少なくとも１つの小さい干渉ＲＮＡまたは小さい干渉ＲＮＡベクターの所定用量を、カテーテルの放出部を通して送達するステップとをさらに含む。さらなる実施形態は、前記身体または脳の外側のポンプへの、少なくとも１つの小さい干渉ＲＮＡまたは小さい干渉ＲＮＡベクターの供給を、周期的に更新する追加のステップを含む。

したがって、本発明は、米国特許第５，７３５，８１４号および同第６，０４２，５７９号に教示されているもののような移植可能なポンプおよびカテーテルを使用して、ならびに、米国特許第５，８１４，０１４号に教示されているもののような、神経または脳に送達される小さい干渉ＲＮＡベクターの量を制御する注入システムの一部としてのセンサをさらに使用して、小さい干渉ＲＮＡベクターを送達することを含む。その他のデバイスおよびシステム、例えば、いずれも参照により本願に組込まれる米国特許出願第０９／８７２，６９８号（２００１年６月１日出願）および同第０９／８６４，６４６号（２００１年５月２３日出願）に開示されたデバイスおよびシステムを、本発明の方法に従って使用することもできる。

そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を測定する手法によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の策定において使用することができる。本発明の組成物の用量は、毒性をほとんどまた
は全く伴わないＥＤ５０を含む、循環血中濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変動しうる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療上有効な量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（つまり症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、該化合物の循環血漿中濃度範囲、または適切な場合には標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿中濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度減少の達成）を達成するように、動物モデルにおいて策定可能である。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィによって測定可能である。

上記に議論したように、ｄｓＲＮＡを個々にまたは複数として投与することに加えて、本発明のｄｓＲＮＡは、疼痛の治療に有効な他の既知の作用薬と組み合わせて投与することができる。どの場合も、投与する医師は、当分野で既知または本明細書に記載の標準的な有効性の尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節することができる。

Ｎａｖ１．８遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療する方法
１つの実施形態では、本発明は、神経障害性疼痛または炎症性疼痛のような、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現によって媒介される病的状態を有する対象の治療方法を提供する。この実施形態では、ｄｓＲＮＡは、Ｎａｖ１．８タンパク質の発現をコントロールするための治療薬として作用する。該方法は、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の医薬組成物を患者（例えばヒト）に投与することを含む。特異性が高いので、本発明のｄｓＲＮＡはＮａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的とする。

疼痛
本明細書で使用されるように、用語「疼痛」は当分野で認識されており、対象（例えばヒトのような哺乳動物）における、有害な化学的、機械的、または温度的刺激によって誘発された身体感覚を包含する。用語「疼痛」は、慢性疼痛、例えば下背痛；関節炎（例えば変形性関節症）による疼痛；関節痛（例えば膝痛または手根管症候群）；筋筋膜疼痛、および神経障害性疼痛を含む。用語「疼痛」はまた、急性疼痛、例えば筋肉緊張および捻挫に関連した疼痛；歯痛；頭痛；外科手術に関連した疼痛；ならびに様々な形の組織傷害（例えば炎症、感染、虚血）に関連した疼痛を含む。

「神経障害性疼痛」は、中枢神経系または末梢神経系の損傷または疾患を原因とする疼痛を指す。組織傷害を原因とする即時の（急性）疼痛とは対照的に、神経障害性疼痛は外傷の数日または数か月後に発症しうる。神経障害性疼痛は、長期にわたる、すなわち慢性であることが多く、持続期間は組織の修復期間に限られない。神経障害性疼痛は自然に生じる場合もあるし、通常は痛みのない刺激の結果として生じる場合もある。神経障害性疼痛は、異常な体性感覚プロセスを原因とし、慢性の感覚障害、例えば自発痛、痛覚過敏（すなわちその刺激について正当な感覚よりも強い疼痛を知覚すること）、および異痛症（すなわち通常は無痛の刺激により疼痛経験が誘発される状態）に関係している。神経障害性疼痛には、その他の原因の中では、限定するものではないが、末梢神経の損傷、ウイルス感染、糖尿病、化学療法、カウザルギー、神経叢引き抜き、脊髄損傷、神経腫、四肢切断、血管炎、外科手術による神経損傷、慢性アルコール中毒症による神経損傷、甲状腺機能低下、尿毒症およびビタミン欠乏を原因とする疼痛がある。神経障害性疼痛は、がんに関連した疼痛の１つのタイプである。がん性疼痛は「侵害受容性」または「混在型」の場合もある。

「慢性疼痛」は、３か月より長く続く疼痛として定義することができ（Bonica, Semin.
Anesth. 1986, 5:82-99）、慣例的な疼痛管理方法には十分には適さない、間断のない執拗な疼痛を特徴としうる。慢性疼痛には、限定するものではないが、炎症性疼痛、術後痛、がん性疼痛、転移がんに関連した変形性関節症疼痛、化学療法で引き起こされた疼痛、三叉神経痛、急性ヘルペス神経痛およびヘルペス後神経痛、糖尿病性神経障害、関節炎による疼痛、関節痛、筋筋膜疼痛、カウザルギー、腕神経叢引き抜き、後頭神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー、線維筋痛、痛風、幻想肢痛、熱傷痛、脊髄損傷に関連した疼痛、多発性硬化症、反射性交感神経性ジストロフィーおよび下背痛、ならびにその他の種類の神経痛、神経障害性および特発性疼痛症候群が挙げられる。

「侵害受容性の疼痛」は、体性または内臓性のいずれかの疼痛感受性神経繊維の活性化に起因する。侵害受容性の疼痛は一般に、直接の組織損傷に対する応答である。最初の損傷により、ブラジキニン、セロトニン、サブスタンスＰ、ヒスタミンおよびプロスタグランジンを含むいくつかの化学物質が放出される。体性神経が関与する場合、疼痛は通常疼くような感覚または圧迫されるような感覚として感じられる。

語句「疼痛および関連障害」において、用語「関連障害」は、疼痛を引き起こすかまたは疼痛に関係があるか、あるいは疼痛と同様のメカニズムを有することが示されている障害を指す。これらの障害には、中毒、発作、脳卒中、虚血、神経変性障害、不安、抑うつ、頭痛、喘息、リウマチ性疾患、変形性関節症、網膜症、炎症性の眼障害、そう痒症、潰瘍、胃の病変、尿失禁、炎症性または不安定性の膀胱障害、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、機能性消化不良、食道起原と推定される機能性胸痛、機能性嚥下障害、非心臓性胸痛、症候性胃食道疾患、胃炎、呑気症、機能性便秘、機能性下痢、おくび、慢性機能性腹痛、反復性腹痛（ＲＡＰ）、機能性腹部膨満症、機能性胆道痛、機能性失禁、機能性肛門・直腸痛、慢性骨盤痛、骨盤底の共同運動障害、詳細不明の機能性肛門・直腸障害、胆嚢仙痛、間質性膀胱炎、月経困難症、ならびに性交疼痛症が挙げられる。

このように本発明は、神経障害性疼痛および炎症性疼痛を含む疼痛を治療するための、特に髄腔内注入または注射により、あるいは静脈内注入または注射によりヒトに投与される抗Ｎａｖ１．８ ｄｓＲＮＡの使用を提供する。

本発明に包含される医薬組成物は、当分野で周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定するものではなく、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、硬膜外、髄腔内、脳室内、実質内（末梢神経系または中枢神経系内）、皮下、経皮、鼻腔内、気道内（エアロゾル）、鼻内、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与、ならびに硬膜外投与により投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ポンプなどによる持続注入で髄腔内に、あるいはボーラス注射により髄腔内に投与される。他の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ポンプなどによる持続注入で静脈内に、あるいはボーラス注射により静脈内に投与される。

Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。該方法は、標的Ｎａｖ１．８遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の組成物を哺乳動物に投与することを含む。特異性が高いため、本発明のｄｓＲＮＡは、標的Ｎａｖ１．８遺伝子のＲＮＡ（第一次ＲＮＡまたはプロセシング後ＲＮＡ）を特異的に標的とする。ｄｓＲＮＡを使用してこれらのＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法は、本明細書中に別記されるようにして実施することができる。

１つの実施形態では、該方法はｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、該ｄｓ
ＲＮＡは、治療される哺乳動物のＮａｖ１．８遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する。治療される生物がヒトのような哺乳動物である場合、組成物は、当分野で周知の任意の手段、例えば、経口または非経口の経路に限定するものではなく、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、硬膜外、髄腔内、脳室内、実質内（末梢神経系または中枢神経系内）、皮下、経皮、鼻腔内、気道内（エアロゾル）、直腸内、膣内および局所（口腔内および舌下など）への投与により投与可能である。好ましい実施形態では、組成物は、髄腔内への注入または注射により、あるいは静脈内への注入または注射により投与される。

別途定義のないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または等価である方法および材料は本発明の実行または試験において使用することができるが、適切な方法および材料について下記に述べる。本明細書において言及されたすべての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照によってその全体が組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うことになる。さらに、材料、方法および実施例は単なる例証であり、限定することを意図したものではない。

Ｎａｖ１．８遺伝子の遺伝子ウォーキング
対象とする４生物種のＮａｖ１．８遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを設計するために、多段階の配列分析法でｓｉＲＮＡを同定した。

ＢｉｏＥｄｉｔ配列アラインメントエディタ（BioEdit Sequence Alignment Editor）
（バージョン７．０．４．１）のＣｌｕｓｔａｌＷマルチアラインメント機能を用いて、ヒト（ＮＭ＿００６５１４）、マウス（ＮＭ＿００９１３４）、ラット（ＮＭ＿０１７２４７）およびイヌ（ＮＭ００１００３２０３）のＮａｖ１．８ ｍＲＮＡ配列の広域アラインメントを実施した。

前記ソフトウェアに組み込まれた配列分析機能により、保存領域を同定した。保存領域は、内部にギャップを含まない、アラインしたすべての配列についての長さが最小１９塩基の連続配列として定義した。保存領域の配列の部位はヒトの配列に従って数えた。

