ES2262545T3 - Vectores lentivirales para la preparacion de composiciones inmunoterapeuticas. - Google Patents

Vectores lentivirales para la preparacion de composiciones inmunoterapeuticas.

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ES2262545T3 ES00972845T ES00972845T ES2262545T3 ES 2262545 T3 ES2262545 T3 ES 2262545T3 ES 00972845 T ES00972845 T ES 00972845T ES 00972845 T ES00972845 T ES 00972845T ES 2262545 T3 ES2262545 T3 ES 2262545T3
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Abstract

Composición inmunógena que comprende un vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta LTC (linfocitos T citotóxicos) o una respuesta CD4, cuando se administra a un paciente.

Description

Vectores lentivirales para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas.
La presente invención se refiere al uso de vectores retrovirales, y especialmente a vectores lentivirales para la preparación de composiciones que son capaces de inducir o contribuir a que tenga lugar o la mejora de una reacción inmunológica in vitro, y en una realización preferida in vivo, frente a epítopos que son codificados por secuencias de nucleótidos presentes en los vectores.
Los inventores han mostrado que los vectores preparados según la presente invención permiten obtener una respuesta inmune mediada por células, especialmente una reacción de linfocitos T citotóxicos (LTC) frente a epítopos.
Además han obtenido datos que muestran que esta respuesta inmune mediada por células puede ser una respuesta específica, obtenida frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de nucleótidos contenidos en los vectores.
Por tanto, la invención proporciona medios que podrían utilizarse en protocolos de tratamiento frente a tumores y cáncer y especialmente podrían utilizarse en protocolos para inmunoterapia o terapia de vacunación frente a tumores
También la invención da a conocer medios que podrían utilizarse para el tratamiento o profilaxis de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con infección por virus y por ejemplo, con infección por retrovirus.
Los inventores además han obtenido resultados que muestran que la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta LTC asociada con el tratamiento mediante las composiciones de la invención puede ser específica para el antígeno del tumor o del virus o células infectadas por el virus, y también puede limitarse a moléculas específicas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad).
Particularmente la invención se refiere al uso de los vectores en composiciones inmunógenas, con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células limitada a las moléculas de clase I del complejo CMH y por ejemplo limitada a moléculas HLA-A2 o B7.
En consecuencia, la invención se refiere a una composición inmunógena que comprende un vector recombinante que comprende un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS). Durante la transcripción inversa, las secuencias cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN de tres cadenas denominada aquí en el presente documento como ADN tricatenario. El ADN tricatenario estimula la importación nuclear del genoma del ADN del vector, siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés) y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que la composición es capaz de inducir o estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o de CD4 frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el
vector.
En una realización preferida de la invención, la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta de LTC o la respuesta de CD4 frente a uno o varios epítopos es una respuesta de LTC o de CD4 de memoria.
Se enfatiza que la presencia, en el vector, de las regiones cPPT y CTS permiten que de ese modo se forme una estructura de ADN tricatenario influyendo y especialmente mejorando la importación nuclear del genoma del vector en células recombinadas con dicho vector.
Esta capacidad de la composición inmunógena según la presente invención para inducir, mejorar o en general para asociarse a los acontecimientos de la respuesta de LTC de memoria, permite proponer el uso de la composición inmunógena en los protocolos de terapia antitumoral o terapia antivírica o antipatógena, incluyendo si la respuesta inmune tiene que inducirse en un largo periodo de tiempo o ser al menos inducible cuando se busca una respuesta en un periodo de tiempo que puede ser inducción a largo plazo de la respuesta, tras la administración de la composición inmunógena. En otras palabras, puede usarse la composición inmunógena para la preparación de composición terapéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales o enfermedades infecciosas, por ejemplo mediante bacterias o virus, induciendo o estimulando o participando en la aparición de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una respuesta de LTC o una respuesta de memoria.
Se enfatiza que la composición inmunógena de la invención, como consecuencia de la presencia de la estructura tricatenaria en la secuencia del vector, que resulta de la presencia de las regiones CTS y cPPT en el vector y en las partículas del vector, permiten la estimulación de la importación nuclear del genoma del vector, en células diana. Los epítopos inducidos en el vector pueden ser propios o no.
La presenta invención abarca también el uso de una secuencia nucleotídica que comprende las secuencias CTS y cPPT de origen retroviral o sintético para aumentar la entrada de las secuencias de nucleótidos o de péptidos en el núcleo de las células diana o células receptoras.
Según un ejemplo, se entiende que dicha secuencia tricatenaria comprende secuencias extrañas o secuencias propias con respecto a las células receptoras.
Por tanto, la invención describe una composición que podría utilizarse en protocolos terapéuticos que presentan analogías con los protocolos de vacunación, para el tratamiento de tumores y especialmente como tratamiento de enfermedades antiinfeccioso o anticancerígeno.
Es interesante observar que según la presente invención, este transgén o secuencia de interés puede ser una secuencia que codifica para uno o varios epítopos de una o varias células tumorales, por ejemplo, epítopos que se han identificado en antígenos diana potenciales para la inducción de una respuesta inmune mediada por células frente al tumor.
Varios epítopos que forman un múltiple epítopo, pueden codificarse por el transgén de la invención. En una realización particular, pueden derivarse de los antígenos diana identificados en el tumor, y pueden elegirse de tal manera que cuando su secuencia codificante se combina para formar el transgén, se obtiene una respuesta inmune mediada por células frente a todos los epítopos o frente a la mayoría de ellos. Puede ensayarse la respuesta inmune mediada por células in vitro o en una realización preferida in vivo. Los protocolos que permiten llevar a cabo tales ensayos se describen en los ejemplos.
Se han identificado antígenos diana en varios tipos de tumores y en particular en melanomas o en carcinomas, incluyendo carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón, cáncer de mama, leucemia y linfoma...
Según otro aspecto de la invención, puede utilizarse la composición inmunógena con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células, en enfermedades infecciosas, que incluyendo infección asociada a virus, o infección ligada a cualquier tipo de patógeno, incluyendo Mycobacteria, por ejemplo M.tuberculosis.
En este caso pueden identificarse antígenos específicos capaces de provocar una respuesta inmune mediada por células y pueden insertarse sus secuencias codificantes en el vector utilizado en la composición inmunógena. Puede utilizarse como ejemplo el gen des de M tuberculosis.
Se añade también según la presente invención, que los vectores que se utilizan en las composiciones inmunógenas pueden expresar epítopos o pueden estar presentes en proteínas (incluyendo glucoproteínas u otros compuestos derivados de proteínas) identificadas como antígenos diana en células tumorales o en células infectadas por virus.
Además, se observa que epítopos, polipéptidos o proteínas utilizadas para proporcionar epítopos, pueden modificarse, por ejemplo mediante mutación, deleción o inserción y por ejemplo pueden modificarse para mejorar su estabilidad.
La invención se refiere también a una composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes que comprenden:
1)
una secuencia de nucleótidos recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos definida (transgén), situada bajo el control de las señales reguladoras de la transcripción y expresión, señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y,
2)
un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral o de un transposón e insertándose en una localización y orientación funcionales con señales reguladoras de retrotranscripción de origen retroviral o similar a retroviral o señales reguladoras de transposones,
en la que la composición inmunógena es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.
