DE69128037T2

DE69128037T2 - Bifunktionelle wählbare fusionsgene

Info

Publication number: DE69128037T2
Application number: DE69128037T
Authority: DE
Inventors: Stephen D. Seattle Wa 98115 Lupton
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1990-11-13
Filing date: 1991-11-12
Publication date: 1998-05-07
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: WO1992008796A1; CA2096222C; CA2096222A1; ATE159548T1; DE69128037D1; EP0557459A1; AU9081591A; DK0557459T3; JP3150340B2; JPH06504432A; AU650085B2; EP0557459B1; IE913929A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Selektionsphänotype exprimierende Gene. Die vorliegende Erfindung betrifft besonders Gene, die sowohl dominantpositive als auch negative Selektionsphänotypen gemeinsam exprimieren können.
Einen Selektionsphänotyp exprimierende Gene werden in DNA-Rekombinationsverfahren als Mittel zur Identifizierung und Isolierung von Wirtszellen, in die das Gen eingeführt wurde, häufig verwendet. Üblicherweise wird das den Selektionsphänotyp exprunierende Gen als Teil eines rekombinanten Expressionsvektors in die Wirtszelle eingeführt. Positive Selektionsgene liefern ein Mittel zur Identifizierung und/oder Isolierung von eingeführte Gene in einer stabilen Form bewahrenden Zellen und haben mit dieser Fähigkeit den Gentransfer und die Analyse der Genfünktion wesentlich erleichtert. Negative Selektionsgene liefern andererseits ein Mittel zur Eliminierung von das eingeführte Gen bewahrenden Zellen.
Eine Reihe von Selektionsphänotypen auf Tierzellen übertragenden Genen ist erhältlich. Die bakterielle Neomycin-Phosphotransferase (neo)- (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1), Hygromycin-Phosphotransferase (hph)- (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147) und Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt)-Gene (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072) sind häufig verwendete dominant-positive Selektionsgene. Das Herpes simplex-Virus-Typ I- Thymidinknase (HSV-I TK)-Gen (Wigler et al., Cell 11(1977), 223) und die zellulären Adeninphosphoribosyltransferase (APRT)- (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 1373) und Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Gene (Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 477) sind häufig verwendete rezessiv-positive Selektionsgene. Allgemein sind dominante Selektionsgene vielseitiger als rezessive Gene, da die Verwendung von rezessiven Genen auf Zellen, die hinsichtlich der Selektionsfünktion defizient sind, beschränkt ist, während dominante Gene in Wildtyp- Zellen verwendet werden können.
Mehrere Gene übertragen negative sowie positive Selektionsphänotypen, emschließlich der HSV-I TK-, HPRT-, APRT- und gpt-Gene. Diese Gene codieren Enzyme, die die Umwandlung von Nucleosid- oder Purinanalogen in cytotoxische Zwischenprodukte katalysieren. Das Nucleosidanaloge GCV ist ein effizientes Substrat für HSV-I TK, jedoch ein schwaches Substrat für zelluläre TK und kann daher zur negativen Selektion auf das HSV-I TK-Gen in Wildtyp-Zellen verwendet werden (St. Clair et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31 (1987), 844). Das HSV-I TK-Gen kann jedoch nur effektiv für eine positive Selektion in mutierten Zellen, denen die zelluläre TK-Aktivität fehlt, verwendet werden. Die Verwendung der HPRT- und APRT-Gene entweder für eine positive oder eine negative Selektion ist in ahnlicher Weise auf HPRT- bzw. APRT-Zehen beschränkt (Fenwick, "The HGPRT System", S.333-373, M. Gottesman (Hrsg.), Molecular Cell Genetics, John Wiley and Sons, New York, 1985; Taylor et al., "The APRT System", S. 311-332, M. Gottesman (Hrsg.), Molecular Cell Genetics, John Wiley and Sons, New York, 1985). Das gpt-Gen kann andererseits sowohl zur positiven als auch zur negativen Selektion in Wildtyp-Zellen verwendet werden. Die negative Selektion auf das gpt-Gen in Wildtyp-Zellen ist unter Verwendung von 6-Thioxantliin möglich, das durch das bakterielle gpt-Enzym, jedoch nicht durch das zelluläre HPRT-Enzym effizient in ein cytotoxisches Nucleotidanalog umgewandelt wird (Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 4139).
Kürzlich richtete sich die Aufmerksamkeit auf Selektionsgene, die in Gentransfervektoren, die zur Verwendung in der Gentherapie am Menschen entwickelt wurden, eingeschlossen werden können. Die Gentherapie ist ein Verfahren zur permanenten Heilung einer genetischen Erbkrankheit, die entsteht, wenn ein oder mehrere Gene defekt sind oder fehlen. Diese Erkrankungen bewirken allgemein eine signifikante Morbidität und Moruilität. Beispiele für solche genetischen Erkrankungen sind Hämophilie A und B (durch Defizienz der Blutgerinnungsfaktoren VIII bzw. IX bewirkt), eine alpha-1-Antitrypsin- und Adenosindesaminase-Defizienz. In jedem dieser besonderen Fälle wurde das fehlende Gen identifiziert und seine komplementäre DNA (cDNA) molekular cloniert (Wood et al., Nature 312 (1984), 330, Anson et al., Nature 315 (1984), 683, Long et al., Biochemistry 23 (1984), 4828, und Daddona et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 12101). Während eine palliative Therapie für einige dieser genetischen Erkrankungen verfügbar ist, häufig in Form einer Verabreichung von Blutprodukten oder Bluttranstusionen, ist ein Weg zur permanenten Heilung solcher genetischen Erkrankungen die Einführung eines Ersatzes für das defekte oder fehlende Gen in die somatischen Zellen des Patienten, em Verfahren, das als "Gentherapie" bezeichnet wird (Anderson, Science 226 (1984), 401). Die Gentherapie kann ferner als Mittel zur Erhöhung der normalen Genfünktion verwendet werden, beispielsweise durch Einführung eines heterologen Gens, das die Zellaktivitäten oder den Zellphänotyp modifizieren kann, oder alternativ ein Arzneimittel exprimieren kann, das zur Behandlung einer Erkrankung benötigt wird.
Das Verfahren der Gentherapie umfaßt üblicherweise die folgenden Schritte: (1) Entfernung von somatischen (nicht-Keim-) Zellen aus dem Patienten, (2) Einführung eines Ersatzgens in die Zellen ex vivo durch einen geeigneten Vektor, der das Ersatzgen exprimieren kann, und (3) Transplantation oder Transfüsion dieser Zellen zurück in den Patienten, in dem das Ersatzgen zur Bereitstellung eines therapeutischen Nutzens exprimiert wird. Der Gentransfer in somatische Zellen für die Gentherapie am Menschen wird gegenwärtig ex vivo durchgeführt (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473, und Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323 (1990), 570), und dieses relativ ineffiziente Verfahren wurde durch die Verwendung eines dominant-positiven Selektionsgens zur Identifizierung und Isolierung der Zellen vor ihrer Rückführung in den Patienten, in die das Ersatzgen eingeführt wurde, erleichtert. Das neo-Gen wurde beispielsweise zur Identifizierung von zur Gentherapie am Menschen verwendeten genetisch modifizierten Zellen verwendet.
Gelegentlich kann jedoch die Einfülnung von genetisch modifizierten Zellen die Gesundheit des Patienten auch beeinträchtigen. Die Fähigkeit zur selektiven Beseitigung von genetisch modifizierten Zellen in vivo wäre ein weiterer Sicherheitsgewinn für Gentherapie-Patienten, da die Umkehrung des Verfahrens möglich ist. Dies könnte durch Einbau eines in Wildtyp-Zellen funktionsfähigen negativen Selektionsgens (oder "Suizidgens") in den Vektor erreicht werden. Der Einbau eines sowohl dominant-positive als auch negative Selektionsphänotypen übertragenden Gens würde die gemeinsame Expression und gemeinsame Regulation der positiven und negativen Selektionsphänotypen sicherstellen und die Größe des Vektors minimieren. Die positive Selektion auf das gpt-Gen erfordert jedoch gelegentlich schwer zu ermittelnde präzise Selektionsbedingungen. Die Durchführbarkeit der Verwendung des gpt-Gens zur negativen In vivo-Selektion wurde außerdem noch nicht eindeutig etabliert. Aus diesem Grund wird die gemeinsame Expression eines dominant-positiven Selektionsphänotyps und eines negativen Selektionsphänotyps üblicherweise durch gemeinsame Expression von zwei unterschiedlichen Genen erreicht, die getrennt andere dominant-positive und negative Selektionsfunktionen codieren, anstatt das gpt-Gen zu verwenden.
Die bisherigen Strategien zur gemeinsamen Expression von von unterschiedlichen Genen codierten dominant-positiven und negativen Selektionsphänotypen stellen oft komplexe Herausforderungen dar. Wie vorstehend beschrieben, ist das am häufigsten verwendete Verfahren die gemeinsame Transfektion von zwei zwei Phänotypen getrennt codierenden Plasmiden (Wigler et al., Cell 16 (1979), 777). Die Effizienz des gemeinsamen Transfers ist jedoch selten 100% und die beiden Gene können einer unabhängigen genetischen oder epigenetischen Regulation unterworfen sein. Eine zweite Strategie ist die Verknüpfung der beiden Gene auf einem einzigen Plasmid oder der Einschluß von zwei unabhängigen Transkriptionseinheiten in einen viralen Vektor. Dieses Verfahren leidet auch unter dem Nachteil, daß die Gene unabhängig reguliert werden können. In retroviralen Vektoren kann die Suppression von der einen oder der anderen unabhängigen Transkriptionseinheit erfolgen (Emerman und Temin, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 792). Ferner kann gelegentlich zu wenig Platz vorhanden sein, um zwei funktionelle Transkriptionseinheiten innerhalb eines viralen Vektors unterzubringen, obwohl retrovirale Vektoren mit funktionellen multiplen Promotoren erfolgreich hergestellt worden sind (Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 1803). Eine dritte Strategie ist die Expression der beiden Gene als eine bicistronische mRNA unter Verwendung eines einzigen Promotors. In diesem Verfahren wird jedoch der distale offene Leserahmen oft mit variabler (und üblicherweise reduzierter) Effizienz translatiert (Kaufman et al., EMBO J. 6 (1987), 187), und es ist unklar, wie effektiv diese Expressionsstrategie in Primärzellen ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur effizienteren und zuverlässigeren gemeinsamen Expression eines dominant-positiven Selektionsphänotyps und eines negativen Selektionsphänotyps, die von verschiedenen Genen codiert werden, bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Selektionsfusionsgen bereit, das ein dominant-positives Selektionsgen, das mit einem negativen Selektionsgen im Leserahmen fusioniert ist, umfaßt. Das Selektionsfusionsgen codiert ein einziges bifunktionelles Fusionsprotein, das auf einem zellulären Wirt einen dominant-positiven und einen negativen Selektionsphänotyp übertragen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Selektionsfusionsgen Nucleotidsequenzen des an Nucleotidsequenzen des HSV-I TK-Gens fusionierten hph-Gens, das hier als das HyTK-Selektionsfusionsgen (Sequenzprotokoll Nr. 1) bezeichnet wird. Das HyTK-Selektionsfusionsgen überträgt sowohl die Hygromycin B-Resistenz (Hmr) zur dominant-positiven Selektion als auch die Ganciclovir-Empfindlichkeit (GCVs) zur negativen Selektion.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Selektionsfusionsgene einschließende rekombinante Expressionsvektoren, beispielsweise Retroviren, und mit den rekombinanten Expressionsvektoren transduzierte Zellen bereit.
Die erfindungsgemäßen Selektionsfusionsgene werden als eine einzige genetische Einheit exprimiert und reguliert, was eine gemeinsame Regulation und gemeinsame Expression mit einem hohen Grad an Effizienz ermöglicht.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt Diagramme der erfindungsgemaße provirale Strukturen enthaltenden Plasmide tgCMV/hygro, tgCMV/TK und tgCMV/HyTK. Die drei Plasmide sind bis auf die zwischen dem HCMV-Promotor (schwarzer Balken) und dem Polyadenylierungssignal der frähen Region von SV40 (schraffierter Balken) insertierten Gene identisch.
Figur 2 zeigt Diagramme der proviralen Strukturen der in Figur 1 dargestellten Plasmide. Die horizontalen Pfeile zeigen die Transkriptionsstartstellen und die Richtung der Transkriptionen. Der leere Balken mit der Bezeichnung LTR ist die retrovirale lange termiriale Wiederholung. Die virale Spleiß-Donorsequenz wird als SD und die virale Akzeptorsequenz wird als SA bezeichnet. Der leere Balken mit der Bezeichnung CMV ist der Cytomegalovirus-Promotor. In tgLS(+)HyTK/stop sind die Positionen der beiden internen Initiationscodons, die im HyTK-Selektionsfusionsgen erhalten bleiben, durch vertikale Pfeile angezeigt. Die Stelle, an der das universelle Translationsterminatoroligonucleotid insertiert wurde, ist ebenfalls markiert.
Die Figuren 3 und 4 sind graphische Darstellungen, die die Ergebnisse eines Kurzzeit-Proliferationstests zeigen, in dem die Hygromycin-resistenten (Hmr) NIH/3T3- Zell-Poole und die Hmr- und HAT-resistenten (HATr) Rat-2-Zell-Poole auf ihre Ganciclovir-Empfindlichkeit (GCVs) getestet werden. Figur 3 zeigt, daß GCV das Wachstum von mit tgCMV/HyTK transfizierten NIH/3T3-Zellen, jedoch nicht das von mit tgCMV/Hygro transfizierten NIH/3T3-Zellen hemmt. Figur 4 zeigt, daß GCV das Wachstum von mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2-Zellen (anfänglich auf Hmr oder HATr selektiert) selbst bei geringsten GCV-Konzentrationen hemmt, und ferner das Wachstum von mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen, allerdings bei leicht höheren Konzentrationen, bemmt. GCV hemmt nicht das Wachstum von mit tgCMV/Hygro transfizierten Rat-2-Zellen.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse der Northern-Analyse von Hmr- und HATr-Zell Poolen. Die polyadenylierte mRNA wurde aus jedem Hmr- und HATr-Zell-Pool extrahiert und zur Herstellung von Northern-Blots verwendet, die mit Sequenzen des hph- Gens (Bild A), HSV-I TK-Gens (Bild B) oder β-Actin-Gens (Bild C) (zur mRNA- Äquivalenz) sondiert wurden. Die Positionen der ribosomalen 28S- und 18S-RNAs sind angezeigt. Die in jeder Bahn vorhandene mRNA wurde aus den nachstehend beschriebenen Zellen extrahiert: Bahn 1, mit tgCMV/hygro transfizierte Rat-2-Zellen, Bahn 2, mit tgCMV/TK transfizierte Rat-2-Zellen, Bahn 3, mit tgCMV/HyTK transfizierte und auf Hmr selektierte Rat-2-Zellen, Bahn 4, mit tgCMV/HyTK transfizierte und auf HATr selektierte Rat-2-Zellen, Bahn 5, mit tgCMV/hygro transfizierte NIH/3T3-Zellen, und Bahn 6, mit tgCMV/HyTK transfizierte NIH/3T3-Zellen.
Figur 6 zeigt Aufnahmen von gefärbten Kolonien von nicht-infizierten NIH/3T3-Zellen (Platten a, b und c) und von mit tgLS(+)HyTK (Platten d und e) oder tgLS(-)CMV/HyTK (Platten f und g)-Retroviren infizierten NIH/3T3-Zellen. Die Zellen wurden im Medium allein oder in einem mit GCV, Hm oder Hm plus GCV supplementiertem Medium in einem Langzeit-Proliferationstest gezüchtet. Die Daten zeigen, daß nicht-infizierte NIH/3T3-Zellen gegen GCV resistent waren und bis zur Konfluenz wuchsen (Platte b), jedoch durch Hm getötet wurden (Platte c). Das Wachstum von NIH/3T3-Zellen, die mit den tgLS(+)HyTK- und tgLS(-)CMV/HyTK-Retroviren infiziert und in Gegenwart von Hm gezüchtet wurden (Platten d und f), wurde durch GCV gehemmt (Platten e und g).

