JP6612237B2 - ヒトｔリンパ向性ウイルス１型に対する免疫応答を生成するためのレンチウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、組換えワクチン技術の分野の発明であり、ヒトＴリンパ向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）に感染した患者において免疫応答を生じさせるために用いることができるレンチウイルスベクターの改良に関する。当該ベクターは、他のベクターに比べて改良された免疫応答を提供する。

組換えワクチンは、改変ウイルスを作製するためのウイルスゲノムの改変を可能にする組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い開発されてきた。このようにして、宿主で特異的免疫応答を発生させるために、感染または形質導入すると標的細胞で発現される免疫原性タンパク質をコードするように遺伝子配列を非病原性ウイルスに導入することは可能であった。

このようなワクチンは、ワクチン技術における大きな進歩となっている（Ｋｕｔｚｌｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、９（１０）：７７６〜７８８頁、２００８）。特に、これらは伝統的なワクチンに比べて、生（弱毒化）ウイルスを回避し、不活化ワクチンの製造に伴うリスクを排除する利点を有する。

改変レトロウイルス（レトロウイルスベクター）を用いる遺伝子送達は、１９８０年代前半にＭａｎｎら（Ｃｅｌｌ、３３（１）：１５３〜９頁、１９８３）により紹介された。最も一般的に使用されるオンコレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく。該ウイルスは、ポリタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖが作製される単純なゲノムを有し、ウイルスの複製にトランスで必要とされる（Ｂｒｅｃｋｐｏｔら、２００７、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１４（１１）：８４７〜６２頁；Ｈｅら ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）。シスで通常必要とされる配列は、長末端反復配列（ＬＴＲ）ならびにこの近接：組み込みに必要とされる逆方向反復（ＩＲまたはａｔｔ部位）、パッケージング配列Ψ、トランスポートＲＮＡ結合部位（プライマー結合部位、ＰＢＳ）、および逆転写に関与するいくつかの付加配列（ＬＴＲ内の反復Ｒ、およびプラス鎖開始に必要なポリプリントラクト、ＰＰＴ）である。複製欠損レトロウイルスベクターを生成するには、一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を完全に欠失させ、発現カセットと置き換える。

レンチウイルスゲノムに由来するレトロウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）は、他のウイルス系に比べていくつかの利点を示すため、遺伝子治療および免疫療法目的の両方に対する有望なツールとして現れた。特に、レンチウイルスベクター自体毒性でなく、他のレトロウイルスと異なりレンチウイルスは、非分裂細胞、特に樹状細胞を形質導入することができ（Ｈｅら ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）、内因性経路を通じた抗原提示を可能にする。

レンチウイルスは、遺伝子組成の類似性、複製の分子機構、および該ウイルスの宿主との生物学的相互作用により連結される。レンチウイルスは、長期の不顕性感染後に知らぬ間に始まりゆっくりと進行するスロー病（ｓｌｏｗ ｄｉｓｅａｓｅ）症候群の病原体として最もよく知られ、ゆえに、レンチウイルスは「スロー」ウイルスと呼ばれている（Ｎａｒａｙａｎら、１９８９、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、７０（７）：１６１７〜３９頁）。レンチウイルスは、全てのレトロウイルスと同じ基本構成を有するが、インビボでのレンチウイルス複製において重要な役割を果たすアクセサリー遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔ、およびｒｅｖ）の存在のためより複雑である。

レンチウイルスはレトロウイルス科のスローウイルス属に相当し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含む。レンチウイルスは宿主中でいつまでも持続し得、生涯にわたる感染の過程において可変的な速度で継続的に複製し得る。宿主における該ウイルスの持続複製は、宿主防御を回避する該ウイルスの能力に依存する。

組換え組み込みレンチウイルスベクターの設計は、レンチウイルスのシス作用性配列とトランス作用性配列の分離に基づく。非分裂細胞への効率的な形質導入は、レンチウイルスゲノム中の２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、樹状細胞（ＤＣ）を含む非分裂細胞の核への遺伝子移入の効率を最大化する、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす（Ｚｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１（２）１７３〜８５頁；Ａｒｈｅｌら、２００７、ＥＭＢＯ Ｊ、２６（１２）：３０２５〜３７頁）。

樹状細胞は、主な機能が抗原を提示し免疫応答を開始することである抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要なクラスを構成するため、抗原提示に最も重要である。

免疫応答を生じるには、抗原タンパク質が細胞によりペプチドに処理され、該ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）により細胞表面に示されなければならない。循環ＡＰＣは、ペプチド−ＭＨＣ複合体を流入領域リンパ節でＴ細胞に提示し、該リンパ節で該複合体はＴ細胞受容体と相互作用し、共刺激シグナルと共にＴ細胞を活性化する。

様々な研究が、レンチウイルスベクターの接種はＤＣによる抗原提示、および抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）の強い活性化をもたらすことを示している。したがって、レンチウイルスベクターは、遺伝子導入および免疫療法適用のためにこの１０年間操作されてきた。

ベクターは、通常、ＣＭＶプロモーターなどのエンハンサーを含む強力な恒常的プロモーターを含む。Ｍｉｃｈｅｌｉｎｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（３４）：４６２２〜２９頁、２００９；Ｋａｒｗａｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（７）：３０９４〜３１０３頁、２００９；Ｎｅｇｒｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（９）：１７１６〜２３頁、２００７；およびＢｕｆｆａら、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７：１６２５〜１６３４頁、２００６。

レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ Ｕ３配列の除去により安全性が改善され、ＬＴＲ内にもともと存在するウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列を完全に欠く「自己不活性化」ベクターをもたらした。

レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルス粒子は、種々のＤＮＡプラスミド、すなわち
（ｉ）パッケージングプラスミド（少なくともＧａｇ、Ｐｏｌ Ｒｅｖ、Ｔａｔおよび、いくつかの場合ではトランスファー構築物のパッケージングに必要な構造タンパク質および酵素タンパク質を発現する）；
（ｉｉ）プロウイルストランスファープラスミド（発現カセットならびにパッケージング、逆転写、および組み込みに必要なＨＩＶシス作用性因子を含有する）；ならびに
（ｉｉｉ）エンベロープコードプラスミド（ほとんどの場合、幅広い種類の細胞、特には、ＤＣを含む主要組織適合（ＭＨＣ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にすることができる混合粒子（偽型）の形成を可能にするタンパク質、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ．Ｇ））
による細胞、例えばＨＥＫ ２９３Ｔヒト培養細胞の一過性トランスフェクションした組換え技術により作製することができる。

この手順は、トランスフェクト細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの一過性産生を得られるようにする。しかし、レンチウイルス粒子ベクターは、パッケージング遺伝子、プロウイルスコードＤＮＡ、およびエンベロープ遺伝子を細胞ゲノムに安定に挿入して、細胞により継続的に産生することもできる。これは、一過性トランスフェクションを必要とせずに細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの継続的産生を可能にする。当然のことながら、これらの手順の組み合わせが使用されてもよく、ＤＮＡ／プラスミドのいくつかは細胞ゲノムに組み込まれ、他は一過性トランスフェクションにより提供される。

非組み込みレンチウイルスベクターが設計されている。非組み込みレンチウイルスベクターの例は、Ｃｏｕｔａｎｔら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７（１１）：ｅ４８６４４頁、２１０２；Ｋａｒｗａｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（７）：３０９４〜３１０３頁、２００９；Ｎｅｇｒｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（９）：１７１６〜１７２３頁、２００７；Ｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：６６７５〜６６８３頁、２０１０に挙げられている。

自己不活性化レンチウイルスベクターにおけるウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、内因性プロモーター活性化の可能性を制限する。この安全性に関する懸念は、Ｘ連鎖（ＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子）重症免疫不全症の稀な形態に罹患している子どもにモロニーウイルスベースのレトロウイルスベクターを用いて行われた、１９９８〜１９９９年に実施されたＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子治療試験から得られた経験に直接対処する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８８（５４６６）：６６９〜７２頁）。この試験中、ヒトＬＭ０２癌原遺伝子のすぐ近くでのモロニー由来レトロウイルスベクターの組み込みの結果、子ども９名中４名が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、２００８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１８（９）：３１３２〜３１４２頁）。悪性腫瘍は、ＬＭ０２癌原遺伝子へのウイルスＵ３プロモーター／エンハンサーの近接の結果であることが示された。結果として、安全性は、ヒトへのレンチベクターの投与についての主要な懸念である。

プロモーターは、転写活性化因子として離れて作用することができるシス作用性配列であるエンハンサーを含みうる。エンハンサーを含むプロモーターは、様々な細胞タイプにおいて導入遺伝子強発現を得るのに最も効率的であると思われるため、ウイルス由来ベクターで幅広く使用されている（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、２０００、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１（１３）：１９０１〜９頁；Ｒｏｕａｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（９）：７１５〜２４頁；Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５（７）：１３９０〜９頁；Ｇｒｕｈら、２００８、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １０（１）２１〜３２頁）。しかし、挿入変異の安全性問題を考えると、転写エンハンサー配列は、エンハンサー近接効果による挿入変異のリスクをなくすためにレンチウイルスベクター構築物から欠失させるべきである。このエンハンサー近接効果は、挿入変異の圧倒的に最も多い機構であり、遺伝子導入後の腫瘍形成事象のヒトまたは動物症例において記載された唯一の効果である。

ゆえに、ウイルスエンハンサーを含まないが免疫原性ペプチドをコードする導入遺伝子の十分な発現、できればＣＭＶプロモーターを用いる場合に観察されるのと同じ程度の発現を可能にするレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターを開発する必要がある。

最近の研究は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ遺伝子（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５（７）：１３９０〜９頁）およびデクチン−２遺伝子（Ｌｏｐｅｓら、２００８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２（１）：８６〜９５頁）に由来するＤＣ特異的プロモーターによるウイルスプロモーターの置換について報告している。Ｌｏｐｅｓらにおいて使用されたデクチン−２遺伝子プロモーターは、推定エンハンサーおよびアデノウイルス保存配列（アデノウイルスプロモーター中の逆方向末端反復）を含有する（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。Ｋｉｍｕｒａらにより使用されたＭＨＣクラスＩＩ遺伝子プロモーターは、いずれの既知のエンハンサーも含有しない。

けれども、エンハンサーがなければ、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、静脈内投与された場合に、ＤＣにおける十分な導入遺伝子発現をもたらさないことが見出された。特に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーで観察された免疫応答と対照的に、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで免疫反応を引き起こさなかった。マウスに注射後、組み込みおよび持続的導入遺伝子発現は観察されたが、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを通じて転写されたレンチウイルスベクターは、ワクチン接種ブースト後でさえ抗原特異的ＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激しなかった。したがって、これらの研究の著者らは、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの使用は、免疫療法との関連ではなく遺伝子置換療法のように発現の持続性が求められる適用にのみ対象となると結論付けた。注目すべきことには、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはほとんどの細胞種において発現されにくい。

ゆえに、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、ＩＶ注入による、抗原に対する免疫応答の誘発に関してレンチウイルスベクターの適切なプロモーターではない。さらに、デクチン−２プロモーターはほとんどの細胞種において発現されにくく、エンハンサーを含有するようである。ゆえに、デクチン−２プロモーターは、安全性の理由のため、レンチウイルスベクターの良好なプロモーターではない。

好ましくは、免疫療法においてレンチウイルスベクターは、所望の特異的免疫応答を誘発する導入遺伝子の有効な発現を提供する。これは、樹状細胞などのＡＰＣにおいて発現が高レベルであることを必要とする。

レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞は、より高度の安全性を提供するために免疫応答により排除されることも好ましい。すなわち、導入遺伝子に対して生じた免疫応答は、レンチウイルスベクターにより形質導入される細胞を排除するのに十分な宿主における免疫応答を誘発することができる。形質導入細胞の排除は、宿主におけるレンチウイルスベクターの持続性、および該ベクターの起こり得る副次的影響を排除する。形質導入細胞が排除されるためには、発現は、非樹状細胞において免疫応答による排除を可能にするレベルで求められる。ゆえに、抗原の適切な発現が望ましい。

同時に、プロモーターは、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞の活性化に関与する重要な細胞（すなわち、樹状細胞）による免疫刺激を最大化すべきであり、悪性腫瘍をもたらす幹細胞における挿入変異および遺伝毒性のリスクを最小化すべきである。ゆえに、プロモーターは、樹状および他の細胞において十分に高い活性を有するべきであるが、エンハンサーを含有すべきでない。これらの基準に基づき、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは、強力なエンハンサーが存在するため理想ではない。これらの基準は、次のように要約される：
１．最大の免疫応答を誘発するための、樹状細胞を含む抗原提示細胞における高発現；
２．誘発された免疫応答による排除に十分な他の形質導入細胞タイプにおける発現；および
３．挿入による影響を回避するためのエンハンサーエレメントの欠如

ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の病原因子である。ＨＴＬＶ−１は、治療法や効果的な治療が存在しない他の病理とも原因的に関連している。例えば、脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）、血管周囲脱髄と軸索変性のある脊髄における灰白質と白質の炎症性慢性髄膜脊髄炎；ブドウ膜炎および自己免疫状態。ゆえに、一つの原因物質であるＨＴＬＶ−１は、少なくとも二つの疾患（ＡＴＬおよびＨＡＭ／ＴＳＰ）に関与しており、感染した個体は、両方を発症するわけではない。