El fragmento de ADN que engloba las secuencias activas-en cis CTS y cPPT es capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas, el "ADN tricatenario", tras la transcripción inversa y de estimular la entrada nuclear del ADN del vector.
Según una realización particular, la composición inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector, comprenden partículas de vector retroviral recombinante que comprenden:
a.
un polipéptido gag que corresponde a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),
b.
un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),
c.
un polipéptido de envoltura o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV)
d.
una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés), que codifica para uno o varios epítopos, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral y un polinucleótido que contiene una región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una orientación funcional con las señales reguladoras mencionadas anteriormente de origen retroviral o similar a retroviral.
Según otra realización, la composición inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia transgén presentes en el vector que comprende partículas similares a retroviral recombinantes que comprenden:
a) un polinucleótido que contiene una región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), derivándose estas regiones de un retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con señales reguladoras de retrotransposón,
b) un polipéptido que corresponde a las nucleoproteínas de un retrotransposón o a polipéptidos derivados funcionales polipéptidos GAG)
c) un polipéptido pol que corresponde a proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposón o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL)
d) un polipéptido de envoltura viral,
e) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés), situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotransposón de retrotranscripción, expresión y encapsidación.
Las partículas de vector retroviral recombinantes que están presentes en la composición inmunógena que responden a una u otra de las definiciones anteriores son capaces en una realización preferida de inducir, mejorar o estar asociadas a la aparición de una respuesta inmune mediada por células de memoria y especialmente una respuesta de LTC de memoria.
Según lo anterior, pueden prepararse las definiciones descritas de la composición inmunógena que contiene los vectores o las partículas de vector según varias realizaciones posibles.
En una realización preferida de la invención, se prepara la composición inmunógena de manera que las secuencias de origen retroviral se derivan de un genoma de lentivirus.
Según otra realización, estas secuencias son de origen retroviral y se derivan de retrotransposón.
En otra realización de la invención, o además de las características anteriormente definidas, el transgén o secuencia de interés que se contiene en el vector recombinante se contiene en un casete de expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.
Alternativamente, las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación del vector son de origen lentiviral y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT es de origen lentiviral.
Según otra realización, las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT en el vector, se derivan de un retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.
Pueden utilizarse otros virus y especialmente lentivirus para diseñar las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación, y también para derivar el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT. Especialmente, por tanto pueden utilizarse los lentivirus CAEV, EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.
Para la obtención de las partículas retrovirales recombinantes de la composición inmunógena de la invención, las secuencias que codifican para los polipéptidos o proteínas necesarias para la trasncomplementación de los vectores son por ejemplo proteínas GAG, POL, y ENV derivadas de lentivirus, y especialmente de VIH, que incluye retrovirus VIH-1 y VIH-2.
Alternativamente, pueden derivarse las secuencias GAG y POL de un virus diferente que el de la secuencia ENV. Por ejemplo, pueden derivarse las secuencias GAG y POL del retrovirus VIH y la secuencia ENV puede derivarse de otro virus o retrovirus, y pueden ser secuencias ENV o bien anfotrópicas o bien ecotrópicas.
En otra realización, la secuencia ENV se deriva del virus de la estomatitis vesicular (VEV).
Según una realización particular de la invención, la composición inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector, comprende partículas similares a retroviral recombinantes que comprenden:
a) un polinucleótido que contiene una región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), derivándose estas regiones de un retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con señales reguladoras de retrotransposón,
b) un polipéptido que corresponde a las nucleoproteínas de un retrotransposón o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG)
c) un polipéptido pol que corresponde a proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposón o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL)
d) un polipéptido de envoltura viral,
e) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén o secuencia de interés), situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotransposón de retrotranscripción, expresión y encapsidación.
La composición inmunógena de la invención que comprende las partículas similares a retroviral recombinante son capaces en una realización preferida de generar una respuesta mediada por células de memoria, especialmente una respuesta de LTC de memoria según las características descritas anteriormente.
La invención se refiere también a constructos de vector que se han depositado con la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes en el Instituto Pasteur en París, Francia) el 11 de octubre de 1999.
Un primer vector es pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP, depositado bajo el número I-2326 el 11 de octubre de 1999 y un segundo vector se designa pTRIP-ILKE-IRES-GFP, y se ha depositado bajo el número I-2327 el 11 de octubre de 1999.
Un tercer vector, pTRIP.DES-IRES-GFP se ha depositado con la CNCM bajo el número I-2331 el 11 de octubre de 1999.
Las secuencias que codifican para los antígenos que están presentes en los constructos anteriores pueden sustituirse por cualquier otro antígeno o epítopo de interés, incluyendo el gen DES completo citado anteriormente de M tuberculosis.
Según otro aspecto de la invención, los vectores, partículas de vector y composiciones inmunógenas que comprenden los mismos, se diseñan de tal manera que las regiones CTS y cPPT se localizan centralmente dentro de la secuencia del vector.
Por "localizada centralmente", se quiere decir que las regiones CTS y cPPT están el centro de la secuencia del vector, o aproximadamente en el centro de esta secuencia. Especialmente, las regiones CTS y cPPT pueden estar en el tercio central del ADN del vector lineal retrotranscrito.
La localización central de la secuencia tricatenaria formada durante la retrotranscripción viral como consecuencia de la presencia de las secuencias CTS y cPPT permiten una mejora de los niveles de transducción de células en contacto con el vector o partículas del vector.
Alternativamente, según una variante del vector, puede insertarse la unidad de transcripción del vector, que incluye el transgén dentro de la región U3 de la región LTR. En consecuencia, tras la retrotranscripción, se duplica el transgén y por tanto aparece a cada lado de la secuencia tricatenaria, permitiendo por tanto que la secuencia tricatenaria se localice en la posición central en el vector, cualquiera que sea el tamaño del transgén.
La invención se refiere también a células que se han puesto en contacto con la composición inmunógena según la invención y especialmente se refiere a células recombinantes tansducidas por el vector o partículas de vector de la composición inmunógena.
Estas células son, ventajosamente, células presentadoras de antígeno. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse estas células de entre células de pulmón, células de cerebro, células epiteliales, astrocitos, microglía, oligodendrocitos, neuronas, células musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales, cepas celulares de la médula ósea, macrófagos, fibroblastos, células hematopoyéticas.
Por tanto, puede utilizarse la composición inmunógena de la invención en protocolos de tratamiento o para la preparación de composiciones de tratamiento para el tratamiento terapéutico de tumores y especialmente de cáncer, en ambos casos para generar una respuesta inmune mediada por células primaria, especialmente una respuesta de LTC que es de manera ventajosa una respuesta de LTC de memoria. Alternativamente, puede utilizarse como un tratamiento adyuvante con otro tratamiento anticancerígeno conocido.
Por ejemplo, puede utilizarse la composición inmunógena de la invención en asociación con quimioterapia o inmunoquimioterapia u otros enfoques para el tratamiento anticancerígeno.
Por la expresión "tratamiento anticancerígeno", se entiende, según la presente invención, la inhibición del crecimiento del tumor o crecimiento potencial del tumor o la inhibición de la propagación de las células malignas, incluyendo la posibilidad de controlar la formación de metástasis, o ambos.
