JP6189594B2 - アディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）関連疾患の治療 - Google Patents

アディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）関連疾患の治療 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる2009年8月11日出願米国仮特許出願第61/232,917号および2009年10月20日出願米国仮特許出願第61/253,187号の優先権を主張する。
本発明の実施形態は、アディポネクチン(ADIPOQ)および関連する分子の発現および/または機能を調節するオリゴヌクレオチドを含む。
DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼーションは、DNA複製、転写および翻訳を含む核酸機能の多くの観点において重要である。ハイブリダイゼーションは、特定の核酸を検出する、またはその発現を変化させる種々の技術の中心でもある。例えばアンチセンスヌクレオチドは、標的RNAにハイブリダイズすることによって遺伝子発現を中断させ、それによりRNAスプライシング、転写、翻訳および複製を妨げる。アンチセンスDNAは、DNA-RNAハイブリッドがリボヌクレアーゼH(大部分の細胞型に存在する活性)による消化のための基質として働くという追加的特性を有する。アンチセンス分子は、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)での場合は細胞に送達される場合があり、RNA分子として内在性遺伝子から発現されうる。近年FDAは、アンチセンス薬VITRAVENE(商標)(サイトメガロウイルス網膜炎の治療用)をアンチセンスが治療有用性を有することを反映して承認した。
米国仮特許出願第61/232,917号 米国仮特許出願第61/253,187号
一実施形態において本発明は、天然アンチセンス転写物の任意の領域を標的にする(1つまたは複数の)アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによって天然アンチセンス転写物の作用を抑制し、対応するセンス遺伝子の上方制御をもたらすための方法を提供する。天然アンチセンス転写物の抑制がsiRNA、リボザイムおよび小分子によって達成されうることも本明細書において意図され、本発明の範囲内であると考えられる。
一実施形態は、in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、配列番号3のヌクレオチド1〜416、配列番号4のヌクレオチド1〜3591、配列番号5のヌクレオチド1〜875、または配列番号6のヌクレオチド1〜194中の連続した5〜30ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの逆相補物に少なくとも50%の配列同一性を有する長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば配列番号3〜6に記載のヌクレオチドおよびその任意の変種、対立遺伝子、相同体、変異体、誘導体、断片および相補配列を標的にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列番号7〜31に記載されている。
他の実施形態は、in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのアンチセンスの逆相補物に少なくとも50%の配列同一性を有する長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態は、in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節する方法であって、アディポネクチン(ADIPOQ)アンチセンスポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに少なくとも50%の配列同一性を有する長さ5〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、前記細胞または組織を接触させ;それによりin vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能および/または発現を調節するステップを含む方法を提供する。
一実施形態において組成物は、センスおよび/またはアンチセンスアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドに結合する1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたまたは置換されたヌクレオチドを含む。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾された結合を含む。
さらに他の実施形態において修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、2’-O-メチル、フルオロ-または炭素、メチレンまたは他のロックド核酸(LNA)分子を含む修飾された塩基を含む。好ましくは修飾されたヌクレオチドは、α-L-LNAを含むロックド核酸分子である。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内で患者に投与される。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、医薬組成物中で投与される。治療計画は、アンチセンス化合物を少なくとも1回患者に投与するステップを含むが、この治療は一定期間にわたる複数回の投与を含むように変更されうる。治療は、1つまたは複数の他の種類の治療と組み合わされうる。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドはリポソームに封入される、または担体分子(例えばコレステロール、TATペプチド)に結合される。
他の態様は下に記載される。
対照と比較した、Lipofectamine 2000を使用して導入したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるHepG2細胞の処理後のADIPOQ1 mRNAにおける変化倍数+標準偏差を示すリアルタイムPCR結果を示す図である。リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ1 mRNAのレベルが、ADIPOQ1アンチセンスAA515150に対して設計した1つのオリゴおよびBC036509に対して設計した1つのオリゴを用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。CUR-1023〜CUR-1029として示すバーは、それぞれ、配列番号7〜13を用いて処理した試料に対応する。 対照と比較した、Lipofectamine 2000を使用して導入したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるHepG2細胞の処理後のADIPOQ1 mRNAにおける変化倍数+標準偏差を示すリアルタイムPCR結果を示す図である。リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した2つのオリゴ(CUR-1107および1108)ならびにBC036509に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1110)を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。CUR-1107、CUR-1108、CUR-1106、CUR-1110、およびCUR-1109として示すバーは、それぞれ、配列番号14〜18を用いて処理した試料に対応する。 対照と比較した、Lipofectamine 2000を使用して導入したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるVero細胞の処理後のADIPOQ1 mRNAにおける変化倍数+標準偏差を示すリアルタイムPCR結果を示す図である。リアルタイムPCR結果は、Vero細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1107)およびBC036509に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1110)を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。CUR-1107、CUR-1108、CUR-1106、CUR-1110、およびCUR-1109として示すバーは、それぞれ、配列番号14〜18を用いて処理した試料に対応する。 対照と比較した、Lipofectamine 2000を使用して導入したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるHepG2細胞の処理後のADIPOQ1 mRNAにおける変化倍数+標準偏差を示すリアルタイムPCR結果を示す図である。リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した2つのオリゴを用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。CUR-1167〜CUR-1171として示すバーは、それぞれ、配列番号19〜23を用いて処理した試料に対応する。 対照と比較した、Lipofectamine 2000を使用して導入したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いるHepG2細胞の処理後のADIPOQ2 mRNAにおける変化倍数+標準偏差を示すリアルタイムPCR結果を示す図である。リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOR2 mRNAのレベルが、ADIPOR2アンチセンスSkerblarbu.aApr ADIPOR2に対して設計したオリゴのうちの一方を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。CUR-1068〜CUR-1071およびCUR-1078〜CUR-1081として示すバーは、それぞれ、配列番号24〜31を用いて処理した試料に対応する。 ハイライト表示した、AA515150に対して設計したオリゴの位置と共に、アカゲザルゲノムに対してアライメントした天然アンチセンス配列AA515150を示す図である。 skerblarbu.a.Apr07に対して設計したオリゴの位置と共に、アカゲザルゲノムに対するアンチセンス配列skerblarbu.a.Apr07のアライメントを示す図である。
配列表の説明
配列番号1:ホモサピエンスアディポネクチン、C1Qおよびコラーゲンドメイン含有(ADIPOQ)転写変異体2 mRNA(NCBI受託番号:NM_004797);配列番号2:ホモサピエンスアディポネクチン受容体2(ADIPOR2)mRNA(NCBI受託番号:NM_024551);配列番号3:天然アンチセンス配列(AA515150);配列番号4:天然アンチセンス配列(BC036509);配列番号5:天然アンチセンス配列(LOC729097.aApr07);配列番号6:天然ADIPOQ1アンチセンス配列(skerblarbu.aApr07);配列番号:7〜31:アンチセンスオリゴヌクレオチド*は、ホスホロチオエート結合を示す。
本発明のいくつかの態様は、以下に例示のための応用の実例を参照して記載される。多数の特定の詳細、関係性および方法が本発明の十分な理解を提供するために記載されることは理解されるべきである。しかし当業者は、本発明が1つもしくは複数の具体的な詳細を使用せずに、または他の方法を使用して実施されうることを容易に認識する。本発明は、いくつかの行為が異なる順序でおよび/または他の行為もしくは事象と同時に生じうることから、行為または事象の順序によって限定されない。さらに例示された全ての行為または事象が本発明による方法を実行するために必要とされるのではない。
本明細書において開示される全ての遺伝子、遺伝子名および遺伝子産物は、本明細書において開示される組成物および方法を適用できる任意の種由来の相同物に対応して意味する。したがって用語は、これだけに限らないがヒトおよびマウス由来の遺伝子および遺伝子産物を含む。特定の種由来の遺伝子または遺伝子産物が開示される場合に、この開示が例示のみを目的とし明確に示すと考えられる文脈が無ければ限定として解釈されないことは理解される。したがって例えば本明細書において開示される遺伝子に関して、哺乳動物に関するいくつかの実施形態において核酸およびアミノ酸配列は、これだけに限らないが他の哺乳動物、魚類、両生類、は虫類および鳥類を含む他の動物由来の相同なおよび/またはオルソロガスな遺伝子および遺伝子産物を包含することが意図される。好ましい実施形態において遺伝子または核酸配列はヒトである。
定義
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本発明の限定となることを意図しない。本明細書において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないと明確に示さなければ複数形を同様に含んで意味する。さらに用語「含んでいる(including)」、「含む(include)」、「有している(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」またはそれらの変形は、詳細な記載および/または特許請求の範囲のいずれにおいても使用され、そのような用語は用語「含む(comprising)」と同様の様式で包括的であることを意図する。
用語「約(about)」または「およそ(approximately)」は、当業者によって決定された特定の値についての許容できる誤差範囲内を意味し、値がどのように測定または決定されたか、すなわち測定系の限界に部分的に依存する。例えば「約」は、当技術分野における実施あたりで1または1より大きい標準偏差を意味できる。別法として「約」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%までおよびより好ましくはさらに1%までの範囲を意味できる。別法として生物学的系またはプロセスに具体的に関して用語は、値の1桁の範囲内、好ましくは5倍以内およびより好ましくは2倍以内を意味できる。特定の値が出願書類および特許請求の範囲に記載される場合、他に明記しない限り用語「約」は特定の値についての許容できる誤差範囲内を意味すると考えられるべきである。
本明細書において使用される用語「mRNA」は、標的遺伝子の現在周知の(1つまたは複数の)mRNA転写物および明らかにされうる任意のさらなる転写物を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」によって、他のRNAまたはDNA(標的RNA、DNA)に結合するRNAまたはDNA分子が意味される。例えばRNAオリゴヌクレオチドの場合、それは他のRNA標的にRNA-RNA相互作用の手段によって結合し、標的RNAの活性を変化させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドの発現および/または機能を上方制御または下方制御できる。定義は、治療、診断または他の観点から有用である任意の外来性RNAまたはDNA分子を含んで意味する。そのような分子として、例えばアンチセンスRNAまたはDNA分子、干渉RNA(RNAi)、マイクロRNA、デコイRNA分子、siRNA、酵素的RNA、治療用編集RNA(therapeutic editing RNA)ならびにアゴニストおよびアンタゴニストRNA、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列(external guide sequence) (EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー(alternate splicers)、プライマー、プローブならびに標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が挙げられる。このようにこれらの化合物は、1本鎖、2本鎖、部分的な1本鎖または環状オリゴマー化合物の形態で導入されうる。
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」はリボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーを意味する。用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらの置換型およびアルファ-アノマー型、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどを含んで天然および/または修飾された単量体または結合の直鎖状または環状オリゴマーも含む。オリゴヌクレオチドは、ワトソン-クリック型の塩基対形成、フーグスティーンまたは非フーグスティーン型の塩基対形成などのような単量体-単量体相互作用の通常の様式の方法によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合できる。
オリゴヌクレオチドは、異なる領域からなる「キメラ」でありうる。本発明の文脈において「キメラ」化合物は、2つ以上の化学的領域、例えば(1つまたは複数の)DNA領域、(1つまたは複数の)RNA領域、(1つまたは複数の)PNA領域などを含有するオリゴヌクレオチドである。各化学的領域は、少なくとも1つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドからなる。典型的にはこれらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の所望の特性を示すために修飾された少なくとも1つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの所望の特性として、これだけに限らないが例えばヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞への取込みの増大および/または標的核酸に対する結合親和性の増大が挙げられる。したがってオリゴヌクレオチドの異なる領域は、異なる特性を有しうる。本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/または上に記載のオリゴヌクレオチド類似体の混合構造として形成されうる。
オリゴヌクレオチドは、「レジスタ(register)」に結合されうる領域から構成されるものでありえ、単量体が連続的に結合する場合、天然DNAにおいてと同様であるかまたはスペーサーを介して結合される。スペーサーは、領域間の共有結合「架橋」を構成することを意図し、場合により炭素原子約100個を超えない長さを有する。スペーサーは、さまざまな機能(例えば正電荷または負電荷の含有)を保持でき、特殊な核酸結合特性(干渉物質、グルーブバインダー、毒素、フルオロフォアなど)を保持でき、親油性であり、例えばアルファヘリックスを誘導するアラニン含有ペプチドのような特殊な2次構造を誘導する。
本明細書において使用されるように、「アディポネクチン(ADIPOQ)」は、すべてのファミリーメンバー、突然変異体、対立遺伝子、断片、化学種、コード配列および非コード配列、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを含む。
本明細書において使用されるように、アディポネクチン1、ADIPOQ1、30kDa脂肪細胞補体関連タンパク質、ACDC、ACRP30、脂肪細胞、C1qおよびコラーゲンドメイン含有タンパク質、脂肪細胞補体関連30kDaタンパク質、アディポネクチン(adiponectin)、アディポネクチン(Adiponectin)、AdipoQ、脂肪組織中に特異的に発現する遺伝子(Adipose most abundant gene transcript 1)タンパク質、ADIPQTL1、ADPN、apM1、APM1、apM-1、APM-1、GBP28、およびゼラチン結合タンパク質という用語は、文献において同一と考えられ、本出願において区別なく使用される。
本明細書において使用されるように、ACDCR2、アディポネクチン受容体タンパク質2、FLJ21432、MGC4640、PAQR2、プロゲスチン、およびadipoQ受容体ファミリーメンバーIIという用語は、本出願において区別なく使用される。
本明細書において使用される用語「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「を標的とするオリゴヌクレオチド」は(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成できる配列、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な2重鎖を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。複合体および2重鎖の安定性は、理論計算および/またはin vitroアッセイによって決定されうる。ハイブリダイゼーション複合体および2重鎖の安定性を決定するための例示的方法は、下の実施例において記載される。
本明細書において使用される用語「標的核酸」は、DNA、そのようなDNAから転写されたRNA(プレmRNAおよびmRNAを含む)ならびにそのようなRNA、コード配列、非コード配列、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドに由来するcDNAも包含する。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の通常の機能を妨げる。特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、通常「アンチセンス」と称される。妨げられるDNAの機能として、例えば複製および転写が挙げられる。妨げられるRNAの機能として、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの移行、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を得るためのRNAのスプライシングおよびRNAが関与しうる、またはRNAによって促進されうる触媒活性などの全ての生体機能が挙げられる。標的核酸機能でのそのような干渉の全体的効果は、コードされる産物またはオリゴヌクレオチドの発現の調節である。
RNA干渉「RNAi」は、「標的」核酸配列に配列特異的相同性を有する2本鎖RNA(dsRNA)分子によって介在される。本発明の特定の実施形態において介在物質は、5〜25ヌクレオチドの「低分子干渉」RNA2重鎖(siRNA)である。siRNAは、ダイサーとして周知のRNase酵素によるdsRNAのプロセシングに由来する。siRNA 2重鎖産物は、RISC(RNA Induced Silencing Complex、RNA誘導サイレンシング複合体)と称される多タンパク質siRNA複合体に入る。いかなる特定の理論にも制約されることなく、次いでRISCは、siRNA 2重鎖が配列特異的方法で相互作用し、触媒的に切断を介在する標的核酸(適切にはmRNA)に導かれると考えられる。本発明により使用されうる低分子干渉RNAは、当技術分野において十分に周知であり、当業者によく知られている手順に従って合成および使用されうる。本発明の方法における使用のための低分子干渉RNAは、適切には約1〜約50の間のヌクレオチド(nt)を含む。非限定的実施形態の例において、siRNAは約5〜約40nt、約5〜約30nt、約10〜約30nt、約15〜約25ntまたは約20〜25ヌクレオチドを含みうる。
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、自動的に核酸配列をアラインメントし、同一または相同な領域を示すコンピュータープログラムを使用することによって促進される。そのようなプログラムは、例えばGenBankなどのデータベースを検索することによって、またはPCR産物を配列決定することによって得られた核酸配列を比較するために使用される。さまざまな種由来の核酸配列の比較は、種の間で適切な程度の同一性を示す核酸配列の選択を可能にする。配列決定されていない遺伝子の場合は、サザンブロットが標的種および他の種における遺伝子間での同一性の程度の決定を可能にするために実施される。当技術分野において十分に周知のとおり、種々の程度のストリンジェンシーでのサザンブロットを実施することによって、同一性の概算的測定値を得ることが可能である。これらの手順は、管理される対象における標的核酸配列に高い相補性を示し、他の種における対応する核酸配列に低い相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択を可能にする。当業者は、本発明における使用のための遺伝子の適切な領域を選択することにおいては相当な許容範囲があることを理解する。
「酵素的RNA」によって酵素活性を有するRNA分子が意味される。酵素的核酸(リボザイム)は、最初に標的RNAに結合することによって作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するために作用する分子の酵素的部分の近接に保持される酵素的核酸の標的結合部分を通じて生じる。したがって酵素的核酸は、最初に標的RNAを認識し、次いで塩基対形成を通じて結合し、ひとたび正しい部位に結合すると標的RNAを切断するために酵素的に作用する。
「デコイRNA」によって、リガンドに対する天然結合ドメインを模倣するRNA分子が意味される。したがってデコイRNAは、特異的リガンドの結合に関して天然結合標的と競合する。例えば、HIVトランス活性化応答(TAR)RNAの過発現は、「デコイ」として作用することができ、HIV tatタンパク質に効率的に結合し、それによりHIV RNAにコードされるTAR配列へのその結合を妨げることが示されている。これは、具体的な例を意味する。当業者は、これが一例に過ぎず、他の実施形態が当技術分野において公知の技術を使用して容易に作成されうることを理解する。
本明細書において使用される用語「単量体」は、典型的には、大きさで数個、例えば約3〜4個の単量体単位から約数百個の単量体単位までの範囲のオリゴヌクレオチドを形成するホスホジエステル結合またはその類似結合によって連結された単量体を示す。ホスホジエステル結合の類似として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロセレノエート、ホスホラミデートなどが挙げられ、下により詳細に記載される。
用語「ヌクレオチド」は天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドを含む。以前「天然に存在しない」と考えられていた種々のヌクレオチドが後に天然で見出されたことは当業者に明確であるべきである。したがって「ヌクレオチド」は、周知のプリンおよびピリミジン複素環含有分子だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。他のタイプのヌクレオチドの例示的実例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、8-oxo-N6-メチルアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、N4,N4-エタノシトシン、N6,N6-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン、5-(C3-C6)-アルキニルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、シュードイソシトシン(pseudoisocytosine)、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン(2-hydroxy-5-methyl-4-triazolopyridin)、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許第5,432,272号に記載の「天然に存在しない」ヌクレオチドを含む分子である。用語「ヌクレオチド」は、これらの全ての例の全体ならびにその類似体および互変異性体を含むことを意図する。特に興味深いヌクレオチドは、ヒトにおける治療的および診断的応用に関連する天然に存在するヌクレオチドと考えられるアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルを含むヌクレオチドである。ヌクレオチドは、例えばKornbergおよびBaker、DNA Replication、第2版(Freeman、San Francisco、1992)に記載の天然2'-デオキシおよび2'-ヒドロキシ糖ならびにそれらの類似体が挙げられる。
ヌクレオチドに関して「類似体」は、修飾された塩基成分および/または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド;2'-O, 3'-C-結合[3.2.0]ビシクロアラビノヌクレオシドを含む。そのような類似体は、結合特性、例えば2重鎖または3重鎖安定性、特異性などを増強するために設計された合成ヌクレオシドを含む。
