DE69434860T2

DE69434860T2 - Herstellung von helfer-freien retroviren mit hohem titer mittels transienter transfektion

Info

Publication number: DE69434860T2
Application number: DE69434860T
Authority: DE
Inventors: S. Warren New York PEAR; P. Garry Portola Valley NOLAN; L. Martin New York SCOTT; David New York BALTIMORE
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1993-02-22
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2014-02-23
Also published as: AU6248994A; ATE341638T1; JPH08506965A; WO1994019478A1; EP0689601B1; CA2156725A1; JP3866760B2; EP0689601A1; DE69434860D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf das Gebiet der Molekularbiologie und weiter insbesondere auf die Präparation von rekombinanten retroviralen Vektoren zur Verwendung in einer Vielzahl von Zusammenhängen, einschließlich sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Anwendungen, und für Forschungszwecke.
Hintergrund der Erfindung
Effizienter Gentransfer ist eine Voraussetzung für erfolgreiche Gentherapie. Retrovirale Vektoren werden als die am meisten Erfolg versprechenden Vehikel angesehen, um effizient ausgewählte Gene in einen großen Bereich von Zielzellen einzuführen, und wurden in der humanen Gentherapie erfolgreich verwendet (in Übersicht dargestellt in Anderson, 1992). Unter den attraktiven Merkmalen der Vektoren sind Ihre Fähigkeiten, Gene effizient in Zellen zu transferieren, welche durch andere Methoden schwierig zu transfizieren sind, hämatopoetische Stammzellen zu infizieren sowie Gene in der Abwesenheit von Replikationskompetentem Virus zu transferieren.
Derzeitige Methoden zur Erzeugung von Helfer-freien retroviralen Beständen („stocks") mit hohem Titer verwenden die Erzeugung einer stabilen Erzeuger-Zellinie, die einen selektiven Vektor exprimiert (in Übersicht dargestellt in Miller, 1990). Erzeuger-Linien werden, durch das Einführen des retroviralen Vektors in eine Verpackungs-Zellinie hergestellt, welche in trans alle Proteine synthetisiert, die für die virale Assemblierung benötigt werden. Es ist dann notwendig, unter vielen individuellen Klonen einen Klon zu selektieren, der den retroviralen Vektor mit einem hohen Titer exprimiert, weil die Virus-Produktion durch den Original-Pool an transfizierten Klonen im Durchschnitt niedrig ist. Die Selektion benötigt mindestens einen Monat und kann aufwendig und teuer sein. Zusätzlich kann die anhaltende hohe Expression der retroviralen mRNA für die Erzeuger-Zellinien nachteilig sein, was dazu fuhrt, daß die Titer bei anhaltender Kultivierung abfallen.
Um in der Gentherapie und vielen anderen Situationen nützlich zu sein, muß der Titer des Virus, der durch die Erzeuger-Linie hergestellt wird, ungefähr 10⁶ oder höher sein. Für jedes Konstrukt ist es oftmals notwendig, viele klonale Zellinien zu testen, um eine zu finden, die stabil rekombinanten Virus mit hohem Titer produziert. Solch eine Prozedur braucht im Durchschnitt zwei Monate, ist arbeitsintensiv und limitiert die Anzahl der Konstrukte, die man produzieren kann. Zusätzlich exprimieren rekombinante Konstrukte oftmals Produkte, die auf lange Sicht schädlich für die Erzeuger-Linie sein können, was zu einem Abfall im Titer führt, wenn die Linie fortgeführt wird. Aufgrund dieses späteren Problems ist es manchmal nicht möglich, hohe Titer für bestimmte Konstrukte zu erreichen.
Zum Beispiel wurde bei dem Versuch, v-abl oder P210^bcr/abl Helfer-freie Retroviren mit hohem Titer zu erzeugen, gefunden, daß nur wenige Klone Virus mit Titern größer als 10⁶/ml produzierten und daß diese Klone üblicherweise ihre Fähigkeit, Virus mit hohem Titer zu produzieren, während der Kultivierung verloren. Dieses Phänomen wurde auch bei retroviraler Transduktion von rel-verwandten Transkriptionsfaktoren beobachtet.
Es besteht daher Bedarf, ein Verfahren für die verlässliche Präparation von viralen Beständen mit hohem Titer zu entwickeln, welches schnell und effizient in seiner Operation ist und konsistent in seinen Ergebnissen ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion von Helfer-freien viralen Beständen („stocks") mit hohem Titer von infektiösen viralen Konstrukten offenbart, die ein genetisches Element von Interesse beinhalten. Das Verfahren umfaßt die Präparation einer Zellinie, die in der Lage ist, solche viralen Bestände zu präparieren, das Einführen eines viralen Konstrukts, das das genetische Element von Interesse enthält, in die Zellinie durch transiente Transfektion und danach Ernten der viralen Bestände, die dadurch präpariert wurden. Die viralen Bestände können retrovirale Bestände umfassen, und die viralen Konstrukte können retrovirale Konstrukte umfassen. Die Zellinie, die in dem Verfahren nützlich ist, kann von der Ad5-transformierten humanen embryonischen Nierenzellinie 293 abgeleitet sein, und insbesondere die klonalen Zellinien, die hierin präpariert werden und 293T/17 und ANJOU 65 benannt wurden. Weiter insbesondere umfaßt die Zellinie, die in der Erfindung nützlich ist, die klonale Verpackungs-Zellinie mit dem Namen BOSC 23, die auch hierin präpariert wird.
Alle drei Zellinien wurden am 12. Februar 1993 bei der American Type Culture Collection in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt: Der Zellinie 293T/17 wurde die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11268 zugeordnet; ANJOU 65 wurde die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11269 und BOSC 23 wurde die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11270 zugeordnet.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die neuen Zellinien, die oben beschrieben sind, welche die Produktion von Helfer-freien Beständen mit hohem Titer von infektiösen viralen Konstrukten, wie z.B. retroviralen Vektoren, in einer relativ kurzen Zeitspanne nachfolgend der Transfektion ermöglichen. Wie oben ausgeführt, umfaßt die erste Zellinie, die gemäß der Erfindung präpariert wird, die 293T/17 Zellinie und wird von Ad5-transformierten humanen embryonischen Nierenzellen, die als 293-Zellen bekannt sind, abgeleitet. Diese Zellinie ist in der Lage, retrovirales Material mit hohem Titer bei Anwesenheit von Helfer-Virus zu produzieren, und kann durch die Transfektion von Verpackungs-Funktionen in die Zellen (z.B. durch sequentielle Transfektion der Konstrukte pCRIP^env- und pCRIP^gag-2 in 293T/17-Zellen) ohne die Entwicklung von Replikations-Kompetenz modifiziert werden.
Die ANJOU 65-Zellinie wird von der 293T/17-Zellinie abgeleitet und enthält einen Teil der Verpackungsfunktion, der für die Zellinie notwendig ist, um als eine Erzeuger-Zellinie gemäß der vorliegenden Erfindung zu dienen. Diese Zellinie zeigt hohe Aktivität an reverser Transkriptase und produziert gleichermaßen Virus mit hohem Titer nach transienter Transfektion eines retroviralen Vektors plus Helfer-Virus. ANJOU 65-Zellen benötigen nur die Einführung eines Hüll-Expressions-Elementes, um als eine vollständige Verpackungs-Zellinie zu dienen. Die ANJOU 65-Zellinie kann verwendet werden, um eine Vielfalt von retroviralen und viralen Konstrukten zu produzieren, wie z.B. amphotrope und Pseudotyp-Retroviren, einschließlich Konstrukte, die für die Infektion von humanen und anderen Zellen geeignet sind, wodurch Gentherapie ermöglicht wird.
Weiterhin erstreckt sich die Erfindung auf eine ecotrope Verpackungs-Zellinie, die hierin als BOSC 23 bezeichnet wird, und auf eine amphotrope Verpackungs-Zellinie, die als CAK 8 bezeichnet wird, wobei beide dieser Zellinien Helfer-freien Retrovirus mit hohem Titer produzieren. Weiter insbesondere sind sowohl die BOSC 23 als auch die CAK 8 Erzeuger-Zellinien viel besser transfizierbar als die derzeit verwendeten Verpackungs-Zellinien. Durch die Verwendung von entweder BOSC 23 oder CAK 8 als Verpackungs-Zellen und durch Op timisierung der CaPO₄ Transfektions-Prozedur können retrovirale Titer von mehr als 10⁶ infektiösen Partikeln pro Milliliter Überstand innerhalb von 48–72 Stunden nach der Transfektion erreicht werden. Die produzierten Retroviren sind Helfer-frei und können früher hämatopoetische Vorläufer infizieren. Dieses transiente System umgeht damit den Zeit-aufwendigen Schritt der Selektion von Erzeuger-Linien mit hohem Titer. Des weiteren können Titer von mehr als 10⁶ erreicht werden, wie hierin illustriert, unter der Verwendung von retroviralen Vektoren, die Gene enthalten, von denen angenommen wurde, daß sie für stabile Erzeuger-Linien „toxisch" sind. Diese schließen die abl und rel-verwandten Gene, wie oben beschrieben, ein. Es ist wahrscheinlich, daß die verkürzte Zeit für die Produktion von Retrovirus in dem vorliegenden transienten System jegliche schädliche Effekte auf die Erzeuger-Zellen minimiert, was eine hohe Titer-Produktion erlaubt.
Ebenso wird hierin eine Methode für die Präparation der klonalen Erzeuger-Zellinien beschrieben, und zwar durch zuerst Identifizieren einer Zellinie, wie z.B. der 293-Zellinie, die das Potential für retrovirale Produktion aufweist, und Einführen in die so selektierte Zellinie von Konstrukten, die die Verpackungsfunktionen enthalten, die für die Zellinie benötigt werden, um besagte retrovirale Konstrukte zu produzieren. Bevorzugterweise sind solche Funktionen in separaten Plasmiden angeordnet, die sequentiell eingeführt werden, um die Präparation von Replikations-kompetentem Helfer-Virus zu vermeiden, so daß die Konstrukte, welche durch die Herstellungsmethode der vorliegenden Erfindung präpariert werden, Helfer-frei sind. Außerdem findet die Methode für die Präparation der Erzeuger-Zellinie bevorzugt bei Anwesenheit eines bakteriellen antibiotischen Selektions-Mediums statt, weil von diesem gefunden wurde, daß es die Präparation der Erzeuger-Zellinie, die die erwünschten Fähigkeiten aufweist, fördert.
Die Präparation von Helfer-freiem Retrovirus mit hohem Titer durch Mittel der Erzeuger-Zellinien und korrespondierender, hierin beschriebender Methoden ist nützlich in einer großen Vielfalt von diagnostischen und therapeutischen Zusammenhängen. Daher erstreckt sich z.B. die vorliegende Erfindung auf die Präparation von Retroviren, die bestimmte genetische Elemente exprimieren, die wiederum verwendet werden können: bei der direkten Einführung via Gentherapie, für die Verwendung im Genaustausch, für die Komplimentierung von genetischen Defekten, Chemotherapie und der Behandlung von infektiösen Erkrankungen, wie z.B. HIV.
Die Anmeldung offenbart auch virale Bestände, welche durch die vorliegende Methode und/oder durch Mittel der Zellinien der Erfindung präpariert wurden. Gleichermaßen werden hierin auch kultivierte Zellen, die mit mindestens einem infektiösen viralen Konstrukt infiziert werden, das von den vorliegenden viralen Beständen abgeleitet wird, betrachtet. Solche kultivierten Zellen können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Verwendungen präpariert werden. Eine diagnostische Anwendung zieht die Präparation von zellulären Modellen für das Studium von Erkrankungen und anderen Zuständen in Erwägung, wo genetische Veränderung oder Dysfunktion vorkommt. Die zellulären Modelle können durch die Infektion der Zellen, die vorgesehen sind, in dem zellulären Modell verwendet zu werden, mit einem retroviralen Vektor präpariert werden, der gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurde und der bestimmtes genetisches Material einführt, was die genetische Veränderung von Interesse widerspiegelt. Weiterhin können in einer Ersatz-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, multiple retrovirale Vektoren in dieselbe Zelle eingeführt werden, um ein zelluläres Modell zu entwickeln, welches multiple genetische Veränderungen widerspiegelt. Dies würde es dem Forscher erlauben, den bestimmten Zustand oder die bestimmten Zustände zu studieren, die aus solchen multiplen Defekten resultieren, und darüber hinaus die individuellen Interaktionen zwischen den entsprechend genetischen Veränderungen zu untersuchen. Auch die Geschwindigkeit und Vielseitigkeit der vorliegenden Methode ermöglicht die Evaluierung einer Vielfalt von viralen Konstrukten und deren Effekte auf die Zellphysiologie.
