JP2003511080A - 免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクター - Google Patents
免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクターInfo
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Abstract
Description
に存在するヌクレオチド配列によってコードされたエピトープに対する免疫反応
の発生若しくは増強を誘導し、又はこれらに寄与することが可能な組成物を調製
するためのレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの使用に関す
る。
特にエピトープに対する細胞障害性Tリンパ球(CTL)反応を得ることが可能
であることを示した。
コードされた1又は数個のエピトープに対して得られた特異的応答であり得るこ
とを示すデータが得られた。
に対する免疫療法又は予防接種療法のプロトコールに使用できる手段を提供する
。
疾患の治療また予防に使用できる手段も開示する。
、特にCTL応答は腫瘍若しくはウイルスの抗原、又はウイルス感染細胞の抗原
に特異的であることが可能で、MHC(主要組織適合複合体)の特定の分子に限
定され得ることを示す結果を得た。
子に限定した細胞性免疫応答を得るために、免疫原組成物に前記ベクターを使用
することに関する。
域(CTS)を包含するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む免疫原組
成物に関する。cPPT及びCTS配列は、逆転写中に3本鎖DNA構造(本明
細書ではDNA3重鎖と称する)の形成を誘導する。このDNA3重鎖は、ベク
ターDNAゲノムの核移入を刺激し、これらの領域の起源はレトロウイルス又は
レトロウイルス様で、前記ベクターは所定のヌクレオチド配列(目的の導入遺伝
子又は配列)に加えて、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写(r
etrotranscription)、発現、及びウイルス粒子形成の調節シ
グナルを含み、この組成物はベクター内に存在する導入遺伝子配列によってコー
ドされた1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)又は
CD4の応答を誘導又は刺激することが可能である。
プに対するCTL応答又はCD4応答は記憶CTL又はCD4応答である。
されることが可能で、それによって前記ベクターで組換えられた細胞でのベクタ
ーゲノムの核移入が影響を受け、特に増強され得ることが強調される。
にその発生に関与することができるので、(前記免疫原組成物の投与後、前記免
疫応答が長期間にわたって誘導されなければならない場合、又は少なくとも応答
が必要とされる期間に(前記応答の長期誘導であってもよい)誘導可能でなけれ
ばならない場合を含む)抗腫瘍治療又は抗ウイルス治療又は抗病原性治療のプロ
トコールにおいて前記免疫原組成物の使用を企図することが可能である。言い換
えると、前記免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にCTL応答又は記憶応答の
発生を誘導又は刺激し、又はそれに寄与することによって、腫瘍疾患又は感染性
疾患(例えば細菌又はウイルスによる)を治療するための治療用組成物の調製に
使用することができる。
クター及びベクター粒子内にcPPT及びCTS領域が存在するため、標的細胞
においてベクターゲノムの核移入を刺激させ得ることが注目される。ベクター内
で誘導されるエピトープは細胞自身のものであってもよいし、細胞以外のもので
あってもよい。
増加させるために、レトロウイルス由来又は合成によるcPPT及びCTS配列
を含むヌクレオチド配列の使用も含む。
が理解されよう。
防接種プロトコールと類似した治療プロトコールにおいて使用可能な組成物を開
示する。
数個のエピトープ、例えば腫瘍に対する細胞性免疫を誘導することが可能な標的
抗原に同定されたエピトープをコードする配列である得ることに注目すると興味
深い。
ードすることができる。特定の実施態様では、それらは腫瘍で確認された標的抗
原から得ることができ、コーディング配列が一緒になって導入遺伝子を形成する
とき、細胞性免疫応答がエピトープ全て又はエピトープのほとんどに対して得ら
れるような方法で選択され得る。細胞性免疫応答はインビトロ、又は好ましい実
施態様ではインビボでアッセイすることができる。このようなアッセイの実施を
可能にするプロトコールは実施例で説明する。
、肺癌、乳癌、白血病及びリンパ腫などを含む癌腫で同定されている。
クテリア、例えばM tuberculosisを含む任意の種類の病原体に関
連する感染症を含めた感染性疾患において、細胞性免疫応答を得るために使用す
ることができる。
そのコーディング配列をベクターに挿入して前記免疫原組成物で使用することが
できる。例えば、M tuberculosisのdes遺伝子が使用できる。
るか、又は腫瘍細胞若しくはウイルス感染細胞上の標的抗原として同定された(
糖タンパク質又はその他のタンパク質由来化合物を含む)タンパク質上に提示す
ることが可能であることも付け加えなければならない。
はタンパク質は、例えば変異、欠失又は挿入によって変更することが可能で、例
えば安定性を高めるために変更することが可能であることにも留意すべきである
。
シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列(導入遺伝子)を含有する
組換えヌクレオチド配列と、 2)シス作用性中心開始領域(CTS)及びシス作用性終止領域(CTS)を
包含するポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又は
レトロウイルス様であるか、又はトランスポゾン由来であり、レトロウイルス又
はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナル
とともに、機能的な方向及び位置に挿入されたポリヌクレオチドと を備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、 ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた1又は数個のエ
ピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)応答を誘導又は刺激すること
ができる免疫原組成物に関する。
鎖DNA構造「DNA3重鎖」を採り、ベクターDNAの核移入を刺激すること
ができる。
た1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)応答を誘導
又は刺激することが可能な前記免疫原組成物は、 a)レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応