ホワイトヘッド研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research）のｓｉＲＮ
Ａ設計ウェブインターフェース（http://jura.wi.mit.edu/siRNAext/）を使用して、保存領域を標的とするすべてのｓｉＲＮＡ候補を同定し、また該候補それぞれについてヒト、マウスおよびラットのＲｅｆＳｅｑデータベース中の配列に対する標的外（オフターゲット）の適合を同定した。交差反応性の基準を満たすｓｉＲＮＡを候補物群から選び出し、ソフトウェアに組み込まれたオフターゲット分析に供した。これについては、選択されたすべてのｓｉＲＮＡについて、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔアルゴリズムによってＮＣＢＩのヒト、マウスおよびラットＲｅｆＳｅｑデータベースに対して３回分析した。

ｂｌａｓｔの結果をダウンロードし、そのアンチセンス種について最もオフターゲットの適合を生じやすいものの実体を知り、またミスマッチを生じる部位を知るために、ｐｅｒｌスクリプトによって分析した。

全てのｓｉＲＮＡ候補を予測された特性に従って格付けした。これについては、異なる基準を適用してｓｉＲＮＡを次の特性、すなわち：
− 反応性の基準：ヒト、マウス、ラットおよびイヌの配列を標的とする
− 特異性の基準：ヒトに対して高度に特異的、少なくともラットおよびマウスに対し
て特異的
に従って分類した。

適用した基準を満たした２つのｓｉＲＮＡを「多生物種を標的とするｓｉＲＮＡ」とした。
より多くのｓｉＲＮＡを同定するために、ｓｉＲＮＡ同定ステップの第２回を、イヌの配列との反応性が無いためそれまで除かれていた領域を追加して同様に実施した。

その結果得られた、上述の基準に適合する１０個のｓｉＲＮＡの集まりを、「ヒト／ラット／マウスを標的とするｓｉＲＮＡ」とした。
ｓｉＲＮＡ設計プロセスの第３回は、マウスとの交差反応性を無視して実施した。

すべての候補ｓｉＲＮＡについて、以下の基準に従って３ステップで再度抽出し格付けした。
ステップ１：
− 反応性の基準：ヒト、ラットおよびマウスの配列を標的とする
− 特異性の基準：ヒトおよびラットに対して高度に特異的、マウスに対して中程度に特異的
→ ４個のｓｉＲＮＡ（「ヒト／ラット／マウスを標的とするｓｉＲＮＡ」の集まりに追加）
ステップ２：
− 反応性の基準：ヒトおよびラットの配列を標的とする
− 配列内部の基準：列内に連続４以上のＧが存在しない
− 特異性の基準：ヒトに対して高度に特異的
→ １９個のｓｉＲＮＡ
ステップ３：
− 反応性の基準：ヒトおよびラットの配列を標的とする
− 特異性の基準：ラットに対して高度に特異的、ヒトに対して特異的、および好ましいｄｄＧ値
→ １個のｓｉＲＮＡ
ステップ２および３から得られた集まり（２０個のｓｉＲＮＡ）を、「ヒト／ラットを標的とするｓｉＲＮＡ」とした。

これらのｉｎ ｓｉｌｉｃｏで選択された３６個のｓｉＲＮＡを合成した（表１）。
さらなる配列の選択は、種間の交差反応性を選択基準として使用しなかったこと、すなわち配列の選択をヒトのＮａｖ１．８配列だけを基準として実施したことを除き、上記の一般化された方法を使用して実施した。さらに、ＦＡＳＴＡでの最適合に基づいた標的外スコアならびに標的外遺伝子の候補の数を基準として格付した。これらのｓｉＲＮＡを表４に示す。

化学修飾によるｓｉＲＮＡの最適化
アンチセンスの分野の研究者が経験してきたように、リボ核酸は、事実上すべての生物学的環境中に存在する様々なヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼなど）によって急速に分解されることが多い。この脆弱性は、ヌクレアーゼがもはや攻撃できないようにこれらのオリゴヌクレオチドを化学修飾することにより、回避される可能性がある。従って、表１のｓｉＲＮＡは化学修飾されたオリゴヌクレオチドを表わし、これらの化学修飾ｓｉＲＮＡを、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現（Ｎａｖ１．８のｍＲＮＡレベル）に対する抑制活性に関して試験した。

ｄｓＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書中で具体的に示されない場合、その試薬は、分子生物学に適用
するための品質／純度規格の分子生物学用試薬を供給する任意の業者から入手可能である。

ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成装置（ドイツ連邦共和国ダルムシュタット所在のApplied Biosystems, Applera Deutschland GmbH）および固体支持体として多孔質ガラス（ＣＰＧ、５００Å、ドイツ連邦共和国ハンブルク所在のProligo Biochemie GmbH）を使用して、１マイクロモル規模で固相合成により作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチル・ヌクレオチド含有ＲＮＡは、対応するホスホロアミダイトおよび２’−Ｏ−メチル・ホスホロアミダイト（ドイツ連邦共和国ハンブルク所在のProligo Biochemie GmbH）をそれぞれ使用した固相合成によって生成させた。これらのビルディングブロックを、Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley and Sons, Inc.（米国ニューヨーク州ニューヨーク所在）に記載のような標
準的なヌクレオシド・ホスホロアミダイトの化学的手法を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（英国グラスゴー所在のChruachem Ltd）溶液に置き換えることにより導入した。さらなる補助試薬はMallinckrodt Baker（ド
イツ連邦共和国グリースハイム所在）から入手した。

陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗製オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製は、確立された手法によって実行した。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ、ドイツ連邦共和国ウンターシュライスハイム（Unterschleissheim）所在のBeckman Coulter GmbH
）を使用して、波長２６０ｎｍにおける各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収によって測定した。二本鎖ＲＮＡは、相補鎖の等モル溶液をアニーリング用バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却することにより生成させた。アニーリングさせたＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。

３’−コレステロールコンジュゲート（３’にコレステロールがコンジュゲートされた）ｓｉＲＮＡ（本明細書では、コレステリル基への連結がホスホジエステル基を介するかホスホロチオエートジエステル基を介するかによって‐Ｃｈｏｌまたは‐ｓＣｈｏｌと称する）の合成用には、適切に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成に使用した。修飾固体支持体は以下のように準備した。

ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボン酸 ＡＡ

４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、撹拌かつ氷冷したエチルグリシネート塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水（５０ｍＬ）中溶液に添加した。その後、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、該混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、該溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、蒸発濃縮した。残留物を蒸留してＡＡを得た（２８．８ｇ、６１％）。

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ

Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解して氷冷した。０℃の該溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を添加した。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボン酸（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。該溶液を室温にしてさらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣによって確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加してジイソプロピル尿素を沈澱させた。該懸濁液をろ過した。ろ液を、５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して粗製生成物を得て、該粗製生成物をカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製して１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを生成した。

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃のジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンに溶解した。該溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗製生成物をその塩酸塩に転化することよって精製した。

３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル ＡＤ

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中に添加した。この懸濁物を氷上で０℃に冷却した。該懸濁物にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。該反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した（１０．３ｇ、９２％）。

１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル ＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン３０ｍＬ中でスラリー化した。該混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステル体ＡＤを、撹拌しながらゆっくり２０分以内に添加した。添加の間、温度は５℃未満に維持した。０℃で３０分間撹拌を続け、氷酢酸１ｍＬを添加し、直ちに４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏの水中（４０ｍＬ）溶液を添加した。得られた混合物を各１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を、各１０ｍＬのリン酸バッファーで２回洗浄し、脱水し、蒸発乾固させた。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬずつの冷炭酸バッファー（ｐＨ９．５）３部で抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、４０ｍＬずつのクロロホルム５部で抽出して合わせ、脱水し、蒸発乾固させた。残留物を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィによっ
て精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステルを得た（３９％）。

［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＦ

ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の還流混合物に、メタノール（２ｍＬ）を１時間かけて少量ずつ添加した。還流温度で撹拌を１時間継続した。室温に冷却した後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空下で濃縮して得た生成物をカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）で精製した（８９％）。

（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＧ

ジオールであるＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）とともに真空内で蒸発させて乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。この反応は、室温で一晩実施した。メタノールを添加して反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、濃縮した。残存ピリジンを、トルエンとともに蒸発させて除去した。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィで精製した（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３中でＲｆ＝０．５）（１．７５ｇ、９５％）。

コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル ＡＨ

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で真空中にて一晩乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルア
ミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液をアルゴン大気下に室温で１６時間撹拌した。その後、該溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮乾固した。残留物をそのまま次のステップに使用した。

コレステロールで誘導体化したＣＰＧ ＡＩ

コハク酸塩であるＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２５ｍＬ）中溶液、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中溶液を連続して添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．６ｍｌ）中溶液を添加した。この反応混合物の色は明るいオレンジ色になった。この溶液を、手首運動型（wrist-action）振盪機で短時間激しく撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。この懸濁物を２時間激しく撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗でろ過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続的に洗浄した。未反応のアミノ基を、無水酢酸／ピリジンを使用してマスキングした。ＣＰＧの装荷の達成は、ＵＶ測定法により測定された（３７ｍＭ／ｇ）。

５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書では「５’−Ｃ３２−」と称する）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書では「５’−Ｃｈｏｌ」と称する）を有するｓｉＲＮＡの合成は、ＷＯ２００４／０６５６０１に記載のようにして実施したが、ただしコレステリル誘導体については、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して酸化ステップを実施し核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入した。

核酸配列は、標準名称法を用いて、特に表２の略語を用いて以降に示す。

Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクションされたヒトＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対するＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの単回投与でのスクリーニング。