Die Anmeldung beschreibt weiterhin eine Methode für die Produktion von Proteinen aus Zelitypen von Interesse. Spezifisch kann eine Vielfalt von Zelltypen dazu gebracht werden, modifiziertes Protein zu produzieren durch die Einführung in die Zellen von genetischem Material in virale Beständen, das gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurde. Exemplarische Zelltypen schließen explantiertes Patientengewebe, Tiergewebe und Zellinien ein. Die vorliegende Methode ermöglicht die Infektion von bestimmten Zelltypen, um gewünschte Gewebespezifische Modifikationen, wie z.B. Protein-Glykosylierung, zu erreichen. Die Produktion von Protein würde durch die Infektion von Zielgewebe oder Zellen mit einem infektiösen viralen Konstrukt stattfinden, welches gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurde, wonach die infizierten Zielzellen das relevante Protein von Interesse produzieren würden, welches solche Modifikationen enthält, wie sie durch die Einführung des genetischen Elements getragen von dem bestimmten viralen Konstrukt erwartet oder vorhergesagt würden.
Auch die Produktion von Retroviren in großem Maßstab gemäß der vorliegenden Anmeldung ermöglicht die Herstellung von spezifisch modifiziertem Protein in großem Maßstab sowie die Präparation von Vakzinen, um Immunität gegenüber bestimmten Antigenen in Wirten zu erreichen.
Eine weitere Anwendung, wie hierin beschrieben, bezieht sich auf die Isolierung von Genen aus cDNA-Bibliotheken und die korrespondierende Identifizierung der Funktion davon. Z.B. können die Produkte einer gesamten cDNA-Bibliothek durch Klonierung in die retroviralen Vektoren exprimiert werden und danach in die Zellinie der vorliegenden Erfindung transfiziert werden. Die Produktion von retroviralen Produkten in großem Maßstab erlaubt die Infektion einer Zielpopulation nachfolgend einer Selektion eines bestimmten Produktes gemäß den Kriterien von Interesse.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich neben der Präparation von Helfer-freien ecotropen Retroviren weiterhin auf die Präparation von Viren, repräsentiert durch die transiente Transfektion von Konstrukten in die BOSC 23-Zellinie. Weiter insbesondere kann die ANJOU 65-Zellinie, die gleichermaßen gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurde, verwendet werden, um amphotrope Retroviren durch Transfektion mit dem geeigneten Hüll-exprimierenden Konstrukt zu präparieren. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Produktion von Helfer-freien amphotropen Retroviren durch Transfektion der CAK 8-Zellinie, die wie hierin präpariert und beschrieben wurde. Zusätzlich kann das Hüll-exprimierende Konstrukt, welches bei der Präparation von Pseudotyp-Retroviren verwendet wird, das G-Glykoprotein von vesikulärem Stomatitis-Virus (VSV) sein, wie diskutiert in Burns et al., 1993, PNAS USA 90: 8033–8037 und wie in Übersicht dargestellt in Hopkins, 1993, PNAS USA 90: 8758–8761. Die so präparierten Viren sind insbesondere gut geeignet für die Infektion von humanen Zellinien sowie von Zellinien anderer Spezies. Alternative Viren und potentielle Gentherapie-Vektoren, wie z.B. Adenovirus und Herpes-Viren, können auch durch die hierin offenbarten Techniken präpariert werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf geeignete Kits für den korrespondierenden Assay der Zellen, die durch die vorliegende Erfindung modifiziert wurden. Demgemäß können Zellen, die die gentechnisch manipulierten Konstrukte enthalten, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt wurden, schnell untersucht werden, um die Genfunktion und die Effekte der Proteinproduktion zu bestimmen. Spezifisch können solche Kits angewendet wer den für die Analyse von Genreporter- und Inducer-Konstrukten, die schnelle Analyse von Mutanten-Konstrukten und deren korrespondierende biologische Funktion und die Produktion von biologisch-relevantem Protein in einer Forschungs-Situation. Solche Kits, welche die Applikationen rekapitulieren, die früher für die vorliegende Erfindung vorgetragen wurden, und die genannten Materialien, einschließlich der Zellinien, wurden präpariert und können in Übereinstimmung hiermit verwendet werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die klonale Zellinie 293T/17, die die ATCC-Zugangs-Nr. CRL 11268 hat, die klonale Zellinie ANJOU 65, die die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11269 hat, die klonale Zellinie BOSC 23, die die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11270 hat, und die klonale Zellinie CAK 8, die die ATCC Zugangs-Nr. CRL 11554 hat, zur Verfügung.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Assay-Kits für die Analyse von gentechnisch manipulierten Konstrukten in Zellen durch Mittel der vorliegenden Erfindung zu präparieren und zu verwenden.
Andere Aufgaben und Vorteile werden dem Fachmann auf dem Gebiet nach einer Durchsicht der darauffolgenden Beschreibung offensichtlich werden, welche mit einer Referenz auf die folgenden illustrativen Zeichnungen fortfährt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein Flußdiagramm, was kurz das Protokoll für die Präparation der ecotropen Erzeuger-Zellinie BOSC 23 der vorliegenden Erfindung vorträgt.
1B ist ein Flußdiagramm, welches das Protokoll für die Präparation der amphotropen Erzeuger-Zellinie CAK 8 der vorliegenden Erfindung im Überblick darstellt.
2 stellt die Ergebnisse von RT-Assays der Überstände aus Klonen von ANJOU-Zellen, die mit pCRIP^env- transfiziert wurden, dar. Individuelle Klone, die gegenüber Hygromycin resistent sind, wurden isoliert und der Überstand wurde mittels RT und einer exogenen Matrize untersucht (Goff et al., 1981). Positive Kontrollen sind: Überstand von 293T/17-Zellen, transfiziert mit pZAP (Wildtyp-Moloney-Virus, Shoemaker et al., 1981) und Überstand von CRE-Zellen (Danos and Mulligan, 1988). Die pZAP-transfizierten Überstände wurden 1:10 und 1:100 verdünnt, wie angezeigt. NIH 3T3-Überstand ist als eine negative Kontrolle beinhaltet.
3A zeigt, daß pGD^v-abl Virus-Infektion nahezu alle 3T3-Zellen transformiert. NIH 3T3-Zellen (5 × 10⁵-Zellen, ausplattiert am Abend vor der Infektion) wurden mit 1 ml des 48 Stunden Überstandes von pGD^v-abl transfizierten BOSC 23-Zellen infiziert. Der korrespondierende Neo-Titer betrug 2,9 × 10⁶/ml.
3B stellt die negative Kontrolle dar, welche pGD-infizierte 3T3-Zellen waren (pGD-Titer betrug 3,9 × 10⁶/ml). Die Photographien wurden 48 Stunden nach der Infektion aufgenommen.
3C stellt die Kinase-Aktivität von Fibroblasten dar, welche mit einem v-abl-retroviralen Vektor infiziert wurden. 3 μg von pGD^v-abl wurden in BOSC 23-Zellen bei Anwesenheit von 25 μM Chlorochin transfiziert, wie im Text beschrieben. 48 Stunden nach der Transfektion wurden 1 ml des Überstandes verwendet, um NIH 3T3-Zellen zu infizieren. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen lysiert und die in vitro abl-Kinase-Aktivität untersucht (Konopka and Witte, 1985). Der Immunopräzipitations-Antikörper war pEX-4 (Konopka and Witte, 1985). Vor der Immunopräzipitation war in der positiven Kontrolle N54 ungefähr halb soviel Protein wie in der 3T3-negativen Kontrolle und in pGD^v-abl infizierten Zellen. Die Proben wurden auf einem 7,5 % SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die phosphorylierten Proteine wurden mittels Autoradiographie für 12 Stunden mit einer Verstärkerfolie detektiert.
3D stellt die Kinase-Aktivität von Fibroblasten dar, die mit einem p210^bcr/abl retroviralen Vektor infiziert wurden. 3 μg von pGD210^bcr/abl wurden in BOSC 23-Zellen bei Anwesenheit von 25 μM Chlorochin transfiziert, wie im Text beschrieben. 48 Stunden nach der Transfektion wurden 1 ml des Überstandes verwendet, um NIH 3T3-Zellen zu infizieren. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen lysiert und in vitro auf abl-Kinase-Aktivität untersucht (Konopka and Witte, 1985). Der immunopräzipitierende Antikörper war pEX-4 (Konopka and Witte, 1985). Vor der Immunopräzipitation gab es ungefähr gleiche Mengen an Protein in der positiven Kontrolle 210W sowie in der pGD-infizierten negativen Kontrolle und den pGD210^bcr/abl-infizierten Zellen. Die Proben wurden auf einem 7,5 % SDS- Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die phosphorylierten Proteine wurden mittels Autoradiographie für 12 Stunden mit einer Verstärkerfolie detektiert.
4A und 4B stellen die Ergebnisse von histochemischer Färbung der Milz von Mäusen dar, die (a) MFG-lacZ-infiziertes Knochenmark und (b) pGD-infiziertes Knochenmark erhielten. Die Maus, die mit MFG-lacZ Knochenmark transplantiert wurde, erhielt 900 cGy und 5 × 10⁴ Knochenmark-Zellen. Die Maus, die mit pGD-Knochenmark infiziert wurde, erhielt 850 cGy und 5 × 10⁴ Knochenmark-Zellen (Die Färbung war auch negativ für die pGD-transplantierte Maus, welche 850 cGy und 1 × 10⁵ Knochenmark-Zellen erhielt.) Die Milzen wurden fixiert und gefärbt und Cryostat-Sektionen wurden geschnitten, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Vergrößerung beträgt 10X.
Detaillierte Beschreibung
Gemäß der vorliegenden Erfindung können konventionelle Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, welche zum durchschnittlichen Können in der Technik gehören. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt. Siehe z.B. Sambrook, et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc. New York, 1989); "DNA Cloning: A Practical Approach, "Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.B. Hames & S.J. Higgins ed 1985); "Transcription And Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney ed 1986); "Immobilized cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert, d.h. das zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle in der Lage ist.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie z.B. Plasmid, Phage oder Cosmid, an welches ein anderes DNA-Segment geknüpft werden kann, um die Replikation für das angeknüpfte Segment zu bewirken.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Deoxyribonukleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) in entweder ihrer Einzelstrang-Form oder einer Doppelstrang-Helix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die primäre oder sekundäre Struktur des Moleküls und limitiert es nicht auf irgendeine bestimmte tertiäre Form. Daher schließt dieser Begriff Doppelstrang-DNA ein, welche inter alia in linearen DNA-Molekülen (z.B. Restriktions-Fragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur von bestimmten Doppelstrang-DNA-Molekülen können hierin Sequenzen gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, indem nur die Sequenz in der 5' zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten Strangs der DNA (d.h. des Strangs, der eine Sequenz homolog zu der der mRNA aufweist) angegeben wird.
Eine DNA „kodierende Sequenz" ist eine Doppelstrang-DNA-Sequenz, welche transkribiert und translatiert wird in ein Polypeptid in vivo, wenn es unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen plaziert wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5' (Amino-)Terminus und ein Translations-Stop-Codon am 3' (Carboxyl-)Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann einschließen, aber ist nicht limitiert auf, prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z.B. Säugetier) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen. Ein Polyadenylierungs-Signal und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz werden üblicherweise 3' zu der kodierenden Sequenz lokalisiert sein.
Transkriptionale und translationale Kontroll-Sequenzen sind DNA-regulatorische Sequenzen, wie z.B. Promotoren, Verstärker, Polyadenylierungs-Signale, Terminatoren und ähnliche, die die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle zur Verfügung stellen.
Eine „Promoter-Sequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die zur Bindung von RNA-Polymerase in einer Zelle und Initiierung der Transkription einer stromab (3'-Richtung) kodierenden Sequenz in der Lage ist. Für die Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promoter-Sequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptions-Initiationsstelle begrenzt und erstreckt sich stromauf (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, die notwendig sind, um Transkription in Spiegeln zu initiieren, die über dem Hintergrund detektierbar sind. Innerhalb der Promotor-Sequenz werden sich eine Transkriptions-Initiationsstelle (üblicherweise z.B. durch Kartierung mit Nuklease S1 definiert) sowie Protein-Bindungsdomänen (Konsensus-Sequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind, gefunden werden. Eukaryotische Promotoren werden oftmals, aber nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen enthalten.
Eine kodierende Sequenz ist „unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche dann in das Protein, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird, translatiert wird.
