DE60028066T2

DE60028066T2 - Lentivirale vektoren für die herstellung von immunotherapeutischen zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60028066T2
Application number: DE60028066T
Authority: DE
Inventors: Pierre Charneau; Hüseyin FIRAT; Veronique Zennou
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1999-10-11
Filing date: 2000-10-10
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: DE60028066D1; HK1049861A1; IL148901A0; ATE326541T1; AU2010203111B2; AU1143501A; EP1650309B1; CY1110551T1; CY1105149T1; JP5265643B2; EP1092779A1; CN1379820B; EP1092779B1; CA2387182A1; JP2003511080A; PT1650309E; EP1650309A1; US20130157357A1; DE69941703D1; EP1222300B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von retroviralen Vektoren und speziell lentiviralen Vektoren für die Herstellung von Zusammensetzungen, die in der Lage sind, eine immunologische Reaktion in vitro, und in einer bevorzugten Ausführungsform in vivo, gegen Epitope, die durch Nukleotidsequenzen kodiert werden, die in den Vektoren vorhanden sind, zu induzieren oder zu ihrem Auftreten beizutragen oder sie zu verbessern.
Die Erfinder haben gezeigt, dass gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Vektoren es ermöglichen, eine zellvermittelte Immunantwort zu erhalten, insbesondere eine Reaktion von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) gegen Epitope.
Es wurden ferner Daten erhalten, die zeigen, dass diese zellvermittelte Immunantwort eine spezifische Antwort sein kann, die gegen ein oder mehrere Epitope erhalten wird, die von der in den Vektoren enthaltenen Nukleotidsequenz kodiert werden.
Deshalb stellt die Erfindung Mittel zur Verfügung, die in Behandlungsprotokollen gegen Tumoren und Krebs verwendet werden können und können insbesondere in Protokollen für Immuntherapie oder Impftherapie gegen Tumoren verwendet werden.
Diese Erfindung offenbart Mittel, die zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten verwendet werden können, insbesondere Krankheiten in Verbindung mit Virusinfektion und zum Beispiel mit Retrovirusinfektion.
Die Erfinder haben ferner Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die zellvermittelte Immunantwort und insbesondere die CTL-Antwort in Verbin dung mit der Behandlung durch die Zusammensetzungen der Erfindung spezifisch für das Antigen des Tumors oder den Virus oder virusinfizierte Zellen sein kann, und auch auf spezifische Moleküle des MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt sein können.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung der Vektoren in immunogenen Zusammensetzungen, um eine zellvermittelte Immunantwort zu erhalten, die auf Moleküle der Klasse I des MHC-Komplexes beschränkt ist und zum Beispiel auf HLA-A2- oder B7-Moleküle beschränkt ist.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung umfassend einen rekombinanten Vektor, der ein Polynukleotid umfasst, das die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die cis-agierende Terminationsregion (CTS) umfasst. Bei der reversen Transkription induzieren cPPT- und CTS-Sequenzen die Bildung einer dreisträngigen DNA-Struktur, die hier als DNA-Triplex bezeichnet wird. Die Triplex-DNA stimuliert die Kerneinfuhr (Nuklearimport) von Vektor-DNA-Genomen, wobei diese Regionen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs sind, wobei der Vektor zusätzlich eine definierte Nukleotidsequenz umfasst (Transgen oder Sequenz) und Regulationssignale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs, worin die Zusammensetzung in der Lage ist, eine CTL-Antwort (cytotoxische T-Lymphocyten) oder eine CD4-Antwort gegen ein oder mehrere Epitotpe, die durch die im Vektor vorhandene transgene Sequenz kodiert werden, zu induzieren oder zu stimulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die zellvermittelte Immunantwort und insbesondere die CTL-Antwort oder die CD4-Antwort gegen ein oder mehrere Epitope eine Memory-CTL-Antwort oder eine CD4-Antwort.
Es wird betont, dass die Gegenwart der cPPt- und CTS-Regionen im Vektor ermöglicht, dass die Triplex-DNA-Struktur gebildet wird, wodurch der Kerneinfuhr des Genoms des Vektors in Zellen, die mit dem Vektor rekombiniert sind, beeinflusst und insbesondere verbessert wird.
Diese Fähigkeit der immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung, das Auftreten einer Memory-CTL-Antwort zu induzieren, verbessern oder allgemein zu beeinflussen, ermöglicht, die Verwendung der immunogenen Zusammensetzung in Protokollen zur Antitumortherapie oder Antivirus- oder Antipathogentherapie vorzuschlagen, darunter, wenn die Immunantwort über eine lange Zeitdauer induziert werden oder mindestens induzierbar sein soll, wenn eine Antwort zu einem Zeitpunkt gesucht ist, der eine Langzeitinduktion der Antwort nach der Verabreichung der immunogenen Zusammensetzung sein kann. Mit anderen Worten, die immunogene Zusammensetzung kann für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Tumorerkrankungen oder Infektionskrankheiten, zum Beispiel durch Bakterien oder Viren verwendet werden, durch Induzieren oder Stimulieren oder Teilnahme am Auftreten einer zellvermittelten Immunantwort, insbesondere einer CTL-Antwort oder einer Memory-Antwort.
Es wird betont, dass die immunogene Zusammensetzung der Erfindung als Folge des Vorhandenseins der Triplexstruktur in der Sequenz des Vektors, die aus dem Vorhandensein der cPPT- und CTS-Regionen im Vektor und in den Vektorpartikeln resultiert, die Stimulation der Kerneinfuhr des Genoms des Vektors in Zielzellen ermöglicht. Die induzierten Epitope im Vektor können eigen oder nicht eigen sein.
Die vorliegende Erfindung deckt auch die Verwendung einer Nukleotidsequenz umfassend die cPPT- und CTS-Sequenzen retroviralen oder synthetischen Ursprungs zur Verbesserung des Eintritts von Nukleotid- oder Peptidsequenzen in den Kern (Nukleus) der Zielzellen oder Empfängerzellen.
Zum Beispiel versteht es sich, dass die Triplexsequenz fremde Sequenzen oder eigene Sequenzen in Bezug auf die Empfängerzellen umfasst.
Auf diese Weise offenbart die Erfindung eine Zusammensetzung, die in therapeutischen Protokollen verwendet werden können, die Analogien zu Impfprotokollen aufweisen, für die Behandlung von Tumoren und insbesondere als Antikrebsbehandlung oder Behandlung von Infektionskrankheiten.
Es ist von Interesse anzumerken, dass gemäß der vorliegenden Erfindung, dieses Transgen oder diese Sequenz von Interesse eine Sequenz sein kann, die für eines oder mehrere Epitope einer oder mehrerer Tumorzellen kodiert, zum Beispiel Epitope, die in potentiellen Zielantigenen für die Induktion einer zellvermittelten Immunantwort gegen den Tumor identifiziert sind.
Mehrere Epitope, die ein Polyepitop bilden, können vom Transgen der Erfindung kodiert werden. In einer besonderen Ausführungsform können sie von im Tumor identifizierten Zielantigenen gewonnen werden, und können so ausgewählt werden, dass, wenn ihre Kodierungssequenz kombiniert wird, um das Transgen zu bilden, eine zellvermittelte Immunantwort gegen alle Epitope oder gegen die meisten davon erhalten wird. Die zellvermittelte Immunantwort kann in vitro untersucht werden oder in einer bevorzugten Ausführungsform in vivo. Protokolle, die das Ausführung solcher Assays ermöglichen, sind in den Beispielen beschrieben.
Es wurden in einigen Arten von Tumoren Zielantigene identifiziert und insbesondere in Melanomen oder in Karzinomen, darunter Nierenkarzi nome, Blasenkarzinome, Kolonkarzinome, Lungenkarzinome, Brustkrebs, Leukämie und Lymphome...
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann die immunogene Zusammensetzung verwendet werden, um eine zellvermittelte Immunantwort bei Infektionskrankheiten zu erhalten, darunter virus-assoziierte Infektion oder Infektion, die mit irgendeiner Art von Krankheitserreger verknüpft ist, darunter Mycobakterien, zum Beispiel Mycobacterium tuberculosis.
In diesem Fall können spezifische Antigene identifiziert werden, die in der Lage sind, eine zellvermittelte Immunantwort hervorzurufen, und ihre in den Vektor eingesetzten Kodierungssequenzen in der immunogenen Zusammensetzung verwendet werden. Als Beispiel kann das des-Gen von M tuberculosis verwendet werden.
Es wird auch angefügt, dass gemäß der vorliegenden Erfindung, die Vektoren, die in den immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden, Epitope exprimieren oder auf Proteinen vorlegen können (darunter Glycoproteine oder andere Proteinderivatverbindungen), die als Zielantigene auf Tumorzellen oder auf virusinfizierten Zellen identifiziert sind.