表１および表４のＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡすべてについて、最初に、Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクションされたヒトＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現を低減する活性に関して１００ｎＭ（表１）または５０ｎＭ（表４）の単一用量で試験した。トランスフェクションの１日前に、Ｃｏｓ−７細胞（ＤＳＭＺ、ドイツ連邦共和国ブラウンシュワイク所在）を、９６ウェルプレート（Greiner Bio-One GmbH、ドイツ連邦共和国フリッケンハウゼン（Frickenhausen）所在）の１ウェルあたり細胞１．５×１０^４個として、１００μｌの
増殖培地（ダルベッコのＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．２μｇ／ｍｌ重炭酸ナトリウム、１００ｕペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、いずれもドイツ連邦共和国ベルリン所在のBiochrom AGより）中に播種した。ｓｉＲ
ＮＡトランスフェクションの４時間前に、２０ｎｇ／ウェル（表１）または５０ｎｇ／ウェル（表４）のプラスミドを、ｓｉＲＮＡについて下記に述べるようにしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）とともにトランスフェクションしたが、このとき該プラスミドはＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈して１ウェルあたりの最終体積を１２．５μｌとし、プレート全体用にマスターミックスとして調製した。

ｓｉＲＮＡトランスフェクションは３連で実施した。各ウェルについて、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen GmbH、ドイツ連邦共和国カールスル
ーエ所在）を１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）と混合し、室温で１５分間インキュベーションした。１００μｌのトランスフェクション体積中でｓｉＲＮＡ濃度を１００ｎＭとする場合は、１ウェルあたり２μｌの５μＭ ｓｉＲＮＡを１０．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物と合わせ、再び室温で１５分間インキュベーションした。そのインキュベーション時に、細胞から増殖培地を取り除き、１ウェルあたり７５μｌの新鮮な培地に交換した。６つのウェルでは、増殖培地を１００μｌの新鮮な培地に交換し、下記に述べるように細胞溶解用混合物を加えて細胞を直ぐに溶解し、プラスミド中のＮａｖ１．８−ｃＤＮＡに起因するｂＤＮＡアッセイのバックグラウンド値を分析した。ｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合物を全部（１ウェルあたり２５μｌずつ）細胞に施用し、細胞を、加湿型インキュベータ（Heraeus GmbH、ドイツ連邦共和国ハーナウ所在）にて３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間インキュベーションした。

細胞を、各ウェルに５０μｌの細胞溶解用混合物（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（Ｒ）ｂＤＮＡキット（米国フレモント所在のGenospectra）由来）を適用することによりハーベスト
し、５３℃で３０分間溶解させた。その後、５０μｌの溶解産物を、ヒトＮａｖ１．８およびヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセット（プローブセットの配列については以下を参照）とともにインキュベーションし、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅの製造業者のプロトコールに従って処理した。化学発光を、Ｖｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Perkin Elmer、ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン所在）でＲＬＵ（相対発光量）として測定し、ヒトＮａｖ１．８プローブセットについて得られた値を、各ウェルについてのそれぞれのヒトＧＡＰＤＨ（ミドリザル（Cercopithecus aethiops）のＧＡＰＤＨ配列は今のところ未知）の値に対して標準化した。プラスミドのトランスフェクションの４時間後に溶解させた細胞で得られた値を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に溶解させた細胞で得られた値から差し引いた。Ｎａｖ１．８を標的としたｓｉＲＮＡで得られた値を、無関係なｓｉＲＮＡ（Ｃ型肝炎ウィルスを標的とするもの）で得られた値（１００％とする）に関してさらに標準化した。

図１は、表１のｓｉＲＮＡを１００ｎＭの単一用量で試験した代表的な実験の結果を示し、表４は追加のｓｉＲＮＡについての５０ｎＭ用量での結果を示している。いくつかのｓｉＲＮＡ（表１および４）は、試験した用量において、Ｎａｖ１．８でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞においてＮａｖ１．８ ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５０％低減するのに有効であった。

Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクションされたヒトＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対する、選択されたｓｉＲＮＡの用量−応答曲線
単一用量でのスクリーニング（図１の結果）から得た、Ｎａｖ１．８に対するいくつかの有効なｓｉＲＮＡについて、用量−応答曲線によってさらに特徴解析した。用量−応答曲線については、トランスフェクションを上記の単一用量でのスクリーニングのように実施し、ただしｓｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）を次のとおり、すなわち１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、１、０．１４、０．０５、０．０１５、０．００５およびｍｏｃｋ（ｓｉＲＮＡなし）とした。ｓｉＲＮＡは、上記のプロトコールに従ってＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈して最終体積を１２．５μｌとした。

３回の独立した用量応答実験を実施し、用量−応答曲線（ＤＲＣ）を生成した。用量−応答曲線には再現性がみられた。結果の要約を表３に示す。

Ｎａｖ１．５ ｍＲＮＡを対象としたＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの特異性試験
Ｎａｖ１．５は、Ｎａｖ１．８と近縁のＮａＶサブタイプであるが、正常な心臓機能において重要な役割を有している。したがって、Ｎａｖ１．８に選択的なｓｉＲＮＡがＮａｖ１．５の発現を抑制しないことを確認することは重要である。いくつかのｓｉＲＮＡについて、これらのｓｉＲＮＡを用いて、内在性のヒトＮａｖ１．５を発現するＳＷ６２０細胞をトランスフェクションし、Ｎａｖ１．５ ｍＲＮＡのレベルを評価することにより、Ｎａｖ１．８に対する特異性を試験した。対照の無関係なｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５００２）もＳＷ６２０細胞にトランスフェクションした。Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡを、次の用量：１２００ｎＭ、４００ｎＭ、１３３．３ｎＭ、４４．４ｎＭ、１４．８ｎＭ、４．９ｎＭ、１．６ｎＭおよびｍｏｃｋ（ｓｉＲＮＡなし）について試験した。Ｎａｖ１．８を標的とする１つのｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６２１７）については、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１ｕＭで試験した。その後、Ｎａｖファミリー中で最もＮａｖ１．８との相同性の高いタンパク質をコードするＮａｖ１．５ ｍＲＮＡの発現を定量した。

トランスフェクションの１日前に、ＳＷ６２０細胞（LCG Promochem、ドイツ連邦共和
国ヴェーゼル所在）を、９６ウェルプレート（Greiner Bio-One GmbH、ドイツ連邦共和国フリッケンハウゼン所在）の１ウェルあたり細胞１．５×１０^４個として、１００μｌの増殖培地（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ Ｌ−１５培地、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｕペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、いずれもドイツ連邦共和国ベルリン所在のBiochrom AGより）中に播種した。

ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは３連で実施した。各ウェルについて、０．６μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴＭ）（Invitrogen GmbH、ドイツ連邦共和国カール
スルーエ所在）を２．４μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ（Invitrogen）と混合し、室温で１０分間インキュベーションした。１００μｌのトランスフェクション体積中でｓｉＲＮＡ濃度を１２００ｎＭにする場合は、１ウェルあたり５μｌの２４μＭ ｓｉＲＮＡを１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物と合わせ、再び室温で２０分間インキュベーションした。そのインキュベーション時に、
細胞から増殖培地を取り除き、血清を含まない新鮮な増殖培地８０μｌ／ウェルに交換した。ｓｉＲＮＡ−Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合物を全部（１ウェルあたり２０μｌずつ）細胞に施用し、細胞を、加湿型インキュベータ（Heraeus GmbH、ドイツ連邦共和国ハーナウ所在）にて３７℃でＣＯ_２を加えずに２４時間インキュベーションした。

細胞を、各ウェルに細胞溶解用混合物（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（Ｒ）ｂＤＮＡキット（米国フレモント所在のGenospectra）に含まれる）５０μｌを適用することによりハーベ
ストし、５３℃で３０分間溶解させた。その後、５０μｌの溶解産物を、ヒトＮａｖ１．５およびヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセット（プローブセットの配列については以下を参照）とともにインキュベーションし、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅの製造業者のプロトコールに従って処理した。化学発光を、Ｖｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Perkin Elmer、ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン所在）でＲＬＵ（相対発光量）として測定し、ヒトＮａｖ１．５プローブセットについて得られた値を、各ウェルについてそれぞれのヒトＧＡＰＤＨの値に対して標準化した。無関係な対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ型肝炎ウィルスを標的とするもの）を陰性対照として使用した。

図２は結果を示している。試験した濃度では、Ｎａｖ１．８を標的とする選択されたｓｉＲＮＡは、無関係な対照ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−５００２）と比較してＮａｖ１．５
ｍＲＮＡの有意な用量依存的抑制を示さず、これらのＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡがＮａｖ１．５に比べてＮａｖ１．８に対して特異的であることが確認された。

さらに、１ｕＭまでの濃度では、ＡＬ−ＤＰ−６２１７はＮａｖ１．５ ｍＲＮＡの有意な抑制を示さず（データは示さない）、このＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡがＮａｖ１．５に比べてＮａｖ１．８に対して特異的であることが確認された。

ラット後根神経節細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対するＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの単一用量によるスクリーニング。

Ｃｏｓ−７細胞にトランスフェクションされたヒトＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現について得られた結果を確認および拡張するために、表１のＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡを、ラット後根神経節（ＤＲＧ）細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８のｍＲＮＡ発現を低減する活性に関して２００ｎＭの単一用量で試験した。

ＤＲＧ細胞を生後３〜６日のスピローグ・ドーリー・ラットから分離した。ＤＲＧを切開し、細胞を、Ｓ−ＭＥＭ（Gibco）中に０．２８Ｗｕｎｓｃｈユニット／ｍｌのリベラ
ーゼブレンザイム（Liberase Blendzyme（Roche））溶液とともに３７℃で３５分間イン
キュベーションすることにより、解離させて単細胞とした。この細胞懸濁液をあらかじめ組織培養用プレートに播種し、非ニューロン細胞を除いた。その後、ニューロンを、組織培養用Ｂｉｏｃｏａｔ^ＴＭＰＤＬ ポリＤ−リジン／ラミニン９６ウェルプレート（BD Biosciences、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在）を用いて、Ｆ１２−ＨＡＭ培地にグルタミン（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）と５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、加熱して不活性化）および５％ウマ血清（加熱して不活性化）（いずれもInvitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）とを含めて５０ｎｇ／ｍｌマウス神経成長因子２．５Ｓ（ＮＧＦ；Promega Corp.、米国ウィスコンシン
州マディソン所在）を補足した培地中に播種し、トランスフェクションまで加湿型インキュベータ中で３７℃、５％ＣＯ_２に維持した。

Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのスクリーニングは、ＤＲＧ培養物中２００ｎＭで２連とし
て、脂質配合系のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ^ＴＭトランスフェクション試薬（Qiagen
GmbH、ドイツ連邦共和国ヒルデン所在、カタログ番号３０１５２５）、特異的なＲＮＡ
濃縮試薬（Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｒ^ＴＭ）およびＲＮＡ濃縮用バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＥＣ−Ｒ^ＴＭ）を使用して、ｓｉＲＮＡ：Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｒ^ＴＭ比（μｇ：μｌ）を常に１：２に、またｓｉＲＮＡ：ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ^ＴＭ比（μｇ：μｌ）を常に１：１２に維持しながら実施した。

ＤＲＧニューロンを、プレート播種の２４時間後にトランスフェクションした。各ウェルについて、０．５２μｌのＥｎｈａｎｃｅｒ Ｒ^ＴＭを最初に１３．６８μｌのＢｕｆｆｅｒ ＥＣ−Ｒ^ＴＭと混合した。アニーリングバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中２５μＭ溶液のＡＬ−ＤＰ−５９８７を０．８μｌ（０．２６μｇ）、あるいはアニーリングバッファー０．８μｌ（ｓｉＲＮＡを含まない対照）を添加し、混合物を室温で５分間インキュベーションした。３．１２μｌのＴｒａｎｓＭｅｓｓｓｅｎｇｅｒ^ＴＭトランスフェクション試薬を６．８８μｌのＢｕｆｆｅｒ ＥＣ−Ｒ^ＴＭで希釈して混合物に加え、該混合物を室温でさらに１０分間インキュベーションしてトランスフェクション複合体を形成させた。血清を含まないＦ１２−ＨＡＭ培地にグルタミン（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を含めて５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ２．５Ｓ（Promega Corp.、米国ウィスコンシン州マ
ディソン所在）および１：５０のＢ２７サプリメント（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を補足した培地７５μｌを、トランスフェクション複合体に添加し、優しく上下にピペット操作することにより完全に混合した。増殖培地をＤＲＧ細胞から取り除き、上記のトランスフェクション複合体混合物９０μｌを該細胞上に添加した。加湿型インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ_２で７〜８時間インキュベーションした後、細胞から上清を除き、新鮮なＦ１２−ＨＡＭ培地にグルタミンを含めて５％ＦＢＳ、５％ウマ血清（いずれもInvitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）、５０ｎｇ／ｍｌのマウスＮＧＦ２．５Ｓ（Promega Corp.、米国ウィスコンシン州マ
ディソン所在）および１：１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を補足した培地を加え、細胞を加湿型インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ_２でさらに１６時間インキュベーションし、Ｎａｖ１．８
ｍＲＮＡを定量した。

Ｎａｖ１．８ ｍＲＮＡのレベルは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ^ＴＭｂＤＮＡキット（Genospectra、米国フレモント所在）を使用し製造業者のプロトコールに従って計測した。簡
潔に述べると、ＤＲＧ細胞から上清を除き、１５０μｌのＬｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ試薬（１容のＬｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ＋２容の培地）を添加し５２℃で３０分間インキュベーションすることによって細胞を溶解させた。４０μｌの溶解産物を、ラットのＮａｖ１．８およびマウスのシヌクレイン（ＳＮＣＬ）に特異的なプローブセットとともに５２℃で４０分間インキュベーションした。化学発光を、Ｖｉｃｔｏｒ^２−Ｌｉｇｈｔ^ＴＭ（PerkinElmer Life And Analytical Sciences, Inc.、米国マサチューセッツ州ボストン所在）で相対発光量（ＲＬＵ）として読み取った。Ｎａｖ１．８のＲＬＵを、各ウェルについてＳＮＣＬのＲＬＵに対して標準化した。その後、標準化したＮａｖ１．８／ＳＮＣＬ比を、ｓｉＲＮＡを含まない対照（１００％とする）と比較した。

図３はその結果を示している。２００ｎＭでは、試験したＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのうち少なくとも１３個（「＊」で示す）が、ｓｉＲＮＡを含まない対照（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ^ＴＭのみ；ＴＭのみ）と比較してＮａｖ１．８ ｍＲＮＡを少なくとも５０％低減させることを示し、ＲｈｏＡに対する無関係な対照ｓｉＲＮＡでは効果がないことが示された。

ラット後根神経節細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対す
るｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６２０９の用量応答
ラット後根神経節細胞の初代培養物における単一用量スクリーニングから、Ｎａｖ１．８に対して有効な１つのｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６２０９）について、用量依存性に関しさらに特徴解析した。用量−応答曲線については、上記のＤＲＧ培養物における単一用量スクリーニングと同様に実験を実施したが、ただしｓｉＲＮＡの濃度を以下のとおり、すなわち１７５、８８、４４、２２、１１および５．５ｎＭとした。すべてのｓｉＲＮＡ濃度について、ｓｉＲＮＡ：Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｒ比（ｕｇ：ｕｌ）を常に１：２に維持し、ｓｉＲＮＡ：ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ比（ｕｇ／ｕｌ）を常に１：１２に維持した（図４）。

図４は、選択されたｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６２０９についての用量応答実験の結果を示している。５．５ｎＭおよび１１ｎＭでは、ＡＬ−ＤＰ−６２０９は、ＳＮＣＬと比較してＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現を抑制しなかったが、８８ｎＭおよび１７５ｎＭでは、ＡＬ−ＤＰ−６２０９は、ＳＮＣＬと比較してＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現を＞４０％抑制した。この実験において、ＳＮＣＬと比較してＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現が最大の抑制を受けたのは１７５ｎＭのときであった。

Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡのｉＦＥＣＴを用いた髄腔内ボーラス投与により炎症性疼痛が防止される
ｉＦＥＣＴを用いて製剤化された抗Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの、完全フロインドアジュバント誘発型触覚過敏に対する効果を、ラットで評価した（図５）。第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットの後肢にＣＦＡ（１５０ｕＬ）を注射した。次いで、第１日、第２日および第３日に、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡを腰部脊髄に髄腔内ボーラス投与した；具体的には、各ボーラス注射について、２ｕｇのｓｉＲＮＡを、ｉＦＥＣＴトランスフェクション試薬（Neuromics、米国ミネソタ州ミネアポリス所在）と、全
体積を１０ｕＬとして１：４（ｗ：ｖ）の比率で複合させた。５群のラット（１群当たりラット５匹）を、ｉＦＥＣＴの存在下で、ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０４９、ＡＬ−ＤＰ−６２０９、ＡＬ−ＤＰ−６２１７またはＡＬ−ＤＰ−６２１８；表１）あるいはＰＢＳのいずれかで治療した。触覚過敏は、８本の較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Stoelting、米国イリノイ州ウッドデール所在）で後肢を調べることにより計測された触
覚の逃避閾値として表した（０．４１ｇ〜１５ｇ）。各フィラメントを肢の足底表面に適用した。刺激の強度を連続的に増大および減少させることにより逃避閾値を測定し、ディクソンのノンパラメトリック検定を用いて計算した（Dixon, WJ. (1980) "Efficient analysis of experimental observations" Annu Rev Pharmacol Toxicol 20:441-462; Chaplan, S.R., F.W. Bach, et al.(1994) "Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw" J Neurosci Methods 53:55-63を参照のこと）。触覚の閾値は、ベース
ラインの閾値を調べるためにＣＦＡ注射の前、ならびにＣＦＡおよび被験物質による治療の後の第４日に計測した。ＰＢＳで治療されたラットでは、予想通り、肢の逃避閾値が低下したことで証拠づけられるように、第４日には触覚過敏が明白であった。ＡＬ−ＤＰ−６２０９で治療されたラットでは、触覚の閾値は第４日においてほぼ正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６２０９がｉｎ ｖｉｖｏにおいて炎症誘導性の痛覚過敏に対して効果的であることが実証された。Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６２１７による治療の結果、触覚の閾値の平均はベースラインに向かう傾向を示し、５匹のラットのうちの１匹は正常な触覚応答を示した。ＡＬ−ＤＰ−６０４９およびＡＬ−ＤＰ−６２１８は、この実験例ではＰＢＳによる治療と比較して顕著な触覚の閾値の変化を示さなかった。

これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡが、トランスフェクション試薬とともに製剤化され髄腔内投与されると、ＣＦＡ誘発型の触覚の痛覚過敏を緩和し、したがって、臨床の炎症性疼痛の有効治療を提供するための新しいアプローチに相当すること
を実証している。

Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション試薬を用いない髄腔内ボーラス投与により炎症性疼痛が緩和される
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に製剤化された抗Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）誘発型触覚過敏に対する効果を、ラットにおいて評価した（図６）。試験した３つのＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのうち、２つのｓｉＲＮＡは、ＣＦＡ誘発触覚過敏に対して効果的であった：すなわち、ＡＬ−ＤＰ−６０５０と化学修飾は異なるが配列は同一の非コンジュゲート型ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４６１、ならびにＡＬ−ＤＰ−６０５０と同じ化学修飾および配列を備え、コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９である。この実験で評価した投薬例では、ＡＬ−ＤＰ−６９８０（ＡＬ−ＤＰ−６２０９と同じ化学修飾および配列を備え、コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ）は、ＣＦＡ誘発型触覚過敏に対して効果的ではなかった。ＡＬ−ＤＰ−４４６１、ＡＬ−ＤＰ−４４５９およびＡＬ−ＤＰ−６９８０の配列を表６に示す。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットの後肢にＣＦＡを注射した。４群のラット（１群当たりラット５匹）を、ＣＦＡ注射後の第１日目を開始としてＮａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４４６１、ＡＬ−ＤＰ−４４５９、またはＡＬ−ＤＰ−６９８０）あるいはＰＢＳのいずれかで治療した。Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４４６１、ＡＬ−ＤＰ−４４５９またはＡＬ−ＤＰ−６９８０）あるいはＰＢＳは、第１日、第２日および第３日に腰部脊髄への髄腔内ボーラス注射（１回の注射当たり１０ｕＬ）により１日に２回（ＢＩＤ）投与した。ベースラインの閾値を調べるためにＣＦＡ注射の前と、次いでＣＦＡおよび被験物質による治療の後の第４日に、上記のようにして触覚過敏を計測した。ＰＢＳで治療されたラットでは、予想通り、肢の逃避閾値の低下によって実証されるように、第４日において触覚過敏が明白であった。ボーラスＢＩＤ（０．５ｍｇ／ボーラス）によってＡＬ−ＤＰ−４４６１で治療されたラットでは、触覚の閾値は第４日において中程度に正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４６１が、ｉｎ ｖｉｖｏのこの投薬例ではＣＦＡ誘発型の触覚過敏に対して中程度に効果的であることが実証された。Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−４４５９を用いたボーラスＢＩＤ（０．１５ｍｇ／ボーラス）による治療の結果、触覚の閾値がほぼ完全に正常化され、５匹のラットすべてについて第４日までに触覚閾値が１０．２ｇ以上までほぼ回復することが実証された。これに対し、ボーラスＢＩＤ（０．１５ｍｇ／ボーラス）によるＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−６９８０は触覚過敏に影響を与えず、培養細胞にトランスフェクションした場合に有効であったとしても標的に対するすべてのコレステロールコンジュゲート型ｓｉＲＮＡが等しく効果的または有効であ
るとは限らないことが示された。

これらの結果は、コレステロールをコンジュゲートすることにより、慢性疼痛を含む神経障害に対するｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性が増強されることを示唆している。更に、これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とし、コレステロールがコンジュゲートされているかまたはコレステロールを含まないｓｉＲＮＡが、生理食塩水中に製剤化されボーラス注射によって髄腔内投与されると、ＣＦＡ誘発型の触覚過敏が緩和され、したがって、臨床の炎症性疼痛の有効な治療を提供する新しいアプローチに相当することを実証している。

トランスフェクション試薬を用いずにＮａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡを髄腔内にポンプ投与またはボーラス投与することにより炎症性疼痛が緩和される
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に製剤化された抗Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡの、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）誘発型触覚過敏に対する効果を、髄腔内ポンプ注入（図７、左側）または髄腔内ＢＩＤボーラス注射（図７、右側）の後にラットにおいて評価した。０．４ｍｇ／日の連続的な髄腔内ポンプ注入によって試験した３つのＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのうち、１つのｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０、表１）は、ＣＦＡ誘発型の触覚過敏に対して中程度に効果的であった。ＡＬ−ＤＰ−６０５０は、０．５ｍｇ／ボーラスの髄腔内ＢＩＤボーラス注射によって試験した時、ＣＦＡ誘発型の触覚過敏に対して効果的であった。

連続的な髄腔内ポンプ注入を用いた抗ＮａＶ１．８ ｓｉＲＮＡの効果を評価するために、第０日に成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットの後肢にＣＦＡを注射した。４群のラット（１群当たりラット５匹）を、ＣＦＡ注射後の第１日を開始としてＮａｖｌ．８に対するｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０、ＡＬ−ＤＰ−６２１８、またはＡＬ−ＤＰ−６２１９）あるいはＰＢＳのいずれかで治療した。すべてのラットにおいて、被験物質を、第１日を開始として注入速度０．５ｕＬ／時の連続的な浸透ミニポンプ注入によって髄腔内投与した。ｓｉＲＮＡを０．４ｍｇ／日として注入した。ベースラインの閾値を調べるためにＣＦＡ注射の前と、次いでＣＦＡおよび被験物質による治療の後との両方について、触覚過敏を上記のようにして計測した（図７、左側）。ＰＢＳで治療されたラットでは、予想通り、肢の逃避閾値の低下によって実証されるように、第４日において触覚過敏が明白であった。連続的な髄腔内ポンプ注入（０．４ｍｇ／日）によってＡＬ−ＤＰ−６０５０で治療されたラットでは、触覚の閾値は第４日において軽度に正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−６０５０が炎症性疼痛に対しｉｎ ｖｉｖｏでこの投薬例を用いることにより軽度に効果的であることが実証された。

ＢＩＤの髄腔内ボーラス注射によるＮａＶ１．８を対象としたｓｉＲＮＡの効果を評価するために、第０日に成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットの後肢にＣＦＡを注射した。２群のラット（１群当たりラット４〜５匹）を、ＣＦＡ注射後の第１日を開始としてＮａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０、０．５ｍｇ／ボーラス）またはＰＢＳのいずれかで治療した。上述のようにして触覚過敏を評価した。ベースラインの閾値を調べるためにＣＦＡ注射の前と、次いでＣＦＡ注射および被験物質による治療の後の第４日に、触覚の閾値を計測した（図７、右側）。予想通り、ＰＢＳで治療されたラットでは、肢の逃避閾値の低下によって実証されるように、第４日において触覚過敏が明白であった。ＢＩＤの髄腔内ボーラス注射（０．５ｍｇ／ボーラス）によってＡＬ−ＤＰ−６０５０で治療されたラットでは、触覚の閾値は第４日においてほぼ正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０が、炎症性疼痛に対しｉｎ ｖｉｖｏでこの投薬例を用いることにより適度に効果的であることが実証された。

これらの結果は、さらに、Ｎａｖ１．８を標的とし、コレステロールがコンジュゲート
されていないｓｉＲＮＡが、生理食塩水中に製剤化されボーラス注射または連続的ポンプ注入のいずれかによって髄腔内投与されると、ＣＦＡ誘発型の触覚過敏が緩和され、したがって、臨床の炎症性疼痛の有効治療を提供する新しいアプローチに相当することを実証している。

Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション試薬を用いない髄腔内ボーラス投与により、炎症性疼痛が緩和される
Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化）の、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）誘発型熱過敏に対する効果を、ラットで評価した（図８）。非コンジュゲート型のｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０（表１）およびコレステロールがコンジュゲートされたｄｓＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９（表６）のいずれも、評価したＢＩＤボーラスの髄腔内投薬例においてＣＦＡ誘発型熱過敏に対して効果的であった。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットの後肢にＣＦＡを注射した。３群のラット（１群当たりラット４〜５匹）を、ＣＦＡ注射後の第１日を開始として、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０またはＡＬ−ＤＰ−４４５９）あるいはＰＢＳで治療した。すべてのラットにおいて、被験物質を、第１日に開始してＢＩＤボーラス注射（１０ｕＬ／ボーラス）で髄腔内投与した。ＡＬ−ＤＰ−４４５９は０．１５ｍｇ／ボーラスで投与し、ＡＬ−ＤＰ−６０５０は０．５ｍｇ／ボーラスで投与した。熱過敏は、ハーグリーヴスおよび共同研究者らの報告（Hargreaves, K., R. Dubner, et al. (1988) "A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia" Pain 32:77-88）のようにして有害な温度刺激に対する肢の逃避反応
潜時を調べることにより計測した。有害な熱照射に応答した後肢の逃避反応までの潜時を測定した。最大４０秒で終了させることにより組織の損傷を防止した。

熱応答を、ベースラインの閾値を調べるためにＣＦＡ注射の前と、次いでＣＦＡ注射および被験物質による治療後の第４日に計測した。予想通り、ＰＢＳで治療されたラットでは、肢の逃避反応潜時が短縮されたことによって証拠づけられるように、第４日において熱過敏が明白であった。髄腔内へのＢＩＤボーラス注射によりＡＬ−ＤＰ−６０５０（０．５ｍｇ／ボーラス）またはＡＬ−ＤＰ−４４５９（０．１５ｍｇ／ボーラス）で治療されたラットでは、熱に対する反応潜時は第４日において正常化され、非コンジュゲート型のＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０およびコレステロールがコンジュゲートされたＮａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこの投薬例で炎症性疼痛に対して効果的であることが実証された。

これらの結果は、コレステロールがコンジュゲートされているかまたは非コンジュゲート型の、Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡは、生理食塩水中に製剤化され、ボーラス注射によって髄腔内投与されると、ＣＦＡ誘発性の熱性痛覚過敏ならびに触覚過敏（上記）を緩和し、したがって、臨床の炎症性疼痛における多種類の痛覚過敏の有効治療を提供する新しいアプローチに相当することを実証している。

Ｎａｖ１．８に対するコレステロールコンジュゲート型ｓｉＲＮＡのトランスフェクション試薬を用いない髄腔内ボーラス投与により、神経障害性疼痛が緩和される
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化された、Ｎａｖ１．８に対するＡＬ−ＤＰ−４４５９（表６）の、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）誘発型の触覚過敏および熱過敏を、ラットで評価した（図９）。評価に用いた髄腔内ボーラス投薬例（０．１５ｍｇ／ボーラス、ＢＩＤ）において、ＡＬ−ＤＰ−４４５９はＳＮＬ誘発型の触覚過敏および熱過敏に対して効果的であった。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットのＬ５およびＬ６脊髄神経を、片側のみ結紮した（ＳＮＬ外科手術）。３群のラット（１群当たりラット６〜８匹）を、ＳＮＬ手術後の第３日を開始として、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９またはＰＢＳのいずれかを髄腔内投与することによって治療した。これらの群のうち２群では、ＡＬ−ＤＰ−４４５９またはＰＢＳを、ＳＮＬ後の３〜７日に１日当たり２回（ＢＩＤ）、腰部脊髄への髄腔内ボーラス注射（１回の注射当たり５ｕＬ）により投与した。１群のラットでは、ＡＬ−ＤＰ−４４５９を、ＳＮＬ後の３〜７日に、注入速度０．５ｕＬ／時で０．１８ｍｇ／日の連続的な浸透ミニポンプ注入により髄腔内投与した。触覚過敏および熱過敏は上述のようにして評価した。