世界中で２０００万人がＨＴＬＶ−１に感染していると推定され、特定の流行地域と異なるウイルスサブタイプが存在するが、その主要な国際的サブタイプＡは遺伝的変異が低い（ＧｅｓｓａｉｎとＣａｓｓａｒ、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３：３８８頁）。しかし、ＨＴＬＶ−１感染患者がＡＬＴおよび炎症性慢性疾患（ＨＡＭ／ＴＳＰ）を発症する推定生涯リスクは、５％未満であり、通常、感染の発症後２０〜３０年である。大多数の感染患者は無症候性キャリアのままであり、ＨＴＬＶ−１病因メカニズムを解読することが関心事である。

ＡＬＴは、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型および急性型の４つのサブタイプに分類される悪性リンパ球増殖性疾患である（Ｓｈｉｍｏｙａｍａ、１９９１、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、７９（３）：４２８〜４３７頁）。分類は、以下の基準：リンパ球数、異型リンパ球の割合、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のレベル、カルシウム濃度と皮膚病変に従って行われる。また、５つめの状態は、典型的なＡＴＬ形態を有する異常末梢血リンパ球が存在する無症候性疾患に特徴がある「プレＡＴＬ」と称されることもある。ＡＴＬ細胞は実際、凝縮クロマチン、小さいかまたは存在しない核および無顆粒、および好塩基球細胞質を有するいわゆる「花細胞」の特徴を有する。

ＡＴＬを発症する患者は、通常リンパ節腫脹、発熱、皮膚病変、白血球増加および肝脾腫大症を経験する。遅発性ＡＴＬサブタイプ（すなわち慢性型およびくすぶり型サブタイプ）では、生存期間中央値はおよそ４年であり（Ｔａｋａｓａｋｉら、２０１０、Ｂｌｏｏｄ、１１５（２２）：４３３７〜４３４３頁）、慢性型サブタイプでは２〜５年、くすぶり型サブタイプではおよそ３年である。しかし、活動性サブタイプ（すなわち急性型、リンパ腫型、または望ましくない慢性型ＡＴＬ）を有する患者の生存期間中央値は、複数薬剤化学療法を行う前向き試験でも５〜１３か月に減少した。

予後因子は、進行した一般状態、高カルシウムレベル、高乳酸脱水素酵素レベル、年齢（４０歳を超える）、および３つを超える病変である。注目すべきは、ＡＴＬを発症する個体は日和見感染症を発症する傾向がある（Ｏｌｉｅｒｅら、２０１１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、２２（４）：１９７〜２１０頁）。

ＡＴＬの治療は疾患のサブタイプに依存する（Ｏｌｉｅｒｅら、２０１１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、２２（４）：１９７〜２１０頁）。しかし、治療の選択肢は非常に限られており、利用可能な治療は再発までの時間を遅らせるに過ぎない。

作用のメカニズムは不明なままであるが、インターフェロン−αとアジドチミジン（ＡＺＴ、ジドブジン）の組み合わせの有効性を評価する研究から有望な結果が得られた。ＡＺＴプラスインターフェロンαを評価する試験のメタアナリシスでは５年全生存率は４６％という、任意の他の実験的ＡＴＬ治療では報告されたことがない値に達したことを示した（Ｂａｚａｒｂａｃｈｉｅｔら、２０１０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２８（２７）：４１７７〜４１８３頁）。生存利益は、白血病ＡＴＬサブタイプ（急性、慢性およびくすぶり）と治療が第一選択として投与されたときに特に観察された。しかしながら、ＡＺＴ／インターフェロンαの治療は、多くの副作用があり、中断することなく生涯にわたって行われる治療である。

この併用療法に三酸化ヒ素を追加した予備的な結果は、地固め療法として有益である可能性があり、さらに調査する価値があることが示唆された（Ｋｃｈｏｕｒら、２０１３、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０：９１頁）。

日本では、第ＩＩＩ相臨床試験により、３つの薬剤群、つまりＶＣＡＰ（ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾロン）、ＡＭＰ（ドキソルビシン、ラニムスチン、プレドニゾロン）およびＶＥＣＰ（ビンデシン、エトポシド、カルボプラチン、プレドニゾロン）の連続的な投与で構成されるｍＬＳＧ１５療法は、新たに診断された急性型、リンパ腫型および望ましくない慢性ＡＴＬにおいては、隔週のＣＨＯＰ（シクロホスファミド−ヒドロキシダウノルビシン−オンコビン−プレドニゾン）より優れており、７．０か月の無増悪生存期間中央値と１２．７か月の全生存期間であったことが示された（Ｔｓｕｋａｓａｋｉｅｔら、２００７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２５（３４）：５４５８〜５４６４頁）。

現在のところ、選択される治療オプションが多剤化学療法剤である場合に、個体の恩恵とリスク比に応じてＣＨＯＰまたはＶＣＡＰ−ＡＭＰ−ＣＥＣＰのいずれを用いるかは臨床医の判断次第である。

再発または難治性のＡＴＬを経験した患者に対して行った第ＩＩ相臨床試験中に、ヒト化モノクローナル抗ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）抗体は、ＡＴＬ、特に急性型サブタイプ疾患に有効であることが示された。試験に登録された２７人の患者は、抗体モガムリズマブで治療された。評価可能であった２６人の患者のうち、１３人は客観的な反応を、そのうち８人は完全寛解を達成した（Ｉｓｈｉｄａら、２０１２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、３０（８）：８３７〜８４２頁）。２０１２年３月には、モガムリズマブは、再発または難治性のＡＴＬの治療に関して日本で認可された（ブランド名ＰＯＴＥＬＩＯＧＯ（登録商標））。市販後調査によりスティーブンス・ジョンソン症候群（致命的なものの一つ）を含むいくつかの深刻な皮膚関連有害事象が報告され、モガムリズマブによる最適な治療戦略を十分に理解する必要性が求められている（Ｉｓｈｉｄａｅｔら、２０１３、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、１０４（５）：６４７〜６５０頁）。近年、急性型、リンパ腫型および望ましくない慢性型のＡＴＬ患者では、ｍＬＳ Ｇ１５単独に比べモガムリズマブをｍＬＳ Ｇ１５に加えた場合に、さらに無増悪生存期間（ＰＦＳ）が得られた。

臨床試験で評価されているＣＤ２５に対する抗体などの、他のモノクローナル抗体は、単独またはイットリウム９０に結合させて、研究されている。抗トランスフェリン受容体抗体もまた前臨床段階で有望な結果が得られた。

ＡＴＬの治療用処置として同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）により有望な結果が得られています。しかし、このオプションの恩恵を受ける可能性がある患者の数は非常に限られている（ＡＴＬを発症している患者は通常老齢であるため、臨床医はこの治療を行うのに消極的である。加えて、適合するドナーを見つけることは困難である）（Ｏｂａｍａら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、６９（３）：２０３〜２０５頁）。さらに、同種ＨＳＣＴの対象である少数の患者では、患者の３０％が移植片対宿主病を発症し、重度の副作用を患うかあるいは死亡し、患者の約３０％が再発し、患者のわずか約３０％が治癒する。

一つの興味深い研究は、化学療法による治療が失敗した後の、モガムリズマブとその後の同種ＨＳＣＴによる患者の治療に成功したことを報告している（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉら、２０１３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ、９８（２）：２５８〜２６０頁）。

よって、いくつかの臨床試験は、反応率を増加させることにより有望な結果を得ているが、治療の多くは長期生存に重大な影響を与えるに至っていない。また、試験された治療法は主に積極的なものである。

他のＴ細胞リンパ腫の治療のために既に承認されているかまだ承認されていない新薬がＡＴＬ患者において評価されようとしている。これらは、例えば、再発性および難治性皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療についてＦＤＡ承認されている、ボリノスタットとロミデプシンヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ）、または、慢性リンパ性白血病の治療について承認されている、アレムツズマブおよび抗ＣＤ５２抗体である。

疾患の活動期型または遅発型のいずれにおいても、良好な全生存期間効果、低い副作用、できるならば生涯にわたって続かない治療となる、ＡＴＬ患者のための新しい治療法が必死に検索される。

無症候性ＨＴＬＶ−１キャリア（ＡＣ）がＡＴＬを発症する前に長い潜伏期間があることを説明する一つの仮説は、宿主免疫応答とＨＴＬＶ−１ゲノム発現との間のバランスである（Ｙｏｓｈｉｄａ、２０１０、Ｐｒｏｃ．Ｊｐｎ Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ．Ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、８６（２）：１１７〜１３０頁）。

実際、いくつかの観察と実験は、ＨＴＬＶ−１の広がりと感染した患者におけるＨＴＬＶ−１関連疾患の発症を制御する際の宿主免疫系の重要な役割を指摘している。これらの中でも、動物モデル（ラット）では、母乳育児によるＨＴＬＶ−１の垂直感染が免疫耐性を与えるためＡＴＬのリスクを高めている（Ｈａｓｅｇａｗａら、２００３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７７（５）：２９５６〜２９６３頁；Ｋｏｍｏｒｉら、２００６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８０（１５）：７３７５〜７３８１頁）。しかしながら、経口感染の前にＨＴＬＶ−１感染ラット細胞を皮下注射するとＡＴＬの出現が防止された。その他は、肝臓移植後の免疫抑制剤で処理された無症候性キャリア（ＡＣ）におけるＡＴＬの発症が報告されている（Ｋａｗａｎｏら、２００６、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８２（６）：８４０〜８４３頁；Ｓｕｚｕｋｉら、２００６、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、８３（５）：４２９〜４３２頁）。また、同種ＨＳＣＴで治療されたＡＴＬ患者では抗ＨＴＬＶ−１免疫応答の増加が観察され、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果と呼ばれており、患者の寛解をもたらしている（Ｈａｒａｓｈｉｍａら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４（１）：３９１〜３９９頁）。また、ＡＴＬにおいて抗ＨＴＬＶ−１免疫応答が低いことが記載されており、患者における疾患の開始および進行に有利に働く可能性がある（Ｋａｎｎａｇｉら、２０１１、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、１０２（４）：６７０〜６７６頁；Ｋａｎｎａｇｉら、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：３２３頁）。

インビトロの実験から、ＨＴＬＶ−１に特異的なＣＴＬが、主にはＴａｘ、そしてそれほどではないにせよそのエンベロープ、ポリメラーゼ、Ｐ１２、Ｐ３０およびＨＢＺを認識したことが示された（Ｋａｎｎａｇｉら、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３：３２３頁に概説される）。ＡＣおよびＡＴＬ患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、頻度、多様性および多官能性について評価されており、ＡＣ患者と比較してＡＴＬ患者ではこれら３つのパラメータで減弱した応答が示された（Ｋｏｚａｋｏｅｔら、２００６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７７（８）：５７１８〜５７２６頁；Ｍａｎｕｅｌら、２０１３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３（７）：１２２３〜１２３９頁）。

これらおよび他の研究は、特定のＨＴＬＶ−１細胞免疫応答がＡＴＬを発症した患者において劇的に損なわれることを示している。ゆえに、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対して細胞性免疫応答を刺激することを目指す治療は、ＡＴＬを治療するための適切な治療オプションであると言える。

前臨床試験は、既に、動物モデルにおけるＡＴＬ表現型の治療におけるＨＴＬＶ−１ウイルスタンパク質Ｔａｘに対するワクチンの有効性を示している。確かに、ＡＴＬ表現型のラットモデルでは（Ｏｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（７）：６０３１〜６０４０頁）、Ｔａｘ ＤＮＡをインビボでワクチン接種すると、インビトロでＨＴＬＶ−１細胞を溶解することができるＴａｘ特異的ＣＴＬの刺激が誘発された。ＨＴＬＶ−１感染細胞の注射と同時にこれらＣＴＬを養子免疫伝達すると、インビボでの腫瘍増殖が阻害される（Ｏｈａｓｈｉら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４（２０）：９６１０〜９６１６頁）。

別の研究では、急性または慢性のＡＴＬサブタイプの患者からのＡＴＬのＣＤ４＋細胞の移植は、ＮＯＧマウスにおいてＡＴＬ様表現型を引き起こす。Ｔａｘペプチドでインビトロ刺激した患者由来のＣＴＬの同時注入によりＡＴＬ病変が低減する。これは、腫瘍部位に、ＨＴＬＶ−１腫瘍細胞を認識して殺すＣＴＬが浸潤するためである（Ｍａｓａｋｉら、２０１３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９１（１）：１３５〜１４４頁）。

最近では、ＡＴＬの治療として、ウイルスタンパク質Ｔａｘ由来のペプチドでパルスした自己樹状細胞を用いた治療ワクチンの臨床試験フェーズＩが、プロウイルス負荷の低減と表面リンパ節のサイズの縮小という、予備的な有望な結果を示した（Ｓｕｅｈｉｒｏら、２０１３、ｔｈｅ １６^ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ：ＨＴＬＶ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓの要約）。さらに関心が寄せられるのは、試験を完了した２人の患者のうち１人が部分寛解を達成し、他の１人は重度の副作用のない安定した疾患を有した。