Außerdem wird angemerkt, dass Epitope, Polypeptide oder Proteine, die zum Bereitstellen von Epitopen verwendet werden, modifiziert sein können, zum Beispiel durch Mutation, Deletion oder Insertion und zum Beispiel zur Verbesserung ihrer Stabilität modifiziert sein können.
Die Erfindung betrifft auch eine immunogene Zusammensetzung umfassend rekombinante Retroviruspartikel umfassend:

1) eine rekombinante Nukleotidsequenz enthaltend eine definierte Nukleotidsequenz (Transgen), die unter die Kontrolle regulatorischer Signale von Transkription und Expression, regulatorischer Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation gestellt sind, und
2) ein Polynukleotid mit der cis-agierenden zentralen Initiationsregion (cPPT) und einer cis-agierenden Terminationsregion (CTS), wobei diese Regionen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs sind oder von einem Transposon und in einer funktionalen Orientierung und Lage mit regulatorischen Retrotranskriptionssignalen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs oder mit regulatorischen Transposonsignalen eingesetzt sind,

Das DNA-Fragment, das die cis-aktiven Sequenzen von cPPT und CTS umfasst, ist in der Lage, eine dreisträngige DNA-Struktur, die "Triplex-DNA" nach reverser Transkription anzunehmen und den Kerneintritt der Vektor-DNA zu stimulieren.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst die immunogene Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine CTL-Antwort (cytotoxische T-Lymphocyten) gegen ein oder mehrere Epitope zu induzieren oder zu stimulieren, die von der im Vektor vorliegenden transgenen Sequenz kodiert wird, rekombinante retrovirale Vektorpartikel umfassend:

a) ein gag-Polypeptid, das Kernproteinen eines Lentivirus oder funktionell abstammenden Polypeptiden (GAG-Polypeptide) entspricht,
b) ein pol-Polypeptid, gebildet aus den RT-, PRO-, IN-Proteinen eines Lentivirus oder eines funktionell abstammenden Polypeptids (POL-Polypeptid),
c) ein Hüll-Polypeptid oder funktionell abstammende Peptide (ENV-Polypeptide),
d) eine rekombinante Nukleotidsequenz umfassend eine definierte Nukleotidsequenz (Transgen oder Sequenz), die für ein oder mehrere Epitope kodiert, die unter die Kontrolle regulatorischer Signale von Transkription und Expression gestellt ist, einer Sequenz, die regulatorische Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs enthält und ein Polynukleotid, das eine cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und eine cis-agierende Terminationsregion (CTS) enthält, wobei diese Regionen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs sind und in einer funktionellen Orientierung mit den oben genannten regulatorischen Signalen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs eingesetzt sind.

Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst die immunogene Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine CTL-Antwort (cytotoxische T-Lymphocyten) gegen ein oder mehrere Epitope zu induzieren oder zu stimulieren, die von der im Vektor vorliegenden transgenen Sequenz kodiert werden, rekombinante retrovirale Vektorpartikel, die umfassen:

a) ein Polynukleotid, das eine cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und eine cis-agierende Terminationsregion (CTS) enthält, wobei diese Regionen aus einem Retrotransposon gewonnen sind und in einer funktionellen Orientierung mit den regulatorischen Retrotransposonsignalen eingesetzt sind,
b) ein Polypeptid, das den Kernproteinen eines Retrotransposons oder funktionell abstammenden Polypeptiden (GAG-Polypeptide) entspricht,
c) ein pol-Polypeptid, das RT-, PRO-, IN-Proteinen eines Retrotransposons oder eines funktionell abstammenden Polypeptids (POL-Polypeptid) entspricht,
d) ein virales Hüll-Polypeptid,
e) eine rekombinante Nukleotidsequenz umfassend eine definierte Nukleotidsequenz (Transgen oder Sequenz), die unter die Kontrolle regulatorischer Signale von Transkription und Expression gestellt ist, regu latorischer Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation.

Die rekombinanten retroviralen Vektorpartikel, die in der immunogenen Zusammensetzung vorliegen, die der einen oder anderen der obigen Definitionen entsprechen, sind in einer bevorzugten Ausführungsform in der Lage, das Auftreten einer zellvermittelten Memory-Immunantwort und speziell eine Memory-CTL-Antwort zu induzieren, verbessern oder damit in Zusammenhang zu stehen.
Gemäß der oben offenbarten Definitionen kann die immunogene Zusammensetzung, die Vektoren oder Vektorpartikel enthält, gemäß einiger möglicher Ausführungsformen herstellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die immunogene Zusammensetzung in der Weise hergestellt, dass die Sequenzen retroviralen Ursprungs von einem Lentivirusgenom gewonnen werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform sind diese Sequenzen retroviral-ähnlichen Ursprungs und vom Transposon gewonnen.
In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich zu den oben definierten Merkmalen, ist das gesuchte Transgen oder die Sequenz, die im rekombinanten Vektor enthalten ist, in einer Expressionskassette enthalten, die regulatorische Signale von Transkription und Expression beinhaltet.
Alternativ sind die regulatorischen Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation des Vektors lentiviralen Ursprungs und das Polynukleotid, das die cPPT- und CTS-Regionen umfasst, ist lentiviralen Ursprungs.
Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die regulatorischen Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation und das Polynukleotid, das die cPPT- und CTS-Regionen im Vektor umfasst, von einem Retrovirus vom HIV-Typ gewonnen, insbesondere HIV-1 oder HIV-2.
Andere Viren und insbesondere Lentiviren können verwendet werden, um die regulatorischen Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation aufzubauen und auch das Polynukleotid zu gewinnen, das die cPPT- und CTS-Regionen umfasst. Insbesondere können die Lentiviren CAEV, EIAV, VISNA, HIV, SIV oder FIV dafür verwendet werden.
Um die rekombinanten Retroviruspartikel der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung zu erhalten, sind Sequenzen, die Polypeptide oder Proteine kodieren, die für die Transkomplementierung von Vektoren notwendig sind, zum Beispiel GAG-, POL- und ENV-Proteine, die von Lentiviren gewonnen sind, und insbesondere von HIV, darunter HIV-1- und HIV-2-Retroviren.
Alternativ können die GAG- und POL-Sequenzen aus einem anderen Virus als die ENV-Sequenz gewonnen werden. Zum Beispiel können GAG- und POL-Sequenzen aus dem HIV-Retrovirus gewonnen werden und die ENV-Sequenz kann von einen anderen Virus oder Retrovirus gewonnen werden und können entweder amphotrophe oder ökotrophe ENV-Sequenzen sein.
In einer anderen Ausführungsform wird die ENV-Sequenz vom vesikularen Stomatitisvirus (VSV) gewonnen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die immunogene Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine CTL-Antwort (cytotoxische T-Lymphocyten) gegen ein oder mehrere Epitiope zu induzieren oder zu stimulieren, die durch die im Vektor vorliegende transgene Sequenz kodiert werden, rekombinante retroviral-ähnliche Partikel, die umfassen:

a) ein Polynukleotid, das eine cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und eine cis-agierende Terminationsregion (CTS) enthält, wobei diese Regionen von einem Retrotransposon abstammen und in einer funktionellen Orientierung mit regulatorischen Retrotransposon-Signalen eingefügt ist,
b) ein Polypeptid, das den Kernproteinen eines Retrotransposons oder funktionell abstammenden Polypeptiden (GAG-Polypeptide) entspricht,
c) ein pol-Polypeptid, das RT-, PRO-, IN-Proteinen eines Retrotransposons oder eines funktionell abstammenden Polypeptids (POL-Polypeptid) entspricht,
d) ein virales Hüll-Polypeptid,
e) eine rekombinante Nukleotidsequenz umfassend eine definierte Nukleotidsequenz (Transgen oder Sequenz), die unter die Kontrolle regulatorischer Signale von Transkription und Expression gestellt ist, regulatorischer Signale von Retrotranskription, Expression und Encapsidation.

Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung, die die rekombinanten retroviral-ähnlichen Partikel umfasst, ist in einer bevorzugten Ausführungsform in der Lage, eine zellvermittelte Memory-Antwort, insbesondere eine Memory-CTL-Antwort gemäß der oben offenbarten Merkmale zu erzeugen.
Die Erfindung betrifft auch Vektorkonstrukte, die bei der CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes am Institut Pasteur in Paris, Frankreich) am 11. Oktober 1999 hinterlegt wurden.
Ein erster Vektor ist pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP am 11. Oktober 1999 unter Nummer I-2326 hinerlegt und ein zweiter Vektor bezeichnet als pTRIP-ILKE-IRES-GFP wurde am 11. Oktober 1999 unter Nummer I-2327 hinterlegt.
Ein dritter Vektor pTRIP.DES-IRES-GFP wurde am 11. Oktober 1999 unter Nummer I-2331 bei der CNCM hinterlegt.
