CN118354790A - 用于表达人乳头瘤病毒(hpv)抗原的慢病毒载体及其在治疗hpv诱发癌症中的应用 - Google Patents
用于表达人乳头瘤病毒(hpv)抗原的慢病毒载体及其在治疗hpv诱发癌症中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及慢病毒载体，特别是非整合型慢病毒载体，其包含编码HPV抗原的至少四种不同核酸序列，涉及包含所述载体的慢病毒载体颗粒，涉及包含其的分离的细胞，以及涉及包含所述慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞的疫苗组合物。本发明进一步涉及它们在治疗或预防HPV诱发的癌症中的应用。
Description
发明领域
本发明涉及重组疫苗技术领域，并且涉及慢病毒载体的改进，其可用作治疗性和预防性疫苗。具体地，本发明涉及表达人乳头瘤病毒(HPV)抗原的慢病毒载体及其在预防和治疗HPV诱发的癌症中的应用。
发明背景
HPV导致全世界5.2％的癌症(Tota等人,Prev Med 2011Oct；53Suppl 1:S12-21)。已鉴定出100多种HPV类型，并根据其与癌症的关联性将其分为3组：具有高致癌潜力的高风险类型(包括HPV 16型(HPV-16)和HPV 18型(HPV-18))，与良性病变相关的低风险型(HPV-6、-11)和皮肤型(包括HPV-1、-2、-3、-4……)(Chen等人Virology vol.516(2018):86-101)。HPV相关癌症的比例因癌症类型和地理位置而异，但据估计，90％的宫颈癌、91％的肛门癌、75％的阴道癌、70％的口咽癌、69％的外阴癌和63％的阴茎癌与HPV感染相关(Saraiya等人,J Natl Cancer Inst.2015Apr 29；107(6)))。
癌症中最常见的两种HPV类型是HPV 16和HPV 18。例如，HPV 16和HPV 18被认为与所有宫颈癌中的70-75％有关(de Sanjose等人,Eur J Cancer.2013Nov；49(16):3450-61)。HPV 16和18还主要涉及肛门癌(91％)、口咽癌(70％)、阴道癌(75％)、阴茎癌(63％)和外阴癌(68％)(Saraiya等人,J Natl Cancer Inst.2015Apr 29；107(6))。
因此，靶向HPV 16/18的治疗性疫苗有可能用于治疗和预防相关癌症，无论其位置如何。
人乳头瘤病毒(HPV)是无包膜双链DNA病毒。它们的基因组编码六种非结构蛋白(早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7)和两种结构蛋白(晚期蛋白L1和L2)(Chen等人Virologyvol.516(2018):86-101)。
在这些蛋白质中，E6和E7的致癌性已得到充分表征。已知它们使p53和pRb肿瘤抑制蛋白失活，从而促进细胞增殖。E6/E7致癌基因对于HPV相关恶性细胞转化的诱导和HPV阳性癌细胞的致癌表型的维持至关重要(Yim and Park,Cancer Res Treat.2005Dec；37(6):319-24)。E6和E7蛋白在所有HPV阳性细胞的感染过程中表达，这一观察结果使它们成为疫苗的完美靶点。
重组病毒载体已被广泛开发用于疫苗接种目的。病毒基因组的修饰允许产生无毒和非传染性的病毒颗粒，其可以用作将遗传物质引入靶细胞的工具。使用重组病毒载体引发T细胞介导的免疫是一种非常有前途的疫苗接种方法。已针对疫苗接种目的评估了多种病毒载体，包括逆转录病毒载体、腺病毒载体和痘苗病毒载体(Milone and O’Doherty,Leukemia(2018)32:1529-1541和Ku等人,Expert Review of Vaccines(2021))。慢病毒属于逆转录病毒科，其包括人类免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒载体主要源自HIV-1。已通过去除LTR U3序列提高了其安全性，从而实现“自我失活”载体，其完全不含病毒启动子和增强子序列。慢病毒载体已成为有前途的工具，因为它们与其他病毒系统相比表现出多种优势。特别是，慢病毒载体没有毒性，并且与其他逆转录病毒不同，能够转导非分裂细胞，特别是树突状细胞(He等人2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)，从而允许通过内源途径持续呈递抗原。
与其他常用的病毒载体相反，慢病毒载体具有转导非分裂细胞的能力。非分裂细胞中的有效转导需要形成被称为中央DNA“瓣”的三链DNA结构，该结构最大限度地提高基因导入非分裂细胞(包括树突状细胞(DC))的细胞核的效率(Arhel等人,EMBO J.2007Jun 20；26(12):3025-3037)(Zennou等人,Cell.2000Apr 14；101(2):173-85)。
树突状细胞(DC)对于抗原呈递至关重要，因为它们构成抗原呈递细胞(APC)的主要类别，其主要功能是呈递抗原并启动免疫反应(Steinman,R.,Banchereau,J.Nature449,419-426(2007))。成熟的DC迁移至引流淋巴结，并在那里通过主要组织相容性复合物(MHC)分子在表面呈递抗原衍生的短肽。然后，淋巴结中存在的抗原特异性T细胞可以通过TCR(T细胞受体)与肽-MHC复合物相互作用。特定TCR对肽-MHC的识别结合共刺激信号启动T细胞激活(Steinman,R.,Banchereau,J.Nature 449,419-426(2007))。
本发明的目的是提供用于预防和治疗HPV诱发的癌症的治疗性和预防性疫苗。
已经描述了使用整合酶缺陷型慢病毒载体(表达与钙网蛋白(CRT)融合的非致癌HPV 16E7)的针对高风险人乳头瘤病毒的治疗性疫苗接种(Grasso等人,Int JCancer.2013Jan 15；132(2):335-44)。这些测试是针对早期肿瘤进行的，并显示该构建体能够在合理但不完美数量的疫苗接种小鼠中根除所述肿瘤。