Genaue Beschreibung der Erfindung

SEQ ID No: 1 und SEQ ID No: 2 (sind unmittelbar vor den Ansprüchen dargestellt) zeigen spezifische Ausführungsformen der Nucleotidsequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen HyTK-Selektionsfusionsgens. Das in dem Sequenzprotokoll dargestellte HyTK-Selektionsfüsionsgen umfaßt Sequenzen des hph-Gens (Nucleotide 1 bis 971), das mit Sequenzen des HSV-I TK-Gens (Nucleotide 972 bis 2076) verknüpft ist.

Definitionen

Wie hier verwendet, meint der Begriff "Selektionsfusionsgen" eine Nucleotidsequenz, die ein dominant-positives Selektionsgen umfaßt, das mit einem negativen Selektionsgen im Leserahmen füsioniert ist und das ein einziges bifunktionelles Fusionsprotein codiert, das auf einem zellulären Wirt einen dominant-positiven und einem negativen Selektionsphänotyp übertragen kann. Ein "dominant-positives Selektionsgen" meint eine Nucleotidsequenz, die ein Protein codiert, das auf einem zellulären Wirt einen dominant-positiven Selektionsphänotyp überträgt und nachstehend noch genauer beschrieben und erläutert wird. Ein "negatives Selektionsgen" meint eine Nucleotidsequenz, die ein Protein codiert, das auf einem zellulären Wirt einen negativen Selektionsphänotyp überträgt und nachstehend noch genauer beschrieben und erläutert wird. Ein "Selektionsgen" meint allgemein dominant-positive und negative Selektionsgene.
Ein Selektionsgen ist "im Leserahmen fusioniert mit" einem anderen Selektionsgen, wenn die Expressionsprodukte der Selektionsgene (d.h. die von den Selektionsgenen codierten Proteine) durch eine Peptidbindung fusioniert sind und mindestens einen Teil der biologischen Aktivität von jedem der beiden Proteine behalten haben. In bezug auf das hier beschriebene HyTK-Selektionsfusionsgen ist beispielsweise das hph-Gen (das die Hygromycin-B-Phosphotransferase, die den dominant-positiven Hygromycin-Resistenz (Hmr)-Selektionsphänotyp überträgt, codiert) im Leserahmen füsioniert mit dem HSV-I TK-Gen (das die Herpes simplex-Virus-Typ I-Thymidinkinase, die einen negativen Selektionsphänotyp der Ganciclovir-Sensitivität oder (GCVs) überträgt, codiert), wenn die hph- und HSV-I TK-Proteine durch eine Peptidbindung fusioniert sind und als einzelnes bifunktionelles Fusionsprotein exprimiert werden. Die erfindungsgemaßen Komponenten-Selektionsgensequenzen sind vorzugsweise benachbart; es können jedoch Selektionsfusionsgene konstruiert werden, in denen die Komponenten- Selektionsgensequenzen durch interne nicht-translatierte Nucleotidsequenzen wie Introns getrennt sind. Für die erfindungsgemäßen Ziele sollten diese nicht-benachbarten Selektionsgensequenzen fusioniert werden, sofern durch Expression des Selektionsfusionsgens ein einzelnes bifunktionelles Fusionsprotein erhalten wird, in dem die Expressionsprodukte der Komponenten-Selektionsgensequenzen durch eine Peptidbindung fusioniert sind.
Der Begriff "Nucleotidsequenz" meint ein Heteropolymer aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden wie eine DNA- oder RNA-Sequenz. Nucleotidsequenzen können als ein separates Fragment oder ein Bestandteil eines größeren Konstrukts vorliegen. Die Nucleotidsequenzen sind vorzugsweise in einer Menge oder Konzentration vorhanden, die eine Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Sequenz durch biochemische Standardverfahren, beispielsweise unter Verwendung eines Clonierungsvektors, ermöglicht. Die rekombinanten Nucleotidsequenzen sind das Produkt von verschiedenen Kombinationen von Clonierungs-, Restriktions- und Ligierungsschritten, die zu einem Konstrukt mit einer strukturellen codierenden Sequenz führen, die von in natürlichen Systemen gefundenen homologen Sequenzen unterscheidbar ist. Allgemein können Nucleotidsequenzen, die die strukturelle codierende Sequenz, beispielsweise die erfindungsgemäßen Selektionsfusionsgene, codieren, aus Nucleotidfragmenten und kurzen Oligonucleotidlinkern oder aus einer Reihe von Oligonucleotiden zusammengesetzt werden, wobei ein synthetisches Gen erhalten wird, das in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert werden kann. Diese Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt, der nicht durch in eukaryontischen Genen üblicherweise vorhandene, interne, nicht-translatierte Sequenzen oder Introns unterbrochen ist. Die die relevanten Selektionsgensequenzen enthaltende genomische DNA wird vorzugsweise verwendet, um geeignete Selektionsgene codierende Nucleotidsequenzen zu erhalten; cDNA-Fragmente können ebenfalls verwendet werden. Die Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5'- oder 3'-seitig vom offenen Leserahmen oder innerhalb des offenen Leserahmens liegen, sofern diese Sequenzen die Manipulation oder Expression der codierenden Bereiche nicht behindern. Einige Gene können jedoch Introns einschließen, die zur korrekten Expression in bestimmten Wirten erforderlich sind, beispielsweise schließt das HPRT- Selektionsgen Introns ein, die zur Expression in embryonalen Stamm (ES)-Zellen erforderlich sind. Wie vorstehend beschrieben, können die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen auch RNA-Sequenzen umfassen, beispielsweise wenn die Nucleotidsequenzen zur Infektion eines zellulären Wirts als RNA in ein Retrovirus verpackt werden. Die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren wird nachstehend genauer erläutert.
Der Begriff "rekombinanter Expressionsvektor" meint eine replizierbare Einheit von DNA oder RNA in einer durch Transfektion oder virale Infektion in eine Zielzelle transduzierbaren Form, die die Expression eines Selektionsfusionsgens codiert, das in mRNA transkribiert und unter der Kontrolle eines genetischen Elements oder von genetischen Elementen, das oder die an der Regulation der Genexpression beteiligt ist oder sind, beispielsweise Transkriptions- und Translationsinitiations- und -terminationssequenzen, in das Protein translatiert wird. Die erfindungsgemaßen rekombinanten Expressionsvektoren können DNA-Konstrukte sein, die in bakteriellen Zellen repliziert und direkt, beispielsweise durch Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation oder andere physikalische Transferverfahren, in Zielzellen transfiziert werden. Die rekombinanten Expressionsvektoren in Form von RNA-Konstrukten können beispielsweise infektiöse Retroviren sein, die in geeignete "Verpackungs"-Zellinien verpackt werden, die zuvor mit einem proviralen DNA-Vektor transfiziert wurden und ein ein RNA- Transktipt der proviralen DNA enthaltendes Retrovirus produzieren. Eine Wirtszelle wird mit dem Retrovirus infiziert und die retrovirale RNA durch reverse Transkription in ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt repliziert, das als Provirus stabil in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert wird. Die Provirus-DNA wird anschließend in der Wirtszelle exprimiert, wobei von der DNA codierte Polypeptide produziert werden. Die erfindungsgemaßen rekombinanten Expressionsvektoren schließen daher nicht nur im infektiösen Retrovirus vorhandene RNA-Konstrukte ein, sondern Kopien von proviraler DNA, die reverse DNA-Transkripte eines Retrovirus-RNA-Genoms einschließen und die stabil in die chromosomale DNA einer geeigneten Wirtszelle integriert sind, oder donierte Kopien davon oder donierte Kopien von nicht-integrierten Zwischenformen von retroviraler DNA. Provirale DNA schließt transkriptionale Elemente in unabhängiger fünktioneller Verbindung mit bestimmten struturellen DNA- Sequenzen ein, die bei der Expression proviraler Sequenzen in infizierten Wirtszellen in mRNA transkribiert und in das Protein translatiert werden. Zur direkten Transfektion verwendete rekombinante Expressionsvektoren schließen DNA-Sequenzen ein, die eine Replikation des Vektors in bakteriellen Wirtszellen ermöglichen. Verschiedene rekombinante Expressionsvektoren, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, werden nachstehend beschrieben.
"Transduzieren" meint die Einführung eines ein Selektionsfüsionsgen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektors in eine Zelle. Die Transduktionsverfahren können physikalischer Natur sein (d.h. Transfektion) oder sie können auf der Verwendung von rekombinante virale Vektoren wie Retroviren codierender DNA beruhen, die in RNA transkribiert, in infektiöse virale Partikel verpackt und zur Infektion von Zielzellen verwendet werden kann, um so das gewünschte genetische Material zu übertragen (d.h. Infektion). Viele unterschiedliche Arten von Säugergen- Transfervektoren und rekombinanten Expressionsvektoren wurden entwickelt (vgl. z. B. Miller und Calos, Hrsg., "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", Current Comm. Mol. Biol. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987)). Nackte DNA kann in Säugerzellen durch Transfektion physikalisch eingeführt werden, wobei eines einer Vielzahl von Verfahren, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Calciumphosphattransfektion (Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81 (1984), 7176), DEAE-Dextran-Transfektion (McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41(1986), 351, Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11(1983), 1295), Protoplastentusion (Deans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81 (1984), 1292), Elektroporation (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81 (1984), 7161), Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413), Polybrene-Transfektion (Kawai und Nishzawa, Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1172) und des direkten Gentransfers durch Lasermikropunktur von Zellmembranen (Tao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 84 (1987), 4180), verwendet werden kann. Verschiedene Infektionsverfahren, die rekombinante infektiöse Viruspartikel zur Genübertragung verwenden, wurden entwickelt. Dies ist eine bevorzugte Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung. Beispiele für so verwendete virale Vektoren sind Virusvektoren, die vom Simianvirus 40 (SV40; Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 82 (1985), 158), von Adenoviren (Karlsson et al., EMBO J. 5 (1986), 2377), vom Adeno-assoziierten Virus (Laface et al., Virology 162 (1988), 483) und von Retroviren (Coffin, 1985, S. 17-71, in Weiss et al. (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Ausg., Bd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) abstammen. Es gibt also zahlreiche Gentransfer- und Expressionsverfahren, sie bewirken jedoch im wesentlichen nur die Einführung und Expression von genetischem Material in Säugerzellen. Mehrere der vorstehend beschriebenen Verfahren wurden zur Transduktion von hämatopoetischen oder lymphoiden Zellen verwendet, beispielsweise die Calciumphosphattransfektion (Berman et al., a.a.O., 1984), Protoplastenfusion (Deans et al., a.a.O., 1984), Elektroporation (Cann et al., Oncogene 3 (1988), 123) und Infektion mit rekombinanten Adenovirusvektoren (Karlsson et al., a.a.O., und Ruether et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 123), Adeno-assoziierten Virusvektoren (Laface et al., a.a.O.) und Retrovirusvektoren (Overell et al., Oncogene 4 (1989), 1425). Primäre T-Lymphocyten wurden durch Elektroporation (Cann et al., a.a.O., 1988) und retrovirale Infektion (Nishihara et al., Cancer Res. 48 (1988), 4730, und Kasid et al., a.a.O., 1990) erfolgreich transduziert.