Die Sequenzen, die für die Antigene kodieren, die in den obigen Konstrukten vorliegen, können durch irgendein anderes gesuchtes Antigen oder Epitop ersetzt sein, darunter das oben zitierte vollständige DES-Gen von M tuberculosis.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung sind die Vektoren, Vektorpartikel und immonogenen Zusammensetzungen, die sie umfassen, in der Weise aufgebaut, dass die cPPT- und CTS-Regionen zentral in der Sequenz des Vektors gelegen sind.
Mit "zentral gelegen" ist gemeint, dass die cPPT- und CTS-Regionen in der Mitte der Sequenz des Vektors liegen, oder ungefähr in der Mitte dieser Sequenz. Insbesondere die cPPT- und CTS-Regionen können im mittleren Drittel der retrotranskribierten linearen Vektor-DNA liegen.
Die zentrale Lage der Triplexsequenz, die bei der viralen Retrotranskription als Folge des Vorhandenseins der cPPT- und CTS-Sequenzen gebildet wird, ermöglicht eine Verbesserung der Transduktionsstufe der mit dem Vektor oder Vektorpartikeln in Kontakt gebrachten Zellen.
Alternativ kann gemäß einer Variante des Vektors die Transkriptionseinheit des Vektors, mit dem Transgen in die U3-Region der LTR-Region eingesetzt werden. Dementsprechend wird nach Retrotranskription das Transgen dupliziert und erscheint deshalb auf jeder Seite der Triplexse quenz, was daher ermöglicht, dass die Triplexsequenz an der zentralen Position des Vektors gelegen ist, ungeachtet der Größe des Transgens.
Die Erfindung betrifft auch Zellen, die mit der immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht wurden und betrifft insbesondere rekombinante Zellen, die durch den Vektor oder Vektorpartikel der immunogenen Zusammensetzung einer Transduktion unterzogen sind.
Diese Zellen sind mit Vorteil Antigen aufweisende Zellen. Als Beispiele können diese Zellen ausgewählt sein aus Lungenzellen, Gehirnzellen, Epithelialzellen, Astrocyten, Mycroglia, Oligodendrocyten, Neuronen, Muskelzellen, hepatischen, dendritischen, neuronalen Zellen, Zelllinien des Knochenmarks, Macrophagen, Fibroblasten, hematopoietischen Zellen.
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung kann auf diese Weise in Behandlungsprotokollen oder für die Herstellung von Behandlungszusammensetzungen für die therapeutische Behandlung von Tumoren und insbesondere von Krebs verwendet werden, um eine primäre zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen, insbesondere eine CTL-Antwort, die mit Vorteil eine Memory-CTL-Antwort ist. Alternativ kann sie als Hilfsbehandlung mit anderen bekannten Antikrebsbehandlungen verwendet werden.
Zum Beispiel kann die immunogene Zusammensetzung der Erfindung in Verbindung mit Chemotherapie oder Immunchemotherapie oder anderen Ansätzen zur Antikrebsbehandlung verwendet werden.
Unter dem Ausdruck "Antikrebsbehandlung" ist gemäß der vorliegenden Erfindung die Inhibierung des Wachstums des Tumors oder potentiellen Wachstums des Tumors oder die Inhibierung der Ausbreitung von bös artigen Zellen, darunter der Möglichkeit zur Beeinflussung der Bildung von Metastasen oder beides zu verstehen.
Deshalb betrifft gemäß der Erfindung der Ausdruck "Antikrebsbehandlung" Protokolle, die zur Beeinflussung des bösartigen Wachstums und der Ausbreitung von Tumoren verwendet werden, um einem Wiederaufflammen der Erkrankung zuvorzukommen, insbesondere in Hinblick auf die Tatsache, dass die immunogene Zusammensetzung in der Lage ist, eine zellvermittelte Memory-Antwort zu induzieren oder zu verbessern und allgemein daran teilzunehmen.
Tumoren, die mit den Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, sind zum Beispiel Melanome oder Karzinome (Lunge, Blase, Niere, Kolon) und Lymphproliferation.
Die Tumoren, die behandelt werden können, sind auch alle Tumoren, die tumorspezifische Antigene exprimieren, darunter Eigenproteinmutationen und/oder Eigenproteinüberexpressionen.
Jeder mögliche zulässige Verabreichungsweg der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung ist von Interesse, darunter Verabreichungsprotokolle mit ex vivo Schritten, zum Beispiel ex vivo Transduktion von Zielzellen gefolgt von Verabreichung der behandelten Zellen an den zu behandelnden Patienten.
Alternativ kann die immunogene Zusammensetzung der Erfindung dem Patienten direkt auf üblichen Verabreichungswegen verabreicht werden, darunter systemische (IV), lokale oder kutane, intradermale, zum Beispiel intratumorale Verabreichungswege.
In einer besonderen Ausführungsform kann die immunogene Zusammensetzung der Erfindung dem Patienten direkt in der Weise verab reicht werden, dass sie in vivo das Auftreten einer zellvermittelten Immunantwort, insbesondere einer CTL-vermittelten Immunantwort induziert, verbessert oder daran teilnimmt.
In einer anderen Ausführungsform werden die immunogenen Zusammensetzungen so verwendet, dass sie das Auftreten einer zellvermittelten Memory-Langzeitantwort ermöglichen.
Es wird betont, dass die immunogene Zusammensetzung der Erfindung aufgrund der Eigenschaft der cPPT- und CTS-Sequenzen, die im Vektor und Vektorpartikeln vorhanden sind, zum Induzieren oder Stimulieren der Kerneinführung des Vektorgenoms in die Zielzellen ein besonderes Interesse besitzt.
Ein besonderer Vorteil der immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung ist, dass sie verwendet werden können, um eine zellvermittelte Immunantwort gegen zahlreiche Epitope hervorbringen oder stimulieren können, die durch die Nukleotidsequenz oder das Transgen im Vektor oder den Vektorpartikeln kodiert werden, und sie können auch verwendet werden, um eine zellvermittelte Immunantwort gegen das Produkt der gesamten Sequenz eines Gens hervorzubringen oder zu stimulieren, zum Beispiel eines Gens eines pathogenen Stoffes oder Fragmente des Gens, die in der Lage sind, für mindestens 8 bis 15 Aminosäuren, bevorzugt 9 bis 12 Aminosäuren zu kodieren. Die Erfindung deckt auch eine Nukleotidsequenz ab, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine mehrfache Wiederholung (mindestens 2 identische Sequenzen) der Aminosäuresequenz kodiert, die eine Zellantwort induziert und/oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens 2 verschiedene Sequenzen enthält, die 2 Epitopen unterschiedlicher Krankheitserreger oder Tumorantigene entspricht.
Weitere Merkmale oder Vorteile der Erfindung sind in den folgenden Beispielen und Zeichnungen offenbart.
Legende der Figuren
1: von HIV-1 gewonnener positiver rekombinanter Triplex-DNA-Vektor, der für ein Melanompolyepitop kodiert.
2: CTL-Antworten von HHD-Mäusen nach Immunisierung mit dem TRIP-mel-IRES-GFP-Vektor.
3: GFP-Expression in menschlichen Zellen 5 Tage nach ihrer Transduktion durch die positiven oder negativen Vektoren von HIV-1 mit zentraler Triplex-DNA.
4: In vitro CTL-Antworten mit menschlichen dendritischen Zellen.
5: Restriktionskarte des Vektors pHR.MEL-IRES-GFP melanomspezifische CTL mono- oder polyepitopische Sequenzen Konstruktion von HR.MEL-IRES-GFP
Zum Konstruieren des Plasmids HL.MEL-IRES-GFP, das NdeI/XhoI-Fragment von TRIP.MEL-IRES-GFP hinterlegt bei der CNCM unter Nr. I-2185 am 20. April 1999 mit einem Teil des CMV-Promotors, dem Polyepitop MEL und dem IRES-GFP anstelle des NdeI/XhoI-Fragments von HR GFP, das einen Teil des CMV-Promotors und das GFP enthält.
6: Restriktionskarte des Vektors pTRIP.ILKE-IRES-GFP HIV-spezifische CTL mono- oder polyepitopische Sequenzen, dessen Epitop I9V.(ILKE); (RT 476-484)
Konstruktion von TRIP.ILKE-IRES-GFP (hinterlegt bei der CNCM, Paris, Frankreich am 6. Oktober 1999 unter Nr. I-2327.
TRIP.ILKE-IRES-GFP wurde durch Einsetzen des PCR-Produkts von ILKE in TRIP ΔE IRES-GFP, zwischen dem CMV-Promotor und der IRES konstruiert. Die Region um das CTL-Epitop beginnend mit ILKE wurde amplifiziert durch PCR auf der Matrix pLAI mit den Primern:
Eine Kozak-Sequenz wird in den vorderen Primer eingesetzt und ein Stopkodon wird in den hinteren Primer eingesetzt.