これらすべてのデータは、ＨＴＬＶ−１細胞に対する細胞免疫応答の刺激は、ＡＴＬ患者を治療するための強力な治療オプションとなりうることを実証している。

ＨＴＬＶ−１に対するワクチン接種を試験する唯一の臨床試験で使用されるエクスビボのペプチドワクチン接種の第一の欠点は、ＨＬＡハプロタイプに従って治療に適する患者を選択することである。第二に、自己ＤＣのエクスビボの成熟には、患者のＰＢＭＣからの精製工程が必要であり、循環する単核細胞が繰り返し枯渇する。病理学的な事情では、これは患者の免疫系に有害であり得る。さらに、自己ＤＣの精製は非常に高価であり、良好なパフォーマンスを得るための技術的課題がある（例として、前立腺癌治療におけるＤｅｎｄｒｅｏｎ社のＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）ワクチンを参照のこと（Ｈｕｂｅｒら、２０１２、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、１０４（４）：２７３〜２７９頁）。

したがって、当分野では改善されたベクターとヒトでのＨＴＬＶ−１の治療のための方法が必要とされている。本発明は、当分野におけるこれらの必要性を満たすものである。

本発明は、レンチウイルスベクターを含む組成物とその使用、および当該組成物の使用方法を包含する。本発明は、ヒトにおける免疫応答を誘発するための方法、組成物および使用を包含する。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクターのＤＮＡがＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含みうる。

ある実施形態では、本発明は、ヒトへの筋肉内投与による免疫応答の誘発のためのレンチウイルスベクター粒子を含む組成物の使用であって、レンチウイルスベクター粒子はレンチウイルスベクターを含み、レンチウイルスベクターのＤＮＡはＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含む、使用を包含する。

ある実施形態では、本発明は、ヒトへの筋肉内投与による免疫応答の誘発のためのレンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、レンチウイルスベクター粒子はレンチウイルスベクターを含み、レンチウイルスベクターのＤＮＡはＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含む、組成物を包含する。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはβ２ｍプロモーターまたはＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質は配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによりコードされる。

いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１０^７レンチウイルスベクター粒子を含む。

Ｔ細胞の刺激のために用いたペプチド（ｐ１２Ｉまたはｐ３０ＩＩ特異的）のプールに従って、ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ ＨＴＬＶ−１抗原を含むレンチウイルスベクターの異なる用量（１．１０ｅ６、１．１０ｅ７、１．１０ｅ８ＴＵ／マウス）を注入した後の、Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスで誘発されたＴ細胞特異的免疫応答（ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ−γ）を示す（累積応答、中央値）。 Ｔ細胞の刺激のために用いたペプチド（ＴａｘまたはＨＢＶ特異的）のプールに従って、抗原ＴａｘおよびＨＢＺの異なる組み合わせ、すなわちＴａｘ−ＨＢＺ、Ｔａｘ−２Ａ−ＨＢＺ、ＨＢＺ−Ｔａｘ、ＨＢＺ−２Ａ−Ｔａｘを含むレンチウイルスベクターの異なる用量（１．１０ｅ６、１．１０ｅ７、１．１０ｅ８ＴＵ／マウス）を注入した後の、Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスで誘発されたＴ細胞特異的免疫応答（ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ−γ）を示す（累積応答、中央値）。 Ｔ細胞の刺激のために用いたペプチド（Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉまたはｐ３０ＩＩ特異的）のプールに従って、抗原ＴａｘおよびＨＢＺの異なる組み合わせ、すなわちＴａｘ−ＨＢＺ−ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩおよびｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺを含むレンチウイルスベクターの異なる用量（１．１０ｅ６、１．１０ｅ７、１．１０ｅ８ＴＵ／マウス）を注入した後の、Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスで誘発されたＴ細胞特異的免疫応答（ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ−γ）を示す（累積応答）。 インビトロでの不死化ＭＥＦにおけるＨＴＬＶ抗原を発現するレンチウイルスベクターの影響の欠如を表す。Ａ）形質導入した不死化ＭＥＦの増殖曲線。Ｂ）ＭＥＦにおける組み込まれた（統合された）ベクターのコピー数。Ｃ）形質導入した不死化ＭＥＦの増殖率。 インビボでのマウスの体重に対するＨＴＬＶ抗原を発現するレンチウイルスベクターの影響の欠如を表す。 形質導入されたマウス（腹側照射）のインビボルシフェラーゼ発現の動態を表す。Ｓ５〜Ｓ８はルシフェラーゼのみを発現するレンチウイルスベクターである。Ｓ３５〜Ｓ３８は、ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原とルシフェラーゼ遺伝子（ＩＲＥＳによって抗原から隔離される）を発現するレンチウイルスベクターである。Ｓ３９〜Ｓ４０は注入していないコントロールである。 形質導入されたマウス（背側照射）のインビボルシフェラーゼ発現の動態を表す。Ｓ５〜Ｓ８はルシフェラーゼ単独である。Ｓ３５〜Ｓ３８は、ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原とルシフェラーゼ遺伝子（ＩＲＥＳによって抗原から隔離される）を発現するレンチウイルスベクターである。Ｓ３９〜Ｓ４０は注入していないコントロールである。

発明の詳細な説明
レンチベクターは、強力な持続型かつ多様なＴ細胞媒介性応答を誘発することができる。そして、レンチウイルスベクターによりコードされる抗原に対する細胞性免疫応答が活性化される。さらに、例えば重度の副作用（すなわち自己免疫性疾患）があり生涯にわたる治療であるインターフェロン−αとＡＺＴの組み合わせとは異なり、効率的な治療用ワクチン接種により患者は持続可能な期間の間その治療を中止することが可能となり、それによって副作用や費用を低減することができる。

他のレトロウイルスとは異なり、おそらくエラーを起こしやすい逆転写（すなわち、過去に感染していない細胞のデノボ感染）によるものではなく、感染細胞のクローナルな拡大（有糸分裂による複製）によるウイルス拡散により、ＨＴＬＶ−１は顕著な遺伝的安定性を表す。よって、抗ＨＴＬＶ−１抗原をコードするレンチウイルスベクターを用いて世界中の患者を治療することができるであろう。

増殖および形質転換の宿主細胞の調節機構への関与に基づいて、抗ＨＴＬＶ−１抗原を設計するために、Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩの４つのＨＴＬＶ−１タンパク質を選択した。

Ｔａｘタンパク質
ＨＴＬＶ−１によるＣＤ４＋ Ｔリンパ球の形質転換における初期段階は、その主要な癌遺伝子であるＴａｘの発癌特性と関連していた。このウイルスタンパク質は、宿主細胞の核に局在し、転写因子またはクロマチンモデラーと相互作用して細胞増殖を促進する（Ｈａｌｌｅｒ、２０００、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１６（１６）：１６８３〜１６８８頁；Ｊｅａｎｇ、２００１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、１２（２−３）：２０７〜２１７頁；Ａｚｒａｎら、２００４、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：２０頁；Ｂｏｘｕｓら、２００８、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、５：７６頁）。Ｔａｘの発現は、いくつかの細胞シグナル伝達経路（すなわち、ＮＦ−ｋＢ、ＳＲＦまたはＡＰ１）の活性化を介してＴリンパ球の増殖および分化を引き起こすことが実証されている。Ｔａｘはまた、複製起点の活性化のタイミングと、ＤＮＡ二本鎖切断を導く活性酸素種の生成を調節することによって、ゲノムの安定性を損なう。さらに、Ｔａｘは、宿主細胞のアポトーシスに関して反対の効果を表出することが記載されている。実際に、低レベルの発現で、Ｔａｘは細胞のアポトーシスを阻害し（Ｂｒａｕｗｅｉｌｅｒら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３１（１）：１３５〜１４０頁；Ｔｓｕｋａｈａｒａら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（１０）：７９８１〜７９８７頁；ＫａｓａｉとＪｅａｎｇ、２００４、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：７頁）、変異原性および発癌性であると考えられている（概説についてはＢｏｘｕｓら、２００８、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、５：７６頁を参照のこと）。これとは対照的に、高レベルの発現では、Ｔａｘは細胞にとって毒性であると思われ、アポトーシスと急速な老化を誘導する（Ｃｈｅｎら、１９９７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ１２）：３２７７〜３２８５頁；ｄｅ Ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４（１６）：７２７０〜７２８３頁；Ｋａｏら、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９（１８）：２２４０〜２２４８頁；ＮｉｃｏｔとＨａｒｒｏｄ、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０（２２）：８５８０〜８５８９頁；ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅら、２００３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４５（１−２）：９９〜１１３頁；Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、６：３５頁；Ｈｏｅｔら、２０１２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８６（１７）：９４７４〜９４８３頁）。Ｔａｘは、特に感染の初期段階に感染した細胞によって発現される。しかし、急性型のＡＴＬ、少なくともＨＴＬＶ−１感染細胞の主要な循環型クローンでは、Ｔａｘ発現がしばしばオフになっているという所見が報告されている（Ｋａｎｎａｇｉ、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：３２３頁）。

ＨＴＬＶ−１ ｂＺＩＰ因子（ＨＢＺ）
ＨＴＬＶ−１のｂＺＩＰ因子（ＨＢＺ）は、Ｔリンパ球の増殖に関与するもう一つのウイルスタンパク質である。これは、プロウイルスのマイナス鎖によってコードされ、宿主細胞の核内に局在している。ＨＴＬＶ−１のｂＺＩＰ因子（ＨＢＺ）は二峰性の役割を持つ。すなわちＨＢＺ ＲＮＡは細胞増殖を促し（Ｓａｔｏｕら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３（３）：７２０〜７２５頁；Ａｒｎｏｌｄら、２００８、Ｂｌｏｏｄ、１１２（９）：３７８８〜３７９７頁）、ＨＢＺタンパク質は、感染した患者の免疫系の主な標的である、古典的ＮＦ−κＢ経路を抑制することおよびＴａｘ発現を下方制御することによってＨＴＬＶ−１感染細胞の宿主免疫攻撃からの回避を促進する可能性がある（Ｇａｕｄｒａｙら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７６（２４）：１２８１３〜１２８２２頁；Ｌｅｍａｓｓｏｎら、２００７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１（４）：１５４３〜１５５３頁；Ｚｈａｏｅｔら、２００９、Ｂｌｏｏｄ、１１３（１２）：２７５５〜２７６４頁）。さらに、ＨＢＺは、形質転換状態の維持に重要な役割を有し、潜在的にＨＴＬＶ−１がＴリンパ球を調節性Ｔ細胞へ変換することを可能にしており、このことがウイルスの持続性のために重要であると考えられている。

アクセサリータンパク質Ｐ１２ＩおよびＰ３０ＩＩ
Ｐ１２Ｉは、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体の膜に局在する。Ｐ１２Ｉは細胞増殖に関与する（Ｎｉｃｏｔら、２００５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４（３９）：６０２６〜６０３４頁；Ｅｄｗａｒｄｓら、２０１１、Ｖｉｒｕｓｅｓ、３（６）：８６１〜８８５頁）。さらに、ｐ１２ＩはＭＨＣＩを劣化させ、細胞へのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞接着を阻害し、ＨＴＬＶ−１感染細胞が免疫系によって認識されることを妨げる（Ｎｉｃｏｔ，ら、２００５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４（３９）：６０２６〜６０３４頁；Ｂａｎｅｒｊｅｅｅｔら、２００７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１（１８）：９７０７〜９７１７頁）。ｐ１２Ｉの膜結合切断型であるＰ８Ｉタンパク質はＴａｘ活性を下方制御する（Ｆｕｋｕｍｏｔｏら、２００７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８１（１７）：９０８８〜９０９９頁）。

最後に、ｐ３０ＩＩは、核および核小体の両方のタンパク質であり、ウイルスタンパク質発現の負の調節因子である（Ｎｉｃｏｔら、２００４、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．、１０（２）：１９７〜２０１頁；Ｍｉｃｈａｅｌら、２００６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３５４（２）：２２５〜２３９頁）。 Ｐ３０ＩＩは、細胞周期進行、細胞シグナル伝達、アポトーシス、ＤＮＡの複製および修復、血管新生および細胞遊走に関与するいくつかの遺伝子の転写および転写後調節に寄与する（Ｔａｙｌｏｒｅｔら、２００９、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０：３１１頁）。さらに、ｐ３０ＩＩはＤＮＡ修復経路とも相互作用する（Ｂａｙｄｏｕｎら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ、１１７（２２）：５８９７〜５９０６頁）。注目すべきは、ミトコンドリアおよび核の両方に局在するｐ３０ＩＩのスプライスされたアイソフォームであるｐ１３ＩＩは、ＲＯＳ産生およびアポトーシス（Ｂｉａｓｉｏｔｔｏｅｔら、２０１０、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１７９７（６−７）：９４５〜９５１頁；Ｓｉｌｉｃ−ｂｅｎｕｓｓｉら、２０１０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ．、３１（５）：３５０〜３５８頁）においても、Ｔａｘ活性の阻害（Ａｎｄｒｅｓｅｎら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ、１１８（６）：１５４９〜１５５９頁）においても、カルシウムの恒常性およびカルシウム依存性遺伝子発現の調節に関与している。