Konstruktion von Selektionsfüsionsgenen

Die erfindungsgemaßen Selektionsfüsionsgene umfassen ein dominant-positives, mit einem negativen Selektionsgen fusioniertes Selektionsgen. Allgemein umfaßt ein Selektionsgen beispielsweise ein Gen, das ein Protein codiert, das einen Antibiotika- Resistenzphänotyp übertragen, einen autotrophen Bedarf (für eine dominant-positive Selektion) ergänzen oder ein toxisches Stoffwechselprodukt (für die negative Selektion) aktivieren kann. Eine ein bifünktionelles Fusionsprotein codierende DNA-Sequenz wird unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfallren konstruiert, um getrennte DNA- Fragmente, die ein dominant-positives Selektionsgen und ein negatives Selektionsgen codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor zusammenzusetzen. Das 3'-Ende eines Selektionsgens wird mit dem 5'-Ende des anderen Selektionsgens ligiert, wobei die Leserahmen der Sequenzen zueinander im richtigen Raster erhalten bleiben, so daß die mRNA-Sequenzen in ein einziges biologisch aktives bifunktionelles Fusionsprotein translatiert werden können. Das Selektionsfusionsgen wird unter der Kontrolle eines einzigen Promotors exprimiert.
Das dominant-positive Selektionsgen ist jegliches Gen, das nach der Transduktion in eine Wirtszelle einen dominanten Phänotyp exprimiert, der eine positive Selektion von stabilen Transduktanten erlaubt. Die Selektion von stabilen Transduktanten kann beispielsweise durchgeführt werden, indem das den Selektionsphänotyp einer Hygromycin-Resistenz (Hmr) übertragende Hygromycin-B- Phosphotransferasegen (hph) (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147, und Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 410, vom Plasmid pHEBo1 erhältlich, unter der ATCC- Hinterlegungsnr. 39820) verwendet wird. Hygromycin B ist ein Aminoglycosid- Antibiotikum, das die Proteinsynthese durch Unterbrechung der Translokation und Förderung der Fehltranslation hemmt. Das hph-Gen überträgt Hmr an mit dem hph-Gen transduzierte Zellen durch Phosphorylierung und Detoxifizierung des Antibiotikums Hygromycin B. Weitere Beispiele für akzeptable dominant-positive Selektionsgene sind das Aminoglycosidphosphotransferasegen (neo oder aph) von Tn5, das die G418- Antibiotikaresistenz codiert (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150(198), 1, und Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327), das Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferasegen (gpt) von E. coli, das die Mycophenolsäureresistenz codiert (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072), das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen aus Mauszellen oder E. coli, das für die Biosynthese von Purinen erforderlich ist und durch den Wirkstoff Methotrexat (MTX) kompetitiv gehemmt werden kann, zur Selektion auf Zellen, die erhöhte Mengen an DHFR konstitutiv exprimieren (Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2495), Simonsen et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 2235), das S. typhimurium-Histidinoldehydrogenase (hisD)-Gen (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047), das Gen für die Tryptophan-Synthase-β-Untereinheit (trpB) von E. coli (Hartman et al., a.a.O.), das Puromycin-N-Acetyltransferase (pac)-Gen (Vara et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 4117), das Adenosindesaminase (ADA)-Gen (Daddona et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 12101), das Multi-Wirkstoffresistenz (MDR)-Gen (Kane et al., Gene 84 (1989), 439), das Maus-Ornithindecarboxylase (OCD)-Gen (Gupba und Coffino, J. Biol. Chem. 260 (1985), 2941), das Gen der katalytischen Untereinheit der Aspartattranscarbamylase von E. coli (pyrB) (Ruiz und Wahl, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 3050) und das E. coli-asnA-Gen, das die Asparaginsynthetase codiert (Cartier et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 1623).
Das negative Selektionsgen ist jegliches Gen, das nach der Transduktion in eine Wirtszelle einen Phänotyp exprimiert, der eine negative Selektion (d.h. Eliminierung) von stabilen Transduktanten erlaubt. In bevorzugten Ausführungsformen ist das in den erfindungsgemäßen Fusionsgenen verwendete negative Selektionsgen das Herpes simplex-Virus Typ I-Thymidinkinase (HSV-I TK)-Gen (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223, McKnight et al., Nucl. Acids Res. 8 (1980), 5931, Preston et al., J. Virol. 38 (1981), 593, und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1441), das eine Ganciclovir-Sensitivität (GCVs) überträgt (St. Clair et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31 (1987), 844). Das HSV-I TK-Gen ist von den Bethesda Research Labs erhältlich (Katalognr. BRL 5365 SA). Eine negative Selektion kann beispielsweise auch unter Verwendung des zellulären Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Gens (Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 477, Fenwick, "The HGPRT System", S. 333-373, M. Gottesman (Hrsg.), Molecular Cell Genetics, (John Wiley and Sons, New York, 1985), des zellulären Adeninphosphoribosyltransferase (APRT)-Gens (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 1373, Taylor et al., "The APRT System", S. 311-332, M. Gottesman (Hrsg.), Molecular Cell Genetics, (John Wiley and Sons, New York, 1985)) und des E. coli-gpt-Gens (Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 4139) durchgeführt werden.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes können die die gleiche Aminosäuresequenz codierenden Nucleotidsequenzen beträchtlich variieren; Beispiele für DNA-Ausführungsformen entsprechen den im Sequenzprotokoll No: 1 dargestellten Nucleotidsequenzen. Diese Varianten haben modifizierte DNA- oder Aminosäuresequenzen mit einer oder mehreren Substitutionen, Deletionen oder Additionen, deren Nettoeffekt die Beibehaltung der biologischen Aktivität ist, und können gegen die hier beschriebenen spezifischen Sequenzen ausgetauscht werden. Die Sequenzen von hph und TK umfassenden Selektionsfusionsgenen sind äquivalent, wenn sie die gesamte oder einen Teil der Sequenzen von hph und HSV-I TK enthalten, mit der Nucleotidsequenz des Sequenzprotokolls. No: 1 unter maßig stringenten Bedingungen (50ºC, 2 x SSC) hybridisieren und ein biologisch aktives Fusionsprotein expritnieren können. Ein "biologisch aktives" Fusionsprotein teilt eine ausreichende Aminosäuresequenzähnlichkeit mit den hier beschriebenen spezifischen erfindungsgemaßen Ausführungsformen, um die Selektionsphänotypen der Komponenten-Selektionsgene übertragen zu können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Sequenzen vom bakteriellen Hygromycinphosphotransferase (hph)-Gen mit Sequenzen vom HSV-I TK-Gen füsioniert. Das erhaltene Selektionsfusionsgen (als HyTK-Selektionsfusionsgen bezeichnet) codiert ein bifunktionelles Fusionsprotein, das Hmr und GCVs überträgt, und liefert ein Verfahren, durch das dominant-positive und negative Selektionsphänotypen als eine einzige genetische Einheit exprimiert und reguliert werden können. Das HyTK- Selektionsfüsionsgen ist daher eine nützliche Erweiterung des vorhandenen Spektrums von zur Verwendung in Tierzellen verfügbaren Selektionsgenen, da es sowohl eine dominant-positive als auch eine negative Selektion in Wildtypzellen ermöglicht.