本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の実質的な相補鎖の対形成を意味する。対形成の1つの機序は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基(ヌクレオチド)間でのワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる水素結合を含む。例えばアデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する相補的ヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、種々の環境下で生じうる。
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が標的核酸の通常の機能を妨げて機能および/または活性の調節を生じ、特異的結合が望ましい条件下(すなわちin vivoアッセイまたは治療的処置の場合での生理的条件下およびin vitroアッセイの場合でのアッセイが実施される条件下)でアンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合に「特異的にハイブリダイズできる」。
本明細書において使用される表現「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズし、他の配列の最小数にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下では異なっており、本発明の文脈においてオリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成物ならびにそれらが調査されるアッセイによって決定される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Na+またはK+などの無機陽イオン塩の低濃度(<0.15M)(すなわち低イオン強度)、20℃〜25℃より高くオリゴマー化合物:標的配列複合体のTmより低い温度、およびホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの変性剤または界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在を含む。例えば、ハイブリダイゼーション率はホルムアミド1%ごとに1.1%低下する。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件の例は、0.1×塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)/0.1%(w/v)SDSで60℃、30分間である。
本明細書において使用される「相補性」は、1つまたは2つのオリゴマー鎖上の2つのヌクレオチド間の正確な対形成のための能力を意味する。例えばアンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置で核酸塩基と水素結合でき、前記標的核酸がDNA、RNAまたはオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補的位置であると考えられる。オリゴマー化合物とさらなるDNA、RNAまたはオリゴヌクレオチド分子とは、各分子における十分な数の相補的位置が相互に水素結合できるヌクレオチドによって占められる場合に相互に相補的である。したがって「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的」は、オリゴマー化合物と標的核酸との間に安定かつ特異的な結合が生じるような十分な数のヌクレオチドにわたる十分な程度の正確な対形成または相補性を示すために使用される用語である。
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズできるその標的核酸のそれに100%相補的である必要がないことは当技術分野において理解される。さらにオリゴヌクレオチドは、介在するまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与せずに(例えばループ構造、ミスマッチもしくはヘアピン構造)1つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズできる。本発明のオリゴマー化合物は、少なくとも約70%、または少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%または少なくとも約99%の配列相補性をそれらがターゲッティングされる標的核酸配列中の標的領域に対して含む。例えば、アンチセンス化合物の20個のヌクレオチドのうちの18個が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性を示す。この例において残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共に一群となっていても点在していても良く、相互にまたは相補的ヌクレオチドに近接している必要はない。そのように長さ18ヌクレオチドであり、標的核酸と完全に相補的な2つの領域によって隣接された4つ(4個)の非相補的ヌクレオチドを有するアンチセンス化合物は、標的核酸に全体で77.8%の相補性を有し、したがって本発明の範囲内になる。アンチセンス化合物と標的核酸の領域との相補性百分率は、当技術分野において周知のBLASTプログラム(basic local alignment search tools)およびPowerBLASTプログラムを使用して日常的に決定されうる。相同性百分率、配列同一性または相補性は、例えば、SmithおよびWatermanのアルゴリズム(Adv. Appl. Math.(1981)、2、482〜489)を使用するGapプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix(登録商標)、Genetics Computer Group、University Research Park、Madison Wis.)の初期設定を使用することによって決定されうる。
本明細書において使用される用語「熱融点(Tm)」は、規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で、標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度を意味する。典型的にはストリンジェントな条件は、塩濃度が少なくともNaイオン濃度(または他の塩)約0.01〜1.0M、pH7.0〜8.3であり、短いオリゴヌクレオチド(例えば10〜50ヌクレオチド)については温度が低くとも約30℃であるものである。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成されうる。
本明細書において使用される用語「調節」は、遺伝子の発現における増大(刺激)または減少(抑制)を意味する。
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される場合に用語「変種」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含する。この定義は、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」または「多型」変種も含みうる。スプライス変種は、参照分子に顕著な同一性を有しうるが、一般にmRNAプロセシングの際のエクソンの選択的スプライシングによる、より多いまたは少ない数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、追加的機能ドメインまたはドメインの欠損を有しうる。種の変種は、1つの種から他の種へ変化するポリヌクレオチド配列である。本発明における特定の有用性は、野生型遺伝子産物の変種である。変種は、核酸配列における少なくとも1つの変異から生じることができ、変化したmRNAまたはその構造または機能が変化していても変化していなくてもよいポリペプチドを生じうる。任意の所与の天然または組換え遺伝子は、対立形態を有さない場合も、1つ有する場合も、多数有する場合もある。変種を生じる通常の変異変化は、一般に天然の欠失、追加またはヌクレオチドの置換に帰する。これらの型の変化のそれぞれは、単独でまたは他との組合せで1回または複数回、所与の配列に生じうる。
得られたポリペプチドは、一般に相互に比較して顕著なアミノ酸同一性を有する。多型変種は、所与の種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変種である。多型変種は、「単一ヌクレオチド多型」(SNP)またはポリヌクレオチド配列が1塩基によって変化している単一塩基変異も包含できる。SNPの存在は、例えば、易罹患性対抵抗性である病態についてのある傾向を有する特定の集団についての指標でありうる。
誘導体ポリヌクレオチドは、化学的修飾(例えば水素のアルキル、アシルまたはアミノ基での置換)に供された核酸を含む。誘導体、例えばオリゴヌクレオチド誘導体は、修飾された糖部分または糖間結合などの天然に存在しない部分を含みうる。これらにおける例は、ホスホロチオエートおよび当技術分野において周知の他のイオウ含有種である。誘導核酸は、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁性粒子などが挙げられる標識も含みうる。
「誘導体」ポリペプチドまたはペプチドは、例えばグリコシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、還元/アルキル化、アシル化、化学的カップリングまたは穏やかなホルマリン処理によって修飾されたものである。誘導体は、これだけに限らないが放射性同位元素、蛍光または酵素標識が挙げられる検出可能な標識を含有するために直接または間接的のいずれかで修飾もされうる。
本明細書において使用される用語「動物」または「患者」は、例えばヒト、ヒツジ、エルク(elk)、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳動物、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、は虫類、魚類、昆虫およびクモ類を含んで意味する。
「哺乳動物」は、典型的には医療の下にある温血哺乳動物(例えばヒトおよび家畜)を含む。例として、ヒトのみに加えて、ネコ、イヌ、ウマ、ウシおよびヒトが挙げられる。
「治療」または「処置」は、(a)哺乳動物において病態が生じることを予防するステップ、具体的にはそのような哺乳動物が病態を罹患しやすいが、罹患しているとまだ診断されていない場合;(b)病態を抑制するステップ、例えばその進行を止めるステップ;および/または(c)病態を軽減するステップ、例えば病態の退行を所望の終点に至るまで生じさせるステップ、を含む哺乳動物における病態の処置を含む。治療は、疾患の症状の回復(例えば疼痛または不快感の緩和)も含み、そのような回復は、疾患に直接効果を与えるまたは与えない場合がある(例えば原因、伝染、発現など)。
本明細書において使用される「癌」は、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌、および肉腫が含まれるがそれらに限定されない、哺乳動物において見出される全ての種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。癌は、「腫瘍」または癌の悪性細胞を含む組織として顕在化する。腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮種、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起膠細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫などであるがそれらに限定されない肉腫および癌が含まれる。本発明により開示される組成物により治療しうる追加的な癌には、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増多症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺癌、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓性インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頚癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が含まれるがそれらに限定されない。
「神経疾患または神経障害」は、神経系および/または視覚系の任意の疾患または障害を指す。「神経疾患または神経障害」は、中枢神経系(脳、脳幹、および小脳)、末梢神経系(脳神経を含めた)、および自律神経系(その一部は、中枢神経系および末梢神経系の両方に位置する)に関与する疾患または障害を包含する。神経障害の例には、頭痛、昏迷および昏睡、認知症、発作、睡眠障害、外傷、感染症、新生物、神経眼科疾患(neuroophthalmology)、運動障害、脱髄疾患、脊髄傷害、ならびに末梢神経、筋肉、および神経筋接合部の障害が含まれるがこれらに限定されない。中毒および精神病には双極性障害および統合失調症が含まれるがこれらに限定されず、これらもまた、神経障害の定義内に包含される。以下:後天性癲癇様失語症;急性播種性脳脊髄炎;副腎白質ジストロフィー;加齢黄斑変性;脳梁欠損;失認症;アイカルディ症候群;アレクサンダー病;アルパース病;交代性片側麻痺;血管性認知症;筋萎縮性側索硬化症;無脳症;アンゲルマン症候群;血管腫症;無酸素症;失語症;失行症;クモ膜嚢胞;クモ膜炎;アーノルド-キアリ奇形;同静脈奇形;アスペルガー症候群;血管拡張性失調症;注意欠損多動性障害;自閉症;自律神経機能不全;背部痛;バッテン病;ベーチェット病;ベル麻痺;良性特発性眼瞼痙攣;良性限局性筋委縮症；良性頭蓋内圧亢進;ビンスワンガー病;眼瞼痙攣;ブロッホ-ズルツベルガー症候群;腕神経叢傷害;脳膿瘍;脳傷害;脳腫瘍(多形神経膠芽腫を含めた);脊髄腫瘍;ブラウン-セカール症候群;カナバン病;手根管症候群;カウザルギー;中枢性疼痛症候群;橋中心髄鞘融解；頭部障害;脳動脈瘤;脳動脈硬化症;脳萎縮;脳性巨人症;脳性麻痺;シャルコー-マリー-トゥース病;化学療法誘導性神経障害および神経障害性疼痛;キアリ奇形;舞踏病;慢性炎症性脱髄性多発神経炎;慢性疼痛;慢性局所疼痛症候群;コフィン-ローリー症候群;遷延性植物状態を含めた昏睡;先天性眼筋麻痺;大脳皮質基底核変性症;頭蓋動脈炎;頭蓋骨縫合早期癒合症;クロイツフェルト-ヤコブ病;累積外傷性障害;クッシング症候群;巨大細胞性封入体病;サイトメガロウイルス感染;眼球クローヌス-ミオクローヌス症候群(dancing eyes-dancing feet syndrome);ダンディー-ウォーカー症候群;ドーソン病;ドモルシエ症候群;デジェリン-クルンプケ麻痺;認知症;皮膚筋炎;糖尿病性神経障害;びまん性硬化症(diffuse sclerosis);自律神経失調症;書字障害;識字障害;ジストニア;早期乳児癲癇性脳症;トルコ鞍空洞症候群;脳炎;脳瘤;脳三叉領域血管腫症;癲癇;エルブ麻痺;特発性振戦;ファブリー病;ファール病;失神;家族性痙性麻痺;熱性痙攣;フィッシャー症候群;フリードリッヒ運動失調;前頭側頭型痴呆症および他の「タウオパチー」;ゴーシェ病;ゲルストマン症候群;巨細胞動脈炎;巨細胞性封入体病;グロボイド細胞性白質ジストロフィー;ギラン-バレー症候群; HTLV1随伴脊髄症;ハラーフォルデン-シュパッツ病;頭部傷害;頭痛;家族性痙攣;遺伝性痙性対麻痺;遺伝性多発性神経炎性失調;耳性帯状ヘルペス;帯状ヘルペス;平山症候群; HIV随伴認知症および神経障害(また、AIDSの神経症状);全前脳胞症;ハンチントン病および他のポリグルタミン反復病;水無脳症；水頭症;副腎皮質ホルモン過剰症;低酸素症;免疫媒介性脳脊髄炎;封入体筋炎;色素失調症;乳児フィタン酸蓄積症;乳児レフスム病;乳児痙攣;炎症性筋炎;頭蓋内嚢胞;頭蓋内高血圧;ジュベール症候群;カーンズ-セイヤー症候群;ケネディー病;傍腫瘍性眼球クローヌスミオクローヌス運動失調(Kinsbourne syndrome);クリッペル-ファイル症候群;クラッベ病;クーゲルベルク-ヴェランダー病;クル病;ラフォラ病;ランバート-イートン筋無力症候群;ランダウ-クレフナー症候群;延髄外側(ヴァレンベルク)症候群;学習障害;リー病;レノックス-ガストー症候群;レッシュ-ナイハン症候群;白質ジストロフィー;レーヴィ小体認知症;滑脳症;閉じ込め症候群;ルーゲーリック病(すなわち、運動ニューロン病または筋萎縮性側索硬化症);腰部椎間板症;ライム病:神経学的続発症;マチャド-ジョゼフ病;巨大脳髄症;巨脳症;メルカーソン-ローゼンタール症候群;メニエール病;髄膜炎;メンケス病;異染性白質ジストロフィー;小頭症;偏頭痛;ミラー-フィッシャー症候群;小発作;ミトコンドリア筋症;メビウス症候群;平山病(monomelic amyotrophy);運動ニューロン病;もやもや病;ムコ多糖症;多発梗塞性認知症;多巣性運動ニューロパチー;多発性硬化症および他の脱髄性障害;体位性低血圧を伴う多系統萎縮症;進行性筋ジストロフィー;重症筋無力症;びまん性硬化症(myelinoclastic diffuse sclerosis);乳児ミオクローヌス癲癇(myoclonic encephalopathy of infants);ミオクローヌス;ミオパチー;先天性筋緊張症;ナルコプレシー;神経線維腫症;神経遮断薬悪性症候群;AIDSの神経症状;全身性エリテマトーデスの神経学的続発症;神経性筋緊張症;神経セロイドリポフスチン症;神経細胞遊走障害;ニーマン-ビック病;オサリバン-マクレオド症候群;後頭神経痛;潜在性二分脊椎症(occult spinal dysraphism sequence);大田原症候群;オリーブ橋小脳萎縮症;眼球クローヌスミオクローヌス運動失調;視神経炎;起立性低血圧;使い過ぎ症候群;感覚異常;神経変性疾患または神経変性障害(パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、認知症、多発性硬化症、ならびに神経細胞死に関連する他の疾患および障害);先天性異常筋強直;傍腫瘍性疾患;発作(paroxysmal attacks);パリー-ロンベルク症候群;ペリツェウス-メルツバッハー症候群;周期性麻痺;末梢性神経障害;有痛性神経障害および神経障害性疼痛;遷延性植物状態;広範性発達障害;光くしゃみ反射;フィタン酸蓄積症;ピック病;圧迫性神経痛(pinched nerve);下垂体腫瘍;多発性筋炎;孔脳症;ポリオ後症候群;ヘルペス後神経痛;後感染性脳脊髄炎;体位性低血圧;プラダー-ウィリー症候群;原発性側索硬化症;プリオン病;進行性顔面半側萎縮症;進行性多巣性白質脳症;進行性硬化性ポリオジストロフィー;進行性核上性麻痺;偽脳腫瘍;ラムゼイ-ハント症候群(I型およびII型);ラスムッセン脳炎;反射性交感神経性ジストロフィー症候群;レフスム病;反復性運動障害;反復性ストレス傷害;むずむず足症候群;レトロウイルス随伴脊髄症;レット症候群;ライ症候群;聖ヴィトゥス舞踏病;ザントホフ病;シルダー病;裂脳症;中隔視神経異形成症;揺さぶられっ子症候群;帯状疱疹;シャイ-ドレーガー症候群;シェーグレン症候群;睡眠時無呼吸症;ソトス症候群;痙縮;二分脊椎症;脊髄傷害;脊髄腫瘍;脊髄性筋委縮症;スティッフ-パーソン症候群;脳卒中;スタージ-ウェーバー症候群;亜急性硬化性全脳炎;皮質下動脈硬化性脳症;シデナム舞踏病;失神;脊髄空洞症;遅発性ジスキネジー;テイ-サックス病;側頭動脈炎;脊髄係累症候群;トムゼン病;胸郭出口症候群;三叉神経痛(Tic Doloureux);トッド麻痺;トゥレット症候群;一過性虚血性発作;伝染性海綿状脳症;横断性脊髄炎;外傷性脳傷害;振戦;三叉神経痛(trigeminal neuralgia);熱帯性痙性不全対麻痺症;結節性硬化症;血管性認知症(多発性梗塞性認知症);側頭性動脈炎を含めた血管炎;フォンヒッペル-リンダウ病;ヴァレンベルク症候群;ヴェルトニッヒ-ホフマン病;ウェスト症候群;鞭打ち症;ウィリアムズ症候群;ウィルソン病;ならびにツェルヴェーガー症候群は、本発明による組成物および方法を使用して治療しうる複数の神経障害、神経症状、神経徴候、および神経症候群のリストである。
「代謝性疾患」は、例えば、インスリン耐性、糖尿病、肥満、グルコース耐性障害、高血中コレステロール、高血糖症、脂質異常症、および高脂血症を含めた、広範囲にわたる内分泌系疾患および内分泌系障害を指す。
「炎症」は、全身性炎症状態、ならびに単球、白血球、および/または好中球の遊走および誘引と局所的に関連する状態を指す。炎症の例には、病原性生物(グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス、真菌、原虫および蠕虫などの寄生虫)による感染、移植拒絶(腎臓、肝臓、心臓、肺、または角膜など固体内臓の拒絶、ならびに移植片対宿主病(GVHD)を含めた骨髄移植の拒絶)、または局在化された慢性もしくは急性の自己免疫反応もしくはアレルギー反応から生じる炎症が含まれるがそれらに限定されない。自己免疫疾患には、急性糸球体腎炎;関節リウマチまたは反応性リウマチ;慢性糸球体腎炎;クローン病、潰瘍性大腸炎、および壊死性大腸炎などの炎症性腸疾患;顆粒球輸血関連症候群;接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬などの炎症性皮膚疾患;全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、および糖尿病の一部の形態、または対象自身の免疫系による攻撃の結果病理的な組織破壊が生じる他の任意の自己免疫状態が含まれる。アレルギー反応には、アレルギー性喘息、慢性気管支炎、急性過敏症および遅延型過敏症が含まれる。全身炎症性病態には、外傷、火傷、虚血性事象(例えば、心筋梗塞および脳卒中を含めた、心臓、脳、腸、または末梢血管系における血栓性事象)後の再灌流、敗血症、ARDS、または多臓器不全症候群と関連する炎症が含まれる。炎症細胞の動員はまた、アテローム斑内においても生じる。炎症には、非ホジキンリンパ腫、ウェゲナー肉芽腫症、橋本甲状腺炎、肝細胞癌、胸腺不形成、慢性膵炎、関節リウマチ、反応性リンパ過形成、骨関節症、潰瘍性大腸炎、乳頭癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、肝硬変、慢性唾液腺炎、腹膜炎、急性膵炎、慢性膵炎、慢性胃炎、腺筋炎、子宮内膜炎、急性子宮頚炎、慢性子宮頚炎、リンパ過形成、多発性硬化症、特発性血小板減少性紫斑に続発する肥大、原発性IgA腎症、全身性エリテマトーデス、乾癬、肺気腫、慢性腎盂腎炎、および慢性膀胱炎が含まれるがそれらに限定されない。
「心血管疾患または心血管状態」には、虚血症を引き起こしうる、または心臓の再灌流により引き起こされる障害が含まれる。例には、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、肉芽腫性心筋炎、慢性心筋炎(非肉芽腫性)、原発性肥大型心筋症、末梢動脈疾患(PAD)、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心停止により引き起こされる心血管組織損傷、心臓バイパス術により引き起こされる心血管組織損傷、心原性ショック、ならびに当業者により知られる関連状態、あるいはとりわけアディポネクチン活性化と関連する組織損傷であるがそれらに限定されない心臓もしくは血管の機能障害または心臓もしくは血管に対する組織損傷を伴う関連状態が含まれるがそれらに限定されない。CVS疾患には、アテローム性動脈硬化、肉芽腫性心筋炎、心筋梗塞、心弁疾患に続発する心筋線維症、梗塞を伴わない真菌線維症、原発性肥大型心筋症、および慢性心筋炎(非肉芽腫性)が含まれるがそれらに限定されない。
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物および分子
標的
一実施形態では、標的は、アディポネクチン(ADIPOQ)の核酸配列、限定を伴うことなく、アディポネクチン(ADIPOQ)と関連するセンスおよび/またはアンチセンス非コードおよび/またはコード配列を含む。
一実施形態では、標的は、ADIPOQ1の核酸配列、限定を伴うことなく、ADIPOQ1遺伝子と関連するセンスおよび/またはアンチセンス非コードおよび/またはコード配列を含む。
一実施形態では、標的は、ADIPOQ2の核酸配列、限定を伴うことなく、ADIPOQ2遺伝子と関連するセンスおよび/またはアンチセンス非コードおよび/またはコード配列を含む。
GBP-28、apM1、AdipoQ、およびAcrp30とも呼ばれるアディポネクチンは、コラーゲンVIIIおよびXならびに補体因子C1qに対して構造的な相同性を有し、ハイレベルでヒト血漿中を循環する新規な脂肪組織特異的タンパク質である。それは、脂肪組織によって分泌される生理活性ポリペプチドのうちの1つであり、これらの複数の機能は、最近の数年で理解され始めた。アディポネクチン発現の低下は、いくつかの動物モデルにおいてインスリン抵抗性と関連している。アディポネクチンの投与には、血漿グルコースの低下およびインスリン感受性の増加が伴った。さらに、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマの刺激を通してインスリン感受性を増強する薬剤であるチアゾリジンジオンは、マウスにおいて血漿アディポネクチンおよびmRNAのレベルを増加させる。他方、この脂肪細胞タンパク質は、血管傷害の実験モデルにおいて保護的な役割を果たすように思われる。ヒトにおいて、アディポネクチンレベルは、脂肪症の程度に逆相関し、健常対象および糖尿病患者の両方においてインスリン感受性と正の関連を示す。血漿アディポネクチンレベルは、肥満および2型真性糖尿病などのようないくつかのインスリン抵抗性の状態においてならびにまた冠動脈疾患を有する患者において減少することが報告された。これに反して、慢性腎不全、I型糖尿病、および神経性食欲不振症は、血漿アディポネクチンレベルの増加と関連する。血漿アディポネクチンの濃度は、グルコース、インスリン、トリグリセリドのレベル、およびボディマス指数と負に相関することならびに高密度リポタンパク質コレステロールレベルおよびインスリン刺激グルコース処理と正に相関することが示された。体重減少およびチアゾリジンジオンを用いる療法は、ヒトにおいて内因性アディポネクチン産生を増加させた。アディポネクチンは、組織の脂肪酸化を増加させることによってインスリン感受性を増加させ、肝臓および筋肉において、循環脂肪酸レベルの低下および細胞内トリグリセリド含有量の低下をもたらす。このタンパク質はまた、血管内皮細胞における接着分子の発現およびマクロファージからのサイトカイン産生を抑制し、したがって、アテローム性動脈硬化症の初期の間に生じる炎症性のプロセスを阻害する。
エネルギー貯蔵のための受動的な貯蔵所としての脂肪組織について古典的な考え方は、もはや妥当ではない。過去十年間で、脂肪組織は、心臓血管の生理機能を調節する内分泌機能を有することが示された。アディポネクチン分泌は、TNFアルファおよびカテコールアミンによって阻害され、PPARガンマ活性化によって刺激される。アディポネクチンは、2つの主な受容体、AdipoR1およびAdipoR2を通して作用する。肝臓において、アディポネクチンは、脂質およびエネルギーの代謝を調整し、脂肪酸異化を刺激し、グルコース新生を低下させる。骨格筋において、それは、脂肪酸酸化およびグルコース取込みを促進する。まとめると、アディポネクチンの代謝作用は、インスリン感受性を増強し、循環脂質レベルを低下させる。アディポネクチンはまた、アテローム発生に対して保護的な効果を有し、内皮および平滑筋細胞に作用し、NO分泌を高め、接着因子の産生を阻害する。心臓において、アディポネクチンは、十分に理解されていないメカニズムを通して、心筋細胞肥大および心筋線維症を阻害する。アディポネクチン産生はまた、肥満および2型糖尿病を有する患者において低下することが示され、その循環レベルは、様々な心疾患において予後の重要性を有する。
脂肪組織は、トリグリセリド貯蔵の部位だけでなく、「アディポカイン」と呼ばれる多くの生物学的活性媒介物質を分泌する、活性のある内分泌器官である。レプチン、腫瘍壊死因子アルファ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-I、レジスチンなどのような、肥満の個人において過剰に産生され、インスリン感受性、リポタンパク質代謝、および心臓血管系に対する有害作用を及ぼす多くのアディポカインとは対照的に、アディポネクチンは、痩せた対象よりも肥満の対照において少量で産生され、主に有利な活性を有する、つまり、インスリン感受性を増加させ、脂肪酸酸化を刺激し、炎症反応を阻害し、内皮依存性一酸化窒素媒介性血管弛緩を誘発する特有のアディポカインであるように思われる。アディポネクチンは、2つの受容体、AdipoR1およびAdipoR2に結合する。アディポネクチンノックアウトマウスは、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高脂質血症、内皮依存性血管弛緩異常、および高血圧症などのようなメタボリック症候群の様々な症状発現ならびに血管傷害後の新生内膜形成増大を示す。臨床研究は、血漿アディポネクチン濃度が、本態性高血圧症および虚血性心疾患の患者においてより低いことを示す。内因性アディポネクチンレベルを高めるまたはこのホルモンに対する感受性を増加させることは、代謝疾患および心血管疾患を有する患者にとって有望な治療上の戦略となるかもしれない。
アディポネクチンは、その抗炎症性のおよびアテローム産生抑制性の特性に関連してインスリン感受性を増加させる。患者においてAIPOQを増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるこの分子のターゲティングは、糖尿病、肥満、癌、関節硬化症などの治療において使用される。癌において、アディポネクチンは、腫瘍サプレッサーとして機能することができ、たとえば、結腸における低レベルのアディポネクチンは、結腸直腸癌を引き起こす。乳癌において、アディポネクチンは、癌の負のレギュレーターであると考えられ、アディポネクチンレベルの増加は、乳癌の発生を阻害するのに治療上役立つまたは乳癌の治療をもたらすであろう。
