JP2003511080A - 免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクター - Google Patents

免疫治療組成物調製用のレンチウイルスベクター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 本発明は、シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を備えたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えベクターを含む免疫原組成物であって、これらの領域の起源はレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、前記ベクターは所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）及びレトロウイルス又はレトロウイルス様の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節遺伝子を含み、前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性リンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能である免疫原組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロで、及び好ましい実施態様ではインビボで、ベクター中
に存在するヌクレオチド配列によってコードされたエピトープに対する免疫反応
の発生若しくは増強を誘導し、又はこれらに寄与することが可能な組成物を調製
するためのレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの使用に関す
る。
【０００２】
【発明の実施の形態】
本発明者等は、本発明に従って調製したベクターによって、細胞性免疫応答、
特にエピトープに対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を得ることが可能
であることを示した。
【０００３】 さらに、この細胞性免疫応答がベクターに含まれるヌクレオチド配列によって
コードされた１又は数個のエピトープに対して得られた特異的応答であり得るこ
とを示すデータが得られた。
【０００４】 従って、本発明は腫瘍及び癌に対する治療プロトコールに使用でき、特に腫瘍
に対する免疫療法又は予防接種療法のプロトコールに使用できる手段を提供する
。
【０００５】 本発明は、感染症、特にウイルス感染、例えばレトロウイルス感染に関連した
疾患の治療また予防に使用できる手段も開示する。
【０００６】 本発明者らは、さらに、本発明の組成物による治療に関連した細胞性免疫応答
、特にＣＴＬ応答は腫瘍若しくはウイルスの抗原、又はウイルス感染細胞の抗原
に特異的であることが可能で、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の特定の分子に限
定され得ることを示す結果を得た。
【０００７】 特に本発明は、ＭＨＣ複合体のクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２又はＢ７分
子に限定した細胞性免疫応答を得るために、免疫原組成物に前記ベクターを使用
することに関する。
【０００８】 従って、本発明はシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領
域（ＣＴＳ）を包含するポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む免疫原組
成物に関する。ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列は、逆転写中に３本鎖ＤＮＡ構造（本明
細書ではＤＮＡ３重鎖と称する）の形成を誘導する。このＤＮＡ３重鎖は、ベク
ターＤＮＡゲノムの核移入を刺激し、これらの領域の起源はレトロウイルス又は
レトロウイルス様で、前記ベクターは所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝
子又は配列）に加えて、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写（ｒ
ｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、発現、及びウイルス粒子形成の調節シ
グナルを含み、この組成物はベクター内に存在する導入遺伝子配列によってコー
ドされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）又は
ＣＤ４の応答を誘導又は刺激することが可能である。
【０００９】 本発明の好ましい実施態様では、細胞性免疫応答、特に１又は数個のエピトー
プに対するＣＴＬ応答又はＣＤ４応答は記憶ＣＴＬ又はＣＤ４応答である。
【００１０】 ベクター内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在すると、３重鎖ＤＮＡ構造が形成
されることが可能で、それによって前記ベクターで組換えられた細胞でのベクタ
ーゲノムの核移入が影響を受け、特に増強され得ることが強調される。
【００１１】 本発明による免疫原組成物は記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導、改良し、又は一般
にその発生に関与することができるので、（前記免疫原組成物の投与後、前記免
疫応答が長期間にわたって誘導されなければならない場合、又は少なくとも応答
が必要とされる期間に（前記応答の長期誘導であってもよい）誘導可能でなけれ
ばならない場合を含む）抗腫瘍治療又は抗ウイルス治療又は抗病原性治療のプロ
トコールにおいて前記免疫原組成物の使用を企図することが可能である。言い換
えると、前記免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ応答又は記憶応答の
発生を誘導又は刺激し、又はそれに寄与することによって、腫瘍疾患又は感染性
疾患（例えば細菌又はウイルスによる）を治療するための治療用組成物の調製に
使用することができる。
【００１２】 本発明の免疫原組成物は、ベクターの配列中に３重鎖構造が存在する結果、ベ
クター及びベクター粒子内にｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が存在するため、標的細胞
においてベクターゲノムの核移入を刺激させ得ることが注目される。ベクター内
で誘導されるエピトープは細胞自身のものであってもよいし、細胞以外のもので
あってもよい。
【００１３】 本発明は、標的細胞又は受容細胞の核への核酸配列又はペプチド配列の移入を
増加させるために、レトロウイルス由来又は合成によるｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列
を含むヌクレオチド配列の使用も含む。
【００１４】 例えば、前記３重鎖配列には受容細胞の外来配列又は自己配列が含まれること
が理解されよう。
【００１５】 従って、本発明は、腫瘍治療、特に抗癌治療又は抗感染性疾患治療のための予
防接種プロトコールと類似した治療プロトコールにおいて使用可能な組成物を開
示する。
【００１６】 本発明では、目的の該導入遺伝子又は配列が、１又は数個の腫瘍細胞の１又は
数個のエピトープ、例えば腫瘍に対する細胞性免疫を誘導することが可能な標的
抗原に同定されたエピトープをコードする配列である得ることに注目すると興味
深い。
【００１７】 ポリペプチドを形成する数個のエピトープは、本発明の導入遺伝子によってコ
ードすることができる。特定の実施態様では、それらは腫瘍で確認された標的抗
原から得ることができ、コーディング配列が一緒になって導入遺伝子を形成する
とき、細胞性免疫応答がエピトープ全て又はエピトープのほとんどに対して得ら
れるような方法で選択され得る。細胞性免疫応答はインビトロ、又は好ましい実
施態様ではインビボでアッセイすることができる。このようなアッセイの実施を
可能にするプロトコールは実施例で説明する。
【００１８】 標的抗原はいくつかの種類の腫瘍、特にメラノーマ又は腎癌、膀胱癌、大腸癌
、肺癌、乳癌、白血病及びリンパ腫などを含む癌腫で同定されている。
【００１９】 本発明の他の態様では、前記免疫原組成物はウイルス関連感染症、又はミコバ
クテリア、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む任意の種類の病原体に関
連する感染症を含めた感染性疾患において、細胞性免疫応答を得るために使用す
ることができる。
【００２０】 この場合、細胞性免疫応答を引き起こすことが可能な特定の抗原を同定して、
そのコーディング配列をベクターに挿入して前記免疫原組成物で使用することが
できる。例えば、Ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｄｅｓ遺伝子が使用できる。
【００２１】 本発明では、前記免疫原組成物で使用されるベクターは、エピトープを発現す
るか、又は腫瘍細胞若しくはウイルス感染細胞上の標的抗原として同定された（
糖タンパク質又はその他のタンパク質由来化合物を含む）タンパク質上に提示す
ることが可能であることも付け加えなければならない。
【００２２】 さらに、エピトープ、エピトープを提供するために使用されたポリペプチド又
はタンパク質は、例えば変異、欠失又は挿入によって変更することが可能で、例
えば安定性を高めるために変更することが可能であることにも留意すべきである
。
【００２３】 本発明は、 １）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節
シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含有する
組換えヌクレオチド配列と、 ２）シス作用性中心開始領域（ＣＴＳ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を
包含するポリヌクレオチドであって、これらの領域の起源がレトロウイルス又は
レトロウイルス様であるか、又はトランスポゾン由来であり、レトロウイルス又
はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグナル又はトランスポゾン調節シグナル
とともに、機能的な方向及び位置に挿入されたポリヌクレオチドと を備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組成物であって、 ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエ
ピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は刺激すること