Rekombinante Expressionsvektoren

Die erfindungsgemaßen Selektionsfusionsgene werden zur Identifizierung, Isolierung oder Eliminierung von Wirtszellen, in die Selektionsfüsionsgene eingeführt werden, verwendet. Die Selektionsfusionsgene werden in die Wirtszelle eingeführt, indem ein das Selektionsfüsionsgen enthaltender rekombinanter Expressionsvektor in die Wirtszelle transduziert wird. Diese Wirtszellen schließen Zelltypen von höherem eukaryontischem Ursprung wie Säuger- oder Insektenzellen oder Zelltypen von niederem prokaryontischem Ursprung wie bakterielle Zellen, beispielsweise E. coli, ein.
Wie vorstehend beschrieben, werden diese Selektionsfusionsgene vorzugsweise als Bestandteil eines rekombinanten Expressionsvektors, der das Selektionsfusionsgen in der Zelle exprimieren und einen Selektionsphänotyp übertragen kann, in eine bestimmte Zelle eingeführt. Diese rekombinanten Expressionsvektoren schließen allgemein synthetische oder natürliche Nucleotidsequenzen ein, die das Selektionsfusionsgen umfassen, das mit geeigneten transkriptionalen oder transiationalen Kontrolisequenzen verknüpft ist, beispielsweise mit einem Replikationsursprung, optionalen Operatorsequenzen zur Kontrolle der Transkription, einem geeigneten Promotor und Enhancer, die mit dem zu exprimierenden Gen verknüpft sind, und weiteren 5na oder 3'-flankierenden nicht-transkribierten Sequenzen und 5'- oder 3'-flankierende nicht-translatierten Sequenzen wie erforderliche Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleis -Donor- und Akzeptorstellen und transkriptionale Terminationssequenzen. Diese regulatorischen Sequenzen können von Säuger-, viralen, mikrobiellen oder Insektengenen stammen. Die Nucleotidsequenzen sind funktionell verknüpft, wenn es einen funktionellen Zusammenhang zwischen ihnen gibt. Beispielsweise ist ein Promotor mit einem Selektionsfusionsgen funktionell verbunden, wenn er die Transkription des Selektionsfusionsgens kontrolliert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einem Selektionsfusionsgen funktionell verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation des Selektionsfusionsgens in ein einziges bifunktionelles Fusionsprotein ermöglicht. Allgemein meint "funktionell verbunden" benachbart.
Spezifische rekombinante Expressionsvektoren zur Verwendung bei zellulären Säuger-, Bakterien- und Hefe-Wirten werden von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Eine genaue Beschreibung von rekombinanten Expressionsvektoren zur Verwendung in Tierzellen kann bei Rigby, J. Gen. Virol. 64 (1983), 255, Elder et al., Ann. Rev. Genet. 15 (1981), 295, und Subramani et al., Anal. Biochem. 135 (1983), 1, gefunden werden. Geeignete rekombinante Expressionsvektoren können auch virale Vektoren, insbesondere Retroviren (nachstehend genauer erläutert), einschließen.
Die erfindungsgemaßen Selektionsfusionsgene werden vorzugsweise der transkriptionalen Kontrolle einer starken Enhancer- und Promotor-Expressions-Kassette unterstellt. Beispiele für diese Expressions-Kassetten sind der menschliche sehr frühe (HCMV-IE)-Promotor des Cytomegalovirus (Boshart et al., Cell 41(1985), 521), β- Actin-Promotor (Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5831), Histon H4-Promotor (Guild et al., J. Virol. 62 (1988), 3795), Maus-Metallothionein-Promotor (McIvor et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 838), Ratten-Wachstumshormon-Promotor (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 431), Promotor der menschlichen Adenosindesaminase (Hantzapoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989), 3519), HSV tk-Promotor (Tabin et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 426), α-1- Antitrypsin-Enhancer (Peng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8146), Immunglobulin-Enhancer/Promotor (Blankenstein et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 10939), die frühen oder späten Promotoren von SV40, der späte Hauptpromotor von Adenovirus 2 oder andere virale Promotoren, die vom Polyomavirus, Rinder- Papillomavirus oder von anderen Retroviren oder Adenoviren stannnen. Die Promotorund Enhancer-Elemente der Immunglobulin (Ig)-Gene übertragen eine deutliche Spezifität an B-Lymphocyten (Banerji et al., Cell 33 (1983), 729, Gillies et al., Cell 33 (1983), 717, und Mason et al., Cell 41 (1985), 479), während die die Transkription des β-Globin-Gens kontrollierenden Elemente nur in erythroiden Zellen funktionieren (van Assendelft et al., Cell 56 (1989), 969). Unter Verwendung von gut bekannten Restriktions- und Ligierungsverfahren können geeignete transkriptionale Kontrollsequenzen aus verschiedenen DNA-Quellen ausgeschnitten und in einem funktionellen Zusammenhang mit den erfindungsgemaß exprimierten intakten Selektionsfusionsgenen integriert werden. So können viele transkriptionale Kontrollsequenzen erfolgreich in retrovirale Vektoren zur Steuerung der Expression von insertierten Genen in infizierten Zellen verwendet werden.

Retroviren

Retroviren können zur hoch-effizienten Transduktion der erfindungsgemäßen Selektionsfusionsgene in eukaryontische Zellen verwendet werden und werden für die Freisetzung eines Selektionsfusionsgens in Primärzellen bevorzugt. Ferner erfolgt die retrovirale Integration in einer kontrollierten Weise und führt zu einer stabilen Integration einer oder mehrerer Kopien der neuen genetischen Information pro Zelle.
Retroviren sind eine Klasse von Viren, deren Genom aus RNA besteht. Die genomische RNA eines Retrovirus enthält trans-wirkende Gensequenzen, die drei virale Proteine eodieren: ein Strukturprotein gag, das mit der RNA im Kern des Viruspartikels assoziiert ist; die das DNA-Komplement erzeugende reverse Transkriptase pol; und ein Hüllglyeoprotein env, das in der Lipoproteinhülle der Partikel vorkommt und bei der Infektion das Virus an die Oberfläche der Wirtszellen bindet. Die Replikation des Retrovirus wird durch eis-wirkende Elemente reguliert, wie dem Promotor zur Transkription der proviralen DNA und anderen Nucleotidsequenzen, die zur viralen Replikation erforderlich sind. Diese eis-wirkenden Elemente liegen in oder sind benachbart zu zwei identischen nicht translatierten langen terminalen Wiederholungen (LTRs) von etwa 600 Basenpaaren, die an den 5'- und 3'-Enden des retroviralen Genoms vorhanden sind. Retroviren replizieren durch Kopieren ihres RNA-Genoms durch reverse Transkription in ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt unter Verwendung einer Virus-codierten, RNA-gerichteten DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase. Das DNA-Zwischenprodukt wird in die chromosomale DNA einer Vogel- oder Säuger- Wirtszelle integriert. Die integrierte retrovirale DNA wird als Provirus bezeichnet. Das Provirus dient als Matrize zur Synthese von RNA-Ketten zur Bildung von infektiösen Viruspartikeln. Die Vorwärts-Transkription des Provirus und der Zusammenbau zu infektiösen Viruspartikeln erfolgt in Gegenwart eines geeigneten Helfervirus mit für die virale Replikation erforderlichen endogenen trans-wirkenden Genen.
Retroviren werden durch Austausch eines oder mehrerer der endogenen transwirkenden Gene einer proviralen Form des Retrovirus gegen ein rekombinantes therapeutisches Gen oder im Fall der vorliegenden Erfindung gegen ein Selektionsfusionsgen und durch anschließende Transduktion des rekombinanten Provirus in eine Zelle als Vektoren verwendet. Die trans-wirkenden Gene schließen die gag-, pol- und env-Gene ein, die Proteine des viralen Kerns, das Enzym reverse Transkriptase bzw. Bestandteile des Hüllproteins codieren, die alle zur Produktion von intakten Virionen erforderlich sind. Rekombinante Retroviren, die für die trans-wirkenden gag-, pol- oder env-Gene defizient sind, können keine essentiellen Proteine zur Replikation synthetisieren und sind daher Replikationsdefekt. Diese replikationsdefekten rekombinanten Retroviren werden unter Verwendung von Verpackungszellinien vermehrt. Diese Verpackungszellinien enthalten integrierte retrovirale Genome, die trans-wirkende Gensequenzen liefern, die zur Produktion von intakten Virionen erforderlich sind. Die in diese Verpackungszellinien transduzierten proviralen DNA-Sequenzen werden in RNA transkribiert und in infektiöse Virionen eingekapselt, die das Selektionsfusionsgen (und/oder therapeutische Gen) enthalten, die jedoch aufgrund des Fehlens der trans-wirkenden Genprodukte gag, pol und env die erforderlichen gag-, pol- und env-Proteine zur Einkapselung der RNA in Partikel zur Infektion anderer Zellen nicht synthetisieren können. Die erhaltenen infektiösen Retrovirusvektoren können daher andere Zellen infizieren und ein Selektionsfusionsgen in die zelluläre DNA einer Wirtszelle integrieren, sie können jedoch nicht replizieren. Mann et al. (Cell 33 (1983), 153) beschreiben beispielsweise die Entwicklung von verschiedenen Verpackungszellinien (z. B.ψ2), die zur Produktion von Helfervirus-freien Vorräten an rekombinantem Retrovirus verwendet werden können. Die Einkapselung in einer Zellinie, die eine ekotrope virale Hülle codierende (z. B.ψ2) trans-wirkende Elemente enthält, liefert ekotrope (begrenztes Wirtsspektrum) Virusnachkommen. Alternativ liefert der Zusammenbau in einer amphotrope Verpackungsgene enthaltenden Zellinie (z.B. PA317, ATCC CRL 9078; Miller und Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 2895) amphotrope (breites Wirtsspektrum) Virusnachkommen.
Zahlreiche Proviruskonstrukte wurden erfolgreich zur Expression von Fremdgenen verwendet (vgl. z. B. Coffin, in Weiss et al. (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Ausg., Bd. 2 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1985, S. 17- 71)). Die meisten proviralen Elemente stammen von murinen Retroviren. Zur erfindungsgemaßen Verwendung adaptierbare Retroviren können jedoch von jeglicher Vogel- oder Säugerzellquelle stammen. Geeignete Retroviren müssen Zellen infizieren können, die die Empfanger des neuen genetischen Materials sein sollen, das unter Verwendung des retroviralen Vektors transduziert werden soll. Beispiele für geeignete Retroviren sind Vogel-Retroviren wie das Vogel-Erythroblastosevirus (AEV), Vogel-Leukosevirus (ALV), Vogel-Myeloblastosevirus (AMV), Vogel-Sarkomvirus (ASV), Fujinami- Sarkomvirus (FuSV), Milz-Nekrosevirus (SNV) und Rous-Sarkomvirus (RSV); Rinder- Leukämievirus (BLV); Katzen-Retroviren wie das Katzen-Leukämievirus (FeLV) oder das Katzen-Sarkomvirus (FeSV); murine Retroviren wie das Mäuse-Leukämievirus (MuLV); Maus-Brusttumorvirus (MMTV) und das Mäuse-Sarkomvirus (MSV), und Primaten-Retroviren wie die menschlichen lymphotropen T-Zell-Viren 1 und 2 (HTLV- 1 und -2) und das Affen-Sarkomvirus (SSV). Viele andere geeignete Retroviren sind dem Fachmann bekannt. Eine Taxonomie von Retroviren wird von Teich, in Weiss et al. (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Ausg., Bd. 2 (1985), 1-160 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) geliefert. Bevorzugte Retroviren zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind die murinen Retroviren, die als Moloney-Maus-Leukämievirus (MoMLV), Moloney-Maus-Sarkomvirus (MoMSV), Harvey-Maus-Sarkomvirus (HaMSV) und Kirsten-Maus-Sarkomvirus (KiSV) bezeichnet werden. Die zur Konstruktion eines retroviralen Vektors aus dem MoMSV-Genom erforderlichen Sequenzen können zusammen mit einer pBR322-Plasmidsequenz wie pMV (ATCC 37190) erhaken werden, während ein Zellinienproduzent von KiSV in K-BALB- Zellen bei der ATCC CCL 163.3 hinterlegt wurde. Eine Hinterlegung von pRSVneo, das von pBR322 stammt, einschließlich des RSV LTR und eines intakten Neomycin- Wirkstoffresistenzmarkers sind von der ATCC unter der Hinterlegungsnr. 37198 erhältlich. Das das SNV-Genom umfassende Plasmid pPB101 ist als ATCC 45012 erhältlich. Die viralen Genome der vorstehend beschriebenen Retroviren werden zur Konstruktion von replikationsdefekten Retrovirusvektoren verwendet, die ihre viralen Genome in die chromosomale DNA einer infizierten Wirtszelle integrieren können, die jedoch nach ihrer Integration nicht replizieren können, um ein infektiöses Virus zu liefern, sofern die Zelle, in die sie eingeführt werden, keine anderen proviralen Elemente enthält, die funktionelle aktive trans-wirkende virale Proteine codieren.
Die durch Retroviren transduzierten erfindungsgemaßen Selektionsfusionsgene werden exprimiert, indem das Selektionsfusionsgen unter die transkriptionale Kontrolle des in die retrovirale LTR eingeschlossenen Enhancers und Promotors oder unter die Kontrolle von zwischen die LTR insertierten heterologen transkriptionalen Kontrolisequenzen plaziert wird. Die Verwendung sowohl von heterologen transkriptionalen Kontrolisequenzen als auch von transkriptionalen LTR-Kontrollsequenzen ermöglicht die gemeinsame Expression eines therapeutischen Gens und eines Selektionsfusionsgens im Vektor, wodurch die Selektion von Zellen möglich ist, die bestimmte, das gewünschte therapeutische Genprodukt codierende Vektorsequenzen expriinieren. Zum Erhalt einer hohen Expressionsrate ist die Plazierung des therapeutischen Gens und/oder Selektionsfusionsgens im Retrovirus unter die transkriptionale Kontrolle einer starken heterologen Enhancer- und Promotorexpressionskassette erforderlich. Viele verschiedene heterologe Enhancer und Promotoren wurden zur Expression von Genen in retroviralen Vektoren verwendet. Diese Enhancer oder Promotoren können von viralen oder zellulären Quellen, einschließlich Säugergenomen, stannnen und sind vorzugsweise konstitutiver Natur. Diese heterologen transkriptionalen Kontrollsequenzen werden vorstehend in bezug auf rekombinante Expressionsvektoren beschrieben. Zur Expression in der transduzierten Zelle werden DNA-Sequenzen, die durch eines der vorstehend beschriebenen Gentransferverfahren eingeführt wurden, üblicherweise unter der Kontrolle eines RNA-Polymerase II-Promotors exprimiert.
Besonders bevorzugte rekombinante Expressionsvektoren zur Verwendung in Retroviren schließen die von Miller und Rosman, Biotechniques 7 (1989), 980, beschriebenen Vektoren pLXSN, pLNCX und pLNL6 und Derivate davon ein. Diese Vektoren können heterologe DNA unter der transkriptionalen Kontrolle des retroviralen LTR- oder CMV-Promotors und das neo-Gen unter der Kontrolle des Promotors der frühen Region von SV40 oder des retroviralen LTR-Promotors expriinieren. Zur erfindungsgemäßen Verwendung wird das neo-Gen durch hier beschriebene bifunktionelle Selektionsfusionsgene wie dem HyTK-Selektionsfusionsgen ersetzt. Die Konstruktion von nützlichen replikationsdefekten Retroviren ist eine Routine-Angelegenheit. Die erhaltenen rekombinanten Retroviren können in die chromosomale DNA einer infizierten Wirtszelle integrieren, nach der Integration jedoch nicht unter Lieferung des infektiösen Virus replizieren, sofern die Zelle, in die sie eingeführt wurden, keine andere provirale Insertion enthält, die funktionell aktive trans-wirkende virale Proteine codiert.