因此，本领域仍然需要治疗由HPV诱发的更具侵袭性和/或良好植入的肿瘤，本领域已知这些肿瘤比小的和早期肿瘤更难以消除。
还需要治疗由HPV诱发的抗性肿瘤，即特征在于它们被调节性T细胞(Treg)强烈浸润的肿瘤。
此外，需要一种治疗性疫苗，其允许CD8+和CD4+细胞浸润到待治疗的HPV诱发的肿瘤中，同时减少所述肿瘤中的Treg。
还需要产生针对HPV、特别是针对PDHPV抗原、更特别是针对HPV 16和HPV 18抗原的强免疫记忆。
还需要产生针对HPV诱发的癌症的新型安全、非致癌、预防性和治疗性疫苗。
还需要一种疫苗，其在施用单剂后量能够完全消除原发性肿瘤并提供针对复发的强有力的保护。
本发明的目的在于满足上述需要。
发明概述
因此，本发明涉及以下项目：
第1项：慢病毒载体，特别是非整合型慢病毒载体，包含选自以下的至少四种不同核酸序列：
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，以及
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列。
如实施例中所示，本发明的慢病毒载体对HPV诱发的肿瘤具有强的治疗和预防活性。
第2项：根据第1项所述的慢病毒载体，其中编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，该核酸序列特别选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
第3项：根据第1项或第2项所述的慢病毒载体，其中编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV16)蛋白E7抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少68％序列同一性的氨基酸序列，该核酸序列特别选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
第4项：根据第1至3项中任一项所述的慢病毒载体，其中编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：24所示的氨基酸具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，该核酸序列特别选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
第5项：根据第1至4项中任一项所述的慢病毒载体，其中编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：33所示的氨基酸具有至少83％序列同一性的氨基酸序列，该核酸序列特别选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32。
第6项：根据第1至5项中任一项所述的慢病毒载体，其中编码抗原的至少四种不同核酸序列融合在一起，形成在单一启动子序列控制下编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列。
第7项：根据第1至6项中任一项所述的慢病毒载体，其中至少四种不同核酸序列从5'端至3'端的顺序选自以下：
(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列；
(b)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列；
(c)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列；和
(d)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列。
第8项：根据第1至7项中任一项所述的慢病毒载体，其中至少四种不同核酸序列从5'末端至3'末端的顺序是(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列。
第9项：根据第1至8项中任一项所述的慢病毒载体，其包含编码与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列特别是核酸序列SEQ ID NO：41。
第10项：根据第1至9项中任一项所述的慢病毒载体，选自在CNCM提交的保藏号为I-5759、I-5760、I-5761和I-5762的非整合型慢病毒载体，和特别是在CNCM提交的保藏号为I-5759的非整合型慢病毒载体。
第11项：根据第1至10项中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含MHC I类启动子，特别是β2-微球蛋白启动子。
第12项：根据第1至11项中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含cPPT/CTS序列，特别是如序列SEQ ID NO：37所示的cPPT/CTS序列。
第13项：根据第1至12项中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含缺乏其U3启动子序列的3’长末端重复序列(LTR)。
第14项：根据第1至13项中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含组成型增强子序列。
第15项：根据第1至14项中任一项所述的非整合型慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式，并且特别地具有如序列SEQ ID NO：38所示的序列。
第16项：一种慢病毒载体颗粒，特别是非整合型慢病毒载体颗粒，其包含至少一种如第1至15项中任一项所定义的慢病毒载体。
第17项：根据第16项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含功能性慢病毒整合酶蛋白。