患者におけるアディポネクチンレベルの修飾はまた、自己免疫疾患または障害を含む炎症性疾患または障害においても重要となるであろう。アディポネクチンは、強力な抗炎症性の特性を有するアディポカインである。アルコール性肝疾患の発生は、部分的に肝マクロファージ(Kupffer細胞)の活性化によって媒介される炎症促進性の活性の増加を伴うと考えられる。慢性的なエタノール摂取は、リポ多糖(LPS)による活性化に対して肝マクロファージを敏感にし、活性酸素種および腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)の産生の増加を引き起こす。アディポネクチンは、エタノール摂取後の肝マクロファージにおけるToll様受容体-4(TLR-4)媒介性のシグナル伝達を正常化することができ、おそらく、アルコール性肝疾患の進行におけるアディポネクチンの肝保護的効果に寄与する。
アテローム性動脈硬化症は、慢性的な炎症性のプロセスと考えられ、これは、動脈壁において存在するが、また、軽度の全身性炎症性反応によっても特徴付けられる。脂肪組織は、この慢性的な炎症性のプロセス、続いて心血管疾患リスクを媒介する際に重要な役割を果たすかもしれず、そのため、脂肪のための貯蔵部位として単に見なされないかもしれない。脂肪細胞は、活性のある内分泌機能を有するかもしれない;それは、いくつかのサイトカイン[中でも、インターロイキン6(Il-6)および腫瘍壊死因子-(TNF-)]ならびに30kDa脂肪細胞補体関連タンパク質であるアディポネクチンを産生する。血清におけるアディポネクチンレベルは、主として脂肪細胞のサイズおよび量によって決定される。最も高度な血清濃度は、体脂肪がほとんどない対象において見つけられる。アディポネクチンは、インスリン抵抗性改善効果およびアテローム産生抑制性の効果を有し、より低い血清レベルは、冠動脈心疾患の患者において報告された。
実施形態では、低レベルのアディポネクチンと関連する疾患または障害を治療するための方法は、アディポネクチンの発現および/または機能を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。オリゴヌクレオチドの例は、配列番号7〜31を含む。
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、アディポネクチン(ADIPOQ)に関し、アディポネクチン(ADIPOQ)のアイソフォーム、受容体、ファミリーなどのいずれにも及ぶ。ADIPOQの同義語は、30kDa脂肪細胞補体関連タンパク質、ACDC、ACRP30、脂肪細胞、C1qおよびコラーゲンドメイン含有タンパク質、脂肪細胞補体関連30kDaタンパク質、アディポネクチン(adiponectin)、アディポネクチン(Adiponectin)、AdipoQ、脂肪組織中に特異的に発現する遺伝子タンパク質、ADIPQTL1、ADPN、apM1、APM1、apM-1、APM-1、GBP28、ゼラチン結合タンパク質を含む。
実施形態では、本発明は、本明細書において記載される分子と関連するすべての態様を企図し、ADIPOQのすべてのペプチド、ポリペプチド、誘導体、ポリヌクレオチドの変異体、およびオリゴヌクレオチド配列を包含する。
他の実施形態では、本発明は、ADIPOQ分子に対して生成されてもよい抗体およびアプタマーを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ファミリーメンバーと関連する疾患または障害を予防するまたは治療するために使用される。アンチセンス化合物を使用して得られた幹細胞から再生成された細胞/組織を用いて治療することができる例示的なアディポネクチン(ADIPOQ)媒介性の疾患および障害は、癌、炎症、アテローム性動脈硬化症、神経系疾患または障害、心臓病または障害、自己免疫疾患または障害、ウイルス、細菌、菌類、原虫などのような作用物質によって引き起こされる感染症または障害または状態、免疫不全症または障害;アレルギー、アテローム性動脈硬化症、代謝疾患または障害(糖尿病、糖尿病性ニューロパチー、肥満、高血糖症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性と関連するメタボリック症候群、メタボリック症候群、高血圧症、インスリン感受性の調節異常と関連する疾患または障害、異常な血液グルコースレベルなど)、肝臓病、腎臓病、アルブミン尿症、および細胞増殖障害を含む。
他の好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ADIPORの発現、機能、および活性を調整し、ADIPORが相互作用する分子を含む。アディポネクチンは、細胞内接着分子-I、血管細胞接着分子-I、およびE-セレクチンを含む接着分子の発現を強力に阻害する。アディポネクチンはまた、IEリン酸化の阻害を通して、TNF誘発性の核因子B活性化をも阻害する。アディポネクチンによる核因子Bの抑制は、内皮細胞への単球接着の阻害のための主な分子メカニズムであるかもしれない。アディポネクチンはまた、マクロファージのスカベンジャー受容体クラスA〜Iの発現をも阻害し、マクロファージによる酸化低密度リポタンパク質の取込みの減少および泡沫細胞の形成の阻害を著しくもたらす。さらに、培養平滑筋細胞において、アディポネクチンは、血小板由来増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子(EGF)様増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、およびEGFを含む増殖因子によって誘発されるDNA合成ならびにヘパリン結合EGF様増殖因子によって誘発される、細胞の増殖および遊走を弱めた。
他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)と関連する疾患または障害に罹患しているまたはそれを発生するリスクがある患者におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の正常な発現および/または正常な機能を調整する。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)のポリヌクレオチドに対して特異的であり、これは、限定を伴うことなく、非コード領域を含む。アディポネクチン(ADIPOQ)標的は、アディポネクチン(ADIPOQ)の変異体;SNPを含むアディポネクチン(ADIPOQ)の突然変異体;アディポネクチン(ADIPOQ)の非コード配列;対立遺伝子、断片などを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA分子である。
本発明の実施形態に従って、標的核酸分子は、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのみに限定されないが、アディポネクチン(ADIPOQ)のアイソフォーム、受容体、ホモログ、非コード領域などのいずれにも及ぶ。
他の好ましい実施形態においてオリゴヌクレオチドは、これだけに限らないが変種、対立遺伝子、相同体、変異体、誘導体、断片およびそれらの相補配列を含むアディポネクチン(ADIPOQ)標的の天然アンチセンス配列(コード領域および非コード領域の天然アンチセンス)を標的にする。好ましくはオリゴヌクレオチドはアンチセンスRNAまたはDNA分子である。
他の実施形態において本発明のオリゴマー化合物は、化合物の1つまたは複数のヌクレオチド位置にさまざまな塩基が存在する変種も含む。例えば最初のヌクレオチドがアデニンである場合、この位置にチミジン、グアノシンまたはシチジンもしくは他の天然または非天然ヌクレオチドを含有する変種が産生されうる。これは、アンチセンス化合物の任意の位置において行われうる。
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性または相補性は、約50%〜約60%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約60%〜約70%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約70%〜約80%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約80%〜約90%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%または約100%である。
アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸への結合が標的核酸の正常な機能を妨げて活性の消失を生じ、特異的な結合が望まれる条件下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合が回避されるために十分な程度の相補性がある場合に特異的にハイブリダイズできる。そのような条件は、すなわちin vivoアッセイおよび治療的処置の場合での生理的条件、およびin vitroアッセイの場合でのアッセイが実施される条件を含む。
アンチセンス化合物(DNA、RNA、キメラ、置換物などにかかわらず)は、化合物の標的DNAまたはRNA分子への結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨げ有用性の消失を生じ、特異的な結合が望まれる条件下(すなわちin vivoアッセイおよび治療的処置の場合での生理的条件、およびin vitroアッセイの場合でのアッセイが実施される条件)でアンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合が回避されるために十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズできる。
他の実施形態において例えばPCR、ハイブリダイゼーションなどを使用して同定および増やされるアンチセンス配列、配列番号3〜6に記載される1つまたは複数の配列などを非限定的に含むアディポネクチン(ADIPOQ)のターゲッティングは、アディポネクチン(ADIPOQ)の発現または機能を調節する。一実施形態において発現または機能は、対照と比較して上方制御される。他の実施形態において発現または機能は、対照と比較して下方制御される。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、PCR、ハイブリダイゼーションなどを使用して同定および増やされるアンチセンス配列を含む配列番号7〜31に記載の核酸配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾された結合などを含みうる。修飾された結合またはヌクレオチド間結合の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含む。他の実施形態においてヌクレオチドは、リン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチド中の糖部分または糖類似成分に結合できるリン誘導体(または修飾されたリン酸基)は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルリン酸塩、アルカンリン酸塩(alkanephosphate)、ホスホロチオエートなどでありうる。上に記載のリン酸類似体の調製およびそれらのヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへの組み込みそれ自体は、周知であり、本明細書に記載される必要はない。
アンチセンスの特異性および感受性も、治療的使用のために当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトでの病態の治療において治療用成分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全にかつ効果的にヒトに投与されており、多数の臨床検査が現在進行中である。したがってオリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成されうる有用な治療方法でありうることが確立される。
本発明の実施形態においてオリゴマーアンチセンス化合物、詳細にはオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、標的遺伝子によってコードされる分子の発現および/または機能を調節する。妨げられるDNAの機能は、例えば複製および転写を含む。妨げられるRNAの機能は、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの移行、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAが関与しうるまたはRNAによって促進されうる触媒活性などの全ての生体機能を含む。機能は、所望の機能に応じて上方制御または抑制されうる。
アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブおよび標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。そのように、これらの化合物は1本鎖、2本鎖、部分的な1本鎖または環状オリゴマー化合物の形態に導入されうる。
本発明の文脈においてアンチセンス化合物を特定の核酸分子にターゲッティングすることは、多段階プロセスでありうる。通常、このプロセスは、機能が調節される標的核酸の同定で始まる。この標的核酸は、例えばその発現が特定の障害もしくは病態に関連する細胞遺伝子(もしくは遺伝子から転写されたmRNA)または感染病原体由来の核酸分子でありうる。本発明において標的核酸は、アディポネクチン(ADIPOQ)をコードする。
通常、ターゲッティングプロセスは所望の効果、例えば発現の調節が得られるようなアンチセンス相互作用が生じる標的核酸中の少なくとも1つの標的領域、セグメントまたは部位の決定も含む。本発明の文脈において用語「領域」は、少なくとも1つの同定可能な構造、機能または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。標的核酸の領域内は、セグメントである。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さな部分またはサブ部分と定義される。本発明において使用される「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。
一実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)の天然アンチセンス配列に結合し、アディポネクチン(ADIPOQ)の発現および/または機能を調節する。アンチセンス配列の例は、配列番号7〜31を含む。
他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの1つまたは複数のセグメントに結合し、アディポネクチン(ADIPOQ)の発現および/または機能を調節する。セグメントは、アディポネクチン(ADIPOQ)センスまたはアンチセンスポリヌクレオチドの少なくとも5個の連続するヌクレオチドを含む。
他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)の天然アンチセンス配列に特異的であり、オリゴヌクレオチドのアディポネクチン(ADIPOQ)の天然アンチセンス配列への結合はアディポネクチン(ADIPOQ)の発現および/または機能を調節する。
他の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は配列番号7〜31に記載の配列、例えばPCR、ハイブリダイゼーションなどを使用して同定および増やされるアンチセンス配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾された結合などを含みうる。修飾された結合またはヌクレオチド間結合の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどを含む。他の実施形態においてヌクレオチドは、リン誘導体を含む。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチド中の糖部分または糖類似成分に結合できるリン誘導体(または修飾されたリン酸基)は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルリン酸塩、アルカンリン酸塩、ホスホロチオエートなどでありうる。上に記載のリン酸類似体の調製およびそれらのヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドへの組み込みそれ自体は、周知であり、本明細書に記載される必要はない。
当技術分野において周知であるとおり、翻訳開始コドンが典型的には5'-AUG(転写されたmRNA分子において、対応するDNA分子においては5'-ATG)であることから、翻訳開始コドンは、「AUGコドン」、「開始コドン」または「AUG開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはin vivoにおいて機能することが示されている。したがって用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、開始アミノ酸は各例において典型的にはメチオニン(真核生物において)またはホルミルメチオニン(原核生物において)であるが、多数のコドン配列を包含できる。真核生物および原核生物の遺伝子は、2つ以上の選択的開始コドンを有し、そのいずれでも特定の細胞型または組織における、または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に利用されうる。本発明の文脈において「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの(1つまたは複数の)配列にかかわらずアディポネクチン(ADIPOQ)をコードする遺伝子から転写されたmRNAの翻訳を開始するためにin vivoで使用される1つまたは複数のコドンを意味する。遺伝子の翻訳終止コドン(または「終止コドン」)は、3つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA(対応するDNA配列は、それぞれ5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGAである)のうちの1つを有しうる。
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからいずれかの方向(すなわち5'または3')での連続する約25から約50ヌクレオチドを包含するそのようなmRNAまたは遺伝子の一部分を意味する。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンからいずれかの方向(すなわち5'または3')での連続する約25から約50ヌクレオチドを包含するそのようなmRNAまたは遺伝子の一部分を意味する。結果として「開始コドン領域」(または「翻訳開始コドン領域」)および「終止コドン領域」(または「翻訳終止コドン領域」)は、本発明のアンチセンス化合物で効果的にターゲッティングされうる全ての領域である。
当技術分野において翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが周知のオープンリーディングフレーム(ORF)または「コード領域」も、効果的にターゲッティングされうる領域である。本発明の文脈においてターゲッティングされた領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内領域である。
他の標的領域は、当技術分野において翻訳開始コドンから5'方向にあるmRNAの一部分を意味することが周知の5'非翻訳領域(5'UTR)を含み、したがって5'キャップ部位とmRNA(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)の翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含む。さらに他の標的領域は、当技術分野において翻訳終止コドンから3'方向にあるmRNAの一部分を意味すると周知の3'非翻訳領域(3'UTR)を含み、したがって翻訳終止コドンとmRNA(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)の3'末端との間のヌクレオチドを含む。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'トリリン酸結合を介してmRNAの最も5'側の残基に結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造それ自体およびキャップ部位に隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。本発明の他の標的領域は、5'キャップ領域である。
いくつかの真核生物mRNA転写物は、直接翻訳されるが、大部分は、それが翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として周知の1つまたは複数の領域を含有する。残りの(したがって翻訳される)領域は「エクソン」として周知であり、連続的なmRNA配列を形成するように一緒にスプライスされる。一実施形態において標的スプライス部位、すなわちイントロン-エクソン接合部またはエクソン-イントロン接合部は、異常なスプライシングが疾患に関与するまたは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関与する状況において特に有用である。再配置または欠失による異常な融合接合は、標的部位の他の実施形態である。異なる遺伝子源由来の2つ(またはそれ以上)のmRNAのスプライシングのプロセスを介して産生されたmRNA転写物は、「融合転写物」として周知である。イントロンは、例えばDNAまたはプレmRNAをターゲッティングするアンチセンス化合物を使用して効果的にターゲッティングされうる。
他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのコード領域および/または非コード領域に結合し、標的分子の発現おび/または機能を調節する。
他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然アンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および/または機能を調節する。
他の実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現および/または機能を調節する。
選択的RNA転写物は、DNAの同じ遺伝子領域から産生されうる。これらの選択的転写物は、一般に「変種」として周知である。より詳細には「プレmRNA変種」は、同じゲノムDNAから産生される転写物であり、同じゲノムDNAから産生される他の転写物とはそれらの開始または終止位置のいずれかにおいて異なり、イントロンおよびエクソン配列の両方を含有する。
スプライシングでの1つまたは複数のエクソンもしくはイントロン領域またはそれらの一部分の切除において、プレmRNA変種は、より小さな「mRNA変種」を産生する。結果としてmRNA変種は、プレmRNA変種にプロセシングされ、それぞれ特有なプレmRNA変種はスプライシングの結果として特有なmRNA変種を常に産生する。これらのmRNA変種は、「選択的スプライス変種」としても周知である。プレmRNA変種のスプライシングが生じない場合は、プレmRNA変種はmRNA変種と同一である。
変種は、転写を開始するまたは終止するための選択的シグナルの使用を通じても産生されうる。プレmRNAおよびmRNAは、1つより多い開始コドンまたは終止コドンを有しうる。選択的開始コドン(alternative start codon)を使用するプレmRNAまたはmRNA由来の変種は、プレmRNAまたはmRNAの「選択的開始変種(alternative start variant)」として周知である。選択的終止コドン(alternative stop codon)を使用するこれらの転写物は、プレmRNAまたはmRNAの「選択的終止変種(alternative stop variant)」として周知である。選択的終止変種の特定の1種類は、機械的な転写による「ポリA終止シグナル」のうちの1つの代替選択から生じる、多数の転写物が産生される「ポリA変種」であり、それにより特有なポリA部位で終結する転写物が産生される。本発明の文脈において、本明細書に記載される種類の変種も標的核酸の実施形態である。
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、活性アンチセンス化合物がターゲッティングされる標的領域の少なくとも5ヌクレオチド長部分として定義される。
特定の例示的標的セグメントの詳細な配列が本明細書に記載されているが、当業者はこれらが本発明の範囲内の具体的実施形態を例示および記載するために利用できることを理解する。追加的標的セグメントは、本開示を考慮して当業者によって容易に同定されうる。
例示的な標的セグメント内から選択された少なくとも5つ(5個)の連続的ヌクレオチド範囲を含む長さ5〜100ヌクレオチドの標的セグメントは、同様にターゲッティングに適すると考えられる。
標的セグメントは、例示的な標的セグメントの1つの5'-末端由来の少なくとも5個の連続するヌクレオチドを含むDNAまたはRNA配列を含みうる(残りのヌクレオチドは、標的セグメントの5'-末端のすぐ上流から始まり、DNAまたはRNAが約5〜約100ヌクレオチドを含有するまで続く同じDNAまたはRNAの連続的範囲である)。同様に標的セグメントは、例示的な標的セグメントの1つの3'-末端由来の少なくとも5個の連続するヌクレオチドを含むDNAまたはRNA配列によって表される(残りのヌクレオチドは、標的セグメントの3'-末端のすぐ下流から始まり、DNAまたはRNAが約5〜約100ヌクレオチドを含有するまで続く同じDNAまたはRNAの連続的範囲である)。本明細書において例示される標的セグメントを用いる当業者は、過度の実験を行うことなくさらなる標的セグメントを同定できる。
ひとたび1つまたは複数の標的領域、セグメントまたは部位が同定されると、所望の効果を得るために標的に十分に相補的である、すなわち十分にハイブリダイズし、かつ十分な特異性を有するアンチセンス化合物が選択される。
本発明の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、特定の標的のアンチセンス鎖に結合する。オリゴヌクレオチドは、長さ少なくとも5ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドが重複する配列をターゲッティングするように合成されて良く、オリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの長さ全体に及ぶように合成される。標的はコード領域および非コード領域も含む。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって特定の核酸をターゲッティングする。特定の核酸に対するアンチセンス化合物のターゲッティングは、多段階プロセスである。通常、このプロセスは、その機能が調節される核酸配列の同定で始まる。これは、例えばその発現が特定の障害もしくは病態に関連する細胞遺伝子(もしくは遺伝子から転写されるmRNA)または例えば非翻訳RNA(ncRNA)などの非翻訳ポリヌクレオチドでありうる。
RNAは、(1)タンパク質に翻訳されるメッセンジャーRNA(mRNA)、および(2)非タンパク質コードRNA(ncRNA)に分類されうる。ncRNAはマイクロRNA、アンチセンス転写物および高密度の終止コドンを含有しており、いかなる広範な「オープンリーディングフレーム」も欠いている他の転写単位(TU)を含む。多くのncRNAは、タンパク質コード遺伝子座の3'非翻訳領域(3'UTR)中の開始部位から始まると考えられる。ncRNAは、しばしばまれであり、FANTOMコンソーシアムによって配列決定されているncRNAの少なくとも半分はポリアデニル化されていないと考えられている。明らかな理由により大部分の研究者は、プロセシングされ、細胞質に排出されるポリアデニル化されたmRNAに注目している。近年、一連のポリアデニル化されていない核内RNAが非常に多い場合があり、そのような転写物の多くが遺伝子間領域から生じることが示された。ncRNAが遺伝子発現を制御しうる機構は、標的転写物との塩基対形成によるものである。塩基対形成によって機能するRNAは、(1)作用するRNAと同じ遺伝子座だが反対の鎖上にコードされ、したがってそれらの標的に対して完全な相補性を示すシスコードの(cis-encoded)RNA、および(2)作用するRNAとは異なる染色体上の位置にコードされ、一般にそれらの標的と完全な塩基対形成可能性を示さないトランスコードの(trans-encoded)RNAに分類されうる。
理論に束縛されることなく、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスポリヌクレオチドの変動は、対応するセンスメッセンジャーRNAの発現を変化させうる。しかしこの制御は、不調和性(アンチセンスノックダウンがメッセンジャーRNAの増加を生じる)または調和性(アンチセンスノックダウンが付随するメッセンジャーRNAの減少を生じる)のいずれであっても良い。これらの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス転写の重複したまたは重複していない部分にターゲッティングされて良く、ノックダウンまたは隔離を生じる。コードおよび非コードアンチセンスは、同一の手段でターゲッティングでき、どちらの分類も対応するセンス転写物を、調和性または不調和性の手段のいずれかで、制御できる。標的に対する使用のための新規オリゴヌクレオチドを同定することに使用される戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアンチセンスRNA転写物のノックダウンまたは所望の標的を調節する任意の他の手段に基づきうる。