Verwendung von bifunktionellen Selektionsfusionsgenen

Die erfindungsgemaßen Selektionsfusionsgene werden besonders zur Verwendung in der Gentherapie als Mittel zur Identifizierung, Isolierung oder Eliminierung von Zellen wie somatischen Zellen, in die die Selektionsfusionsgene eingeführt werden, bevorzugt. In der Gentherapie werden somatische Zellen aus einem Patienten entfernt, mit einem ein therapeutisches Gen und das erfindungsgemäße Selektionsfusionsgen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektor transduziert und anschließend in den Patienten zurückgeführt. Somatische Zellen, die als Vehikel zur Gentherapie verwendet werden können, sind hämatopoetische (vom Knochenmark statmende) Zellen, Keratinocyten, Hepatocyten, Endothelzellen und Fibroblasten (Friedman, Science 244 (1989), 1275). Alternativ kann die Gentherapie unter Verwendung von injizierbaren, somatische Zellen in vivo transduzierenden Vektoren erreicht werden. Die Durchführbarkeit des Gentransfers in Menschen wurde gezeigt (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473, und Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323 (1990), 570).
Die erfindungsgemaßen Selektionsfusionsgene sind zur Eliminierung von genetisch modifizierten Zellen in vivo besonders nützlich. Die In vivo-Eliminierung von einen negativen Selektionsphänotyp exprimierenden Zellen ist in der Gentherapie als Mittel zur Beseitigung eines Zelltransplantats besonders nützlich, wobei sie ein Mittel zur Umkehrung des Gentherapieverfahrens bereitstellt. Es wurde beispielsweise gezeigt, daß die Verabreichung des Anti-Herpesvirus-Wirkstoffs Ganciclovir an transgene Tiere, die das HSV-I TK-Gen von einem Immunglobulinpromotor aus exprimieren, zu einer selektiven Beseitigung von das HSV-I TK-Gen exprimierenden Zellen führt (Heyman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 2698). Unter Verwendung der gleichen transgenen Mäuse wurde auch gezeigt, daß GCV die vollständige Regression von Abelson-Leukämievirus-induzierten Lymphomen induziert (Moolten et al., Human Gene Therapy 1 (1990), 125). In einer dritten Untersuchung, in der ein Maussarkom (K3T3) mit einem HSV-I TK exprimierenden Retrovirus infiziert und in syngene Mäuse transplantiert wurde, waren die durch die Sarkomzellen induzierten Tumore nach einer Behandlung mit GCV vollständig eliminiert (Moolten und Wells, J. Natl. Cancer Inst. 82 (1990), 297).
Die erfindungsgemaßen bifunktionellen Selektionsfusionsgene können auch zur Erleichterung der Genmodifikation durch homologe Rekombination verwendet werden. Reid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 4299, beschrieben kürzlich ein Zwei-Schritt-Verfahren zur Genmodifikation durch homologe Rekombination in ES- Zellen (homologe "in-out"-Rekombination) unter Verwendung des HPRT-Gens. Kurz gesagt umfaßt dieses Verfahren zwei Schritte: einen "in"-Schritt, in dem das HPRT-Gen in Zielgensequenzen eingebettet und in HPRT&supmin;-Wirtszellen transfiziert wird und homologe Rekombinante, die das HPRT-Gen in dem Ziellocus eingebaut haben, durch ihr Wachstum in HAT-Medium und durch genomische Analyse unter Verwendung der PCR identifiziert werden. In einem zweiten "out"-Schritt wird ein Konstrukt, das die gewunschten Ersatzsequenzen enthält, die in den Zielgensequenzen (jedoch ohne das HPRT-Gen) eingebettet sind, in die Zellen transfiziert und homologe Rekombinante mit den Ersatzsequenzen (jedoch nicht dem HPRT-Gen) werden durch negative Selektion auf HPRT&spplus;-Zellen isoliert. Obwohl dieses Verfahren die Einführung von unfaßbaren (subtle) Mutationen in ein Zielgen ohne Einfuhrung von Selektionsgensequenzen in das Zielgen ermöglicht, ist eine positive Selektion von Transformanten in einer HPRT&supmin;- Zellinie erforderlich, da das HPRT-Gen für eine positive Selektion rezessiv ist. Aufgrund der ineffizienten Expression des HPRT-Gens in ES-Zellen ist ferner die Verwendung eines großen 9 kbp-HPRT-Mini-Gens erforderlich, das die Konstruktion und Vermehrung von homologen Rekombinationsvektoren erschwert. Die erfindungsgemäßen Selektionsfusionsgene liefern ein verbessertes Verfahren, wobei homologe "in- out"-Rekombinationen durchgeführt werden können. Da die erfindungsgemäßen Selektionsfusionsgene für eine positive Selektion domiant sind, kann jegliche Wildtyp- Zelle verwendet werden (d. h. man ist nicht auf die Verwendung von im Selektionsphänotyp defizienten Zellen beschränkt). Ferner ist die Größe des das Selektionsfusionsgen enthaltenden Vektors relativ zum großen HPRT-Mini-Gen signifikant reduziert.
Zur Erläuterung wird das HyTK-Selektionsfusionsgen wie folgt verwendet: Im ersten "in"-Schritt wird das HyTK-Selektionsfusionsgen in Zielgensequenzen eingebettet, in eine Wirtszelle transfiziert und homologe Rekombinante, die das HyTK- Selektionsfusionsgen in den Ziellocus eingebaut haben werden, durch ihr Wachstum in einem Hm-enthaltenden Medium identifiziert, wonach eine Genomanalyse unter Verwendung der PCR durchgeführt wird. Die HyTK&spplus;-Zellen werden anschließend im zweiten "out"-Schritt verwendet, in dem ein Konstrukt, das die in Zielgensequenzen jedoch ohne das HyTK-Selektionsfusionsgen) eingebetteten gewünschten Ersatzsequenzen enthält, in die Zellen transfiziert wird. Homologe Rekombinante werden durch selektive Eliminierung von HyTK&spplus;-Zellen unter Verwendung von Ganciclovir isoliert, wonach eine Genomanalyse unter Verwendung der PCR durchgeführt wird.

Beispiele

Beispiel 1

Konstruktion und Charakterisierung von das HVTK-Selektionsfusionsgen enthaltenden Plasmidvektoren

A. Konstruktion des bifunktionellen HyTK-Selektionsfusionsgens

Die hph- und HSV-I TK-Gene wurden zunächst unter die regulatorische Kontrolle des HCMV-Promotors in tgCMV/hygro bzw. tgCMV/TK gestellt. Das Plasmid tgCMV/hygro (Figur 1) besteht aus den folgenden Elementen: dem BalI-SstII- Fragment, das den HCMV IE94-Promotor enthält (Boshart et al., Cell 41 (1985), 521); einem Oligonucleotid, das eine einer Consensus-Translationsüiitiationssequenz für Säugerzellen (GCCGCCACC ATG) entsprechende Sequenz enthält (Kozak, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8125); den Nucleotiden 234-1256 des hph-Gens (Kaster et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 6895), das die Hygromycinphosphotransferase codiert; dem BclI- BaMHI-Fragment des SV40-Genoms (Tooze, J., Hrsg., Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. Ausg. DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1981), das die Polyadenylierungssequenz der frühen Region von SV40 enthält; dem NruI-AlwNI-Fragment von pML2d (Lusky und Botchan, Nature 293 (1981), 79), das den bakteriellen Replikationsursprung enthält; und dem AlwNI-AatII-Fragment von pGEM1 (Promega Corporation), das das β-Lactamasegen enthält.
Plasmid tgCMV/TK (Figur 1) ist dem tgCMV/hygro ähnlich, enthält jedoch die Nucleotide 519 bis 1646 des HSV-I TK-Gens (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1441) anstelle des hph-Gens.
Plasmid tgCMV/HyTK (Figur 1), das das Selektionsfusionsgen, das das hph- Gen und das HSV-I TK-Gen umfaßt, enthält, wurde durch Insertion des 1644 bp-Spei- Scai-Fragments von tgCMV/hygro zwischen die Spei- und MluI-Stellen von tgCMV/TK konstruiert. Vor der Ligierung wurde die MluI-Stelle im HSV-I TK-Gen mit T4-DNA- Polymerase behandelt, um eine Ligierung von glatten Enden mit der ScaI-Stelle zu ermöglichen, wodurch der offene Leserahmen erhalten blieb. Es wird angenommen, daß die Translation dieses Fusionsgens (mit der Bezeichnung HyTK-Selektionsfusionsgen) ein einziges bifunktionelles Fusionsprotein erzeugt, das aus den Aminosäuren 1 bis 324 des hph-Proteins und den Aminosäuren 10 bis 376 des HSV-I TK-Proteins besteht. Die 17 C-terminalen Aminosäuren des hph-Proteins und die 9 N-terminalen Aminosäuren des TK-Proteins sind im bifunktionellen Fusionsprotein deletiert.