ができる免疫原組成物に関する。
【００２４】 ｃＰＰＴ及びＣＴＳシス作用性配列を包含するＤＮＡ配列は、逆転写後に３本
鎖ＤＮＡ構造「ＤＮＡ３重鎖」を採り、ベクターＤＮＡの核移入を刺激すること
ができる。
【００２５】 特定の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子配列によってコードされ
た１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導
又は刺激することが可能な前記免疫原組成物は、 ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチドに対応
するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、 ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポ
リペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、 ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポ
リペプチド）と、 ｄ）転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれ、１又は数個のエピトープ
をコードする所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロ
ウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節
シグナルを含有する配列と、並びにシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシ
ス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含有するポリヌクレオチドであって、これらの領
域がレトロウイルス又はレトロウイルス様の起源であり、上記レトロウイルス又
はレトロウイルス様起源の調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されている
ポリヌクレオチドとを備えた組換えヌクレオチド配列と を具備する組換えレトロウイルスベクター粒子を含む。
【００２６】 他の実施態様では、ベクターに存在する導入遺伝子によってコードされた１又
は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導又は促
進することが可能な免疫原組成物は、 ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）
を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で
、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向挿入されたポリヌクレ
オチドと、 ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は又は機能的に得られたポリペプ
チドに対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、 ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌポ
リペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、 ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、 ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレトロ
トランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目的
の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列を具備する組換えレト
ロウイルス様粒子と を含む。
【００２７】 好ましい実施態様では、前記の定義の何れか１つに応じた免疫原組成物に存在
する組換えレトロウイルスベクター粒子は、記憶細胞性免疫応答、特に記憶ＣＴ
Ｌ応答の発生を誘導、増強するか、又は関連することが可能である。
【００２８】 前記で開示した定義に従って、ベクター又はベクター粒子を含む免疫組成物は
、いくつか可能な実施態様によって調製することができる。
【００２９】 本発明の好ましい実施態様では、レトロウイルス起源の配列をレンチウイルス
ゲノムから得る方法で免疫原組成物は調製される。
【００３０】 他の実施態様では、これらの配列の起源はレトロウイルス様であり、レトロト
ランスポゾンからも得られる。
【００３１】 本発明の他の実施態様では、又は前記で定義した特徴に加えて、組換えベクタ
ーに含有される目的の導入遺伝子又は配列は、転写及び発現の調節シグナルを含
有する発現カセットに含まれる。
【００３２】 あるいは、ベクターの逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルはレ
ンチウイルス起源であり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を備えたポリヌクレオチドも
レンチウイルス起源である。
【００３３】 他の実施態様では、ベクター内の逆転写、発現、及びウイルス粒子形成の調節
シグナル並びにｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドは、ＨＩＶ型、
特にＨＩＶ−２又はＨＩＶ−２のレトロウイルスから得られる。
【００３４】 他のウイルス、特にレンチウイルスは、逆転写発現及びウイルス粒子形成の調
節シグナルを設計するために、さらにはｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌク
レオチドを得るために使用することができる。従って、特にレンチウイルスＣＡ
ＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶを使用することができ
る。
【００３５】 本発明の免疫原組成物の組換えレトロウイルス粒子を獲得するため、ベクター
のトランス相補性に必要なポリペプチド又はタンパク質をコードする配列は、例
えばレンチウイルス、特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２レトロウイルスを含むＨＩ
Ｖ由来のＧＡＧ、ＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質である。
【００３６】 あるいは、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列は、ＥＮＶ配列とは異なるウイルスに由来し
てもよい。例えば、ＧＡＧ及びＰＯＬ配列はＨＩＶレトロウイルス由来であり、
ＥＮＶ配列は他のウイルス又はレトロウイルス由来し、且つアンフォトロピック
又はエコトロピックＥＮＶ配列の何れであってもよい。
【００３７】 他の実施態様では、ＥＮＶ配列は水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）から得られる
。
【００３８】 本発明の特定の実施態様では、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によって
コードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）
応答を誘導又は促進することが可能な免疫原組成物は、 ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）
を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾンから得
られ、レトロトランスポゾン調節シグナルと共に機能的な方向に挿入されたポリ
ヌクレオチドと、 ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチド
に対応するポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、 ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌ
ポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、 ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、 ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレト
ロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目
的の導入遺伝子又は配列）を含む組換えヌクレオチド配列と を備えた組換えレトロウイルス様粒子を含む。
【００３９】 好ましい実施態様では、組換えレトロウイルス様粒子を含む本発明の免疫原組
成物は、前記で開示した特徴によって、記憶細胞性応答、特に記憶ＣＴＬ応答を
引き起こすことが可能である。
【００４０】 本発明は、１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｓ ａｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃ
ｅ）に寄託されたベクター構築物にも関する。
【００４１】 第１のベクターは、１９９９年１０月１１日にｌ−２３２６号として寄託され
たｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであり、第２のベクターはｐ
ＴＲＩＰ−ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと称し、１９９９年１０月１１日にｌ−
２３２７号として寄託された。
【００４２】 第３のベクター、ｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、１９９９年１０
月１１日にｌ−２３３１号としてＣＮＣＭに寄託された。
【００４３】 前記構築物に存在する抗原をコードする配列は、前記で引用したＭ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓの完全なＤＥＳ遺伝子を含む、他の任意の目的の抗原又はエピ
トープによって置き換えることができる。
【００４４】 本発明の他の態様では、ベクター、ベクター粒子及び同物を含む免疫原組成物
は、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心に位置するように設計される
。