Nach Verdauen mit BglII/EcoRI wurde das PCR-Produkt in TRIP ΔE IRES-GFP in die BamHI/EcoRI-Stellen eingesetzt.
Der Vektor exprimiert einen bicistronischen Messenger, der für GFP kodiert und eine Region des RT-Gens von VIH, entsprechend einem Cluster von Epitopen, umfassend insbesondere das Epitop I9V (RT 476-484) mit Restriktion auf HLA.A2.1 (Walker B. D., 1989 PNAS 86, S. 9514–9518).
7: Restriktionskarte des Vektors pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP Translokation TEL/AML-Sequenz
TRIP.TEL/AML-IRES-GFP wurde durch Einsetzen des PCR-Produkts von TEL/AML in TRIP ΔE IRES-GFP, zwischen dem CMV-Promotor und der IRES konstruiert. Die Region um die Translokation zwischen TEL und AML wurde amplifiziert durch PCR mit den Primern:
Eine Kozak-Sequenz wird in den vorderen Primer eingesetzt und ein Stopkodon wird in den hinteren Primer eingesetzt.
Nach Verdauen mit BglII/Eco RI wurde das PCR-Produkt in TRIP ΔE IRES-GFP in die BamHI/EcoRI-Stellen eingesetzt.
8: Transduktionskapazität des positiven DNA-Triplexvektors von HIV, der für das Epitoppeptid I9V kodiert (gewonnen von HIV1 pol) und GFP von dendritischen Mäusezellen, die unter Verwendung von Knochenmarkszellen von transgenen HHD-Mäusen gewonnen sind.
Ungefähr 80% der dendritischen Mäusezellen werden durch den positiven rekombinanten Triplexvektor von HIV einer Transduktion unterzogen, wie es durch FACS-Analysen der intrazellulären GFP-Expression dokumentiert ist.
9: Bestimmung von CTL-Antworten von HHD-Mäusen nach Immunisierung mit dem für das DES-Gen von Mycobacterium tuberculosis kodierenden Vektor TRIP-des-IRES-GFP
10: Restriktionskarte von pTRIP.DES-IRES-GFP hinterlegt bei der CNCM am 11. Oktober 1999.
Beispiele
Lentivirale Vektoren besitzen die Fähigkeit zur Transduktion von Zellen, darunter nicht teilende Zellen, und werden zunehmend für die Gentherapie vorgeschlagen. Unlängst wurde gezeigt, dass lentivirale Vektoren, die die cis-agierende Polypurintraktsequenz (zentrale DNA-Triplex) enthalten, effizientere Transduktion bei Zellen von Menschen und Mäusen zeigen, als die mit Deletion für den zentralen DNA-Triplex (Charneau P. et al., J. Mol. Biol. 1994, 241, 651–662). Lentivirale Vektoren mit oder ohne die zentrale Triplex-DNA, und die für das selbe HLA-A2.1 Restriktionsmelanom-CTL-Polyepitop kodieren, wurden nun auf ihre Fähigkeit zum Induzieren von CTL-Antworten getestet. Die direkte Verabreichung in vivo des lentiviralen Vektors, der zentrale DNA enthält, induziert starke CTL-Antworten gegen alle Epitoppeptide, die von den Polyepitopsequenzen in "HLA-A2.1 reinen" HHD-Mäusen kodiert werden. Es wird ein klarer Vorteil für den lentiviralen Vektor gezeigt, der die Triplex-DNA enthält. Außerdem wurde gezeigt, dass der lentivirale Vektor, der Triplex-DNA enthält, Transduktion der menschlichen dendritischen Zellen bis zu 7-mal effizienter erreicht als der Vektor, der kein Triplex ent hält. Diese dendritischen Zellen mit ex vivo Transduktion rufen effizient spezifische primäre CTL-Antworten gegen die meisten Melanomepitoppeptide hervor. Da der Sicherheitsaspekt des modifizierten lentiviralen Vektors überwiegend gelöst ist, wird die Verwendung dieses Vektors nicht nur für Gentherapie beim Menschen in vivo vorgeschlagen, sondern auch für Immuntherapie bei Krebspatienten.
Einführung
Die Unterklasse Lentiviridiae der Retroviren kann die meisten Zelltypen infizieren, darunter nicht teilende Zellen. Diese Eigenschaft macht den Lentivirus für die Gentherapie interessant. Es wurden schon einige rekombinante lentivirale Vektoren mit Replikationsdefekt von verschiedenen Gruppen konstruiert (Naldini PNAS 93, 11382–8, Science, 1996). Diese überarbeiteten und entgifteten lentiviralen Vektoren werden als die effizientesten und sichersten Vektoren für die Gentherapie vorgeschlagen (Zufferey R. & Kim V. N. J. Virol. 72, 9873–80, 1998). Es wurde ein Vektor auf Basis des Lentivirus (HIV) des Menschen entwickelt, mit Pseudotyp des vesikularen Stomatitisvirus-G-Glycoproteins (VSVG) (Burns J. C., 1993 PNAS 90, 8033–7). Dieser Vektor weist Deletion für die meisten der nicht essentiellen Virusproteine auf, enthält aber eine cis-agierende Polypurintraktsequenz (cPPT, zentrale Triplex-DNA). Die zentrale Triplex-DNA verstärkt die Einführung von HIV-DNA-Molekülen nach Retrotranskription in den Kern beträchtlich. Ferner wurde beobachtet, dass der lentivirale Vektor, der die zentrale Triplex-DNA enthält, effizientere Transduktion bei Zellen von Mäusen und Menschen in vitro zeigt, als der Vektor, der den Triplex nicht enthält.
Die "HLA-A2.1 reine" transgene HHD-Maus (Pascolo et al., J. Exp. Med., 1997, 185: 2043–2051) ermöglicht eine experimentell kontrollierte Bestimmung des immunogenen Potentials von Epitoppeptiden und von verschiedenen Immunisierungsstrategien. Unter Verwendung dieser HHD-Mäuse wird die Fähigkeit eines Melanompolyepitops, das durch verschiedene rekombinante Vektoren kodiert wird, zur Induktion gleichzeitiger CTL-Antworten in einem einzelnen Tier berichtet. Die Fähigkeit von lentiviralen Vektoren mit oder ohne die zentrale Triplex-DNA, und die für das selbe Melanompolyepitop zur in vivo CTL-Induktion in transgenen HHD-Mäusen kodiert, wird das erste Mal untersucht. Außerdem wurde auch erforscht, ob dendritische Zellen des Menschen (hDC, human dendritic cells), die von den selben rekombinanten lentiviralen Vektoren Transduktion erfahren, primäre CTL-Antworten gegen die Melanompolyepitopgruppen ex vivo induzieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Triplex-DNA die Fähigkeit des lentiviralen Vektors zur Induktion spezifischer CTL-Antworten in vivo durch direkte Verabreichung der rekombinanten Vektoren oder ex vivo unter Verwendung von dendritischen Zellen nach Transduktion signifikant verstärkt.
Ergebnisse
Beispiel I: Melanompolyepitopimmunisierung
Nach Feststellung, dass Injektion von Rekombinanten-DNA, die für eine Melanompolyepitopgruppe kodiert, gleichzeitig CTL-Antworten gegen verschiedene Melanomepitope in HHD-Mäusen hervorrufen kann, wurde die immunogene Fähigkeit eines Lentivirusvektors, der für die selbe Melanompolyepitopgruppe kodiert (1 und Tabelle 1) getestet. Ein TRIP-mel-IRES-GFP-Vektor (CNCM I-2185 hinterlegt am 20. April 1999) wurde mit 1,25 μg/p24 pro Maus entweder intravenös, intraperitoneal oder subkutan verabreicht. Es wurden mindestens 3 Mäuse pro Gruppe verwendet.
Es wurden mehrere spezifische CTL-Antworten gleichzeitig gegen die meisten der zehn Melanomepitope induziert. Es wurden ungeachtet des Verabreichungsweges ähnliche CTL-Antworten sowohl gegen HeLa- Zellen mit Peptidbeladung (Tabelle 2), TRIP-mel-IRES-GFP-Transduktion, HHD-Transfektion (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Intraperitoneale Injektion induzierte jedoch etwas bessere CTL-Antworten. Starke Antworten wurden gegen NA17-A.nt38 und gp100.154 Epitoppeptide hervorgerufen. Signifikante Antworten wurden auch gegen gp100.457, MART.1.27, Mage-3 und Tyrosinase.368-D beobachtet. CTL-Antworten waren schwach gegen gp100.209, gp100.280, MART-1.32 und Tyrosinase.1. Die Epitope, die auf Immunisierung mit Vektor TRIP-mel-IRES-GFP schwache CTL-Antworten hervorrufen, fallen in die Gruppen der CTL-Nichtinduktoren (non CTL-inducer), wenn sie unter Verwendung anderer nicht lentiviraler Vektoren verabreicht werden.