B. Dominant-positive Selektion von das HyTK-Selektionsfusionsgen enthaltenden Zellen

Zum Aufzeigen, daß das HyTK-Selektionsfusionsgen sowohl hph- als auch TK-Enzymaktivitäten codiert, wurden die Häufigkeiten, mit denen tgCMV/HyTK eine Hygromycinresistenz (Hmr) (in NIH/3T3-Zellen und Rat-2-Zellen) übertrug, und die Fähigkeit zum Wachstum in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HATr) enthaltenden Medium (in Rat-2-Zellen) mit denen der Eltemplasmide tgCMV/hygro bzw. tgCMV/TK verglichen.
NIH/3T3-Zellen wurden in Dulbeccos-modifiziertem-Eagle-Medium (DMEM; Gibco Laboratories), dem 10% Rinderkälberserum (Hyclone), 2 mM L- Glutanun, 50 E/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin zugesetzt wurden, bei 37ºC in einer 10% CO&sub2; enthaltenden feuchten Atmosphäre gezüchtet. TK&supmin;-Rat-2-Zellen (Topp, Virology 113 (1981), 408) wurden in DMEM, dem 10% fötales Rinderserum (Hyclone), 2 mM L-Glutamin, 50 E/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin zugesetzt wurden, bei 37ºC in einer 10% CO&sub2; enthaltenden angefeuchteten Atmosphäre gezüchtet. NIH/3T3- und Rat-2-Zellen wurden mit den vorstehend beschriebenen DNA- Vektoren durch Elektroporation, wie nachstehend beschrieben, transfiziert. Exponentiell wachsende MH/3T3- und Rat-2-Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet, durch Waschen von Serum befreit und in DMEM bei einer Konzentration von 107 Zellen/ml resuspendiert. Eine Supercoil-Struktur aufweisende Plasmid-DNA (5 µg) wurde zu 800 µl Zellsuspension (8 x 10&sup6; Zellen) zugesetzt und das Gemisch einer Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser and Capacitance Extender-Geräts von Biorad (200 bis 300 V, 960 µF, 0,4 cm Elektrodenabstand, bei Umgebungstemperatur) unterzogen. Nach der Transfektion wurden die Zellen in 9 cm- Schalen zurückgegeben und in nicht-selektivem Medium gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und zu 6 x 10&sup5; pro 9 cm-Schale auf die Schalen aufgebracht, und man ließ sie über Nacht anhaften. Das nicht-selektive Medium wurde gegen selektives Medium (das 500 µg/ml Hygromycin B für NIH/3T3-Zellen und 300 µg/ml Hygromycin B oder HAT für Rat-2-Zellen enthielt) ausgetauscht und die Selektion etwa 10 bis 12 Tage fortgesetzt, bis Kolonien sichtbar wurden. Die Platten wurden mit Methylenblau angefärbt und ausgezählt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt. Die beschriebene Zahl der Kolonien ist die Durchschnittszahl von Kolonien pro 9 cm-Schale. Tabelle 1
In beiden Zellinien führte tgCMV/HyTK mit einer etwas größeren Häufigkeit als tgCMV/hygro zu Hmr-Kolonien. In Rat-2-Zellen war tgCMV/HyTK jedoch etwas weniger effizient als tgCMV/TK bei der Erzeugung von HATr-Kolonien. Dies zeigt, daß das HyTK-Selektionsfusionsgen sowohl hph- als auch TK-Enzymaktivitäten codiert, wenn auch mit unterschiedlichen Effizienzen.

C. Negative Selektion von Zellen, die das HVTK-Selektionsfusionsgen enthalten

Zur Untersuchung der Verwendbarkeit des HyTK-Selektionsfusionsgens zur negativen Selektion wurden die durch jede Transfektion erhaltenen Kolonien (Tabelle 1) vereinigt und zu Zellinien zur weiteren Analyse vermehrt. Die Hmr NIH/3T3-Zellpoole und die Hmr und HATr-Rat-2-Zellpoole wurden auf GCVs in einem Kurzzeit- Zellproliferationstest, wie nachstehend beschrieben, getestet.
Die transfizierten NIH/3T3- und Rat-2-Zellen (jeweils 3 x 10&sup4;) wurden in 9 cm-Gewebekulturschalen auf komplettes Nährmedium aufgebracht und man ließ sie 4 Stunden anhaften. Dem Medium wurden anschließend verschiedene Konzentrationen von GCV (Syntex, Palo Alto, CA) zugesetzt und die Zellen weitere 60 Stunden inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt, die anhaftenden Zellen durch Trypsinbehandlung geerntet und mit Trypanblau angetarbt und die lebensfahigen Zellen gezählt. Das Zellwachstum wurde als Bruchteil des in Abwesenheit von GCV beobachteten Zellwachstums ausgedrückt. Die dargestellten Ergebnisse sind der Durchschnitt von dreifachen Tests.
Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das HyTK- Selektionsfusionsgen GCVs in NIH/3T3-Zellen überträgt. Der Inhibitionsgrad des Zellwachstums war proportional zur Konzentration des verwendeten GCV und erreichte 100% bei einer Konzentration von 1 µM. Im Gegensatz dazu wurden mit tgCMV/hygro transfizierte NIH/3T3-Zellen durch GCV über den getesteten Konzentrationsbereich (0,03 µm bis 1,0 µM) nicht nachteilig beeinflußt.
Die in Figur 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das HyTK- Selektionsfusionsgen bei der negativen Selektion in Rat-2-Zellen effektiver als das HSV- I TK-Gen ist. Das Wachstum von mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2-Zellen wurde selbst bei der geringsten verwendeten Konzentration von GCV (0,03 µM) fast vollständig gehemmt, ungeachtet dessen, ob die Zellen anfänglich auf Hmr oder HATr selektiert wurden. Das Wachstum von mit tgCMV/hygro transfizierten Rat-2-Zellen wurde durch GCV über den getesteten Konzentrationsbereich (0,03 µM bis 1,0 µm) nicht gehemmt. Das Wachstum von mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen wurde durch GCV gehemmt, die zur Wachstumsinhibition erforderlichen Konzentrationen waren jedoch viel höher als die zur Innibition des Wachstums von mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2- Zellen erforderlichen Konzentrationen. Die mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen waren weniger empfindlich gegen GCV als die mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2- Zellen. Dies widersprach anscheinend dem Ergebnis, das bei der Verwendung der beiden Gene zur positiven Selektion in Rat-2-Zellen erhalten wurde (Tabelle 1), was anzeigte, daß das HyTK-Selektionsfusionsgen weniger effektiv als das HSV-I TK-Gen bei der Übertragung von HATr war. Eine weitere Beobachtung bezüglich der relativen Empfindlichkeiten dieser Zellinien gegen GCV war, daß die mit tgCMV/HyTK transfizierten NIH/3T3-Zellen weniger empfindlich gegen GCV waren als die mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2-Zellen.

D. Northern-Analyse von transfizierten Zellüiien

Zur Untersuchung der Ursache für die unterschiedlichen GCV- Empfindlichkeiten der Hmr- und HATr-NIH/3T3- und Rat-2-Zellpoole (Figuren 3 und 4) und der unterschiedlichen Effizienz, mit der das HyTK-Selektionsfusionsgen zu Hmr- und HATr-Kolonien führte (Tabelle 1), wurden Northern-Blots von mRNA von jedem Zellpool mit Sequenzen der hph- und HSV-I TK-Gene, wie nachstehend beschrieben, sondiert.
Polyadenylierte mRNA wurde gemäß Standardverfahren hergestellt (Ausabel et al., Hrsg., Current protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, 1987). Mit RNA-Proben (10 µg) wurden auf 1,1 % Agarosegelen, die Formaldehyd enthielten, eine Elektrophorese durchgeführt, wie beschrieben (Ausabel et al., a.a.O.). Nach der Elektrophorese wurden die Gele umgedreht und durch Kapillartransfer in 20 x SSC auf Duralon-UV-Nylonmembranen (Stratagene) geblottet. Nach der Fixierung der mRNA an die Membran durch UV-Bestrahlung (0,12 J/cm²) wurden die Membranen in Starks- Puffer (50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Kaliumphosphat (pH 6,5), 1% SDS, 0,1% Ficoll, 0,1 % PVP, 0,1 % BSA, 300 µg/ml geschorene und denaturierte Lachssperma- DNA und 0,05 % Sarkosyl) bei 50ºC über mehrere Stunden inkubiert. Eine hph-spezifische, gleichförmig markierte einzeisträngige Antisense-RNA-Sonde wurde hergestellt (Ausabel et al., a.a.O.), 1 x 10&sup6; CPM/ml dem Hybridisierungsgemisch zugesetzt und die Inkubation 15 Std. bei 63ºC fortgesetzt. Die Membran wurde anschließend in 0,1 x SSC und 0,1 % SDS bei 63ºC gewaschen und gegen einen Autoradiographiefilm Kodak XAR-5) exponiert. Zum Nachweis der HSV-I TK- und β-Actinsequenzen wurden gelgereinigte Restriktionsfragmente der HSV-I TK- und β-Actingene durch Zufalls-Priming radioaktiv markiert (Ausabel et al., a.a.O.). Die Membranen wurden in Starks-Puffer mehrere Stunden bei 42ºC vorhybridisiert, wonach 1 x 10&sup6; CPM/ml Sonde zum Hybridisierungsgemisch zugesetzt wurden, und die Inkübation wurde 15 Stunden bei 42ºC fortgesetzt. Die Membranen wurden anschließend in 6 x SSC und 1 % SDS bei 63ºC gewaschen und gegen einen Autoradiographiefllm (Kodak XAR-5) exponiert.
Sowohl in Rat-2- als auch NIH/3T3-Zellen war das mit der hph-Sonde nachgewiesene, stabile (steady state) mRNA-Niveau in den mit tgCMV/hygro transfizierten Zellen höher als in den mit tgCMV/HyTK transfizierten und auf Hmr selektierten Zellen (Figur 5, Gel A, Bahnen 5 und 6). Dies könnte zeigen, daß ein höheres Expressionsniveau des hph-Gens zur Übertragung einer Resistenz gegen äquivalente Konzentrationen des Hygromycin B (300 µg/ml in Rat-2- und 500 µg/ml in NIH/3T3- Zellen) erforderlich ist, aufgrund der Tatsache, daß das bifunktionelle Fusionsprotein effektiver als das hph-Protein bei der Inaktivierung von Hygromycin B oder stabiler als das hph-Protein ist. Diese Schlußfolgerung wird durch die Ergebnisse in Tabelle 1 unterstützt, die zeigen, daß tgCMV/HyTK zu einer etwas größeren Zahl von Hmr Kolonien in beiden Zellinien als tgCMV/hygro führte.
Die RNA-Northern-Analyse zeigte ferner, daß die mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen ein stabiles (steady state) Niveau an mRNA exprimierten, ähnlich den Rat-2-Zellen, die mit tgCMV/HyTK transfiziert waren und auf HATr selektiert wurden (Figur 5, Gel B, Bahnen 2 und 4). tgCMV/TK ließ jedoch eine größere Zahl von HATr-Zellen als tgCMV/HyTK entstehen (Tabelle 1). Dies laßt darauf schließen, daß das HyTK-Selektionsfusionsprotein weniger effektiv als das HSV-I TK-Protein bei der Phosphorylierung von Thymidin oder weniger stabil als das HSV-I TK-Protein ist.
Schließlich exprimierten die mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2-Zellen mehrfach höhere (bei einer Selektion auf Hmr, Figur 5, Gel B, Bahn 3) oder ähnliche (bei einer Selektion auf HATr, Figur 5, Gel B, Bahn 4) stabile (steady state) Niveaus von mRNA im Vergleich mit mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen (Figur 5, Gel B, Bahn 2). Die beiden mit tgCMV/HyTK transfizierten Rat-2-Zellpoole waren mehr als 30 mal so empfindlich gegen GCV wie die mit tgCMV/TK transfizierten Rat-2-Zellen (Figur 4). Dies läßt den Schluß zu, daß das bifunktionelle Fusionsprotein deutlich effektiver als das HSV-I TK-Protein bei der Phosphorylierung von Ganciclovir oder deutlich stabiler als das HSV-I TK-Protein ist. Die erhöhte Fähigkeit des bifunktionellen Fusionsproteins zur Übertragung von GCVs und die gleichzeitige abnehmende Fälligkeit zur Übertragung von HATr läßt den Schluß zu, daß sich das bifunktionelle Fusionsprotein und das HSV-I TK-Protein durch ihre Substrataffmität und nicht durch ihre Stabilität unterscheiden.