【００４５】 「中心に位置する」とは、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域がベクター配列の中心、又
はこの配列のほぼ中心にあることを意味する。特に、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域は
逆転写された直鎖状ベクターＤＮＡの中央の３分の１以内にあることが可能であ
る。
【００４６】 ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列が存在する結果としてウイルス逆転写中に形成された
３重鎖配列が中央に位置することによって、そのベクター又はベクター粒子と接
触する細胞の形質導入量を増大させることが可能である。
【００４７】 あるいは、前記ベクターの変種によっては、導入遺伝子を含むベクターの転写
単位はＬＴＲ領域のＵ３領域内に挿入することができる。従って、逆転写の後、
導入遺伝子は複製され、従って３重鎖配列のそれぞれの鎖に現れ、従って導入遺
伝子の大きさにかかわらず、３重鎖配列がベクターの中心部分に位置することが
可能となる。
【００４８】 本発明は、本発明による免疫原組成物と接触するように置かれた細胞に関し、
特に免疫原組成物のベクター又はベクター粒子によって形質導入された組換え細
胞にも関する。
【００４９】 これらの細胞は、有利には、抗原提示細胞である。例えば、これらの細胞は、
肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニ
ューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファー
ジ、繊維芽細胞、造血細胞から選択することができる。
【００５０】 従って、本発明の免疫原組成物は、一次細胞性免疫応答、特に、有利には記憶
ＣＴＬ応答であるＣＴＬ応答を発生させ、腫瘍、特に癌の治療方法又は治療処置
のための治療組成物の調製に使用することができる。あるいは、その他公知の抗
癌治療の補助処置として使用することができる。
【００５１】 例えば、本発明の免疫原組成物は、化学療法又は免疫化学療法又は抗癌治療の
その他のアプローチと関連させて使用することができる。
【００５２】 「抗癌治療」という表現は、本発明では、腫瘍の増殖又は腫瘍が増殖する可能
性を阻害すること、若しくは転移巣形成の制御を含めた悪性細胞の拡散を阻害す
ることを意味するか、又はその両者を意味するものである。
【００５３】 従って、本発明では、「抗癌治療」という表現は、特にこの免疫原組成物が記
憶細胞性応答を誘導又は増強し、一般的には関与することが可能であるという事
実を考慮すると、疾患の治癒を期待して、悪性細胞の増殖及び腫瘍の拡散を制御
するために使用する方法に関している。
【００５４】 本発明の組成物で治療し得る腫瘍は、例えば、メラノーマ又は（肺、膀胱、腎
臓、大腸）含めた癌腫及びリンパ滲出である。
【００５５】 治療可能な腫瘍も、変異した自己タンパク質及び／又は過剰発現した自己タン
パク質を含む腫瘍特異的抗原を発現している全ての腫瘍である。
【００５６】 エキソビボ段階を含む投与方法、例えば、標的細胞にエキソビボ導入した後、
標的細胞を治療する患者に投与することを含めて、受容可能な本発明の免疫原組
成物の投与方法はいずれも興味深い。
【００５７】 あるいは、本発明の免疫原組成物は、全身（ＩＶ）、局所、又は皮膚、皮下、
例えば筋肉内投与経路を含めた通常の投与経路によって患者に直接投与し得る。
【００５８】 特定の実施態様では、本発明の免疫原組成物は、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ
性免疫応答の発生をインビボで誘導、増強、又は関与する方法で患者に直接投与
し得る。
【００５９】 他の実施態様では、前記免疫原組成物は、長期間記憶細胞性応答を発生させる
ために使用される。
【００６０】 本発明の前記免疫原組成物は、ベクター又はベクター粒子に存在するｃＰＰＴ
及びＣＴＳ配列の特性によって、標的細胞内でベクターゲノムの核移入を誘導又
は促進するので特に興味深いことが強調される。
【００６１】 本発明の免疫原組成物が特に優位なのは、これらがベクター又はベクター粒子
に存在する関心のあるヌクレオチド配列又は導入遺伝子によってコードされた複
数のエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するために使用できるこ
と、及び完全な遺伝子配列、例えば病原性物質の遺伝子の産物又は少なくとも８
から１５アミノ酸、好ましくは９から１２アミノ酸をコードし得る前記遺伝子の
断片の産物に対する細胞性免疫応答を惹起又は促進するためにも使用できること
である。本発明はまた、細胞性応答を誘導する前記アミノ酸配列の複数反復（少
なくとも２回の同一配列）及び／又は異なる病原性抗原又は腫瘍抗原の２個のエ
ピトープに対応する少なくとも２種の異なる配列を含むアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【００６２】 本発明のその他の特性又は利点を、以下の実施例及び図面で開示する。
【００６３】 実施例 レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を含む細胞を形質導入する能力を有し
ており、遺伝子治療にとってますます重要となっている。最近、ポリプリン広域
シス作用性配列（中心ＤＮＡ３重鎖）を含むレンチウイルスベクターが中心ＤＮ
Ａ３重鎖を欠失したものよりもヒト及びマウスをより効果的に形質導入すること
が示された（Ｃｈａｒｎｅａｕ Ｐ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９
９４、２４１、６５１〜６６２）。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、又は含まず、同
様のＨＬＡ−Ａ２．１限定メラノーマＣＴＬポリエピトープをコードするレンチ
ウイルスベクターのＴＬ応答を誘導する能力を本明細書で試験した。ＨＨＤ（Ｈ
ＬＡ−Ａ２．１純系）マウスにおいて、中心ＤＮＡを含むレンチウイルスベクタ
ーを直接インビボ投与すると、ポリエピトープ配列によってコードされたエピト
ープペプチド全てに対する強いＣＴＬ応答が誘導された。レンチウイルスベクタ
ーはＤＮＡ３重鎖を含むと明らかに有利であることが示された。さらに、ＤＮＡ
３重鎖を含むレンチウイルスが３重鎖を含まないベクターよりもヒト樹状細胞を
７倍も効果的に形質導入することが示された。これらのエキソビボ導入した樹状
細胞は、メラノーマエピトープペプチドのほとんどに対して効果的かつ特異的な
１次ＣＴＬ応答を引き起こす。変更したレンチウイルスの安全性の問題がほぼ解
決されたので、このベクターをインビボにおけるヒトの遺伝子治療だけでなく、
癌患者の免疫療法にも使用することを提案する。
【００６４】 緒言 レトロウイルスの亜種レンチウイルスは、非分裂細胞を含めたほとんどの細胞
種に感染することができる。この特性があるため、レンチウイルスは遺伝子治療
にとって魅力的な存在である。いくつかの複製欠失組換えレンチウイルスベクタ
ーは、既に様々なグループによって構築されている（Ｎａｌｄｉｎｉ ＰＮＡＳ
９３、１１３８２〜８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６）。再操作し、無毒化した
これらのレンチウイルスベクターは最も効果的かつ安全な遺伝子治療用ベクター
として提案されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ、＆ Ｋｉｍ Ｖ．Ｎ．Ｊ Ｖｉ
ｒｏｌ、７２、９８７３〜８０、１９９８）。本発明者等は、水疱性口炎ウイル
スＧタンパク質（ＶＳＶＧ）偽型レンチウイルス（ＨＩＶ）をベースとしたベク
ターを開発した（Ｂｕｒｎｓ Ｊ．Ｃ．、１９９３ ＰＮＡＳ ９０、８０３３
〜７）。このベクターは非必須なウイルスタンパク質をほとんど欠失しているが
、ポリプリン領域シス作用性配列（ｃＰＰＴ、中心ＤＮＡ３重鎖）を含む。この
中心ＤＮＡ３重鎖は、逆転写されたＨＩＶ−ＤＮＡ分子の核移入をかなり促進す
る。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスは、この３重鎖を含まない
ベクターよりも効果的にマウス及びヒト細胞を形質導入させることが認められた
。
【００６５】 ＨＨＤ（ＨＬＡ−Ａ２．１純系）トランスジェニックマウス（Ｐａｓｃｏｌｏ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：２０４３〜２０５
１）を用いると、実験的に制御したエピトープペプチドの免疫原性の評価及び様
々な免疫戦略の評価が可能である。これらのＨＨＤマウスを使用して、異なる組
換えベクターによってコードされたメラノーマポリペプチドが単一の動物個体内
で同時にＣＴＬ応答を誘導する能力が報告された。中心ＤＮＡ３重鎖を含むか、
又は含まず、同様のメラノーマポリエピトープをコードするレンチウイルスベク
ターが、ＨＨＤトランスジェニックマウスにおいてインビボＣＴＬを誘導する能
力について最初に調べた。さらに同様の組換えレンチウイルスによって形質導入
されたヒト樹状細胞（ｈＤＣ）がエキソビボでメラノーマポリエピトープモチー
フに対して１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかについても調べた。本発明の結果
によって、組換えベクターを直接投与するか、又はエキソビボで形質導入した樹
状細胞を使用すると、ＤＮＡ３重鎖によってレンチウイルスベクターがインビボ
で特異的なＣＴＬ応答を誘導する能力が著しく増強されることが示された。
【００６６】 結果 実施例１：メラノーマポリエピトープの免疫 メラノーマから得られたポリエピトープモチーフをコードする組換えＤＮＡを
ＨＨＤマウスに注射することによって、いくつかのメラノーマエピトープに対し
て同時にＣＴＬ応答を惹起することができることを証明した後、同様のメラノー
マポリペプチドモチーフ（図１及び表１）をコードするレンチウイルスの免疫原
能を試験した。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（ＣＮＣＭ １−
２１８５として１９９９年４月２０日に寄託）をマウス当たり１．２５μｇ／ｐ
２４で静脈内、腹腔内、又は皮下内に投与した。１群当たり少なくとも３匹のマ
ウスを使用した。
【００６７】 １０個のメラノーマエピトープのほとんどに対して特異的な複数のＣＴＬ応答
が同時に誘導された。投与経路に関わらず、負荷したペプチド（表２）及びＴＲ
ＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで形質導入したＨＨＤトランスフェクトＨｅＬ
ａ細胞（データは示していない）の両者に対して同様のＣＴＬ応答が認められた
。しかし、腹腔内注射によって、わずかに良好なＣＴＬ応答が誘導された。強い