Por tanto, según la invención, la expresión "tratamiento anticancerígeno" se refiere a protocolos que se utilizan para controlar el crecimiento maligno y la propagación de tumores, que anticipan la reaparición de la enfermedad, especialmente en vista del hecho de que la composición inmunógena es capaz de inducir o mejorar, y en general de participar con una respuesta mediada por células de memoria.
Los tumores que pueden tratarse con las composiciones de la invención, son por ejemplo melanomas o carcinomas que incluyen (de pulmón, de vejiga, renal, de colon) y linfoproliferación.
Los tumores que pueden tratarse son también todos los tumores que expresan antígenos específicos de tumor que incluyen proteína propia mutada y/o proteína propia sobreexpresada.
Son de interés cualquier vía de administración posible aceptable de la composición inmunógena de la invención que incluyendo protocolos de administración que comprenden etapas ex vivo, por ejemplo transducción de células diana ex vivo seguida de administración de las células tratadas al paciente que va a tratarse.
Alternativamente, la composición inmunógena según la invención puede administrarse directamente al paciente a través de vías usuales de administración, incluyendo las vías de administración sistémica (IV), local, cutánea, intradérmica, por ejemplo intratumoral.
En una realización preferida, la composición inmunógena según la invención puede administrarse directamente al paciente de manera que inducirá, mejorará o participará in vivo en la aparición de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una respuesta inmune mediada por LTC.
En otra realización, se utilizan las composiciones inmunógenas de modo que pueden permitir la aparición de una respuesta mediada por células de memoria a largo plazo.
Se enfatiza que la composición inmunógena de la invención tiene un particular interés debido a la propiedad de las secuencias CTS y cPPT que están presentes en el vector y partículas de vector para inducir o para estimular la importación nuclear del genoma del vector en las células diana.
Una ventaja particular de las composiciones inmunógenas de la invención es que pueden utilizarse para provocar o estimular una respuesta inmune mediada por células frente a epítopos múltiples codificados por la secuencia de nucleótidos de interés o transgén presente en el vector o partículas de vector, y también pueden utilizarse para provocar o estimular una respuesta inmune mediada por células frente al producto de una secuencia completa de un gen, por ejemplo un gen de un agente patógeno o fragmentos de dicho gen capaz de codificar para al menos de 8 a 15 aminoácidos preferiblemente de 9 a 12 aminoácidos. La invención cubre también una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una repetición múltiple (al menos 2 secuencias idénticas) de dicha secuencia de aminoácidos que induce una respuesta celular y/o una secuencia de aminoácidos que contiene al menos 2 secuencias diferentes que corresponden a 2 epítopos de patógenos diferentes o antígenos tumorales.
Otras características y ventajas de la invención se describen en los ejemplos y dibujos siguientes.
Leyendas de las figuras
Figura 1: vector recombinante positivo de ADN tricatenario derivado de VIH-1 que codifica para múltiples epítopos de melanoma.
Figura 2: respuestas de LTC de ratones HHD tras la inmunización con el vector TRIP-mel-I RES-GFP.
Figura 3: expresión de GFP en células humanas 5 días después de su transducción por los vectores derivados de VIH-1 negativo o positivo de ADN tricatenario central.
Figura 4: respuestas de LTC in vitro utilizando células dendríticas humanas.
Figura 5: mapa de restricción del vector pHR.MEL-IRES-GFP
Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC específicos de melanoma
Construcción de HR.MEL-IRES-GFP
Para construir el plásmido HL.MEL-IRES-GFP, el fragmento NdeI/XhoI del TRIP.MEL- IRES-GFP depositado en la CNCM con el número I-2185 el 20 de abril de 1999 que contiene parte del promotor de CMV, los múltiples epítopos MEL y el IRES-GFP en lugar del fragmento NdeI/XhoI de HR GFP que contiene parte del promotor CMV y el GFP.
Figura 6: mapa de restricción del vector pTRIP.ILKE-IRES-GFP
Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC específicos de VIH, cuyo epítopo I9V.(ILKE); (RT 476-484)
Construcción de TRIP.ILKE-IRES-GFP (depositado en la CNCM, París, Francia el 6 de octubre de 1999 con el número I2327 (preparado previamente en respuesta fechada el 9 de enero). Se construyó TRIP.ILKE-IRES-GFP mediante inserción del producto de PCR de ILKE en TRIP \DeltaE IRES-GFP, entre el promotor de CMV y el IRES. Se amplificó mediante PCR la región que rodeaba al epítopo LTC que empezaba por ILKE en la matriz pLAI con los cebadores:
5 ILKE: 5'TCAGATCTGCCACCATGGCACTAACAGAAGTAATACCAC 3'
3 RIILKE: 5'CGGAATTCTTATTGGCCTTGCCCCTGCTTC 3'
Se insertó una secuencia de Kozak dentro del cebador en el sentido de 5' y se insertó un codón de parada dentro del cebador en el sentido de 3'. Tras la digestión con BglII/Eco RI se insertó el producto de PCR dentro de TRIP \DeltaE IRES-GFP dentro de los sitios BamHI/EcoRI. El vector expresa un mensajero bi-cistrónico que codifica para GFP y una región del gen de RT (transcriptasa inversa) de VIH, que corresponde a un grupo de epítopos, que comprenden especialmente el epítopo I9V (RT 476-484) restringido a HLA.A2.1 (Walker B.D., 1989 PNAS 86 pág. 9514-9518).
Figura 7: mapa de restricción del vector pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP.
Secuencia de TEUAML de translocación
Se construyó TRIP.TEL/AML-IRES-GFP mediante inserción del producto de PCR de TEUAML dentro de TRIP \DeltaE IRES-GFP, entre el promotor de CMV y el IRES. Se amplificó mediante PCR la región que rodeaba la translocación entre TEL y AML con los cebadores:
5 Bgl TA: 5'GAAGATCTGCCACCATGAAGCCCATCAACCTCTCTCAT 3'
3 RITA: 5'CGGAATTCTTACCCAGCGCAACGCCTC 3'
Se insertó una secuencia Kozak dentro del cebador en el sentido de 5´ y se insertó un codón de parada en el cebador en el sentido de 3'. Tras la digestión con Bgl II/EcoRI se insertó el producto de PCR dentro de TRIP \DeltaE IRES-GFP dentro de los sitios de BamHI/EcoRI.
Figura 8: capacidad de transducción del vector positivo de ADN tricatenario derivado de VIH que codifica para el péptido de epítopo I9V (derivado de pol VIH-1) y GFP de células dendríticas murinas que se produjeron utilizando células de médula ósea de ratones transgénicos HHD. Se transdujeron aproximadamente el 80% de las células dendríticas murinas mediante el vector recombinante positivo tricatenario derivado de VIH tal como se documenta en los análisis FACS de expresión de GFP intracelular.
Figura 9: evaluación de las respuestas de LTC en ratones HHD después de la inmunización con el vector TRIP-des-IRES-GFP vector que codifica para el gen DES de Mycobacterium tuberculosis.
Figura 10: mapa de restricción de pTRIP.DES-IRES-GFP deposiado en la CNCM el 11 de octubre de 1999.