ベースラインの応答（ＢＬ）を調べるためにＳＮＬ手術の前と、触覚過敏および熱性痛覚過敏が完全に発症したことを確認するために被験物質による治療前のＳＮＬ後第３日に、触覚応答（図９、左）および熱応答（図９、右）を計測した。ＰＢＳで治療されたラットでは、予想通り、肢の逃避閾値の低下および熱に対する反応潜時の短縮によってそれぞれ証拠づけられるように、ＳＮＬ後の第３日、第５日および第７日において触覚過敏および熱過敏が明白であった。Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−４４５９は、０．１８ｍｇ／日の連続的なポンプ注入により髄腔内投与された場合、記載の時間枠を越えても触覚または過敏性に有意な影響は及ぼさなかった。対照的に、ボーラスＢＩＤ（０．１５ｍｇ／ボーラス）によりＡＬ−ＤＰ−４４５９で治療されたラットでは、触覚の閾値および熱に対する反応潜時がＳＮＬ後の第７日（治療第５日）においてほぼ正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９がＳＮＬ誘発型の触覚過敏および熱性痛覚過敏に対してｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることが実証された。

これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とするコレステロールコンジュゲート型ｓｉＲＮＡが、生理食塩水中で製剤化されて髄腔内投与されると、ラットにおける実験的神経損傷誘発型の慢性疼痛に対して効果的であり、したがって、臨床の神経障害性疼痛の有効治療を提供するための新しいアプローチに相当することを実証している。

ＮａＶ１．８を標的とする、非コンジュゲート型およびコレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡは、３７℃のヒト脳脊髄液中で安定である
ＮａＶ１．８を標的とする、非コンジュゲート型およびコレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中における安定性を測定するために、ｓｉＲＮＡ二重鎖をヒトＣＳＦ中にて３７℃で４８時間インキュベーションし、一本鎖を定量的イオン交換クロマトグラフィで計測した。この実施例では、非コンジュゲート型ｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−６０５０、ＡＬ−ＤＰ−６２０９、ＡＬ−ＤＰ−６２１７、ＡＬ−ＤＰ−６２１８およびＡＬ−ＤＰ−６２１９（表１）と、コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−４４５９（表６）とを評価した。３０μｌのヒトＣＳＦを、９６ウェルプレート中で３μｌの５０μＭ ｓｉＲＮＡ（１５０ｐｍｏｌｅ／ウェル）と混合し、蒸発しないように密閉し、３７℃で１〜４８時間インキュベーションした。３０μｌのＰＢＳ中における３７℃で４８時間のインキュベーションを、非特異的分解の対照とした。４μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）および２５μｌのプロテイナーゼＫバッファーを添加し、この混合物を４２℃で２０分間インキュベーションすることにより、反応を停止させた。サンプルを、０．２μｍの９６ウェルフィルタプレートを使用し３０００ｒｐｍで２０分間回転ろ過した。インキュベーションウェルを５０μｌのミリポア水で２回洗浄し、洗浄液を合わせて同様に回転ろ過した。ろ過体積の体積変化を正規化するための内部標準（ＩＳ）として作用するように、５０μＭの４０ｍｅｒ ＲＮＡの５μｌアリコートを各サンプルに添加した。サンプルを変性条件下のイオン交換ＨＰＬＣによって分析した。

１．コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４４５９の
分析用ＨＰＬＣシステム
カラム：ダイオネクス（Dionex）ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００（４×２５０ｍｍ分析用カラム）
温度：８０℃（変性条件）
流速：１ｍｌ／分
注入量：５０ｕｌ
検出：２６０（参照波長６００ｎｍ）
ＨＰＬＣ溶離液Ａ：２５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；５０％ＡＣＮ；ｐＨ＝８
ＨＰＬＣ溶離液Ｂ：Ａ液中の６００ｍＭ ＮａＢｒ
グラジエント条件：

２．非コンジュゲート型ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０、６２０９、６２１７、６２１８、６２１９のためのＨＰＬＣシステム
カラム：ダイオネクスＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００（４×２５０ｍｍ分析用カラム）
温度：３０℃（ｐＨ＝１１のため変性条件）
流速：１ｍｌ／分
注入量：５０ｕｌ
検出：２６０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ）
ＨＰＬＣ溶離液Ａ：１０％ＡＣＮ中の２０ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４；ｐＨ＝１１
ＨＰＬＣ溶離液Ｂ：Ａ液中の１Ｍ ＮａＢｒ
グラジエント条件：

ＩＥＸ−ＨＰＬＣ変性条件下では、二重鎖は２つの分離した一本鎖として溶出された。内部標準は二重鎖の一本鎖よりも長い保持時間で溶出され、分析への干渉はなかった。

注入を行うごとに、クロマトグラムをダイオネクスＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（Ｒ）６．６０ＨＰＬＣソフトウェアで自動的に積分したが、必要に応じて手動で調節した。ピーク面
積はすべて内部標準（ＩＳ）ピークに対して次の方程式：
ＣＦ_（ＩＳ）＝１００／ピーク面積_（ＩＳ）；補正ピーク面積_{（ｓ／ａｓ）}＝ＣＦ＊ピーク面積_{（ａ／ａｓ）}
によって補正した。

すべての時点において、残存している完全なＦＬＰの％値は、次の方程式：
％−ＦＬＰ_{（ｓ／ａｓ）}＝（補正ピーク面積_{（ｓ／ａｓ）}／補正ピーク面積_{（ｓ／ａｓ）；ｔ＝０分}）＊１００％
によって計算される。

すべての値を、ｔ＝０分におけるインキュベーションに対し標準化した。
非コンジュゲート型ｓｉＲＮＡの結果を図１０に示す。ＰＢＳ中３７℃で４８時間のインキュベーション（ＰＢＳ−４８）の後、５種すべてのｓｉＲＮＡが完全に安定であり、検出可能な減少は認められなかった。ヒトＣＳＦ中３７℃で４８時間のインキュベーション後では、５つのｓｉＲＮＡのうち３つ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０、ＡＬ−ＤＰ−６２０９およびＡＬ−ＤＰ−６２１７）は２０％未満の減少を示したが、２つのｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６２１８およびＡＬ−ＤＰ−６２１９）は５０％を超える減少を示した。コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡのＡＬ−ＤＰ−４４５９の結果を図１１に示す。ＰＢＳ中３７℃で４８時間のインキュベーション（ＰＢＳ−４８）の後、ＡＬ−ＤＰ−４４５９は完全に安定であり、検出可能な減少は認められなかった。ヒトＣＳＦ中での安定性についての評価では、ＡＬ−ＤＰ−４４５９は３７℃で４８時間安定であることが見出され、４８時間を超えて検出された変動は２０％未満であった。

ＮａＶ１．８を標的とする、非コンジュゲート型およびコレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡは、ラット知覚ニューロン初代培養物において用量依存的にＮａＶ１．８ ｍＲＮＡを低減する
ラット後根神経節細胞の初代培養物における単一用量スクリーニング由来の、Ｎａｖ１．８に対する別の有効なｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−６０５０、表１）およびそのコレステロールコンジュゲート型であるＡＬ−ＤＰ−４４５９（表６）を、用量依存性についてさらに特徴解析した。用量−応答曲線については、次の濃度、すなわち２００、８０、３２、１２．８、５．１２、２．０５、０．８２および０．３３ｎＭのｓｉＲＮＡを用いてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して（以下を参照）トランスフェクションを実施した（図１２）。

ＤＲＧニューロンを、プレートへの播種の２４時間後にトランスフェクションした。各ウェルについて、０．４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Invitrogen Corporation、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を使用し、トランスフェクションを製造業者のプロトコールに従って実施した。具体的には、ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００複合体を以下のようにして調製した。適正な量のｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ血清使用量低減培地で希釈し、穏やかに混合した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００を使用前に撹拌し；次いで９６ウェルプレートの各ウェルについて、０．４ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００を２５μｌのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ Ｉ血清使用量低減培地で希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベーションした。５分間のインキュベーションの後、１ｕｌの上記希釈ｓｉＲＮＡを希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００と合わせた（全体積２６．４μｌ）。該複合物を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベーションしてｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００複合体を形成させた。その後、グルタミン（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を含み５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ２．５Ｓ（Promega Corp.、米国ウィスコンシン州マディソン所在）および１：５０ Ｂ２７サプリメント
（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）が補足された無血清Ｆ
１２−ＨＡＭ培地１００μｌを上記トランスフェクション複合体に添加し、穏やかに上下にピペット操作することにより混合した。ＤＲＧ細胞から増殖培地を取り除き、上記トランスフェクション複合体の混合物１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。加湿型インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２で２０時間インキュベーションした後、細胞から上清を取り除き、グルタミンを含んだ新鮮なＦ１２−ＨＡＭ培地に５％ＦＢＳ、５％ウマ血清（いずれもInvitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）、５０ｎｇ／ｍｌマウスＮＧＦ２．５Ｓ（Promega Corp.、米国ウィスコンシン州マディソ
ン所在）および１：１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen Gibco、米国カリフォルニア州カールスバード所在）を補足したものを添加した。細胞を、加湿型インキュベータにて３７℃、５％ＣＯ_２でさらに２０〜２４時間インキュベーションし、前述のようにｂＤＮＡ分析によってＮａｖ１．８ ｍＲＮＡを定量した。

図１２は、選択されたｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０およびそのコレステロールコンジュゲート型であるＡＬ−ＤＰ−４４５９の用量応答実験の結果を示している。ＡＬ−ＤＰ−６０５０およびそのコレステロールコンジュゲート型のＡＬ−ＤＰ−４４５９は、この実験において、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）と比べて用量依存的にＮａｖ１．８ ｍＲＮＡ発現を抑制し、最大の抑制は＞３０ｎＭのｓｉＲＮＡにおける〜４０％であった。