するgagポリペプチド(GAGポリペプチド)と、 b)レンチウイルスのRT、PRO、INタンパク質又は機能的に得られたポ
リペプチドによって構成されたpolポリペプチド(POLポリペプチド)と、 c)エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド(ENVポ
リペプチド)と、 d)転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれ、1又は数個のエピトープ
をコードする所定のヌクレオチド配列(目的の導入遺伝子又は配列)と、レトロ
ウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節
シグナルを含有する配列と、並びにシス作用性中心開始領域(cPPT)及びシ
ス作用性終止領域(CTS)を含有するポリヌクレオチドであって、これらの領
域がレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、上記レトロウイルス又
はレトロウイルス様起源の調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されている
ポリヌクレオチドとを備えた組換えヌクレオチド配列と を具備する組換えレトロウイルスベクター粒子を含む。
は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)応答を誘導又は促
進することが可能な免疫原組成物は、 a)シス作用性中心開始領域(cPPT)及びシス作用性終止領域(CTS)
を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で
、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向挿入されたポリヌクレ
オチドと、 b)レトロトランスポゾンの核タンパク質又は又は機能的に得られたポリペプ
チドに対応するポリペプチド(GAGポリヌクレオチド)と、 c)レトロトランスポゾンのRT、PRO、INタンパク質に対応するpolポ
リペプチド又は機能的に得られたポリペプチド(POLポリペプチド)と、 d)ウイルスエンベロープポリペプチドと、 e)転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロ
トランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列(目的
の導入遺伝子又は配列)を備えた組換えヌクレオチド配列を具備する組換えレト
ロウイルス様粒子と を含む。
する組換えレトロウイルスベクター粒子は、記憶細胞性免疫応答、特に記憶CT
L応答の発生を誘導、増強するか、又は関連することが可能である。
、いくつか可能な実施態様によって調製することができる。
ゲノムから得る方法で免疫原組成物は調製される。
ランスポゾンからも得られる。
ーに含有される目的の導入遺伝子又は配列は、転写及び発現の調節シグナルを含
有する発現カセットに含まれる。
ンチウイルス起源であり、cPPT及びCTS領域を備えたポリヌクレオチドも
レンチウイルス起源である。
シグナル並びにcPPT及びCTS領域を含むポリヌクレオチドは、HIV型、
特にHIV−2又はHIV−2のレトロウイルスから得られる。
節シグナルを設計するために、さらにはcPPT及びCTS領域を含むポリヌク
レオチドを得るために使用することができる。従って、特にレンチウイルスCA
EV、EIAV、VISNA、HIV、SIV又はFIVを使用することができ
る。
のトランス相補性に必要なポリペプチド又はタンパク質をコードする配列は、例
えばレンチウイルス、特にHIV−1及びHIV−2レトロウイルスを含むHI
V由来のGAG、POL及びENVタンパク質である。
てもよい。例えば、GAG及びPOL配列はHIVレトロウイルス由来であり、
ENV配列は他のウイルス又はレトロウイルス由来し、且つアンフォトロピック
又はエコトロピックENV配列の何れであってもよい。
。
コードされた1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)
応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、 a)シス作用性中心開始領域(cPPT)及びシス作用性終止領域(CTS)
を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾンから得
られ、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向に挿入されたポリ
ヌクレオチドと、 b)レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチド
に対応するポリペプチド(GAGポリペプチド)と、 c)レトロトランスポゾンのRT、PRO、INタンパク質に対応するpol
ポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド(POLポリペプチド)と、 d)ウイルスエンベロープポリペプチドと、 e)転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレト
ロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列(目
的の導入遺伝子又は配列)を含む組換えヌクレオチド配列と を備えた組換えレトロウイルス様粒子を含む。
成物は、前記で開示した特徴によって、記憶細胞性応答、特に記憶CTL応答を
引き起こすことが可能である。
tionale de Culture de Microorganisme
s at Institut Pasteur in Paris、Franc
e)に寄託されたベクター構築物にも関する。
たpTRIP.TEL/AML−IRES−GFPであり、第2のベクターはp
TRIP−ILKE−IRES−GFPと称し、1999年10月11日にl−
2327号として寄託された。
月11日にl−2331号としてCNCMに寄託された。
rculosisの完全なDES遺伝子を含む、他の任意の目的の抗原又はエピ
トープによって置き換えることができる。
は、cPPT及びCTS領域がベクター配列の中心に位置するように設計される
。
はこの配列のほぼ中心にあることを意味する。特に、cPPT及びCTS領域は
逆転写された直鎖状ベクターDNAの中央の3分の1以内にあることが可能であ
る。
3重鎖配列が中央に位置することによって、そのベクター又はベクター粒子と接
触する細胞の形質導入量を増大させることが可能である。
単位はLTR領域のU3領域内に挿入することができる。従って、逆転写の後、
導入遺伝子は複製され、従って3重鎖配列のそれぞれの鎖に現れ、従って導入遺
伝子の大きさにかかわらず、3重鎖配列がベクターの中心部分に位置することが
可能となる。
特に免疫原組成物のベクター又はベクター粒子によって形質導入された組換え細
胞にも関する。
肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニ
ューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファー
ジ、繊維芽細胞、造血細胞から選択することができる。
CTL応答であるCTL応答を発生させ、腫瘍、特に癌の治療方法又は治療処置
のための治療組成物の調製に使用することができる。あるいは、その他公知の抗
癌治療の補助処置として使用することができる。
その他のアプローチと関連させて使用することができる。
性を阻害すること、若しくは転移巣形成の制御を含めた悪性細胞の拡散を阻害す
ることを意味するか、又はその両者を意味するものである。
憶細胞性応答を誘導又は増強し、一般的には関与することが可能であるという事
実を考慮すると、疾患の治癒を期待して、悪性細胞の増殖及び腫瘍の拡散を制御
するために使用する方法に関している。
臓、大腸)含めた癌腫及びリンパ滲出である。
パク質を含む腫瘍特異的抗原を発現している全ての腫瘍である。
標的細胞を治療する患者に投与することを含めて、受容可能な本発明の免疫原組
成物の投与方法はいずれも興味深い。
例えば筋肉内投与経路を含めた通常の投与経路によって患者に直接投与し得る。
性免疫応答の発生をインビボで誘導、増強、又は関与する方法で患者に直接投与
し得る。
ために使用される。
及びCTS配列の特性によって、標的細胞内でベクターゲノムの核移入を誘導又
は促進するので特に興味深いことが強調される。
に存在する関心のあるヌクレオチド配列又は導入遺伝子によってコードされた複
数のエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するために使用できるこ
と、及び完全な遺伝子配列、例えば病原性物質の遺伝子の産物又は少なくとも8
から15アミノ酸、好ましくは9から12アミノ酸をコードし得る前記遺伝子の
断片の産物に対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するためにも使用できること
である。本発明はまた、細胞性応答を誘導する前記アミノ酸配列の複数反復(少
なくとも2回の同一配列)及び/又は異なる病原性抗原又は腫瘍抗原の2個のエ
ピトープに対応する少なくとも2種の異なる配列を含むアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
ており、遺伝子治療にとってますます重要となっている。最近、ポリプリン広域
シス作用性配列(中心DNA3重鎖)を含むレンチウイルスベクターが中心DN
A3重鎖を欠失したものよりもヒト及びマウスをより効果的に形質導入すること
が示された(Charneau P.et.al.J.Mol.Biol.19
94、241、651〜662)。中心DNA3重鎖を含むか、又は含まず、同
様のHLA−A2.1限定メラノーマCTLポリエピトープをコードするレンチ
ウイルスベクターのTL応答を誘導する能力を本明細書で試験した。HHD(H
LA−A2.1純系)マウスにおいて、中心DNAを含むレンチウイルスベクタ
ーを直接インビボ投与すると、ポリエピトープ配列によってコードされたエピト
ープペプチド全てに対する強いCTL応答が誘導された。レンチウイルスベクタ
ーはDNA3重鎖を含むと明らかに有利であることが示された。さらに、DNA
3重鎖を含むレンチウイルスが3重鎖を含まないベクターよりもヒト樹状細胞を
7倍も効果的に形質導入することが示された。これらのエキソビボ導入した樹状
細胞は、メラノーマエピトープペプチドのほとんどに対して効果的かつ特異的な
1次CTL応答を引き起こす。変更したレンチウイルスの安全性の問題がほぼ解
決されたので、このベクターをインビボにおけるヒトの遺伝子治療だけでなく、
癌患者の免疫療法にも使用することを提案する。
種に感染することができる。この特性があるため、レンチウイルスは遺伝子治療
にとって魅力的な存在である。いくつかの複製欠失組換えレンチウイルスベクタ
ーは、既に様々なグループによって構築されている(Naldini PNAS
93、11382〜8、Science、1996)。再操作し、無毒化した
これらのレンチウイルスベクターは最も効果的かつ安全な遺伝子治療用ベクター
として提案されている(Zufferey R、& Kim V.N.J Vi
rol、72、9873〜80、1998)。本発明者等は、水疱性口炎ウイル
スGタンパク質(VSVG)偽型レンチウイルス(HIV)をベースとしたベク
ターを開発した(Burns J.C.、1993 PNAS 90、8033
〜7)。このベクターは非必須なウイルスタンパク質をほとんど欠失しているが
、ポリプリン領域シス作用性配列(cPPT、中心DNA3重鎖)を含む。この
中心DNA3重鎖は、逆転写されたHIV−DNA分子の核移入をかなり促進す
る。さらに、中心DNA3重鎖を含むレンチウイルスは、この3重鎖を含まない
ベクターよりも効果的にマウス及びヒト細胞を形質導入させることが認められた
。
et al.、J.Exp.Med.、1997、185:2043〜205
1)を用いると、実験的に制御したエピトープペプチドの免疫原性の評価及び様
々な免疫戦略の評価が可能である。これらのHHDマウスを使用して、異なる組
換えベクターによってコードされたメラノーマポリペプチドが単一の動物個体内
で同時にCTL応答を誘導する能力が報告された。中心DNA3重鎖を含むか、
又は含まず、同様のメラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベク
ターが、HHDトランスジェニックマウスにおいてインビボCTLを誘導する能
力について最初に調べた。さらに同様の組換えレンチウイルスによって形質導入
されたヒト樹状細胞(hDC)がエキソビボでメラノーマポリエピトープモチー
フに対して1次CTL応答を誘導するかどうかについても調べた。本発明の結果
によって、組換えベクターを直接投与するか、又はエキソビボで形質導入した樹
状細胞を使用すると、DNA3重鎖によってレンチウイルスベクターがインビボ
で特異的なCTL応答を誘導する能力が著しく増強されることが示された。
HHDマウスに注射することによって、いくつかのメラノーマエピトープに対し
て同時にCTL応答を惹起することができることを証明した後、同様のメラノー
マポリペプチドモチーフ(図1及び表1)をコードするレンチウイルスの免疫原
能を試験した。TRIP−mel−IRES−GFPベクター(CNCM 1−
2185として1999年4月20日に寄託)をマウス当たり1.25μg/p
24で静脈内、腹腔内、又は皮下内に投与した。1群当たり少なくとも3匹のマ
ウスを使用した。
が同時に誘導された。投与経路に関わらず、負荷したペプチド(表2)及びTR
IP−mel−IRES−GFPで形質導入したHHDトランスフェクトHeL
a細胞(データは示していない)の両者に対して同様のCTL応答が認められた
。しかし、腹腔内注射によって、わずかに良好なCTL応答が誘導された。強い
応答がNA17−A.nt38及びgp100.154エピトープペプチドに対
して引き起こされた。gp100.457、MART.1.27、Mage−3
、及びチロシナーゼ368−Dに対してまた、著しい応答が認められた。gp.