応答がＮＡ１７−Ａ．ｎｔ３８及びｇｐ１００．１５４エピトープペプチドに対
して引き起こされた。ｇｐ１００．４５７、ＭＡＲＴ．１．２７、Ｍａｇｅ−３
、及びチロシナーゼ３６８−Ｄに対してまた、著しい応答が認められた。ｇｐ．
１００．２０９、ｇｐ．１００．２８０、ＭＡＲＴ−１．３２、及びチロシナー
ゼ１に対するＣＴＬ応答は弱かった。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベク
ターで免疫した後に弱いＣＴＬ応答が引き起こされたエピトープは全て、その他
のレンチウイルスベクター以外を投与したときのＣＴＬ非誘導群に分類された。
【００６８】 インビボで検出可能なＣＴＬを誘導するために必要なレンチウイルスベクター
の最小用量 著しいＣＴＬ応答を引き起こすレンチウイルスベクターの最小用量は、６種の
異なる用量のＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを腹腔内投与して（
１用量あたり４匹のＨＨＤマウス）決定した。５１Ｃｒ試験の直前に２匹のマウ
スのエフェクター細胞を混合して同一のＥ／Ｔ比を得る実験を２回実施した。ほ
とんどの実験において、メラノーマエピトープペプチド全てに対するＣＴＬ応答
を試験した。結果は非常に類似しており、極めて同質であったので、「線量−効
果」関係を明確かつ簡潔に比較するためにＮＡ１７／Ａエピトープペプチドに対
するＣＴＬ応答のみを考慮した。マウス当たり５００ｎｇと２５００ｎｇ／ｐ２
４との間の用量を使用して、最良のＣＴＬ応答が得られた。いくつかのメラノー
マエピトープに対して検出可能なＣＴＬ応答が得られたが、レンチウイルスの用
量が高くても用量の低い場合よりも良好なＣＴＬ応答が誘導されるわけではなか
った。いくつかのメラノーマペプチドに対するいくつかの特異的なＣＴＬ応答が
実証されたとしても、マウス当たり５００ｎｇ／ｐ２４未満の用量では、効果的
なＣＴＬ応答を誘導するには不十分であった。マウス当たり１２５０ｎｇ／ｐ２
４の用量で、何匹かのマウスにおいてポリエピトープモチーフに含まれる１０個
のエピトープ全てに対してＣＴＬ応答が生じたことは注目に値する（図３）。
【００６９】 長期の記憶ＣＴＬ誘導 マウス８匹にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを注射した。免疫
後、このマウスを１２日目又は５ヶ月目に殺処分した。５日間はメラノーマエピ
トープペプチドで、さらに２日間は１０％ＴＣＧＦでインビトロ誘発した後、マ
ウス４匹のエフェクター細胞を混合してペプチドを負荷したＨＨＤトランスフェ
クトＲＭＡＳ細胞に対して試験した。１２日前に免疫したマウスでは、ｇｐ１０
０．２９及びＭａｒｔ１．３２以外のメラノーマエピトープペプチド全てについ
てＣＴＬ応答が証明された。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注射して５
ヶ月経つと、１次ＣＴＬ誘導エピトープ全てがまだ強いＣＴＬ応答を誘導した（
図２）。マウス免疫後、１２日目又は５ヶ月目のＣＴＬ応答のレベルは、驚くほ
ど同等であった。レンチウイルスベクターによってインビボ導入された細胞は、
免疫系によって破壊されずにコードされたメラノーマポリエピトープを産生し続
けることが示唆された。
【００７０】 インビボ免疫における中心ＤＮＡ３重鎖の役割 ＨＨＤマウスそれぞれに、同時にＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＨ
Ｒ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターをマウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ
、５０ｎｇ、１２ｎｇ、及び３ｎｇ／ｐ２４の用量で腹腔内投与して免疫した。
別個の２回の実験において、各用量について少なくとも４匹のマウスを試験した
。合成ペプチドでインビトロ誘発した後、ペプチドを加えたＲＭＡＳ−ＨＨＤ標
的細胞を使用して脾細胞の細胞溶解能を試験した。結果は極めて似通っていたの
で、明確かつ簡潔にするためにＮＡ１７／Ａ、Ｍａｒｔ−１．２７、ｇｐ１００
．１５４、及びチロシナーゼ．３６８−Ｄエピトープペプチドに対するＣＴＬ応
答のみを試験した。
【００７１】 結果を表３に示す。一般に、マウス当たり８００ｎｇ、２００ｎｇ、５０ｎｇ
／ｐ２４の用量のＴＲＩＰ−ＬＶベクターで免疫したマウスはＨＲ−ＬＶベクタ
ーで免疫したマウスよりも強いＣＴＬ応答を引き起こした。使用したベクターに
かかわらず、マウス当たりの１２ｎｇ／ｐ２４未満の用量では検出可能なＣＴＬ
応答は認められなかった（データは示さず）。これによって、中心ＤＮＡ複合体
を含むレンチウイルスベクターの形質導入能はこの複合体を欠失したものよりも
増強されていることが確認された。
【００７２】 レンチウイルスベクターによる樹状細胞の形質導入 ＭＴ４及びＨｅＬａ細胞などの腫瘍細胞が中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイ
ルスによって中心ＤＮＡ３重鎖を持たないベクターよりも３０倍まで効果的に形
質導入されることが最初に観察された。次に、様々な濃度でこれら２種のレンチ
ウイルスベクターの形質導入能を健常提供者又はＨＨＤマウスのＤＣについて試
験した。ＧＦＰを発現するＤＣのパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによっ
て測定し、２種のレンチウイルスベクターによるＤＣの形質導入濃度と見なした
。
【００７３】 ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターは、どのベクター濃度でもＨＲ−ＧＦＰよりも効果
的に細胞を形質導入した。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたマ
ウス及びヒトＤＣのＧＦＰ発現は、それぞれＨＲ−ＧＦＰベクターによって形質
導入されたＧＦＰの発現の３倍及び７倍に達した（図４）。
【００７４】 ＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによって形質導入されたヒト樹
状細胞を使用した１次ＣＴＬ誘発 健常なＨＬＡ−Ａ２．１提供者から得られた単核細胞（ＭＮＣ）を、同提供者
から得られたＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによって形質導入したＤＣを
使用して週に１回インビトロで誘発した。樹状細胞におけるＧＦＰ発現の存在を
ＦＡＣＳによって分析し、形質導入の効果を確かめた。３週間後、ＭＮＣ細胞障
害性は、ＦＣＳを含まない培養条件で標的としてペプチドを付加したＴ２細胞を
使用した５１Ｃｒアッセイによって試験した。
【００７５】 ＴＲＩＰ ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで形質導入したｈＤＣは、Ｍａ
ｒｔ１．３１以外のメラノーマエピトープペプチド全てに対して著しいＣＴＬ応
答を誘発したが、形質導入しなかったｈＤＣでは通常のバックグランドの応答し
か誘発しなかった（図５）。
【００７６】 考察 複製欠失レンチウイルス由来のベクターが様々な非分裂細胞を形質導入できる
ことは、近年報告で示されている（Ｍａｌｄｉｎｉ、１９９６、Ｋａｆｒｉ、１
９９７）。レンチウイルスは非分裂細胞の完全な核膜を通過して移入することが
できる（Ｃａｓｅ、１９９９）。本明細書では、この方法と中心ＤＮＡ３重鎖と
称したポリプリン領域シス作用性配列を組み合わせると、大いに可能性が広がる
ことを実証した。この配列をレンチウイルス由来ベクターに導入すると、ニュー
ロン、肝細胞、及び造血幹細胞／始原細胞を含めた数種の細胞の安定したインビ
ボ及びエキソビボ形質導入を３０倍高めることが可能であった。
【００７７】 最近、レンチウイルス由来のベクターの安全性及び遺伝子治療での使用に関す
る取り組みで、進歩が認められた（Ｎａｒｒｙ Ｋｉｍ Ｖ ｅｔ ａｌ １９
８８、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ、１９９９）。しかし、古典的なマウスのレトロウイル
スベクター及びレトロウイルスではないベクターの使用が成功した免疫治療で（
Ｃｏｎｄｏｎ、１９９６、Ｓｏｎｇ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、１９９７）、レ
ンチウイルスベクターを適用することについては研究されなかった。有望なワク
チン戦略を開発するために、中心ＤＮＡ３重鎖を含み、メラノーマポリエピトー
プをコードするレンチウイルスベクターの免疫原能を試験した。最初に、このベ
クターを直接注射して、メラノーマエピトープに対してインビボで特異的なＣＴ
Ｌ応答が引き起こされ得るかどうかについて調べた。今までに、ＨＨＤ ＨＬＡ
−Ａ２．１（純系）トランスジェニックマウスにおいていくつかの免疫戦略の比
較が行われた。組換えｐＣＭＶ−Ｂ１０（ＨＢｓ）ＤＮＡ又は同様のメラノーマ
ポリエピトープをコードする組換えワクチンを使用すると、１個体マウスにおい
て、メラノーマポリエピトープに含まれる４から６個の異なるペプチドに対する
ＣＴＬ応答が同時に誘導されることが可能であった。同様のメラノーマポリエピ
トープをコードするＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターでは、特異的
細胞溶解についてだけでなく、ＣＴＬ応答を誘発するポリペプチドの数について
も、同様のポリエピトープモチーフをコードするその他のベクターよりも顕著に
優れた結果が得られた。特に、ベクターを腹腔内及び皮下注射すると、ＴＲＩＰ
ｍｅｌ ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによってコードされたエピトープ全てに対
してＣＴＬ応答が誘導されるマウスがいた。
【００７８】 形質導入又はペプチド付加された樹状細胞は、様々なガン細胞に対して有望な
免疫方法として使用できることがいくつかのグループによって報告された（Ｍａ
ｙａｒｄｏｍｏ、ＪＩ、１９９５、Ｓｏｎｇ Ｗ、１９９７、Ｓｐｅｃｈｔ、Ｊ
Ｍ、１９９７）。従って、本発明の目的のために、マウス及びヒトの樹状細胞が
効果的に形質導入され、インビトロで１次ＣＴＬ応答を誘導するかどうかを調べ
た。本発明の結果によって、これらの細胞が容易に形質導入され得ることが示唆
された。さらに、これらの形質導入細胞は組換えレンチウイルスによってコード
されたエピトープ全てを提示した。興味深いことに、ヒト樹状細胞は最も容易に
形質導入された。細胞をインビトロ形質導入することによって、レンチウイルス
ベクターが様々な宿主細胞にゲノムを有害な方法で組み込むことを回避できる。
この理由によって、インビトロ形質導入された細胞は、最初の臨床応用で適切か
つ安全な送達方法となるだろう。