ＡＴＬ病因に選択されたウイルスタンパク質の推定される役割
Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩは、細胞機構と相互作用し、その代謝を破壊する。細胞増殖、ＤＮＡ修復および免疫系応答に働きかけるので、それらはＡＴＬ患者ではインビボの発現が低いが、白血病細胞によって発現され得る発癌タンパク質と考えられる（Ｋａｎｎａｇｉら、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：３２３頁）。実際、ＴａｘはＡＴＬ患者に見られる免疫優性標的抗原である（Ｋａｎｎａｇｉｅｔら、１９９１、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３（８）：７６１〜７６７頁；Ｐｉｑｕｅら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０（８）：４９１９〜４９２６頁）。さらに、免疫応答標的化Ｔａｘは寛解を達成した同種ＨＳＣＴによって治療されるＡＴＬ患者において観察されている（Ｈａｒａｓｈｉｍａｅｔら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４（１）：３９１〜３９９頁）。ｐ１２Ｉ／ｐ８ＩのＲＮＡはＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞およびマクロファージにおいてインビトロおよびエクスビボで検出される（Ｋｏｒａｌｎｉｋら、１９９２、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、８（１１）：１８４５〜１８４９頁）。さらに、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩは、臨床状態がどのような場合であってもインビボでＨＴＬＶ−１患者の免疫系の標的である（Ｃｈｅｎら、１９９７、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７１（２）：１９６〜２０２頁；Ｄｅｋａｂａｎｅｔら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７４（１）：８６〜９３頁；ＰｉｑｕｅとＤｏｋｈｅｌａｒ、２０００、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１６（１６）：１７８３〜１７８６頁）。インビボでのＨＴＬＶ−１タンパク質の発現がまだ議論されていても、ＨＢＺの発現は、研究されるＡＴＬ患者のすべてのケースで保存されているようである（ＺｈａｏとＭａｔｓｕｏｋａ、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：２４７頁）。また、ＨＴＬＶ−１キャリアにおけるＨＢＺに対する免疫応答が既に観察されている（Ｍａｃｎａｍａｒａら、２０１０、ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．、６（９）：ｅ１００１１１７頁；Ｅｎｏｓｅ−Ａｋａｈａｔａら、２０１３、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０：１９頁）。

ゆえに、患者の白血病細胞についてウイルスタンパク質発現の様々なパターンの可能性には仮説があるので、どのレベルのウイルスタンパク質発現であっても、患者のＡＴＬ細胞に対して免疫応答を刺激するためには、ＴａｘおよびＨＢＺの両方のペプチド配列を含む抗原が必要な戦略でありうる（Ｕｍｉｎｏら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ、１１７（２０）：５４７３〜５４７８頁）。ＴａｘおよびＨＢＺ抗原のもう一つの利点は、配列内の遺伝的多様性が低いことである（Ｋｕｂｏｔａら、２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７８（９）：５９６６〜５９７２頁；ＺｈａｏとＭａｔｓｕｏｋａ、２０１２、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３：２４７頁）。最後に、ｐ１２Ｉおよびｐ１３ＩＩは、細胞膜の脂質ラフト内の内膜およびｐ８Ｉに局在する。原形質膜への細胞内での膜輸送により、これらタンパク質由来の配列は細胞表面上に存在するかもしれない。アイソフォームタンパク質であるＰ１２Ｉ／Ｐ８ＩおよびＰ３０ＩＩ／Ｐ１３ＩＩの共通配列内のエピトープを選択することによって、免疫応答の増強を引き起こすかもしれない。

ＡＴＬの出現および維持における上記所見、それらの発現およびこれらのタンパク質の役割に基づいて、臨床的に必要な戦略は、Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２およびＰ３０抗原の１、２、３、または４つすべてに対して強力かつ選択的な細胞性免疫応答を誘発することである。

安全な抗原の設計
活性を表す細胞内局在へウイルスタンパク質を標的化するすべての配列を切断または削除した。加えて、主要なエピトープの一部ではない転写因子または他のエフェクターとの相互作用に関与する膜貫通ドメインおよび配列を切断または削除して、任意の野生型活性を無効にした。Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩ由来のエピトープを組み合わせ、直接またはリンカー配列により融合させた。Ｔａｘの発癌活性に関して、他のウイルスタンパク質によるＴａｘ発現の下方制御は、免疫系による認識およびＴａｘを発現する細胞の溶解を制限しうる。レンチウイルスベクターにおいて、Ｔａｘ、ＨＢＺ、Ｐ１２ＩおよびＰ３０ＩＩ由来のペプチドを含む抗原の発現はβ２ミクログロブリンプロモーターの制御下にあり、ゆえに抗原は宿主細胞内で構成的に発現され、その発現はβ２ミクログロブリンプロモーターとのウイルスペプチドの相互作用によって調節することができず、Ｔａｘポリペプチドの発癌効果のリスクを制限する。

本研究では、Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩ抗原の異なる組み合わせを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける細胞性免疫応答を誘発する能力について試験した。

ＨＴＬＶ−１抗原のそれぞれの組み合わせのＴ細胞特異的応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行うことによってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて評価した（図１、２および３）。ＨＢＺ、ｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩに対するワクチン接種が動物モデルにおいてＴ細胞免疫応答を誘発することができることを初めて実証した。

驚くべきことに、Ｔ細胞応答は、抗原（Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２Ｉまたはｐ３０ＩＩ）に応じてのみならず、その抗原の組み合わせおよび構成に応じて変化した。

例えば、図１は、Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原がＨＢＺ−Ｔａｘより強いＴ細胞応答を誘発したことを示している。さらに、Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原は、ＨＢＺ−ＴＡＸとは対照的に、１．１０ｅ６ ＴＵ／マウスで有意に免疫原性であるようである。興味深いことに、コンストラクトＴａｘ−２Ａ−ＨＢＺは、２Ａ配列なしで直接融合されたＴａｘ−ＨＢＺよりもＣ５７ＢＬ／６Ｊにおいて免疫原性が低いのに対して、ＨＢＺ−ＴａｘおよびＨＢＺ−２Ａ−Ｔａｘは同様の効果を持っている。

Ｔａｘ−ＨＢＺおよびｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ抗原は一緒に含まれるように選択した。Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を抗原ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩに直接融合して、ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺおよびＴａｘ−ＨＢＺ−ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩの２つの組み合わせとした。以前に観察されたように、Ｔ細胞免疫応答は組み合わせに応じて有意に変化するという結果が示された。すなわちｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原はＴａｘ−ＨＢＺ−ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩよりもＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて強力なＴ細胞応答を誘発した。

抗ＨＴＬＶ−１ワクチンの設計は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける強力かつ適切なＴ細胞免疫応答の誘発に選択された異なる抗原の組み合わせの重要性を明らかにしている。ポリペプチドの立体構造を予測することは、特異的免疫応答を刺激する最高の能力を持つであろうワクチンを開発するために、適切なエピトープを選択することと同じくらい重要である。観察された最良の抗原の組み合わせはｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原であった。

ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクターの発癌性のインビトロ評価を行った。安全性の評価を行い、抗原の組み合わせが形質導入後の細胞の代謝を妨げないことを確認した。一次および不死化細胞（原発性および天然の不死化マウス胚線維芽細胞ＭＥＦおよび原発性ヒト胚性線維芽細胞ＭＲＣ５）を、ベクターおよびポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにより形質導入した。細胞が発癌性質を示さない限り３Ｄの細胞は増殖／成長しないので、３週間封入培地（アガロース）での成長を評価した。また、コロニーの顕微鏡観察および検出キットによっても評価した。結果を図４に示す。

ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクターを用いて一次線維芽細胞を形質導入した結果、ＭＲＣ５の形態に変化はなかった。ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクターを用いて不死化ＭＥＦを形質導入した結果、約１か月の間、成長に変化がなかった。ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクターあるいはｗｔＨＴＬＶ−１タンパク質を用いて形質導入した不死化ＭＥＦにおいてはクローン原性細胞は見られなかった。

ＮＯＧマウスにおけるｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクター＋ＶＰＸベクターの発癌性をネガティブコントロールを用いて評価した。結果を図５に示す。マウスに対しては影響がなかったことが観察された。

インビボでのｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ抗原を発現するレンチウイルスベクターからの発現は、レンチベクターならびにコントロールベクターにルシフェラーゼ発現カセットを挿入することによって試験した。ルシフェラーゼ発現は、ＮＯＧマウスの腹側または背側に筋肉内注射した後の生物発光によりモニターした。結果を図６および７に示す。

ルシフェラーゼ発現は投与後６時間から観察された。グループ１（ＨＴＬＶ−ルシフェラーゼ）では、生物発光が経時的に減少することが観察された。グループ２（ルシフェラーゼのみ）では、生物発光が経時的に増加することが観察された。

試験の最後（第６６日目）まで腫瘍の成長は観察されなかった。

免疫原性タンパク質の発現を駆動する特殊なプロモーターと組み込みレンチベクターを動物に筋肉内投与すると、当該動物からの組み込まれたベクターの排除を引き起こすタンパク質に対して予想外に高くかつ長期化した免疫応答が生じる。よって、本発明は、高くかつ長期化した免疫応答と、ヒトへの投与のための高い安全性を有する新規なレンチベクターを提供する。

したがって、本発明は、ヒトへの投与によって免疫応答を誘発するためのレンチウイルスベクター粒子を用いた組成物、方法および使用であって、レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、レンチウイルスベクターのＤＮＡがＨＴＬＶ−１ Ｔａｘおよび／またはＨＢＺ抗原、および／またはｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩ抗原の発現を駆動するプロモーターを含む、組成物、方法および使用を包含する。好ましくは、抗原は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４〜配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる。最も好ましくは、抗原は配列番号２０によってコードされる。

ＭＨＣクラスＩおよびβ２ｍプロモーター
ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＮＦ−Ｋｂ結合部位、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、およびＳＸＹ調節モジュール（ＳＸＹ）の保存を示す。ヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターは、単一ＮＦ−Ｋｂ結合部位の上流ではあるが、ＩＳＲＥを含有するので、ＭＨＣクラスＩプロモーターにいくらか類似性を示す。

ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、抗原提示細胞（樹状細胞を含む）特異的プロモーターであると考えられている。ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはＳＸＹモジュールを含有するが、該プロモーターはＮＦ−Ｋｂ結合部位またはＩＳＲＥを含有しない（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｌｓｅｎら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、４８：２０８〜２２１頁）。ゆえに、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはＭＨＣクラスＩプロモーターとは極めて異なる。結果として、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは非常に異なる細胞発現パターンを有する（図２４）。

別の抗原提示細胞特異的プロモーターであるデクチン−２は、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含有するが、ＳＸＹモジュールを含有しない（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。

様々な哺乳動物（ヒト）ＭＨＣクラスＩプロモーターの配列を以下に示す。

ＨＬＡ−Ａ２ （ＭＨＣ Ｉ）：
attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg （配列番号１）

ＨＬＡ−Ｂ７ （ＭＨＣ Ｉ）：
ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacccggactcagag （配列番号２）

ＨＬＡ−Ｃｗ５ （ＭＨＣ Ｉ）：
cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag （配列番号３）

ＨＬＡ−Ｅ （ＭＨＣ Ｉ）：
taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaagaagttctcaggactcagagg （配列番号４）

ＨＬＡ−Ｆ （ＭＨＣ Ｉ）：
aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccagagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggtcatg （配列番号５）

ヒトβ２ミクログロブリンプロモーターの配列を以下に示す。
aacatcacgagactctaagaaaaggaaactgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggtgacggtccctgcgggccttgtcctgattggctgggcacgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgag （配列番号６）

ＭＨＣＩおよびβ２ｍプロモーターはエンハンサーを含有しない。さらに、これらプロモーターは、ＢＤＣＡ＋樹状細胞におけるプロモーターの発現が腎臓、平滑筋、肝臓および心臓細胞での発現よりも高い点において樹状特異的である（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ）。これらはまた、他の形質導入された細胞種において相対的に高い発現を有する。例えば、ＢＤＣＡ＋樹状細胞におけるプロモーターの発現は、骨格筋細胞におけるプロモーター発現のたった１２〜１００倍であり、ＭＨＣＩＩ ＨＬＡ−ＤＲαプロモーターによっては９００倍であるのとは対照的である。同上。

本発明は、ＭＨＣＩおよびβ２ｍプロモーターを含むレンチウイルスベクター、および筋肉内投与によって宿主に免疫応答を誘発するためのこれらの使用を包含する。

本発明は、宿主の細胞、好ましくは樹状細胞（ＤＣ）において、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする導入遺伝子の転写を指示する、クラスＩ ＭＨＣまたはβ２ｍ遺伝子プロモーター由来のプロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。

投与方法
本発明は、ヒトへのレンチウイルスベクター（または「レンチベクター」）の投与方法を包含する。好ましくは、レンチベクターは、樹状細胞を含む抗原提示細胞における抗原の高発現を駆動し、誘発される免疫応答によって除去するのに十分な他の形質導入された細胞種における発現を駆動するプロモーターを含有する。最も好ましくは、プロモーターはエンハンサーエレメントを欠き、挿入の影響を回避する。