戦略1:不調和性調節の場合、アンチセンス転写のノックダウンが、通常の(センス)遺伝子の発現を上昇させる。後者の遺伝子が周知のまたは推定上の薬物標的をコードする場合は、そのアンチセンス対応物のノックダウンは受容体アゴニストまたは酵素刺激物質の作用をおそらく模倣できる。
戦略2;調和性調節の場合、アンチセンスおよびセンス転写物の両方を同時にノックダウンすることができ、したがって通常の(センス)遺伝子発現の相乗的低減を達成する。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドがノックダウンを達成するために使用される場合、この戦略は、センス転写物にターゲッティングされた1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドと対応するアンチセンス転写物に対する他のアンチセンスオリゴヌクレオチドとに、または重複しているセンスおよびアンチセンス転写物を同時にターゲッティングする単一のエネルギー的に対称なアンチセンスオリゴヌクレオチドに適用するために使用されうる。
本発明によりアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、siRNA化合物などの1本鎖または2本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、および標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズし、その機能を調節する他のオリゴマー化合物を含む。そのようにそれらはDNA、RNA、DNA様、RNA様、もしくはそれらの混合物でありうる、またはこれらの1つまたは複数の模倣物でありうる。これらの化合物は、1本鎖、2本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物であって良く、内部もしくは末端バルジ、ミスマッチまたはループなどの構造要素を含有できる。アンチセンス化合物は、日常的には直鎖状に調製されるが、環状および/または分枝状に結合されるかまたはそうでなければ調製されうる。アンチセンス化合物は、例えば全体的もしくは部分的な2本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした2本の鎖、または全体的もしくは部分的な2本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするために十分な自己相補性を有する1本鎖などの構築物を含みうる。2本鎖は、遊離の3'もしくは5'末端を残すように内部で結合されうるか、または連続的ヘアピン構造もしくはループを形成するように結合されうる。ヘアピン構造は、5'または3'末端のいずれかにオーバーハングを含有でき、1本鎖形質の伸長を生じる。場合により2本鎖化合物は、両末端にオーバーハングを含有できる。さらなる修飾は、末端のうちの1つ、選択されたヌクレオチド位置、糖位置またはヌクレオチド間結合のうちの1つに結合した複合基を含みうる。代替として2本鎖は、非核酸成分またはリンカー基を介して連結されうる。1本だけの鎖から形成される場合dsRNAは、2重鎖を形成するためにそれ自体の上に折りたたまれる自己相補性ヘアピン型分子の形態を取りうる。したがってdsRNAは、完全にまたは部分的に2本鎖でありうる。遺伝子発現の特異的な調節は、遺伝子導入細胞系におけるdsRNAヘアピンの安定な発現によって達成されうるが、いくつかの実施形態において遺伝子の発現または機能は、上方制御される。2本鎖、または2重鎖を形成するためにそれ自体の上に折りたたまれる自己相補性ヘアピン型分子の形態を取る1本鎖から形成される場合、2本鎖(または1本鎖の2
重鎖形成領域)は、ワトソン-クリック様に塩基対形成する相補的RNA鎖である。
ひとたび系に導入されると本発明の化合物は、標的核酸の切断もしくは他の修飾に影響する1つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発できる、または占有に基づく機構を介して作用できる。一般に核酸(オリゴヌクレオチドを含む)は、「DNA様」(すなわち一般に1つまたは複数の2'-デオキシ糖を有し、一般にU塩基よりもT塩基を有する)または「RNA様」(すなわち一般に1つまたは複数の2'-ヒドロキシ糖または2'-修飾糖を有し、一般にT塩基よりもU塩基を有する)と記載されうる。核酸ヘリックスは、1つより多い種類の構造を、最も通例ではA-形態およびB-形態を取りうる。一般にB-形態様構造を有するオリゴヌクレオチドは「DNA様」であり、A-形態様構造を有するものは「RNA様」であると考えられる。いくつかの(キメラ)実施形態においてアンチセンス化合物は、A-およびB-形態領域の両方を含有できる。
他の実施形態において所望のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド;修飾された結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド;干渉RNA(RNAi)、低分子干渉RNA(siRNA);マイクロ干渉RNA(miRNA);低分子一過的RNA(stRNA);または低分子ヘアピンRNA(shRNA);低分子RNA誘導遺伝子活性化(RNAa);低分子活性化RNA(saRNA)またはこれらの組合せのうちの少なくとも1を含む。
dsRNAは、遺伝子発現、「低分子RNA誘導遺伝子活性化」またはRNAaと称されている機構も活性化できる。遺伝子プロモーターをターゲッティングするdsRNAは、関連する遺伝子の強力な転写活性化を誘導する。RNAaは、合成dsRNAを使用してヒト細胞において実証され、「低分子活性化RNA」(saRNA)と称された。
低分子干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA(miRNA)などの低分子2本鎖RNA(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)として周知の進化的に保存された機構の引き金であることが見出されている。RNAiは、一定に遺伝子発現抑制を導く。しかし、下の実施例の節において詳細に記載される例においては、オリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドおよびそれにコードされる産物の発現および/または機能を増加させることが示されている。dsRNAは低分子活性化RNA(saRNA)としても作用できる。理論に束縛されることなく、遺伝子プロモーター中の配列をターゲッティングすることによって、saRNAはdsRNA誘発転写活性化(RNAa)と称される現象において標的遺伝子発現を誘導する。
さらなる実施形態において、本明細書において同定する「標的セグメント」は、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの発現を調節する追加的化合物の選別において使用されうる。「調節物質」は、アディポネクチン(ADIPOQ)をコードする核酸分子の発現を減少または増加させ、標的セグメントに相補的である少なくとも5個のヌクレオチド部分を含む化合物である。選別方法は、アディポネクチン(ADIPOQ)のセンスまたは天然ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の標的セグメントを1つまたは複数の候補調節物質に接触させるステップ、およびアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチド、例えば配列番号7〜31をコードする核酸分子の発現を減少または増加させる1つまたは複数の候補修飾物質を選択するステップを含む。1つまたは複数の候補調節物質が、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の発現を調節できる(例えば減少させるまたは増加させる)ことが一度示されれば、次いで調節物質は、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの機能のさらなる調査研究において、または本発明による研究、診断もしくは治療剤としての使用のために使用されうる。
天然アンチセンス配列のターゲッティングは、標的遺伝子の機能を調節する。例えば、アディポネクチン(ADIPOQ) (例えばアクセッション番号NM_004797およびNM_024551)。好ましい実施形態において標的は、アディポネクチン(ADIPOQ)のアンチセンスポリヌクレオチドである。好ましい実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのセンスおよび/または天然アンチセンス配列(例えばアクセッション番号NM_004797およびNM_024551)、変種、対立遺伝子、アイソフォーム、相同体、変異体、誘導体、断片およびそれらの相補配列をターゲッティングする。好ましくはオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子であり、標的はアンチセンスおよび/またはセンスアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのコード領域および非コード領域を含む。
本発明の標的セグメントは、本発明のそれぞれの相補的アンチセンス化合物と安定化された2本鎖(2重鎖)オリゴヌクレオチドを形成するように組み合わされうる。
そのような2本鎖オリゴヌクレオチド成分は、当技術分野において標的発現を調節し、アンチセンス機構を介して翻訳およびRNAプロセシングを制御すると示されている。さらに2本鎖成分は化学修飾に供されうる。例えばそのような2本鎖成分は、2重鎖アンチセンス鎖の標的への古典的ハイブリダイゼーションによって標的を抑制することが示されており、それにより標的の酵素的分解の引き金を引く。
好ましい実施形態においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチド(例えばアクセッション番号NM_004797およびNM_024551)、変種、対立遺伝子、アイソフォーム、相同体、変異体、誘導体、断片およびそれらの相補配列をターゲッティングする。好ましくはオリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。
本発明の実施形態により標的核酸分子は、アディポネクチン(ADIPOQ)だけに限定されず、任意のアイソフォーム、受容体、相同体およびアディポネクチン(ADIPOQ)様分子に及ぶ。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列、例えば配列番号3〜6に記載のポリヌクレオチドおよび任意の変種、対立遺伝子、相同体、変異体、誘導体、断片およびそれらの相補配列をターゲッティングする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列番号7〜31として記載されている。
一実施形態においてオリゴヌクレオチドは、これだけに限らないがアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドに関連する非コードセンスおよび/またはアンチセンス配列が挙げられるアディポネクチン(ADIPOQ)アンチセンスの核酸配列に相補的であるかまたは結合し、アディポネクチン(ADIPOQ)分子の発現および/または機能を調節する。
他の好ましい実施形態においてオリゴヌクレオチドは、配列番号3〜6に記載のアディポネクチン(ADIPOQ)天然アンチセンスの核酸配列に相補的であるかまたは結合し、アディポネクチン(ADIPOQ)分子の発現および/または機能を調節する。
一実施形態においてオリゴヌクレオチドは、配列番号7〜31の少なくとも5個の連続するヌクレオチドの配列を含み、アディポネクチン(ADIPOQ)分子の発現および/または機能を調節する。
ポリヌクレオチド標的は、そのファミリーメンバーを含めたアディポネクチン(ADIPOQ)、アディポネクチン(ADIPOQ)の変種;SNPを含むアディポネクチン(ADIPOQ)の変異体; アディポネクチン(ADIPOQ)の非コード配列; アディポネクチン(ADIPOQ)の対立遺伝子;種の変種、断片などを含む。好ましくはオリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である。
他の実施形態において、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドをターゲッティングするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA、干渉RNA(RNAi)、低分子干渉RNA(siRNA);マイクロ干渉RNA(miRNA);低分子一過的RNA(stRNA);または低分子ヘアピンRNA(shRNA);低分子RNA誘導遺伝子活性化(RNAa);または低分子活性化RNA(saRNA)を含む。
他の実施形態において、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチド、例えば配列番号3〜6のターゲッティングは、これらの標的の発現または機能を調節する。一実施形態において発現または機能は対照と比較して上方制御される。他の実施形態において発現または機能は対照と比較して下方制御される。
他の実施形態においてアンチセンス化合物は、配列番号7〜31に記載の配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオチド、より短いまたはより長い断片、修飾された結合などを含みうる。
他の実施形態において配列番号7〜31は、1つまたは複数のLNAヌクレオチドを含む。
所望の標的核酸の調節は、当技術分野において周知のいくつかの方法において実施されうる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAなど。酵素的核酸分子(例えばリボザイム)は、ヌクレオチド塩基配列に特異的なやり方で他の別々の核酸分子を繰り返し切断する能力を含む種々の反応の1つまたは複数を触媒できる核酸分子である。そのような酵素的核酸分子は、例えば実質的にいかなるRNA転写物をターゲッティングするのにも使用されうる。
それらの配列特異性により、トランス切断酵素的核酸分子は、ヒト疾患に対する治療剤としての有望さを示す。酵素的核酸分子は、細胞性RNA背景中で特定のRNA標的を切断するために設計されうる。そのような切断事象はmRNAを非機能性にし、かつそのRNAからのタンパク質発現を抑止する。このやり方で、病態に関連するタンパク質の合成は選択的に抑制されうる。
一般にRNA切断活性を有する酵素的核酸は、最初に標的RNAに結合することによって作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するために作用する分子の酵素的部分に近接に保持される酵素的核酸の標的結合部分を通じて生じる。したがって酵素的核酸分子は、最初に標的RNAを認識し、次いで相補的塩基対形成を通じて結合し、ひとたび正確な部位に結合すると標的RNAを切断するために酵素的に作用する。そのような標的RNAの戦略的切断は、コードされているタンパク質の合成を方向付けるその能力を破壊する。酵素的核酸がそのRNA標的に結合および切断した後、それはRNAから解離し、別の標的を探して繰り返し新たな標的に結合し、切断できる。
In vitro選択(進化的)戦略などのいくつかの手法が、ホスホジエステル結合およびアミド結合の切断および連結などの種々の反応を触媒できる新規核酸触媒を発展させるために使用されている。
触媒活性のために最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現制御の目的のためにRNA切断リボザイムを使用するいかなる戦略にも顕著に貢献する。例えばハンマーヘッド型リボザイムは、飽和(10mM)濃度のMg2+補助因子の存在下で触媒速度(kcat)約1分-1で機能する。人工的「RNAリガーゼ」リボザイムは、対応する自己修飾反応を約100分-1の速度で触媒することが示されている。加えてDNAから作られた基質結合腕を有するある種の修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、100分-1に近い多重回転数(multiple turn-over rate)でRNA切断を触媒することが周知である。最後にハンマーヘッドの触媒コア中の特定の残基の特定のヌクレオチド類似体での置換は、触媒速度に10倍程度の改善を示す修飾されたリボザイムをもたらす。これらの発見は、リボザイムが、ほとんどの天然の自己切断リボザイムによってin vitroで示されるものより顕著に大きな触媒速度での化学的形質転換を促進できることを示す。それにより、ある種の自己切断リボザイムの構造は、最大の触媒活性をもたらすように最適化されうる、またはRNAホスホジエステル切断について顕著に早い速度を示す完全に新規のRNAモチーフが作製されうることが可能である。
「ハンマーヘッド」モデルにあてはまるRNA触媒によるRNA基質の分子間切断は、1987年に最初に示された。RNA触媒は、回収され、複数のRNA分子と反応し、それが真に触媒作用的であることを示した。
「ハンマーヘッド」モチーフに基づいて設計された触媒RNAは、標的配列に必要な塩基対形成を維持するために触媒RNA中に適切な塩基変更を作製することによって特定の標的配列を切断するために使用されている。これは、特定の標的配列を切断するための触媒RNAの使用を可能にし、「ハンマーヘッド」モデルによって設計された触媒RNAがin vivoで特定の基質RNAを切断できる可能性があることを示している。
RNA干渉(RNAi)は、哺乳動物および哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するための強力な手段になっている。この手法は、発現プラスミドまたはウイルスおよび、siRNAにプロセシングされる低分子ヘアピンRNAのコード配列を使用するRNAそれ自体としてまたはDNAとしてのいずれかでの低分子干渉RNA(siRNA)の送達を必要とする。この系は、プレ-siRNAのそれらが活性である細胞質への効率的な輸送を可能にし、遺伝子発現のために制御された組織特異的なプロモーターの使用を可能にする。
一実施形態においてオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス化合物は、リボ核酸(RNA)および/もしくはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーもしくはポリマーまたはそれらの模倣物、キメラ、類似体もしくは相同体を含む。この用語は、天然に存在するヌクレオチド、糖およびヌクレオチド間(骨格)共有結合ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を含むオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞への増強された取込み、標的核酸に対する増強された親和性およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの望ましい特性からしばしば天然形態よりも望ましい。
本発明により、オリゴヌクレオチドまたは「アンチセンス化合物」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えばRNA、DNA、それらの模倣物、キメラ、類似体または相同体)、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、siRNA化合物などの1本鎖または2本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、saRNA、aRNAおよび標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズしその機能を調節する他のオリゴマー化合物を含む。そのようにそれらは、DNA、RNA、DNA様、RNA様もしくはそれらの混合物でありうるか、またはこれらの1つまたは複数の模倣物でありえる。これらの化合物は、1本鎖、2本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物であることができ、内部もしくは末端バルジ、ミスマッチまたはループなどの構造要素を含みうる。アンチセンス化合物は、日常的には直鎖状に調製されるが、環状および/または分枝状に結合されるかまたはそうでなければ調製されうる。アンチセンス化合物は、例えば全体的もしくは部分的な2本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした2本の鎖、または全体的もしくは部分的な2本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするために十分な自己相補性を有する1本鎖などの構築物を含みうる。2本の鎖は、遊離の3'もしくは5'末端を残すように内部で結合されうるか、または連続的ヘアピン構造もしくはループを形成するように結合されうる。ヘアピン構造は、1本鎖形質の伸長を生じさせるために5'または3'末端のいずれかにオーバーハングを含有できる。場合により2本鎖化合物は、両末端にオーバーハングを含みうる。さらなる修飾は、末端のうちの1つ、選択されたヌクレオチド位置、糖位置またはヌクレオチド間結合のうちの1つに結合した複合基を含みうる。代替として2本の鎖は、非核酸成分またはリンカー基を介して結合できる。1本鎖だけから形成される場合dsRNAは、2重鎖を形成するためにそれ自体の上に折りたたまれる自己相補性ヘアピン型分子の形態を取りうる。したがってdsRNAは、完全にまたは部分的に2本鎖でありうる。遺伝子発現の特異的な調節は、遺伝子導入細胞系におけるdsRNAヘアピンの安定な発現によって達成されうる。2本鎖、または2重鎖を形成するためにそれ自体の上に折りたたまれる自己相補性ヘアピン型分子の形
態を取る1本鎖から形成される場合、2本鎖(または1本鎖の2重鎖形成領域)は、ワトソン-クリック様に塩基対形成する自己相補的RNA鎖である。
ひとたび系に導入されると本発明の化合物は、標的核酸の切断もしくは他の修飾をもたらす1つもしくは複数の酵素もしくは構造タンパク質の作用を誘発できる、または占有に基づく機構を介して作用できる。一般に核酸(オリゴヌクレオチドを含む)は、「DNA様」(すなわち一般に1つまたは複数の2'-デオキシ糖を有し、一般にU塩基よりもT塩基を有する)または「RNA様」(すなわち一般に1つまたは複数の2'-ヒドロキシ糖または2'-修飾糖を有し、一般にT塩基よりもU塩基を有する)と記載されうる。核酸ヘリックスは、1つより多い構造を、最も通例ではA-形態およびB-形態を取りうる。一般にB-形態様構造を有するオリゴヌクレオチドは「DNA様」であると、A-形態様構造を有するものは「RNA様」であると考えられる。いくつかの(キメラ)実施形態においてアンチセンス化合物は、A-およびB-形態領域の両方を含有できる。
本発明によるアンチセンス化合物は、長さ約5〜約80ヌクレオチド(すなわち約5〜約80個連結したヌクレオシド)由来のアンチセンス部分を含みうる。これは、アンチセンス化合物のアンチセンス鎖または一部分の長さを意味する。言い換えると、本発明の1本鎖アンチセンス化合物は、5〜約80ヌクレオチドを含み、本発明の2本鎖アンチセンス化合物(例えばdsRNAなど)は、長さ5〜約80ヌクレオチドのセンスおよびアンチセンス鎖または一部分を含む。当業者は、これが長さ5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80ヌクレオチドまたはこれらの範囲内の任意の長さのアンチセンス部分を内包することを理解する。
一実施形態において本発明のアンチセンス化合物は、長さ10〜50ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者は、これが長さ10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドまたはこれらの範囲内の任意の長さのアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドを具体化することを理解する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは長さ15ヌクレオチドである。
一実施形態において本発明のアンチセンスまたはオリゴヌクレオチド化合物は、長さ12または13〜30ヌクレオチドのアンチセンス部分を有する。当業者は、これが長さ12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30ヌクレオチドまたはこれらの範囲内の任意の長さのアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を具体化することを理解する。
他の好ましい実施形態において本発明のオリゴマー化合物は、化合物中の1つまたは複数のヌクレオチド位置に異なる塩基が存在する変種も含む。例えば、最初のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシンまたはシチジンを含有する変種が産生されうる。これは、アンチセンスまたはdsRNA化合物の任意の位置においてなされうる。次いでこれらの化合物は、標的核酸の発現を抑制するそれらの能力を測定するために本明細書に記載の方法を使用して検査される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性または相補性は、約40%〜約60%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約60%〜約70%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約70%〜約80%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約80%〜約90%である。いくつかの実施形態において、相同性、配列同一性または相補性は、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%または約100%である。
他の実施形態において、例えば配列番号7〜31に記載の核酸分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換または修飾を含む。一実施形態においてヌクレオチドはロックド核酸(LNA)で置換される。
他の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、アディポネクチン(ADIPOQ)に関連するコードおよび/または非コード配列ならびに配列番号1〜6として記載の配列の、核酸分子センスおよび/またはアンチセンスの1つまたは複数の領域をターゲッティングする。オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜6の重複領域にもターゲッティングされる。
本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。本発明の文脈において「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、それぞれ少なくとも1つのヌクレオチドからなる2つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の有益な特性(例えばヌクレアーゼ耐性の増大、細胞への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大など)を付与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つの領域、およびRNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断できる酵素のための基質である領域を典型的には含有する。例示の方法により、RNase Hは、RNA:DNA 2重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがってRNase Hの活性化は、RNA標的の切断を生じ、それにより遺伝子発現のアンチセンス調節の効率を非常に増強する。結果としてキメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して低分子オリゴヌクレオチドで同程度の結果がしばしば得られる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動および必要に応じて当技術分野において周知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出できる。好ましい一実施形態においてキメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増大させる少なくとも1つの領域、およびRNase Hの基質として作用する領域を通常含む。オリゴヌクレオチドのその標的(この場合、rasをコードする核酸)に対する親和性は、オリゴヌクレオチド/標的対のTm(オリゴヌクレオチドと標的とが解離する温度であり、解離は分光光度的に検出される)を測定することによって日常的に決定される。Tmが高ければ高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は大きい。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、上に記載のオリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成されうる。そのような化合物は、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。そのようなハイブリッド構造の調製を説明する代表的な米国特許は、これだけに限らないが、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5, 220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号および第5,700,922号を含む。
