ES2337429T3 - Vectores lentivirales para la preparacion de composiciones inmunoterapeuticas. - Google Patents
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Abstract
Uso de: a) un transgén que es la secuencia de un gen de un agente patógeno o un fragmento de dicho gen que codifica para uno o varios epítopos de 8 a 15 aminoácidos, situado bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una orientación funcional con respecto a las señales reguladoras de origen retroviral o similar a retroviral mencionadas anteriormente, en la preparación de un vector.
Description
Vectores lentivirales para la preparación de
composiciones inmunoterapéuticas.
La presente invención se refiere al uso de
vectores retrovirales, y especialmente a vectores lentivirales para
la preparación de composiciones que son capaces de inducir o
contribuir a que tenga lugar o la mejora de una reacción
inmunológica in vitro, y en una realización preferida in
vivo, frente a epítopos que son codificados por secuencias de
nucleótidos presentes en los vectores.
Los inventores han mostrado que los vectores
preparados según la presente invención permiten obtener una
respuesta inmune mediada por células, especialmente una reacción de
linfocitos T citotóxicos (LTC) frente a epítopos.
La invención se refiere al uso de (a) un
transgén que es la secuencia de un gen de un agente patógeno o un
fragmento de dicho gen que codifica para uno o varios epítopos de 8
a 15 aminoácidos, situado bajo el control de señales reguladoras de
transcripción y expresión, (b) una secuencia que contiene señales
reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de
origen retroviral o similar a retroviral, y (c) regiones de
iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación
de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de
tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de
origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una
orientación funcional con respecto a las señales reguladoras de
origen retroviral o similar a retroviral mencionadas anteriormente,
en la preparación de un vector.
Además han obtenido datos que muestran que esta
respuesta inmune mediada por células puede ser una respuesta
específica, obtenida frente a uno o varios epítopos codificados por
la secuencia de nucleótidos contenidos en los vectores.
También la solicitud da a conocer medios que
podrían utilizarse para el tratamiento o profilaxis de enfermedades
infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con infección por
virus y por ejemplo, con infección por retrovirus.
Los inventores además han obtenido resultados
que muestran que la respuesta inmune mediada por células y
especialmente la respuesta LTC asociada con el tratamiento mediante
las composiciones de la invención puede ser específica para el
antígeno del tumor o del virus o células infectadas por el virus, y
también puede limitarse a moléculas específicas del CMH (complejo
mayor de histocompatibilidad).
Particularmente la invención se refiere al uso
de los vectores en composiciones inmunógenas, con el fin de obtener
una respuesta inmune mediada por células limitada a las moléculas de
clase I del complejo CMH y por ejemplo limitada a moléculas
HLA-A2 o B7.
En consecuencia, la solicitud se refiere a una
composición inmunógena que comprende un vector recombinante que
comprende un polinucleótido que engloba la región de iniciación
central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de
acción en cis (CTS). Durante la transcripción inversa, las
secuencias cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN
de tres cadenas denominada aquí en el presente documento como ADN
tricatenario. El ADN tricatenario estimula la importación nuclear de
genomas del ADN del vector, siendo estas regiones de origen
retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además
una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de
interés) y señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y
encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que
la composición es capaz de inducir o estimular una respuesta de LTC
(linfocitos T citotóxicos) o de CD4 frente a uno o varios epítopos
codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.
En una realización preferida de la invención, la
respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta
de LTC o la respuesta de CD4 frente a uno o varios epítopos es una
respuesta de LTC o de CD4 de memoria.
Se enfatiza que la presencia, en el vector, de
las regiones cPPT y CTS permiten que de ese modo se forme una
estructura de ADN tricatenario influyendo y especialmente mejorando
la importación nuclear del genoma del vector en células
recombinadas con dicho vector.
Esta capacidad de la composición inmunógena
según la presente invención para inducir, mejorar o en general para
asociarse a los acontecimientos de la respuesta de LTC de memoria,
permite proponer el uso de la composición inmunógena en los
protocolos de terapia antitumoral o terapia antivírica o
antipatógena, incluyendo si la respuesta inmune tiene que inducirse
en un largo periodo de tiempo o ser al menos inducible cuando se
busca una respuesta en un periodo de tiempo que puede ser inducción
a largo plazo de la respuesta, tras la administración de la
composición inmunógena. En otras palabras, puede usarse la
composición inmunógena para la preparación de composición
terapéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas, por
ejemplo mediante bacterias o virus, induciendo o estimulando o
participando en la aparición de una respuesta inmune mediada por
células, especialmente una respuesta de LTC o una respuesta de
memoria.
Se enfatiza que la composición inmunógena de la
invención, como consecuencia de la presencia de la estructura
tricatenaria en la secuencia del vector, que resulta de la presencia
de las regiones CTS y cPPT en el vector y en las partículas del
vector, permiten la estimulación de la importación nuclear del
genoma del vector, en células diana.
La presente invención abarca también el uso de
una secuencia nucleotídica que comprende las secuencias CTS y cPPT
de origen retroviral o sintético para aumentar la entrada de las
secuencias de nucleótidos o de péptidos en el núcleo de las células
diana o células receptoras.
Por tanto, la invención describe una composición
que podría utilizarse en protocolos terapéuticos que presentan
analogías con los protocolos de vacunación, para el tratamiento de
enfermedades antiinfeccioso.
Varios epítopos que forman un múltiple epítopo,
pueden codificarse por el transgén de la invención. Puede ensayarse
la respuesta inmune mediada por células in vitro o en una
realización preferida in vivo. Los protocolos que permiten
llevar a cabo tales ensayos se describen en los ejemplos.
Según otro aspecto de la invención, puede
utilizarse la composición inmunógena con el fin de obtener una
respuesta inmune mediada por células, en enfermedades infecciosas,
incluyendo infección asociada a virus, o infección ligada a
cualquier tipo de patógeno, incluyendo Mycobacteria, por
ejemplo M. tuberculosis.
En este caso pueden identificarse antígenos
específicos capaces de provocar una respuesta inmune mediada por
células y pueden insertarse sus secuencias codificantes en el vector
utilizado en la composición inmunógena. Puede utilizarse como
ejemplo el gen des de M. tuberculosis.
Se añade también que los vectores preparados
según la invención que se utilizan en las composiciones inmunógenas
pueden expresar epítopos o pueden estar presentes en proteínas
(incluyendo glucoproteínas u otros compuestos derivados de
proteínas) identificadas como antígenos diana en células infectadas
por virus.