Minimale Dosis an lentiviralem Vektor für in vivo nachweisbare CTL-Induktion
Die minimale Dosis an lentiviralem Vektor, die eine signifikante CTL-Antwort hervorruft, wurde in HHD-Mäusen unter Verwendung intraperitonealer Injektionen von Vektor TRIP-mel-IRES-GFP in sechs unterschiedlichen Dosen mit 4 Mäusen pro Dosis bestimmt. Es wurden zwei Experimente durchgeführt, in denen Effektorzellen von zwei Mäusen so vermischt werden, dass sie ähnliche E/T-Verhältnisse unmittelbar vor dem ⁵¹Cr-Test aufweisen. In den meisten Experimenten wurden die CTL-Antworten gegen alle Melanomepitoppeptide getestet. Weil die Ergebnisse in hohem Maß ähnlich sind und sehr homogen, wurden zum Zwecke der Klarheit und Vereinfachung nur die CTL-Antworten gegen Epitoppeptid NA17/A berücksichtigt, um den "Dosiseffekt" zu vergleichen. Die besten CTL-Antworten wurden unter Verwendung von Dosen zwischen 500 ng und 2500 ng/p24 pro Maus erhalten (Tabelle 2). Obwohl nachweisbare CTL-Antworten gegen einige der Melanomepitope erhalten wurden, wurden durch hohe Lentiviraldosen keine besseren CTL-Antworten als bei niedrigeren Dosen erhalten. Obwohl einige spezifische CTL-Antworten gegen einige der Melanomepitoppeptide aufge zeigt wurden, waren Dosen unter 500 ng/p24 pro Maus nicht ausreichend, um effiziente CTL-Antworten zu induzieren. Es ist anzumerken, dass bei einer Dosis von 1250 ng/p24 pro Maus einige Mäuse CTL-Antworten gegen zehn von zehn Epitopen in der Polyepitopgruppe erzeugten (3).
Memory-CTL-Langzeitinduktion
Acht Mäusen wurde der Vektor TRIP-mel-IRES-GFP injiziert. Die Mäuse wurden entweder 12 Tage oder 5 Monate nach Immunisierung getötet. Nach 5 Tagen in vitro Stimulation mit den Melanomepitoppeptiden und zwei weiteren Tagen mit 10% TCGF, wurden Effektorzellen von vier Mäusen vermischt und gegen mit Peptid beladene RMAS-Zellen mit HHD-Transfektion geprüft. Es wurden bei 12 Tage zuvor immunisierten Mäusen spezifische CTL-Antworten für alle Melanomepitoppeptide aufgezeigt, außer für gp100.209 und Mart1.32. Fünf Monate nach Injektion der TRIP-mel-IRES-GFP, induzierten alle primären CTL-induktorepitope noch starke CTL-Antworten (2). Das Niveau der CTL-Antworten 12 Tage oder 5 Monate nach Immunisierung von Mäusen war überraschend vergleichbar. Dies legt nahe, dass Zellen mit Transduktion durch den lentiviralen Vektor in vivo nicht durch das Immunsystem zerstört werden und die Produktion der kodierten Melanompolyepitope fortsetzen.
Rolle der zentralen Triplex-DNA für die Immunisierung in vivo
HHD-Mäuse wurden einzeln gleichzeitig mit Vektoren TRIP-mel-IRES-GFP und HR-mel-IRES-GFP immunisiert, die intraperitoneal in Dosen von 800 ng, 200 ng, 50 ng, 12 ng und 3 ng/p24 pro Maus verabreicht wurden. Mindestens vier Mäuse wurden für jede Dosis in zwei separaten Experimenten getestet. Nach in vitro Stimulation durch synthetische Peptide wurde die cytolytische Fähigkeit von Milzzellen unter Verwen[TEXT FEHLT] gebnisse in hohem Maß homogen sind, wurden zum Zwecke der Klarheit und Einfachheit nur CTL-Antworten gegen NA17/A, Mart-1.27, gp100.154 und Tyrosinase.368-D Epitoppeptid getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Allgemein brachten mit dem Vektor TRIP-LV in Dosen von 800 ng, 200 ng und 50 ng/p24 pro Maus immunisierte Mäuse besserte CTL-Antworten hervor als die mit dem Vektor HR-LV immunisierten Mäuse. Es zeigte sich keine nachweisbare CTL-Antwort bei einer Dosis unter 12 ng/p24 pro Maus, ungeachtet der verwendeten Vektoren (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigt die verstärkte Transduktionsfähigkeit von lentiviralen Vektoren, die den zentralen DNA-Komplex enthalten, im Vergleich zu denen ohne diesen Komplex.
Transduktion von dendritischen Zellen durch die lentiviralen Vektoren
Es wurde zu Beginn beobachtet, dass Tumorzellen wie MT4- und HeLa-Zellen durch den lentiviralen Vektor, der die zentrale Triplex-DNA enthält, eine bis zu 30-mal effizientere Transduktion erfahren können, als durch den Vektor ohne die zentrale Triplex-DNA. Die Transduktionsfähigkeit dieser beiden lentiviralen Vektoren bei unterschiedlichen Konzentrationen wurde dann an DC von gesunden Spendern oder von HHD-Mäusen getestet. Der Prozentanteil von DC, die GFP exprimieren und ihre mittlere Fluoreszenzintensität wurden durch FACS gemessen und als Transduktionswert der DC durch die beiden lentiviralen Vektoren betrachtet.
Der Vektor TRIP-GFP ergab effizientere Transduktion der Zellen als der Vektor HR-GFP und bei allen Vektorkonzentrationen. Die GFP-Expression bei DC von Mäusen und Menschen nach Transduktion durch den Vektor TRIP-GFP war entsprechend bis zu 3- und 7-mal höher als die Expression bei Transduktion durch den Vektor HR-GFP (3).
Primäre CTL-Induktion mit dendritischen Zellen des Menschen nach Transduktion durch Vektor TRIP-mel-IRES-GFP
Einkernige Zellen (MNC, mononuclear cells) erhalten von gesunden HLA-A2.1 Spendern wurden in vitro einmal wöchentlich unter Verwendung der DC vom selben Spender mit Transduktion durch TRIP-mel-IRES-GFP stimuliert. Das Auftreten von GFP-Expression in den dendritischen Zellen wurde durch FACS analysiert, um effiziente Transduktion nachzuweisen. Nach drei Wochen wurde die cytotoxische Kapazität der MNC in einem ⁵¹Cr-Assay unter Verwendung von peptid-gepulsten T2-Zellen als Ziele in FCS-freien Kulturbedingungen geprüft.
Die hDC nach Transduktion mit dem Vektor TRIP-mel-IRES-GFP induzierten signifikante CTL-Antworten gegen alle Melanomepitoppeptide außer Mart1.31, während hDC ohne Transduktion nur gewöhnliche Hintergrundantworten induzierten (4).
Diskussion
Jüngste Berichte zeigen, dass Vektoren von Lentivirus mit Replikationsdefekt eine Reihe von nicht teilenden Zellen einer Transduktion unterziehen können (Naldini, 1996, Kafri, 1997). Lentivirus kann durch die intakte Kernmembran von nicht teilenden Zellen eindringen (Case 1999). Es wurde nun aufgezeigt, dass diese Verfahrensweise überwiegend von einer cis-agierenden Polypurintraktsequenz begleitet wird, die die zentrale Triplex-DNA dominiert. Einführung dieser Sequenz in die von Lentivirus gewonnenen Vektoren ermöglicht bis zu 30-fach höhere stabile Transduktion in vivo und ex vivo bei einigen Zelltypen, darunter Neuronen, Hepatocyten und hematopoietischen Stamm-/Progenitorzellen.