第18项：根据第16或17项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)，特别是VSV-GIndiana血清型或VSV-G New Jersey血清型。
第19项：根据第16至18项中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含HIV-1亚型D Gag和Pol蛋白。
第20项：一种分离的细胞，其包含第1至14项中任一项所述的慢病毒载体或第16至19项中任一项所述的慢病毒载体颗粒。
第21项：一种疫苗组合物，其包含第1至14项中任一项所述的慢病毒载体、第16至19项中任一项所述的慢病毒载体颗粒或第19项中所述的细胞。
第22项:根据第21项所述的疫苗组合物，其用于治疗或预防HPV诱发的癌症，特别是选自宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌及其转移瘤，特别是其肺转移瘤。
第23项：根据第1至15项中任一项所述的慢病毒载体、根据第16至19项中任一项所述的慢病毒载体颗粒或根据第20项所述的细胞，其用作药物或疫苗。
第24项:根据第23项所述的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞，其用于治疗或预防HPV诱发的癌症，特别是选自宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌及其转移瘤，特别是其肺转移瘤。
第25项:根据第22项所述使用的疫苗组合物，或根据第23或24项所述使用的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞与至少一种免疫检查点抑制剂组合施用，所述至少一种免疫检查点抑制剂特别选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A、抗TIM-3、抗TIGIT和抗LAG-3单克隆抗体的至少一种单克隆抗体，更特别地与至少一种抗PD-1单克隆抗体组合施用。
第26项:根据第25项所述使用的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂同时或分开施用，并且特别地，所述至少一种免疫检查点抑制剂在施用所述疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞后至少2天并且特别是至少4天施用。
与本发明的任一特定的一个或多个所述方面相关的细节、实例和优选项将在本文中进一步描述，并且同样适用于本发明的所有方面。除非本文另有说明，或者与上下文明显矛盾，否则本文描述的实施方案、实施例和优选项的任何组合及其所有可能的变体均包含在本发明内。
附图的简要说明
图1证明本发明的HPV疫苗在体内具有免疫原性。小鼠经肌内注射1x107TU的慢病毒载体颗粒(包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体或在CNCM提交的保藏号为I-5762慢病毒载体)或50μL稀释剂。14天后，准备脾细胞并用4个不同的肽库重新刺激过夜以用于IFNg ELISPOT。
横坐标：从左到右：用在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体或50μL稀释剂(对照)获得的结果。
纵坐标：斑点形成细胞(SFC)/106个细胞。
图2显示本发明的疫苗完全消除了体内良好植入的肿瘤。皮下注射TC-1细胞，并每隔一天测量肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为70mm3时，对小鼠进行随机分组并肌内接种1x108TU的LV-GFP Indiana(作为对照)、包含I-5759的Indiana慢病毒载体颗粒、包含I-5760的Indiana慢病毒载体颗粒、包含I-5761的Indiana慢病毒载体颗粒或包含I-5762的Indiana慢病毒载体颗粒。
横坐标：天。
纵坐标：肿瘤体积(mm3)。
图3示出表达设计I-5759、I-5760、I-5761、I-5762的根据本发明的慢病毒载体或作为对照的稀释剂产生持久免疫力以防止复发的能力。第60天，消除了原发肿瘤的小鼠在另一胁腹接受了重新攻击。对照小鼠(未经治疗)也进行了皮下注射以检查幼稚小鼠中的肿瘤细胞生长。
横坐标：天。
纵坐标：肿瘤体积(mm3)。
图4代表小鼠中的剂量/反应。将1x106个TC-1细胞注射到动物的胁腹中，每周测量两次肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为80mm3时，将小鼠随机分组并接种稀释剂(对照)、1x107TU的I-5759疫苗或1x108TU(i.m.)的I-5759疫苗。
横坐标：天。
纵坐标：肿瘤体积(mm3)。
图5代表用根据本发明的慢病毒载体接种后的淋巴细胞肿瘤浸润。将1x106个TC1肿瘤细胞注射(s.c.)在动物的胁腹，每周测量两次肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为80mm3时，将小鼠随机分组并接种稀释剂(对照)、1x107TU的I-5759疫苗或1x108TU(i.m.)的I-5759疫苗。
接种疫苗后十天，收集肿瘤，消化并通过流式细胞术进行分析。根据本领域熟知的方法进行FACS染色并在Macsquant facs上获取数据。
横坐标：从左到右：稀释剂(对照)；1x108TU的I-5759疫苗。
纵坐标：左上图：％CD8+T细胞(活细胞内)；右上图：CD4+T细胞百分比(活细胞内)；下图：％Treg细胞(活细胞内)。
图6表示根据本发明的载体消除良好建立的大肿瘤的能力。将1x106个TC1细胞注射(s.c.)在动物的胁腹。当平均肿瘤体积约为300mm3时，将小鼠随机分组并用稀释剂(对照)或1x108TU(i.m.)的根据本发明的包含慢病毒载体颗粒的疫苗进行疫苗接种，所述慢病毒载体颗粒包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体。