Eine „Signalsequenz" kann vor der kodierenden Sequenz eingeschlossen sein. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zu dem Polypeptid, welches mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid auf die Zelloberfläche zu dirigieren oder das Polypeptid in das Medium zu sekretieren; dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle abgeschnitten, ehe das Protein die Zelle verläßt. Signalsequenzen können assoziiert mit einer Vielzahl von Proteinen gefunden werden, die nativ in Prokaryoten und Eukaryoten sind. Z.B. wird der α-Faktor, ein natives Hefeprotein, aus der Hefe sekretiert und seine Signalsequenz kann an heterologe Proteine angeknüpft werden, damit diese in das Medium sekretiert werden (siehe US-Patent 4,546,082; EP 0 116 201 , Veröffentlichungsdatum 12. Januar 1983; US-Patentanmeldung Seriennr. 522,909, angemeldet am 12. August 1983). Weiterhin wurde von dem α-Faktor-Leiter und seinen Analoga gefunden, daß sie heterologe Proteine von einer Vielfalt von Hefen sekretieren, wie z.B. Saccharomyces und Kluyveromyces ( EP 88 312 306.9 , angemeldet am 23. Dezember 1988; US-Patentanmeldung Seriennr. 139,682, angemeldet am 30. Dezember 1987 und EP-Veröffentlichung Nr. 0 301 669, Veröffentlichungsdatum 1. Februar 1989).
Eine Zelle wurde „transformiert" durch exogene oder heterologe DNA, wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA integriert (kovalent verbunden) werden, die das Genom der Zelle ausmacht. In Prokaryoten, Hefe und Säugetier-Zellen kann z.B. die transformierende DNA auf einem episomalen Element, wie z.B. einem Plasmid, beibehalten werden.
In Bezug auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle, eine Zelle, in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom integriert wurde, so daß sie von den Tochterzellen durch Chromosom-Replikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle demonstriert, Zellinien oder Klone zu etablieren, umfaßt von einer Population von Tochterzellen, die die transformierende DNA enthalten. Ein „Klon" ist eine Population von Zellen, die von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorgänger durch Mitose abgeleitet wurde. Eine „Zellinie" ist ein Klon einer primären Zelle, welche zum stabilen Wachstum in vitro für viele Generationen in der Lage ist.
Ein „Retrovirus" ist ein Virus, das genomische RNA enthält, welche die Bildung eines DNA-Moleküls leitet, welches wiederum als eine Matrize für die Produktion der mRNA für die Konstruktion von neuen Viren agiert. Ein „retroviraler Vektor/Konstrukt" ist ein infektiöser Retrovirus, der verwendet wird, um ein nicht-virales Gen in mitotische Zellen sowohl in vitro als auch in vivo einzuführen. Allgemeiner gesagt ist ein Virus ein zelluläres parasitisches Partikel, umfassend Nukleinsäure (entweder RNA oder DNA), welche innerhalb einer äußeren Hülle aus Protein, bekannt als das Capsid, enthalten ist. Das infektiöse Viruspartikel ist auch bekannt als ein „Virion". Wie hierin verwendet, beabsichtigt der Begriff „Virus" dementsprechend Retroviren innerhalb seines Umfanges einzuschließen.
Ein „viraler Bestand" („viral stock") ist der Virus-enthaltende Überstand, der aus Zellen präpariert wurde, die mit einem viralen Vektor oder Konstrukt transfiziert oder infiziert wurden. Solche Zellen schließen diejenigen ein, die hierin beschrieben und offenbart werden. Der Begriff „retrovirales Bestand" („retroviral stock") wird verwendet, wenn er sich auf infektiöse retrovirale Partikel bezieht, die auf diese Weise präpariert wurden.
„Replikations-kompetente" virale Konstrukte sind Konstrukte, die alle Gene behalten, die für strukturelle Virion-Proteine kodieren, sowie die cis-agierenden viralen Elemente, die für die Transmission notwendig sind. Ein Virus wird als „Replikations-inkompetent" betrachtet, wenn er einige oder alle Gene, die für strukturelle Virion-Proteine kodieren, deletiert hat oder wenn diese abwesend sind.
Ein „Helfer-Virus" ist ein Replikations-kompetenter Virus, der manchmal in Beständen von Replikations-inkompetentem Virus vorhanden ist. Im Fall der retroviralen Produktion, wie in der Praxis der vorliegenden Methode, ist die Anwesenheit von Helfer-Virus ein Kontaminationsstoff der wünschenswerterweise vermieden wird. Z.B. könnte, wenn Tier-Infektionen durchgeführt werden, Helfer-Virus zur Entwicklung einer nicht gewünschten pathologischen Bedingung in dem Wirt führen.
Ein „ecotroper" Retrovirus ist ein Virus, der ein murines virales Hüll-Glykoprotein trägt, das an den „ecotropen Rezeptor" bindet, der nur auf Ratten- und Maus-Zellen gefunden wird. Das ecotrope Glykoprotein erlaubt im Allgemeinen keine Infektion von humanen Zellen. Im Gegensatz dazu ist ein „amphotroper" Retrovirus ein Retrovirus, einschließlich eines murinen Virus, welcher die env-Gene der amphotropen Klasse von Glykoproteinen enthält und welcher an einen breiten Bereich von Wirten binden kann, einschließlich Nagetier, Maus, Mensch, Huhn, Hund, Katze und Nerz.
Die Begriffe „genetisches Material" und „genetisches Elemente) von Interesse" wie hierin verwendet, beziehen sich allgemein auf Nukleinsäuren (z.B. RNA und DNA) und weiter insbesondere auf solche Materialien, wie sie wünschenswerter Weise in eine Zielzelle eingeführt werden können durch Einführung innerhalb eines viralen Konstruktes, welches gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wird. Bestimmte „genetische Materialien/Elemente von Interesse" schließen die folgenden ein: Antisense-Nukleinsäure; DNA; mRNA; ribosomale RNA; rekombinante RNA; kleine Kern-RNAs; Nukleotide, die ein Mitglied kodieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Fragmenten von Proteinen, Antisense-Nukleinsäure; DNA, mRNA, ribosomale RNA, rekombinante RNA und kleine Kern-RNAs; Fragmente von einem der vorangehenden und Kombinationen davon.
Eine Zusammensetzung, umfassend „A" (wobei „A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, Vektor ist) ist im wesentlichen frei von „B" (wobei „B" eines oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektor etc. umfaßt), wenn mindestens 75 Gew% der Proteine, DNA oder Vektoren (in Abhängigkeit von der Kategorie der Spezies, zu welchen A und B gehören) in den Zusammensetzungen „A" ist. Bevorzugterweise umfaßt „A" mindestens 90 Gew% der A + B Spezies in der Zusammensetzung, am meisten bevorzugt 99 Gew%. Es wird auch bevorzugt, daß eine Zusammensetzung, welche im wesentlichen frei von Kontamination ist, nur eine einzelne molekulare Gewichtsspezies enthält, die die Aktivität oder das Charakteristikum der Spezies von Interesse aufweist.
In ihrem primären Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Präparation und die Verwendung von besonders manipulierten retroviralen Erzeuger-Zellinien, die von der Ad5-transformierten humanen embryonischen Zellinie 293 abgeleitet wurden, um als Verpackungs-Zellinie für die Präparation von retroviralen Beständen zu dienen, die ein genetisches Elemente) von Interesse enthalten, die von hohem Titer und frei von Helfer-Virus sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt demgemäß:

A. Präparieren einer Zellinie, die zur Präparation besagter viraler Bestände fähig ist;
B. transientes Transfizieren eines viralen Konstruktes, das besagtes genetisches Element von Interesse enthält, in die besagte Zellinie und
C. Ernten der viralen Bestände, die dadurch präpariert wurden.

Weiter insbesondere erstreckt sich die Erfindung auf die klonalen Zellinien, die früher hierin beschrieben wurden, die 293T/17, ANJOU 65, BOSC 23 und CAK 8 genannt werden, und auf Zellinien-Derivate davon. Die klonalen Zellinien der Erfindung ermöglichen die Präparation von großen Beständen an Retrovirus durch die vorliegende Methode, welche auf transienter Transfektion basiert. Alle Zellinien, die hierin offenbart und beansprucht werden, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Den ersten drei Zellinien wurde ein Hinterlegungsdatum vom 12. Februar 1993 und die folgenden Zugangs-Nummern zugeteilt. 293T/17 – Zugangs-Nr. CRL 11268; ANJOU 65 – Zugangs-Nr. CRL 11269; BOSC 23 – Zugangs-Nr. CRL 1170. CAK wurde bei der ATCC am 12. Februar 1994 hinterlegt und die Zugangs-Nr. zugeteilt.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf das Verfahren zur Präparation der klonalen Zelllinien durch Selektion und Isolation einer Quantität von geeigneten Zellen, wie z.B. den 293-Zellen, gefolgt durch die Einführung in solche Zellen von Konstrukten, wie z.B. Plasmiden, welche die Zellen fähig machen, Virus zu produzieren. Insbesondere enthalten die Plasmide Elemente, die die Verpackung des Virus durch die Replikation der viralen Sequenz gefolgt von der Einkapselung durch die Hüll-Funktion ermöglichen.
Einer der Aspekte der vorliegenden Methode umfaßt die sequentielle Einführung der Konstrukte, die die Zellinie befähigen, den Virus zu replizieren und zu verpacken, weil davon gefunden wurde, daß es die gewünschten Attribute des Helfer-Virus verleiht, ohne solche Konstrukte zu befähigen, Replikations-Kompetenz zu entwickeln. Außerdem wird die Erzeuger-Zellinie bevorzugt in einem bakteriellen antibiotischen Selektionsmedium gehalten, wie z.B. das gpt-Selektionsmedium, das hierin später beschrieben wird.
Die kennzeichnenden Charakteristika transienter Transfektion in eine hoch-transfizierbare Helfer-Erzeuger-Zellinie sind es, daß jede transfizierte Zelle zur Produktion der Retroviren beiträgt. Dabei kann in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung jede Zelle darauf gerichtet werden, verschiedene Viren aufzunehmen. Da 3 × 10⁶ Zellen, die mit 5 μg DNA (4 × 10¹¹ DNA-Molekülen bei einer Länge von 10 kb) transient transfiziert wurden bei einer Effizienz von 66 %, bis zu 10⁷ Retrovirus/ml produzieren, produziert jede transfizierte Zelle ungefähr 0,5 infektiöse Viren pro ml. Daher wird dieser Ansatz die effiziente Einführung einer retroviralen Expressions-Bibliothek in die Ziel-Zellen erlauben.
Wie vorher erwähnt und in größerem Detail hierin später beschreiben, erstreckt sich die Erfindung auf virale Bestände, die durch die vorliegende Methode präpariert werden, sowie auf die kultivierten Zellen und Vakzine, die unter der Verwendung solcher Bestände präpariert werden. Ebenso können genetische Anomalien oder Dysfunktionen behandelt werden, und zwar durch die Präparation eines wiederherstellenden genetischen Konstruktes innerhalb eines Virus mittels der vorliegenden Methode, gefolgt von der Verabreichung eines solchen Konstruktes, um auf Zellen abzuzielen, um residente Anomalien oder Dysfunktionen zu behandeln. Kultivierte Zellen können mit multiplen und verschiedenen viralen Konstrukten infiziert werden, um korrespondierend multiple genetische Änderungen zu simulieren.
Zusätzlich erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung von bestimmten der Zellinien, die während der Präparation von BOSC 23 und CAK 8 zwischendurch entwickelt wurden und die unabhängige Nützlichkeit bei der Präparation von alternierenden Vektoren von Interesse besitzen. Z.B. kann die ANJOU 65-Zellinie verwendet werden, um eine Erzeuger-Linie für bestimmte alternierende Viren zu präparieren, wie z.B. amphotrope und Pseudotyp-Retroviren, welche bei der Infektion von Säugetier- und anderen Spezies, einschließlich Menschen, nützlich sein werden. Insbesondere, und wie hierin beschrieben, wurde ANJOU 65 verwendet, um die amphotrope Erzeuger-Zellinie CAK 8 zu präparieren. Und gleichermaßen betrachtet die Erfindung die Präparation eines Pseudotyp-Retrovirus, wie z.B. der einschließlich eines Hüll-Konstruktes, abgeleitet aus vesikulärem Stomatitis Virus (VSV), wie in Burns et al. supra, diskutiert.
Wie hierin früher und oben beschrieben, bietet die vorliegende Erfindung signifikante diagnostische und therapeutische Anwendungen. Die Vektoren oder Konstrukte, die mittels der Erfindung präpariert wurden, können in Studien von bestimmten Tier-Erkrankungs-Modellen verwendet werden, z.B. β-Thalassämie oder Gaucher Erkrankungen, welche in Anstrengungen zur Entdeckung von Wirkstoffen dienen können. Gleichermaßen können therapeutische Protokolle entwickelt werden, um bestimmte therapeutisch aktive Gene an Wirtszellen mit Bedarf dafür zu liefern, und zwar durch Mittel der direkten an vivo Einführung von retroviralen Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurden. Die Fähigkeit, solche Gentherapie zu verabreichen, findet besondere Nützlichkeit in Organen, wie dem Knochenmark, deren Zellen von einer Population von pluripotenten Vorläufer-Zellen abgeleitet werden. Und die Erfindung erstreckt sich auf eine Methode, die Knochenmark-Transplantation einschließt. Normalerweise kann die Erfindung Nützlichkeit bei der Adaptation an andere Organe finden, wo ähnliche Strategien möglich sind. Das obere wird im Wege der Illustration und nicht der Einschränkung präsentiert.