【００７９】 Ｗａｒｎｅｒ等は、マウスのレトロウイルスベクターによって形質導入したＨ
ＩＶ−タンパク質を発現する繊維芽細胞を使用して、レトロウイルスベクターが
いくつかの動物モデルだけでなく、ＨＩＶ患者のＣＴＬ応答を誘導する能力を初
めて示した（１９９８年にＷａｒｎｅｒによって概説されている）。マウスに直
接注射すると、プロウイルスのＤＮＡが効果的に抗原を提示する樹状細胞で検出
された（Ｓｏｎｇ、１９９７）。しかし、レンチウイルスとは対照的に、マウス
のレトロウイルスベクターはＤＣなどの非分裂細胞を形質導入することができず
、コードされた遺伝子のインビボ発現は「遮断される」ことが多い。結果的に、
これらのレトロウイルスベクターはヒトの免疫治療にとって有力な候補とはなら
ない（Ｋａｆｒｉ）。
【００８０】 我々の結果によって、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレンチウイルスベクターは、Ｈ
ＨＤマウスにおいて中心ＤＮＡ３重鎖を含まないベクターよりも強くインビボで
ＣＴＬ応答を誘導することが示唆される。さらに、中心ＤＮＡ３重鎖を含むレン
チウイルスベクターはインビトロで容易にｈＤＣを形質導入することができ、ひ
いては臨床的免疫治療に使用することができよう。
【００８１】 材料及び方法 レンチウイルスベクター構造 ベクタープラスミド：ＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺ由来のｐＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（Ｎ
ａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ ９３、１１３８２〜８、１９９６）。Ｌ
ａｃＺリポーター遺伝子は、ＥＧＦＰ遺伝子で置き換えた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
。ＴＲＩＰ−ＥＧＦＰでは、ＥＧＦＰ遺伝子をｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むＨ
ＩＶ−１ＬＡＩの中心断片のＣｌａｌ部位に挿入した。
【００８２】 ＥＧＦＰ遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドからＰｆｕポリメラーゼ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲによって増幅し、５′及び３′それぞれ
にＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を付加した。ＰＣＲプライマは以下の通りで
あった。 Ｂａｍ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＴＣ ＧＣＣ
ＡＣＣ ３′ Ｘｈｏ ＧＦＰ ５′ＣＣ ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＧＧ
ＣＣＧ ３′ ＨＲ ＧＦＰベクターは、このＰＣＲ断片をｐＨＲ′ＣＭＶＬａｃＺのＢａｍ
ＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングし直して、ＬａｃＺ ＯＲＦをＥＧＦＰに
置き換えることによって構築した。
【００８３】 ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含むｐＬＡＩ３の１７８ｂｐ断片（４７９３から４９７
１）をＰＣＲによって増幅した。この断片をＨＲ ＧＦＰの特有のＣｌａＩ部位
に挿入するために、ＮａｒＩ制限部位をプライマの５′に付加した。 Ｎａｒ ＴＲＩＰ＋： ５′ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＧＡＡＴＴＣ
ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＣ ３′ Ｎａｒ ＴＲＩＰ−： ５′ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣＧＣＣ ＣＣＡ ＡＡＧ
ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ Ｃ ３′ 正方向でこの３重鎖配列を挿入すると、ＴＲＩＰ ＧＦＰプラスミドベクター
が生じ、逆向きだとＴＲＩＰｉｎｖ ＧＦＰが生じた。あるいは、同様の３重鎖
断片をｐｃＰＰＴ−ＡＧ、ｐｃＰＰＴ−Ｄ、ｐｃＰＰＴ−２２５及びｐＣＴＳプ
ラスミドから増幅して、対応するウイルスのようにｃＰＰＴ又はＣＴＳに同様の
変異を含むベクターを作製した。
【００８４】 まず、ＴＲＩＰ ＧＦＰベクター又はＴＲＩＰ−ＥＧＦＰ（ＣＮＣＭに１９９
８年４月１５日Ｉ−２００５号として寄託）に存在するＥｃｏＲＩ部位を充填し
て、ＴＲＩＰ ＧＦＰΔＥベクターを作製した。次に、ＴＲＩＰ ＧＦＰ ΔＥ
ベクターの０．７ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＥＧＦＰの代わりに、ピコナウ
イルスの内部リボゾーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含む１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ／
ＸｈｏＩ断片をＥＧＦＰの上流にクローニングして、ＴＲＩＰ ΔＥ ＩＲＥＳ
ＧＦＰベクターを作製した。ＣＭＶプロモータとＩＲＥＳ ＧＦＰ配列の間に
存在する部位は、ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＸＩ−ＳｎａＢＩ及びＥｃｏＲＩである。
ＣＴＬポリエピトープメラノーマ（ｍｅｌ）断片をＰＣＲによってｐＢＳ ｍｅ
ｌ ｐｏｌｙ上に作製し、プライマ５ＢｇｌＭｌｕ Ｍｅｌ： ５′ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴ ３
′ ３ＲＩＭｅｌ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧＡＴ
Ｇ３′ の内部にｋｏｚａｃコンセンサス配列を挿入した。
【００８５】 ｍｅｌ ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、ＴＲＩＰ Δ
Ｅ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ＴＲＩＰ ｍ
ｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰとも称するＴＲＩＰ ΔＥ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰ
を作製した。
【００８６】 ＨＲ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰは、メラノーマポリエピトープ及びＴＲＩＰ ｍｅｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰのＩＲＥＳ ＧＦＰを含むＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラ
グメントをＨＲ ＧＦＰのものと交換して作製した。ＮｄｅＩ部位はＣＭＶプロ
モータの末端に位置している。
【００８７】 ウイルスベクターの産生 レンチウイルスベクターは、既に記載されたように（Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｉ．Ｍ
．ＰＮＡＳ １９９６ 及びｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）、リン酸−カルシウム
法を用いて、２９３Ｔ細胞を３種のプラスミドによって一過性にトランスフェク
トすることによって作製した。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞にＶＳＶエンベ
ローププラスミド（ｐＭＤＧ）２０μｇ及び様々なパッケージング（８．２又は
８．９１）プラスミド及びレンチウイルスベクタープラスミド４０μｇをトラン
スフェクトした。トランスフェクトして６０ｈ後及び８４ｈ後に、調整培地を収
集した。次いで、ウイルスを濃縮して、ｄＮＴＰを既に記載されたように処理し
た（Ｎａｌｄｉｎｉ ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。ＨｅＬａ Ｐ４．２細胞及
びＭＴ３細胞に対するウイルス力価は、系列希釈及びｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセ
イによって測定した（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６）。
【００８８】 ＤＥＡＥ−デキストラン２０μＭ存在下で、９６ウェルプレートに接種したＰ
４細胞に等量の粒子（ウェル当たりｐ２４ウイルス抗原１ｎｇ）を感染させるこ
とによって、ウイルスの１サイクル力価測定を実施した。実験全体を通して、プ
ロテアーゼ阻害剤サキナビル（Ｒｏｃｈｅ）を１μＭで添加して、感染１回に限
定した分析を行った。細胞の有糸分裂は、感染前日にアフィコリン（ａｐｈｉｃ
ｏｌｉｎ）（８μＭ）処理して阻害した。β−ガラクトシダーゼ活性は、化学ル
ミネセンスβ−Ｇａｌリポーター遺伝子アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使
用して、感染４８時間後に測定した。
【００８９】 ＨｅＬａ細胞を等量のベクター粒子（ウェル当たりｐ２４ ５ｎｇ）で３回感
染させた。形質導入後４８時間して、培地をＴＮＢ（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ｐＨ
７．５、ＮａＣｌ ５０ｍＭ）２００μｌに置換して、生細胞の蛍光をマイクロ
プレート蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ）及びＥＧＦＰ対応フィルター
（励起：４８５ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を使用して定量した。
【００９０】 マウス ＨＨＤマウスについては既に説明されている（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）。
このマウスは、ヒトｂ２ｍのＣ末端がペプチドのアーム（ＧＧＧＧＳ）ｘ３によ
ってキメラ重鎖（ＨＬＡ−Ａ２．１、ａ１−ａ２、Ｈ−２Ｄｂ ａ３−膜間ドメ
イン、及び細胞質内ドメイン）のＮ末端に共有結合したトランスジェニック１本
鎖組織適合クラスＩ分子を発現する。これらのマウスのＨ−２Ｄｂ及びマウスｂ
２ｍ遺伝子はさらに相同的組換えによって分断され、マウス組織適合クラス１分
子の細胞表面での発現が完全に欠如しており、血清学的に検出されなくなってい
る。