100.209、gp.100.280、MART−1.32、及びチロシナー
ゼ1に対するCTL応答は弱かった。TRIP−mel−IRES−GFPベク
ターで免疫した後に弱いCTL応答が引き起こされたエピトープは全て、その他
のレンチウイルスベクター以外を投与したときのCTL非誘導群に分類された。
の最小用量 著しいCTL応答を引き起こすレンチウイルスベクターの最小用量は、6種の
異なる用量のTRIP−mel−IRES−GFPベクターを腹腔内投与して(
1用量あたり4匹のHHDマウス)決定した。51Cr試験の直前に2匹のマウ
スのエフェクター細胞を混合して同一のE/T比を得る実験を2回実施した。ほ
とんどの実験において、メラノーマエピトープペプチド全てに対するCTL応答
を試験した。結果は非常に類似しており、極めて同質であったので、「線量−効
果」関係を明確かつ簡潔に比較するためにNA17/Aエピトープペプチドに対
するCTL応答のみを考慮した。マウス当たり500ngと2500ng/p2
4との間の用量を使用して、最良のCTL応答が得られた。いくつかのメラノー
マエピトープに対して検出可能なCTL応答が得られたが、レンチウイルスの用
量が高くても用量の低い場合よりも良好なCTL応答が誘導されるわけではなか
った。いくつかのメラノーマペプチドに対するいくつかの特異的なCTL応答が
実証されたとしても、マウス当たり500ng/p24未満の用量では、効果的
なCTL応答を誘導するには不十分であった。マウス当たり1250ng/p2
4の用量で、何匹かのマウスにおいてポリエピトープモチーフに含まれる10個
のエピトープ全てに対してCTL応答が生じたことは注目に値する(図3)。
後、このマウスを12日目又は5ヶ月目に殺処分した。5日間はメラノーマエピ
トープペプチドで、さらに2日間は10%TCGFでインビトロ誘発した後、マ
ウス4匹のエフェクター細胞を混合してペプチドを負荷したHHDトランスフェ
クトRMAS細胞に対して試験した。12日前に免疫したマウスでは、gp10
0.29及びMart1.32以外のメラノーマエピトープペプチド全てについ
てCTL応答が証明された。TRIP−mel−IRES−GFPを注射して5
ヶ月経つと、1次CTL誘導エピトープ全てがまだ強いCTL応答を誘導した(
図2)。マウス免疫後、12日目又は5ヶ月目のCTL応答のレベルは、驚くほ
ど同等であった。レンチウイルスベクターによってインビボ導入された細胞は、
免疫系によって破壊されずにコードされたメラノーマポリエピトープを産生し続
けることが示唆された。
R−mel−IRES−GFPベクターをマウス当たり800ng、200ng
、50ng、12ng、及び3ng/p24の用量で腹腔内投与して免疫した。
別個の2回の実験において、各用量について少なくとも4匹のマウスを試験した
。合成ペプチドでインビトロ誘発した後、ペプチドを加えたRMAS−HHD標
的細胞を使用して脾細胞の細胞溶解能を試験した。結果は極めて似通っていたの
で、明確かつ簡潔にするためにNA17/A、Mart−1.27、gp100
.154、及びチロシナーゼ.368−Dエピトープペプチドに対するCTL応
答のみを試験した。
/p24の用量のTRIP−LVベクターで免疫したマウスはHR−LVベクタ
ーで免疫したマウスよりも強いCTL応答を引き起こした。使用したベクターに
かかわらず、マウス当たりの12ng/p24未満の用量では検出可能なCTL
応答は認められなかった(データは示さず)。これによって、中心DNA複合体
を含むレンチウイルスベクターの形質導入能はこの複合体を欠失したものよりも
増強されていることが確認された。
ルスによって中心DNA3重鎖を持たないベクターよりも30倍まで効果的に形
質導入されることが最初に観察された。次に、様々な濃度でこれら2種のレンチ
ウイルスベクターの形質導入能を健常提供者又はHHDマウスのDCについて試
験した。GFPを発現するDCのパーセント及び平均蛍光強度をFACSによっ
て測定し、2種のレンチウイルスベクターによるDCの形質導入濃度と見なした
。
的に細胞を形質導入した。TRIP−GFPベクターによって形質導入されたマ
ウス及びヒトDCのGFP発現は、それぞれHR−GFPベクターによって形質
導入されたGFPの発現の3倍及び7倍に達した(図4)。
状細胞を使用した1次CTL誘発 健常なHLA−A2.1提供者から得られた単核細胞(MNC)を、同提供者
から得られたTRIP mel−IRES−GFPによって形質導入したDCを
使用して週に1回インビトロで誘発した。樹状細胞におけるGFP発現の存在を
FACSによって分析し、形質導入の効果を確かめた。3週間後、MNC細胞障
害性は、FCSを含まない培養条件で標的としてペプチドを付加したT2細胞を
使用した51Crアッセイによって試験した。
rt1.31以外のメラノーマエピトープペプチド全てに対して著しいCTL応
答を誘発したが、形質導入しなかったhDCでは通常のバックグランドの応答し
か誘発しなかった(図5)。
ことは、近年報告で示されている(Maldini、1996、Kafri、1
997)。レンチウイルスは非分裂細胞の完全な核膜を通過して移入することが
できる(Case、1999)。本明細書では、この方法と中心DNA3重鎖と
称したポリプリン領域シス作用性配列を組み合わせると、大いに可能性が広がる
ことを実証した。この配列をレンチウイルス由来ベクターに導入すると、ニュー
ロン、肝細胞、及び造血幹細胞/始原細胞を含めた数種の細胞の安定したインビ
ボ及びエキソビボ形質導入を30倍高めることが可能であった。
る取り組みで、進歩が認められた(Narry Kim V et al 19
88、Zufferey、1999)。しかし、古典的なマウスのレトロウイル
スベクター及びレトロウイルスではないベクターの使用が成功した免疫治療で(
Condon、1996、Song、1997、Specht、1997)、レ
ンチウイルスベクターを適用することについては研究されなかった。有望なワク
チン戦略を開発するために、中心DNA3重鎖を含み、メラノーマポリエピトー
プをコードするレンチウイルスベクターの免疫原能を試験した。最初に、このベ
クターを直接注射して、メラノーマエピトープに対してインビボで特異的なCT
L応答が引き起こされ得るかどうかについて調べた。今までに、HHD HLA
−A2.1(純系)トランスジェニックマウスにおいていくつかの免疫戦略の比
較が行われた。組換えpCMV−B10(HBs)DNA又は同様のメラノーマ
ポリエピトープをコードする組換えワクチンを使用すると、1個体マウスにおい
て、メラノーマポリエピトープに含まれる4から6個の異なるペプチドに対する
CTL応答が同時に誘導されることが可能であった。同様のメラノーマポリエピ
トープをコードするTRIP mel IRES−GFPベクターでは、特異的
細胞溶解についてだけでなく、CTL応答を誘発するポリペプチドの数について
も、同様のポリエピトープモチーフをコードするその他のベクターよりも顕著に
優れた結果が得られた。特に、ベクターを腹腔内及び皮下注射すると、TRIP
mel IRES−GFPベクターによってコードされたエピトープ全てに対
してCTL応答が誘導されるマウスがいた。
免疫方法として使用できることがいくつかのグループによって報告された(Ma
yardomo、JI、1995、Song W、1997、Specht、J
M、1997)。従って、本発明の目的のために、マウス及びヒトの樹状細胞が