Beispiel 2

Konstruction und Charakterisierung der das HyTK-Selektionsfusionsgen enthaltenden retroviralen Vektoren

A. Konstruktion von retroviralen Vektoren

Zwei das HyTK-Selektionsfusionsgen enthaltende retrovirale Expressionsvektoren wurden konstruiert. Im ersten Vektor tgLS(+)HyTK wurde das HyTK- Selektionsfusionsgen unter die regulatorische Kontrolle des in der retroviralen LTR vorhandenen Promotors gestellt. Im zweiten Vektor tgLS(-)CMV/HyTK wurde das HyTK-Selektionsfusionsgen unter die regulatorische Kontrolle des HCMV-Promotors gestellt.
Der retrovirale Expressionsvektor tgLS(+)HyTK (seine provirale Struktur ist in Figur 2 dargestellt) besteht aus den nachstehenden Elementen: der 5'-LTR und den Sequenzen bis einschließlich der PstI-Stelle bei Nucleotid 984 von MoMSV (Van Beveren et al., Cell 27 (1981), 97); die Sequenzen von der Psti-Stelle bei Nucleotid 563 bis Nucleotid 1040 von MoMLV (Shinnick et al., Nature 293 (1981), 543), einschließlich Punktmutationen (ATG T TAG), die das Pr65-gag-Translationsinitiationscodon eliminieren (Bender et al., J. Virol. 61 (1987), 1639); einem das HyTK- Selektionsfusionsgen enthaltenden Fragment von tgCMV/HyTK; Sequenzen von Nucleotid 7764 und bis einschließlich des 3'-LTR von MoMLV (Shinnick et al., Nature 293 (1981), 543); dem den bakteriellen Replikationsursprung enthaltenden NruI-AlwNI- Fragment von pML2d (Lusky und Botchan, Nature 293 (1981), 79); und dem das β- Lactamasegen enthaltenden AlwNI-AatII-Fragment von pGEMI (Promega Corporation).
Der retrovirale Expressionsvektor tgLS(-)CMV/HyTK (dessen provirale Struktur in Figur 2 dargestellt ist) ist dem tgLS(+)HyTK ährilich, trägt jedoch eine Punktinutation (AGGT T AGGC), die die von MoMSV stammende Spleiß- Donorsequenz eliminiert (die vom retroviralen Vektor ΔH [Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 1803] übertragen wurde), und enthält den HCMV-Promotor stromaufwärts der HyTK-Selektionsfusionsgensequenzen.
Der retrovirale Expressionsvektor tgLS(+)HyTK/stop (dessen provirale Struktur in Figur 2 dargestellt ist) wurde von tgLS(+)HyTK abgeleitet durch Insertion des universellen Translationsterminatoroligonucleotids (Pharmacia), 5'- GCTTAATTAATTAAGC-3', in die NaeI-Stelle, die in der Nähe der Verbindungsstelle der hph- und HSV-I TK-Sequenzen des HyTK-Selektionsfusionsgens liegt.

B. Erzeugung von retrovirale Vektoren produzierenden stabilen Zellinien

Stabile ψ2-Verpackungszellinien, die die vorstehend beschriebenen ekotropen Retroviren produzierten, wurden, wie nachstehend beschrieben, erzeugt. ψ2-Zellen (Mann et al., Cell 33 (1983), 153) wurden in Dulbeccos-modifiziertem-Eagle-Medium (DMEM; Gibco Laboratories), das mit 10% Rinderkälberserum (Hyclone), 2 mM L- Glutamin, 50 E/ml-Peniclllin und 50 µg/ml Streptomycin versetzt war, bei 37ºC in einer 10% CO&sub2; enthaltenden feuchten Atmosphäre gezüchtet. PA317-Zellen (Miller und Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 2895) wurden in DMEM gezüchtet, das mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone), 2 mM L-Glutamin, 50 E/ml-Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin versetzt war, bei 37ºC in einer 10% CO&sub2; enthaltenden feuchten Atmosphäre gezüchtet.
Die vorstehend beschriebenen retroviralen Expressionsvektoren wurden zunächst durch Elektroporation in amphotrope PA317-Verpackungszellen transfiziert. Amphotrope Virlonen, die von vorübergehend transfizierten PA317-Verpackungszellen produziert wurden, wurden anschließend zur Infektion der ψ2-Zellen verwendet, wie nachstehend beschrieben. Exponentiell wachsende PA317-Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet, durch Waschen vom Serum befreit und in DMEM bei einer Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert. Eine Supercoil-Struktur aufweisende Plasmid-DNA (5 µg) wurde zu 800 µl Zellsuspension (8 x 10&sup6; Zellen) zugesetzt und das Gemisch einer Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulsers und Capacitance Extenders von Biorad (200 bis 300 V, 960 µF, 0,4 cm Elektrodenabstand, bei Umgebungstemperatur) unterzogen. Die transfizierten PA317-Zellen wurden anschließend in eine 9 cm-Gewebekulturschale transferiert, die 10 ml komplettes Nährmedium, das mit 10 mM Natriumbutyrat (Sigma Chemical Co.) versetzt war, enthielt und man ließ sie über Nacht anhaften. Nach 15 Stunden wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Medium, das vorübergehend produzierte amphotrope Retroviruspartikel enthielt, geerntet, 10 min bei 2 000 UpM zentrifugiert und zur Infektion der ekotropen ψ2-Verpackungszellen verwendet. Sich exponentiell teilende ψ2-Zellen wurden mit einer Dichte von 10&sup6; Zellen pro 9 cm- Gewebekulturschale plattiert und man ließ sie über Nacht anhaften. Am folgenden Tag wurde das Medium entfernt und durch Serienverdünnungen des Virus-enthaltenden Überstandes (6 ml/Schale) in mit 4 µg/ml Polybrene (Sigma Chemical Co.) versetztem Medium ersetzt. Die Infektion der ψ2-Zellen durch virale Partikel erfolgte über Nacht und anschließend wurde der Überstand durch komplettes Nährmedium ersetzt. Die infizierten Zellen wurden nach weiteren 8 bis 24 Stunden Wachstum durch Zugabe von Hygromycin B (Calbiochem) zu einer Endkonzentration von 500 µg/ml auf eine Wirkstoffresistenz selektiert. Die Kolonien der Hmr-Zellen wurden unter Verwendung von Clonierungszylindern 12 bis 14 Tage später isoliert und in Massenkulturen zur Analyse individuell vermehrt. Die Southern-Analyse (Daten nicht dargestellt) zeigte, daß die proviralen Strukturen in sechs von sechs unabhängigen Clonen intakt waren, was zeigt, daß das HyTK-Selektionsfusionsgen mit dem retroviralen Lebenszyklus kompatibel ist.

C. Transduktion von Hmr, HATr und GCVs durch tgLS(+)HyTK- und tgLS(-)CMV/HyTK-Retrovirus-Expressionsvektoren

Die infizierten ψ2-Clone wurden auf NIH/3T3-Zellen (Selektion auf Hmr) und auf Rat-2-Zellen (Selektion auf Hmr oder HATr) (Tabelle 2), wie nachstehend beschrieben, titriert. Die das Virus produzierenden ψ2-Clone wurden bis zur Konfluenz in 9 cm-Gewebekulturschalen gezüchtet und anschließend 15 ml Wirkstoff-freies Medium zugesetzt. Nach einer Inkubation über Nacht wurden Aliquote des Überstandes zum Testen genommen. Sich exponentiell teilende NIH/3T3- oder Rat-2-Zellen wurden durch Trypsinbehandlung geerntet und mit einer Dichte von 2,5 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm-Vertiefung in 6 Vertiefungen aufweisende Gewebekulturträger ausgebracht (seeded). Am folgenden Tag wurde das Medium durch Serienverdünnungen des Virusenthaltenden Überstandes (1 ml/Vertiefung) in mit 4 µg/ml Polybrene (Sigma Chemical Co.) versetztem Medium ersetzt. Alle Überstände wurden 10 min bei 2 000 UpM vor der Verwendung zur Entfernung von lebenden Zellen zentrifugiert. Die Infektion konnte sich über Nacht fortsetzen, und der Überstand wurde anschließend durch komplettes Nährmedium ersetzt. Die infizierten Zellen wurden nach weiteren 8- bis 24-stündigem Wachstum durch Zugabe von Hygromycin B (Calbiochem) zu einer Endkonzentration von 500 µg/ml (NIH/3T3-Zellen) oder 300 µg/ml (Rat-2-Zellen) oder durch Zugabe von HAT-Zusatz (Gibco) (Rat-2-Zellen) auf eine Wirkstoffresistenz selektiert. Nach insgesamt 12 bis 14 Tagen Wachstum wurden die Zellen in situ mit 100% Methanol fixiert und mit Methylenblau angefärbt.
Wie nachstehend in Tabelle 2 dargestellt, übertragen beide Retroviren Hmr (an NIH/3T3- und Rat-2-Zellen) und HATr (an Rat-2-Zellen). Alle Viren wurden von einem Clon von infizierten ψ2-Zellen geerntet. Tabelle 2 Titer von von ψ2-Verpackungszellen produzierten ekotropen Retroviren auf NIH/3T3- Zellen und Rat-2-Zellen
Um zu zeigen, daß die tgLS(+)HyTK- und tgLS(-)CMV/HyTK-Retroviren auch GCVs übertrugen, wurden mit den beiden Retroviren infizierte NIH/3T3-Zellen auf Hmr (500 µg/ml) 10 Tage selektiert und anschließend vereinigt, vermehrt und auf GCVs im nachstehend beschriebenen Langzeit-Zellproliferationstest getestet.
Nicht-infizierte NIH/3T3-Zellen und die Poole der infizierten NIH/3T3- Zellen wurden mit einer relativ geringen Zelldichte (10&sup4; Zellen/9 cm-Schale) in komplettem Nährmedium plattiert und man ließ sie 4 Stunden anhaften. Dem Medium wurde anschließend Hygromycin B (500 µg/ml) mit oder ohne 1 µM GCV zugesetzt und die Zellen uber einen Zeitraum von 10 Tagen ihkubiert. Das Medium wurde anschließend entfernt, und die Zellen wurden in situ mit 100% Methanol fixiert und mit Methylenblau angefärbt. Das Wachstum von beiden Zellpoolen, an der Koloniebildung gemessen, wurde fast vollständig durch GCV gehemmt (Figur 6, Platten e und g), was anzeigt, daß beide Retroviren Hmr und GCVs übertrugen. Nicht-infizierte NIH/3T3- Zellen waren gegen diese GCV-Konzentration resistent und wuchsen zu einer konfluenten einzelligen Schicht (Figur 6, Platte b), wurden jedoch durch 500 µg/ml Hm vollständig abgetötet (Figur 6, Platte c). Kolonien von Zellen, die sowohl gegen Hm als auch GCV resistent waren, wurden mit geringer Häufigkeit (10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;³) von den Retrovirus-infizierten Populationen erhalten (Figur 6, Platten e und g). In den in den Zellen, die zu diesen Kolonien führten, vorhandenen Proviren hatten wahrscheinlich Punktinutationen oder sehr kleine Deletionen oder Umordnungen in der HSV-I TK- Einheit, die die Fähigkeit zur Phosphorylierung von GCV beseitigen, stattgefunden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit mit tgLS(+)HyTK oder tgLS(-)CMV/HyTK infizierten Rat-2-Zellinien erhalten (Daten nicht dargestellt).