好ましくは、投与は筋肉内である。ある実施形態では、レンチベクターは針を用いて筋肉内に注入される。

好ましくは、レンチベクター粒子は、機能性インテグラーゼタンパク質を含む組み込みレンチベクター粒子である。

ある実施形態において、本発明は、レンチウイルスベクター粒子の筋肉内投与を含む、ヒトにおいて免疫応答を誘発するための方法を含む。本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するためのレンチウイルスベクター粒子を用いる方法であって、レンチウイルスベクター粒子はレンチウイルスベクターを含み、レンチウイルスベクターのＤＮＡは、ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘおよび／またはＨＢＺ抗原、および／またはｐ１２Ｉおよびｐ３０ＩＩ抗原の発現を駆動するプロモーターを含む、方法を包含する。好ましくは、抗原は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４〜配列番号２１、最も好ましくは配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによりコードされる。

好ましくは、レンチベクター粒子は、１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１０^８、２×１０^８、５×１０^８、または１０^９ＴＵの用量にある。

レンチベクター粒子は、被験体に単回用量または複数回（すなわち２、３、４など）の用量で投与されうる。レンチベクター粒子は１回目（初回刺激）および２回目（追加免疫）の投与で投与されうる。ある実施形態では、１回目の用量は１０^７〜１０^８ＴＵのレンチベクター粒子を含み、２回目の用量は１０^７〜１０^８ＴＵのレンチベクター粒子を含む。

１回目と２回目の投与の間、および投与とその後の投与との間の時間は変化しうる。ある実施形態では、投与間の時間は２〜６週間である。様々な実施形態では、投与間の時間は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、３０または５２週間である。様々な実施形態では、投与間の時間は、少なくとも１、３、６、９、１２、２４、３６または４８か月である。様々な実施形態では、投与間の時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０年である。

レンチウイルスベクター
本発明の文脈内では「レンチウイルスベクター」は、シス作用性レンチウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、トランスで提供されるレンチウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ）を必要とする導入遺伝子による宿主細胞の形質導入のための非複製ベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、機能性Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現を欠く。レンチウイルスベクターは、前記レトロウイルスベクターの作製または開発の段階に応じてＲＮＡまたはＤＮＡ分子の形態で存在してもよい。

レンチウイルスベクターは、プラスミドなどの組換えＤＮＡ分子の形態にあってもよい。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスおよび他のタンパク質の複合体内のＲＮＡ分子などのレンチウイルス粒子ベクターの形態であってもよい。典型的には、改変または組換えレンチウイルス粒子に相当するレンチウイルス粒子ベクターは、一本鎖ＲＮＡの２つのコピーからなるゲノムを含む。これらのＲＮＡ配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖ＤＮＡ配列（プロウイルスベクターＤＮＡ）からの転写により得ることができ、または形質転換された宿主細胞でのプラスミドＤＮＡ（プラスミドベクターＤＮＡ）の一過性発現から得ることができる。

好ましくは、レンチウイルスベクター粒子は組み込みのための能力を有する。よって、機能的なインテグラーゼタンパク質を含む。非組み込みベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子の組み込み能力のほとんどまたはすべてを排除する1または複数の変異を有する。例えば、非組込みベクター粒子は、組み込み能力の低下を引き起こすレンチウイルスpol遺伝子によってコードされたインテグラーゼに変異を含みうる。対照的に、組み込みベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子の組み込み能力のほとんどまたはすべてを排除する任意の変異を含まない機能的インテグラーゼタンパク質を含む。

レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来し、病原性に関与する遺伝的決定基を除去し、治療効果を得るのに有用な新たな決定基を導入するために改変される。

このようなベクターは、シスおよびトランス作用性配列の分離に基づく。複製欠損ベクターを生成するために、トランス作用性配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ遺伝子）を欠失させ、導入遺伝子をコードする発現カセットに置き換えることができる。

非分裂細胞への効率的な組み込みおよび複製は、通常、レンチウイルスゲノムの中心に２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらし、該フラップは、樹状細胞などの非分裂細胞の核孔での組み込み前複合体の脱コート、および核への発現カセットの効率的な移入のためのシグナルとして作用する。

１つの実施形態において、本発明は、特に、欧州特許出願ＥＰ ２ １６９ ０７３号に記載されているようなｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列と呼ばれるセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。

宿主細胞ゲノムへのベクタープロウイルスＤＮＡ配列の組み込みに関与する長末端反復配列（ＬＴＲ）などのさらなる配列は、通常はシスで存在する。ベクターは、例えば前記ＬＴＲのドメインＵ３（ΔＵ３）中のＬＴＲ配列を変異させて得ることができる（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０〜７頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１２）：９８７３〜８０頁）。

好ましくは、ベクターはエンハンサーを含有しない。１つの実施形態において、本発明は、３’ＬＴＲ中のプロモーターおよびエンハンサー配列を除去している変異Ｕ３領域（ΔＵ３）を好ましくは有するＬＴＲ配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。

パッケージング配列Ψ（プサイ）も、ポリヌクレオチド配列のキャプシド形成を助けるためにベクター粒子に取り込むことができる（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１（９）：１８５９〜７４頁；Ｐａｓｃｈｅｎら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １２（６）：１９６〜２０３頁）。

１つの実施形態において、本発明は、レンチウイルスパッケージング配列Ψ（プサイ）を含むレンチウイルスベクターを包含する。

トランスポートＲＮＡ結合部位もしくはプライマー結合部位（ＰＢＳ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ＰｏｓｔＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）などのさらなる追加の機能性配列も、インビボで導入遺伝子のより安定な発現を得るために、有利には本発明のレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に含まれてもよい。

１つの実施形態において、本発明は、ＰＢＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。１つの実施形態において、本発明は、ＷＰＲＥおよび／またはＩＲＥＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。

ゆえに、好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、１つのΨ配列、１つの（好ましくは２つの）ＬＴＲ配列、およびβ２ｍまたはクラスＩ ＭＨＣプロモーターの転写制御下に、好ましくは配列番号２０のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む発現カセットを含む。

プロモーター
様々な実施形態において、プロモーターは最大の免疫応答を誘発するために、樹状細胞などの抗原提示細胞において高い発現を駆動する。好ましくは、プロモーターは、誘発される免疫応答によって除去するのに十分な他の形質導入された細胞種における発現を駆動する。最も好ましくは、プロモーターは、挿入の影響を回避するためにエンハンサーエレメントを欠いている。

最も好ましくは、プロモーターはＣＭＶプロモーター／エンハンサーではない。好ましくは、プロモーターはデクチン−２ないしはＭＨＣＩＩプロモーターではない。

様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、β２ｍまたはＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。好ましくは、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、ＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーター、ＨＬＡ−Ｃｗ５プロモーター、ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｅプロモーターである。様々な実施形態において、プロモーター配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のプロモーター配列と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。

本発明は、エンハンサーを含有しないプロモーターを含むレンチウイルスベクターを包含する。

本発明は、レンチウイルスベクターへのＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）またはβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターの挿入を包含する。本明細書で使用されるとき、「ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーター」または「β２ミクログロブリンプロモーター」は、自然発生または合成のＭＨＣクラスＩプロモーターまたはβ２ミクログロブリンプロモーターを含む。「ＭＨＣクラスＩプロモーター」なる用語は、β２ｍプロモーターを含まない。

プロモーターは天然に生じるプロモーターであってよい。自然発生プロモーターの例は、ヒトβ２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ遺伝子プロモーターである。これらの自然発生ＭＨＣＩプロモーターは通常、ＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子、またはゲノムデータベース（例えば：ＮＣＢＩポリヌクレオチドデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／ｄｎａ−ｒｎａ）中のこのようなタンパク質を推定的にコードすると見なされる遺伝子のプロモーター領域からクローン化または複製される。β２ｍおよびクラスＩ ＭＨＣタンパク質は両方とも、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に進入する。

これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、ほぼ全ての細胞タイプにおいて見出される。ＭＨＣＩタンパク質は通常、白血球の膜の表面に存在し、ここでβ２ミクログロブリン（β２ｍ）と結合する。これらの結合タンパク質の役割は、内因性供給源由来のペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することである。これらはゆえに、抗原特異的免疫応答の生成に中心的な役割を果たす。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、多年の間広く研究および記載されてきたため、この遺伝子は十分に特徴付けされ、およびＢＬＡＳＴ方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３〜４１０頁）などの配列比較ツールを用いて検出可能である。

ＭＨＣクラスＩプロモーターは、樹状細胞を含む抗原提示細胞中で強力に活性化される能力のほか、他のヒト体組織の大部分において強度を低下させる能力を共有する。

本発明のプロモーターは、１つまたは複数のＳｐ１およびＥＴｓ結合部位などのさらなる調節エレメントを含有することができる。好ましい実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、２つのＳｐ１結合部位および１つのＥｔｓ結合部位を含有する。他の実施形態において、Ａｐ１および／またはＡｐ２部位がプロモーターにさらに含有される。

好ましいプロモーターは、自然発生のヒトβ２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｆプロモーターである。

プロモーターはまた、合成であってもよい。合成プロモーターには、プロモーターの個々の成分を会合するために分子生物学的手法を用いて合成されるプロモーター、または分子生物学的手法を用いる自然発生プロモーターに由来するプロモーターが含まれる。

様々な実施形態において、合成プロモーターは、β２ｍまたはＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターのプロモーター配列（例えば、配列番号：１〜６）と９０％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９９％を超える同一性、または１００％を共有するポリヌクレオチド配列を含む。

ある実施形態では、本発明は、β２ｍまたはＭＨＣクラスＩプロモーターをレンチウイルスベクターに挿入して導入遺伝子の発現を駆動することを含む方法であって、このとき当該導入遺伝子が、好ましくはＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ、ＨＴＬＶ−１ ｂＺＩＰ因子（ＨＢＺ）、および／またはアクセサリータンパク質Ｐ１２ＩおよびＰ３０ＩＩ抗原をコードし、最も好ましくは配列番号６６のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号６６のアミノ酸配列からなる、方法を包含する。当該方法は、ＤＮＡ ｆｌａｐ配列などの本明細書中に記載するいずれかの他の核酸エレメントを挿入することをさらに含みうる。

導入遺伝子
本発明の文脈内で「導入遺伝子」は、レンチウイルスベクターで形質導入される細胞に普通は存在しない、レンチウイルスベクター内の核酸配列である。レンチウイルスベクターは、形質導入細胞にこの配列を導入するのに役立つ。「導入遺伝子」なる用語は、導入遺伝子の形質導入を促進するようなベクターの配列を含まない。導入遺伝子は、別の生物由来の核酸配列であってもよい。あるいは、導入遺伝子は、同じ生物由来であるが、発現を制御する異なる調節配列を有する核酸配列であってもよい。導入遺伝子は、センスまたはアンチセンス核酸分子であってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、導入遺伝子配列は抗原または免疫原性ポリペプチドをコードする。

好ましくは、抗原または免疫原性ポリペプチドは、ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ、ＨＴＬＶ−１ ｂＺＩＰ因子（ＨＢＺ）、および／またはアクセサリータンパク質Ｐ１２Ｉおよび／またはＰ３０ＩＩ抗原または免疫原性ポリペプチドである。好ましくは、ポリエピトープを形成するいくつかのエピトープは、本発明の導入遺伝子によってコードされる。様々な実施形態において、導入遺伝子は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４〜配列番号２１によってコードされる少なくとも１、２、３または４の抗原を含む。

好ましくは、抗原または免疫原性ポリペプチドは、ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むか、またはＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質からなる。

特に好ましいＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質は以下のアミノ酸配列を含む。
MPKTRRRPRRSQRKRPPTPWQPPPFSLQGLHLAFQLSSIAINPQLLHFFFPSTMLFRLLSPLSPLALATSAAFFSARLLRRALTMLIISPLPRVWTEMAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVDGRVIGSALQFLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPITHTTPNIPPSFLQAMRKYSPFRNGYMEPTLGQHLPTLSFPDPGLRPQNLYTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFCHPGQLGAFLTNVPYKRIEKLLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQNGLLPFHSTLTTPGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSHGLIQYSSFHNLHLLFEEYTNIPISMLFRCLPVSCPEDLLVEELVDGLLSLEEELKDKEEEKAVLDGLLSLEEESRGRLRRGPPGEKAPPRGETHRDRQRRAEEEREKEEEKQIAEYLKRKEEEKAREKKAADVARRKQEEQER （配列番号６６）

ＢおよびＴ細胞ベースの免疫応答はいずれも同じ抗原によって誘発されうる。

レンチウイルスベクター粒子の作製
本発明は、好ましくはエンハンサー配列を含まないが、代わりにβ２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターを含有するレンチウイルス粒子ベクターの作製方法を提供する。レンチウイルス粒子ベクター（またはレンチウイルスベクター粒子）は、ウイルスタンパク質に関連してレンチウイルスベクターを含む。該ベクターは、好ましくは組み込みベクターである。

遺伝子発現を駆動するための従来技術ベクターにおいて使用されるウイルスエンハンサー配列を、エンハンサーを含有しないβ２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターと置換することは、
１）エンハンサー配列に連結した挿入変異のリスクを減少させることによって；および
２）免疫応答を導入遺伝子の産物に対して誘発して、どんな細胞種であれベクターが組み込まれた細胞をすべて免疫系により排除することによって、組み込みレトロウイルスベクターの安全性を向上させ得る。ゆえに、一定の期間後、人体はこのようなベクターのいかなる複製物も含有し得ない。