横坐标：天。
纵坐标：肿瘤体积(mm3)。
图7描绘了用CFSE标记并在不存在(未刺激条件)或存在根据本发明的疫苗(I-5759)的情况下培养的人PBMC中的T细胞反应。培养2周后测量细胞增殖和活化(n＝3)。通过在培养物中添加本发明的慢病毒载体，CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖(通过CFSE稀释测量)(A)和CD25激活标记物的表达(B)增加。
横坐标：从左到右：未刺激(Unstim-对照)；I-5759疫苗。
纵坐标：(A)左图：CD8+群体中CFSElow的百分比；右图：CD4+群体中CFSElow的百分比。(B)左图：CD4+群体中CD25+的百分比；右图：CD8+群体中CD25+的百分比。
图8A至8D描绘了根据本发明的慢病毒载体的抗原构建体的四个实例。这些抗原构建体中的每一个由各种顺序的以下四种序列组成：编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列，编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列和编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列。图8A代表在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的抗原构建体。图8B代表在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体的抗原构建体。图8C代表在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体的抗原构建体，图8D代表在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体的抗原构建体。
图9A和9B描绘了在用或不用ETTDPDRAHYNIVTF(SEQ ID NO：39)和PDRAHYNIVTFCCKC(SEQ ID NO：40)合成肽的混合物刺激的情况下，通过细胞内细胞因子染色(ICS)分析的脾细胞的T细胞细胞因子应答，所述合成肽均含有RAHYNIVTF H-2Db-限制性T细胞表位(粗体字符代表H-2Db锚定残基)(SEQ ID NO：49)，脾细胞是在C57BL/6小鼠(n＝5/组)通过使用Ctrl Lenti(LV-GFP Indiana)或使用根据本发明的包含慢病毒载体颗粒的疫苗的肌内免疫进行接种后14天通过肌内注射获得的，所述慢病毒载体颗粒包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体。图9A特别代表了对产生细胞因子的CD8+T细胞进行的细胞计数门控策略以及通过表面CD107a染色评估的产生IFN-γ的CD8+T细胞的脱粒活性。图9B代表每个(多)功能细胞亚群和CD8+T亚群内的IFN-γ+CD107a+细胞的概括频率。
图10描绘了移植肿瘤并接种根据本发明的HPV疫苗(I-5759)或移植肿瘤且未接种疫苗的小鼠(对照-Ctrl Lenti)的肿瘤浸润先天免疫细胞(NK)的细胞计数分析。检测到CD11b和NKp46。
图11代表根据本发明的载体消除良好建立的大肿瘤的能力。首次移植后119天，用1.106个TC-1肿瘤细胞对消除了原发肿瘤的治愈小鼠(右图)在另一肋腹上进行再次攻击，并在没有任何治疗的情况下进行维持。对照小鼠(未治疗-对照老年小鼠-左图)也进行了皮下注射，以检查肿瘤细胞生长。
横坐标：肿瘤再攻击后的天数。
纵坐标：肿瘤体积(mm3)。
图12A和12B示出了使用次优剂量的根据本发明的疫苗(I-5759)的疫苗接种与抗PD-1疗法(单克隆抗体抗PD-1)之间的协同作用。
图12A代表小鼠中肿瘤植入(D0)(横坐标)后几天内肿瘤体积(mm3-纵坐标)的演变。在三组相同的移植肿瘤小鼠上进行了实验。在第一组中(10只小鼠-对照组-图12A的左图)，对小鼠施用LV-空Indiana(D13)(作为对照)(箭头指示的天)，并在四天后施用抗-PD-1(程序性细胞死亡蛋白-1)单克隆抗体(D17，然后是D20、D22、D24、D28和D31)。在第二组(12只小鼠-对照组-图12A的中图)中，对小鼠施用根据本发明的疫苗(I-5759)(D13)(箭头指示的天)，四天后施用对照抗体(同种型ctrl)(D17，然后是D20、D22、D24、D28和D31)。在第三组(14只小鼠-图12A的左图)中，对小鼠施用根据本发明的疫苗(D13)(I-5759)(箭头指示的天)，四天后施用mAb抗PD-1(D17，然后是D20、D22、D24、D28和D31)。
图12B代表每组小鼠随着时间的推移(天-横坐标)的存活率(小鼠的百分比-纵坐标)(组对照1：Ctrl Lenti+抗PD-1；组对照2：I-5759+ctrl Ig；组3：I-5759+抗PD-1)。
图13A和13B代表单次感染Lenti-HPV-07疫苗后静脉内注射TC1-nLuc细胞诱导的具有肺转移灶的小鼠的治愈。
图13A代表由于注射到不同组小鼠的TC1-nLuc细胞稳定表达的纳米荧光素酶，在将所述细胞静脉内注射至所述小鼠之后以每秒光子(p/s)表示的发光值(纵坐标-总通量)随时间推移(横坐标-天)的变化。测试了3组小鼠：阴性对照组，小鼠未注射TC1-nLuc细胞(n＝11)(Neg Ctrl)，对照组，小鼠注射TC1-nLuc细胞，并在第5天注射对照慢病毒(LV-空Indiana)-1.109TU(n＝11)(TC1+Ctrl Lenti)以及注射了TC1-nLuc细胞并在第5天注射了根据本发明的疫苗(Lenti-HPV-07(I-5759))-1.109TU的一组小鼠(n＝11)(TC1+Lenti-HPV-07)
图13B代表上面详述的三个实验组的个体小鼠在肿瘤注射后第22天的个体p/s值。纵坐标：以每秒光子(p/s)表示的发光值(总通量)。横坐标，从左到右：Neg Ctrl组、CtrlLenti组、Lenti-HPV-07组。
序列概述