Unlängst wurde Fortschritt beim Behandeln von Sicherheitsaspekten von aus Lentivirus gewonnenen Vektoren und ihrer Verwendung in der Gentherapie erzielt (Narry Kim V et al. 1988, Zufferey, 1999). Lentivirale Vektoren wurden jedoch noch nie bei Immuntherapieanwendungen untersucht, für die klassische retrovirale Vektoren der Maus und nicht retrovirale Vektoren erfolgreich verwendet werden (Condon 1996, Song 1997, Specht 1997). Um eine starke Impfstrategie zu entwickeln, wurde die immunogene Fähigkeit eines lentiviralen Vektors, der die zentrale Triplex-DNA enthält und ein Melanomepitop kodiert, getestet. Es wurde zunächst direkte Injektion dieses Vektors untersucht, um zu ermitteln, ob er in vivo spezifische CTL-Antworten gegen die Melanomepitope hervorrufen kann. Zuvor wurden einige Immunisierungsstrategien in HLA-A2.1 "reinen" transgenen HHD-Mäusen verglichen. Unter Verwendung rekombinanter pCMV-B10 (HBs) DNA oder rekombinanter Impfstoffe, die für das selbe Melanomepitop kodieren, war es möglich, gleichzeitig in einer einzelnen Maus CTL-Antworten gegen vier bis sechs verschiedene Peptide zu induzieren, die im Melanomepitop vorhanden sind. Für den Vektor TRIP-mel-IRES-GFP, der für das selbe Melanomepitop kodiert, wurden bezüglich der spezifischen Lysis, aber auch bezüglich der Anzahl Peptide, die CTL-Antworten hervorrufen, signifikant bessere Ergebnisse erzielt als mit anderen Vektoren, die für die selbe Polyepitopgruppe kodieren. Insbesondere intraperitoneale und subkutane Injektion des Vektors induzierte in einigen Mäusen CTL-Antworten gegen alle Epitope, die vom Vektor TRIP-mel-IRES-GFP kodiert werden.
Einige Gruppen berichten, dass dendritische Zellen nach Transduktion oder Peptidbeladung als potenter Immunisierungsansatz gegen eine Reihe von Krebszellen verwendet werden können (Mayardomo, JI, 1995, Song W, 1997, Specht, JM, 1997). Zum Zwecke dieser Erfindung wurde daher untersucht, ob dendritische Zellen von Mäusen und Menschen effizient einer Transduktion unterzogen werden können und primäre CTL-Antworten in vitro induzieren. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass diese Zellen leicht Transduktion erfahren können. Außerdem wiesen diese Zellen nach Transduktion alle Epitope auf, für die der rekombinante lentivirale Vektor kodiert. Interessanterweise erfahren dendritische Zellen des Menschen wahrscheinlich am leichtesten Transduktion. In vitro Transduktion von Zellen verhindert, dass lentivirale Vektoren ihr Genom in eine Reihe von Wirtszellen in schädlicher Weise integrieren. Aus diesem Grund sollten Zellen mit in vitro Transduktion ein geeignetes und sicheres Abgabeverfahren für eine erste klinische Anwendung bilden.
Warner et al. waren die Ersten, die die Fähigkeit von retroviralen Vektoren zum Induzieren effizienter CTL-Antworten in verschiedenen Tiermodellen zeigten, aber auch in HIV-Patienten, wobei retrovirale Mausvektor-Transduktions-HIV-1-Proteine mit Fibroblastexpression verwendet werden (berichtet von Warner 1998). Direkt in die Maus injiziert wurde provirale DNA in dendritischen Zellen nachgewiesen, die effizient Antigene aufweisen (Song, 1997). Im Gegensatz zu lentiviralen Vektoren, können die retroviralen Mausvektoren keine nicht teilenden Zellen zur Transduktion führen wie DC und in vivo Expression des kodierenden Gens erfährt oft einen "Shut-off". Folglich sind diese retroviralen Vektoren nicht die besten Kandidaten für eine Immuntherapie des Menschen (Kafri).
Die Ergebnisse der Erfindung demonstrieren deutlich, dass lentivirale Vektoren, die die zentrale Triplex-DNA enthalten, stärkere CTL-Antworten in vivo in HHD-Mäusen induzieren als die, die die zentrale Triplex-DNA nicht enthalten. Darüber hinaus können lentivirale Vektoren, die die zentrale Triplex-DNA enthalten, leicht hDC-Transduktion in vitro erreichen, was anschließend für klinische Immuntherapie verwendet werden kann.
Materialien und Verfahren
Konstruktionen lentiviraler Vektoren
Vektorplasmide: pTRIP-EGFP gewonnen aus HR'CMVLac2 (Naldini et al., PNAS 93, 11382–8, 1996). Das LacZ-Reportergen wird durch das EGFP-Gen ersetzt (Clontech). In TRIP-EGFP wird das EGFP-Gen an die ClaI-Stelle eines zentralen Fragments von HIV-1LAI eingesetzt, das cPPT- und CTS-Sequenzen umfasst.
Das EGFP-Gen wird durch PCR amplifiziert, wobei Pfu-Polymerase (Stratagene) vom pEGFP-N1-Plasmid verwendet wird, wobei BamHI und XhoI-Restriktionsstellen in 5' bzw. 3' hinzugefügt werden. PCR-Primer sind wie folgt:
HR GFP-Vektor wurde durch Zurückklonen dieses PCR-Fragments in BamHI- und XhoI-Stellen von pHR'CMVLacZ konstruiert, wobei LacZ ORF durch EGFP ersetzt wird.
Ein Fragment mit 178 bp von pLAI3 (4793 bis 4971) umfassend cPPT und CTS, wurde durch PCR amplifiziert. Es werden NarI-Restriktionsstellen in 5' der Primer hinzugefügt, mit dem Ziel dieses Fragment in die einzige ClaI-Stelle von HR GFP einzusetzen:
Insertion dieser Triplexsequenz in der korrekten Orientierung führt zum TRIP GFP Plasmidvektor, und TRIPinv GFP in der umgekehrten Orientierung. Alternativ wurde das selbe Triplexfragment aus pcPPT-AG-, pcPPT-D-, pcPPT-225- und pCTS-Plasmiden amplifiziert, um Vektoren zu erzeugen, die die selben Mutationen in cPPT oder in CTS wie die entsprechenden Viren aufweisen.
Zunächst wurde die im TRIP-GFP-Vektor oder TRIP-EGFP (hinterlegt bei der CNCM unter Nr. I-2005 am 25. April 1998) vorhandene EcoRI-Stelle gefüllt, wobei der TRIP-GFP-ΔE-Vektor gebildet wird. Dann wird ein 1,2 Kb BamHI/XhoI-Fragment, das die interne Ribosomeintrittstelle (IRES, internal ribosome entry site) eines Picomavirus enthält, vor dem EGFP anstelle des 0,7 kb BamHI/XhoI-EGFP in einen TRIP-GFP-ΔE-Vektor geklont, was den TRIP-ΔE-IRES-GFP-Vektor bildet. Die zwischen dem CMV-Promotor und der IRES-GFP-Sequenz vorhandenen Stellen sind BamHI-BstXI-SnaBi und EcoRI. Ein CTL-Polyepitopmelanom-Fragment (mel) wurde durch PCR auf dem pBS-mel-poly erzeugt, was eine Kozac-Konsensussequenz in den Pirmern 5BgIMlu Mel einsetzt:
Das mel-PCR-Fragment wird mit BglII/EcoRI verdaut und in die BamHI/EcoRI-Stellen von TRIP ΔE IRES GFP eingesetzt, was das TRIP ΔE mel IRES GFP bildet, auch TRIP mel IRES GFP genannt.
Das HR mel IRES GFP wird gebildet durch Austausch des NdeI/XhoI-Fragments, das das Melanompolyepitop enthält und das IRES GFP von TRIP mel IRES GFP gegen das von HR GFP. Die NdeI-Stelle ist am Ende des CMV-Promotors gelegen.
Herstellung von viralen Vektoren
Die lentiviralen Vektoren wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Naldini I. M. PNAS 1996 und Science 1996) durch eine Transient-Tree-Plasmid-Transfektion von 293 T-Zellen unter Verwendung der Phosphat-Calcium-Technik. Kurz gesagt, 293-Zellen erfahren Transfektion mit 20 μg des VSV-Hüllplasmids (pMDG) und 40 μg der verschiedenen Verpa ckungs- (8.2 oder 8.91) und lentiviralen Vektorplasmide. Konditionierte Medien werden 60 h und 84 h nach der Transfektion aufgenommen. Der Virus wird dann konzentriert und dNTPs wie zuvor beschrieben behandelt (Naldini Science 1996). Virustiter von HeLa P4.2-Zellen und MT4-Zellen wurden durch serielle Verdünnung und p24 ELISA-Assay bestimmt (Naldini Science 1996).
Eine Zyklustitration von Viren wurde dreifach durch Infektion von P4-Zellen auf 96-Lochplatten mit äquivalenten Mengen an Partikeln durchgeführt (1 ng von p24 Virusantigen pro Vertiefung), in Gegenwart von 20 μM DEAE-Dextran. Der Proteaseinhibitor Saquinavir (Roche) wurde mit 1 μM im Experiment zugegeben, um die Analyse auf einen einzigen Infektionszyklus zu beschränken. Die Zellmitose wurde am Tag vor der Infektion durch Aphicolinbehandlung (8 μM) inhibiert. Die β-Galactosidaseaktivität wurde 48 h nach Infektion mit einem chemilumineszenten β-Gal-Reportergenassay (Boehringer) gemessen.