Ejemplos
Los vectores lentivirales tienen la capacidad de transducir células, incluyendo células que no se dividen, y se proponen de manera creciente para la terapia génica. Recientemente, se mostró que los vectores lentivirales que contienen la secuencia de acción en cis del tracto de polipurina (ADN tricatenario central) muestran una transducción más eficaz de células murinas y humanas que aquellos con el ADN tricatenario central eliminado (Chameau P. et al, J. Mol. Biol. 1994, 241, 651-662). Se han probado ahora los vectores lentivirales que contienen o no ADN tricatenario central y que codifican para los mismos múltiples epítopos de LTC de melanoma restringido por HLA-A2.1 para determinar sus capacidades para inducir respuestas de LTC. La administración directa in vivo del vector lentiviral que contiene ADN central indujo respuestas de LTC fuertes frente a todos los péptidos epítopos codificados por las secuencias de múltiples epítopos en ratones HHD de "HLA-A2.1 pura". Se mostró una clara ventaja para el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario. Además, se mostró que el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario transduce las células dendríticas humanas de manera hasta 7 veces más eficaz que el vector que no contiene el ADN tricatenario. Estas células dendríticas transducidas ex vivo provocaron respuestas de LTC primarias específicas eficaces frente a la mayoría de los péptidos epítopos de melanoma. Ya que ha sido resuelto en mayor parte el asunto de la seguridad del vector lentiviral modificado, se propone el uso de ese vector no solo para terapia génica humana in vivo, sino también para inmunoterapia de pacientes con cáncer.
Introducción
La subclase lentiviridae de retrovirus puede infectar a la mayoría de los tipos de células incluyendo las células que no se dividen. Esta propiedad hace a los lentivirus atractivos para la terapia génica. Ya se han construido varios vectores lentivirales recombinantes de replicación defectuosa por diferentes grupos (Naldini PNAS 93, 11382-8, Science, 1996). Estos vectores lentivirales destoxificados y creados de nuevo por ingeniería se proponen como los vectores de terapia génica más eficaces y seguros (Zufferey R, y Kim V.N. J Virol, 72, 9873-80, 1998). Se desarrolló un vector basado en VIH lentiviral humano, pseudotipado con glucoproteína G de virus de estomatitis vesicular (VSVG) (Bums J.C., 1993 PNAS 90, 8033-7). Este vector se suprimió para la mayoría de las proteínas virales no esenciales pero contiene una secuencia de acción en cis del tracto de polipurina (cPPT, ADN tricatenario central). El ADN tricatenario central aumenta de manera considerable la importación nuclear de moléculas de ADN de VIH retrotranscritas. Además, se observó que el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central presenta una transducción más eficaz de células murinas y humanas in vitro que el vector que no contiene el ADN tricatenario.
El ratón transgénico HHD de "HLA-A2.1 pura" (Pascolo et al., J. Exp. Med., 1997, 185 : 2043-2051) permite una evaluación controlada de manera experimental del potencial inmunógeno de péptidos epítopos y de varias estrategias de inmunización. Utilizando estos ratones HHD, se ha informado de la capacidad de múltiples epítopos de melanoma codificados por diferentes vectores recombinantes para inducir repuestas de LTC simultáneas en un único animal. Se ha estudiado en primer lugar la capacidad de los vectores lentivirales que contienen o no ADN tricatenario central y que codifican para los mismos múltiples epítopos de melanoma para la inducción de LTC in vivo en ratones transgénicos HHD. Además, también se investigó si las células dendríticas humanas (DCh) transducidas mediante los mismos vectores lentivirales recombinantes inducen repuestas de LTC primarias frente al motivo de múltiples epítopos de melanoma ex vivo. Los presentes resultados demuestran que el ADN tricatenario aumenta de manera significativa la capacidad del vector lentiviral para inducir respuestas de LTC especificas in vivo mediante la administración directa de los vectores recombinantes o ex vivo utilizando las células dendríticas transducidas.
Resultados Ejemplo I Inmunización de múltiples epítopos de melanoma
Tras establecer que la inyección de ADN recombinante que codifica para un motivo de múltiples epítopos derivado de melanoma puede provocar respuestas de LTC simultáneas frente a varios epítopos de melanoma en ratones HHD, se probó la capacidad inmunógena de un vector lentiviral que codifica para el mismo motivo de múltiples epítopos de melanoma (fig. 1 y tabla 1). Se administró un vector TRIP-mel-IRES-GFP (CNCM I-2185 depositado el 20 de abril de 1999) a 1,25 mg/p24 por ratón por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea. Se usaron al menos 3 ratones por grupo.
Se indujeron simultáneamente respuestas de LTC específicas múltiples frente a la mayoría de los diez epítopos de melanoma. Se observaron respuestas de LTC similares independientemente de la vía de administración frente a ambos péptidos cargados (tabla 2) y células HeLa transfectadas de HHD, transducidas de TRIP-mel-IRES-GFP (valores no mostrados). Sin embargo, La inyección intraperitoneal indujo respuestas de LTC levemente mejores. Se provocaron respuestas fuertes frente a péptidos epítopos NA17-A.nt38 y gp100.154. También se observaron repuestas significativas frente a gp100.457, MART.1.27, Mage-3, y Tirosinasa.368-D. Las respuestas de LTC fueron débiles frente a gp100.209, gp100.280, MART-1.32, y Tirosinasa.1. Los epítopos que provocan respuestas de LTC débiles seguidas de inmunización del vector TRIP-mel-IRES-GFP caen todos en los grupos de no inductores de LTC cuando se administran utilizando otros vectores no lentivirales.
Dosis mínima de vector lentiviral requerida para la inducción de LTC detectable in vivo
Se determinó la dosis mínima de vector lentiviral que provoca una respuesta de LTC significante en ratones HHD utilizando inyecciones intraperitoneales del vector TRIP-mel-IRES-GFP en seis dosis diferentes utilizando 4 ratones por dosis. Se llevaron a cabo dos experimentos en los cuales se mezclaron células efectoras de dos ratones para tener razones similares E/T justo antes del ensayo de ^{51}Cr. Se probaron en la mayoría de los experimentos respuestas de LTC frente a todos los péptidos epítopos de melanoma. Debido a que los resultados fueron altamente similares y muy homogéneos, se tuvieron en cuenta solamente las respuestas de LTC frente al péptido epítopo NA17/A para comparar la relación "dosis-efecto" por el bien de la claridad y simplicidad. Se obtuvieron las mejores respuestas de LTC utilizando dosis de entre 500 ng y 2500 ng/p24 por ratón (tabla 2). Aunque se obtuvieron repuestas de LTC detectables frente a algunos de los epítopos de melanoma, altas dosis de lentiviral no indujeron mejores respuestas de LTC que las dosis bajas. Incluso aunque se pusieron en evidencia algunas respuestas de LTC especificas frente a algunos péptidos epítopos de melanoma, dosis inferiores a 500 ng/p24 por ratón no fueron suficientes para inducir respuestas de LTC eficaces. Debe observarse que en dosis de 1250 ng/p24 por ratón algún ratón generó respuestas de LTC frente a diez de los diez epítopos incluidos en el motivo de múltiples epítopos (fig. 3).