他の実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の2'位置で修飾された少なくとも1つのヌクレオチド、最も好ましくは2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル、または2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態においてRNA修飾は、ピリミジン、脱塩基残基またはRNAの3'末端の反転塩基(inverted base)のリボース上の2'-フルオロ、2'-アミノおよび2'O-メチル修飾を含む。そのような修飾は、日常的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりもより高いTm(すなわちより高い標的結合親和性)を有することが示されている。そのような増大した親和性の効果は、遺伝子発現のRNAiオリゴヌクレオチド抑制を非常に増強する。RNAse Hは、RNA:DNA 2重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであり、したがってこの酵素の活性化は、RNA標的の切断を生じ、それによりRNAi抑制の効率を非常に増強できる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によって日常的に実証されうる。他の実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドもヌクレアーゼ耐性を増強するために修飾される。細胞は、核酸を分解できる種々のエキソ-およびエンド-ヌクレアーゼを含有する。多数のヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾が、それが組み込まれるオリゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されている。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物または単離されたヌクレアーゼ溶液とインキュベートし、一定時間後に残っている未変化オリゴヌクレオチドの量を、通常は電気泳動によって、測定することにより日常的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を増強するために修飾されているオリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長時間未変化で残存する。種々のオリゴヌクレオチド修飾がヌクレアーゼ耐性を増強するまたは付与するために実証されている。現在のところ少なくとも1つのホスホロチオエート修飾を含有するオリゴヌクレオチドはより好ましい。いくつかの場合に標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾も、単独で、ヌクレアーゼ耐性を増強できる。いくつかの望ましい修飾は、De Mesmae
kerら(1995)、Acc. Chem. Res.、28:366〜374に見出すことができる。
本発明のために想定されるいくつかのオリゴヌクレオチドの具体的な例は、修飾された骨格、例えばホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖部分間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を含むものを含む。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格、詳細にはCH2 --NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2 [メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として周知]、CH2 --O--N (CH3)--CH2、CH2 --N (CH3)--N (CH3)--CH2およびO--N (CH3)-- CH2 --CH2骨格、式中天然のホスホジエステル骨格はO-P--O-- CHと表される)を有するものである。De Mesmaekerら(1995)、Ace. Chem. Res. 28:366〜374)によって開示されたアミド骨格も好ましい。同様に好ましいのは、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号)。他の好ましい実施形態において、ペプチド核酸(PNA)骨格、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格などは、ポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドは直接または間接的にポリアミド骨格のアザ窒素原子に結合される。オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換された糖部分も含みうる。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の: OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2またはO(CH2)n CH3 (式中nは1から約10である); C1〜C10低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--、S--、またはN-アルキル; O--、S--、またはN-アルケニル; SOCH3; SO2; CH3; ONO2; NO2; N3; NH2;ヘテロシクロアルキル;ヘテロシクロアルカリル;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノ;置換されたシリル; RNA切断基;レポーター基;干渉物質;オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基;またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基および同様の特性を有する他の置換基のうちの1つを2'位置に含む。修飾は、2'-メトキシエトキシ[2'-O-CH2 CH2 OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)としても周知]を含む。他の好ましい修飾は2'-メトキシ(2'-O--CH3)、2'-プロポキシ(2'-OCH2 CH2CH3)および2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様に修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、詳細には3'末端ヌクレオチドの糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でも作製されうる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖類似体も有しうる。
オリゴヌクレオチドは、追加的または代替的に核酸塩基(当技術分野において単に「塩基」としばしば称される)修飾または置換も含みうる。本明細書において使用される「未修飾」または「天然」ヌクレオチドは、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾されたヌクレオチドは、天然の核酸においてまれに、または一過的にだけ見出されるヌクレオチド、例えばヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、詳細には5-メチルシトシン(5-メチル-2'-デオキシシトシンとも称され、5-Me-Cとも当技術分野においてしばしば称される)、5-ヒドロキシメチルシトシン(HMC)、グリコシルHMCおよびゲントビオシルHMCならびに合成ヌクレオチド、例えば2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニンおよび2,6-ジアミノプリンを含む。当技術分野において周知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシン、も含まれうる。5-Me-C置換は、核酸2重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示されており(Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T. and Lebleu, B.(編)、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現在好ましい塩基置換である。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞への取込みを増強する1つまたは複数の成分または複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的結合を含む。そのような成分として、これだけに限らないがコレステロール成分、コレステリル成分、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸などの脂質成分を含む。親油性成分を含むオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当技術分野、例えば米国特許第5,138,045号、第5,218,105号および第5,459,255号において周知である。
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が一律に修飾される必要はなく、実際に前述の修飾のうちの1つより多くが単一のオリゴヌクレオチド中に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシド中にさえも組み込まれうる。本発明は、本明細書前記に定義するキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含む。
他の実施形態において本発明の核酸分子は、これだけに限らないが脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質またはポリ炭化水素化合物が挙げられる他の成分と複合される。当業者は、これらの分子が、糖、塩基またはリン酸基のいくつかの位置に核酸分子を含む1つまたは複数の任意のヌクレオチドに連結されうることを理解する。
本発明により使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合におよび日常的に固相合成の十分に周知な技術を通じて作製される。そのような合成のための装置は、Applied Biosystemsを含むいくつかの販売者によって販売されている。そのような合成のための任意の他の手段も使用されうる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために類似技術を使用することも十分に周知である。類似技術ならびに商業的に入手可能な修飾されたアミダイトおよび多孔質ガラス(CPG)製品(ビオチン、フルオレセイン、アクリジンもしくはソラレン修飾アミダイトなど)および/または蛍光標識、ビオチン化もしくは、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドなどの他の修飾オリゴヌクレオチドを合成するためのCPG(Glen Research、Sterling VAから入手可能)の使用も十分に周知である。
本発明により、強度、特異性および作用期間の増強のためならびにオリゴヌクレオチドの投与経路を拡げるためのLNA単量体の使用などの修飾の使用は、MOE、ANA、FANA、PSなど現在の化学を含む。これは現在のオリゴヌクレオチド中のいくつかの単量体のLNA単量体による置換によって達成されうる。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、親化合物に類似する大きさを有する場合があり、またはより大きくて良く、または好ましくは小さくて良い。そのようなLNA修飾オリゴヌクレオチドが約70%より少ない、より好ましくは約60%より少ない、最も好ましくは約50%より少ないLNA単量体を含有することは好ましく、それらの大きさは約5から25ヌクレオチドの間であることは好ましく、より好ましくは約12から20ヌクレオチドの間である。
修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、これだけに限らないがホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、(3'アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む)メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、(3'アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含む)ホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、ならびに逆転した方向性を有する(ヌクレオチド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'にまたは2'-5'から5'-2'に連結している)ものを含む。種々の塩、塩混合物および遊離酸の形態も含まれる。
上のリン含有結合の調製を説明する代表的な米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;および5,625,050を含む。
修飾オリゴヌクレオチド骨格はリン原子を含まず、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または1つもしくは複数の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオチド間結合によって形成された骨格を有する。これらは、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される);シロキサン骨格;スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファメート骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;ならびに他のN、O、SおよびCH2が混合した構成成分部分を有するものを含む。
上のオリゴヌクレオチドの調製を説明する代表的な米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;および5,677,439を含む。
他のオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオチド間結合(すなわち骨格)の両方は新たな基で置換される。塩基単位は、適切な核酸ターゲッティング合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の1つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、詳細にはアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないがそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,539,082号、米国特許第5,714,331号および米国特許第5,719,262号を含む。PNA化合物のさらなる説明は、Nielsenら(1991)、Science、254、1497〜1500において見出される。
本発明の他の実施形態において、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N (CH3)-O-CH2- (メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として周知)、-CH2-O-N (CH3)-CH2、CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2- (式中天然のホスホジエステル骨格は上に参照の米国特許第5,489,677号の-O-P-O-CH2-として表される)、ならびに上に参照の米国特許第5,602,240号のアミド骨格が好ましい。同様に好ましいのは、上に参照の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換された糖部分を含みうる。オリゴヌクレオチドは、以下の: OH; F; O-、S-、もしくはN-アルキル; O-、S-、もしくはN-アルケニル; O-、S-もしくはN-アルキニル;またはOアルキル-O-アルキル(式中アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、CからCOアルキルに、またはC2からCOアルケニルおよびアルキニルに、置換されるまたは置換されない場合がある)のうちの1つを2'位置に含む。特に好ましいのは、O (CH2)n OmCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2およびO(CH2nON(CH2)nCH3)2であり、式中nおよびmは1から約10であって良い。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下: CからCO、(低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルもしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基および同様の特性を有する他の置換基のうちの1つを2'位置に含む。修飾は、2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても周知)すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらなる修飾は、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、本明細書以下の実施例において記載のとおり2'-DMAOEとしても周知,ならびに2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても周知)すなわち、2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2を含む。
他の修飾は、2'-メトキシ(2'-O CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-O CH2CH2CH2NH2)および2'-フルオロ(2'-F)を含む。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、詳細には3'末端ヌクレオチドの糖の3'位置または2'-5'連結オリゴヌクレオチドおよび5'末端ヌクレオチドの5'位置にも作製されうる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分などの糖類似体も有しうる。そのような修飾糖構造の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;および5,700,920を含む。
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基(当技術分野において単に「塩基」としばしば称される)修飾または置換も含みうる。本明細書において使用される「未修飾」または「天然」ヌクレオチドは、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾ヌクレオチドは、5-メチルシトシン(5-Me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ特に5-臭化、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの他の合成および天然ヌクレオチドを含む。
さらに、ヌクレオチドは、米国特許第3,687,808号に開示のもの、「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz、J.I.(編)、John Wiley & Sons、1990に開示のもの、Englischら、「Angewandle Chemie、International Edition」、1991、30、613頁に開示のもの、Sanghvi, Y. S.、15章、「Antisense Research and Applications」、289〜302頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B. ea.、CRC Press、1993によって開示されたものを含む。特定のこれらのヌクレオチドは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびに、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6およびO-6置換プリンを含む。5-メチルシトシン置換物は、0.6〜1.2℃の核酸2重鎖安定性における増大を示しており(Sanghvi, Y.S.、Crooke, S.T.およびLebleu, B.編、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現在のところ好ましい置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。
上に記載の修飾ヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドの調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許3,687,808、ならびに4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,596,091;5,614,617;5,750,692,および5,681,941を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、活性、細胞性分布またはオリゴヌクレオチドの細胞への取込みを増強する1つまたは複数の成分または複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。
そのような成分は、これだけに限らないが、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-tオキシコレステロール成分などの脂質成分を含む。
そのようなオリゴヌクレオチド複合体の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717、5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241、5,391,723;5,416,203、5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941を含む。
創薬:本発明の化合物は、創薬および標的検証の分野にも応用されうる。本発明は、本明細書において同定する化合物および好ましい標的セグメントの、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドと病態、表現型または状態との間に存在する関係性を解明するための創薬努力における使用を包含する。これらの方法は、試料、組織、細胞または生体を本発明の化合物と接触させるステップ、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの核酸またはタンパク質レベルおよび/または関連する表現型もしくは化学的な評価項目を処置後のある時期に測定するステップ、ならびに場合により測定値を未処置試料または本発明のさらなる化合物で処置した試料と比較するステップを含む、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの検出または調節を含む。これらの方法は、標的検証のプロセスのために未知の遺伝子の機能を決定するために、または特定の疾患、状態もしくは表現型の治療もしくは予防のための標的としての特定の遺伝子産物の妥当性を決定するために他の実験と並行でまたは組み合わせて実施されうる。
遺伝子発現の上方制御または抑制の評価
外来性核酸の宿主細胞または生体への輸送は、細胞中または生体中の核酸を直接検出するステップによって評価されうる。そのような検出は、当技術分野において周知のいくつかの方法によって達成されうる。例えば、外来性核酸の存在は、サザンブロットまたは核酸に関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によって検出されうる。外来性核酸の発現も遺伝子発現分析を含む従来法を使用して測定されうる。例えば外来性核酸から産生されるmRNAはノーザンブロットおよび逆転写PCR(RT-PCR)を使用して検出および定量されうる。
外来性核酸からのRNAの発現も、酵素活性またはレポータータンパク質活性を測定することによって検出されうる。例えば、アンチセンス調節活性は、外来性核酸がエフェクターRNAを産生していることの指標としての標的核酸発現における減少または増加として間接的に測定されうる。配列保存に基づいてプライマーは設計可能であり、標的遺伝子のコード領域を増幅するために使用されうる。任意の翻訳または非コード領域が使用されうるが、最初に各遺伝子から最も高く発現されるコード領域がモデル制御遺伝子を構築するために使用されうる。各制御遺伝子は、各コード領域をレポーターコード領域とそのポリ(A)シグナルとの間に挿入することによって組み立てられる。これらのプラスミドは、レポーター遺伝子を遺伝子の上流部分に、および潜在的RNAi標的を3'非コード領域に有するmRNAを産生する。個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、レポーター遺伝子の調節によって評価される。本発明の方法において有用なレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(LacZ)、ベータグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリン合成酵素(NOS)、オクトピン合成酵素(OCS)、およびそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンに耐性を付与する多重選択マーカー(Multiple selectable markers)は、利用可能である。レポーター遺伝子の調節を測定するための方法は、当技術分野において十分に周知であり、これだけに限らないが蛍光定量的方法(例えば蛍光分光法、蛍光励起細胞分取(FACS)、蛍光顕微鏡)、抗生物質耐性測定(antibiotic resistance determination)を含む。
ADIPOQ1およびADIPOQ2のタンパク質およびmRNAの発現は、当業者に知られる方法ならびに本明細書の別の箇所において説明される方法を使用してアッセイすることができる。例えば、ELISAなどのイムノアッセイを使用して、タンパク質レベルを測定することができる。ELISA用のアディポネクチン(ADIPOQ)抗体は、例えば、R&D Systems (Minneapolis、MN)、Abeam (Cambridge、MA)から市販されている。
実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して処置した試料(例えば、in vivoまたはin vitroでの細胞または組織)中におけるアディポネクチン(ADIPOQ)発現(例えば、mRNAまたはタンパク質の発現)は、対照試料中における脂質輸送代謝遺伝子発現と比較することにより評価される。例えば、当業者に知られた方法を使用して、タンパク質または核酸の発現を、偽処置試料または未処置試料中におけるタンパク質または核酸の発現と比較することができる。代替的に、所望される情報に応じて、対照アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、配列が変更されているまたは異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド)で処置した試料と比較することもできる。別の実施形態において、処置試料対未処置試料中におけるアディポネクチン(ADIPOQ)タンパク質またはアディポネクチン(ADIPOQ)核酸の発現の差違を、処置試料対未処置試料中における異なる核酸(研究者により適切であるとみなされる任意の基準核酸、例えば、ハウスキーピング遺伝子を含めた)の発現の差違と比較することもできる。