HeLa-Zellen wurden dreifach mit äquivalenter Menge an Vektorpartikeln infiziert (5 ng p24 pro Vertiefung). 48 Stunden nach Transduktion wurde das Medium durch 200 μl TNB ersetzt (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) und die Fluoreszenz lebender Zellen mit einem Mikroplattenfluorimeter (Victor², Wallac) und EGFP geeigneten Filtern (Erregung: 485 nm, Emission: 520 nm) quantitativ bestimmt.
Mäuse. HHD-Mäuse wurden zuvor beschrieben (Pascolo, 1997). Sie exprimieren ein transgenes einkettiges Molekül der Histokompatibilitätsklasse I, in der das C-Ende des humanen b2m kovalent mit einem Peptidarm (GGGGS) × 3 am N-Ende einer Chimärenkette (HLA-A2.1 a1-a2, N-2D^b a3 – transmembrane und intracytoplasmatische Domänen) verknüpft ist. Das H-2D^b-Gen und Maus-b2m-Gen dieser Mäuse wurden durch homologe Rekombination weiter zerteilt, was zu einem vollständi gen Fehlen serologisch nachweisbarer Zelloberflächenexpression von Molekülen der Histokompatibilitätsklasse I der Maus führt.
Erzeugung von hDC und primäre CTL-Induktion
Dendritische Zellen des Menschen wurden aus Cytaphereseprodukten von gesunden Spendern des Haplotyps HLA-A2.1 (IDM, Paris, Frankreich) erhalten. FACS-Analyse dieser DC unter Verwendung von mAbs gegen CD3, CD14, CD80, CD83, HLA-ABC und HLA-DR zeigten einen unreifen DC-Phänotyp. Die hDC wurden in 1 ml AMV-5 Kulturmedium mit den lentiviralen Vektoren in Konzentrationen von 600 ng, 300 ng, 150 ng und 150 ng/p24 pro 1 × 10⁶ Zellen über zehn Tage einer Transduktion unterzogen. Der Prozentanteil und die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP-Expression in hDC nach Transduktion mit den beiden lentiviralen Vektoren wurden durch FACS gemessen (Becton Dickinson, BD, USA).
Mononukleare Zellen (MNC) vom selben Spender wurden in vitro durch die hDC oder hDC nach Transduktion mit einem Verhältnis von 4 MNC zu 1 hDC stimuliert. Die MNC wurden zweimal erneut stimuliert unter Verwendung der selben cryogelagerten hDC nach Transduktion und dann auf cytolytische Aktivität in einem 4 h ⁵¹Cr-Releaseassay getestet, wobei als Ziele T2-Zellen beladen mit relevanten oder negativen Kontrollpeptiden (Inf.m.58) (10 μg/ml, 5 × 10⁶ Zellen/ml, in FCS-freiem RPMI-Medium, 2 h bei RT) verwendet werden.
Erzeugung von dendritischen Zellen der Maus
Aus Knochenmark gewonnene dendritische Zellen wurden wie zuvor beschrieben erzeugt [43, 51]. Mononukleare Knochenmarkszellen wurden in RPMI versetzt mit 10% FCS, 2 mM L Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 5 × 10⁵ M 2-Mercaptoethanol (vollständiges RPMI-Medium), ferner versetzt mit 20 ng/ml rekombinantes GM-CSF der Maus und 100 ng/ml rekombinantes IL4 der Maus (beide von GENZYME, Cambridge, MA) kultiviert. An Tag 2 und 6 wurden nicht anhaftende Zellen sorgfältig entfernt und frisches vollständiges RPMI-Medium versetzt mit 10 ng/ml GM-CSF der Maus und 50 ng IL4 der Maus hinzugefügt. Am Tag 7 wurde das Kulturmedium durch 1 ml vollständiges RPMI-Medium versetzt mit den lentiviralen Vektoren in Konzentrationen von 600 ng, 300 ng, 150 ng und 150 ng/p24 pro 1 × 10⁶ Zellen ersetzt. Am Tag 9 aufgenommene dendritische Zellen waren mehr als 95 rein (IA^b+, HHD⁺, CD3^–, 33D1⁺, NDL145⁺ und CD 11c⁺) wie mit geeigneten mAb bestimmt. Der Prozentanteil und die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP-Expression von Maus-DC wurden dann am Tag 9 und 12 durch FACS gemessen.
Vektorimmunisierung und in vitro Restimulation und cytolytische Assays
HHD-Mäusen wurden 12 Tage entweder intraperitoneal, intravenös oder subkutan lentivirale Vektoren injiziert. Milzzellen von Mäusen wurden dann in vollständigem RPMI-Medium durch jedes Epitoppeptid über sieben Tage einzeln restimuliert. Die letzten beiden Tage wurden die kultivierten Zellen durch 10% TCGF restimuliert. Am Tag 7 wurden die kultivierten Zellen in einem 4 h ⁵¹Cr-Releaseassay auf cytolytische Aktivität getestet, wie es schon beschrieben wurde (Pascolo, 1997), wobei als Ziele TAP-RMA-S-Zellen mit HHD-Transfektion beladen mit relevanten oder negativen Kontrollpeptiden (Inf.m.58) (10 μg/ml, 5 × 10⁶ Zellen/ml, in FCS-freiem RPMI-Medium, 2 h bei RT) verwendet werden. Die HeLa-Zellen mit oder ohne TRIP-mel-ITES-GFP Transduktion und HHD-Transfektion wurden parallel als Zielzellen verwendet. Der Prozentanteil der spezifischen Lysis wurde wie folgt berechnet: (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(Gesamtfreisetzung – spontane Freisetzung) × 100
Beispiel II: Bestimmung von CTL-Antworten in HHD-Mäusen nach Immunisierung mit TRIP-des-IRES-GFP-Vektor, der für das DES-Gen von Mycobacterium tuberculosis kodiert
Das DES-Gen ist in WO 98/04711 offenbart.
Experimentelle Verfahrensweise
In einem ersten Schritt wurden die TRIP-des-IRES-GFP-Vektoren zur Transduktion von HeLa-HDD-Zellen verwendet. Diese Zellen erfahren Transduktion und Klonierung durch Grenzverdünnung. Der Klon, der das höhere GFP exprimiert, wurde zur Verwendung als Zielzellen in klassischen ⁵¹Cr-CTL-Tests ausgewählt.
In einem zweiten Schritt wurden HDD-Mäusen intraperitoneal 1,2 μg/p24 pro Maus der TRIP-des-IRES-GFP-Vektorpartikel injiziert. Milzzellen dieser Mäuse wurden in vitro an 12 Tagen nach Injektion stimuliert mit entweder 0,2 μg oder 1 μg/p24/ml (2 106 Zellen pro ml) der Vektorpartikel oder mit TRIP-des-IRES-GFP nach Transduktion, LPS stimulierten syngenetischen Blastzellen mit 1 μg/p24/ml/2 106 Zellen/ml. Sechs Tage nach in vitro Stimulation wurde die cytolytische Fähigkeit der Zellen in einem ⁵¹Cr-Test unter Verwendung der HeLa-HDD-Zielzellen mit des-Transduktion getestet. Kontrollzielzellen waren HeLa-HDD-Zellen nach Transduktion mit Melanompolyepitop (TRIP-mel-IRES-GFP).
Ergebnisse
Diese Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob von HIV gewonnene triplex-positivie Vektoren, die ein ganzes Gen kodieren, in der Lage sind, Zelltransduktion zu erreichen und spezifische CTL-Antworten gegen die Zielzellen zu induzieren, die das selbe Gen exprimieren. Wie in 9 dargestellt ist, wird unter allen Bedingungen spe zifische Lysis erhalten. LPS-Blastzellen nach Transduktion induzierten schwache CTL-Antworten. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung von 1 μg/p24/ml Vektorpartikel erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein gesamtes Gen in das Genom der Wirtzelle eingeführt werden kann und sein Produkt wird verarbeitet, ausgegeben und induziert signifikante CTL-Antworten. Diese Ergebnisse demonstrieren auch, dass des-Gen mindestens ein oder mehrere HLA-A2.1-Restriktions-CTL-Epitoppeptide enthält.