この方法の１つの実施形態によれば、レンチベクター粒子は、ＤＮＡプラスミドで形質転換された宿主細胞において得られる。このようなＤＮＡプラスミドは、
−細菌複製起源（例えば：ｐＵＣ ｏｒｉ）、
−選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えば：ＫａｎＲ）、およびより特定すると
−β２ｍまたはＭＨＣクラスＩプロモーターに転写的に連結された少なくとも１つの導入遺伝子を含むレンチウイルスベクター
を含み得る。

このような方法は、以下のステップ：
ｉ）適切な宿主細胞にレンチウイルスベクターをトランスフェクトするステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に、レトロウイルス（好ましくはレンチウイルス）の少なくとも構造活性およびポリメラーゼ（＋インテグラーゼ）活性をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターをトランスフェクトするステップと（このようなパッケージングプラスミドは当技術分野で記載されている（Ｄｕｌｌら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２（１１）：８４６３〜７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１２）：９８７３〜８０頁））、
ｉｉｉ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記トランスフェクト宿主細胞を培養するステップと、
ｉｖ）前記培養宿主細胞におけるステップｉｉｉ）の発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含む、本発明による組換えベクター粒子の作製を可能にする。

種々の理由のため、得られたレトロウイルス粒子をシュードタイピングする、すなわち特異的粒子エンベロープタンパク質を付加または置換することが有用であり得る。例えば、これは、組換え粒子を天然粒子または他の組換え粒子と区別するために、異なるエンベロープタンパク質を有するのに有利であり得る。ワクチン接種戦略の問題において、この後者がレンチウイルスに対して既に免疫を生じた場合、シュードタイピングされた粒子ベクターは免疫系を免れる可能性が高い。疾患に対して患者を免疫するのに類似の粒子ベクターの連続注射が必要とされる場合、これは特に有用である。

本発明のレトロウイルス粒子をシュードタイピングするために、宿主細胞は、ウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする１つまたはいくつかのエンベロープＤＮＡプラスミドでさらにトランスフェクトされ得る。

適切な宿主細胞は、好ましくは、例えばＨＥＫ細胞系のようなヒト培養細胞系である。

あるいは、ベクター粒子の作製方法は、ゲノムが１つまたは複数の以下の成分、すなわち、レンチウイルスベクターＤＮＡ配列、パッケージング遺伝子、およびエンベロープ遺伝子で安定に形質転換されている宿主細胞において実施される。このようなＤＮＡ配列は、ベクター配列の転写を可能にし、および粒子産生速度を向上させる追加のプロモーターを含む本発明によるプロウイルスベクターに類似していると見なすことができる。

好ましい実施形態において、宿主細胞は、全細胞を膨潤または死滅させることなしにウイルス粒子を培地中で連続的に産生することができるようにさらに改変される。ウイルス粒子を作製するためのこのような手法に関しては、Ｓｔｒａｎｇら、２００５、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９（３）：１１６５〜７１頁；Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２００５、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１（３）：４５２〜９頁；Ｓｔｅｗａｒｔら、２００９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１６（６）：８０５〜１４頁；およびＳｔｕａｒｔら、２０１１、Ｈｕｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒを参照することができる。

本発明のある目的物は、レンチウイルス粒子ベクターで形質転換された宿主細胞からなる。

レンチウイルス粒子ベクターは、以前に定義されているように、以下のエレメント：
−ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列と、
−β２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターの制御下の導入遺伝子配列、および場合により、上に記載された追加のエレメントの１つと
を含むことができる。

導入遺伝子を細胞で発現させる方法
本発明は、導入遺伝子を細胞、好ましくは非分裂細胞で発現させる方法を包含する。方法は、導入遺伝子の発現を可能にする条件下で、細胞を本発明のレンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターで形質導入するステップを含む。

細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。特に好ましいのはヒト非分裂細胞である。

導入遺伝子は、好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードする。方法はさらに、ポリペプチドを回収または単離するステップを含んでもよい。特に好ましいポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、および１５〜２１、最も好ましくは配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされるものである。

レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターは、好ましくはβ２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターを含む。

１つの実施形態において、本発明は、本発明の導入遺伝子をレンチウイルスベクターに挿入するステップと、導入遺伝子を含有するベクターで細胞を形質導入するステップとを含む、導入遺伝子の発現方法を包含する。

レンチウイルスベクターの治療的使用
本発明はさらに、エピトープ、より特にベクター中に存在する導入遺伝子によりコードされたエピトープに対する免疫学的反応の発生または改善を誘発するまたはこれに寄与することができる治療組成物またはワクチンを調製するための、本発明によるレンチウイルスベクター（特にはレンチウイルスベクター粒子の形態で）の使用に関する。

本発明はゆえに、特に筋肉内投与のための医薬品またはワクチンとして有用であるベクターを提供する。

これらのベクターは、感染症、特にはＨＴＬＶ−１ウイルス感染に伴う疾患の治療または予防に優先的に使用される。

本発明のベクターは、樹状細胞をより特異的に標的にして、これらの細胞における導入遺伝子により発現された抗原に関連する細胞媒介免疫応答および特にはＣＴＬ応答を得ることから、本発明のベクターは、ＨＴＬＶ−１を標的にするワクチンとして特に有用である。

したがって、本発明は、以前に定義されているようなレンチウイルスベクターを含む免疫原性組成物に関する。

本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、標的細胞へのベクターゲノムの核移入を誘発または刺激するように、ベクターおよびベクター粒子中にｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列を含有する。

逆転写中に、ｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列は、ＤＮＡ三重螺旋と呼ばれるＤＮＡベクター配列の核移入を刺激する３本鎖ＤＮＡ構造の形成を誘導する。好ましくは、ベクターは、導入遺伝子、ならびにレトロウイルスまたはレトロウイルス様起源の逆転写、発現およびキャプシド形成の調節シグナルを含み、組成物は、ベクター中に存在する導入遺伝子配列によりコードされた１つまたはいくつかのエピトープに対するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）および／またはＣＤ４応答を誘発または刺激することができる。

導入遺伝子の発現は、ベクターへのβ２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターの包含により大幅に向上される。

ゆえに、本発明によるレンチウイルスベクターは、記憶ＣＴＬ応答の発生を誘導し、改善する能力、または一般に記憶ＣＴＬ応答の発生に関連する能力を有する。換言すると、該ベクターは、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ応答または記憶応答の誘導、刺激、または該応答の発生への関与により、ＨＴＬＶ−１関連疾患を治療するための治療組成物の調製に使用することができる。

本発明のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを宿主に投与するステップと、宿主において導入遺伝子に対する特異的免疫応答を発生させるステップとを含む治療方法、および免疫応答の誘発方法において使用することができる。これらの宿主で発生した細胞および抗体は、診断試薬として使用することができる。

本発明によるレンチウイルスベクターは、好ましくは筋肉内投与のためであり、最も好ましくは針による注入による。

特定の実施形態において、本発明による免疫原性組成物は、細胞媒介免疫応答、特にはＣＴＬ媒介免疫応答を誘発し、改善し、または該応答の発生にインビボで関与するように、患者に直接投与することができる。

別の実施形態において、免疫原性組成物は、長期記憶細胞媒介応答の発生を可能にし得るように単回でまたは反復投与時に使用される。

本発明の免疫原性組成物の特定の利点は、目的とするヌクレオチド配列、またはベクターもしくはベクター粒子中に存在する導入遺伝子によりコードされた多数のエピトープに対する細胞媒介免疫応答を誘発または刺激するのに使用できることである。

本発明はまた、細胞応答を誘発する前記アミノ酸配列、および／または異なる抗原の２つのエピトープに対応する少なくとも２つの異なる配列を含有するアミノ酸配列の多数の反復（少なくとも２つの同一配列）をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターも包含する。特に好ましい抗原は、配列番号８、１０、１２、１４、および１５〜２１、最も好ましくは配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされるものである。

結果として、本発明は、ＨＴＬＶ−１関連疾患の治療のための予防的および／または治療的ワクチン接種プロトコルにおいて使用され得る組成物を包含する。

特に、該組成物は、アジュバント、他の免疫原性組成物、化学療法、または任意の他の治療的処置と組み合わせて使用することができる。

本発明は、機能的インテグラーゼタンパク質とレンチウイルスベクターとを含有するレンチウイルスベクター粒子を含んでなる、ヒトへの筋肉内投与のための組成物であって、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡが抗原の発現を駆動するβ２ｍまたはＭＨＣＩプロモーターを含む、組成物を包含する。特に好ましい抗原は、配列番号８、１０、１２、１４、および１５〜２１のヌクレオチド配列によってコードされるものである。

本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するための、レンチウイルスベクター粒子を含んでなる組成物であって、前記レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡがＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ抗原の発現を駆動するプロモーターを含み、前記ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ抗原が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる、組成物を包含する。

本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するための、レンチウイルスベクター粒子を含んでなる組成物であって、前記レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡがＨＴＬＶ−１ ＨＢＺ抗原の発現を駆動するプロモーターを含み、前記ＨＴＬＶ−１ ＨＢＺ抗原が、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる、組成物を包含する。

本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するための、レンチウイルスベクター粒子を含んでなる組成物であって、前記レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡがＰ１２Ｉ抗原（ｐ１２Ｉ Ａｇ）またはＰ３０ＩＩ抗原（ｐ３０ＩＩ Ａｇ）の発現を駆動するプロモーターを含み、前記Ｐ１２Ｉ抗原（ｐ１２Ｉ Ａｇ）またはＰ３０ＩＩ抗原（ｐ３０ＩＩ Ａｇ）が、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる、組成物を包含する。

本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するための、レンチウイルスベクター粒子を含んでなる組成物の使用であって、前記レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡが前記いずれかの抗原の発現を駆動するプロモーターを含み、前記抗原が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる、組成物の使用を包含する。

本発明は、ヒトへの筋肉内投与によって免疫応答を誘発するための、レンチウイルスベクター粒子を含んでなる組成物の使用であって、前記レンチウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡがＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含み、好ましくは前記抗原が、配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡによってコードされる、および／または配列番号６６のアミノ酸配列を有する、組成物の使用を包含する。

ゆえに、本発明の種々の実施形態を記載してきたが、本明細書における開示は例示のみであること、ならびに様々な他の代替、適合、および変更が本発明の範囲内で行われ得ることが当業者により留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に例証されている特定の実施形態に限定されない。

実施例１ 抗原
Ｔａｘ、ＨＢＺ、ｐ１２およびｐ３０ＩＩのウイルスタンパク質を用いて、ワクチン候補のためのＨＴＬＶ−１抗原を設計した。対応するＤＮＡコード化配列とエピトープの設計を以下に記載する。

Ｔａｘ配列
野生型コード化配列：atggcccacttcccagggtttggacagagtcttcttttcggatacccagtctacgtgtttggagactgtgtacaaggcgactggtgccccatctctgggggactatgttcggcccgcctacatcgtcacgccctactggccacctgtccagagcatcagatcacctgggaccccatcgatggacgcgttatcggctcagctctacagttccttatccctcgactcccctccttccccacccagagaacctctaagacccttaaggtccttaccccgccaatcactcatacaacccccaacattccaccctccttcctccaggccatgcgcaaatactcccccttccgaaatggatacatggaacccacccttgggcagcacctcccaaccctgtcttttccagaccccggactccggccccaaaacctgtacaccctctggggaggctccgttgtctgcatgtacctctaccagctttccccccccatcacctggcccctcctgccccatgtgattttttgccaccccggccagctcggggccttcctcaccaatgttccctacaaacgaatagaaaaactcctctataaaatttcccttaccacaggggccctaataattctacccgaggactgtttgcccaccacccttttccagcctgctagggcacccgtcacgctgacagcctggcaaaacggcctccttccgttccactcaaccctcaccactccaggccttatttggacatttaccgatggcacgcctatgatttccgggccctgccctaaagatggccagccatctttagtactacagtcctcctcctttatatttcacaaatttcaaaccaaggcctaccacccctcatttctactctcacacggcctcatacagtactcttcctttcataatttgcatctcctatttgaagaatacaccaacatccccatttctctactttttaacgaaaaagaggcagatgacaatgaccatgagccccaaatatcccccgggggcttagagcctctcagtgaaaaacatttccgtgaaacagaagtctga（配列番号７）

Ｔａｘタンパク質の主な活性領域：ａａ１−１６５、核局在化配列：ａａ４−１７４、Ｃｒｅｂ１との相互作用ドメイン：ａａ６７−１４７、ジンクフィンガードメイン：ａａ２１７−２４０、ＳＨ３結合ドメイン：ａａ２４１−２８５、ＣｒｅｂｂＰ／ Ｐ３００との相互作用ドメイン：ａａ３１６−３３３、Ｉｋｂｋｇとの相互作用ドメイン：ａａ３３７−７３８、ＮＦ−κＢとの相互作用ドメイン：ａａ３４６−４３５とａａ６３７−７４４、ホモ二量体化ドメイン：ａａ５６２−６０６、核輸送シグナル：ａａ８６５−９６６、トランス活性化ドメイン：ａａ９３４−９５７、Ｃｒｅｂｂ−Ｃｔｅｒとの相互作用ドメイン：ａａ１０４８−１０５９、ＰＤＺ結合ドメイン。