Además, se observa que epítopos, polipéptidos o
proteínas utilizadas para proporcionar epítopos, pueden modificarse,
por ejemplo mediante mutación, deleción o inserción y por ejemplo
pueden modificarse para mejorar su estabilidad.
La solicitud se refiere también una composición
inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes que
comprenden:
- 1)
- una secuencia de nucleótidos recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos definida (transgén), situada bajo el control de las señales reguladoras de la transcripción y expresión, señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y,
- 2)
- un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral o de un transposón e insertándose en una localización y orientación funcionales con señales reguladoras de retrotranscripción de origen retroviral o similar a retroviral o señales reguladoras de transposones,
en la que la composición inmunógena es capaz de
inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T
citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la
secuencia de transgén presente en el vector.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN que engloba las secuencias
activas- en cis CTS y cPPT es capaz de adoptar una estructura de
ADN de tres cadenas, el "ADN tricatenario", tras la
transcripción inversa y de estimular la entrada nuclear del ADN del
vector.
Según una realización particular, la composición
inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de
LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos
codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector,
comprenden partículas de vector retroviral recombinante que
comprenden:
- a.
- un polipéptido gag que corresponde a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),
- b.
- un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),
- c.
- un polipéptido de envoltura o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV)
- d.
- una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés), que codifica para uno o varios epítopos, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral y un polinucleótido que contiene una región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una orientación funcional con las señales reguladoras mencionadas anteriormente de origen retroviral o similar a retroviral.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización, la composición
inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de
LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos
codificados por la secuencia transgén presentes en el vector que
comprende partículas similares a retroviral recombinantes que
comprenden:
a) un polinucleótido que contiene una región de
iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de
terminación de acción en cis (CTS), derivándose estas regiones de un
retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con
señales reguladoras de retrotransposón,
b) un polipéptido que corresponde a las
nucleoproteínas de un retrotransposón o a polipéptidos derivados
funcionales (polipéptidos GAG),
c) un polipéptido pol que corresponde a
proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposón o un polipéptido
derivado funcional (polipéptido POL),
d) un polipéptido de envoltura viral,
e) una secuencia de nucleótidos recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o
secuencia de interés), situada bajo el control de señales
reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de
retrotransposón de retrotranscripción, expresión y
encapsidación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las partículas de vector retroviral
recombinantes que están presentes en la composición inmunógena que
responden a una u otra de las definiciones anteriores son capaces
en una realización preferida de inducir, mejorar o estar asociadas
a la aparición de una respuesta inmune mediada por células de
memoria y especialmente una respuesta de LTC de memoria.
Según lo anterior, pueden prepararse las
definiciones descritas de la composición inmunógena que contiene
los vectores o las partículas de vector según varias realizaciones
posibles.
En una realización preferida de la invención, se
prepara la composición inmunógena de manera que las secuencias de
origen retroviral se derivan de un genoma de lentivirus.
Según otra realización, estas secuencias son de
origen similar a retroviral y se derivan de retrotransposón.
En otra realización de la invención, o además de
las características anteriormente definidas, el transgén o
secuencia de interés que se contiene en el vector recombinante se
contiene en un casete de expresión que incluye señales reguladoras
de transcripción y expresión.
Alternativamente, las señales reguladoras de
retrotranscripción, expresión y encapsidación del vector son de
origen lentiviral y el polinucleótido que comprende las regiones CTS
y cPPT es de origen lentiviral.
Según otra realización, las señales reguladoras
de retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido
que comprende las regiones CTS y cPPT en el vector, se derivan de
un retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1 o
VIH-2.
Pueden utilizarse otros virus y especialmente
lentivirus para diseñar las señales reguladoras de
retrotranscripción, expresión y encapsidación, y también para
derivar el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT.
Especialmente, por tanto pueden utilizarse los lentivirus CAEV,
EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.
Para la obtención de las partículas retrovirales
recombinantes de la composición inmunógena de la invención, las
secuencias que codifican para los polipéptidos o proteínas
necesarias para la transcomplementación de los vectores son por
ejemplo proteínas GAG, POL, y ENV derivadas de lentivirus, y
especialmente de VIH, que incluye retrovirus VIH-1
y VIH-2.
Alternativamente, pueden derivarse las
secuencias GAG y POL de un virus diferente que el de la secuencia
ENV. Por ejemplo, pueden derivarse las secuencias GAG y POL del
retrovirus VIH y la secuencia ENV puede derivarse de otro virus o
retrovirus, y pueden ser secuencias ENV o bien anfotrópicas o bien
ecotrópicas.
En otra realización, la secuencia ENV se deriva
del virus de la estomatitis vesicular (VEV).
Según una realización particular, la composición
inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de
LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos
codificados por la secuencia de transgén presente en el vector,
comprende partículas similares a retroviral recombinantes que
comprenden:
a) un polinucleótido que contiene una región de
iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de
terminación de acción en cis (CTS), derivándose estas regiones de un
retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con
señales reguladoras de retrotransposón,
b) un polipéptido que corresponde a las
nucleoproteínas de un retrotransposón o a polipéptidos derivados
funcionales (polipéptidos GAG)
c) un polipéptido pol que corresponde a
proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposón o un polipéptido
derivado funcional (polipéptido POL),
d) un polipéptido de envoltura viral,
e) una secuencia de nucleótidos recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o
secuencia de interés), situada bajo el control de señales
reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de
retrotransposón de retrotranscripción, expresión y
encapsidación.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición inmunógena de la invención que
comprende las partículas similares a retroviral recombinantes son
capaces en una realización preferida de generar una respuesta
mediada por células de memoria, especialmente una respuesta de LTC
de memoria según las características descritas anteriormente.
La solicitud se refiere también a constructos de
vector que se han depositado con la CNCM (Collection Nationale de
Culture de Microorganismes en el Instituto Pasteur en París,
Francia) el 11 de octubre de 1999.
Un primer vector es
pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP, depositado
bajo el número I-2326 el 11 de octubre de 1999 y un
segundo vector se designa
pTRIP-ILKE-IRES-GFP,
y se ha depositado bajo el número I-2327 el 11 de
octubre de 1999.
Un tercer vector,
pTRIP.DES-IRES-GFP se ha depositado
con la CNCM bajo el número I-2331 el 11 de octubre
de 1999.