観察された差違は、対照との比較において使用するために所望される形で、例えば、比率または割合の形態で表すことができる。実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した試料中におけるアディポネクチン(ADIPOQ)mRNAまたは脂質輸送代謝遺伝子タンパク質のレベルは、未処置試料または対照核酸で処置した試料と比べて、約1.25倍〜約10倍以上増大または減少する。実施形態において、アディポネクチン(ADIPOQ)mRNAまたはアディポネクチン(ADIPOQ)タンパク質のレベルは、少なくとも約1.25倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約4.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約5.5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約6.5倍、少なくとも約7倍、少なくとも約7.5倍、少なくとも約8倍、少なくとも約8.5倍、少なくとも約9倍、少なくとも約9.5倍、または少なくとも約10倍以上増大または減少する。
キット、研究用試薬、診断および治療
本発明の化合物は、診断、治療および予防のためにならびに研究用試薬およびキットの構成要素として利用されうる。さらに、精緻な特異性を有して遺伝子発現を抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者によって特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々のメンバー間の機能を区別するためにしばしば使用される。
キットおよび診断ならびに種々の生物学的系における使用のために、本発明の化合物は、単独でまたは他の化合物もしくは治療薬との組合せのいずれでも、細胞中および組織中で発現される遺伝子の部分的または全体的な相補体の発現様式を解明するための差次的および/またはコンビナトリアルな分析での手段として有用である。
本明細書において使用される用語「生物学的系」または「系」は、アディポネクチン(ADIPOQ)の産物を発現するまたは発現できるようにされる任意の生体、細胞、細胞培養物または組織として定義される。これらは、これだけに限らないがヒト、遺伝子導入動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植物およびそれらの組合せを含む。
非限定的一例として、1つまたは複数のアンチセンス化合物で処置した細胞中または組織中の発現様式は、アンチセンス化合物で処置していない対照細胞または組織と比較され、生じた様式は、それらが例えば検査される遺伝子の疾患関連性、シグナル経路、細胞内局在性、発現レベル、大きさ、構造または機能に関連することから、遺伝子発現の差次的レベルについて分析される。これらの分析は、刺激されたまたは刺激されていない細胞で、発現様式に影響する他の化合物の存在下または非存在下で実施されうる。
当技術分野において周知の遺伝子発現分析方法の例は、DNAアレイまたはマイクロアレイ(BrazmaおよびVilo(2000)、FEBS Lett.、480、17〜24; Celisら(2000)、FEBS Lett.、480、2〜16)、SAGE (遺伝子発現の連続的分析)(Maddenら(2000)、Drug Discov. Today、5、415〜425)、READS (消化cDNAの制限酵素増幅) (PrasharおよびWeissman(1999)、Methods Enzymol、303、258〜72)、TOGA (総遺伝子発現分析) (Sutcliffeら(2000)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、97、1976〜81)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celisら(2000)、FEBS Lett.、480、2〜16; Jungblutら、Electrophoresis、1999、20,、2100〜10)、発現された配列タグ(EST)配列決定(Celisら、FEBS Lett.、2000、480、2〜16; Larssonら、J. Biotechnol、2000、80、143〜57)、サブトラクティブRNAフィンガープリンティング(SuRF) (Fuchsら(2000)、Anal. Biochem.、286、91〜98; Larsonら(2000)、Cytometry、41、203〜208)、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ(DD) (JurecicおよびBelmont(2000)、Curr. Opin. Microbiol.、3、316〜21)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(Carulliら(1998)、J. Cell Biochem. Suppl、31、286〜96)、FISH (蛍光in situハイブリダイゼーション)技術(GoingおよびGusterson(1999)、Eur. J. Cancer、35、1895〜904)および質量分析法(To、Comb(2000). Chem. High Throughput Screen、3、235〜41)を含む。
本発明の化合物は、これらの化合物がアディポネクチン(ADIPOQ)をコードする核酸にハイブリダイズすることから、研究および診断のために有用である。例えば、本明細書において開示のとおりの効率および条件下で効果的なアディポネクチン(ADIPOQ)調節因子としてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、遺伝子増幅または検出に好都合な条件下でそれぞれ効果的なプライマーまたはプローブである。これらのプライマーまたはプローブは、アディポネクチン(ADIPOQ)をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において、およびアディポネクチン(ADIPOQ)のさらなる研究における検出または使用のための前記核酸分子の増幅において有用である。アディポネクチン(ADIPOQ)をコードする核酸と、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、詳細にはプライマーおよびプローブとのハイブリダイゼーションは当技術分野において周知の手段によって検出されうる。そのような手段は、オリゴヌクレオチドへの酵素の複合、オリゴヌクレオチドの放射標識、または任意の他の適切な検出手段を含みうる。試料中のアディポネクチン(ADIPOQ)のレベルを検出するためにそのような検出手段を使用するキットも調製されうる。
アンチセンスの特異性および感度は、治療用使用のために当業者によって利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物の病態の治療における治療用成分として使用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、ヒトに安全かつ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。したがって、アンチセンス化合物が細胞、組織および動物、特にヒトの治療用のための治療計画において有用であるように構成されうる有用な治療様式でありうることは確立されている。
治療用に、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの発現を調節することによって治療されうる疾患または障害を有すると疑われる動物(好ましくはヒト)は、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療される。例えば、非限定的一実施形態において方法は、治療を必要とする動物に治療有効量のアディポネクチン(ADIPOQ)調節物質を投与するステップを含む。本発明のアディポネクチン(ADIPOQ)調節物質は、アディポネクチン(ADIPOQ)タンパク質の活性を効果的に調節するか、またはアディポネクチン(ADIPOQ)タンパク質の発現を調節する。一実施形態において動物におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現は、対照と比較して約10%抑制される。好ましくは動物におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現は、約30%抑制される。より好ましくは動物におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現は、50%またはそれを超えて抑制される。したがってオリゴマー化合物は、アディポネクチン(ADIPOQ)mRNAの発現を対照と比較して少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%調節する。
一実施形態においてアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現および/または動物においては、対照と比較して少なくとも約10%増加する。好ましくは動物におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現は、約30%増加する。より好ましくは動物におけるアディポネクチン(ADIPOQ)の活性または発現は、約50%またはそれを超えて増加する。したがってオリゴマー化合物は、アディポネクチン(ADIPOQ)mRNAの発現を対照と比較して少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%調節する。
例えばアディポネクチン(ADIPOQ)の発現の低下は、動物の血清、血液、脂肪組織、肝臓または任意の他の体液、組織または器官において測定されうる。好ましくは、分析される前記体液、組織または器官中に含まれる細胞は、アディポネクチン(ADIPOQ)ペプチドをコードする核酸分子および/またはアディポネクチン(ADIPOQ)タンパク質それ自体を含有する。
本発明の化合物は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物中で利用されうる。本発明の化合物および方法の使用は、予防的にも有用である。
複合体
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞への取込みを増強する1つまたは複数の成分または複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。これらの成分または複合体は、1級または2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した複合基を含みうる。本発明の複合基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的な複合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文脈において薬力学特性を増強する基は、取込みを改善し、分解への耐性を増強し、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の取込み、分布、代謝または排出を改善する基を含む。代表的複合基は、参照により本明細書に組み込まれる1992年10月23日出願の国際特許出願PCT/US92/09196および米国特許第6,287,860号において開示されている。複合体成分は、これだけに限らないがコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール成分などの脂質成分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性原薬、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアセピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファ
ロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質とも複合体化されうる。
そのようなオリゴヌクレオチド複合体の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、米国特許4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717、5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241、5,391,723;5,416,203、5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941を含む。
製剤
本発明の化合物は、取込み、分布および/または吸収の補助のために、例えばリポソーム、受容体-標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物と、混合物と混合、封入、複合体化または他の方法で付随されうる。そのような取込み、分布および/または吸収を補助する製剤の調製を説明する代表的米国特許は、これだけに限らないが、それぞれが本明細書に参照として組み込まれる米国特許5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,165;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的発現および/または機能を調節するためにベクターと関連して投与される必要はないが、本発明の実施形態は、プロモーター、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列を含み、強い恒常的プロモーター活性または所望の場合に誘導されうるプロモーター活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための発現ベクター構築物に関する。
一実施形態において発明実施は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つを適切な核酸送達系と共に投与するステップを含む。一実施形態においてシステムは、ポリヌクレオチドに機能的に連結された非ウイルス性ベクターを含む。そのような非ウイルス性ベクターの例は、オリゴヌクレオチド単独(例えば、配列番号7〜31の任意の1つもしくは複数)または適切なタンパク質、多糖類または脂質製剤との組合せを含む。
追加的に適切な核酸送達系は、ウイルスベクターを含み、典型的にはアデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス(AAV)、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルス(HVJ)-リポソーム複合物の少なくとも1つ由来の配列を含む。好ましくはウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに機能的に連結された強力な真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。
追加的なベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的複合体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIVベースのウイルスを含む。1つのHIVベースのウイルスベクターは、gagおよびpol遺伝子がHIVゲノム由来であり、env遺伝子が他のウイルス由来である少なくとも2つのベクターを含む。DNAウイルス性ベクターは好ましい。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスIウイルス(HSV)ベクターなどのヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターを含む。
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステルもしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与において生物学的に活性な代謝産物またはその残渣を(直接または間接的に)提供できる任意の他の化合物を包含する。
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩:すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒物学的な効果を与えない塩を意味する。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の例およびそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身処置のいずれが望ましいかおよび治療される場所に応じて多数の方法で投与されうる。投与は、局所(点眼および膣および直腸を含む粘膜送達を含む)、肺、例えば噴霧吸入器によってを含む粉末剤またはエアロゾルの吸入または吹送法によって;気管内、鼻腔内、上皮性および経皮性)、経口または非経口でありうる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入;または頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与を含む。
中枢神経系における組織を治療するためには、例えば、脳脊髄液中への注射または注入により投与を行うことができる。脳脊髄液中へのアンチセンスRNAの投与は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2007/0117772号、「Methods for slowing familial ALS disease progression」において説明されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、中枢神経系内における細胞に投与することが意図される場合、投与は、対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドが血液脳関門を透過することを促進しうる1または複数の薬剤と共に投与することができる。注射は、例えば、内嗅皮質または海馬内において行うことができる。筋肉組織内の運動ニューロンにアデノウイルスベクターを投与することにより神経栄養因子を送達することは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,632,427号、「Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons」において説明されている。脳、例えば、線条体、視床、海馬、または黒質にベクターを直接送達することは当技術分野において知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6.756,523号、「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain」において説明されている。投与は注射によるように急速でありうる、または徐放製剤のゆっくりした注入もしくは投与によるようにある時間にわたって行いうる。
対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、所望の薬学的特性または薬力学的特性をもたらす薬剤と結合またはコンジュゲートさせることもできる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェリン受容体に対する抗体など、血液脳関門を越えた透過または輸送を促進することが当技術分野において知られる任意の物質と結合させ、静脈内注射により投与することができる。アンチセンス化合物は、例えば、そのアンチセンス化合物をより有効にし、かつ/または血液脳関門を越えるそのアンチセンス化合物の輸送を増大させるウイルスベクターと結合させることができる。例えば、メソエリトリトール、キシリトール、D(+)ガラクトース、D(+)ラクトース、D(+)キシロース、ズルジトール、ミオイノシトール、L(-)フルクトース、D(-)マンニトール、D(+)グルコース、D(+)アラビノース、D(-)アラビノース、セロビオース、D(+)マルトース、D(+)ラフィノース、L(+)ラムノース、D(+)メリビオース、D(-)リボース、アドニトール、D(+)アラビトール、L(-)アラビトール、D(+)フコース、L(-)フコース、D(-)リキソース、L(+)リキソース、およびL(-)リキソースが含まれるがそれらに限定されない糖、またはグルタミン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンが含まれるがそれらに限定されないアミノ酸の注入により、血液脳関門を浸透圧的に離開させることもまた達成しうる。血液脳関門の透過を増強するための方法および材料は、例えば、参照によりそれらの全体において全てが組み込まれる米国特許第4,866,042号、「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、同第6,294,520号、「Material for passage through the blood-brain barrier」、および同第6,936,589号、「Parenteral delivery systems」において説明されている。
対象のアンチセンス化合物は、他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的分子、取込み、分布、および/または吸収の一助とするための経口製剤、直腸内製剤、局所製剤、または他の製剤と共に混合する、封入する、コンジュゲートする、または他の形で会合させることができる。例えば、陽イオン脂質を製剤中に組み入れて、オリゴヌクレオチドの取込みを促進することができる。取込みを促進することが示されているこのような1つの組成物は、LIPOFECTIN (GIBCO-BRL、Bethesda、MDから市販されている)である。
少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドが、経口投与に特に有用であると考えられる。局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれうる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが、必要または所望でありうる。コーティングしたコンドーム、グローブなどもまた有用でありうる。
好都合には単位投与形態で存在できる本発明の医薬製剤は、製薬業界において十分に周知の従来技術により調製されうる。そのような技術は、活性成分を(1つまたは複数の)薬学的担体または(1つまたは複数の)賦形剤と関連させるステップを含む。一般に製剤は、活性成分を均一かつ本質的に液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方と関連させるステップ、次いで必要な場合は産物を成形するステップによって調製される。
本発明の組成物は、これだけに限らないが錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬および浣腸などの任意の多数の可能な投与形態に製剤されうる。本発明の組成物は、水性懸濁剤、非水性または混合媒体としても製剤されうる。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランが挙げられる懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含有できる。懸濁剤は、安定剤も含みうる。
本発明の医薬組成物は、これだけに限らないが液剤、乳剤、フォーム剤およびリポソーム含有製剤を含む。本発明の医薬組成物および製剤は、1つまたは複数の浸透促進剤、担体、賦形剤または他の活性もしくは不活性成分を含みうる。
典型的には乳剤は、1つの液剤が他に通常直径0.1μmを超える液滴の形態で分散された不均一系である。乳剤は、分散相に加えて追加的構成成分を含有でき、活性剤は水相中、油相中またはそれ自体としての分離相中に溶液として存在できる。マイクロエマルジョンは、本発明の実施形態として含まれる。乳剤およびそれらの使用は、当技術分野において十分に周知であり、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用される用語「リポソーム」は、球状の1つまたは複数の二重層中に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。リポソームは、親油性物質および送達される組成物を含有する水性の内部から形成された膜を有する単層膜または多重膜ビヒクルである。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられる正に荷電したリポソームである。pH感受性または負に荷電したリポソームは、複合体化するよりもDNAを捕捉すると考えられる。カチオン性および非カチオン性の両方のリポソームは、DNAを細胞に送達するために使用されている。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、用語は本明細書における使用で1つまたは複数の特殊化された脂質(specialized lipids)を含むリポソームを意味する。リポソームに組み込まれた場合、これらの特殊化された脂質は、そのような特殊化された脂質を欠いているリポソームと比較して増強された循環寿命を有するリポソームを生じる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのビヒクル形成脂質部分の一部が1つまたは複数の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール(PEG)成分などの1つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。リポソームおよびそれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
本発明の医薬製剤および組成物は、界面活性剤もさらに含みうる。薬剤製品、製剤および乳剤における界面活性剤の使用は、当技術分野において十分に周知である。界面活性剤およびそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
一実施形態において本発明は、核酸、具体的にはオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすために種々の浸透促進剤を使用する。非親油性薬剤の細胞膜を超える拡散の補助に加えて、浸透促進剤は親油性薬剤の浸透性も促進する。浸透促進剤は、5つの広い部類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤のうちの1つに属する物として分類されうる。浸透促進剤およびそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
当業者は、製剤がそれらの目的とする使用、すなわち投与経路により日常的に設計されることを理解している。
局所投与のための製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含む。脂質およびリポソームは中性(例えばジオレオイル-ホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン)陰性(例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)およびカチオン性(例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンDOTMA)を含む。
局所または他の投与のために、本発明のオリゴヌクレオチドはリポソーム中に包含されうるか、またはそれら、詳細にはカチオン性リポソームと複合体を形成できる。別法としてオリゴヌクレオチドは、脂質中に、詳細にはカチオン性脂質に複合体化されうる。脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるそれらの塩ならびにそれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
経口投与用の組成物および製剤は、粉剤もしくは顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水溶液中もしくは非水溶液中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル、ゲルカプセル、サシェ(sachet)、錠剤またはミニ錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は、望ましい場合がある。経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが1つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート剤と共に投与されるものである。界面活性剤は、脂肪酸および/もしくはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および/またはそれらの塩を含む。胆汁酸/塩および脂肪酸ならびにそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。同様に好ましいのは、浸透促進剤の組合せ、例えば胆汁酸/塩との組合せでの脂肪酸/塩である。特に組合せは、ラウリン酸ナトリウム塩、カプリン酸およびUDCAである。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥された粒子を含む顆粒形態またはマイクロまたはナノ粒子を形成するように複合化されて経口送達されうる。オリゴヌクレオチド複合剤およびそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,860号にさらに記載されている。