Beispiel 3

Beweise für die Produktion eines bifunktionellen Selektionsfusionsproteins

In HSV-I-infizierten Zellen verwendet das HSV-I TK-Gen üblicherweise drei Translationsinitiationsstellen und codiert drei "nested" Polypeptide, die alle eine TK- Aktivität besitzen (Haarr et al., J. Virol. 56 (1985), 512). Da das HyTK- Selektionsfusionsgen zwei dieser Initiationscodons behält, war es vorstellbar, daß als Ergebnis der Translationsinitiation an einem oder beiden dieser internen AUG-Codons das HyTK-Selektionsfusionsgen auch die eine TK-Aktivität aufweisenden "nested" Polypeptide codieren könnte. Das bifunktionelle Fusionsprotein behält die hph-Aktivität und kann, kann aber auch nicht, eine TK-Aktivität aufweisen. Zum Ausschließen dieser Möglichkeit wurde die Oligonucleotidsequenz 5'-GCTTAATTAATTAAGC-3', die Translationsterminationscodons in allen drei Leserahmen trägt, in das HyTK- Selektionsfusionsgen in tgLS(+)HyTK eingeführt, wobei das Konstrukt mit der Bezeichnung tgi-S(+)HyTK/stop erzeugt wurde (Figur 1B). Das Oligonucleotid wurde an einer NaeI-Stelle stromabwärts der von hph stammenden Sequenzen, jedoch stromaufwärts der beiden internen AUG-Codons in die von HSV-I TK stammenden Sequenzen des HyTK-Selektionsfusionsgens insertiert (Figur 1B). Die tgLS(+ )HyTK- und tgi-S(+)HyTK/stop-Retrovirus-Expressionsvektoren wurden in ψ2-Zellen transfiziert und das vorübergehend produzierte Virus zur Infektion von Rat-2-Zellen verwendet, die anschließend auf Hmr oder HATr selektiert wurden (Tabelle 3). Der retrovirale Expressionsvektor tgLS(+)HyTK transduzierte sowohl Hmr als auch HATr, der retrovirale Expressionsvektor tgLS(+)HyTK/stop konnte jedoch nur Hmr transduzieren. Die Insertion der Translationsterminationscodons beseitigte vollständig die Fähigkeit des Retrovirus zur Transduktion von HATr, was anzeigt, daß die internen Translationsinitiationscodons im HyTK-Selektionsfusionsgen nicht verwendet werden und das HyTK-Selektionsfusionsgen tatsächlich ein bifunktionelles Fusionsprotein codiert. Die Viren wurden aus den vorübergehend transfizierten ψ2-Zellen geerntet. Tabelle 3 Titer von vorübergehend von ψ2-Verpackungszellen produzierten ekotropen Retroviren auf NIH/3T3-Zellen und Rat-2-Zellen
Wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, wurden retrovirale Expressionsvektoren, die das HyTK-Selektionsfusionsgen enthielten, konstruiert und zum Aufzeigen der Effizienz des HyTK-Selektionsfusionsgens zur positiven und negativen Selektion in NIH/3T3- und Rat-2-Zellen verwendet. Virus-Vorräte mit hohem Titer, die sowohl Hmr als auch HATr auf infizierte Zellen übertrugen, wurden erzeugt. Die infizierten Zellen enthielten nicht umgeordnete Proviren und wurden durch GCV abgetötet 099,9%). Das HyTK-Selektionsfusionsgen war geringfügig effektiver als das hph-Gen bei der Ubertragung von Hmr sowohl in HIH/3T3- als auch Rat-2-Zellen (Tabelle 1). Der genetische Nachweis, daß das HyTK-Selektionsfusionsgen ein bifunktionelles Fusionsprotein codiert, das hph- und HSV-I TK-Enzymaktivitäten aufweist, wurde durch Insertion von Translationsterminationscodons in das HyTK- Selektionsfusionsgen (in tgLS(+)HyTK/stop; Figur 2) stromabwärts der von hph stammenden Sequenzen, jedoch stromaufwärts der von HSV-I TK stammenden Sequenzen, erhalten. Wie zu erwarten wäre, wenn das HyTK-Selektionsfusionsgen ein bifunktionelles Fusionsprotein codieren wurde, ließ die Insertion der Translationsterminationscodons die Fähigkeit des Virus zur Übertragung von Hmr intakt, beseitigte jedoch die Fähigkeit des Retrovirus zur Transduktion von HATr (Tabelle 3). Im Vergleich mit dem HSV-I TK-Gen in Rat-2-Zellen war das HyTK- Selektionsfusionsgen etwas weniger effektiv bei der Übertragung der Fähigkeit zum Wachstum in HAT-Medium (Tabelle 1), jedoch deutlich effektiver bei der Übertragung von GCVs (Figur 4). Diese Beobachtungen können weder auf der Basis der relativen stabilen (steady state) Niveaus der mRNA-Expression (Figur 5) noch auf der Basis der Veränderungen der Stabilität des HyTK-Selektionsfusionsproteins erklärt werden. Der anscheinende Widerspruch kann durch die Hypothese erklärt werden, daß die von HSV-1 TK stammende Einheit des HyTK-Selektionsfusionsproteins eine Substrataffinität aufweist, die sich von der des Wildtyp-HSV-I TK-Proteins (möglicherweise aufgrund einer Konformationsänderung) unterscheidet, wobei eine reduzierte Fähigkeit zur Phosphorylierung von Thymidin und eine erhöhte Fähigkeit zur Phosphorylierung von GCV vorliegt. Veränderte Substrataffinitäten wurden kürzlich in einer Reihe von pathogenen Wirkstoff-resistenten Stämmen von HSV-I bemerkt, die mutierte TK-Proteine codieren, die eine reduzierte Fähigkeit zur Phosphorylierung von Thymidinanalogen zeigen, jedoch die Fähigkeit zur Phosphorylierung von Thymidin behalten (Larder et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 2027, Palu et al., Virus Res. 13 (1989), 303, und Larder und Darby, Antiviral Res. 4 (1984), 1). Die etwas erhöhte Effizienz, mit der das HyTK- Selektionsfusionsgen relativ zum hph-Gen Hmr überträgt (Tabelle 1) kann auf eine Erhöhung der Proteinstabilität oder eine erhöhte spezifische Aktivität der Phosphotransferase zurückgeführt werden.
Ferner wurde ein einziges etwa 76 kD-Protein durch ein gegen HSV-I TK gerichtetes polydonales Kaninchen-Antiserum aus Extrakten von das HyTK- Selektionsfusionsgen exprimierenden Zellen spezifisch immunpräzipitiert. Daher war der durch das HyTK-Selektionsfusionsgen übertragene Phänotyp nicht auf eine interne Translationsinitiation in der von HSV-I TK stammenden Einheit des Gens zurückzuführen und das HyTK-Selektionsfusionsgen codiert tatsächlich ein bifunktionelles Selektionsfusionsgen.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Lupton, Stephen D.
(ii) Titel der Erfindung: Bifunktionelle Selektionsfusionsgene
(iii) Zahl der Sequenzen: 2
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Empfänger: Immunex Corporation
(B) Straße: 51 University Street
(C) Stadt: Seattle
(D) Staat: WA
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 98101
(v) Computer-lesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette, 3,50 Inch, 800 kb-Speicher
(B) Computer: Apple Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh
(D) Software: Microsoft Word
(vi) Aktuelle Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Einreichungsdatum:
(C) Klassifikation:
(viii) Vorherige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: 07/612,326
(B) Einreichungsdatum: 13. Nov. 1990
(ix) Anwalts/Vertreter-Information:
(A) Name: Wight, Christopher L.
(B) Registrierungsnummer: 31,680
(C) Referenz/Aktennummer: 2702-A
(x) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: (206) 587-0430
(B) Telefax: (206) 587-0606
(C) Telex: 756822
(2) Information zu SEQ ID No: 1:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 2076 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: doppelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Hypothetisch: N
(iv) Antisense: N
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1..2076
(D) Weitere Information:
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Reifes Peptid
(B) Lage: 1..2073
(D) Weitere Information: (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID No: 1:
(2) Information zu SEQ ID No: 2:
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 691 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID No: 2:

Claims

1. Selektionsfusionsgen, das zwei Gene umfaßt, wobei das erste ein dominant-positives Selektionsgen ist, das im Leserahmen mit einem zweiten Gen fusioniert ist, das ein negatives Selektionsgen ist, wobei das Selektionsfusionsgen ein einzelnes bifunktionelles Fusionsprotein codiert, das einen zellulären Wirt sowohl mit einem dominant-positiven Selektionsphänotyp als auch mit einem negativen Selektionsphänotyp ausstatten kann.

2. Selektionsfusionsgen nach Anspruch 1, wobei das dominant-positive Selektionsgen hph, neo oder gpt ist und das negative Selektionsgen HSV-I-TK, HPRT, APRT oder gpt ist.

3. Selektionsfusionsgen nach Anspruch 1, wobei der dominant-positive Selektionsmarker hph ist und der negative Selektionsmarker HSV-I-TK ist.

4. Selektionsfusionsgen nach Anspruch 3, das die Sequenz der Aminosäuren 1-691 von Seq ID No: 2 codiert.

5. Selektionsfusionsgen nach Anspruch 4, das die Sequenz der Nucleotide 1-2073 von SEQ ID No: 1 umfaßt.

6. Rekombinanter Expressionsvektor, der ein Selektionsfusionsgen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.

7. Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 6, der ein Retrovirus ist.

8. Zelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 6 oder 7 transduziert ist.

9. Verfahren zur Ausstattung einer Zelle mit einem dominant-positiven und negativen Selektionsphänotyp, das die Transduktion der Zelle mit einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 6 oder 7 umfaßt.

10. Verfahren zur Isolierung von Zellen mit einem negativen Selektionsphänotyp, das umfaßt:

(a) Transduktion einer Zellpopulation mit einem rekombinanten Expressionsvektor mit einem Selektionsfusionsgen, das zwei Gene umfaßt, wobei ein erstes Gen ein dominant-positives Selektionsgen ist, das im Leserahmen mit einem zweiten Gen fusioniert ist, das ein negatives Selektionsgen ist, wobei die Zellen mit einem dominant-positiven Selektionsphänotyp und einem negativen Selektionsphänotyp ausgestattet werden;

(b) positive Selektion zur Auswahl von Zellen mit einem dominant-positiven Selektionsphänotyp, wobei gleichzeitig Zellen selektiert werden, die einen negativen Selektionsphänotyp haben.