Las secuencias que codifican para los antígenos
que están presentes en los constructos anteriores pueden sustituirse
por cualquier otro antígeno o epítopo de interés, incluyendo el gen
DES completo citado anteriormente de M. tuberculosis.
Según otro aspecto, los vectores, partículas de
vector y composiciones inmunógenas que comprenden los mismos, se
diseñan de tal manera que las regiones CTS y cPPT se localizan
centralmente dentro de la secuencia del vector.
Por "localizada centralmente", se quiere
decir que las regiones CTS y cPPT están el centro de la secuencia
del vector, o aproximadamente en el centro de esta secuencia.
Especialmente, las regiones CTS y cPPT pueden estar en el tercio
central del ADN del vector lineal retrotranscrito.
La localización central de la secuencia
tricatenaria formada durante la retrotranscripción viral como
consecuencia de la presencia de las secuencias CTS y cPPT permiten
una mejora de los niveles de transducción de células en contacto
con el vector o partículas del vector.
Alternativamente, según una variante del vector,
puede insertarse la unidad de transcripción del vector, que incluye
el transgén dentro de la región U3 de la región LTR. En
consecuencia, tras la retrotranscripción, se duplica el transgén y
por tanto aparece a cada lado de la secuencia tricatenaria,
permitiendo por tanto que la secuencia tricatenaria se localice en
la posición central en el vector, cualquiera que sea el tamaño del
transgén.
La solicitud también describe células que se han
puesto en contacto con la composición inmunógena según la invención
y especialmente se refiere a células recombinantes transducidas por
el vector o partículas de vector de la composición inmunógena.
Estas células son, ventajosamente, células
presentadoras de antígeno. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse
estas células de entre células de pulmón, células de cerebro,
células epiteliales, astrocitos, microglía, oligodendrocitos,
neuronas, células musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales,
cepas celulares de la médula ósea, macrófagos, fibroblastos,
células hematopoyéticas.
Son de interés cualquier vía de administración
posible aceptable de la composición inmunógena de la invención
incluyendo protocolos de administración que comprenden etapas ex
vivo, por ejemplo transducción de células diana ex vivo
seguida de administración de las células tratadas al paciente que va
a tratarse.
Alternativamente, la composición inmunógena
según la invención puede administrarse directamente al paciente a
través de vías usuales de administración, incluyendo las vías de
administración sistémica (IV), local, cutánea, intradérmica, por
ejemplo intratumoral.
En una realización particular, la composición
inmunógena puede administrarse directamente al paciente, de manera
que inducirá, mejorará o participará in vivo en la aparición
de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una
respuesta inmune mediada por LTC.
En otra realización, se utilizan las
composiciones inmunógenas de modo que pueden permitir la aparición
de una respuesta mediada por células de memoria a largo plazo.
Se enfatiza que la composición inmunógena de la
invención tiene un particular interés debido a la propiedad de las
secuencias CTS y cPPT que están presentes en el vector y partículas
de vector, para inducir o para estimular la importación nuclear del
genoma del vector en las células diana.
Una ventaja particular de las composiciones
inmunógenas es que pueden utilizarse para provocar o estimular una
respuesta inmune mediada por células frente a epítopos múltiples
codificados por la secuencia de nucleótidos de interés o transgén
presente en el vector o partículas de vector, y también pueden
utilizarse para provocar o estimular una respuesta inmune mediada
por células frente al producto de una secuencia completa de un gen,
por ejemplo un gen de un agente patógeno o fragmentos de dicho gen
capaz de codificar para al menos de 8 a 15 aminoácidos
preferiblemente de 9 a 12 aminoácidos. La solicitud describe también
una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para una repetición múltiple (al menos 2
secuencias idénticas) de dicha secuencia de aminoácidos que induce
una respuesta celular y/o una secuencia de aminoácidos que contiene
al menos 2 secuencias diferentes que corresponden a 2 epítopos de
patógenos diferentes.
Otras características y ventajas de la invención
se describen en los ejemplos y dibujos siguientes.
Figura 1: vector recombinante positivo de ADN
tricatenario derivado de VIH-1 que codifica para
múltiples epítopos de melanoma.
Figura 2: respuestas de LTC de ratones HHD tras
la inmunización con el vector
TRIP-mel-IRES-GFP.
Figura 3: expresión de GFP en células humanas 5
días después de su transducción por los vectores derivados de
VIH-1 negativo o positivo de ADN tricatenario
central.
Figura 4: respuestas de LTC in vitro
utilizando células dendríticas humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5: mapa de restricción del vector
pHR.MEL-IRES-GFP.
Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC
específicos de melanoma.
Construcción de
HR.MEL-IRES-GFP.
Para construir el plásmido
HL.MEL-IRES-GFP, el fragmento
NdeI/XhoI del TRIP.MEL-IRES-GFP
depositado en la CNCM con el número I-2185 el 20 de
abril de 1999 que contiene parte del promotor de CMV, los múltiples
epítopos MEL y el IRES-GFP en lugar del fragmento
NdeI/XhoI de HR GFP que contiene parte del promotor CMV y el
GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: mapa de restricción del vector
pTRIP.ILKE-IRES-GFP.
Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC
específicos de VIH, cuyo epítopo I9V.(ILKE); (RT
476-484).
Construcción de
TRIP.ILKE-IRES-GFP (depositado en la
CNCM, París, Francia el 6 de octubre de 1999 con el número
I-2327).
Se construyó
TRIP.ILKE-IRES-GFP mediante
inserción del producto de PCR de ILKE en TRIP \DeltaE
IRES-GFP, entre el promotor de CMV y el IRES. Se
amplificó mediante PCR la región que rodeaba al epítopo LTC que
empezaba por ILKE en la matriz pLAI con los cebadores:
Se insertó una secuencia de Kozak dentro del
cebador en el sentido de 5' y se insertó un codón de parada dentro
del cebador en el sentido de 3'. Tras la digestión con BglII/Eco RI
se insertó el producto de PCR dentro de TRIP \DeltaE
IRES-GFP dentro de los sitios BamHI/EcoRI. El vector
expresa un mensajero bi-cistrónico que codifica
para GFP y una región del gen de RT (transcriptasa inversa) de VIH,
que corresponde a un grupo de epítopos, que comprenden
especialmente el epítopo I9V (RT 476-484)
restringido a HLA.A2.1 (Walker B.D., 1989 PNAS 86 pág.
9514-9518).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7: mapa de restricción del vector
pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP.
Secuencia de TEUAML de translocación.