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤(これだけに限らないが浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤など)も含有できる滅菌水性溶液を含みうる。
本発明の特定の実施形態は、1つまたは複数のオリゴマー化合物および非アンチセンス機構により作用する1つまたは複数の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は、これだけに限らないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチル-ニトロソウレア、ブスルファン、ミトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバシン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロ-ホスホラミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベステロール(DES)などの癌化学療法剤を含む。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は、個々に(例えば、5-FUとオリゴヌクレオチド)、連続して(例えば、一定期間の5-FUとオリゴヌクレオチドに続いてMTXとオリゴヌクレオチド)、または1つまたは複数の他のそのような化学療法剤と組み合わせて(例えば、5-FU、MTXとオリゴヌクレオチドまたは5-FU、放射線療法とオリゴヌクレオチド)使用されうる。これだけに限らないが非ステロイド性抗炎症剤および副腎皮質ステロイドが挙げられる抗炎症剤ならびに、これだけに限らないがリビビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルが挙げられる抗ウイルス剤も本発明の組成物に組合せられうる。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス剤との組合せも本発明の範囲内である。2つ以上組み合わされた化合
物は、一緒にまたは連続的に使用されうる。
他の関連する実施形態において本発明の組成物は、第1の核酸にターゲッティングされる1つまたは複数のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的にターゲッティングされる1つまたは複数の追加的アンチセンス化合物を含有できる。例えば、第1の標的は、アディポネクチン(ADIPOQ)の特定のアンチセンス配列であることができ、第2の標的は他のヌクレオチド配列由来の領域でありうる。別法として本発明の組成物は、同じアディポネクチン(ADIPOQ)核酸標的の異なる領域にターゲッティングされる2つ以上のアンチセンス化合物を含有できる。アンチセンス化合物の多数の例は、本明細書において例示され、他は当技術分野において周知の適切な化合物中から選択されうる。2つ以上組み合わされた化合物は、一緒にまたは連続的に使用されうる。
投薬
治療用組成物の処方およびそれらの続く投与(投薬)は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、数日間から数カ月間続くまたは治療が効果的になるもしくは病態の減退が達成されるまでの治療過程において、治療される病態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬計画は、患者身体での薬剤蓄積の測定から算出されうる。当業者は、最適投与量、投薬方法および繰り返し率(repetition rate)を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変動する場合があり、一般にin vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であると見出されたEC50sに基づいて概算されうる。一般に投与量は、体重1kgあたり0.01μg〜100gであり、1日に、1週間に、1カ月にもしくは1年に1回もしくは複数回またはさらに2〜20年ごとに1回である場合がある。当業者は、測定された滞留時間および体液または組織における薬剤の濃度に基づいて投薬についての繰り返し率を容易に概算できる。治療の成功に続いて、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここでオリゴヌクレオチドは維持投与において体重1kgあたり0.01μg〜100g、1日1回または複数回から20年ごとに1回の範囲で投与される。
実施形態において、患者は少なくとも約1、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100mg/体重kgである用量の薬物により治療される。ある注射用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる米国特許第7,563,884号、「Antisense modulation of PTP1B expression」において説明されている。
本発明の種々の実施形態は上に記載されているが、それが例示の方法によってのみ表されており、限定でないことは理解されるべきである。開示された実施形態への多数の変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書における開示により作製されうる。したがって本発明の広さおよび範囲は、上に記載の実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
本明細書において記述する全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願において引用する全ての刊行物および特許書類は、それぞれ個々の刊行物または特許書類が個々に記載された場合と同じ程度に全ての目的について参照により本明細書に組み込まれる。この書類における種々の参考文献の引用によって、出願人らはいずれの特定の参考文献をも出願人らの発明の「先行技術」であることを承認しない。発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例において例示される。
(実施例)
以下の非限定的実施例は、本発明の選択された実施形態を例示するために利用できる。示される構成要素の割合における変動および構成要素における代替は当業者に明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることは理解される。
(実施例1)
アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖および/またはセンス鎖核酸分子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
上に示すとおり用語「に特異的なオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド標的」は、(i)標的遺伝子の一部分と安定な複合体を形成できる配列、または(ii)標的遺伝子のmRNA転写物の一部分と安定な2重鎖を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、核酸配列を自動的に配列比較し、同一または相同な領域を示すコンピュータープログラムを使用することによって促進される。そのようなプログラムは、例えばGenbankなどのデータベースを検索することによって、またはPCR産物を配列決定することによって得られた核酸配列を比較するために使用される。さまざまな種由来の核酸配列の比較は、種の間で適切な程度の同一性を示す核酸配列の選択を可能にする。配列決定されていない遺伝子の場合は、標的種と他の種とでの遺伝子間の同一性の程度の決定を可能にするためにサザンブロットが実施される。さまざまな程度のストリンジェンシーでサザンブロットを実行することによって、当技術分野において周知であるとおり、同一性の近似測定値を得ることが可能である。これらの手順は、制御される対象での標的核酸配列への高い程度の相補性、および他の種での対応する核酸配列への低い程度の相補性を示すオリゴヌクレオチドの選択を可能にする。当業者は、本発明における使用のために遺伝子の適切な領域を選択することには相当な許容範囲が存在することを理解する。
アンチセンス化合物は、標的核酸への化合物の結合が標的核酸の通常の機能を干渉し、機能および/または活性の調節を生じる場合かつ特異的結合が望まれる条件下(すなわちin vivoアッセイまたは治療的処置の場合での生理的条件下およびin vitroアッセイの場合でのアッセイが実施される条件下)で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合に「特異的にハイブリダイズできる」。
本明細書において記載するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は、当技術分野において周知の1つまたは複数のin vitroアッセイによって決定されうる。例えば本明細書において記載するオリゴヌクレオチドの特性は、標的天然アンチセンスと潜在的薬剤分子との間の結合強度を融解曲線アッセイを使用して測定することによって得られる。
標的天然アンチセンスと潜在的薬剤分子(「分子」)との間の結合強度は、分子間相互作用の強度を測定する任意の確立された方法、例えば融解曲線アッセイを使用して概算することができる。
融解曲線アッセイは、天然アンチセンス/「分子」複合体に関して2本鎖立体構造から1本鎖立体構造への急速な移行が生じる温度を決定する。この温度は、2分子間の相互作用強度の信頼できる測定値として広く認められている。
融解曲線アッセイは、実際の天然アンチセンスRNA分子のcDNA複製物または「分子」の結合部位に対応する合成DNAもしくはRNAヌクレオチドを使用して実施されうる。このアッセイを実行するために必要な全ての試薬を含むマルチプルキットは、利用可能である(例えば、Applied Biosystems Inc. MeltDoctor kit)。これらのキットは、2本鎖DNA(dsDNA)結合色素(ABI HRM dyes、SYBR Green、SYTOなど)の1つを含有する適切な緩衝液を含む。dsDNA色素の特性は、それらは遊離形態ではほとんど蛍光を発光しないが、dsDNAに結合した場合は高度に蛍光性であるものである。
アッセイを実施するために、cDNAまたは対応するオリゴヌクレオチドを「分子」と詳細な製造者の手順書によって定められた濃度で混合する。混合物をすでに形成された全てのdsDNA複合体を解離させるため95℃に加熱し、次いでDNA分子をアニールさせるために室温またはキット製造者によって定められた他の低い温度まで徐冷する。新たに形成された複合体を、次いで反応によって産生される蛍光量についてのデータを連続に収集しながら同時にゆっくりと95℃まで加熱する。蛍光強度は、反応物中に存在するdsDNAの量に反比例する。データは、キットに適合するリアルタイムPCR装置(例えば、ABIのStepOne Plus Real Time PCR SystemまたはLightTyper instrument、Roche Diagnostics、Lewes、UK)を使用して収集できる。
融解ピークは、適切なソフトウエア(例えば、LightTyper (Roche)またはSDS Dissociation Curve、ABI)を使用して温度に関する蛍光の負の微分係数(-d(蛍光)/dT) y軸)を温度(x軸)に対してプロットすることによって作図する。データをdsDNA複合体から単鎖分子への急速な移行の温度を同定するために分析する。この温度をTmと称し、2分子間の相互作用の強度に正比例する。典型的にはTmは40℃を超える。
(実施例2)
ADIPOQポリヌクレオチドの調節
アンチセンスオリゴヌクレオチドでのHepG2細胞の処置
ATCC (cat# HB-8065)由来のHepG2細胞を増殖培地(MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024またはMediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech cat# MT30-002-CI))中、37℃、5% CO2で増殖させた。実験前日に、細胞を1mlあたり1.5×105個の密度で6ウエルプレートに再播種し、37℃、5% CO2でインキュベートした。実験当日に6ウエルプレートの培地を新鮮増殖培地に交換した。全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドを濃度20μMに希釈した。この溶液2μlをOpti-MEM培地(Gibco cat#31985-070) 400μlおよびLipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019) 4μlと室温で20分間インキュベートし、HepG2細胞を含む6ウエルプレートの各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに水2μlを含む同様の混合物を偽形質移入対照用に使用した。37℃、5% CO2での3〜18時間のインキュベーション後、培地を新鮮増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の48時間後、培地を除去し、RNAを細胞からPromegaからのSV Total RNA Isolation System (cat # Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(cat# 74181)を製造者の手順書に従って使用して抽出した。RNA 600ngをThermo ScientificからのVerso cDNAキット(cat#AB1453B)またはHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキットcat# 4368813)を製造者の手順書に記載のとおり使用して実施した逆転写反応に加えた。この逆転写反応からのcDNAをABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)およびABI (Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay)によって設計されたプライマー/プローブを使用するリアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。以下のPCRサイクルを使用した: 50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間、60℃で1分間)を40サイクル、StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied BiosystemsによるHs02564413_s1およびHs01047563_m1)を使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後の遺伝子発現における倍数変化を処置試料と偽形質移入試料との間での18S-標準化dCt値の差に基づいて算出した。
結果:
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した1つのオリゴおよびBC036509に対して設計した1つのオリゴを用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す(図1)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した2つのオリゴ(CUR-1107および1108)ならびにBC036509に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1110)を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す(図2)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した2つのオリゴを用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す(図4)。
リアルタイムPCR結果は、HepG2細胞におけるADIPOR2 mRNAのレベルが、ADIPOR2アンチセンスSkerblarbu.aApr ADIPOR2に対して設計したオリゴのうちの一方を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す。LOC729097に対して設計したオリゴ(CUR-1078〜CUR-1081)は、ADIPOR2発現を増加させなかった(図5)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるVero76細胞の処理
ATCCからのVero76細胞(カタログ番号CRL-1587)を、37℃および5%CO2で、増殖培地(MEM/EBSS(Hycloneカタログ番号SH30024またはMediatechカタログ番号MT-10-010-CV)+10%FBS(Mediatechカタログ番号MT35-01I-CV)+ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatechカタログ番号MT30-002-CI))中で成長させた。実験の前日に、細胞を、6ウェルプレートに1.5×105/mlの密度で再度平板培養し、37℃および5%CO2でインキュベートした。実験の日に、6ウェルプレート中の培地は、新鮮な増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、20μMの濃度まで水中で希釈した。この溶液の2μlを、20分間、室温で、400μlのOpti-MEM培地(Gibcoカタログ番号31985-070)および4ulのLipofectamine 2000(Invitrogenカタログ番号I1668019)と共にインキュベートし、Vero76細胞を有する6ウェルプレートの各ウェルに加えた。オリゴヌクレオチド溶液の代わりに2μlの水を含む同様の混合物は、偽トランスフェクト対照に使用した。37℃および5%CO2でのインキュベーションの3〜18時間後に、培地を新鮮な増殖培地に交換した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの追加の48時間後に、培地を取り出し、RNAは、メーカーの指示に従って、PromegaからのSV Total RNA Isolation System(カタログ番号Z3105)またはQiagenからのRNeasy Total RNA Isolationキット(カタログ番号74181)を使用して細胞から抽出した。600ngのRNAを、メーカーのプロトコールに記載されるように、Thermo ScientificからのVerso cDNAキット(カタログ番号AB1453B)を使用して実行した逆転写反応に追加した。この逆転写反応からのcDNAは、ABI Taqman Gene Expression Mix(カタログ番号4369510)ならびにABIによって設計されたプライマー/プローブ(Applied Biosystems Inc.、Foster City CAによるApplied Biosystems Taqman Gene Expression Assay:Hs02564413_slおよびHs01047563_ml)を使用して、リアルタイムPCRによって遺伝子発現をモニターするために使用した。StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)を使用し、以下のPCRサイクルを使用した:50℃で2分間、95℃で10分間、(95℃で15秒間および60℃で1分間)を40サイクル。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理後の遺伝子発現の変化倍数は、処理試料および偽トランスフェクト試料の間の18S標準化dCt値の差異に基づいて計算した。
結果:リアルタイムPCR結果は、Vero細胞におけるADIPOQ mRNAのレベルが、ADIPOQアンチセンスAA515150に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1107)およびBC036509に対して設計した1つのオリゴ(CUR-1110)を用いる処理の48時間後に、著しく増加することを示す(図3)。

Claims (21)

  1. in vivoまたはin vitroで患者の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させるための組成物であって、長さが10〜25ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは配列番号3、4、5または6からなる群から選択される天然アンチセンスポリヌクレオチドを標的とし、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドはADIPOQまたはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させる活性を有し、前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号7〜20、22〜28、30または31のヌクレオチドに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組成物。
  2. アディポネクチン(ADIPOQ)の機能および/または発現が、対照と比較してin vivoまたはin vitroで増加する、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号3または4から選択されるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列を標的にする、請求項1に記載の組成物。
  4. 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドのコードおよび/または非コード核酸配列にアンチセンスな天然アンチセンスポリヌクレオチドを標的にする、請求項1に記載の組成物。
  5. 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの重複および/または非重複配列を有する天然アンチセンスポリヌクレオチドを標的にする、請求項1に記載の組成物。
  6. 前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾糖部分、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド、およびその組み合わせから選択される1つまたは複数の修飾を含む、請求項1に記載の組成物。
  7. 前記1つまたは複数の修飾が、2'-O-メトキシエチル修飾糖部分、2'-メトキシ修飾糖部分、2'-O-アルキル修飾糖部分、二環式糖部分、およびその組み合わせから選択される、少なくとも1つの修飾糖部分を含む、請求項6に記載の組成物。
  8. 前記1つまたは複数の修飾が、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、およびその組み合わせから選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、請求項6に記載の組成物。
  9. 前記1つまたは複数の修飾が、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、アラビノ核酸(FANA)、およびその組み合わせから選択される少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項6に記載の組成物。
  10. 前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、配列番号7〜20、22〜28、30または31として記載される少なくとも1つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組成物。
  11. in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させるための組成物であって、長さが19〜30ヌクレオチドの少なくとも1つの低分子干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドを含み、前記少なくとも1つのsiRNAオリゴヌクレオチドは配列番号3、4、5または6から選択されるアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して特異的であり、前記少なくとも1つのsiRNAオリゴヌクレオチドはADIPOQまたはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させる活性を有し、前記オリゴヌクレオチドは配列番号7〜20、22〜28、30または31のヌクレオチドに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組成物。
  12. 前記少なくとも1つのsiRNAオリゴヌクレオチドが、配列番号3または4から選択されるアディポネクチン(ADIPOQ)ポリヌクレオチドの天然アンチセンスポリヌクレオチドに対して特異的である、請求項11に記載の組成物。
  13. in vivoまたはin vitroで哺乳動物の細胞または組織におけるアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2の機能および/または発現を増加させるための組成物であって、アディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの天然アンチセンス鎖の非コードおよび/またはコード配列に対して特異的な、長さが10〜25ヌクレオチドの少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号7〜20、22〜28、30または31のヌクレオチドに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドはADIPOQまたはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させる活性を有する、組成物。
  14. 少なくとも1つの修飾を含む合成修飾オリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも1つの修飾は、少なくとも1つの修飾糖部分、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド、およびその組み合わせから選択され、前記オリゴヌクレオチドは、正常対照と比較して、in vivoまたはin vitroで配列番号3、4、5または6から選択されるADIPOQまたはADIPOR2の天然アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズし、前記ADIPOQまたはADIPOR2の機能および/または発現を増加させるアンチセンス化合物であり、前記オリゴヌクレオチドは配列番号7〜9、13、15、16、18、24、26、28、30または31のヌクレオチドに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、合成修飾オリゴヌクレオチド。
  15. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号9、13および15からなる群から選択される、請求項１４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
  16. アンチセンス配列、相補的配列、対立遺伝子、ホモログ、アイソフォーム、変異体、誘導体、突然変異体、断片、またはその組み合わせを含む1つまたは複数のアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドに対する天然アンチセンスに対して特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号7〜18、24、26〜28、30および31として記載されるヌクレオチド配列のいずれか1つと比較して、少なくとも80%の配列同一性を有し、前記オリゴヌクレオチドはADIPOQまたはADIPOR2ポリヌクレオチドの機能および/または発現を増加させる活性を有する、組成物。
  17. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号7〜18、24、26〜28、30および31として記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項16に記載の組成物。
  18. 配列番号7〜18、24、26〜28、30および31として記載されるオリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の修飾または置換を含む、請求項17に記載の組成物。
  19. 前記1つまたは複数の修飾が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、ロックド核酸(LNA)分子、およびその組み合わせから選択される、請求項18に記載の組成物。
  20. 少なくとも1つのアディポネクチン(ADIPOQ)もしくはADIPOR2ポリヌクレオチドおよび/またはその少なくとも1つのコード産物と関連する疾患を予防または治療するための組成物であって、前記少なくとも1つのアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの天然アンチセンス配列に結合し、かつ前記少なくとも1つのアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドの発現を増加させる、治療有効量の少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記少なくとも1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号7〜20、22〜28、30または31のヌクレオチドに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組成物。