トランスフェクション試薬を用いずにＮａｖ１．８に対する非コンジュゲート型ｓｉＲＮＡを髄腔内ボーラス投与することにより、神経障害性疼痛が緩和される
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化された、Ｎａｖ１．８に対するＡＬ−ＤＰ−６０５０（表１）の、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）誘発型熱過敏に対する効果を、ラットで評価した（図１３）。評価に用いた髄腔内ボーラス投与例（０．１５ｍｇ／ボーラス、ＢＩＤ）において、ＡＬ−ＤＰ−６０５０はＳＮＬ誘発型熱過敏に対して効果的であった。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットのＬ５およびＬ６脊髄神経を、片側のみ結紮した（ＳＮＬ外科手術）。２群のラット（１群当たりラット８匹）を、ＳＮＬ手術後の第３日を開始として、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０あるいはＰＢＳのいずれかの髄腔内ボーラス注射により治療した。髄腔内ボーラス注射（１回の注射当たり５ｕＬ中に０．１５ｍｇ）は、ＳＮＬ後の第３〜７日に腰部脊髄に１日２回（ＢＩＤ）実施した。上述のようにして熱過敏性を評価した。

熱への応答は、ベースラインの応答（ＢＬ）を調べるためにＳＮＬ手術の前と、熱性痛覚過敏が完全に発症したことを確認するために被験物質による治療の前のＳＮＬ後第３日に計測した。ＰＢＳで治療されたラットでは、熱過敏は、予想通り、熱に対する反応潜時の短縮によって証拠づけられるように、ＳＮＬ後第３日、第５日および第７日において明白であった。対照的に、ボーラスＢＩＤ（０．１５ｍｇ／ボーラス）によりＡＬ−ＤＰ−６０５０で治療されたラットでは、熱に対する反応潜時は、ＳＮＬ後第５日（治療第３日）および第７日（治療第５日）においてほぼ正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０がＳＮＬ誘発型の熱性痛覚過敏に対してｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることが実証された。

これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡが、生理食塩水中で製剤化され、髄腔内ボーラス注射によって投与されると、ラットにおける実験的な神経損傷誘発型の慢性疼痛に対して効果的であり、したがって、臨床の神経障害性疼痛の有効治療を提供するための新しいアプローチに相当することを実証している。

Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡのＮＤ９８−２．７リポソーム製剤の髄腔内ボーラス投与により、神経障害性疼痛が緩和される
ＮＤ９８−２．７中で製剤化され（後述）、髄腔内ボーラス注射によって投与される、Ｎａｖ１．８に対するＡＬ−ＤＰ−６０５０（表１）の、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）誘発型の熱過敏に対する効果を、ラットで評価した（図１４）。評価に用いた髄腔内ボーラス投与例（５マイクログラム／ボーラス、毎日）において、ＡＬ−ＤＰ−６０５０はＳＮＬ誘発型の熱過敏に対して効果的であった。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットのＬ５およびＬ６脊髄神経を、片側のみ結紮した（ＳＮＬ外科手術）。２群のラット（１群当たりラット６匹）を、ＳＮＬ手術後の第３日を開始として、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０（ＮＤ９８−２．７中で製剤化）あるいはＰＢＳのいずれかを髄腔内ボーラス注射することにより治療した。髄腔内ボーラス注射（１回の注射当たり５ｕＬ中に５マイクログラム）は、ＳＮＬ後の第３〜５日に毎日、腰部脊髄に対して実施した。上述のようにして熱過敏を評価した。

熱への応答は、ベースラインの応答（ＢＬ）を調べるためにＳＮＬ手術の前と、熱性痛覚過敏が完全に発症したことを確認するために被験物質による治療の前のＳＮＬ後第３日に計測した。ＰＢＳで治療されたラットでは、熱過敏は、予想通り、熱に対する反応潜時の短縮によって証拠づけられるように、ＳＮＬ後第３日、第５日、第７日および第１０日において明白であった。対照的に、ＮＤ９８−２．７リポソーム中に製剤化されたＡＬ−ＤＰ−６０５０の、毎日の髄腔内ボーラス注射（５マイクログラム／ボーラス）により治療されたラットでは、熱に対する反応潜時は、ＳＮＬ後第５日（治療第３日）においてほぼ正常化され、このことから、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０は、ＮＤ９８−２．７リポソーム中に製剤化して髄腔内注射で投与することにより、ＳＮＬ誘発型の熱性痛覚過敏に対してｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることが実証された。さらに、ＮＤ９８−２．７リポソーム製剤を用いて有効とするために必要なｓｉＲＮＡの用量レベル（１日当たり５マイクログラム）は、ＰＢＳ製剤を用いて有効と観察された用量レベル（１日当たり３００マイクログラム）よりもはるかに低かった。

これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡが、髄腔内ボーラス注射により、かつＮＤ９８−２．７リポソーム中で製剤化されて投与されると、ラットにおいて実験的な神経損傷誘発型の慢性疼痛に対して効果的であり、したがって、臨床の神経障害性疼痛の有効治療を提供するための新しいアプローチに相当することを実証している。

Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡのＮＤ９８−２．７リポソーム製剤の静脈内ボーラス投与および連続的ポンプ投与により、神経障害性疼痛が緩和される
ＮＤ９８−２．７中で製剤化され、静脈内ボーラス注射または連続的な静脈内ポンプ注入により投与される、Ｎａｖ１．８に対するＡＬ−ＤＰ−６０５０（表１）の、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）誘発型の熱過敏に対する効果を、ラットで評価した（図１４）。評価に用いたボーラス静脈内投与例（毎日０．５ｍｇ／ボーラス、およそ２ｍｇ／ｋｇ／ボーラスに相当）、および評価に用いた連続的な静脈内ポンプ注入例（０．２４ｍｇ／日、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日に相当）において、ＮＤ９８−２．７リポソーム中で製剤化されたＡＬ−ＤＰ−６０５０は、ＳＮＬ誘発型の熱過敏に対して効果的であった。

第０日に、成体オスのスピローグ・ドーリー・ラットのＬ５およびＬ６脊髄神経を、片側のみ結紮した（ＳＮＬ外科手術）。２群のラット（１群当たりラット６匹）を、ＳＮＬ手術後の第３日を開始として、Ｎａｖ１．８に対するｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０（ＮＤ９８−２．７中で製剤化）を静脈内ボーラス注射または連続的な静脈内ポンプ注入により治療した。静脈内ボーラス注射（１回のボーラス注射当たり１ｍＬ中に０．５ｍｇ）は、ＳＮＬ後の第３〜５日に毎日実施した。連続的な静脈内ポンプ注入（１０ｕＬ／時、０．２４ｍｇ／日に相当）は、ＳＮＬ後の第３〜１０日に頚静脈内カニューレを介
して投与した。上述のようにして熱過敏を評価した。

熱への応答は、ベースラインの応答（ＢＬ）を調べるためにＳＮＬ手術の前に、また熱性痛覚過敏が完全に発症したことを確認するためにＳＮＬ後第３日に被験物質による治療前に計測した。熱過敏は、予想通り、熱に対する肢の逃避反応潜時の短縮によって証拠づけられるように、治療前のＳＮＬ後第３日において明白であった。対照的に、ＮＤ９８−２．７リポソーム中に製剤化されたＡＬ−ＤＰ−６０５０の、毎日の静脈内ボーラス注射（０．５ｍｇ／ボーラス）により治療されたラットでは、熱に対する反応潜時は、ＳＮＬ後第５日（治療第３日）、およびＳＮＬ後第７日（最後の静脈内ボーラス治療の２日後）においてほぼ正常化され、Ｎａｖ１．８ ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−６０５０は、ＮＤ９８−２．７リポソーム中に製剤化して静脈内ボーラス注射で投与することにより、ＳＮＬ誘発型の熱性痛覚過敏に対してｉｎ ｖｉｖｏで効果的であることが実証された。更に、ＮＤ９８−２．７リポソーム中に製剤化されたＡＬ−ＤＰ−６０５０を用いて連続的な静脈内ポンプ注入（０．２４ｍｇ／日）により治療されたラットでは、熱に対する反応潜時は、ＳＮＬ後第５日（治療第３日）、第７日（治療第５日）および第１０日（治療第８日）においてほぼ正常化された。

これらの結果は、Ｎａｖ１．８を標的とするｓｉＲＮＡが、ＮＤ９８−２．７リポソーム中で製剤化され、静脈内ボーラス注射または連続的な静脈内ポンプ注入により投与されると、ラットにおいて実験的な神経損傷誘発型の慢性疼痛に対して効果的であり、したがって、臨床の神経障害性疼痛の有効治療を提供するための新しいアプローチに相当することを実証している。さらに、これらの結果は、ｓｉＲＮＡのＮＤ９８−２．７リポソーム製剤が、全身投与により、後根神経節の知覚ニューロンにｓｉＲＮＡを有効に送達しうることを実証している。

製剤化の手順
リピドイド（lipidoid）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）、コレステロール（Sigma-Aldrich）およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Avanti Polar Lipids）を使用して脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。

各々のエタノール溶液ストックを調製した（ＮＤ９８（図１５のＮＤ９８異性体Ｉ）、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ；ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ）。その後、ＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ−セラミドＣ１６の溶液ストックを、４２：４８：１０のモル比で合わせた。この合わせた脂質溶液を、最終的なエタノール濃度が３５〜４５％となり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が１００〜３００ｍＭとなるように、水性のｓｉＲＮＡ溶液（ｐＨ５の酢酸ナトリウム中）と急速に混合した。混合により脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子が自然に形成された。所望の粒度分布に応じて、場合によっては、得られたナノ粒子混合物を、加熱バレル式射出装置（Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ^ＴＭ、Northern Lipids, Inc）を使用して、ポリカーボネート膜（１００ｎｍカットオフ）によって射出成形した。その他の場合は、射出成形ステップは省略した。エタノール除去およびこれと同時のバッファー交換は、透析あるいは接線流ろ過のいずれかによって実施した。バッファーをｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。