Se construyó
TRIP.TEL/AML-IRES-GFP mediante
inserción del producto de PCR de TEUAML dentro de TRIP \DeltaE
IRES-GFP, entre el promotor de CMV y el IRES. Se
amplificó mediante PCR la región que rodeaba la translocación entre
TEL y AML con los cebadores:
Se insertó una secuencia Kozak dentro del
cebador en el sentido de 5' y se insertó un codón de parada en el
cebador en el sentido de 3'. Tras la digestión con Bgl II/EcoRI se
insertó el producto de PCR dentro de TRIP \DeltaE
IRES-GFP dentro de los sitios de BamHI/EcoRI.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8: capacidad de transducción del vector
positivo de ADN tricatenario derivado de VIH que codifica para el
péptido de epítopo I9V (derivado de pol VIH-1) y GFP
de células dendríticas murinas que se produjeron utilizando células
de médula ósea de ratones transgénicos HHD. Se transdujeron
aproximadamente el 80% de las células dendríticas murinas mediante
el vector recombinante positivo tricatenario derivado de VIH tal
como se documenta en los análisis FACS de expresión de GFP
intracelular.
Figura 9: evaluación de las respuestas de LTC en
ratones HHD después de la inmunización con el vector
TRIP-des-IRES-GFP
que codifica para el gen DES de Mycobacterium
tuberculosis.
Figura 10: mapa de restricción de
pTRIP.DES-IRES-GFP depositado en la
CNCM el 11 de octubre de 1999.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores lentivirales tienen la capacidad de
transducir células, incluyendo células que no se dividen, y se
proponen de manera creciente para la terapia génica. Recientemente,
se mostró que los vectores lentivirales que contienen la secuencia
de acción en cis del tracto de polipurina (ADN tricatenario central)
muestran una transducción más eficaz de células murinas y humanas
que aquellos con el ADN tricatenario central eliminado (Charneau P.
et al, J. Mol. Biol. 1994, 241, 651-662). Se
han probado ahora los vectores lentivirales que contienen o no ADN
tricatenario central y que codifican para los mismos múltiples
epítopos de LTC de melanoma restringido por
HLA-A2.1 para determinar sus capacidades para
inducir respuestas de LTC. La administración directa in vivo
del vector lentiviral que contiene ADN central indujo respuestas de
LTC fuertes frente a todos los péptidos epítopos codificados por
las secuencias de múltiples epítopos en ratones HHD de
"HLA-A2.1 pura". Se mostró una clara ventaja
para el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario. Además,
se mostró que el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario
transduce las células dendríticas humanas de manera hasta 7 veces
más eficaz que el vector que no contiene el ADN tricatenario. Estas
células dendríticas transducidas ex vivo provocaron
respuestas de LTC primarias específicas eficaces frente a la mayoría
de los péptidos epítopos de melanoma. Ya que ha sido resuelto en
mayor parte el asunto de la seguridad del vector lentiviral
modificado, se propone el uso de ese vector no solo para terapia
génica humana in vivo, sino también para inmunoterapia de
pacientes con cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
La subclase lentiviridae de retrovirus puede
infectar a la mayoría de los tipos de células incluyendo las
células que no se dividen. Esta propiedad hace a los lentivirus
atractivos para la terapia génica. Ya se han construido varios
vectores lentivirales recombinantes de replicación defectuosa por
diferentes grupos (Naldini PNAS 93, 11382-8,
Science, 1996). Estos vectores lentivirales destoxificados y creados
de nuevo por ingeniería se proponen como los vectores de terapia
génica más eficaces y seguros (Zufferey R, y Kim V.N. J Virol, 72,
9873-80, 1998). Se desarrolló un vector basado en
VIH lentiviral humano, pseudotipado con glucoproteína G de virus de
estomatitis vesicular (VSVG) (Bums J.C., 1993 PNAS 90,
8033-7). Este vector se suprimió para la mayoría de
las proteínas virales no esenciales pero contiene una secuencia de
acción en cis del tracto de polipurina (cPPT, ADN tricatenario
central). El ADN tricatenario central aumenta de manera considerable
la importación nuclear de moléculas de ADN de VIH retrotranscritas.
Además, se observó que el vector lentiviral que contiene el ADN
tricatenario central presenta una transducción más eficaz de células
murinas y humanas in vitro que el vector que no contiene el
ADN tricatenario.
\newpage
La solicitud WO98/39463 describe vectores con
proteínas no esenciales eliminadas, en el estudio de la transducción
celular, y demuestra que la eliminación de la mayoría de las
proteínas no esenciales no alteró la transducción ni la importación
nuclear del genoma viral y su integración. Menciona que algunos
otros factores deben mediar la transferencia del complejo de
preintegración en el núcleo, y que esta función parece retenerse en
los genes gag, pol, tat o rev. No se indicó ni la naturaleza del
factor, ni su ubicación.
El ratón transgénico HHD de
"HLA-A2.1 pura" (Pascolo et al., J. Exp.
Med., 1997, 185: 2043-2051) permite una evaluación
controlada de manera experimental del potencial inmunógeno de
péptidos epítopos y de varias estrategias de inmunización.
Utilizando estos ratones HHD, se ha informado de la capacidad de
múltiples epítopos de melanoma codificados por diferentes vectores
recombinantes para inducir repuestas de LTC simultáneas en un único
animal. Se ha estudiado en primer lugar la capacidad de los
vectores lentivirales que contienen o no ADN tricatenario central y
que codifican para los mismos múltiples epítopos de melanoma para la
inducción de LTC in vivo en ratones transgénicos HHD.
Además, también se investigó si las células dendríticas humanas
(DCh) transducidas mediante los mismos vectores lentivirales
recombinantes inducen repuestas de LTC primarias frente al motivo
de múltiples epítopos de melanoma ex vivo. Los presentes
resultados demuestran que el ADN tricatenario aumenta de manera
significativa la capacidad del vector lentiviral para inducir
respuestas de LTC específicas in vivo mediante la
administración directa de los vectores recombinantes o ex
vivo utilizando las células dendríticas transducidas.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen DES se describe en el documento WO
98/04711.
\vskip1.000000\baselineskip
En una primera etapa, se utilizaron los vectores
TRIP-des-IRES-GFP
para transducir las células HeLa-HDD. Estas células
se transdujeron y se clonaron limitando la dilución. Se seleccionó
el clon que expresó el nivel más alto de GFP para utilizarlo como
células diana en pruebas de LTC de ^{51}Cr clásicas.