Literaturquellen

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Sequenzprotokoll

Claims

Immunogene Zusammensetzung, umfassend einen rekombinanten Vektor, in welchem ein DNA-Fragment eingefügt ist, das die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die cis-agierende Terminationsregion (CTS) umfaßt, das nach reverser Transkription fähig ist, eine dreisträngige DNA-Struktur (die DNA-Triplex) anzunehmen, wobei das DNA-Fragment retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs ist, wobei der Vektor zusätzlich eine transgene Sequenz aufweist, die ein oder mehrere Epitop(e) von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen und regulatorische Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs kodiert, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e), kodiert durch die in dem Vektor vorliegende transgene Sequenz, die immunogene Zusammensetzung befähigt (befähigen), eine zellvermittelte Antwort, beispielsweise eine CTL-(cytotoxische T-Lymphozyten)Antwort oder eine CD4-Antwort, zu induzieren oder zu stimulieren, wenn sie einem Patienten verabreicht wird.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment, das die cPPT- und CTS-Regionen umfaßt, 178 bp lang ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die hervorgerufene CTL-Antwort eine Memory-CTL-Antwort ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzen retroviralen Ursprungs von einem Lentivirus-Genom abstammen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Sequenz in einer Expressionskassette enthalten ist, die regulatorische Signale der Transkription und Expression einschließt.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend rekombinante retrovirale oder rekombinante retroviral-ähnliche Partikel, umfassend 1) eine transgene Sequenz, die ein oder mehrere Epitop(e) von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen kodiert, die unter der Kontrolle regulatorischer Signale der Transkription und Expression bzw. regulatorischer Signale zur Retrotranskription, Expression und Encapsidierung steht und 2) ein DNA-Fragment, das die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die cis-agierende Terminationsregion (CTS) umfaßt, das nach reverser Transkription fähig ist, eine dreisträngige DNA-Struktur (die DNA-Triplex) anzunehmen, wobei das DNA-Fragment retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs oder von einem Transposon ist und in einer funktionellen Orientierung und in eine Stelle mit regulatorischen Retrotranskriptions-Signalen retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs oder regulatorischen Transposonen-Signale eingefügt ist, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e), kodiert durch die in dem Vektor vorliegende transgene Sequenz, die immunogene Zusammensetzung befähigt (befähigen), eine zellvermittelte Antwort, z. B. eine CTL-(cytotoxische T-Lymphozyten)Antwort oder eine CD4-Antwort, zu induzieren oder zu stimulieren, wenn sie einem Patienten verabreicht wird.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die rekombinanten retroviralen Partikel ferner folgendes umfassen: a) ein gag-Polypeptid, das Kernproteinen eines Lentivirus oder funktionell abstammenden Polypeptiden (GAG-Polypeptide) entspricht, b) ein pol-Polypeptid, gebildet aus den RT-, PRO-, IN-Proteinen eines Lentivirus oder eines funktionell abstammenden Polypeptids (POL-Polypeptid), c) ein Hüll-Polypeptid oder funktionell abstammende Peptide (ENV-Polypeptide).
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die rekombinanten retroviral-ähnlichen Partikel umfassen: a) ein DNA-Fragment, das die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die cis-agierende Terminationsregion (CTS) umfaßt, das nach reverser Transkription fähig ist, eine dreisträngige DNA-Struktur (die DNA-Triplex) anzunehmen, wobei das DNA-Fragment von einem Retrotransposon abstammt und in einer funktionellen Orientierung mit regulatorischen Retrotransposon-Signalen eingefügt ist, b) ein Polypeptid, das den Kernproteinen eines Retrotransposons oder funktionell abstammenden Polypeptiden (GAG-Polypeptide) entspricht, c) ein pol-Polypeptid, das RT-, PRO-, IN-Proteinen eines Retrotransposons oder eines funktionell abstammenden Polypeptids (POL-Polypeptid) entspricht, d) ein virales Hüll-Polypeptid, e) eine transgene Sequenz, die ein oder mehrere Epitop(e) von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen kodiert, die unter der Kontrolle regulatorischer Signale der Transkription und Expression bzw. regulatorischer Retrotransposon-Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung steht, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e), kodiert durch die in dem Vektor vorliegende transgene Sequenz, die immunogene Zusammensetzung befähigt (befähigen), eine zellvermittelte Antwort, beispielsweise eine CTL-Antwort oder eine CD4-Antwort, zu induzieren oder zu stimulieren, wenn sie einem Patienten verabreicht wird.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das DNA-Fragment, das die cPPT- und CTS-Regionen umfaßt, 178 bp lang ist.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die hervorgerufene CTL-Antwort eine Memory-CTL-Antwort oder eine CD4-Antwort ist.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung lentiviralen Ursprungs sind und das Polynukleotid, das die cPPT- und CTS-Regionen umfaßt, lentiviralen Ursprungs ist.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung und das Polynukleotid, das die cPPT- und CTS-Regionen umfaßt, von einem Virus abstammen, der ausgewählt ist aus den Lentiviren CAEV, EIAV, VISNA, HIV, SIV oder FIV.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung und das Polynukleotid, das die cPPT- und CTS-Regionen in dem Vektor umfaßt, von einem Retrovirus des HIV-Typs, insbesondere HIV-1 oder HIV-2, abstammen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid des Vektors eine DNA-Sequenz ist, die die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die Terminationsregion (CTS) eines retroviralen HIV-1-Genoms umfaßt.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die gag-, pol- und env-Sequenzen der Vektorpartikel von den Sequenzen eines HIV-Retrovirus, insbesondere HIV-1 oder HIV-2, abstammen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die gag- und pol-Sequenzen von den Sequenzen eines HIV-Retrovirus abstammen und die env-Sequenz von einem anderen HIV-Retrovirus oder von einem Virus abstammt.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die env-Sequenz amphotrope ENV-Polypeptide kodiert.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die env-Sequenz ecotrope ENV-Polypeptide kodiert.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die env-Sequenz von dem vesikularen Stomatitisvirus (VSV) abstammt.
Vektorkonstrukt, welches ein Plasmid ist, nämlich pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP, am 11. Oktober 1999 unter Nummer I-2326 bei CNCM hinterlegt, pTRIP.DES-IRES-GFP am 11. Oktober 1999 unter I-2331 bei CNCM hinterlegt oder pTRIP.ILKE-IRES-GFP am 11. Oktober 1999 unter Nummer I-2327 bei CNCM hinterlegt, wobei die TEL/AML-, die DES- oder die ILKE-Epitope durch eine transgene Sequenz ersetzt sind, die ein oder mehrere Epitop(e) von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen kodiert.
Zelle, die mit einem rekombinanten Vektor oder rekombinanten Partikeln einer immunogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder einem Vektorkonstrukt nach Anspruch 20 transduziert ist.
Rekombinante Zelle nach Anspruch 21, welche eine Antigen-präsentierende Zelle ist oder eine Zelle, ausgewählt aus Lungenzellen, Gehirnzellen, Epithelialzellen, Astrocyten, Mycroglia, Oligodendrocyten, Neuronen, Muskel, hepatischen, dendritischen, neuronale Zellen, Zellinien des Knochenmarks, Macrophagen, Fibroblasten bzw. hematopoietischen Zellen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, zur therapeutischen Behandlung von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die transgene Sequenz ein Polyepitop von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen kodiert.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e) von Karzinomen von Nieren-, Blasen-, Darm- oder Lungenkarzinomen oder Brustkrebs abstammen.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e) oder das Polyepitop durch Mutation, Deletion oder Insertion verändert ist (sind).
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder ein Vektor oder ein Vektorpartikel, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die cPPT- und CTS-Regionen eine zentrale Stelle in der Sequenz des Vektors aufweisen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder ein Vektor oder ein Vektorpartikel, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die transgene Sequenz in die U3-Region des Regulationssignals zur Retrotranskription eingefügt ist.
Rekombinanter Vektor, in welchem ein DNA-Fragment eingefügt ist, das die cis-agierende zentrale Initiationsregion (cPPT) und die cis-agierende Terminationsregion (CTS) umfaßt, das nach reverser Transkription fähig ist, eine dreisträngige DNA-Struktur (die DNA-Triplex) anzunehmen, wobei das DNA-Fragment retroviralen oder retrovial-ähnlichen Ursprungs ist, wobei der Vektor zusätzlich eine transgene Sequenz aufweist, die ein oder mehrere Epitop(e) von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen und regulatorischer Signale der Retrotranskription, Expression und Encapsidierung retroviralen oder retroviral-ähnlichen Ursprungs kodiert, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e), kodiert durch die in dem Vektor vorliegende transgene Sequenz, die immunogene Zusammensetzung befähigt (befähigen), eine zellvermittelte Antwort, beispielsweise eine CTL-Antwort oder eine CD4-Antwort, zu induzieren oder zu stimulieren, wenn sie einem Patienten verabreicht wird.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 29, wobei das DNA-Fragment, das die cPPT- und CTS-Regionen umfaßt, 178 bp lang ist.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 29 oder 30, wobei die transgene Sequenz ein Polyepitop von Karzinomen, Leukämie oder Lymphomen kodiert.
Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e) von Nieren-, Blasen-, Darm- oder Lungenkarzinomen oder Brustkrebs abstammt (abstammen).
Rekombinanter Vektor nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das eine oder die mehreren Epitop(e) oder das Polyepitop durch Mutation, Deletion oder Insertion verändert ist (sind).
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, die fähig ist, die Kerneinfuhr des Vektorgenoms in Zielzellen zu induzieren oder zu stimulieren.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 29 bis 33 in einer immunogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20.