効果的に形質導入され、インビトロで1次CTL応答を誘導するかどうかを調べ
た。本発明の結果によって、これらの細胞が容易に形質導入され得ることが示唆
された。さらに、これらの形質導入細胞は組換えレンチウイルスによってコード
されたエピトープ全てを提示した。興味深いことに、ヒト樹状細胞は最も容易に
形質導入された。細胞をインビトロ形質導入することによって、レンチウイルス
ベクターが様々な宿主細胞にゲノムを有害な方法で組み込むことを回避できる。
この理由によって、インビトロ形質導入された細胞は、最初の臨床応用で適切か
つ安全な送達方法となるだろう。
IV−タンパク質を発現する繊維芽細胞を使用して、レトロウイルスベクターが
いくつかの動物モデルだけでなく、HIV患者のCTL応答を誘導する能力を初
めて示した(1998年にWarnerによって概説されている)。マウスに直
接注射すると、プロウイルスのDNAが効果的に抗原を提示する樹状細胞で検出
された(Song、1997)。しかし、レンチウイルスとは対照的に、マウス
のレトロウイルスベクターはDCなどの非分裂細胞を形質導入することができず
、コードされた遺伝子のインビボ発現は「遮断される」ことが多い。結果的に、
これらのレトロウイルスベクターはヒトの免疫治療にとって有力な候補とはなら
ない(Kafri)。
HDマウスにおいて中心DNA3重鎖を含まないベクターよりも強くインビボで
CTL応答を誘導することが示唆される。さらに、中心DNA3重鎖を含むレン
チウイルスベクターはインビトロで容易にhDCを形質導入することができ、ひ
いては臨床的免疫治療に使用することができよう。
aldini et al、PNAS 93、11382〜8、1996)。L
acZリポーター遺伝子は、EGFP遺伝子で置き換えた(Clontech)
。TRIP−EGFPでは、EGFP遺伝子をcPPT及びCTS配列を含むH
IV−1LAIの中心断片のClal部位に挿入した。
tratagene)を使用してPCRによって増幅し、5′及び3′それぞれ
にBamHI及びXhoI制限部位を付加した。PCRプライマは以下の通りで
あった。 Bam GFP 5′CC GGATCC CCA CCG GTC GCC
ACC 3′ Xho GFP 5′CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG
CCG 3′ HR GFPベクターは、このPCR断片をpHR′CMVLacZのBam
HI及びXhoI部位にクローニングし直して、LacZ ORFをEGFPに
置き換えることによって構築した。
1)をPCRによって増幅した。この断片をHR GFPの特有のClaI部位
に挿入するために、NarI制限部位をプライマの5′に付加した。 Nar TRIP+: 5′ GTC GTC GGCGCC GAATTC
ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3′ Nar TRIP−: 5′GTC GTC GGCGCC CCA AAG
TGG ATC TCT GCT GTC C 3′ 正方向でこの3重鎖配列を挿入すると、TRIP GFPプラスミドベクター
が生じ、逆向きだとTRIPinv GFPが生じた。あるいは、同様の3重鎖
断片をpcPPT−AG、pcPPT−D、pcPPT−225及びpCTSプ
ラスミドから増幅して、対応するウイルスのようにcPPT又はCTSに同様の
変異を含むベクターを作製した。
8年4月15日I−2005号として寄託)に存在するEcoRI部位を充填し
て、TRIP GFPΔEベクターを作製した。次に、TRIP GFP ΔE
ベクターの0.7kb BamHI/XhoI EGFPの代わりに、ピコナウ
イルスの内部リボゾーム結合部位(IRES)を含む1.2kb BamHI/
XhoI断片をEGFPの上流にクローニングして、TRIP ΔE IRES
GFPベクターを作製した。CMVプロモータとIRES GFP配列の間に
存在する部位は、BamHI−BstXI−SnaBI及びEcoRIである。
CTLポリエピトープメラノーマ(mel)断片をPCRによってpBS me
l poly上に作製し、プライマ5BglMlu Mel: 5′CCAGATCTACGCGTGCCACCATGGCTGCTGGT 3
′ 3RIMel: 5′CGGAATTCGACCTAAACGCAACGGAT
G3′ の内部にkozacコンセンサス配列を挿入した。
E IRES GFPのBamHI/EcoRI部位に挿入して、TRIP m
el IRES GFPとも称するTRIP ΔE mel IRES GFP
を作製した。
グメントをHR GFPのものと交換して作製した。NdeI部位はCMVプロ
モータの末端に位置している。
.PNAS 1996 及びscience 1996)、リン酸−カルシウム
法を用いて、293T細胞を3種のプラスミドによって一過性にトランスフェク
トすることによって作製した。簡単に説明すると、293T細胞にVSVエンベ
ローププラスミド(pMDG)20μg及び様々なパッケージング(8.2又は
8.91)プラスミド及びレンチウイルスベクタープラスミド40μgをトラン
スフェクトした。トランスフェクトして60h後及び84h後に、調整培地を収
集した。次いで、ウイルスを濃縮して、dNTPを既に記載されたように処理し
た(Naldini science 1996)。HeLa P4.2細胞及
びMT3細胞に対するウイルス力価は、系列希釈及びp24 ELISAアッセ
イによって測定した(Naldini Science 1996)。
4細胞に等量の粒子(ウェル当たりp24ウイルス抗原1ng)を感染させるこ
とによって、ウイルスの1サイクル力価測定を実施した。実験全体を通して、プ
ロテアーゼ阻害剤サキナビル(Roche)を1μMで添加して、感染1回に限
定した分析を行った。細胞の有糸分裂は、感染前日にアフィコリン(aphic
olin)(8μM)処理して阻害した。β−ガラクトシダーゼ活性は、化学ル
ミネセンスβ−Galリポーター遺伝子アッセイ(Boehringer)を使
用して、感染48時間後に測定した。
染させた。形質導入後48時間して、培地をTNB(Tris 50mM、pH
7.5、NaCl 50mM)200μlに置換して、生細胞の蛍光をマイクロ
プレート蛍光計(Victor2、Wallac)及びEGFP対応フィルター
(励起:485nm、発光:520nm)を使用して定量した。
このマウスは、ヒトb2mのC末端がペプチドのアーム(GGGGS)x3によ
ってキメラ重鎖(HLA−A2.1、a1−a2、H−2Db a3−膜間ドメ
イン、及び細胞質内ドメイン)のN末端に共有結合したトランスジェニック1本
鎖組織適合クラスI分子を発現する。これらのマウスのH−2Db及びマウスb
2m遺伝子はさらに相同的組換えによって分断され、マウス組織適合クラス1分
子の細胞表面での発現が完全に欠如しており、血清学的に検出されなくなってい
る。
シス生成物(IDM、パリ、フランス)から得られた。CD3、CD14、CD
80、CD83、HLA−ABC、及びHLA−DRに対するmAbを使用した
これらのDCのFACS分析によって、未熟DC表現型が示された。レンチウイ
ルスベクターを1.106細胞当たり600ng、300ng、150ng、及
び150ng/p24の濃度で含むAMV−5培地中で、このhDCを10日間
形質導入した。2種のレンチウイルスベクターで形質導入したhDCにおけるG
FP発現のパーセント及び平均蛍光強度をFACSによって測定した(Bect