En una segunda etapa, se inyectaron ratones HDD
por vía intraperitoneal utilizando 1,2 \mug/p24 por ratón de las
partículas de vector
TRIP-des-IRES-GFP.
Se estimularon in vitro células del bazo de estos ratones 12
días después de la inyección con o bien 0,2 \mug o 1 \mug/p24/ml
(2x10^{6} células por ml) de partículas de vector o bien con
blastocitos singénicos estimulados con LPS, transducidos con
TRIP-des-IRES-GFP
con 1 \mug/p24/ml/2x10^{6} células/ml. Seis días después de la
estimulación in vitro, se comprobó la capacidad citolítica
de las células en un ensayo de ^{51}Cr utilizando células diana
HeLa-HDD transducidas con des. Las células diana de
control fueron células HeLa-HDD transducidas por el
múltiple epítopo de melanoma
(TRIP-mel-IRES-GFP).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos se han realizado para
estudiar si los vectores positivos tricatenarios derivados de VIH
que codifican para un gen completo son capaces de transducir células
y de inducir respuestas específicas de LTC frente a las células
diana que expresan el mismo gen. Tal como se ilustra en la figura 9,
se obtiene una lisis específica en todas las condiciones. Los
blastocitos de LPS transducidos indujeron respuestas de LTC
débiles. Se obtuvieron los mejores resultados utilizando 1
\mug/p24/ml de partículas de vector. Estos resultados muestran
que puede introducirse un gen completo en el genoma de la célula
huésped y se procesa y presenta su producto, e induce respuestas de
LTC significativas. Estos resultados también demuestran que el gen
des contiene al menos uno o más péptidos epítopos de LTC
restringidos por HLA-A2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
comparativo
Tras establecer que la inyección de ADN
recombinante que codifica para un motivo de múltiples epítopos
derivado de melanoma puede provocar respuestas de LTC simultáneas
frente a varios epítopos de melanoma en ratones HHD, se probó la
capacidad inmunógena de un vector lentiviral que codifica para el
mismo motivo de múltiples epítopos de melanoma (fig. 1 y tabla 1).
Se administró un vector
TRIP-mel-IRES-GFP
(CNCM I-2185 depositado el 20 de abril de 1999) a
1,25 \mug/p24 por ratón por vía intravenosa, intraperitoneal o
subcutánea. Se usaron al menos 3 ratones por grupo.
Se indujeron simultáneamente respuestas de LTC
específicas múltiples frente a la mayoría de los diez epítopos de
melanoma. Se observaron respuestas de LTC similares
independientemente de la vía de administración frente a ambos
péptidos cargados (tabla 2) y células HeLa transfectadas de HHD,
transducidas de
TRIP-mel-IRES-GFP
(valores no mostrados). Sin embargo, la inyección intraperitoneal
indujo respuestas de LTC levemente mejores. Se provocaron
respuestas fuertes frente a péptidos epítopos
NA17-A.nt38 y gp100.154. También se observaron
repuestas significativas frente a gp100.457, MART.1.27,
Mage-3, y Tirosinasa.368-D. Las
respuestas de LTC fueron débiles frente a gp100.209, gp100.280,
MART-1.32, y Tirosinasa.1. Los epítopos que provocan
respuestas de LTC débiles seguidas de inmunización del vector
TRIP-mel-IRES-GFP
caen todos en los grupos de no inductores de LTC cuando se
administran utilizando otros vectores no lentivirales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la dosis mínima de vector
lentiviral que provoca una respuesta de LTC significante en ratones
HHD utilizando inyecciones intraperitoneales del vector
TRIP-mel-IRES-GFP en
seis dosis diferentes utilizando 4 ratones por dosis. Se llevaron a
cabo dos experimentos en los cuales se mezclaron células efectoras
de dos ratones para tener razones similares E/T justo antes del
ensayo de ^{51}Cr. Se probaron en la mayoría de los experimentos
respuestas de LTC frente a todos los péptidos epítopos de melanoma.
Debido a que los resultados fueron altamente similares y muy
homogéneos, se tuvieron en cuenta solamente las respuestas de LTC
frente al péptido epítopo NA17/A para comparar la relación
"dosis-efecto" por el bien de la claridad y
simplicidad. Se obtuvieron las mejores respuestas de LTC utilizando
dosis de entre 500 ng y 2500 ng/p24 por ratón (tabla 2). Aunque se
obtuvieron repuestas de LTC detectables frente a algunos de los
epítopos de melanoma, altas dosis de lentiviral no indujeron
mejores respuestas de LTC que las dosis bajas. Incluso aunque se
pusieron en evidencia algunas respuestas de LTC específicas frente
a algunos péptidos epítopos de melanoma, dosis inferiores a 500
ng/p24 por ratón no fueron suficientes para inducir respuestas de
LTC eficaces. Debe observarse que en dosis de 1250 ng/p24 por ratón
algún ratón generó respuestas de LTC frente a diez de los diez
epítopos incluidos en el motivo de múltiples epítopos (fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron a ocho ratones con el vector
TRIP-mel-IRES-GFP.
Se sacrificaron los ratones o bien 12 días o bien 5 meses después
de la inmunización. Tras 5 días después de la estimulación in
vitro con los péptidos epítopos de melanoma y dos días
adicionales con TCGF al 10%, se mezclaron las células efectoras de
los cuatro ratones y se probaron frente a células RMAS
transfectadas de HHD cargadas con péptidos. Se evidenciaron las
respuestas de LTC específicas para todos los péptidos epítopos de
melanoma menos para gp100.209 y Mart1.32 en ratones inmunizados 12
días antes. Cinco meses después de la inyección del
TRIP-mel-IRES-GFP,
todavía indujeron respuestas de LTC fuertes todos los epítopos
inductores de LTC primarios (fig. 2). Fue sorprendentemente
comparable el nivel de las respuestas de LTC 12 días o 5 meses
después de la inmunización de los ratones. Esto sugiere que las
células transducidas in vivo mediante el vector lentiviral
no se destruyen por el sistema inmunitario y continúan produciendo
los múltiples epítopos de melanoma codificantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron individualmente ratones HHD con
los vectores
TRIP-mel-IRES-GFP y
HR-mel-IRES-GFP al
mismo tiempo administrados por vía intraperitoneal en dosis de 800
ng, 200 ng, 50 ng, 12 ng, y 3 ng/p24 por ratón. Se probaron al
menos cuatro ratones para cada dosis en dos experimentos separados.