Inducción de LTC de memoria a largo plazo
Se inyectaron a ocho ratones con el vector TRIP-mel-IRES-GFP. Se sacrificaron los ratones o bien 12 días o bien 5 meses después de la inmunización. Tras 5 días después de la estimulación in vitro con los péptidos epítopos de melanoma y dos días adicionales con TCGF al 10%, se mezclaron las células efectoras de los cuatro ratones y se probaron frente a células RMAS transfectadas de HHD cargadas con péptidos. Se evidenciaron las respuestas de LTC especificas para todos los péptidos epítopos de melanoma menos para gp100.209 y Mart1.32 en ratones inmunizados 12 días antes. Cinco meses después de la inyección del TRIP-mel-IRES-GFP, todavía indujeron respuestas de LTC fuertes todos los epítopos inductores de LTC primarios (fig. 2). Fue sorprendentemente comparable el nivel de las respuestas de LTC 12 días o 5 meses después de la inmunización de los ratones. Esto sugiere que las células transducidas in vivo mediante el vector lentiviral no se destruyen por el sistema inmunitario y continúan produciendo los múltiples epítopos de melanoma codificantes.
Función del ADN tricatenario central para la inmunización in vivo
Se inmunizaron individualmente ratones HHD con los vectores TRIP-mel-IRES-GFP y HR-mel-IRES-GFP al mismo tiempo administrados por vía intraperitoneal en dosis de 800 ng, 200 ng, 50 ng, 12 ng, y 3 ng/p24 por ratón. Se probaron al menos cuatro ratones para cada dosis en dos experimentos separados. Tras la estimulación in vitro mediante péptidos sintéticos, se probó la capacidad citolítica de células de bazo utilizando células diana RMAS-HHD impulsadas por péptido. Debido a que los resultados fueron altamente homogéneos, se probaron solamente las respuestas de LTC frente a péptido epítopo NA17/A, Mart-1.27, gp100.154, y Tirosinasa.368-D por el bien de la claridad y simplicidad.
Se ilustran los resultados en la tabla 3. En general, los ratones inmunizados con el vector TRIP-LV en dosis de 800 ng, 200 ng, y 50 ng/p24 por ratón, provocaron repuestas de LTC mejores que los ratones inmunizados con el vector HR-LV. Independientemente de los vectores utilizados no hubo respuesta de LTC detectable en dosis inferiores a 12 ng/p24 por ratón (valores no mostrados). Esto confirma la capacidad de transducción mejorada de los vectores lentivirales que contienen el complejo de ADN central en comparación con aquellos que carecen de este complejo.
Transducción de células dendríticas mediante vectores lentivirales
Se observó inicialmente que las células tumorales tales como células MT4 y HeLa pueden transducirse de manera hasta 30 veces más eficaz mediante el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central que mediante el vector que carece de ADN tricatenario central. Se probó entonces la capacidad de transducción de estos dos vectores lentivirales en diferentes concentraciones en DC de donantes sanos o de ratones HHD. Se midieron el porcentaje de DC que expresa GFP y su intensidad de fluorescencia media mediante FACS y se consideraron como el nivel de transducción de DC mediante los dos vectores lentivirales.
El vector TRIP-GFP transdujo las células de manera más eficaz que el vector HR- GFP en todas las concentraciones de vector. La expresión de GFP de DC murina y humana transducida mediante el vector TRIP-GFP fue respectivamente hasta 3 y 7 veces más alta que la expresión de aquellas transducidas mediante el vector HR-GFP (fig. 3).
Inducción de LTC primaria utilizando células dendríticas humanas transducidas mediante el vector TRIP mel IRES-GFP
Se estimularon in vitro células mononucleares (MNC) obtenidas de donantes de HLA-A2.1 sanos una vez a la semana utilizando las DC del mismo donante transducidas mediante TRIP mel-IRES-GFP. Se analizó la presencia de la expresión de GFP en las células dendríticas mediante FACS para verificar la transducción eficaz. Después de tres semanas, se probó la capacidad citotóxica de las MNC en un ensayo de ^{51}Cr utilizando células T2 impulsadas por péptido como dianas en condiciones de cultivo libre de FCS.
Las DCh transducidas con el vector TRIP-mel-IRES-GFP vector indujeron respuestas de LTC significantes frente a todos los péptidos epítopos de melanoma menos Mart1.31, mientras que las DCh no transducidas indujeron solo respuestas de fondo habituales (fig. 4).
Discusión
Recientes informes muestran que los vectores derivados de lentivirus defectuosos de replicación pueden transducir una variedad de células que no se dividen (Naldini, 1996, Kafri, 1997). Los lentivirus pueden entrar a través de la membrana celular intacta de células que no se dividen (Case, 1999). Se ha evidenciado ahora que este procedimiento se organiza de manera larga mediante una secuencia de acción en cis del tracto de polipurina, denominada el ADN tricatenario central. La introducción de esta secuencia dentro del vector derivado de lentiviral permite una transducción estable ex vivo e in vivo de hasta 30 veces más alta de varios tipos de células que incluyen neuronas, hepatocitos, y células progenitoras/madre hematopoyéticas.
Recientemente, se ha logrado un progreso para tratar el asunto de la seguridad de vectores derivados de lentivirus y su uso en terapia génica (Narry Kim V et al 1988, Zufferey, 1999). Sin embargo, no se han estudiado nunca los vectores lentivirales para aplicaciones inmunoterapéuticas para las que se utilizaron con éxito el vector retroviral murino clásico y vectores no retrovirales (Condon, 1996, Song 1997, Specht, 1997). Para desarrollar una estrategia de vacunación potente, se ha probado la capacidad inmunógena de un vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central y que codifica para múltiples epítopos de melanoma. Se estudió primero la inyección directa de este vector para someter a ensayo si puede provocar respuestas de LTC especificas in vivo frente a los epítopos de melanoma. Se compararon previamente varias estrategias de inmunización en ratones HHD transgénicos de HLA-A2.1 "pura". Utilizando ADN de pCMV-B10 (HBs) recombinante o vacunas recombinantes que codifican para los mismos múltiples epítopos de melanoma, fue posible inducir de manera simultánea, en un solo ratón, respuestas de LTC frente a cuatro de seis péptidos diferentes incluidos en el polipéptido de melanoma. Se obtuvieron mejores resultados de manera significante para el vector TRIP mel IRES-GFP vector que codifica para los mismos múltiples epítopos de melanoma que para otros vectores que codifican para el mismo motivo de múltiples epítopos en cuanto a la lisis especifica pero además en cuanto al número de péptidos que provocan repuestas de LTC. De manera particular, la inyección por vía subcutánea e intraperitoneal del vector indujeron en algunos ratones respuestas de LTC frente a todos los epítopos codificados por el vector TRIP mel IRES-GFP.