on Dickinson、BD、USA)。
に対して4MNCの比でインビトロ誘発した。このMNCを同一の低温保存した
形質導入hDCを使用して2回再誘発して、次いで関連ペプチド又は陰性対照(
lnf.m.58)ペプチドを付加したT2細胞を標的として使用した4h51 Cr−放出アッセイで細胞溶解活性を試験した(10μg/ml、5.106細
胞/ml、FCSを含まないRPMI培地、室温で2時間)。
核細胞を10%FCS、Lグルタミン 2mM、ペニシリン 50U/ml、ス
トレプトマイシン 50μg/ml、メルカプトエタノール 5.105Mを補
足したRPMI(完全RPMI培地)に、さらに組換えマウスGM−CSF 2
0ng/ml及び組換えマウスIL4 100ng/ml(いずれもGENZY
ME(ケンブリッジ、MA)製)を補足して培養した。2日目及び6日目に、付
着しなかった細胞を注意深く除去して、マウスGN−CSF 10ng/ml及
びマウスIL4 50ngを補足した新鮮な完全RPMI培地を添加した。7日
目に、培養培地を1.106細胞当たり600ng、300ng、150ng、
及び150ng/p24の濃度のレンチウイルスベクターを補足したRPMI完
全培地1mlで置換した。9日目に集めた樹状細胞を適切なmAbで評価したと
ころ、純度は95%を上回っていた(IAb+、HHD+、CD−3、33D1 + 、NDL145+、及びCD11c+)。次いで、マウスDCにおけるGFP
発現のパーセント及び平均蛍光強度をFACSで9日目及び12日目に測定した
。
注射した。次いで感作されたマウスの脾細胞を各エピトープペプチドで独立して
RPMI完全培地中で7日間再誘導した。最後の2日間に、培養細胞を10%T
CGFによって再誘導した。7日目に、培養した細胞の細胞溶解活性は、既に記
載されたように(Pascolo、1997)、関連ペプチド又は陰性対照ペプ
チド(lnf.m.58)を付加したHHDトランスフェクトTAP−RMA−
S細胞を標的として使用して、4h 51Cr−放出アッセイで試験した(FC
Sを含まないRPMI培地中10μg/ml、5.106細胞/ml、室温で2
時間)。TRIP−mel−ITES−GFPで形質導入した、又は形質導入し
ていないHHDトランスフェクトHeLa細胞を並行して標的細胞として使用し
た。特異的溶解のパーセントを以下の通りに算出した:(実験上の放出−自発放
出)(総放出−自発放出)x100。
S遺伝子をコードするTRIP−des−IRES−GFPベクターで免疫した
HHDマウスのCTL応答の評価 DES遺伝子についてはWO98/04711で開示している。
La−HDD細胞を形質導入した。これらの細胞を形質導入して、限界希釈によ
ってクローニングした。GFPを高濃度で発現しているクローンを選択して、古
典的な51CrCTL試験の標的細胞として使用した。
粒子をマウス当たり1.2micg/p24で腹腔内注射した。注射後12日目
に、これらのマウスの脾細胞を、ベクター粒子0.2micg、又は1micg
/p24/ml(ml当たり2106細胞)、あるいはTRIP−des−IR
ES−GFPで形質導入し、LPSで誘導した同系繊維芽細胞1micg/p2
4/ml/2106細胞/mlで誘発した。インビトロ誘発後6日目に、細胞の
細胞溶解活性をdes形質導入HeLa−HDD標的細胞を使用した51Cr試
験で試験した。対照の標的細胞はメラノーマポリエピトープによって形質導入し
た(TRIP−mel−IRES−GFP)HeLa−HDD細胞とした。
胞を形質導入したり、同遺伝子を発現する標的細胞に対して特異的なCTL応答
を誘導したりできるかどうかを調べるために実施した。図9に例示したように、
特異的な細胞溶解が全ての条件で認められる。形質導入したLPS−繊維芽細胞
では弱いCTL応答が誘導された。ベクター粒子1micg/p24/mlを使
用すると最も良い結果が得られた。これらの結果によって、完全な遺伝子が宿主
のゲノムに導入され、その産物が処理されて、提示されて著しいCTL応答が誘
導され得ることが示される。これらの結果によってまた、des遺伝子は少なく
とも1個又は複数のHLA−A2.1に限定されたCTLエピトープペプチドを
含んでいることが示唆される。
換えベクター。
CTL応答。
ヒト細胞でのGFP発現。
月20日に1−2185号としてCNCMに寄託されたCMVプロモータの一部
、ポリペプチドMEL及びIRES−GFPを含むTRIP.MEL−IRES
−GFPのNdeI/XhoIフラグメントをCMVプロモータの一部及びGF
Pを含むHR GFPのNdeI/XhoIフラグメントと置き換えた。
ILKE);(RT476−484) TRIP.ILKE−IRES−GFP(1999年10月6日、_号としてC
NCM(フランス、パリ)に寄託)の構築 TRIP.ILKE−IRES−GFPは、TRIPΔE IRES−GFP
のCMVプロモータとIRESの間にILKEのPCR産物を挿入することによ
って構築した。ILKEによって始まるCTLエピトープの周りの領域は、プラ
イマ 5 ILKE:5′TCAGATCTGCCACCATGGCACTAACAG
AAGTAATACCAC 3′ 3 RIILKE:5′CGGAATTCTTATTGGCCTTGCCCCT
GCTTC 3′ を用いてマトリックスpLAI上にPCRによって増幅した。 Kozak配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入
した。 BglII/EcoRIで消化した後、PCR産物をTRIPΔE IRES
−GFPのBamHI/EcoRI部位に挿入した。 このベクターは、GFP及びエピトープのクラスタに対応し、特にHLA.A
2.1に限定されたI9Vエピトープ(RT476〜484)を含むVIHのR
T遺伝子の領域をコードするバイシストロン性情報を発現する(Walker
B.D.、1989 PNAS 86 p.9514〜9518)。
物をTRIPΔE IRES−GFPのCMVプロモータとIRESの間に挿入
することによって構築した。TELとAMLとの間の転座周囲の領域は、プライ
マ 5 BgI TA: 5′GAAGATCTGCCACCATGAAGCCCA
TCAACCTCTCTCAT 3′ 3 RITA: 5′CGGAATTCTTACCCAGCGCAACGCCT
C 3′ を用いてPCRによって増幅した。 Kozak配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入
した。 BglII/EcoRIで消化した後、PCR産物をTRIPΔE IRES
−GFPのBamHI/EcoRI部位に挿入した。
スジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のGFPをコ
ードするHIV由来DNA3重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内GFP発現のFACS分析によって実証されたように、マウス樹状細胞
の約80%がHIV由来3重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
スジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のGFPをコ
ードするHIV由来DNA3重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内GFP発現のFACS分析によって実証されたように、マウス樹状細胞