Tras la estimulación in vitro mediante péptidos sintéticos,
se probó la capacidad citolítica de células de bazo utilizando
células diana RMAS-HHD impulsadas por péptido.
Debido a que los resultados fueron altamente homogéneos, se probaron
solamente las respuestas de LTC frente a péptido epítopo NA17/A,
Mart-1.27, gp100.154, y
Tirosinasa.368-D por el bien de la claridad y
simplicidad.
Se ilustran los resultados en la tabla 3. En
general, los ratones inmunizados con el vector
TRIP-LV en dosis de 800 ng, 200 ng, y 50 ng/p24 por
ratón, provocaron repuestas de LTC mejores que los ratones
inmunizados con el vector HR-LV. Independientemente
de los vectores utilizados no hubo respuesta de LTC detectable en
dosis inferiores a 12 ng/p24 por ratón (valores no mostrados). Esto
confirma la capacidad de transducción mejorada de los vectores
lentivirales que contienen el complejo de ADN central en comparación
con aquellos que carecen de este complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó inicialmente que las células
tumorales tales como células MT4 y HeLa pueden transducirse de
manera hasta 30 veces más eficaz mediante el vector lentiviral que
contiene el ADN tricatenario central que mediante el vector que
carece de ADN tricatenario central. Se probó entonces la capacidad
de transducción de estos dos vectores lentivirales en diferentes
concentraciones en DC de donantes sanos o de ratones HHD. Se
midieron el porcentaje de DC que expresa GFP y su intensidad de
fluorescencia media mediante FACS y se consideraron como el nivel
de transducción de DC mediante los dos vectores lentivirales.
El vector TRIP-GFP transdujo las
células de manera más eficaz que el vector HR-GFP en
todas las concentraciones de vector. La expresión de GFP de DC
murina y humana transducida mediante el vector
TRIP-GFP fue respectivamente hasta 3 y 7 veces más
alta que la expresión de aquellas transducidas mediante el vector
HR-GFP (fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimularon in vitro células
mononucleares (MNC) obtenidas de donantes de
HLA-A2.1 sanos una vez a la semana utilizando las
DC del mismo donante transducidas mediante TRIP
mel-IRES-GFP. Se analizó la
presencia de la expresión de GFP en las células dendríticas
mediante FACS para verificar la transducción eficaz. Después de
tres semanas, se probó la capacidad citotóxica de las MNC en un
ensayo de ^{51}Cr utilizando células T2 impulsadas por péptido
como dianas en condiciones de cultivo libre de FCS. Las DCh
transducidas con el vector
TRIP-mel-IRES-GFP
indujeron respuestas de LTC significantes frente a todos los
péptidos epítopos de melanoma menos Mart1.31, mientras que las DCh
no transducidas indujeron sólo respuestas de fondo habituales (fig.
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Recientes informes muestran que los vectores
derivados de lentivirus defectuosos de replicación pueden transducir
una variedad de células que no se dividen (Naldini, 1996, Kafri,
1997). Los lentivirus pueden entrar a través de la membrana celular
intacta de células que no se dividen (Case, 1999). Se ha evidenciado
ahora que este procedimiento se organiza de manera larga mediante
una secuencia de acción en cis del tracto de polipurina, denominada
el ADN tricatenario central. La introducción de esta secuencia
dentro de los vectores derivados de lentiviral permitió una
transducción estable ex vivo e in vivo de hasta 30
veces más alta de varios tipos de células que incluyen neuronas,
hepatocitos, y células progenitoras/madre hematopoyéticas.
Recientemente, se ha logrado un progreso para
tratar el asunto de la seguridad de vectores derivados de lentivirus
y su uso en terapia génica (Narry Kim V et al 1988,
Zufferey, 1999). Sin embargo, no se han estudiado nunca los
vectores lentivirales para aplicaciones inmunoterapéuticas para las
que se utilizaron con éxito el vector retroviral murino clásico y
vectores no retrovirales (Condon, 1996, Song 1997, Specht, 1997).
Para desarrollar una estrategia de vacunación potente, se ha
probado la capacidad inmunógena de un vector lentiviral que contiene
el ADN tricatenario central y que codifica para múltiples epítopos
de melanoma. Se estudió primero la inyección directa de este vector
para someter a ensayo si puede provocar respuestas de LTC
específicas in vivo frente a los epítopos de melanoma. Se
compararon previamente varias estrategias de inmunización en ratones
HHD transgénicos de HLA-A2.1 "pura".
Utilizando ADN de pCMV-B10 (HBs) recombinante o
vacunas recombinantes que codifican para los mismos múltiples
epítopos de melanoma, fue posible inducir de manera simultánea, en
un solo ratón, respuestas de LTC frente a cuatro de seis péptidos
diferentes incluidos en el polipéptido de melanoma. Se obtuvieron
mejores resultados de manera significante para el vector TRIP mel
IRES-GFP que codifica para los mismos múltiples
epítopos de melanoma que para otros vectores que codifican para el
mismo motivo de múltiples epítopos en cuanto a la lisis específica
pero además en cuanto al número de péptidos que provocan repuestas
de LTC. De manera particular, la inyección por vía subcutánea e
intraperitoneal del vector indujeron en algunos ratones respuestas
de LTC frente a todos los epítopos codificados por el vector TRIP
mel IRES-GFP.
Varios grupos informaron que pueden utilizarse
las células dendríticas que son transducidas o cargadas con péptido
como un enfoque de inmunización potente frente a una variedad de
células cancerígenas (Mayardomo, JI, 1995, Song W, 1997, Specht,
JM, 1997). Para el fin de esta invención, se ha estudiado por tanto
si las células dendríticas humanas o murinas pueden transducirse de
manera eficaz e inducir respuestas de LTC primarias in
vitro. Los presentes resultados demuestran de manera clara que
estas células pueden transducirse fácilmente. Además, estas células
transducidas presentaron todos los epítopos codificados por el
vector lentiviral recombinante. De manera interesante,
probablemente las células dendríticas humanas fueron transducidas de
la manera más fácil. La transducción in vitro de las células
evita a los vectores lentivirales integrar su genoma dentro de una
variedad de células huésped de manera peligrosa. Por esta razón, las
células transducidas in vitro debe constituir un método de
administración seguro y apropiado para una primera aplicación
clínica.