Ｔａｘ抗原（Ｔａｘ Ａｇ）
atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcc（配列番号８）

Ｔａｘ野生型（ＷＴ）から削除されたヌクレオチド配列：ａａ７３−１７４；ａａ９５５−１０５９。ＡＴＬ患者においてＴリンパ球を活性化することが見出された主なエピトープ：ａａ３１−６０；ａａ２６２−２８８；ａａ３９１−４３５；ａａ４５１−５０１；ａａ５２６−５８５；ａａ８１４−８４０；ａａ９０１−９２７（Ｋａｎｎａｇｉら、１９９２；Ａｒｎｕｌｆら、２００４；Ｓｕｚｕｋｉら、２０１２）。切断ないし欠失させた活性ドメイン：ａａ１−１６５、核局在化配列；ａａ４−１７４、Ｃｒｅｂ１との相互作用ドメイン；ａａ６７−１４７、ジンクフィンガードメイン；ａａ８６５−９６６、トランス活性化ドメイン；ａａ９３４−９５７、Ｃｒｅｂｂ−Ｃｔｅｒとの相互作用ドメイン；ａａ１０４８−１０５９、ＰＤＺ結合ドメイン。

ＨＢＺ配列
野生型コード化配列：atggcggcctcagggctgtttcgatgcttgcctgtgtcatgcccggaggacctgctggtggaggaattggtggacgggctattatccttggaggaagagttaaaggacaaggaggaggagaaagctgtgcttgacggtttgctatccttagaagaggaaagccgcggccggctgcgacggggccctccaggggagaaagcgccacctcgcggggaaacgcatcgtgatcggcagcgacgggctgaggagaagaggaagcgaaaaaaagagcgggagaaagaggaggaaaagcagattgctgagtatttgaaaaggaaggaagaggagaaggcacggcgcaggaggcgggcggagaagaaggccgctgacgtcgccaggaggaagcaggaagagcaggagcgccgtgagcgcaagtggagacaaggggctgagaaggcgaaacagcatagtgctaggaaagaaaaaatgcaggagttggggattgatggctatactagacagttggaaggcgaggtggagtccttggaggctgaacggaggaagttgctgcaggagaaggaggatttgatgggagaggttaattattggcaggggaggctggaggcgatgtggttgcaataa（配列番号９）

ＨＢＺタンパク質の主な活性領域：ａａ１−２４、転写活性化のためのＲＮＡ活性ドメイン；ａａ２５９−２７６、ａａ３４６−３６０およびａａ４１２−４２３、核局在化シグナル；ａａ４１８−５７６、ロイシンジッパーモチーフ。

ＨＢＺ抗原（ＨＢＺ Ａｇ）
atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacgg（配列番号１０）

ＨＢＺ ＷＴから削除されたヌクレオチド配列：ａａ１−２４；ａａ２５９−２７６；ａａ３４６−３６０；ａａ４１２−６２７。ＡＴＬ患者においてＴリンパ球を活性化することが見出された主なエピトープ：ａａ３７−１１１；ａａ１３３−１５９；ａａ１７２−１９８；ａａ２３２−２５８；ａａ３１０−３８１；ａａ４７５−６２１（ＭａｃＮａｍａｒａら、２０１０）。切断ないし欠失させた活性ドメイン：ａａ１−２４、転写活性化のためのＲＮＡ活性ドメイン；ａａ２５９−２７６、ａａ３４６−３６０およびａａ４１２−４２３、核局在化シグナル；ａａ４１８−５７６、ロイシンジッパーモチーフ。

Ｐ１２Ｉ／ｐ２７Ｉアイソフォーム配列
野生型コード化配列：atgcccaagacccgtcggaggccccgccgatcccaaagaaaaagacctccaacaccatggcagcctcctccgttcagcctccaaggactccacctcgccttccaactgtctagtatagccatcaatccccaactcctgcattttttctttcctagcactatgctgtttcgccttctcagccccttgtctccacttgcgctcacggcgctcctgctcttcctgcttcctcctagcgacgtcagcggccttcttctccgcccgcctcctgcgccgtgccttctcctcttccttccttttcaaatactcagcggtctgcttttcctcctctttctcccgctctttttttcgcttcctcttctcctcagcccgtcgctgccgatcacgatgcgtttccccgcgaggtggcgctttctcccctggagggccccgtcgcagccggccgcggctttcctcttctaa（配列番号１１）

ｐ１２Ｉ／ｐ２７Ｉアイソフォームタンパク質の主な活性領域：ａａ１８４−２４９およびａａ３０１−３６０、らせん状膜貫通ドメイン；ａａ２３５−２５２およびａａ３１９−３８７、ロイシンジッパー；ａａ１６９−１８３、ａａ２５６−２７３、ａａ３６７−３９０およびａａ４２１−４３８、ＳＨ３結合ドメイン。

Ｐ１２Ｉ抗原（ｐ１２Ｉ Ａｇ）
atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctg（配列番号１２）

＊ｐ１２Ｉ ＷＴから削除されたヌクレオチド配列：ａａ２０２−４５６。ＡＴＬ患者においてＴリンパ球を活性化することが見出された主なエピトープ：ａａ９１−１３８；ａａ１６９−１９５；ａａ２３５−２７９；ａａ３６４−４１１およびａａ４１５−４５６（Ｄｅｋａｂａｎら、２０００；Ｐｉｑｕｅら、２０００）。切断ないし欠失させた活性ドメイン：ａａ１８４−２４９およびａａ３０１−３６０、らせん状膜貫通ドメイン；ａａ２３５−２５２およびａａ３１９−３８７、ロイシンジッパー；ａａ２５６−２７３、ａａ３６７−３９０およびａａ４２１−４３８、ＳＨ３結合ドメイン。

Ｐ３０ＩＩ配列
野生型コード化配列：atggcactatgctgtttcgccttctcagccccttgtctccacttgcgctcacggcgctcctgctcttcctgcttcctcctagcgacgtcagcggccttcttctccgcccgcctcctgcgccgtgccttctcctcttccttccttttcaaatactcagcggtctgcttttcctcctctttctcccgctctttttttcgcttcctcttctcctcagcccgtcgctgccgatcacgatgcgtttccccgcgaggtggcgctttctcccctggagggccccgtcgcagccggccgcggctttcctcttctaaggatagcaaaccgtcaagcacagcttcctcctcctccttgtcctttaactcttcctccaaggataatagcccgtccaccaattcctccaccagcaggtcctccgggcatgacacaggcaagcatcgaaacagccctgcagatacaaagttaaccatgcttattatcagcccacttcccagggtttggacagagtcttcttttcggatacccagtctacgtgtttggagactgtgtacaaggcgactggtgccccatctctgggggactatgttcggcccgcctacatcgtcacgccctactggccacctgtccagagcatcagatcacctgggaccccatcgatggacgcgttatcggctcagctctacagttccttatccctcgactcccctccttccccacccagagaacctctaa（配列番号１３）

ｐ３０ＩＩタンパク質の主な活性領域：ａａ２１７−２３４およびａａ２７１−２９４、核局在化シグナル；ａａ５２３−５５２、ミトコンドリア標的シグナル。

Ｐ３０ＩＩ抗原（ｐ３０ＩＩ Ａｇ）
gccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag（配列番号１４）

ｐ３０ＩＩ ＷＴから削除されたヌクレオチド配列：ａａ１−８１；ａａ１２７−４５６；ａａ５０２−７２３。ＡＴＬ患者においてＴリンパ球を活性化することが見出された主なエピトープ：ａａ９１−１１７；ａａ４６６−４９２（Ｐｉｑｕｅら、２０００）。切断ないし欠失させた活性ドメイン：ａａ２１７−２３４およびａａ２７１−２９４、核局在化シグナル；ａａ５２３−５５２、ミトコンドリア標的シグナル。

実施例２ プラスミド構築
選択された抗原の異なるプラスミド構築は、直接融合されたかまたは２Ａ配列（acg cgt gcc cct gtg aag cag acc ctg aat ttc gat ctg ctg aag ctg gcc ggc gac gtg gag tct aat cct ggc cca act agt）によって分離された抗原を用いて行った。この２Ａ配列は、ポリペプチドのプロセスを補助すると思われるタンパク質分解の配列である（Ｌｕｋｅ、２００７）。異なる組み合わせは、最適化コドンで合成された、Ｔａｘ−ＨＢＺ、Ｔａｘ−２Ａ−ＨＢＺ、ＨＢＺ−Ｔａｘ、ＨＢＺ−２Ａ−Ｔａｘ、ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ、Ｔａｘ−ＨＢＺ−ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩおよびｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺである。抗原の組合せの発現は、ヒトβ２ミクログロブリンプロモーターの制御下にある。

試験したＨＴＬＶ−１抗原の異なる組み合わせの配列：
ＴＡＸ−ＨＢＺ
atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga （配列番号１５）

ＨＢＺ−ＴＡＸ ＣＯ
atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcctgatga （配列番号１６）

ＴＡＸ−２Ａ−ＨＢＺ
atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccacgcgtgcccctgtgaagcagaccctgaatttcgatctgctgaagctggccggcgacgtggagtctaatcctggcccaactagtatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga （配列番号１７）

ＨＢＺ−２Ａ−ＴＡＸ
atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggacgcgtgcccctgtgaagcagaccctgaatttcgatctgctgaagctggccggcgacgtggagtctaatcctggcccaactagtatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcctgatga （配列番号１８）

ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ
atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag （配列番号１９）

ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ−Ｔａｘ−ＨＢＺ
atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgagatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga （配列番号２０）

Ｔａｘ−ＨＢＺ−ｐ１２Ｉｐ３０ＩＩ
atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatgaatgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag （配列番号２１）

抗原を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＦｌａｐ−ＡＧ骨格にクローニングする。ｐＦＬＡＰ−ＡＧは、ｐＶＡＸ−１プラスミド（インビトロジェン社）のＳｐｅ１とＸｂａ１部位の間のｐＴＲＩＰΔＵ３−ＣＭＶ−ＧＦＰ（Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｌ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２、２６３−２６７頁）のプロウイルス領域を増幅し、クローニングすることによって作製した。得られたプラスミド、ｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰはＳＶ４０配列にて完結させ（ｐＴＲＩＰΔＵ３−ＣＭＶ−ＧＦＰから増幅し、Ｐｍｌ１部位の間にクローニングした）、ｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＳＶプラスミドとした。次いで、ＣＭＶプロモーターを除去し、ヒトβ２ミクログロブリンプロモーターにより置き換えた（ＭｌｕＩとＢａｍＨ１部位との間）。結果として生じた、抗原がＧＦＰマーカー（ＢａｍＨ１−ＸｈＩ部位）の代わりにクローニングされうるプラスミドを、ｐＦＬＡＰ−ＡＧと命名した。

Ｔａｘ＿Ａｇ−ＨＢｚ＿Ａｇ、ＨＢｚ＿Ａｇ Ｔａｘ＿Ａｇ、Ｔａｘ＿Ａｇ−ＨＢｚ＿Ｐ１２ＩＰ３０ＩＩおよびＰ１２ＩＰ３０ＩＩ−Ｔａｘ＿Ａｇ−ＨＢｚ＿Ａｇ。抗原は、ＧｅｎｅＡｒｔ（ライフテクノロジーズ社）からそれぞれ入手し、融合ＰＣＲを用いて一つに結合した。簡単に言えば、それぞれの抗原性コンストラクトのために、３つの別々のＰＣＲ反応を実施した。最初のＰＣＲで第一の抗原を増幅し、第二のＰＣＲで第一の抗原の末端と相同な２５ｂｐのオーバーハングを含む第二の抗原を増幅する。次いでＰＣＲ１と２の産物をゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、キアゲン社）、第三のＰＣＲのためのマトリックスとして用いる。ＰＣＲ１および２の産物をハイブリダイズし、全抗原の増幅のためのマトリックスを作成した。各コンストラクトの３回のＰＣＲに用いたプライマーを表１に示す。ＰＣＲ３の産物は、ゲル精製し、ＰＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社）にクローニングし、配列決定し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＦｌａｐ−ＡＧ骨格内の同じ部位間にクローニングした。

Ｔａｘ＿Ａｇ−２Ａ−ＨＢｚ＿ＡｇおよびＨＢｚ＿Ａｇ−Ｔａｘ＿Ａｇ。抗原は、ＧｅｎｅＡｒｔ（ライフテクノロジーズ社）からそれぞれ入手し、ＰＣＲを用いて一つに結合した。ここで、２つのＰＣＲ技術を用いて２つの抗原を構築した。第一に、２つの連続伸長ＰＣＲを用いて、第一の抗原の末端に２Ａペプチドの最初の５０ヌクレオチドを追加し、２つの連続伸長ＰＣＲを用いて、第二の抗原の始まりに２Ａペプチドの最後の５０ヌクレオチドを追加した。２つの抗原は２４ヌクレオチドを共通して持つので、融合ＰＣＲを用いて、最終的な抗原を再構築した（融合ＰＣＲの説明については上記参照）。 ＰＣＲに用いたプライマーを表２および３に示す。最終ＰＣＲ産物は、ゲル精製し、ＰＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（ライフテクノロジーズ社）にクローニングし、配列決定し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＦｌａｐ−ＡＧ骨格内の同じ部位間にクローニングした。