の約80%がHIV由来3重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
ードするTRIP−des−IRES−GFPベクターで免疫したHHDマウス
のCTL応答の評価。
S−GFPの制限地図。
Claims (35)
- 【請求項1】 組換えベクターを含む免疫原組成物であって、 前記ベクターがシス作用性中心開始領域(cPPT)とシス作用性終止領域(
CTS)とを備えたポリヌクレオチドを含み、該領域はレトロウイルス又はレト
ロウイルス様の起源であり、前記ベクターはさらに所定のヌクレオチド配列(目
的の導入遺伝子又は配列)とレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写
、発現及びウイルス粒子形成の制御シグナルとを含み、前記組成物は細胞性応答
、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた1
又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)応答又はCD4
応答を誘導又は刺激することができることを特徴とする免疫原組成物。 - 【請求項2】 発生したCTL応答が記憶CTL応答である請求項1に記載
の免疫原組成物。 - 【請求項3】 レトロウイルス起源の前記配列がレンチウイルスのゲノムか
ら得られたことを特徴とする請求項1に記載の免疫原組成物。 - 【請求項4】 前記目的の導入遺伝子又は配列が転写及び発現の調節シグナ
ルを含む発現カセットに含有されることを特徴とする請求項1から3の何れか1
項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項5】 1)転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイル
ス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列(導入遺
伝子)を含有する組換えヌクレオチド配列と、2)シス作用性中心開始領域(c
PPT)及びシス作用性終止領域(CTS)を含むポリヌクレオチドであって、
これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、トランス
ポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグ
ナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入さ
れているポリヌクレオチドとを備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組
成物であって、 前記免疫原組成物が細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺
伝子配列によってコードされた1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障
害性Tリンパ球)応答又はCD4応答を誘導又は刺激することができる免疫組成
物。 - 【請求項6】 a)レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポ
リペプチドに対応するgagポリペプチド(GAGポリペプチド)と、 b)レンチウイルスのRT、PRO、INタンパク質又は機能的に得られたポ
リペプチドによって構成されたpolポリペプチド(POLポリペプチド)と、 c)エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド(ENVポ
リペプチド)と、 d)1又は数個のエピトープをコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御
下におかれた所定のヌクレオチド配列(目的の導入遺伝子又は配列)と、レトロ
ウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節
シグナルを含有する配列と、シス作用性中心開始領域(cPPT)及びシス作用
性終止領域(CTS)とを備えたポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配
列であって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり
、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の上記調節シグナルとともに、機能
的な方向及び位置に挿入された組換えヌクレオチド配列と を備えた組換えレトロウイルスベクター粒子を含む免疫原組成物であって、 前記組成物が、前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードさ
れた1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球)応答を誘
導又は促進することができる免疫原組成物。 - 【請求項7】 前記組換えレトロウイルス様粒子が、 a)シス作用性中心開始領域(cPPT)及びシス作用性終止領域(CTS)
を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で
あり、レトロトランスポゾン調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されてい
るポリヌクレオチドと、 b)レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチド
に対応するポリペプチド(GAGポリヌクレオチド)と、 c)レトロトランスポゾンのRT、PRO、INタンパク質に対応するpol
ポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド(POLポリペプチド)と、 d)ウイルスエンベロープポリペプチドと、 e)転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレト
ロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列(目
的の導入遺伝子又は配列)を備えた組換えヌクレオチド配列と を含む免疫原組成物であって、 前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列
によってコードされた1又は数個のエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリ
ンパ球)応答又はCD4応答を誘導又は促進することができ、前記組成物は前記
導入遺伝子配列によってコードされた1又は数個のエピトープに対して細胞性応
答CTL(細胞障害性Tリンパ球)応答又はCD4応答を誘導又は促進すること
ができる免疫原組成物。 - 【請求項8】 発生したCTL応答が記憶CTL応答又はCD4応答である
請求項5〜7の何れか1項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項9】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの起
源がレンチウイルスであり、cPPT及びCTSを含む前記ポリヌクレオチドの