Warner et al fueron los primeros que
mostraron la capacidad del vector retroviral para inducir respuestas
de LTC eficaces en varios modelos de animales, pero además en
pacientes con VIH utilizando fibroblastos transducidos de vector
retoviral murino que expresan proteínas VIH-1
(revisado por Warner 1998). Se detectaron ADN provirales en células
dendríticas que presentan antígenos de manera eficaz, inyectado
directamente en el ratón (Song, 1997). Sin embargo, en contraste
con los vectores lentivirales, los vectores retrovirales murinos no
pueden transducir células que no se dividen tales como DC y la
expresión in vivo del gen codificante se somete a menudo a
un "apagado" ("shut off"). Consecuentemente, estos
vectores retrovirales no son los mejores candidatos para la
inmunoterapia humana (Kafri).
Los resultados demuestran de manera clara que
los vectores derivados de lentiviral que contienen el ADN
tricatenario central inducen respuestas de LTC más fuertes in
vivo en ratones HHD que aquellos que no contienen el ADN
tricatenario central. Además, el vector lentiviral que contiene el
ADN tricatenario central puede transducir fácilmente DCh in
vitro lo que puede utilizarse posteriormente para inmunoterapia
clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Plásmidos de vector: pTRIP-EGFP
derivado de HR'CMVLacZ (Naldini et al, PNAS 93,
11382-8, 1996). El gen indicador de LacZ se
sustituyó por el gen EGFP (Clontech). Se insertó el gen EGFP en
TRIP-EGFP, en el sitio ClaI de un fragmento central
de VIH-1LAI que comprende las secuencias cPPT y
CTS.
Se amplificó el gen EGFP mediante PCR utilizando
Pfu polimerasa (Stratagene) del plásmido pEGFP-N1,
añadiendo los sitios de restricción BamHI y XhoI en sentido de 5' y
3' respectivamente. Los cebadores de PCR fueron como siguen:
Se construyó el vector HR GFP volviendo a clonar
este fragmento de PCR en los sitios BamHI y XhoI de pHR'CMVLacZ,
sustituyendo LacZ ORF por EGFP.
Se amplificó un fragmento de 178 pb de pLAl3 (47
93 a 4971), que engloba cPPT y CTS, mediante PCR. Se añadieron los
sitios de restricción de NarI en el sentido de 5' de los cebadores
con el propósito de insertar este fragmento dentro del sitio ClaI
único de HR GFP:
La inserción de esta secuencia tricatenaria en
la orientación correcta dio una elevación del vector del plásmido
TRIP GFP, y TRIPinv GFP en la orientación inversa. Alternativamente,
se amplificó el mismo fragmento tricatenario de los plásmidos
pcPPT-AG, pcPPT-D,
pcPPT-225 y pCTS para generar vectores que incluyen
las mismas mutaciones en el cPPT o en el CTS tal como los virus
correspondientes.
En primer lugar, se rellenó el sitio EcoRI
presente en el vector TRIP GFP o TRIP-EGFP
(depositado en la CNCM bajo el nº I-2005 el 15 de
abril de 1998), creando el vector TRIP GFP \DeltaE. Entonces se
clonó en el sentido de 5' del EGFP un fragmento de BamHI/XhoI de
1,2 Kb que contiene el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES)
de un picornavirus en lugar del BamHI/XhoI EGFP de 0,7 Kb en un
vector TRIP GFP \DeltaE, creando el vector TRIP \DeltaE IRES
GFP. Los sitios presentes entre el promotor CMV y la secuencia de
IRES GFP son BamHI-BstXI-SnaBI y
EcoRI. Se generó un fragmento de melanoma (mel) de múltiple epítopo
LTC mediante PCR en el pBS mel poly, insertando una secuencia
consenso de kozac dentro de los cebadores 5BglMlu Mel:
Se digirió el fragmento de PCR de mel mediante
BgIII/EcoRI y se insertó en los sitios BamHI/EcoRI de TRIP
\DeltaE IRES GFP, creando el TRIP \DeltaE mel IRES GFP también
llamado TRIP mel IRES GFP.
Se creó el HR mel IRES GFP intercambiando el
fragmento de NdeI/XhoI que contiene los múltiples epítopos de
melanoma y el IRES GFP de TRIP mel IRES GFP con el de HR GFP. Se
sitúa el sitio NdeI en el extremo del promotor CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron los vectores lentivirales tal como
se describió anteriormente (Naldini I.M. PNAS 1996 y science 1996)
mediante una transfección transitoria de células 293T con plásmido
ramificado utilizando la técnica de calcio-fosfato.
Brevemente, se transfectaron las células 293T con 20 \mug del
plásmido de envuelta de VEV (pMDG) y 40 \mug de varios
acondicionamientos (8.2 ó 8.91) y plásmidos de vector lentiviral. Se
recogieron medios condicionados 60 h y 84 h después de la
transfección. Entonces se concentró el virus y se trataron los
dNTPs tal como se describió anteriormente (Naldini science 1996). Se
determinaron las titulaciones virales en células HeLa P4. 2 y
células MT4 mediante dilución seriada y por ensayo ELISA p24
(Naldini Science 1996).
\newpage
Se llevó a cabo una titulación de ciclo de virus
por triplicado mediante infección de células P4 situadas en placas
de 96 pocillos, con cantidades equivalentes de partícula (1 ng de
antígeno viral p24 por pocillo), en presencia de 20 \muM de
DEAE-dextrano. Se añadió el inhibidor de proteasa
Saquinavir (Roche) a 1 \muM en todo el experimento, para
restringir el análisis a un único ciclo de infección. Se inhibió la
mitosis celular mediante el tratamiento con aphicolin (8 \muM),
el día anterior a la infección. Se midió la actividad
\beta-galactosidasa 48 h después de la infección
utilizando un ensayo de gen indicador de \beta-Gal
quimioluminiscente (Boehringer).
Se infectaron las células HeLa por triplicado
con la cantidad equivalente de partículas de vector (5 ng de P24
por pocillo). A las 48 horas después de la transducción, se
sustituyó el medio por 200 \mul de TNB (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl
150 mM) y se cuantificó la fluorescencia de las células vivas
utilizando un fluorímetro de microplaca (Victor2, Wallac) y filtros
adaptados de EGFP (excitación: 485 nm, emisión: 520 nm).