Ｐ１２ＩＰ３０ＩＩ。コドン最適化Ｐ１２ＩＰ３０ＩＩは、ＧｅｎｅＡｒｔ（ライフテクノロジーズ社）から購入し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を用いてｐＦｌａｐ−ＡＧ内に直接クローニングした。

用いたプライマーの配列を表１、２および３に示す。

表１。抗原性コンストラクトを増幅するために実現された３回のＰＣＲに用いたプライマー。太字の配列は、第一抗原の末端に相補性がある５’オーバーハングを表す。

表２。連続伸長ＰＣＲに用いたプライマー。

表３。全抗原性コンストラクトを増幅するために実現された融合ＰＣＲに用いたプライマー。

実施例３ レンチウイルスベクター製造
レンチベクターは、基本的にはＮａｌｄｉｎｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７頁に記載されるように、共トランスフェクションにより、試験するＨＴＬＶ−１抗原を含むプラスミド、キャプシド形成プラスミド、ＶＳＶ．Ｇエンベロープを提供するプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージ化した。

実施例４ 免疫モニタリング
ＨＴＬＶ−１抗原の各組み合わせについて特異的Ｔ細胞応答をモニタリングするために、ＨＴＬＶ−１抗原の発現がヒトβ２ミクログロブリンプロモーターにより駆動される、１×１０^６ＴＵ、１×１０^７ＴＵおよび１×１０^８ＴＵのレンチベクターを用いて筋肉内投与によりＣ５７ＢＩ／６ｊマウスを免疫化した。免疫化の１４日後、脾臓細胞を、レンチベクターで免疫したマウス脾臓から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。９６ウェル組織培養プレート（ミリポア社）を、１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮγ ｍＡｂ（マウスＩＦＮγ Ｅｌｉｓｐｏｔペア；ＢＤバイオサイエンシーズ ファーミンジェン社）を用いて一晩、４℃でコーティングした。プレートを２００μｌ ＤＰＢＳ／ウェルで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ培地／１０％ウシ胎仔血清で２時間、３７℃でブロックした。プレートを２００μｌ ＤＰＢＳ／ウェルで３回洗浄した。脾臓細胞を１×１０^５細胞／ウェルで３通りにプレートに添加し、２μｇ／ｍｌの刺激性ペプチドのプール（抗原に特異的な）、コンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ；供給源）、または培地単独で刺激した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、次いで２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ２０で３回、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳで３回すすいだ。検出のため、１０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮγ−ビオチン化モノクローナル抗体（ＢＤファーミンジェン社）を室温で２時間添加した。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ロッシュ社）を室温で９０分間、ダルベッコＰＢＳで１：２０００に希釈した。プレートを洗浄後、スポット（ＩＦＮγ分泌細胞）を１００μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（シグマ社）を添加して可視化した。プレートを青いスポットが生じるまで室温で１５〜３０分間インキュベートし、次いで水道水でよく洗浄し、２４時間風乾した。スポットをＡＩＤ読み取り機（オートイムノダイアグノスティカ社、ドイツ）を用いてカウントした。コントロールウェル（ペプチドを含まない培地中で培養したもの）から減算した後、３通りのウェルから１００万当たりのＩＦＮｇスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均数を算出した。ワクチン接種に用いるＨＴＬＶ−１完全配列をカバーする重複合成ペプチドを用いた（ジェンスクリプト社）。

実施例５ インビトロ発癌性試験
細胞培養
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ；ＡＴＣＣ参照番号ＳＣＲＣ−１００８）は、１０回連続して継代した後自然発生的に不死化（ＭＥＦｉ）にした。それらは、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（ハイクローン社、ニュージーランド）、２ｍＭグルタミン（ライフ社、フランス）、１００単位／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ社、フランス）、１ｍＭナトリウム−ピルビン酸（ライフ社、フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で培養した。

形質導入
ウェル当たり１０００００細胞を６ウェルプレート（マルチウェルＴＣプレート、ファルコン社、フランス）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２加湿雰囲気で４時間接着させた。次いで、それらは、４μｇ／ｍＬの臭化ヘキサジメトリン（シグマ社、フランス）を添加したＭＯＩ１０のレンチウイルスＧＦＰ、ＴＨＶ０２、ＷＴ ＴＡＸ、ＷＴ ＨＢＺまたはＷＴ Ｐ１２ベクターを用いて、はじめ２時間、その後１６時間で、２回形質導入した。翌日培養培地を除去し、形質導入した細胞をレンチベクターを含まない培地中で２日間生育した。コントロールＧＦＰ形質導入細胞の写真は、緑色蛍光顕微鏡（オリンパスＣＫＸ４１）を用いて撮影し、形質導入効率を観察した。

コロニー形成アッセイ
ＭＥＦｉ細胞および形質導入ＭＥＦｉ細胞は、ＴＲＹＰＬＥセレクト（ライフ社、フランス）によりレンチベクターを含まない培養培地中で３日後にトリプシン処理し、数をカウントし、０．８％アガロース（ライフ社、フランス）にてコートした２４ウェル白色プレート（ベルトールド社、フランス）中完全培地（ライフ社、フランス）を添加した０．４％軟寒天中に含めた。基準曲線を生成するために、０〜３２０００個の非形質導入ＭＥＦｉ細胞を播種し、一方で８０００個の形質導入ＭＥＦｉ細胞を播種した。細胞を２１日間増殖させ、潜在的なコロニー形成をモニターした。すべての実験は、２つの独立した実験を用いて２通り行った。

コロニーの顕微鏡評価
すべてのプレートウェルは、オリンパスＣＫＸ４１顕微鏡により明視野条件で試験し、１０Ｘ／０．２５レンズとＸＣ３０カメラＡｎａｌｙＳＩＳ ｇｅｔＩＴソフトウェアを使用して記録した。コロニーは、計数した細胞が１０よりも多いものと定義した。

細胞生存率は、オリンパスＣＫＸ４１顕微鏡を用いて蛍光灯の下でＣｙＱｕａｎｔ直接細胞増殖アッセイ（下記参照）で観察した。

細胞増殖アッセイ
ＣｙＱｕａｎｔ直接細胞増殖アッセイ（ライフ社、フランス）を製造業者の推奨に従って実施し、生細胞と生存クローン原性細胞を計数することによってＡｎａｌｙＳＩＳ ｇｅｔＩＴソフトウェアを用いて分析した。

Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ＡＴＰ生物発光アッセイ（プロメガ社、フランス）は、含まれる細胞のより良好な溶解のための培養持続時間（３７℃、１時間）を除いて、製造業者の説明書に従って実施した。Ｔｒｉｓｔａｒ２マルチモードリーダー（ベルトールド社、フランス）を用いて分析を行った。範囲内の生物発光強度が０〜少なくとも１６０００細胞へ線形であった場合に、アッセイは有効であるとみなした。

増幅曲線は、４〜５日ごとに１か月間細胞をカウントすることにより行った。細胞は、ＴｒｙｐＬＥセレクト（ライフ社、フランス）によりトリプシン処理し、Ｎｕｃｌｅｃｏｕｎｔｅｒカセット（ザルトリウス社、フランス）で計数した。その後、それらをＴＣフラスコＴ１６２（コーニング社、フランス）に５０００００細胞で播種し、３７℃および５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で培養した。

ＤＮＡ抽出とｑＰＣＲ
形質導入の４日後、１〜２．１０^６個の細胞をトリプシン処理し、４５０ｇで遠心分離してペレット化し、製造業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＤＮＡ抽出ミニキット（キアゲン社、フランス）を用いて抽出した。

ｑＰＣＲを用いて、ＤＮＡ１ｎｇ当たりのｆｌａｐの組み込まれたコピー数を測定した。ｆｌａｐプライマーおよび特定のＦＡＭプローブを用いてＣＦＸ−９６（バイオラド社、フランス）の内部手続きに従ってｑＰＣＲを実施した。用いた配列は、TGG AGG AGG AGA TAT GAG GG （Ｆｗ）（配列番号６７）、CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA （Ｒｖ）（配列番号６８）、およびFAM- AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ2（プローブ）（配列番号６９）であった。

Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモサイエンティフィック社、フランス）を用いてＤＮＡの濃度を測定した。

ＲＮＡ抽出とｑＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ抽出（マシュレナーゲル社、フランス）を使用してＭＥＦｉおよびＭＥＦｉ ＴＨＶ０２形質導入細胞から抽出し、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ライフ社、フランス）にて逆転写し、ＣＦＸ−９６（バイオラド社、フランス）の製造者の指示に従ってＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（バイオラド社、フランス）にて増幅した。ＴＨＶ０２を検出するために用いたプライマー配列は、TCATCTTCCACAAGTTCCAGAC（フォワード）（配列番号７０）およびGATAGGGATGTTGGTGTACTCTTC（リバース）（配列番号７１）とした。増幅産物はバイオラド社ＣＦＸ−Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア上でリアルタイムに可視化した。

実施例６ インビボ発癌性試験
ＣＩＥＡ ＮＯＧ免疫不全マウスはタコニック社から購入した。受け取り時に動物を分離し、５匹の動物群に収容し、１週間馴化した。馴化後、動物を試験群に無作為に区分した。すべての動物は試験開始時に７週齢であった。本試験は、コントロール群（非処置マウス）と３つの処置群（ＨＴＬＶ−１．ＶＰＸベクター、Ｅｍｐｔｙ．ＶＰＸベクターおよびプラセボ群−ＰＢＳラクトース）からなる。各群は７匹のマウスを含み、動物は３か月間観察した。レンチウイルスベクターおよびプラセボはそれぞれ、最大達成可能な用量の試験ベクターを筋肉内投与した。２．０８×１０^７ＴＵ／マウスのＨＴＬＶ−１．ＶＰＸベクターおよび３．５３×１０^８ＴＵ／マウスのＥｍｐｔｙ．ＶＰＸベクター。すべての試験動物は、一般的な身体状態と行動について毎週観察し、観察結果を記録した。詳細な身体検査は各動物について週間隔で行い、毛皮の状態、筋緊張、呼吸、運動および姿勢などのパラメータの異常な変化を評価した。動物は、外部触知可能な腫瘍の存在について試験した。体重および摂餌量を評価した。試験の終了時に動物は剖検し、組織はその後の組織病理学的評価のために固定した。

実施例７ インビボ生物発光／発現試験
ＣＩＥＡ ＮＯＧ免疫不全マウスはタコニック社から購入した。受け取り時に動物を分離し、４または５匹の動物群に収容し、２週間馴化した。馴化後、動物を試験群に無作為に区分した。すべての動物は試験開始時に５週齢であった。本試験は、コントロール群（非処置マウス）と２つの処置群（ＨＴＬＶ−１．ルシフェラーゼベクター、ルシフェラーゼベクター）からなる。各群は１９匹のマウス（処置マウス）と１７匹のマウス（未処理マウス）を含む。動物は３か月間観察した。レンチウイルスベクターはそれぞれ、最大達成可能な用量の試験ベクターを筋肉内投与した。２．９８×１０^８ＴＵ／マウスのＨＴＬＶ−１．ルシフェラーゼベクターおよび５．５６×１０^７ＴＵ／マウスのルシフェラーゼベクター。すべての試験動物は、一般的な身体状態と行動について週ごとに観察し、観察結果を記録した。詳細な身体検査は各動物について週間隔で行い、毛皮の状態、筋緊張、呼吸、運動および姿勢などのパラメータの異常な変化を評価した。動物は、外部触知可能な腫瘍の存在について試験した。体重および摂餌量を評価した。試験の終了時に動物は剖検し、組織はその後の組織病理学的評価のために固定した。

インビボでの生物発光の撮像および定量化：光を通さないカメラボックス（ＩＶＩＳスペクトラム、ゼノジェン社）内に取り付けられた超高感度冷却ＣＤＤカメラを用いて測定を行った。生物発光シグナルの撮像および測定値を取得し、リビングイメージソフトウェア２．５（ゼノジェン社）を用いて分析した。画像化のために、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、腹腔内注射を介して１５ｍｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン２００μＬ（キャリパーライフサイエンス社）を投与した。Ｄ−ルシフェリン注射の１分後に撮像した。

Claims (6)

1. ヒトへの筋肉内投与によって、ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドに対する免疫応答の誘発のための、レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、
   前記レンチウイルスベクター粒子はレンチウイルスベクターを含み、
   前記レンチウイルスベクターのＤＮＡは、ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする配列と、前記ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターとを含む、組成物。
2. 前記レンチウイルスベクターがβ２ｍプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記レンチウイルスベクターがＭＨＣクラスＩプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質をコードする配列が、配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記ＨＴＬＶ−１ ｐ１２ｐ３０−Ｔａｘ−ＨＢＺ融合タンパク質が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 少なくとも１０^７レンチウイルスベクター粒子を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。