【００９１】 ｈＤＣ及び１次ＣＴＬ誘導の発生 ヒト樹状細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１ハプロタイプの健常提供者のサイタフェレ
シス生成物（ＩＤＭ、パリ、フランス）から得られた。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ
８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲに対するｍＡｂを使用した
これらのＤＣのＦＡＣＳ分析によって、未熟ＤＣ表現型が示された。レンチウイ
ルスベクターを１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、及
び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度で含むＡＭＶ−５培地中で、このｈＤＣを１０日間
形質導入した。２種のレンチウイルスベクターで形質導入したｈＤＣにおけるＧ
ＦＰ発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳによって測定した（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ、ＵＳＡ）。
【００９２】 同一提供者の単核細胞（ＭＮＣ）をｈＤＣ又は形質導入したｈＤＣで１ｈＤＣ
に対して４ＭＮＣの比でインビトロ誘発した。このＭＮＣを同一の低温保存した
形質導入ｈＤＣを使用して２回再誘発して、次いで関連ペプチド又は陰性対照（
ｌｎｆ．ｍ．５８）ペプチドを付加したＴ２細胞を標的として使用した４ｈ５１ Ｃｒ−放出アッセイで細胞溶解活性を試験した（１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細
胞／ｍｌ、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地、室温で２時間）。
【００９３】 マウス樹状細胞の生成 骨髄由来樹状細胞を既に記載されたように生成した［４３、５１］。骨髄の単
核細胞を１０％ＦＣＳ、Ｌグルタミン ２ｍＭ、ペニシリン ５０Ｕ／ｍｌ、ス
トレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌ、メルカプトエタノール ５．１０５Ｍを補
足したＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ培地）に、さらに組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ ２
０ｎｇ／ｍｌ及び組換えマウスＩＬ４ １００ｎｇ／ｍｌ（いずれもＧＥＮＺＹ
ＭＥ（ケンブリッジ、ＭＡ）製）を補足して培養した。２日目及び６日目に、付
着しなかった細胞を注意深く除去して、マウスＧＮ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌ及
びマウスＩＬ４ ５０ｎｇを補足した新鮮な完全ＲＰＭＩ培地を添加した。７日
目に、培養培地を１．１０６細胞当たり６００ｎｇ、３００ｎｇ、１５０ｎｇ、
及び１５０ｎｇ／ｐ２４の濃度のレンチウイルスベクターを補足したＲＰＭＩ完
全培地１ｍｌで置換した。９日目に集めた樹状細胞を適切なｍＡｂで評価したと
ころ、純度は９５％を上回っていた（ＩＡｂ＋、ＨＨＤ＋、ＣＤ−３、３３Ｄ１ ＋ 、ＮＤＬ１４５＋、及びＣＤ１１ｃ＋）。次いで、マウスＤＣにおけるＧＦＰ
発現のパーセント及び平均蛍光強度をＦＡＣＳで９日目及び１２日目に測定した
。
【００９４】 ベクターによる免疫及びインビトロ再誘導及び細胞溶解アッセイ ＨＨＤマウスにレンチウイルスベクターを１２日間腹腔内、静脈内又は皮下内
注射した。次いで感作されたマウスの脾細胞を各エピトープペプチドで独立して
ＲＰＭＩ完全培地中で７日間再誘導した。最後の２日間に、培養細胞を１０％Ｔ
ＣＧＦによって再誘導した。７日目に、培養した細胞の細胞溶解活性は、既に記
載されたように（Ｐａｓｃｏｌｏ、１９９７）、関連ペプチド又は陰性対照ペプ
チド（ｌｎｆ．ｍ．５８）を付加したＨＨＤトランスフェクトＴＡＰ−ＲＭＡ−
Ｓ細胞を標的として使用して、４ｈ ５１Ｃｒ−放出アッセイで試験した（ＦＣ
Ｓを含まないＲＰＭＩ培地中１０μｇ／ｍｌ、５．１０６細胞／ｍｌ、室温で２
時間）。ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＴＥＳ−ＧＦＰで形質導入した、又は形質導入し
ていないＨＨＤトランスフェクトＨｅＬａ細胞を並行して標的細胞として使用し
た。特異的溶解のパーセントを以下の通りに算出した：（実験上の放出−自発放
出）（総放出−自発放出）ｘ１００。
【００９５】 実施例ＩＩ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥ
Ｓ遺伝子をコードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した
ＨＨＤマウスのＣＴＬ応答の評価 ＤＥＳ遺伝子についてはＷＯ９８／０４７１１で開示している。
【００９６】 実験方法 第１段階では、ＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを使用してＨｅ
Ｌａ−ＨＤＤ細胞を形質導入した。これらの細胞を形質導入して、限界希釈によ
ってクローニングした。ＧＦＰを高濃度で発現しているクローンを選択して、古
典的な５１ＣｒＣＴＬ試験の標的細胞として使用した。
【００９７】 第２段階では、ＨＤＤマウスにＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター
粒子をマウス当たり１．２ｍｉｃｇ／ｐ２４で腹腔内注射した。注射後１２日目
に、これらのマウスの脾細胞を、ベクター粒子０．２ｍｉｃｇ、又は１ｍｉｃｇ
／ｐ２４／ｍｌ（ｍｌ当たり２１０６細胞）、あるいはＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲ
ＥＳ−ＧＦＰで形質導入し、ＬＰＳで誘導した同系繊維芽細胞１ｍｉｃｇ／ｐ２
４／ｍｌ／２１０６細胞／ｍｌで誘発した。インビトロ誘発後６日目に、細胞の
細胞溶解活性をｄｅｓ形質導入ＨｅＬａ−ＨＤＤ標的細胞を使用した５１Ｃｒ試
験で試験した。対照の標的細胞はメラノーマポリエピトープによって形質導入し
た（ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）ＨｅＬａ−ＨＤＤ細胞とした。
【００９８】 結果 これらの実験は、全遺伝子をコードするＨＩＶ由来の３重鎖陽性ベクターが細
胞を形質導入したり、同遺伝子を発現する標的細胞に対して特異的なＣＴＬ応答
を誘導したりできるかどうかを調べるために実施した。図９に例示したように、
特異的な細胞溶解が全ての条件で認められる。形質導入したＬＰＳ−繊維芽細胞
では弱いＣＴＬ応答が誘導された。ベクター粒子１ｍｉｃｇ／ｐ２４／ｍｌを使
用すると最も良い結果が得られた。これらの結果によって、完全な遺伝子が宿主
のゲノムに導入され、その産物が処理されて、提示されて著しいＣＴＬ応答が誘
導され得ることが示される。これらの結果によってまた、ｄｅｓ遺伝子は少なく
とも１個又は複数のＨＬＡ−Ａ２．１に限定されたＣＴＬエピトープペプチドを
含んでいることが示唆される。
【参照文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 メラノーマポリペプチドをコードするＨＩＶ−１由来の３重鎖ＤＮＡ陽性の組
換えベクター。
【図２】 ＴＲＩＰ−ｍｅｌ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫した後のＨＨＤマウスの
ＣＴＬ応答。
【図３】 中心ＤＮＡ３重鎖陽性又は陰性ＨＩＶ由来ベクターによる形質導入後５日目の
ヒト細胞でのＧＦＰ発現。
【図４】 ヒト樹状細胞を使用したインビトロＣＴＬ応答。
【図５】 ｐＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カード。 メラノーマ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列 ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの構築 ＨＲ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを構築するために、１９９９年４
月２０日に１−２１８５号としてＣＮＣＭに寄託されたＣＭＶプロモータの一部
、ポリペプチドＭＥＬ及びＩＲＥＳ−ＧＦＰを含むＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ
−ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＣＭＶプロモータの一部及びＧＦ
Ｐを含むＨＲ ＧＦＰのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントと置き換えた。
【図６】 ｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限カード ＨＩＶ特異的ＣＴＬモノ又はポリエピトープ配列、そのエピトープはＩ９Ｖ．（
ＩＬＫＥ）；（ＲＴ４７６−４８４） ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１９９９年１０月６日、＿号としてＣ
ＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託）の構築 ＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
のＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間にＩＬＫＥのＰＣＲ産物を挿入することによ
って構築した。ＩＬＫＥによって始まるＣＴＬエピトープの周りの領域は、プラ
イマ ５ ＩＬＫＥ：５′ＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＡＣＡＧ
ＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＣ ３′ ３ ＲＩＩＬＫＥ：５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＴＴＣ ３′ を用いてマトリックスｐＬＡＩ上にＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入
した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ
−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。 このベクターは、ＧＦＰ及びエピトープのクラスタに対応し、特にＨＬＡ．Ａ