Ratones. Se han descrito anteriormente
los ratones HHD (Pascolo, 1997). Estos expresan una molécula de
clase I de histocompatibilidad de cadena sencilla transgénica en la
que el C terminal de la b2m humana se une covalentemente mediante
un brazo peptídico (GGGGS) x 3 al N terminal de una cadena pesada
quimérica (HLA-A2.1 a1-a2,
H-2D^{b} a3-transmembrana, y
dominios intracitoplásmicos). Se han interrumpido adicionalmente el
H-2D^{b} y los genes b2m de ratón
de estos ratones mediante recombinación homóloga dando como
resultado una ausencia completa de expresión en superficie de
células detectable serológicamente de moléculas de clase I de
histocompatibilidad de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células dendríticas humanas a
partir de productos de citaféresis de donantes sanos de haplotipo
de HLA-A2.1 (IDM, París, Francia). El análisis FACS
de estas DC utilizando mAbs frente a CD3, CD14, CD80, CD83,
HLA-ABC, y HLA-DR mostró el fenotipo
de DC inmaduro. Se transdujeron las DCh en 1 ml de medio de cultivo
AMV-5 con los vectores lentivirales en
concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por
1x10^{6} células durante 10 días. Se midieron el porcentaje y la
intensidad de fluorescencia media de la expresión de GFP en DCh
transducida con los dos vectores lentivirales mediante FACS (Becton
Dickinson, BD, EE.UU). Se estimularon células mononucleares (MNC)
del mismo donante in vitro mediante la DCh o la DCh
transducida con una razón de 4 MNC con respecto a 1 DCh. Se
volvieron a estimular las MNC dos veces utilizando la misma DCh
transducida-crioconservada y después se comprobó la
actividad citolítica en un ensayo de liberación de ^{51}Cr
durante 4 h, utilizando como dianas células T2 cargadas con péptidos
de control negativo o relevante (Inf.m.58) (10 \mug/ml,
5x10^{6} células/ml, en medio RPMI libre de FCS, 2 h a TA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron células dendríticas derivadas de
médula ósea tal como se describió anteriormente [43, 51]. Se
cultivaron las células mononucleares de médula ósea en medio RPMI
complementado con FCS al 10%, L glutamina 2 mM, 5 0 U/ml de
penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina,
2-mercaptoetanol 5x10^{5} M(medio RPMI
completo), complementado adicionalmente con 20 ng/ml de
GM-CSF de ratón recombinante y 100 ng/ml de IL4 de
ratón recombinante (ambos de GENZYME, Cambridge, MA). Se retiraron
cuidadosamente las células no adherentes, en el día 2 y 6, y se
añadió medio RPMI completo nuevo, complementado con 10 ng/ml de
GM-CSF de ratón y 50 ng de IL4 de ratón. Se
sustituyó el medio de cultivo en el día 7 por 1 ml de medio RPMI
completo complementado con los vectores lentivirales a
concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por
1x10^{6} células. Las células dendríticas recogidas en el día 9
tenían una pureza de más del 95% (IA^{b+}, HHD^{+}, CD3^{-},
33D1^{+}, NDL145^{+}, y CD 11c^{+}), tal como se ensayó con
mAb apropiado. Entonces se midió el porcentaje y la intensidad
media de fluorescencia de la expresión de GFP en DC murina en los
días 9 y 12 mediante FACS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron vectores lentivirales en ratones
HHD bien por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o bien por
vía subcutánea durante 12 días. Entonces se volvieron a estimular de
manera individual las células del bazo de ratones cebados en medio
RPMI completo mediante cada péptido epítopo durante siete días. En
los dos últimos días, se volvieron a estimular las células
cultivadas mediante TCGF al 10%. En el día 7 se comprobó la
actividad citolítica de las células cultivadas tal como ya se ha
descrito (Pascolo, 1997), en un ensayo de liberación de ^{51}Cr
durante 4 h, utilizando como dianas células
TAP-RMA-S transfectadas con HHD
cargadas con péptidos de control negativo o relevante (Inf.m.58)
(10 \mug/ml, 5x10^{6} células/ml, en medio RPMI libre de FCS, 2
h a TA). Se utilizaron paralelamente como células diana las células
HeLa transfectadas con HHD transducidas o no con
TRIP-mel-ITES-GFP.
Se calculó el porcentaje de lisis específica tal como sigue:
(liberación
experimental - liberación espontánea) / (liberación total -
liberación espontánea) x
100.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (20)
1. Uso de:
- a)
- un transgén que es la secuencia de un gen de un agente patógeno o un fragmento de dicho gen que codifica para uno o varios epítopos de 8 a 15 aminoácidos, situado bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión,
- b)
- una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y
- c)
- regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una orientación funcional con respecto a las señales reguladoras de origen retroviral o similar a retroviral mencionadas anteriormente, en la preparación de un vector.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dichas secuencias de origen retroviral se derivan de un genoma de
lentivirus.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que
dichas secuencias de origen similar a retroviral se derivan de un
retrotransposón.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho transgén está contenido en
un casete de expresión que incluye señales reguladoras de
transcripción y expresión.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas señales reguladoras de
retrotranscripción, expresión y encapsidación son de origen
lentiviral, y dichas regiones de cPPT y de CTS son de origen
lentiviral.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas señales reguladoras de
retrotranscripción, expresión y encapsidación y dichas regiones de
cPPT y de CTS, se derivan de un virus seleccionado de lentivirus,
tal como CAEV, EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que
dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y
encapsidación y dichas regiones de cPPT y de CTS se derivan de un
retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1
o
VIH-2.
VIH-2.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas regiones de cPPT y de CTS
tienen una localización central dentro de la secuencia del
vector.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho transgén se inserta en la
región U3 de las señales de regulación para retrotranscripción.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho transgén es un gen que
codifica para un antígeno de una bacteria.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que
dichas bacterias son Mycobacteria.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que
dichas micobacterias son Mycobacterium tuberculosis.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que
dicho transgén es la secuencia completa del gen DES de M.
tuberculosis.
14. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho transgén es un gen que
codifica para un antígeno de un virus.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que
dicho virus es un retrovirus.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que
dicho transgén es una secuencia de múltiples epítopos de LTC
específica de VIH.
17. Uso según la reivindicación 15, en el que
dicho transgén es una secuencia de un epítopo de LTC específica de
VIH.
18. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho uno o varios epítopos codifica(n) para de 9 a 12
aminoácidos.
\newpage
19. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho vector es adecuado para
provocar o estimular una respuesta inmunitaria mediada por células
frente a uno o varios epítopos codificados por dicho transgén.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que
dicha respuesta inmunitaria mediada por células es una respuesta de
linfocitos T citotóxicos (LTC) o una respuesta de CD4.
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