Die Erfindung betrachtet korrespondierender Weise Zusammensetzungen für die Verabreichung gemäß der zuvor beschriebenen Verfahren, umfassend geeignete Einheits-Dosierungen von Vektoren oder infektiösen Konstrukten, die gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurden. Vorbestimmte Quantitäten eines bestimmte retroviralen Vektors oder infektiösen Konstruktes können präpariert und verabreicht werden gemäß geeigneter Protokolle für solch eine Therapie. Die exakten Quantitäten werden mit der bestimmten Therapie variieren und sind variabel im Rahmen des Ermessens des fachmännischen Arztes.
Die Anwendungen der Verfahren und Materialien der Erfindung sowohl auf dem medizinischen als auch auf dem biotechnologischen Gebiet werden in größerem Detail unten diskutiert:
GENTHERAPIE: Die Erfindung erlaubt die schnelle Produktion von Helfer-freien retroviralen Beständen mit hohem Titer, die genetische Elemente von Interesse exprimieren, wie hierin definiert. Solche genetischen Elemente schließen solche ein, die für Proteine, Teile von Proteinen, Messenger-RNAs, ribosomale RNAs, kleine Kern-RNAs, manipulierte RNAs und Proteine, Antisens-Nukleotide sowie anderes genetisches Material kodieren; wovon sich alle unter der Kontrolle von genetischen regulatorischen Elementen befinden. Die Mängel der bisherigen Gentherapie-Ansätze schließen die zeitaufwendige Kreation von stabilen Zellinien (mehr als ein Monat wird benötigt) und die Schwierigkeit der Generation von retroviralen Erzeuger-Linien mit hohem Titer ein. Die vorliegende Methode überwindet diese zwei haupt sächlichen Limitationen und wird daher in großem Maße die Einführung von rekombinanten Retroviren in Zielzellen zum Zweck der Bereitstellung medizinischer Therapie ermöglichen.
Die Produktion von Helfer-freien retroviralen Beständen mit hohem Titer in sehr kurzer Zeit (2 bis 3 Tage) durch die vorliegende Methode beschleunigt die Gentherapie-Technologie und macht sie in einigen Fällen erst möglich. Spezifische Schritte für die Gentherapie, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, sind (1) die notwendige Testung von multiplen unterschiedlichen genetischen Konstrukten in verschiedenen Zelltypen hinsichtlich deren Effizienz bei der spezifischen Proteinproduktion, deren zelluläre Toxizität und deren Zelltyp-Spezifität, (2) Anpassung der Retroviren an spezifische Patienten-Bedürfnisse und (3) Produktion von Helfer-freien Retroviren mit hohem Titer für die Verwendung in Genaustausch, Kontemplation von genetischen Defekten, Chemotherapie und der Behandlung von infektiösen Erkrankungen, wie z.B. HIV.
KRANKHEITS- UND ENTWICKLUNGS-MODELLE: Ein anderes Gebiet, auf welchem die Erfindung angewendet werden kann, ist die Entwicklung von Modellen humaner und Tiererkrankung. Wie oben diskutiert, machen es die Limitationen der derzeitigen Methodologien schwierig, Modelle von Erkrankungen zu etablieren, welche aus Infektion, Transformation oder anderen Störungen in einer seltenen Zielzelle resultieren. Die Verwendung der Erfindung sollte die Schaffung von Modellen für solche Erkrankungen, wie chronische myelogene Leukemie, aplastische Anämie, HIV, sowie Karzinogenese in frühen Stadien ermöglichen. Indem man erlaubt, daß dieselbe Zelle mit multiplen retroviralen Vektoren infiziert wird, kann unsere Erfindung auch das Studium von Erkrankungen erlauben, welche von multiplen genetischen Änderungen resultieren. Diese Methodologie macht es möglich, schnell eine Anzahl von genetischen Konstrukten zu testen, um Erkrankungs-Pathogenese aufzugliedern.
Durch den Einsatz einer transienten Transfektions-Methode für die Produktion von Helferfreiem Retrovirus mit hohem Titer wird die Erfindung die Einführung von genetischem Material in multiple unterschiedliche Zelltypen ermöglichen. Solche Gewebetypen schließen explantiertes Patientengewebe, tierisches Gewebe und Zellinien ein. Die biologische Aktivität von verschiedenen Konstrukten und deren Effekte auf zellulären Physiologie können schnell erforscht werden.
Die Erfindung macht es auch möglich, unter der Verwendung der Viren mit hohem Titer Entwicklung zu studieren, um spezifische Zelltypen, sogar wenn sie selten sind, zu markieren. Das Studium der Nachkommen von Zellen, die den Marker enthalten, sollte die Aufgliederung von Entwicklungs-Stoffwechselwegen erlauben. Gleichermaßen sollte es möglich sein, seltene Zellen in einer Population zu markieren, wie z.B. verbleibende Tumorzellen nach der Behandlung.
PROTEIN-HERSTELLUNG: Die Erfindung erlaubt spezifische Protein-Produktion aus Zelltypen von Interesse, einschließlich primärer Zellen und kultivierter Säugetier-Zellinien. Die Methode umfaßt die Präparation eines viralen Bestandes, enthaltend das genetische Material oder Element von Interesse, gefolgt durch die Einführung des viralen Bestandes in eine zelluläre Ziel-Kolonie für die Produktion des gewünschten Proteins. Die Verfahren, die derzeitig verwendet werden, leiden sowohl unter dem Erfordernis, stabile Zellinien herzustellen, als auch der potentiellen Langzeit-Toxizität auf die produzierende Zelle durch das generierte Produkt.
Für pharmazeutische Zwecke können diese Viren verwendet werden, um geeignete Zelltypen zu infizieren. Diese Zellen produzieren dann große Quantitäten des relevanten Proteins mit geeigneten Gewebe-spezifischen Modifikationen. Wenn z.B. Glykosylierung für die Funktion eines bestimmten Proteins notwendig ist, kann dieses Protein diese Modifizierung nach der Infektion des geeigneten Zelltypes durchlaufen.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um retrovirale Konstrukte zu produzieren, welche für die Immunisierung verwendet werden können. Die Einführung von antigenem Material durch Viren für die Produktion von Vakzinen wurde lange Zeit benutzt, um Immunität in Vakzin-Empfängern zu stimulieren. Retrovirale Konstrukte, die spezifisches antigenes Material exprimieren, können unter der Verwendung der vorliegenden Methode schnell mit hohem Titer präpariert werden. Diese Viren können als Vakzine verwendet werden, um Immunität direkt zu induzieren, oder können verwendet werden, um geeignete Empfängerzellen zu infizieren, um große Quantitäten des spezifisch modifizierten Proteins zu produzieren.
GEN-ISOLIERUNG: Die Erfindung sollte in großem Maß die Fähigkeit erhöhen, Gene aus cDNA-Bibliotheken zu isolieren und deren Funktion zu identifizieren. Aufgrund der schnel len Produktion von Viren mit hohem Titer sollte es nun möglich sein, die Produkte von cDNA-Bibliotheken zu exprimieren, indem diese in retrovirale Vektoren kloniert werden, welche dann in eine der klonalen Erzeuger-Zellen, die hierin offenbart werden, transfiziert werden. Diese Viren können dann eine Ziel-Population infizieren und dann wird das Produkt nach den Kriterien von Interesse selektiert. Z.B. können Gene, die auf der Oberfläche exprimiert werden, durch FACS identifiziert werden oder Zellinien, die mutant in einem defektiven Gen sind, können mit einer retroviralen Bibliothek aus einer Wildtyp-Gewebequelle komplementiert werden. Gleichermaßen können dominant negative und dominant positive Mutationen von Polypeptiden durch geeignete Selektion identifiziert werden. Nachdem die Zellen selektiert wurden, ist es relativ leicht, die cDNA zu identifizieren, die für den Effekt verantwortlich ist, weil sie als ein integrierter Provirus von bekannter genetischer Struktur existiert.
PRODUKTION VON ANDEREN VIREN: Ein ähnlicher Ansatz zu demjenigen, der hierin für die Produktion von Helfer-freien ecotropen Retroviren beschrieben wird, ist für die Produktion von anderen Typen an Retroviren sowie anderen Typen von Viren möglich. Amphotrope und Pseudotyp-Retroviren können für die Transfektion des geeigneten Hüll-exprimierenden Konstruktes in ANJOU 65-Zellen einfach hergestellt werden. Die Präparation und Verwendung der CAK 8-Zellinie ist illustrativ für die vorhergehende. Die Selektions-Methode wird ermöglicht durch Selektieren derjenigen Klone mit hoher Hüll-Produktion am FACS (Nolan and Pear, unveröffentlicht). Diese amphotropen und Pseudotyp-Viren werden für die Infektion von humanen und Zellinien anderer Spezies essentiell sein.
Um das Potential zur Erzeugung von Replikations-kompetentem Virus zu verringern, kann es möglich sein, die Verpackungs-Funktionen aus Konstrukten zu exprimieren, welche keine Homologie mit den retroviralen Vektoren enthalten. Markowitz und Banks haben gezeigt, daß es möglich ist, Retroviren mit hohem Titer durch Plazieren der Verpackungs-Funktionen auf zwei verschiedenen Plasmiden zu produzieren, deren einziges Gebiet der Homologie außerhalb der 5' LTR eine kleine Region der Überlappung mit dem 5'-Teil des Hüllgens war (Markowitz et al., 1988). Diese Vektoren enthalten viel weniger Homologie zueinander als die CRIP-Vektoren, welche ausgiebige Homologie über das retrovirale Genom hinweg teilen. Es sollte möglich sein, den Ansatz von Markowitz und Bank weiter zu modifizieren durch Ersetzen der 5' LTRs mit Promotoren, wie z.B. mit CMV, die keine Homologie mit dem 5' LTR des retroviralen Vektors teilen. Dies sollte die Möglichkeit der Rekombination, welche zu Replikations-kompentendem Retrovirus führt, um mehrere Größenordnungen reduzieren.
Es wird in Erwägung gezogen, daß sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von hohen Titern an Viren erstreckt, die andere als Retroviren sind. Dies schließt solche potentiellen Gentherapie-Vektoren ein wie Adenovirus und Herpes-Viren. Wenn man in der Lage ist, die Verpackungs-Funktionen in eine 293-abgeleitete Zellinie einzubauen, sollte es möglich sein, transient eine große Vielfalt von Helfer-freien Viren mit hohem Titer zu produzieren.
KITS: Die Erfindung findet auch breite Anwendung in anderen Gebieten der rekombinanten DNA-Technologie. Ein bedeutender Aspekt der Technologie ist die Einführung von genetisch manipulierten Konstrukten in Zellen und die Untersuchung der nachfolgenden Effekte. Ein Testkit kann demgemäß präpariert werden, der verwendet werden kann, um die Aktivität des genetischen Materials oder Elements/Elemente von Interesse auf eine zelluläre Ziel-Population zu messen und zu untersuchen, welcher eine der Zellinien der Erfindung in Kombination mit Reagenzien für optimale Transfektion umfasst. Die vorliegende Erfindung verbessert in starkem Maße die Einführung von genetischem Material in Säugetierzellen. Es ist vorgesehen, daß Kits für den schnellen Assay von Gen-Funktion und den Effekten der Protein-Produktion von Säugetierzellen entwickelt werden kann. Spezifische Verwendungen für solche Kits schließen ein: (1) Analyse von Genreporter- und Inducer-Konstrukten, (2) schnelle Analyse von Mutanten-Konstrukten und deren biologischer Funktion und (3) Produktion von biologisch relevantem Protein in einer Forschungs-Situation. Das System wurde schon verwendet, um Proteine in Zellen überzuexprimieren, um die subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen, und die Verwendung von Reporter-Konstrukten, basierend auf Retroviren, um transkriptionelle Funktion zu untersuchen, wurde schon etabliert.
Die vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden nach einer Durchsicht der folgenden illustrativen Beschreibung, die die Details der präparierten Zellinien und der eingeführten Konstrukte und der Verfahren, die deren Entwicklung und Validierung folgen, präsentiert. Spezifische Beispiele werden danach präsentiert.
Materialien und Methoden
Zellinien und Plasmide. 293T-Zellen (DuBridge et al., 1987), die ursprünglich als 293tsA1609neo bezeichnet wurden, wurden von S. Haase (Stanford) erhalten und in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), enthaltend 10 % (vol/vol) fötales Kalbsserum, aufgezogen. Wirkstoff-Selektionen in transfizierten 2937-Zellen wurden mit 400 ng/ml Hygromycin (Calbiochem) bei Hygromycin-Resistenz und 50 ng/ml Mycophenolsäure bei gpt-Resistenz durchgeführt. Individuelle Klone wurden isoliert mittels sterilen Klonierungs-Ringen und auf 24-Well-Platten transferiert. Die folgenden Zellinien, alle aufgezogen in DMEM, enthaltend 10 % (vol/vol) Kalbserum, wurden verwendet: NIH 3T3, BAG (Price et al., 1987), N54 (Jackson and Baltimore, 1989) und 210W (Lugo and Witte, 1989).