起源がレンチウイルスであることを特徴とする請求項1〜8の何れか1項に記載
の免疫原組成物。 - 【請求項10】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及
び前記ベクター内のcPPT及びCTSを含む前記ポリヌクレオチドがHIV型
レトロウイルス、特にHIV−1又はHIV−2由来であることを特徴とする請
求項1〜9の何れか1項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項11】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及
び前記ベクター内のcPPT及びCTSを含む前記ポリヌクレオチドが、レンチ
ウイルスCAEV、EIAV、VISNA、HIV、SIV又はFIVから選択
されたウイルス由来であることを特徴とする請求項10に記載の免疫原組成物。 - 【請求項12】 前記ベクターの前記ポリヌクレオチドがHIV−1レトロ
ウイルスゲノムのシス作用性中心開始領域(cPPT)及び終止領域(CTS)
を含むDNA配列であることを特徴とする請求項1〜11の何れか1項に記載の
免疫原組成物。 - 【請求項13】 前記ベクター粒子のgag、pol及びenv配列がHI
Vレトロウイルス、特にHIV−1又はHIV−2の配列由来であることを特徴
とする請求項5〜12の何れか1項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項14】 gag及びpol配列がHIVレトロウイルスの配列由来
であり、env配列が異なるHIVレトロウイルス又はウイルス由来であること
を特徴とする請求項5〜12の何れか1項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項15】 前記env配列がアンフォトロピックENVポリペプチド
をコードすることを特徴とする請求項14に記載の免疫原組成物。 - 【請求項16】 前記env配列がエコトロピックENVポリペプチドをコ
ードすることを特徴とする請求項14に記載の免疫原組成物。 - 【請求項17】 前記env配列が水疱性口内炎ウイルス(VSV)から得
られたことを特徴とする請求項14に記載の免疫原組成物。 - 【請求項18】 CNCMに1999年10月11日、I−2326号とし
て寄託されたプラスミドpTRIP.TEL/AML−IRES−EGFP、又
はCNCMに1999年10月11日、I−2331号として寄託されたPtr
ip.DES−IRES−GFPであることを特徴とするベクター。 - 【請求項19】 CNCMに1999年10月11日、I−2337号とし
て寄託されたプラスミドpTRIP.ILKE−IRES−GFPであることを
特徴とするベクター。 - 【請求項20】 請求項1〜17の何れか1項に記載の免疫原組成物と接触
した組換え細胞。 - 【請求項21】 抗原提示細胞又は肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、
マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、
神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択され
た細胞である請求項20に記載の組換え細胞。 - 【請求項22】 腫瘍又は感染性疾患を治療的に処置するための請求項1〜
17の何れか1項に記載の免疫原組成物又は組換え細胞。 - 【請求項23】 前記ベクターに含まれた導入遺伝子が腫瘍細胞又は感染性
病原体から得られたエピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド、タンパク
質である請求項1から17のいずれかに記載の免疫原組成物。 - 【請求項24】 前記エピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド又は
前記タンパク質がメラノーマ細胞由来である請求項23に記載の免疫原組成物。 - 【請求項25】 前記cPPT及びCTS領域が前記ベクターの前記配列内
の中心に位置する請求項1〜17の組成物、又は請求項1〜17のいずれかに定
義されたベクター又はベクター粒子。 - 【請求項26】 前記導入遺伝子が逆転写の調節シグナルのU3領域に挿入
された請求項1〜17の何れか1項に記載された組成物又は請求項1〜17の何
れか1項に記載されたベクター又はベクター粒子。 - 【請求項27】 シス作用性中心開始領域(cPPT)及びシス作用性末端
領域(CTS)を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、これら
の領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、前記ベクターがさ
らに定義されたヌクレオチド配列(目的の導入遺伝子又は配列)を含み、前記ヌ
クレオチド配列が病原体の遺伝子配列、及びレトロウイルス又はレトロウイルス
様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルであり、前記組成物
が細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコー
ドされた1個又はいくつかのエピトープに対するCTL(細胞障害性Tリンパ球
)応答又はCD4応答を誘導又は促進することが可能であることを特徴とする組
換えベクター。 - 【請求項28】 前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子が細菌、例え
ばミコバクテリア、特にMycobacterium tuberculosi
sの抗原をコードする遺伝子である請求項27に記載の組換えベクター。 - 【請求項29】 前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子がウイルス又
はレトロウイルスの抗原をコードする遺伝子である請求項27に記載の組換えベ
クター。 - 【請求項30】 前記TEL/AML又は前記ILKEエピトープが病原体
の遺伝子、例えばM tuberculosisのDES遺伝子の一部と置換さ
れた請求項18又は19に記載のベクター。 - 【請求項31】 前記ベクターのゲノムの標的細胞核への移入を誘導又は促
進することが可能な請求項1〜17の何れか1項に記載の免疫原組成物。 - 【請求項32】 請求項1〜17の何れか1項に記載の免疫原組成物におけ
る請求項18又は19又は27又は31の何れかに記載のベクターの使用。 - 【請求項33】 レンチウイルス又はレトロトランスポゾンベクター中で逆
転写後に3本鎖DNA構造(DNA3重鎖)をとるcPPT及びCTS領域を含
み、前記ベクターDNAの形質導入細胞核への侵入速度を促進するヌクレオチド
配列の使用。 - 【請求項34】 細胞又は患者の細胞性応答を誘導するための請求項33に
記載のヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項35】 前記ベクターDNAの速い侵入速度を誘導するか、又は前
記ベクターDNAの核移入速度を増加させることが可能なcPPT及びCTS領
域によって誘導された3本鎖DNA配列。
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