Varios grupos informaron que pueden utilizarse las células dendríticas que son transducidas o cargadas con péptido como un enfoque de inmunización potente frente a una variedad de células cancerígenas (Mayardomo, JI, 1995, Song W, 1997, Specht, JM, 1997). Para el fin de esta invención, se ha estudiado por tanto si las células dendríticas humanas o murinas pueden transducirse de manera eficaz e inducir respuestas de LTC primarias in vitro. Los presentes resultados demuestran de manera clara que estas células pueden transducirse fácilmente. Además, estas células transducidas presentaron todos los epítopos codificados por el vector lentiviral recombinante. De manera interesante, probablemente las células dendríticas humanas fueron transducidas de la manera más fácil. La transducción in vitro de las células evita a los vectores lentivirales integrar su genoma dentro de una variedad de células huésped de manera peligrosa. Por esta razón, las células transducidas in vitro debe constituir un método de administración seguro y apropiado para una primera aplicación clínica.
Warner et al fueron los primeros que mostraron la capacidad del vector retroviral para inducir respuestas de LTC eficaces en varios modelos de animales, pero además en pacientes con VIH utilizando fibroblastos transducidos de vector retoviral murino que expresan proteínas VIH-1 (revisado por Warner 1998). Se detectaron ADN provirales en células dendríticas que presentan antígenos de manera eficaz, inyectado directamente en el ratón (Song, 1997). Sin embargo, en contraste con los vectores lentivirales, los vectores retrovirales murinos no pueden transducir células que no se dividen tales como DC y la expresión in vivo del gen codificante se somete menudo objeto a un "apagado" ("shut off"). Consecuentemente, estos vectores retrovirales no son los mejores candidatos para la inmunoterapia humana (Kafri).
Los resultados demuestran de manera clara que los vectores derivados de lentiviral que contienen el ADN tricatenario central inducen respuestas de LTC más fuertes in vivo en ratones HHD que aquellos que no contienen el ADN tricatenario central. Además, el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central puede transducir fácilmente DCh in vitro lo que puede utilizarse posteriormente para inmunoterapia clínica.
Materiales y Métodos Construcciones de vector lentiviral
Plásmidos de vector: pTRIP-EGFP derivado de HR'CMVLacZ (Naldini et al, PNAS 93,11382-8, 1996). El gen indicador de LacZ se sustituyó por el gen EGFP (Clontech). Se insertó el gen EGFP en TRIP- EGFP, en el sitio Clal de un fragmento central de VIH-1LAI que comprende las secuencias cPPT y CTS. Se amplificó el gen EGFP mediante PCR utilizando Pfu polimerasa (Stratagene) del plásmido pEGFP-N1, añadiendo los sitios de restricción BamHI y Xhol en sentido de 5' y 3' respectivamente. Los cebadores de PCR fueron como siguen:
Bam GFP 5' CC GGATCC CCA CCG GTC GCC ACC 3'
Xho GFP 5' CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG CCG 3'
Se construyó el vector HR GFP volviendo a clonar este fragmento de PCR en los sitios BamHI y Xhol de pHR'CMVLacZ, sustituyendo LacZ ORF por EGFP. Se amplificó un fragmento de 178 pb de pLAl3 (4793 a 4971), que engloba cPPT y CTS, mediante PCR. Se añadieron los sitios de restricción de Narl en el sentido de 5' de los cebadores con el propósito de insertar este fragmento dentro del sitio Clal único de HR GFP:
Nar TRIP+: 5' GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3'
Nar TRIP-: 5' GTC GTC GGCGCC CCA AAG TGG ATC TCT GCT GTC C 3'
La inserción de esta secuencia tricatenaria en la orientación correcta dio una elevación del vector del plásmido TRIP GFP, y TRIPinv GFP en la orientación inversa. Alternativamente, se amplificó el mismo fragmento tricatenario de los plásmidos pcPPT-AG, pcPPT-D, pcPPT-225 y pCTS para generar vectores que incluyen las mismas mutaciones en el cPPT o en el CTS tal como los virus correspondientes.
\newpage
En primer lugar, se rellenó el sitio EcoRI presente en el vector TRIP GFP o TRIP-EGFP (depositado en la CNCM bajo el nº I-2005 el 15 de abril de 1998), creando el vector TRIP GFP \DeltaE. Entonces se clonó en el sentido de 5' del EGFP un fragmento de BamHI/XhoI de 1,2 Kb que contiene el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) de un picomavirus en lugar del BamHI/XhoI EGFP de 0,7 Kb en un vector TRIP GFP \DeltaE, creando el vector TRIP \DeltaE IRES GFP. Los sitios presentes entre el promotor CMV y la secuencia de IRES GFP son BamHI-BstXI-SnaBI y EcoRI. Se generó un fragmento de melanoma (mel) de múltiple epítopo LTC mediante PCR en el pBS mel poly, insertando una secuencia consenso de kozac dentro de los cebadores 5BglMlu Mel:
5'CCAGATCTACGCGTGCCACCATGGCTGCTGGT 3'
3RIMel: 5'CGGAATTCGACCTAAACGCAACGGATG3'.
Se digirió el fragmento de PCR de mel mediante BgIII/EcoRI y se insertó en los sitios BamHI/EcoRI de TRIP \DeltaE IRES GFP, creando el TRIP \DeltaE mel IRES GFP también llamado TRIP mel IRES GFP.
Se creó el HR mel IRES GFP intercambiando el fragmento de Ndel/Xhol que contiene los múltiples epítopos de melanoma y el IRES GFP de TRIP mel IRES GFP con el de HR GFP. Se sitúa el sitio Ndel en el extremo del promotor CMV.
Producción de vectores virales
Se produjeron los vectores lentivirales tal como se describió anteriormente (Naldini I.M. PNAS 1996 y science 1996) mediante una transfección transitoria de células 293T con plásmido ramificado utilizando la técnica de calcio-fosfato. Brevemente, se transfectaron las células 293T con 20 \mug del plásmido de envuelta de VEV (pMDG) y 40 \mug de varios acondicionamientos (8.2 ó 8.91) y plásmidos de vector lentiviral. Se recogieron medios condicionados 60 h y 84 h después de la transfección. Entonces se concentró el virus y se trataron los dNTPs tal como se describió anteriormente (Naldini science 1996). Se determinaron las titulaciones virales en células HeLa P4.2 y células MT4 mediante dilución seriada y por ensayo ELISA p24 (Naldini Science 1996).
Se llevó a cabo una titulación de ciclo de virus por triplicado mediante infección de células P4 situadas en placas de 96 pocillos, con cantidades equivalentes de partícula (1 ng de antígeno viral p24 por pocillo), en presencia de 20 µM de DEAE-dextrano. Se añadió el inhibidor de proteasa Saquinavir (Roche) a 1 \muM en todo el experimento, para restringir el análisis a un único ciclo de infección. Se inhibió la mitosis celular mediante el tratamiento con aphicolin (8 \muM), el día anterior a la infección. Se midió la actividad \beta-galactosidasa 48 h después de la infección utilizando un ensayo de gen indicador de \beta- Gal quimioluminiscente (Boehringer).