Die folgenden Plasmide wurden verwendet: pBND 8 (Turner and Cepko, unveröffentlicht), ein retroviraler Vektor abgeleitet von dem BAG-Vektor (Price et al., 1987), in welchem β-Galaktosidase-Expression durch den viralen Promotor in der LTR gesteuert wird und die neo-Kassette deletiert ist, pSPUD (Walsh and Cepko, 1988), pCRIP^env- (Danos and Mulligan, 1988), pCRIP^gag-2 (Danos and Mulligan, 1988), pCRIP^amgag (Danos and Mulligan, 1988), MFG-lacZ, ein retroviraler Vektor, der zusätzliche Verpackungs-Sequenzen aus der gag-Region enthält (Bender et al., 1987) und β-Galaktosidase aus der retroviralen LTR exprimiert (Spain et al, unveröffentlicht), MFG-tPA, (ähnlich zu MFG-lacZ, der aber das humane tPA-Gen anstelle von β-Galaktosidase exprimiert, (Spain et al., unveröffentlicht), pZAP (Shoemaker et al., 1981), pSV2Hgm (Bernard et al., 1985), GPT2E (Jasin and Berg, 1988), pGD (Daley et al., 1990), pGD^v-abl (Scott et al., 1991) und pGD210^bcr/abl (Daley et al., 1990) wurden zuvor beschrieben. Alle Plasmide wurden in Escherichia coli DH5α aufgezogen.
Enzymatische Assays und Nukleinsäure-Prozeduren. Färbung auf β-Galaktosidase-Aktivität in intakten Zellen und Milz wurde gemäß MacGregor et al. (MacGregor et al., 1990) durchgeführt. Der FACS-gal Assay wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Nolan et al., 1988). Die Aktivität der reversen Transkriptase wurde in dem Kulturmedium von exponentiell wachsenden Zellen untersucht, wie beschrieben von Goff et al. (Goff et al., 1981). Die in vitro abl-Kinase-Assays wurden durchgeführt, wie von Konopka et al. beschrieben, unter der Verwendung von Anti-pEX4 als immunopräzipitierender Antikörper (Konopka and Witte, 1985). Die Isolierung von DNA und Blot-Analyse wurden mittels Standard-Prozeduren durchgeführt (Ausubel et. al., 1989).
Transfektionen, Infektionen und Bestimmung von viralen Titern. Außer in den Fällen, wo es anderweitig angegeben ist, wurde Transfektion von Calciumphosphat/DNA-Ko-Präzipitaten in 60 mm Schalen durchgeführt, in die 1,5–2,5 × 10⁶ 293T-Zellen (oder Derivate) in 4 ml DMEM mit 10 % FCS am Abend vor der Transfektion ausplattiert wurden. Chlo rochin wurde zu diesem Medium in einer Endkonzentration von 25 μM ungefähr 15–30 Minuten vor der Addition der DNA/HBS-Lösung addiert. Entweder 250 ml oder 500 ml HBS (pH = 7,05) wurden zu einem gleichen Volumen von DNA/CaCl₂-Lösung durch Sprudeln für 10 Sekunden addiert und die resultierende Lösung wurde sofort zu dem obigen Medium addiert, wonach die Zellen in den 37°C-Inkubator (5 % CO₂) zurück gebracht wurden (Heinzel et al., 1988). Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion wurde das Medium gegen 3 ml frisches DMEM, enthaltend 10% FCS, gewechselt. Vierundzwanzig bis achtundvierzig Stunden danach wurde das Medium entfernt und durch einen 0,45 μm Filter filtriert oder bei 1500 U/min für 5 Minuten in einer Sorvall RT6000B Zentrifuge zentrifugiert. In Experimenten mit Chorochin wurde das Medium gegen 10 % FCS 10 Stunden nach der Transfektion gewechselt und ein zweites Mal 24 Stunden nach der Transfektion gewechselt.
Infektionen fanden in einem Gesamtvolumen von 3 ml an 10% CS, enthaltend 8 μg/ml Polybren, statt, die zu den 373-Zellen addiert wurden, die in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen auf einer 10 cm Schale am Abend vor der Infektion ausplattiert wurden. Sieben ml des Mediums, enthaltend 10 % CS, wurden zu den Schalen nach 3 Stunden addiert und die Zellen wurden 48 Stunden später auf β-Galaktosidase-Aktivität gefärbt. Der virale Titer wurde als die durchschnittliche Anzahl von blauen Zellen pro 10–25 Hochleistungs-Feldern (40.000–100.000 Gesamtzellen) multipliziert mit der Vergrößerung bestimmt oder es wurde, wenn Fax-Analyse durchgeführt wurde, der Prozentsatz von positiven Zellen mit der Gesamtzahl der Zellen multipliziert. G418-Selektion wurde durchgeführt, wie oben, außer, daß 48 Stunden nach der Infektion die Zellen 1:10 in selektives Medium aufgeteilt wurden, alle 3 Tage wieder gefüttert wurden und Kolonien 12 Tage später gezählt wurden. Bei der Bestimmung des G418-Titers wurden die Anzahl der Kolonien durch 4 geteilt, um 2-Zell-Verdoppelungen in Betracht zu ziehen.
Helver-Virus-Assay. 1 ml Überstand aus transfizierten BOSC 23-Zellen wurde verwendet, um BAG-Zellen zu infizieren, wie oben beschrieben, und die Zellen wurden alle 3–4 Tage 1:10 aufgeteilt. Um den Titer an Virus zu bestimmen, der verwendet wurde, um die BAG-Zellen zu infizieren, wurde 1 ml des viralen Überstandes von den transfizierten BOSC 23-Zellen parallel dazu verwendet, um 3T3-Zellen zu infizieren, welche auf β-Galaktosidase oder G418-Resistenz untersucht wurden. Wenn die Passage 3, 5 und 10 der BAG-infizierten Zellen ungefähr 50 % Konfluenz erreicht hatte, wurde das Medium gewechselt und 24 Stunden später wurden 3 ml des Überstandes filtriert (0,45 μM) und verwendet, um 3T3-Zellen zu infizie ren, welche 48 Stunden später auf β-Galaktosidase-Aktivität gefärbt wurden. Für das 293T/17-Experiment wurden 5 μg von pCRIP^env-, pCRIP^gag-2 und pBND 8 in 293T/17-Zellen ko-transfiziert und 1 ml des viralen Überstandes wurde verwendet, um die BAG-Zellen zu infizieren. Die BAG-Zellen wurden behandelt, wie oben, außer daß das β-Galaktosidase-Färben nur mit Zellen der Passage 3 durchgeführt wurde.
Knochenmarks-Transplantation. Knochenmarks-Transplantation wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Daley et al., 1990). 11 Monate alte weibliche Balb/c Mäuse waren Empfänger und die Donoren waren 11 Monate alte männliche Balb/c Mäuse, behandelt mit 2 ng 5-Fluorouracil (5-FU) 4 Tage vor der Knochemarks-Ernte. Ko-Kultivierung wurde durchgeführt in WEHI-3B konditioniertem Medium mit BOSC 23-Zellen, welche mit 6 μg MFG-lacZ vor der Ko-Kultivierung transfiziert worden waren. Nicht-adhärente Zellen wurden 48 Stunden später entfernt und in die laterale Schwanzvene der Empfänger-Mäuse injiziert, welche 850 oder 900 cGy (2 Dosen, aufgeteilt durch 3 Stunden) bei Zell-Konszentration im Bereich von 2,5 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ pro Maus erhalten hatten. Überlebende Mäuse wurden am Tag 13 geopfert und die Milz wurde analysiert.
Beispiel 1
Die Produktion von retroviralen Beständen mit hohem Titer durch transiente Transfektion erscheint limitiert zu sein durch die Transfizierbarkeit der Erzeuger-Zellen, dem Typ der Expressions-Produkte und der Kopienzahl der eingeführten Konstrukte. Frühere Studien in diesem Labor haben gezeigt, daß die Ad5-transformierte embryonische Nierenzellinie 293 (Graham et al., 1977) signifikant besser transfizierbar war als NIH 3T3-Zellen, die Zellinie von welcher die meisten Erzeuger-Zellinien abgeleitet wurden. Als ein Ergebnis wurde die Hypothese aufgestellt, daß die transiente Transfektion einer Erzeuger-Linie, basierend auf 293-Zellen, retrovirale Vektoren mit höheren Titern produzieren würde, als die transiente Transfektion von 3T3-basierten Erzeuger-Zellinien.
Um die Chancen zu maximieren, transient retrovirale Vektoren mit hohem Titer zu erhalten, wurde das System unter der Verwendung der 293T-Linie entwickelt, einer 293-Sublinie, welche das große T-Antigen von SV40 enthält (DuBridge et al., 1987). Da 293T das große T enthält, sollte die Kopienanzahl und der virale Titer des Konstruktes, enthaltend einen SV40-Ursprung der Replikation, erhöht sein. Zusätzlich wurden Vektoren, die auf murinem Molo ney Leukämie-Virus basieren, ausgewählt, weil diese Vektoren zur Produktion von Titern höher als 10⁶/ml in den besten stabilen Erzeuger-Zellinien fähig sind (Miller, 1990).
Um die Hypothese zu testen, daß transiente Transfektion von 293-Zellen verwendet werden kann, um retrovirale Vektoren mit hohem Titer zu produzieren, wurde anfänglich untersucht, ob es möglich ist, retrovirale Vektoren mit hohem Titer bei der Anwesenheit von Helfer-Virus zu erhalten. Als ein erster Schritt wurde die Zellinie 293T durch Limitieren der Verdünnung kloniert, um zu versichern, daß die Ausgangs-Population einheitlich hochtranfizierbar war. 14 unabhängige Klone wurden durchsucht durch Transfizieren eines Replikations-defekten retroviralen Konstruktes, daß das lacZ-Gen enthält, pBND 8 (Turner and Cepko, unveröffentlicht). 48 Stunden später wurden Zellen von jedem Klon histochemisch gefärbt, um das lacZ-Gen-Produkt zu detektieren. Mehr als 50 % der Zellen von 9 Klonen und von der älterlichen Population exprimierten β-Galaktosidase, wohingegen weniger als 25 % der Zellen der 5 verbleibenden Klone positiv färben (Daten nicht gezeigt).
Um zu bestimmen, welcher Klon den höchsten infektiösen retroviralen Titer ergab, wurden 7 der 9 Klone, die hohe Transfizierbarkeit zeigten, auf infektiösen Retrovirus untersucht. Das Assay-System bestand darin, equimolare Mengen (3 μg) von pBND 8 und eines Klons des Replikations-kompetenten Moloney MuLV (pZAP (Shoemaker et al., 1981)) zu kotransfizieren in 5 × 10⁵ Zellen des bestimmten 293T-Subklons, welcher 16–24 Stunden vorher ausplattiert worden war. 48–72 Stunden nach der Transfektion wurden 1 ml des viralen Überstandes verwendet, um 3T3-Zellen zu infizieren, welche 48 Stunden nach der Infektion auf β-Galaktosidase gefärbt wurden. Unter der Verwendung dieses Assays ergaben 3 Klone den höchsten Titer von ungefähr 1,5 × 10⁶ (Daten nicht gezeigt). Einer dieser Klone (im nachfolgenden als 293T/17 bezeichnet) wurde für die weitere Analyse ausgewählt. In nachfolgenden Experimenten waren wir in der Lage, einen retroviralen Titer von 4,6 × 10⁶ nach der Transfektion von 2 × 10⁶ 293T/17-Zellen mit 7,5 μg von sowohl pBND 8 als auch pZAP zu erhalten. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 1 präsentiert.
Tabelle 1 Retrovirale Produktion von BOSC 23 und Vorläufer-Zellen nach der Transfektion
Bemerkungen:

^a: Anwesenheit oder Abwesenheit von 25 μM Chlorochin, wie in Materialien und Methoden beschrieben.
^b: Infektiöser Titer pro ml (βgal positive Zellen)
^c: Anwesenheit oder Abwesenheit von Replikations-kompetentem Virus, wie in Materialien und Methoden beschrieben.
^d: 60% der Zellen wurden transfiziert, wie durch FACS untersucht (siehe Materialien und Methoden)
^e: Volumen aller Transfektions-Reagenzien war verdoppelt
^f: 302 % der Zellen waren transfiziert, wie durch FACS untersucht (siehe Materialien und Methoden)
^g: Titer, bestimmt durch G418-Resistenz
^h: Keine Titer, aber parallel transfiziertes MFG-lacZ ergab einen Titer von 7 × 10⁶/ml

Diese Ergebnisse zeigten, daß es möglich war, retrovirale Vektoren mit hohem Titer durch transiente Transfektion von 293-Zellen zu erhalten.