  21. 前記少なくとも1つのアディポネクチン(ADIPOQ)またはADIPOR2ポリヌクレオチドと関連する疾患が、癌、炎症、アテローム性動脈硬化症、神経系疾患または障害、心臓病または障害、自己免疫疾患または障害、ウイルス、細菌、菌類、原虫などのような作用物質によって引き起こされる感染症または障害または状態、免疫不全症または障害;アレルギー、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、糖尿病性ニューロパチー、肥満、高血糖症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性と関連するメタボリック症候群、メタボリック症候群、高血圧症、インスリン感受性の調節異常と関連する疾患または障害、および異常な血液グルコースレベルを含む代謝疾患または障害、肝臓病、腎臓病、アルブミン尿症、および細胞増殖障害から選択される、請求項20に記載の組成物。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
EA201492123A1 (ru) 2012-05-16 2015-10-30 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии семейства генов smn
EA201492116A1 (ru) 2012-05-16 2015-05-29 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2
EP2850188A4 (en) 2012-05-16 2016-01-20 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF THE MULTIGENIC FAMILY OF HEMOGLOBIN
KR102028784B1 (ko) 2012-05-16 2019-10-04 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN104583401A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节atp2a2表达的组合物和方法
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
CN104540946A (zh) 2012-05-16 2015-04-22 Rana医疗有限公司 用于调节utrn表达的组合物和方法
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
WO2017048620A1 (en) * 2015-09-14 2017-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
KR101901669B1 (ko) * 2016-01-27 2018-09-28 경상대학교산학협력단 아디포넥틴 수용체 활성화 신규 펩티드를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2019226952A1 (en) * 2018-05-24 2019-11-28 Valkyrie Pharmaceutics, Inc. Methods and formulations for the treatment of obesity and obesity-related metabolic diseases

Family Cites Families (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1109630A (en) 1910-05-26 1914-09-01 Liberty Trust Company Combined washing and clothes-drying machine.
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5288512A (en) 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US6034233A (en) 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
DE4223850A1 (de) 1991-07-23 1993-01-28 Mitsubishi Chem Ind Magnetooptisches aufzeichnungsmedium
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
IL101600A (en) 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
WO1994009148A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Toray Industries, Inc. Process for producing major histocompatibility antigen class ii protein and material having the same immobilized thereon
JPH08510130A (ja) 1993-05-11 1996-10-29 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 異常スプライシングを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同物質の利用法
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
EP0889122A3 (en) 1993-11-30 1999-03-03 McGILL UNIVERSITY Inhibition of DNA Methyltransferase
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
WO1995022618A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
GB9501465D0 (en) 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5739311A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
BR9707529A (pt) 1996-02-14 2000-01-04 Isis Pharmaceuticals Inc Oligunucleotìdeo especificamente hibridizável com dna ou rna.
PT888385E (pt) 1996-03-14 2004-01-30 Genentech Inc Utilizacoes de gdnf e de receptores de gdnf
AU2733697A (en) 1996-04-17 1997-11-07 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of vascular endothelial growth factor (vegf/vpf) expression
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US6221587B1 (en) 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
SK17432000A3 (sk) 1998-05-26 2001-07-10 Icn Pharmaceuticals, Inc. Zlúčenina, ktorá zahŕňa nukleozid s 2',4'-mostíkom a oligonukleotid z nej odvodený
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2243761C (en) 1998-07-21 2009-10-06 Certicom Corp. Timing attack resistant cryptographic system
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
AU1607100A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Alcon Laboratories, Inc. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
AU776512B2 (en) 1999-01-27 2004-09-09 David Laurence Becker Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
ATE385237T1 (de) 1999-02-26 2008-02-15 Univ British Columbia Antisense-therapie für trpm-2
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
JP4726302B2 (ja) 1999-03-15 2011-07-20 ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬
EP1161554B1 (en) 1999-03-18 2011-03-09 Exiqon A/S Detection of mutations in genes by specific lna primers
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
IL145496A0 (en) 1999-03-24 2002-06-30 Exiqon As Improved synthesis of [2.2.1] bicyclo nucleosides
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
EP1171078A4 (en) 1999-03-26 2002-11-06 Aventis Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INFLUENCING THE BLOOD LEVELS OF HIGH DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) CHOLESTEROL AND APOLIPOPROTEIN AI, VERY LOW DENSITY LIPOROTEIN (VLDL) CHOLESTEROL AND LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) CHOLESTER
ES2300261T3 (es) 1999-04-08 2008-06-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Potenciacion de la respuesta inmune para aplicaciones de vacunas y terapia genetica.
WO2000063365A1 (en) 1999-04-21 2000-10-26 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU781437B2 (en) 1999-06-25 2005-05-26 Serono Genetics Institute S.A. A novel BAP28 gene and protein
US20040006031A1 (en) 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001021631A2 (en) 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6986988B2 (en) 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001025488A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
AU1085401A (en) * 1999-10-15 2001-04-30 Orchid Biosciences, Inc. Genotyping reagents, kits and methods of use thereof
AU2778801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Baylor University Antisense compositions and methods
WO2001051490A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methanocarba cycloalkyl nucleoside analogues
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AP2002002638A0 (en) 2000-03-27 2002-09-30 Univ Delaware Targeted chromosomal genomic alternations with modified single stranded oligonucleotides.
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
US20030176341A1 (en) 2000-06-29 2003-09-18 Jean-Francois Meritet Interferon-alpha induced gene
WO2002009700A1 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Cancer Research Technology Limited Cancer treatment by combination therapy
WO2002018388A1 (fr) 2000-08-29 2002-03-07 Takeshi Imanishi Analogues de nucleosides et derives d'oligonucleotides renfermant ces analogues
HUP0301805A3 (en) 2000-09-02 2005-12-28 Gruenenthal Gmbh Antisense oligonucleotides against vanilloid receptor 1
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
AU2001289085A1 (en) 2000-09-20 2002-04-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
US20030186920A1 (en) 2000-10-13 2003-10-02 Sirois Martin G. Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
EP1368458A2 (en) 2001-02-26 2003-12-10 Pharma Pacific Pty. Ltd. Interferon-alpha induced gene
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
KR20040022449A (ko) 2001-07-12 2004-03-12 유니버시티 오브 매사추세츠 유전자 불활성화를 매개하는 소형 간섭 ｒｎａ의 생체내제조
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2002334307A1 (en) 2001-09-04 2003-03-18 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US20040214766A1 (en) 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
BR0213180A (pt) 2001-10-10 2004-09-14 Nestle Sa Planta de café com uma atividade de alfa-d-galactosidase reduzida
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US20050143357A1 (en) 2002-02-25 2005-06-30 Ake Pousette Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-) methods and uses thereof
US7144995B2 (en) 2002-03-08 2006-12-05 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
PT2264172T (pt) 2002-04-05 2017-12-06 Roche Innovation Ct Copenhagen As Compostos oligoméricos para a modulação da expressão do hif-1α.
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
AU2003298556A1 (en) 2002-08-19 2004-05-04 Regulome Corporation Functional sites
AU2003270537B2 (en) 2002-09-10 2008-03-20 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
EP1549387A1 (en) 2002-09-25 2005-07-06 Pharmacia Corporation Antisense modulation of farnesoid x receptor expression
US7229976B2 (en) 2002-09-26 2007-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
US20040152651A1 (en) 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
CA2504926C (en) 2002-11-01 2014-01-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for sirna inhibition of hif-1 alpha
EP1560840B1 (en) 2002-11-05 2015-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
DK2752488T3 (da) 2002-11-18 2020-04-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-design
US7250289B2 (en) * 2002-11-20 2007-07-31 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis of mouse
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7790867B2 (en) 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
CA2515677A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 Wyeth Methods for monitoring drug activities in vivo
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7339051B2 (en) 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
CA2540692C (en) 2003-06-02 2013-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CN1984921B (zh) 2003-06-03 2010-06-16 Isis药物公司 存活蛋白表达的调节
US7568709B2 (en) 2003-07-03 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Passive stabilization systems for wheeled objects
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ545134A (en) 2003-09-18 2009-06-26 Lilly Co Eli Modulation of eIF4E expression
US8258105B2 (en) 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8632570B2 (en) * 2003-11-07 2014-01-21 Biedermann Technologies Gmbh & Co. Kg Stabilization device for bones comprising a spring element and manufacturing method for said spring element
AU2004303464B2 (en) 2003-12-23 2009-10-01 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of BCL-2
RU2388817C2 (ru) 2004-01-12 2010-05-10 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Активация экспрессии гена костного морфогенетического белка (вмр) в костных клетках посредством электромагнитных сигналов
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7577587B2 (en) 2004-07-07 2009-08-18 Sap Ag Purchase order and purchase order response interactive forms
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
US20060040861A1 (en) 2004-07-29 2006-02-23 Yoshiki Iwamoto Method of treating, preventing, and diagnosing prostate cancer
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
JP4583849B2 (ja) 2004-09-14 2010-11-17 塩野義製薬株式会社 新規糖尿病関連因子
NZ555644A (en) 2004-11-09 2009-04-30 Santaris Pharma As Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1A expression
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
JP5116107B2 (ja) 2005-06-27 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ＨＩＦ−１のＲＮＡｉ調節及びその治療的利用
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US20070259377A1 (en) * 2005-10-11 2007-11-08 Mickey Urdea Diabetes-associated markers and methods of use thereof
JP5111385B2 (ja) 2005-10-28 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法
AU2006311725B2 (en) 2005-11-04 2011-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of NAV1.8 gene
EP2431467A3 (en) 2005-11-17 2012-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
US20070248590A1 (en) 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof
CN101374964B (zh) 2005-12-09 2013-07-17 贝勒研究院 外周血液白细胞转录模式的模块水平分析
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
US20070213274A1 (en) 2005-12-20 2007-09-13 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)
EP1976567B1 (en) * 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
CA2636724A1 (en) * 2006-01-09 2007-08-02 Children's Hospital Medical Center Adiponectin for treatment of various disorders
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007115168A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
ES2471978T3 (es) 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
EP3249052B1 (en) 2006-05-11 2019-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007134181A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
CA2675946A1 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Lionel Navarro Methods and compositions for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways
CA2686933A1 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
BRPI0913657A2 (pt) 2008-07-01 2020-08-04 Monsanto Technology Llc constructos de dna recombinante e métodos para a modulação da expressão de um gene-alvo
EP2352830B1 (en) 2008-10-03 2019-01-16 CuRNA, Inc. Treatment of apolipoprotein-a1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-a1
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
CN102449151A (zh) * 2008-10-22 2012-05-09 夸克医药公司 治疗眼部疾病的方法
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
EP2358382A2 (en) 2008-11-22 2011-08-24 The University of Bristol NOVEL USES OF VEGFxxxB
CA2770104C (en) 2009-08-11 2019-03-19 Opko Curna, Llc Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)

Also Published As

Publication number Publication date
EP2464731A4 (en) 2013-05-15
EP2464731A2 (en) 2012-06-20
US10316317B2 (en) 2019-06-11
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