Se infectaron las células HeLa por triplicado con la cantidad equivalente de partículas de vector (5 ng de P24 por pocillo). A las 48 horas después de la transducción, se sustituyó el medio por 200 \mul de TNB (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM) y se cuantificó la fluorescencia de las células vivas utilizando un fluorímetro de microplaca (Victor2, Wallac) y filtros adaptados de EGFP (excitación: 485 nm, emisión: 520 nm). Ratones. Se han descrito anteriormente los ratones HHD (Pascolo, 1997). Estos expresan una molécula de clase I de histocompatibilidad de cadena sencilla transgénica en la que el C terminal de la b2m humana se une covalentemente mediante un brazo peptídico (GGGGS) x 3 al N terminal de una cadena pesada quimérica (HLA- A2.1 a1-a2, H-2Db a3-transmembrana, y dominios intracitoplásmicos). Se han interrumpido adicionalmente el H-2Db y los genes b2m de ratón de estos ratones mediante recombinación homóloga dando como resultado una ausencia completa de expresión en superficie de células detectable serológicamente de moléculas de clase I de histocompatibilidad de ratón.
Generación de DCh e inducción de LTC primaria
Se obtuvieron células dendríticas humanas a partir de productos de citaféresis de donantes sanos de haplotipo de HLA-A2.1 (IDM, París, Francia). El análisis FACS de estas DC utilizando mAbs frente a CD3, CD14, CD80, CD83, HLA-ABC, y HLA-DR mostró el fenotipo de DC inmaduro. Se transdujeron las DCh en 1 ml de medio de cultivo AMV-5 con los vectores lentivirales en concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por 1x10^{6} células durante 10 días. Se midieron el porcentaje y la intensidad de fluorescencia media de la expresión de GFP en DCh transducida con los dos vectores lentivirales mediante FACS (Becton Dickinson, BD, EE.UU).
Se estimularon células mononucleares (MNC) del mismo donante in vitro mediante la DCh o la DCh transducida con una razón de 4 MNC con respecto a 1 DCh. Se volvieron a estimular las MNC dos veces utilizando la misma DCh transducida-crioconservada y después se comprobó la actividad citolítica en un ensayo de liberación de ^{51}Cr durante 4 h, utilizando como dianas células T2 cargadas con péptidos de control negativo o relevante (Inf.m.58) (10 \mug/ml, 5x10^{6} células/ml, en medio RPMI libre de FCS, 2 h a TA).
Generación de células dendríticas murinas
Se generaron células dendríticas derivadas de médula ósea tal como se describió anteriormente [43, 51]. Se cultivaron las células mononucleares de médula ósea en medio RPMI complementado con FCS al 10%, L glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 5\times10^{5} M(medio RPMI completo), complementado adicionalmente con 20 ng/ml de GM-CSF de ratón recombinante y 100 ng/ml de IL4 de ratón recombinante (ambos de GENZYME, Cambridge, MA). Se retiraron cuidadosamente las células no adherentes, en el día 2 y 6, y se añadió medio RPMI completo nuevo, complementado con 10 ng/ml de GM-CSF de ratón y 50 ng de IL4 de ratón. Se sustituyó el medio de cultivo en el día 7 por 1 ml de medio RPMI completo complementado con los vectores lentivirales a concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por 1\times10^{6} células. Las células dendríticas recogidas en el día 9 tenían una pureza de más del 95% (IA^{b+}, HHD^{+}, CD3^{-}, 33D1^{+}, NDL145^{+}, y CD 11c^{+}), tal como se ensayó con mAb apropiado. Entonces se midió el porcentaje y la intensidad media de fluorescencia de la expresión de GFP en DC murina en los días 9 y 12 mediante FACS.
Ensayos citolíticos y de reestimulación in vitro y de inmunización del vector
Se inyectaron vectores lentivirales en ratones HHD bien por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o bien por vía subcutánea durante 12 días. Entonces se volvieron a estimular de manera individual las células del bazo de ratones cebados en medio RPMI completo mediante cada péptido epítopo durante 7 días. En los dos últimos días, se volvieron a estimular las células cultivadas mediante TCGF al 10%. En el día 7 se comprobó la actividad citolítica de las células cultivadas tal como ya se ha descrito (Pascolo, 1997), en un ensayo de liberación de ^{51}Cr durante 4 h, utilizando como dianas células TAP-RMA-S transfectadas con HHD cargadas con péptidos de control negativo o relevante (Inf.m.58) (10 \mug/ml, 5\times10^{6} células/ml, en medio RPMI libre de FCS, 2 h a TA). Se utilizaron paralelamente como células diana las células HeLa transfectadas con HHD transducidas o no con TRIP-mel-ITES-GFP. Se calculó el porcentaje de lisis específica tal como sigue: (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación total - liberación espontánea) x 100.
Ejemplo II Evaluación de respuestas LTC en ratones HHD tras la inmunización con el vector TRIP-des-IRES-GFP que codifica para el gen DES de Mycobacterium tuberculosis
El gen DES se describe en el documento WO 98/04711.
Procedimiento experimental
En una primera etapa, se utilizan los vectores TRIP-des-IRES-GFP para transducir las células HeLa-HDD. Estas células se transdujeron y se clonaron limitando la dilución. Se seleccionó el clon que expresó el nivel más alto de GFP para utilizarlo como células diana en pruebas de LTC de ^{51}Cr clásicas.
En una segunda etapa, se inyectaron ratones HDD por vía intraperitoneal utilizando 1,2 \mug/p24 por ratón de las partículas de vector TRIP-des-IRES-GFP. Se estimularon in vitro las células del bazo de estos ratones 12 días después de la inyección con o bien 0,2 \mug o 1 \mug/p24/ml (2\times10^{6} células por ml) de partículas de vector o bien con blastocitos singénicos estimulados con LPS, transducidos con TRIP-des-IRES-GFP con 1 \mug/p24/ml/2\times10^{6} células/ml. Seis días después de la estimulación in vitro, se comprobó la capacidad citolítica de las células en una ensayo de ^{51}Cr utilizando células diana HeLa-HDD transducidas en des. Las células diana de control fueron células HeLa-HDD transducidas por el múltiple epítopo de melanoma (TRIP-mel-IRES-GFP).
Resultados
Estos experimentos se han realizado para estudiar si los vectores positivos tricatenarios derivados de VIH que codifican para un gen completo son capaces de transducir células y de inducir respuestas específicas de LTC frente a las células diana que expresan el mismo gen. Tal como se ilustra en la figura 9, se obtiene una lisis específica en todas las condiciones. Los blastocitos de LPS transducidos indujeron respuestas de LTC débiles. Se obtuvieron los mejores resultados utilizando 1 \mug/p24/ml de partículas de vector. Estos resultados muestran que un gen completo puede introducirse en el genoma de la célula huésped y se procesa y presenta su producto, e induce respuestas de LTC significativas. Estos resultados también demuestran que el gen des contiene al menos uno o más péptidos epítopos de LTC restringidos de HLA-A2.1.
Referencias
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6. Pascolo, S., Bervas, N., Ure, J.M., Smith, A.G., Lemonnier, F.A. & Pérarnau, B. HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8+ T lymphocytes from \beta2 microglobulin (\beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db \beta2m double knockout mice J. Exp. Med. 185, 2043-2051 (1997).