Beispiel 2
Strategie für die Erzeugung der ecotropen Helfer-freien Zellinie: Der nächste Schritt bestand darin, eine Helfer-freie Erzeugerlinie aus der 293T/17-Sublinie herzustellen. Die Präparation einer ecotropen Zellinie wird in 1A im Überblick dargestellt. Für die Strategie dieser Schaffung einer Helfer-freien Erzeuger-Zellinie wurde bestimmt, daß Plasmide, die die Moloney Verpackungs-Funktionen enthalten, in die 293T/17-Zellinie stabil transfiziert werden. Um dies zu erreichen, wurde ein Satz von Plasmiden, pCRIP^env- und pCRIP^gag-2, verwendet, um die Moloney Verpackungs-Funktionen in zwei Plasmide zu plazieren (Danos and Mulligan, 1988). pCRIP^env- enthält eine Mutation in der Hüll-Region und exprimiert sowohl gag als auch pol-Produkte. pCRIP^gag-2 enthält Mutationen in der gag-Region und exprimiert nur die ecotrope Hülle (Danos and Muligan, 1988). Zusätzlich wurde die Retrovirus-RNA-Verpackungsstelle deletiert und die 3' LTR wurde in beiden Plasmiden durch eine SV40 polyA-Stelle ersetzt (Danos and Mulligan, 1988). Mit diesen multiplen Veränderungen sind für die Generation von Helfer-Virus mehr als 2 Kreuzungs-Ereignisse notwendig, sogar bei der Verwendung von gag⁺-Vektoren, wie z.B. MFG (Danos and Mulligan, 1988).
Um die Helfer-freie Erzeuger-Zellinie zu schaffen, wurde entschieden, die pCRIP^env- und pCRIP^gag-2-Konstrukte eher nacheinander als simultan einzuführen, um das Risiko der Rekombination und Produktion von Replikations-kompetentem Virus zu verringern (Danos and Mulligan, 1988). Dementsprechend wurde das gag-pol exprimierende Konstrukt pCRIP^env in 293T/17-Zellen eingeführt und der Klon mit der höchsten Aktivität an reverser Transkriptase wurde selektiert. Nachfolgend wurde pCRIP^gag-2, welches die ecotrope Hülle exprimiert, in die pCRIP^env Zellinie eingeführt und die resultierenden Zellinien wurden auf die Fähigkeit, infektiösen Retrovirus nach der Transfektion des retroviralen Vektors der Wahl zu produzieren, durchsucht.
Beispiel 3
Erzeugung der ANJOU-Zellen: Der erste Schritt bei der Erzeugung der Helfer-freien Linie war es, eine Zellinie zu schaffen, die hohe Spiegel an gag-pol exprimiert. Um dies zu errei chen, wurden 6 μg des Plasmids pCRIP^env, das mit AseI linearisiert wurde, in 293T/17-Zellen zusammen mit 3 μg eines Plasmids transfiziert, das Hygromycin-Resistenz als einen selektierbaren Marker kodiert. Individuelle Kolonien, die in Hygromycin-Selektionsmedium aufgezogen wurden, wurden aufgepickt und auf reverse Transkriptase-Aktivität durchsucht (Goff et al., 1981). Von den 175 untersuchten Klonen produzierten 4 Klone ähnliche oder größere Mengen an reverser Transkriptase als CRE-Zellen, eine 3T3-abgeleitete Erzeuger-Zellinie, die durch die Transfektion der pCRIP^env- und pCRIP^gag-2-Konstrukte hergestellt wurde (Danos and Mulligan, 1988). Die beste gag-pol produzierende Zellinie, Nr. 65 (nachfolgend als ANJOU 65 bezeichnet) produzierte reverse Transkriptase in einem Spiegel, der 10 mal höher war als der von CRE und 1/10 des von Moloney Wildtyp-Virus betrug (2). Die reverse Transkriptase-Aktivität von ANJOU 65 verblieb stabil für mindestens 5 Passagen, sogar wenn die Zellen ohne Hygromycin-Selektion aufgezogen wurden. Transiente Transfektion von ANJOU 65-Zellen mit pBND 8 und dem Hüll-exprimierenden Konstrukt pCRIP^gag-2 ergaben einen retroviralen Titer von 1,5 × 10⁵ (Tabelle 1).
Beispiel 4
Erzeugung der BOSC 23-Zellen: Der nächste Schritt bei der Erzeugung der Helfer-freien Zellinie war es, das ecotrope Hüll-Konstrukt zu transfizieren und die Zellinie zu selektieren, die die höchsten Titer von infektiösem Retrovirus produziert. ANJOU 65-Zellen wurden mit 10 μg des AseI linearisierten, die ecotrope Hülle kodierenden Konstruktes pCRIP^gag-2 und 5 μg des Plasmides, das das selektierbare Marker-Gen für gpt-Resistenz kodiert, gpt2E (Jasin and Berg, 1988) transfiziert. Die Zellen wurden anfänglich in gpt-Selektionsmedium aufgezogen (Mulligang and Berg, 1981); wenn individuelle Klone jedoch ausreichende Dichte erreicht hatten, um auf 10 cm Platten zu wachsen, wurde die Selektion entfernt und sie wurden durchsucht, wie in Materialien und Methoden beschrieben.
Kurz gesagt, wurden Klone, die als 2 × 10⁶-Zellen 16–24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert wurden, mit 3 μg pBND transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurde 1 ml von „Virus"-enthaltendem Überstand verwendet, um 3T3-Zellen zu infizieren, welche 48 Stunden nach der Infektion auf β-Galaktosidase untersucht wurden. Von 70 durchsuchten Klonen produzierten nur 6 Klone Virus mit einem Titer von größer als 10⁴/ml. Von diesen 6 Klonen produzierten 2 Klone Virus mit einem Titer von größer als 10⁵/ml und ein Klon, Nr. 96 (nachfolgend als BARTLETT 96 bezeichnet) produzierte Virus von mehr als 10⁶/ml (1,6 × 10⁶/ml; siehe Tabelle 1 oben).
Weil BARTLETT 96 und zwei subklonierte Linien eine Verringerung in der Fähigkeit demonstrierten, Retrovirus über die Zeit zu verpacken, wenn sie ohne gpt-Selektion aufgezogen wurden (Tabelle 1 und Daten nicht gezeigt), erschien es, daß die gpt-Selektion für die Beibehaltung des Phänotyps des hohen Titers dieser Sublinie notwendig sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden Zellen der Passage 2 der BARTLETT 96-Linie aufgetaut und durch limitierende Verdünnung kloniert, entweder bei Anwesenheit oder Abwesenheit von gpt-Selektion. Für diese Experimente wurde MFG-lacZ, ein β-Galaktosidase-exprimierender retroviraler Vektor, der eine ausgedehnte Retrovirus-RNA-Verpackungsstelle enthält, in dem Transfektionsassay verwendet (Spain et al., unveröffentlicht). Dieser Vektor produzierte infektiöse retrovirale Titer, die ungefähr zweimal höher waren als die von pBND 8, welches nicht die ausgedehnte Verpackungsstelle enthält, nachfolgend der Transfektion der BARTLETT 96-Zellen (Daten nicht gezeigt). 24 Klone, die in Medium ohne Selektion aufgezogen wurden, wurden analysiert und 4 der 24 hatten virale Titer von größer als 10⁵/ml und einer dieser 4 Klone hatte einen Titer von größer als 10⁶/ml. 22 Klone, die in gpt-Selektions-Medium gehalten wurden, wurden analysiert und 18 der 22 Klone produzierten Virus mit einem Titer von größer als 10⁵/ml und 7 dieser Klone hatten Titer von größer als 10⁶ ml. Von diesen 7 Klonen ergab der Klon, der den höchsten Titer produzierte, BOSC 23, einen Titer von 2,9 × 10⁶/ml (Tabelle 1). BOSC 23, der in allen nachfolgenden Analysen verwendet wurde, wurde in gpt-selektivem Medium gehalten und sein viraler Titer verblieb stabil für mindestens 25 Passagen, was dadurch zeigt, daß die Aufrechterhaltung der gpt-Selektion essentiell für das Erhalten des Phänotyps des hohen Titers dieses Klons ist (Tabelle 1).
Beispiel 5
Chlorochin-Behandlung der BOSC23-Zellen verdoppelt den infektiösen Titer: Um den infektiösen Titer zu maximieren, wurden mehrere Modifikationen im CaPO₄-Transfektionsprotokoll durchgeführt. Das Wachstum der BOSC 23-Linie in 10 FCS mit 25 μM Chlorochin in den anfänglichen 10 Stunden der Transfektion resultierte in einem 2–3-fachen Anstieg im Titer (Tabelle 1, Zeile 9). Dies ist vermutlich so aufgrund der lysosomalen neutralisierenden Aktivität von Chlorochin (Ausubel et al., 1989). Die Verdoppelung der Volumen aller Transfektions-Reagenzien schien auch zu leicht höherer Transfektions-Effizienz zu führen (Tabelle 1, Zeile 10). Die Effekte von Chlorochin und der Reagenz-Volumen auf den infektiösen Titer scheinen das Resultat von steigender Transfektions-Effizienz zu sein, weil Veränderungen in der Prozentzahl von transfizierten Zellen, wie mittels FACS gemessen, nahezu linear mit dem Anstieg im viralen Titer waren. Durch die Verwendung dieser Bedingungen waren wir in der Lage, soviel wie 60% der BOSC 23-Zellen zu transfizieren, und dies führte zu lacZ-infektiösen Titern im Bereich von 10⁷/ml (Tabelle 1, Zeile 10).
Beispiel 6
Transiente Transfektion von BOSC 23 produziert abl-exprimierende retrovirale Vektoren mit hohem Titer: Ein Grund für die Erzeugung des transienten retroviralen Erzeuger-Systems BOSC 23 war es, hohe Titer von retroviralen Vektoren zu erhalten, die Gene exprimieren, die man nicht mit hohem Titer in stabilen Zellinien exprimieren kann. Vorherige Ergebnisse in diesem Labor haben gezeigt, daß es sehr schwierig ist, entweder v-abl oder P210^bcr/abl-Helfer-freie retrovirale Erzeuger-Zellinien zu schaffen, welche G418-Titer von größer als 10⁵/ml behalten. Um zu testen, ob unser transientes System in der Lage war, diese Gene mit einem höheren Titer zu exprimieren, wurde entweder pGD-v-abl (Scott et al., 1991) oder pGD210^bcr/abl (Daley et al., 1990) in BOSC 23-Zellen transfiziert. In den resultierenden Überständen wurden dann durch G418-Selektion die Titer bestimmt.
Der älterliche pGD-Vektor (Daley et al., 1990), der nur eine Neomycin-Resistenz-Kassette enthält, produzierte einen viralen Titer von 3,9 × 10⁶/ml (Tabelle 1). pGD^v-abl produzierte Virus mit einem neo-Titer von 2,9 × 10⁶/ml (Tabelle 1) und der pGD210^bcr/abl produzierte Virus mit einem neo-Titer von 1,1 × 10⁶/ml (Tabelle 1). Um zu zeigen, daß das abl-Gen so effizient transduziert war wie der Neomycin-Resistenz-Marker, infizierten wir 3T3-Zellen mit 1 ml von BOSC 23-produziertem pGD^v-abl Retrovirus. Dies transformierte ungefähr 100 % der Zellen (3A) und ist konsistent mit einem infektiösen Titer von größer als 10⁶/ml, was dem neo-Titer entspricht.
Um zu demonstrieren, daß das korrekte abl-Protein-Produkt durch die BOSC 23 produzierten retroviralen Vektoren hergestellt wurde, wurden in vitro abl-Kinase Assays (Konopka and Witte, 1985) mit den infizierten 3T3-infizierten Zellen durchgeführt. Wie in 3C gezeigt, war das P 160, das aus den pGD-v-abl-infizierten 3T3-Zellen immunopräzipitiert wurde, iden tisch in der Größe mit dem P160^v-abl aus einer Zellinie, die A-MuLV exprimiert (N54; (Jackson and Baltimore, 1989)). Gleichermaßen waren P210, das aus pGD210^bcr/abl-infizierteri 3T3-Zellen immunopräzipitiert wurde, und das Protein identisch in der Größe zu dem P210-Produkt aus der 210W-Zellinie (Lugo ans Witte, 1989), einer Zellinie, die P210^bcr/abl exprimiert (3D). Daher ist das BOSC 23-System leicht in der Lage, sowohl hohe Titer als auch korrekte Proteinprodukte der retroviralen Vektoren zu produzieren, die toxische Gene exprimieren.