２．１に限定されたＩ９Ｖエピトープ（ＲＴ４７６〜４８４）を含むＶＩＨのＲ
Ｔ遺伝子の領域をコードするバイシストロン性情報を発現する（Ｗａｌｋｅｒ
Ｂ．Ｄ．、１９８９ ＰＮＡＳ ８６ ｐ．９５１４〜９５１８）。
【図７】 ｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの制限地図 ＴＥＬ／ＡＭＬ配列の転座 ＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＴＥＬ／ＡＭＬのＰＣＲ産
物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＣＭＶプロモータとＩＲＥＳの間に挿入
することによって構築した。ＴＥＬとＡＭＬとの間の転座周囲の領域は、プライ
マ ５ ＢｇＩ ＴＡ： ５′ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡ
ＴＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴ ３′ ３ ＲＩＴＡ： ５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＴ
Ｃ ３′ を用いてＰＣＲによって増幅した。 Ｋｏｚａｋ配列は、上流プライマに挿入し、終止コドンは下流プライマに挿入
した。 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後、ＰＣＲ産物をＴＲＩＰΔＥ ＩＲＥＳ
−ＧＦＰのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【図８Ａ】 （ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトラン
スジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコ
ードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞
の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図８Ｂ】 （ＨＩＶ１ｐｏｌから得られた）Ｉ９Ｖエピトープペプチド及びＨＨＤトラン
スジェニックマウスの骨髄細胞を使用して産生したマウス樹状細胞のＧＦＰをコ
ードするＨＩＶ由来ＤＮＡ３重鎖陽性ベクターの形質導入能。 細胞内ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって実証されたように、マウス樹状細胞
の約８０％がＨＩＶ由来３重鎖陽性組換えベクターによって形質導入された。
【図９】 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子をコ
ードするＴＲＩＰ−ｄｅｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターで免疫したＨＨＤマウス
のＣＴＬ応答の評価。
【図１０】 １９９９年１０月１１日にＣＮＣＭに寄託されたｐＴＲＩＰ．ＤＥＳ−ＩＲＥ
Ｓ−ＧＦＰの制限地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シャルノー、ピエール フランス国、エフ−75005 パリ、リュ・ デ・エコール ６ビス (72)発明者 フィラ、ヒュセイン フランス国、エフ−75013 パリ、リュ・ ドゥ・トルビヤック 245 (72)発明者 ズノー、ベロニーク フランス国、エフ−75001 パリ、リュ・ グルヌータ 48 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 CA04 DA02 EA02 FA02 FA07 GA11 GA18 4B065 AA93X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 ZB26 ZB31 ZB33 ZB35 4C085 AA05 BA65 CC08 CC21 EE01 4C087 BB65 BC83 CA12 ZB26 ZB31 ZB33 ZB35

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換えベクターを含む免疫原組成物であって、 前記ベクターがシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）とシス作用性終止領域（
    ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含み、該領域はレトロウイルス又はレト
    ロウイルス様の起源であり、前記ベクターはさらに所定のヌクレオチド配列（目
    的の導入遺伝子又は配列）とレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写
    、発現及びウイルス粒子形成の制御シグナルとを含み、前記組成物は細胞性応答
    、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺伝子配列によってコードされた１
    又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４
    応答を誘導又は刺激することができることを特徴とする免疫原組成物。
  2. 【請求項２】 発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答である請求項１に記載
    の免疫原組成物。
  3. 【請求項３】 レトロウイルス起源の前記配列がレンチウイルスのゲノムか
    ら得られたことを特徴とする請求項１に記載の免疫原組成物。
  4. 【請求項４】 前記目的の導入遺伝子又は配列が転写及び発現の調節シグナ
    ルを含む発現カセットに含有されることを特徴とする請求項１から３の何れか１
    項に記載の免疫原組成物。
  5. 【請求項５】 １）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイル
    ス粒子形成の調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（導入遺
    伝子）を含有する組換えヌクレオチド配列と、２）シス作用性中心開始領域（ｃ
    ＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドであって、
    これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であるか、トランス
    ポゾン由来であり、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写調節シグ
    ナル又はトランスポゾン調節シグナルとともに、機能的な方向及び位置に挿入さ
    れているポリヌクレオチドとを備えた組換えレトロウイルス粒子を含む免疫原組
    成物であって、 前記免疫原組成物が細胞性応答、例えば前記ベクター中に存在する前記導入遺
    伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障
    害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は刺激することができる免疫組成
    物。
  6. 【請求項６】 ａ）レンチウイルスの核タンパク質又は機能的に得られたポ
    リペプチドに対応するｇａｇポリペプチド（ＧＡＧポリペプチド）と、 ｂ）レンチウイルスのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質又は機能的に得られたポ
    リペプチドによって構成されたｐｏｌポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、 ｃ）エンベロープポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＥＮＶポ
    リペプチド）と、 ｄ）１又は数個のエピトープをコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御
    下におかれた所定のヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）と、レトロ
    ウイルス又はレトロウイルス様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節
    シグナルを含有する配列と、シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用
    性終止領域（ＣＴＳ）とを備えたポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配
    列であって、これらの領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり
    、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源の上記調節シグナルとともに、機能
    的な方向及び位置に挿入された組換えヌクレオチド配列と を備えた組換えレトロウイルスベクター粒子を含む免疫原組成物であって、 前記組成物が、前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコードさ
    れた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘
    導又は促進することができる免疫原組成物。
  7. 【請求項７】 前記組換えレトロウイルス様粒子が、 ａ）シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性終止領域（ＣＴＳ）
    を含むポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロトランスポゾン由来で
    あり、レトロトランスポゾン調節シグナルとともに機能的な方向に挿入されてい
    るポリヌクレオチドと、 ｂ）レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的に得られたポリペプチド
    に対応するポリペプチド（ＧＡＧポリヌクレオチド）と、 ｃ）レトロトランスポゾンのＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮタンパク質に対応するｐｏｌ
    ポリペプチド又は機能的に得られたポリペプチド（ＰＯＬポリペプチド）と、 ｄ）ウイルスエンベロープポリペプチドと、 ｅ）転写及び発現の調節シグナル、逆転写、発現及びウイルス粒子形成のレト