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<110> INSTITUTO PASTEUR
CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
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<120> VECTORES PARA LA PREPARACIÓN DE COMPOSICIONES INMUNOTERAPÉUTICAS
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<130> B4408_AD/CAL
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<140> TODAVÍA NO ASIGNADO
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<141> 10-10-2000
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<150> 99402492.5
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<151> 11-10-1999
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<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(39)
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<223> Cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcagatctgc caccatggca ctaacagaag taataccac 
\hfill
39 
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<210> 2
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(30)
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<223> Cebador
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cggaattctt attggccttg cccctgcttc 
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(38)
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<223> Cebador
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gaagatctgc caccatgaag cccatcaacc tctctcat 
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<223> Cebador
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cggaattctt acccagcgca acgcctc 
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27 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<223> Cebador
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ccggatcccc accggtcgcc acc 
\hfill
23 
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1) .. (23)
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<223> Cebador
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ccctcgagct agagtcgcgg ccg 
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23 
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<210> 7
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(38)
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<223> Fragmento tricatenario
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<400> 7
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gtcgtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc 
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38 
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<210> 8
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(34)
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<223> Fragmento tricatenario
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<400> 8
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34 
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<210> 9
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<220>
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1)..(32)
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<400> 9
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
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<221> característica-heterogénea
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<222> (1) .. (27)
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<223> Cebador
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<400> 10
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cggaattcga cctaaacgca acggatg 
\hfill
27 
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<210> 11
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<211> 92
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<212> PRT
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<213> humana
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<220>
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<221> PÉPTIDO
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<222> (1)..(92)
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<223> epítopo de melanoma
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<400> 11
100

Claims (35)

1. Composición inmunógena que comprende un vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta LTC (linfocitos T citotóxicos) o una respuesta CD4, cuando se administra a un paciente.
2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones cPPT y CTS es de 178 pb de longitud.
3. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la respuesta de LTC generada es una respuesta de LTC de memoria.
4. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque las secuencias de origen retroviral se derivan a partir de un genoma de lentivirus.
5. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha secuencia de transgén está contenida en un casete de expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.
6. Composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes o similares a retrovirales recombinantes que comprende 1) una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y 2) un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral e insertándose en una localización y orientación funcional con señales reguladoras de la retrotranscripción de origen retroviral o similares a retroviral o señales reguladoras de transposones, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o una respuesta de CD4, cuando se administra a un paciente.
7. Composición inmunógena según la reivindicación 6, en la que dichas partículas retrovirales recombinantes comprenden además:
e.
un polipéptido gag que corresponde a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),
f.
un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),
g.
un polipéptido de envoltura o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV),
8. Composición inmunógena según la reivindicación 6, en la que dichas partículas similares a retrovirales recombinantes comprenden:
a)
un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, derivándose dicho fragmento de ADN de un retrotransposón e insertándose en una orientación funcional con señales reguladoras de retrotransposón,
b)
un polipéptido que corresponde a las nucleoproteínas de un retrotransposon o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),
c)
un polipéptido pol que corresponde a proteínas RT, PRO, IN de un retrotransposon o un polipéptido derivado funcional (polipéptido POL),
d)
un polipéptido de envoltura viral,
e)
una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, señales reguladoras de retrotransposón de retrotranscripción, expresión y encapsidación, en la que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo una respuesta de LTC o una respuesta de CD4, cuando se administra a un paciente.
9. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones cPPT y CTS es de 178 pb de longitud.
10. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que la respuesta de LTC generada es una respuesta de LTC o CD4 de memoria.
11. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación son de origen lentiviral, y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT es de origen lentiviral.
12. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque las señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT, se derivan de un virus seleccionado de los lentivirus CAEV, VAIE, VISNA, VIH, VIS o VIF.
13. Composición inmunógena según la reivindicación 12, caracterizada porque las señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT en el vector, se derivan de un retrovirus de tipo-VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.
14. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el polinucleótido del vector es una secuencia de ADN que comprende la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación (CTS) de un genoma retroviral de VIH-1.
15. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, caracterizada porque las secuencias gag, pol y env de las partículas del vector se derivan de las secuencias de un retrovirus de VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.
16. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, caracterizada porque las secuencias gag y pol se derivan de las secuencias de un retrovirus de VIH y la secuencia env se deriva de un retrovirus de VIH diferente o de un virus.
17. Composición inmunógena según la reivindicación 16, caracterizada porque la secuencia env codifica para polipéptidos ENV anfótropos.
18. Composición inmunógena según la reivindicación 16, caracterizada porque la secuencia env codifica para polipéptidos ENV ecotrópicos.
19. Composición inmunógena según la reivindicación 16, caracterizada porque la secuencia env se deriva de los virus de la estomatitis vesicular (VEV).
20. Constructo de vector que es un plásmido pTRIP TEL/AML-IRES-GFP depositado con el CNCM el 11 de octubre de 1999, bajo el número I-2326, pTRIP.DES-IRES-GFP depositado con el CNCM el 11 de octubre de 1999, bajo el I-2331 o pTRIP.ILKE-IRES-GFP, depositado con el CNCM el 11 de octubre de 1999, bajo el número de I-2327, en el que los epítopos TEUAML, el DES o el ILKE están sustituidos por una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma.
21. Transducto de célula con un vector recombinante o partículas recombinantes de una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o constructo de vector según la reivindicación 20.
22. Célula recombinante según la reivindicación 21, que es una célula que presenta un antígeno o una célula elegida entre células de pulmón, células de cerebro, células epiteliales, astrocitos, microglía, oligodendrocitos, neuronas, células musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales, cepas celulares de la médula, macrófagos, fibroblastos, células hematopoyéticas.
23. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para el tratamiento terapéutico de carcinomas, leucemia o linfoma.
24. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la secuencia de transgén codifica para un múltiple epítopo de carcinomas, leucemia o linfoma.
25. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que dicho uno o varios epítopos de carcinomas se derivan de carcinoma renal, de vejiga, de colon o pulmón o cáncer de mama.
26. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en la que dicho uno o varios epítopos o dicho múltiple epítopo se modifica mediante mutación, deleción o inserción.
27. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o vector o partícula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que las regiones CTS y cPPT tienen una localización central en la secuencia del vector.
28. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 o vector o partícula de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que dicha secuencia de transgén se inserta en la región U3 de las señales de regulación para la retrotranscripción.
29. Vector recombinante en el que se inserta un fragmento de ADN que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS), capaz de adoptar una estructura de ADN de tres cadenas (el ADN tricatenario) tras la transcripción inversa, siendo dicho fragmento de ADN de origen retroviral o similar a retroviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, y señales reguladoras de la retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, en el que dicho uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector permiten que la composición inmunógena induzca o estimule una respuesta mediada por células por ejemplo a una respuesta de LTC o una respuesta de CD4, cuando se administra a un paciente.
30. Vector recombinante según la reivindicación 29, en el que dicho fragmento de ADN que engloba las regiones CTS y cPPT es de 178 pb de longitud.
31. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que dicha secuencia de transgén codifica para un múltiple epítopo de carcinomas, leucemia o linfoma.
32. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que dicho uno o varios epítopos se derivan de carcinoma renal, de vejiga, de colon o pulmón o cáncer de mama.
33. Vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que dicho uno o varios epítopos o dicho múltiple epítopo se modifica mediante mutación, deleción o inserción.
34. Composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 que es capaz de inducir o estimular la importación nuclear del genoma del vector en células diana.
35. Uso de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
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