Beispiel 7
Tests auf Replikations-kompetenten Virus: Um auf die Produktion von Helfer-Virus zu testen, wurde die Indikator-Zellinie BAG verwendet (Price et al., 1987). Diese Zellinie enthält integrierten β-Galaktosidase-Provirus, welcher in der Lage ist, bei Anwesenheit von entweder Helfer-Virus oder retroviralen Verpackungs-Funktionen gerettet zu werden. Unter der Verwendung dieser Zellinie und dem folgenden Protokoll kann Replikations-kompetenter Virus bei Verdünnungen von mindestens 10⁶ detektiert werden (Daten nicht gezeigt). BAG-Zellen wurde mit 1 ml viralem Überstand von pGD (neo-Titer: 3,9 × 10⁶), pGD^v-abl (neo-Titer: 2,9 × 10⁶) oder MFG-tPA (kein Titer bestimmt, jedoch hatte parallel transfiziertes MFG-lacZ einen Titer von 7 × 10⁶) infiziert. Die Zellen wurden alle 2–3 Tage 1:10 aufgeteilt und 3 ml des Überstandes wurden verwendet, um 373-Zellen nach der Passage 3, 5 und 10 zu infizieren. Es wurden keine β-Galaktosidase-positiven Zellen nach der Infektion von 373-Zellen zu allen 3 Zeitpunkten (9, 15 bzw. 30 Runden der Replikation; Tabelle 1, Zeilen 12, 13, 15) beobachtet. Als eine positive Kontrolle wurden MFG-tPA und pZAP ko-transfiziert und der Überstand wurde verwendet, um BAG-Zellen zu infizierten. Der virale Titer in diesen positiven Kontrollen betrug ungefähr 3 × 10⁴ bei allen drei Zeitpunkten. Diese Ergebnisse zeigen, daß unter unseren Bedingungen die retroviralen Vektoren, die durch BOSC 23-Zellen produziert werden, frei von Helfer-Virus sind.
Beispiel 8
Um die Hypthese zu testen, daß die simultane Einführung der zwei Plasmide, die die gag-pol und env-Funktionen kodieren, Replikations-kompetenten Virus produzieren würde, wurden pCRIP^env-, pCRIP^gag-2 und pBND8 in 293T/17-Zellen ko-transfiziert und 48 Stunden später wurden 1 ml Überstand verwendet, um BAG-Zellen zu infizieren. Die BAG-Zellen wurden aufgeteilt 1:10 für 3 Passagen und dann wurde 1 ml des „viralen" Überstandes verwendet, um 3T3-Zellen zu infizieren, welche 48 Stunden nach der Transfektion auf β-Galaktosidase-Aktivität gefärbt wurden. β-Galaktosidase-positive Zellen waren vorhanden, was anzeigt, daß die Ko-Einführung dieser 3 Elemente zur Bildung von Replikations-kompetentem Virus führt (Tabelle 1, Zeile 2). Daher können im Gegensatz zu dem vorliegenden Ansatz, der integrierte Verpackungs-Funktionen verwendet, Systeme, die auf der Ko-Einführung von Helfer-Verpackungs-Funktionen durch transiente Transfektion beruhen, zur Helfer-Virus-Bildung führen.
Beispiel 9
Retrovirale Vektoren, hergestellt durch BOSC 23-Zellen, sind in der Lage, Tag 13 CFU-S zu infizieren: Um zu bestimmen, ob retrovirale Vektoren, die durch das BOSC 23-System produziert wurden, dazu in der Lage waren, seltene Zellen in einer Population zu infizieren, wurden diese retroviralen Vektoren verwendet, um murine hämatopoetische Vorläufer zu infizieren, wie durch β-Galaktosidase-Aktivität oder provirale Integration von Tag 13 CFU-S untersucht wurde. Tag 13 CFU-S sind angereichert mit hämatopoetischen Stammzellen (Spangrude, 1989). 1,25 × 10⁶ Ficoll-Schicht („Ficoll-banded")-Zellen, abgeleitet aus langen Knochen („long bones") der Maus, wurden in WEHI-3B-konditioniertem Medium mit BOSC 23-Zellen ko-kultiviert, welche einen Tag zuvor mit entweder MFG-lacZ oder pGD transfiziert wurden. Parallel durchgeführte Experimente zeigten, daß die mit MFG-lacZ transfizierten Zellen Virus mit einem Titer von 5 × 10⁶ produzierten. 48 Stunden nach der Ko-Kultivierung wurden die nicht-adhärenten Zellen von den adhärenten Zellen später abpipettiert und in letal bestrahlte Empfänger injiziert. Zwei Mäuse, die 900 cGy und 5 × 10⁴ MFG-lacZ infizierte Knochemarks-Zellen erhielten, überlebten bis zum Tag 13 und nach der Nekroskopie waren CFU-S grob sichtbar. 4 Mäuse, die 850 cGy empfingen, wovon zwei 5 × 10⁴ pGD-infizierte Knochenmark-Zellen erhielten und zwei 1 × 10⁵ pGD-infizierte Knochenmark-Zellen erhielten, überlebten bis zum Tag 13. In den Milzen der Mäuse, die 850 cGy empfingen, waren CFU-S nicht grob sichtbar, was vorschlägt, daß dies keine letale Bestrahlungsdosis war. Eine Milz aus einer der Mäuse, die MFG-lacZ infiziertes Knochenmark erhielten, wurde auf β-Galaktosidase-Aktivität gefärbt (MacGregor et al., 1990) und diese Milz war stark positiv, wie angezeigt durch zwei deutliche blaue Gebiete, die ungefähr 0,2 mm im Durchmesser betrugen, sowie unterbrochene blaue Punkte überall in der Milz. Keine β-Galaktosidase- Aktivität war sichtbar in den zwei Milzen, die aus den pGD-Tieren gefärbt wurden (wovon je eines der Tiere 5 × 10⁴-Zellen und 1 × 10⁵-Zellen erhielt). Cryostat-Sektionen wurden von den pGD und MFG-lacZ-Milzen präpariert und, wie in 4A gezeigt, gibt es zwei deutliche X-gal gefärbte Gebiete in der MFG-lacZ-Milz, welche höchstwahrscheinlich mit den CFU-S korrespondieren. Zusätzlich gab es individuell gefärbte Zellen in der MFG-lacZ-Milz, welche möglicherweise Infektion oder reifere Zellen repräsentieren. In den Milzen der Mäuse, die pGD-infiziertes Knochenmark empfingen, waren keine X-gal gefärbten Zellen vorhanden (4B).
Beispiel 10
Strategie für die Erzeugung der amphotropen Helfer-freien Zellinie: In ähnlicher Art und Weise wie die Präparation der ecotropen Zellinie, die in Beispiel 2 beschrieben wird, begann die Präparation der amphotropen Zellinie mit der Präparation einer Helfer-freien Erzeuger-Zellinie aus der 293T/17 Sublinie (1B). Die Strategie zur Erzeugung der Helfer-freien Erzeuger-Zellinie war im allgemeinen die gleiche wie diejenige von Beispiel 2 und demgemäß wurde ein Satz von Plasmiden, pCRIP^env- und pCRIP^amgag, verwendet, welche die Moloney Verpackungs-Funktionen auf zwei Plasmide (Danos and Mulligan, 1988) plazierten. pCRIP^env- enthält eine Mutation in der Hüllregion und exprimiert sowohl gag als auch pol-Produkte. pCRIP^amgag enthält Mutationen in der gag-Region und exprimiert nur die amphotrope Hülle (Danos and Mulligan, 1988). Wie im Protokoll in Beispiel 2 wurde die Retrovirus-RNA-Verpackungsstelle deletiert und die 3' LTR wurde in beiden Plasmiden durch eine SV-40 Poly A-Stelle ersetzt (Danos and Mulligan, 1988). Mit diesen multiplen Veränderungen sind mehr als zwei Kreuzungs-Ereignisse notwendig, um Helfer-Virus zu generieren, sogar wenn gag+-Vektoren verwendet werden, wie z.B. MFG (Danos and Mulligang, 1988).
Auf ähnliche Weise wie bei der Präparation der ecotropen Zellinie wurden die Konstrukte pCRIP^env- und pCRIP^amgag eher nachfolgend zueinander als simultan eingeführt, um das Risiko der Rekombination und Produktion von Replikations-kompetentem Virus zu verringern (Danos and Mulligan, 1988). Demgemäß wurde das gag-pol exprimierende Konstrukt pCRIP^env- in 293T/17-Zellen eingeführt und der Klon mit der höchsten Aktivität an reverser Transkriptase wurde selektiert. Nachfolgend wurde pCRIP^amgag, welches die amphotrope Hülle exprimiert, in die Zellinie pCRIP^env eingeführt und die resultierenden Zellinien wurden auf die Fähigkeit, infektiösen Retrovirus nach der Transfektion des retroviralen Vektors der Wahl zu produzieren, durchsucht.
Beispiel 11
Erzeugung der CAK 8-Zellen: Der nächste Schritt bei der Erzeugung der amphotropen Helfer-freien Zellinie war es, das amphotrope Hüll-Konstrukt zu transfizieren und die Zelline zu selektieren, die den höchsten Titer an infektiösem Retrovirus produzierte. ANJOU 65-Zellen wurden mit 10 μg des mit AseI linearisierten, amphotropen Hüll-kodierenden Konstrukts pCRIP^amgag und 5 μg des Plasmids, das das selektierbare Marker-Gen für gpt-Resistenz kodiert, gpt2E (Jasin and Berg, 1988) transfiziert. Die Zellen wurden anfänglich in gpt-Selektionsmedium aufgezogen (Mulligan and Berg, 1981) und die Population wurde mittels FACS und einem Antikörper gegen die amphotrope Hülle 83 A25 (B. Cheseboro) durchsucht, um hoch-amphotrope Hüll-exprimieriende Zellen zu selektieren. Zellen mit hoher Hüll-Expression wurden als einzelne Zellen aussortiert und aufgezogen. Die Zellinie, die die höchste Hüll-Expression zeigte, war Ampho 18. Bei der Aufzucht dieser Zellinie in Hygromycin-Medium starben diese Zellen jedoch ab und zusätzlich produzierte diese Zellinie keine infektiösen Retrovirus-Partikel. Als ein Ergebnis wurden die Konstrukte pCRIP^env- und pSV2 Hgm nochmals eingeführt. Individuelle Klone wurden selektiert und mittels eines reverse Transkripase-Assays durchsucht. Der Klon mit der höchsten RT-Aktivität war Ampho 133. Dieser Klon produzierte auch infektiöse Retroviren mit einem lacZ-Titer von 2 × 10⁶ infektiösen Viren pro Milliliter auf NIH 3T3-Zellen. Ampho 133 wurden subkloniert und ein Klon wurde erhalten, der als CAK 8 bezeichnet wurde. CAK 8 ist eine amphotrope Erzeuger-Zellinie, welche lacZ-Titer von 2 × 10⁶ auf NIH 3T3-Zellen ergibt, wenn mit 3 μg MFG-lacZ bei Anwesenheit von Chlorochin transfiziert.
DISKUSSION:
Wie oben beschrieben und bestätigt, wurden ein Verfahren und korrespondierende Materialien für die schnelle Generation von hohen Titer-Beständen von Helfer-freien Retroviren entwickelt. Die Erfindung verwendet die transiente Einführung von DNA, die rekombinante DNA-Sequenzen und genetisches Material von Interesse enthält, in Säugetier-Zellen. Innerhalb von drei Tagen produzieren transfizierte Zellen einen hohen Titer des eingeführten retroviralen Vektors (größer als 10⁶ prüfbare infektiöse Einheiten/ml) ohne Nachweis von Helfer-Virus. Es wird angenommen, daß niemand zuvor Helfer-freie retrovirale Bestände mit solch einem Titer mittels transienter Transfektion hergestellt hat. Die Titer, die in dem vorliegenden transienten System erhalten werden, sind vergleichbar mit den besten Titern, die unter der Verwendung der derzeitigen Erzeuger-Zellinien und der Selektion für stabile Klone erhalten werden. Retrovirale Bestände mit hohen Titern sind notwendig für die effiziente Einführung von rekombinantem genetischem Material in seltene Zellen, wie z.B. Stammzellen, und selten teilende Zellen, wie z.B. Neuronen, und um in der Lage zu sein, alle Zellen in einer großen Zielpopulation zu infizieren.