    ロトランスポゾン調節シグナルの制御下に置かれた所定のヌクレオチド配列（目
    的の導入遺伝子又は配列）を備えた組換えヌクレオチド配列と を含む免疫原組成物であって、 前記組成物は細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列
    によってコードされた１又は数個のエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリ
    ンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することができ、前記組成物は前記
    導入遺伝子配列によってコードされた１又は数個のエピトープに対して細胞性応
    答ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進すること
    ができる免疫原組成物。
  8. 【請求項８】 発生したＣＴＬ応答が記憶ＣＴＬ応答又はＣＤ４応答である
    請求項５〜７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
  9. 【請求項９】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルの起
    源がレンチウイルスであり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドの
    起源がレンチウイルスであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載
    の免疫原組成物。
  10. 【請求項１０】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及
    び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ型
    レトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２由来であることを特徴とする請
    求項１〜９の何れか１項に記載の免疫原組成物。
  11. 【請求項１１】 前記逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナル及
    び前記ベクター内のｃＰＰＴ及びＣＴＳを含む前記ポリヌクレオチドが、レンチ
    ウイルスＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶから選択
    されたウイルス由来であることを特徴とする請求項１０に記載の免疫原組成物。
  12. 【請求項１２】 前記ベクターの前記ポリヌクレオチドがＨＩＶ−１レトロ
    ウイルスゲノムのシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及び終止領域（ＣＴＳ）
    を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の
    免疫原組成物。
  13. 【請求項１３】 前記ベクター粒子のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列がＨＩ
    Ｖレトロウイルス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の配列由来であることを特徴
    とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
  14. 【請求項１４】 ｇａｇ及びｐｏｌ配列がＨＩＶレトロウイルスの配列由来
    であり、ｅｎｖ配列が異なるＨＩＶレトロウイルス又はウイルス由来であること
    を特徴とする請求項５〜１２の何れか１項に記載の免疫原組成物。
  15. 【請求項１５】 前記ｅｎｖ配列がアンフォトロピックＥＮＶポリペプチド
    をコードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
  16. 【請求項１６】 前記ｅｎｖ配列がエコトロピックＥＮＶポリペプチドをコ
    ードすることを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ｅｎｖ配列が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）から得
    られたことを特徴とする請求項１４に記載の免疫原組成物。
  18. 【請求項１８】 ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３２６号とし
    て寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＴＥＬ／ＡＭＬ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、又
    はＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３１号として寄託されたＰｔｒ
    ｉｐ．ＤＥＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを特徴とするベクター。
  19. 【請求項１９】 ＣＮＣＭに１９９９年１０月１１日、Ｉ−２３３７号とし
    て寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＩＬＫＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであることを
    特徴とするベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物と接触
    した組換え細胞。
  21. 【請求項２１】 抗原提示細胞又は肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、
    マイクログリア、乏突起神経膠細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、
    神経細胞、骨髄の細胞株、マクロファージ、繊維芽細胞、造血細胞から選択され
    た細胞である請求項２０に記載の組換え細胞。
  22. 【請求項２２】 腫瘍又は感染性疾患を治療的に処置するための請求項１〜
    １７の何れか１項に記載の免疫原組成物又は組換え細胞。
  23. 【請求項２３】 前記ベクターに含まれた導入遺伝子が腫瘍細胞又は感染性
    病原体から得られたエピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド、タンパク
    質である請求項１から１７のいずれかに記載の免疫原組成物。
  24. 【請求項２４】 前記エピトープ、ポリエピトープを含むポリペプチド又は
    前記タンパク質がメラノーマ細胞由来である請求項２３に記載の免疫原組成物。
  25. 【請求項２５】 前記ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域が前記ベクターの前記配列内
    の中心に位置する請求項１〜１７の組成物、又は請求項１〜１７のいずれかに定
    義されたベクター又はベクター粒子。
  26. 【請求項２６】 前記導入遺伝子が逆転写の調節シグナルのＵ３領域に挿入
    された請求項１〜１７の何れか１項に記載された組成物又は請求項１〜１７の何
    れか１項に記載されたベクター又はベクター粒子。
  27. 【請求項２７】 シス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス作用性末端
    領域（ＣＴＳ）を含むポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、これら
    の領域の起源がレトロウイルス又はレトロウイルス様であり、前記ベクターがさ
    らに定義されたヌクレオチド配列（目的の導入遺伝子又は配列）を含み、前記ヌ
    クレオチド配列が病原体の遺伝子配列、及びレトロウイルス又はレトロウイルス
    様起源の逆転写、発現及びウイルス粒子形成の調節シグナルであり、前記組成物
    が細胞性応答、例えば前記ベクターに存在する前記導入遺伝子配列によってコー
    ドされた１個又はいくつかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球
    ）応答又はＣＤ４応答を誘導又は促進することが可能であることを特徴とする組
    換えベクター。
  28. 【請求項２８】 前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子が細菌、例え
    ばミコバクテリア、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
    ｓの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベクター。
  29. 【請求項２９】 前記目的のヌクレオチド配列又は導入遺伝子がウイルス又
    はレトロウイルスの抗原をコードする遺伝子である請求項２７に記載の組換えベ
    クター。
  30. 【請求項３０】 前記ＴＥＬ／ＡＭＬ又は前記ＩＬＫＥエピトープが病原体
    の遺伝子、例えばＭ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＥＳ遺伝子の一部と置換さ
    れた請求項１８又は１９に記載のベクター。
  31. 【請求項３１】 前記ベクターのゲノムの標的細胞核への移入を誘導又は促
    進することが可能な請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項１〜１７の何れか１項に記載の免疫原組成物におけ
    る請求項１８又は１９又は２７又は３１の何れかに記載のベクターの使用。
  33. 【請求項３３】 レンチウイルス又はレトロトランスポゾンベクター中で逆
    転写後に３本鎖ＤＮＡ構造（ＤＮＡ３重鎖）をとるｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含
    み、前記ベクターＤＮＡの形質導入細胞核への侵入速度を促進するヌクレオチド
    配列の使用。
  34. 【請求項３４】 細胞又は患者の細胞性応答を誘導するための請求項３３に
    記載のヌクレオチド配列の使用。
  35. 【請求項３５】 前記ベクターＤＮＡの速い侵入速度を誘導するか、又は前
    記ベクターＤＮＡの核移入速度を増加させることが可能なｃＰＰＴ及びＣＴＳ領
    域によって誘導された３本鎖ＤＮＡ配列。
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