製剤の特徴解析
標準的な方法または射出成形しない方法のいずれかによって調製した製剤を、同じ方法で特徴解析する。製剤を最初に、目視検査によって特徴解析する。該製剤は凝集物や堆積物のない白みがかった半透明の溶液のはずである。脂質ナノ粒子の粒度および粒度分布は、モールヴァン製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Malvern、米国）を使用して動
的光散乱によって計測する。粒子のサイズは、２０〜３００ｎｍ、理想的には４０〜１０
０ｎｍとする。粒度分布は単峰型とする。製剤中のｓｉＲＮＡ全体の濃度ならびに封入されたフラクションを、色素排除法を使用して概算する。製剤化ｓｉＲＮＡのサンプルを、製剤化を妨害する界面活性剤である０．５％トリトン‐Ｘ１００の存在下または非存在下で、ＲＮＡ結合性の染料Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）とともにインキュベーションする。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含んでいるサンプルからのシグナルを標準曲線と比較することによって測定する。封入されたフラクションは、総ｓｉＲＮＡ含量から（界面活性剤の非存在下でのシグナルから計測した）「自由な」ｓｉＲＮＡ含量を差し引くことにより決定する。封入されたｓｉＲＮＡの割合（％）は通常＞８５％である。

ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様では、Ｎａｖ１．８遺伝子の発現活性を調節するＮａｖ１．８特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10；Skillern, A., et al., International PCT Publication No. WO 00/22113、Conrad, International PCT Publication No. WO 00/22114、ならびにConrad, US Pat. No. 6,054,299を参照のこと）。
これらの導入遺伝子は、宿主ゲノムに一体化された導入遺伝子として組込まれかつ受け継がれうる、直線状の構築物、環状プラスミド、あるいはウイルスベクターとして導入可能である。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるように構築されてもよい（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。

ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別個の発現ベクター上のプロモータによって転写され、標的細胞内に同時トランスフェクションされてもよい。別例として、ｄｓＲＮＡの個々の鎖それぞれが、いずれも同じ発現プラスミド上にあるプロモータによって転写されてもよい。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカー・ポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復配列として発現され、該ｄｓＲＮＡがステム・アンド・ループ構造を有するようになっている。

組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、限定するものではないが、アデノ随伴ウイルス（総説として、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129を参照のこと）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616, Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434)およびRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-1555を参照のこと）；あるいはアルファ・ウイルスならびに当分野で既知のその他のものに基づいて構築することができる。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのうち少なくともいずれか一方において、上皮細胞を含む様々な種類の細胞に様々な遺伝子を導入するために使用されてきた（例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; country-regionU.S. Patent No. 4,868,116; placecountry-regionU.S. Patent No. 4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/05345；およびPCT Application WO 92/07573を参照のこと）。形質導入可能であり、かつ細胞のゲノムに挿入された遺伝子を発現可能な組換えレトロウイルスベクターは、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰのような適切なパッケージング細胞株に該組換えレトロウイルスゲノムをト
ランスフェクションすることにより作製することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えばラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の種々様々の細胞および組織を感染させるために使用可能であり（Hsu et
al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、かつ、感染のために活発に有系分裂する細胞を必要とはしないという長所をも有している。

本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかの中でｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモータは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ（例えばリボソームＲＮＡプロモータ）でもよいし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ（例えば、ＣＭＶの初期プロモータまたはアクチンプロモータまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモータ）でもよいし、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモータ）でもよく、あるいは、発現プラスミドがＴ７プロモータからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするものとして、例えばＴ７プロモータなどの原核生物のプロモータであってもよい。プロモータは、導入遺伝子の発現を膵臓に対して方向付けることも可能である（例えば、膵臓用のインスリン調節配列（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515）を参照）。

さらに、導入遺伝子の発現は、誘導可能な調節配列および発現系、例えばある種の生理学的な調節因子（例えば循環血中グルコースレベルまたはホルモン）に感受性の調節配列の使用により、正確に調節することが可能である（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物において導入遺伝子の発現をコントロールするのに適した
、そのような誘導可能な発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化を誘導する化学物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の使用目的に基づいて適切な調節配列／プロモータ配列を選ぶことができるだろう。

好ましくは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは下記に述べるようにして送達され、標的細胞中に持続される。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子を一過性に発現させるウイルスベクターを使用することもできる。そのようなベクターは、必要なときに繰り返し投与することができる。一旦発現されると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合してその機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身性のものであってもよいし、患者から取り出された標的細胞に投与した後で患者に再導入することによるものでもよいし、あるいは所望の標的細胞内への導入を可能にする任意の他の手段によるものでもよい。

ｄｓＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドは、通常、カチオン性脂質担体（例えばＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非カチオン性の脂質系担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ^ＴＭ）との複合体として、標的細胞内にトランスフェクションされる。一週間またはそれ以上の期間にわたる、単一のＮａｖ１．８遺伝子の異なる領域または複数のＮａｖ１．８遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを介したノックダウンのための、多重脂質トランスフェクションも、本発明によって企図される。本発明のベクターの宿主細胞内への導入の成功は、様々な既知の方法を使用してモニタすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光マーカーなどのリポーターを用いて示すことができる。ｅｘ ｖｉｖｏの細胞の安定的トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞に、ヒグロマイシンＢ耐性のような、特定の環境要因（例えば抗生物質および薬物）に対する耐性を与えるマーカーを使用して、確実にすることができる。

Ｎａｖ１．８特異的ｄｓＲＮＡ分子をベクターに挿入し、ヒト患者のための遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（U.S. Patent 5,328,470を参照）、あるいは定位注射によって（例えば
、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照）、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含んでいてもよいし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリックスからなるものでもよい。別例として、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクターがそのまま生成されうる場合（例えばレトロウイルスベクター）、医薬調製物は、該遺伝子送達システムを生成する１個以上の細胞を含んでいてもよい。

Ｃｏｓ‐７細胞にトランスフェクションされたヒトＮａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対する表１のｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図。 Ｎａｖ１．８ ｄｓＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＳＷ６２０細胞に内在するＮａｖ１．５ ｍＲＮＡに対し交差反応しないことを示す図。 ラット後根神経節細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８ ｍＲＮＡに対する表１のｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図。 後根神経節細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８ ｍＲＮＡに対するｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６２０９の用量応答を示す図。 ラットにおける完全フロインドアジュバント誘発型触覚過敏に対する、ｉＦＥＣＴを伴ったｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６２０９のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ラットにおける完全フロインドアジュバント誘発型触覚過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−４４５９およびＡＬ−ＤＰ−４４６１のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ラットにおける完全フロインドアジュバント誘発型触覚過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ラットにおける完全フロインドアジュバント誘発型熱過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０およびＡＬ−ＤＰ−４４５９のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ラットにおける脊髄神経結紮誘発型の触覚過敏および熱過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−４４５９のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 非コンジュゲート型ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０、ＡＬ−ＤＰ−６２０９、ＡＬ−ＤＰ−６２１７、ＡＬ−ＤＰ−６２１８、およびＡＬ−ＤＰ−６２１９の３７℃ヒト脳脊髄液中における安定性を示す図。 コレステロールがコンジュゲートされたｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−４４５９の３７℃ヒト脳脊髄液中における安定性を示す図。 ラット後根神経節細胞の初代培養物における内在性Ｎａｖ１．８のｍＲＮＡ発現に対する、ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０およびそのコレステロールコンジュゲート型であるＡＬ−ＤＰ−４４５９の用量応答を示す図。 ラットにおける脊髄神経結紮誘発型の熱過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ラットにおける脊髄神経結紮誘発型の熱過敏に対する、ｄｓＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−６０５０のＮＤ９８−２．７リポソーム製剤のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を示す図。 ＮＤ９８脂質の構造を示す図。

Claims (16)

1. 細胞内のヒトＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は配列番号１７の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は配列番号１８の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ。
2. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、該修飾ヌクレオチドが、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
3. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡであって、該修飾ヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐Ｏ‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
4. 請求項１から３いずれかに記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
5. ｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む、生物体におけるＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物であって、前記ｄｓＲＮＡは互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は配列番号１７の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は配列番号１８の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含む、医薬組成物。
6. 髄腔内への注入または注射、あるいは静脈内への注入または注射からなる群から選択される投与のために製剤化されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 細胞内のＮａｖ１．８遺伝子の発現をインビトロで抑制する方法であって、
   （ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は配列番号１７の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は配列番号１８の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含む、工程、および
   （ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、Ｎａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞内のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する工程
   を含む方法。
8. 疼痛を治療、予防、または管理するための医薬組成物であって、治療上または予防上有効な量のｄｓＲＮＡを含み、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は配列番号１７の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は配列番号１８の少なくとも１９から２１ヌクレオチドを含む、医薬組成物。
9. 前記疼痛は、神経障害性疼痛および炎症性疼痛からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 細胞内のヒトＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、該センス鎖は配列番号１７からなり、該アンチセンス鎖は配列番号１８からなる、ｄｓＲＮＡ。
11. 請求項１０に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
12. ｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む、生物体におけるＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物であって、前記ｄｓＲＮＡは互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、該センス鎖は配列番号１７からなり、該アンチセンス鎖は配列番号１８からなる、医薬組成物。
13. 髄腔内への注入または注射、あるいは静脈内への注入または注射からなる群から選択される投与のために製剤化されることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 細胞内のＮａｖ１．８遺伝子の発現をインビトロで抑制する方法であって、
    （ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、該センス鎖は配列番号１７からなり、該アンチセンス鎖は配列番号１８からなる、工程、および
    （ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、Ｎａｖ１．８遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞内のＮａｖ１．８遺伝子の発現を抑制する工程
    を含む方法。
15. 疼痛を治療、予防、または管理するための医薬組成物であって、治療上または予防上有効な量のｄｓＲＮＡを含み、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、該センス鎖は配列番号１７からなり、該アンチセンス鎖は配列番号１８からなる、医薬組成物。
16. 前記疼痛は、神経障害性疼痛および炎症性疼痛からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。

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