Das Modelsystem, was hierin verwendet wird, ist die hochtransfizierbare Zellinie 293T, eine transformierte Zellinie, die das Adenovirus Ela-Gen und SV40 großes T-Antigen exprimiert. Durch die Einführung von Konstrukten, die retrovirale Verpackungsfunktionen exprimieren, in einen Subklon dieser Zellinie wurden die retroviralen Verpackungs-Zellinien BOSC 23 und CAK 8 und die Vorläufer-Linien 293T/17 und ANJOU 65 erzeugt. BOSC 23-Zellen sind in der Lage, infektiöse Retroviren mit einem Titer im Bereich von 10⁷ infektiösen Partikeln pro ml zu produzieren. Das Erreichen eines retroviralen Titers im 10⁷-Bereich erforderte verschiedene Modifikationen im typischen CaPO₄-Transfektionsprotokoll. Dies schloss das Aufziehen der Zellen in Medien, das 25 μM Chlorochin enthält, in den anfänglichen 10 Stunden der Transfektion, Verdoppelung der Volumen aller Reagenzien und Optimisierung der Dichte der BOSC 23-Zellen und der Menge der transfizierten DNA ein. Diese Veränderungen erhöhten die Transfizierbarkeit und die virale Produktion der BOSC 23-Zellen, was zu transienten Transfektions-Frequenzen von ungefähr 60 % der BOSC 23-Zellen bzw. hohen Titern an Viren führte.
Im Vergleich zur Erzeugung von stabilen Erzeuger-Zellinien, ist das vorliegende System in der Lage, Virus mit hohen infektiösen Titern zu produzieren, aber ohne den Arbeitsaufwand, die Zeit und die Kosten, die zur Selektion und Testung von individuellen Klonen gehören. Die Selektion von stabilen Klonen, die hohe Titer produzieren, benötigt mindestens einen Monat an intensiver Zellkultur und Testung; wohingegen das vorliegende System die Produktion von retroviralen Vektoren mit hohem Titer in weniger als 72 Stunden erlaubt. Als ein Ergebnis ermöglicht das vorliegende System in starkem Maße die Testung der Effizienz von verschiedenen Konstrukten oder verschiedenen Bedingungen.
Ein hauptsächlicher Vorteil des BOSC 23 als auch des CAK 8-Systems ist die Fähigkeit, hohe Titer von retroviralen Vektoren zu produzieren, welche schädlich für das Wachstum der stabi len Erzeuger-Zellinien ist. Unsere Erfahrung mit stabilen Erzeuger-Zellinien, die entweder v-abl oder P210^bcr/abl retrovirale Vektoren exprimieren, zeigten, daß sogar, wenn diese Zellinien anfänglich die retroviralen Konstrukte mit hohem Titer exprimierten, die Titer mit fortgesetzter Propagation der Zellinie abfielen. Obwohl dieses Phänomen nicht gut verstanden ist, kann es eher aufgrund der epigenetischen Mechanismen in Zusammenhamg mit dem Ausmaß der Tranformation und der zellulären Anhaftung als aufgrund eines direkten toxischen Defekts des Genprodukts auftreten (Ziegler et al., 1981). Dieses Phänomen ist nicht auf retrovirale Konstrukte limitiert, die Mitglieder der abl-Familie enthalten, da ein ähnliches Phänomen mit Mitgliedern der rel-Familie der Transkriptionsfaktoren beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Unter der Verwendung des BOSC 23-Systems war es möglich, Titer von größer als 10⁶ sowohl für v-abl als auch P210^bcr/abl retrovirale Konstrukte zu erhalten und zu zeigen, daß die korrekten abl-Proteinprodukte produziert wurden. Weil die BOSC 23-Zellen den Produkten des retroviralen Konstruktes für weniger als 72 Stunden ausgesetzt sind, werden jegliche schädliche Effekte des Produktes auf die Zellinie minimiert. Die Fähigkeit des BOSC 23-Systems, die retrovirale Vektor-Produktion mit hohem Titer für alle Gene, die bisher exprimiert wurden, einschließlich derjenigen, von denen zuvor angenommen wurde, daß sie „toxisch" sind, zu unterstützen, sollte den Umfang und die Nützlichkeit der retroviralen Vektoren in starkem Maße ausdehnen.
Das BOSC 23-System ist auch frei von detektierbarem Replikations-kompetentem Virus. Dies wurde mittels eines stringenten Assays demonstriert, in welchem entweder die Verpackung der Helfer-Funktionen oder die Produktion von Helfer-Virus selbst zur Rettung des integrierten lacZ-enthaltenden Provirus aus einer Indikator-Zellinie (BAG) führen würde. Es wurde keine Rettung unter der Verwendung von drei verschiedenen retroviralen Vektor-Konstrukten beobachtet, einschließlich eines Vektors, der eine verlängerte retrovirale RNA-Verpackungsstelle (MFG-tPA) enthält, sogar wenn jede BAG-infizierte Population mindestens 30 Runden der Replikation durchlief.
Es gab verschiedene vorherige Versuche, Retroviren mit hohem Titer durch transiente Transfektion herzustellen. Die transiente Transfektion von entweder Psi-2 oder PA317-Zellinien führte zu Titern im Bereich von 10⁴/ml (Price et al., 1987, Miller et al., 1986). Kürzlich haben Landau und Littman ein System beschrieben, in dem zwei retrovirale Vektoren, die SV40 ori-Sequenzen enthalten und die Verpackungs-Funktionen auf einem Vektor und das Gen von Interesse auf dem anderen Vektor exprimieren, in COS-Zellen ko-transfiziert werden (Landau and Littman, 1992). Sie haben Titer so hoch wie 1 × 10⁵ erhalten, welche Helfer-frei erscheinen und abhängig sind von der Amplifikation des SV40 ori-enthaltenden Vektors. Es ist irgendwie überraschend, daß sie nicht die Produktion von Replikations-kompetentem Virus dokumentieren, weil nur ein homologes Rekombinations-Ereignis notwenig ist, um Helfer-Virus zu erzeugen. Die Ko-Transfektion von 293T/17-Zellen mit pCRIP^env-, pCRIP^gag-2 und pBND, welche dieselbe Region der Homologie enthalten wie das Landau-System, aber zwei Rekombinations-Ereignisse benötigen, um Helfer-Virus zu generieren, führte zu Replikationskompetentem Virus. Wenn das COS-System frei von Helfer-Virus ist, kann dies vorschlagen, daß es einen Unterschied in den Rekombinations-Raten zwischen 293 und COS-Zellen gibt.
Weil BOSC 23 ein integriertes großes T-Antigen von SV40 enthalten, kann es möglich sein, retrovirale Titer unter der Verwendung von retroviralen Vektoren zu erhöhen, die den SV40-Ursprung der Replikation enthalten. In dem COS-System erhöhten sich die Titer von 10³ auf 10⁵ unter der Verwendung von Vektoren, die den SV40-Ursprung der Replikation enthalten (Landau and Littman, 1992). Es wurde versucht, einen Vorteil aus dieser potentiellen Amplifikation zu ziehen, und zwar durch Transfektion von BARTLETT 96 (und 293T/17 bei Anwesenheit von Helfer) mit pSPUD, einem retroviralen Vektor, in welchem lacZ durch den SV40-Promotor angetrieben wird. Jedoch wurde kein Amplifikations-Effekt beobachtet und tatsächlich fielen die retroviralen Titer um ein Log ab, wenn dieser Vektor verwendet wurde (Daten nicht gezeigt). Ein potentieller Nachteil der Erhöhung des retroviralen Titers durch Amplifikation ist, daß dies die Rekombinations-Rate erhöhen kann (Heinzel et al., 1988), und daher die Chance, Replikations-kompetenten Retrovirus zu produzieren.
Die folgende Liste ist eine Liste der Publikationen, auf die sich in der vorangegangenen Beschreibung bezogen wurde.

Anderson, W. F. (1992). Human gene therapy. Science 256, 808–813.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E. Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., and Struhl, K., eds., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., New York, 1989).
Bender, M.A., Palmer, T.D., Gelinas, R. E., Miller, A. D. (1987). Evidence that the packaging signal of Moloney murine leukemia virus extends into the gag region. J. Virol 61, 1639–1646.
Bernard, H. U., Kramer, G., and Rowekamp, W. G. (1985). Construction of a fusion gene that confers resistance against hygromycin B to mammalin cells in culture. Exp. Cell Res. 158, 237–243.
Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., and Burrascano, M. (1993). Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: Concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalin and nonmammalin cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8033–8037.
Daley, G. Q., Van Etten, R. A., and Baltimore, D. (1990). Induction of chronic myelogenous leukaemia in mice by the P210 bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science 247; 824–830.
Danos, O., and Mulligan, R. C. (1988). Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6460–6464.
DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Phalk-Mool, L., Miller, J. H., and Calos, M. P. (1987). Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7, 379–137.
Goff S., Traktman, P., and Baltimore, D. (1981). Isolation and properties of Moloney murine leukaemia virus mutants: use of rapid assay for release of virion reverse transciptase. J. Virol. 38, 239–248.
Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., and Naish, R. (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59–72.
Heinzel, S. S., Krysan, P. J., Calos, M. P., and DuBridge, R. B. (1988). Use of simian virus 40 replication to amplify Epstein-Barr virus shuttle vectors in human cells. J. Virol. 62, 3738–3746.
Hopkins, N. (1993). Commentary. High titers of retrovirus (vesicular stomatitis virus) pseudotypes, at last. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8759–8760.
Jackson, P., and Baltimore, D. (1989). N-terminal mutations activate the leukemogenic potential of the myristoylated form of c-abl. EMBO J. 8, 449–456.
Jasin, M., and Berg, P. (1988). Homologous integration in mammalian cells without target gene selection. Genes and Dev. 2, 1353–1363.
Konopka, J. B., and Witte, O.N. (1985). Detection of c-abl tyrosine kinase activity in vitro permits direct comparison of normal and altered abl gene products. Mol. Cell. Biol. 5, 3116–3123.
Landau, N. R., and Littman, D. R. (1992). Packaging system for rapid generation of marine leukaemia virus vectors with variable tropism. J. Virol. 66, 5110–5113.
Lugo, T. G., and Witte, O. N. (1989). The bcr-abl oncogene transforms rat-1 cells and cooperates with v-myc. Mol. Cell. Biol. 9, 1263–1270.
MacGregor, G. R., Nolan, G. P., Fiering, S., Roederer, M., and Herzenberg, L. A., in Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocals E. J. Murray, Eds. (The Humana Press Inc., Clifton, NJ, 1990), pp. 1–19.
Markowitz, D., Goff S., and Bank, A. (1988). A safe packaging line of gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 62, 1120–1124.
Miller, A. D. (1990). Retrovirus packaging cells, Human Gene Ther. 1, 5–14.
Miller, A. D., Trauber, D. R., and Buttimore, C. (1986). Factors involved in production of helper virus-free retrovirus vectors. Som. Cell Mol. Gen. 12, 175–183.
Mulligan, R. C., and Berg, P. (1981). Selection for animal cells that express the escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072–2076.
Nolan, G. P., Fiering, S., Nicolas, J. F., and Herzenberg, L. A. (1988). Fluorescenceactivated cell analysis and sorting of viable mammalian cells based on β-D-galactosidase activity after transduction of E.col LacZ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2603–2607.
Price, J., Turner, D., and Cepko, C. (1987). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 156–160.
Scott, M. L., Van Etten, R. A., Daley, G. Q., and Baltimore, D. (1991). v-abl causes hemtopoietic disease distinct form that caused by bcr-abl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6506–6510.
Shoemaker, C., Hoffmann, J., Goff S. P., and Baltimore, D. (1981). Intramolecular integration within moloney marine leukaemia virus DNA J. Virol. 40, 164–172.
Spain, L, Robbins, P., and Mulligan, R.C. unpublished.
Spangrude, G. J. (1989). Enrichment of marine haemopoietic stem cells: diverging roads. Immunol. Today 10, 344–350.
Turner, D., and Cepko, C. unpublished
Walsh, C., and Cepko, C. (1988). Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science 241, 1342–1345.
Ziegler, S. F., Whitlock, C. A., Goff S. P., Gifford, A., and Witte, O. N. (1981). Lethal effect of the abelson marine leukaemia virus transforming gene product. Cell 27, 477–486.

Diese Erfindung kann in anderen Formen ausgeführt werden oder auf andere Weise durchgeführt werden, ohne von den essentiellen Charakteristika dieser Erfindung abzurücken. Die vorliegende Offenbarung beabsichtigt daher, in allen Bezügen illustrativ und nicht restriktiv zu sein, wobei der Umfang der Erfindung durch die angefügten Ansprüche angezeigt wird.

Claims

Klonale Zell-Linie 293T/17, die die ATCC Zugangsnummer CRL 11268 hat.
Klonale Zell-Linie ANJOU 65, die die ATCC Zugangsnummer CRL 11269 hat.
Klonale Zell-Linie BOSC 23, die die ATCC Zugangsnummer CRL 11270 hat.
Klonale Zell-Linie CAK 8, die die ATCC Zugangsnummer CRL 11554 hat.
Testkit für die Messung und die Einschätzung der Aktivität von genetischem Material von Interesse auf eine zelluläre Zielpopulation, wobei das Testkit eine Zell-Linie gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit Reagenzien für eine optimale Transfektion umfaßt.