SEQ ID NO：1是编码来自HPV 16的E6蛋白的核酸序列
SEQ ID NO：2是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：3是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：4是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：5是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：6是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：7是来自HPV 16的E6蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：8是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：9是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：10是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：11是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：12是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：13是编码来自HPV 16的E7蛋白的核酸序列
SEQ ID NO：14是编码来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：15是编码来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：16是来自HPV 16的E7蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：17是来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：18是来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：19是编码来自HPV 18的E6蛋白的核酸序列
SEQ ID NO：20是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：21是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：22是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：23是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：24是来自HPV 18的E6蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：25是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：26是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：27是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：28是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：29是编码来自HPV 18的E7蛋白的核酸序列
SEQ ID NO：30是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：31是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：32是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
SEQ ID NO：33是来自HPV 18的E7蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：34是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：35是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：36是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：37是编码cPPT/CTS序列的核酸序列
SEQ ID NO：38是编码土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式的核酸序列
SEQ ID NO：39是合成的E7HPV16衍生肽，其含有RAHYNIVTF H-2Db-限制性T细胞表位
SEQ ID NO：40是合成的E7HPV16衍生肽，其含有RAHYNIVTF H-2Db-限制性T细胞表位
发明详述
本发明人已发现，对有需要的个体施用编码至少四种不同的人乳头瘤病毒(HPV)抗原、并且特别是选自至少两种不同HPV亚型、特别是HPV 16和HPV 18亚型的蛋白质E6和E7的至少4种HPV抗原产生对HPV诱发的癌症的高预防和治疗活性。
根据本发明的慢病毒载体能够诱导针对由HPV感染诱导的肿瘤的强的、持久的和广泛的细胞介导的应答。
本说明书通篇描述了根据本发明的慢病毒载体、以及包含它们的慢病毒载体颗粒、包含所述慢病毒载体或慢病毒载体颗粒的分离细胞以及包含它们的疫苗组合物。
定义
除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语均具有本领域常用的含义。
如本文所用，“转基因”是指可以通过重组技术在适当条件下在非天然环境或异源细胞中表达的多核苷酸。
本文所用的术语“重组”，当关于本发明的细胞使用时，表示该细胞已通过将内源和/或异源核酸或蛋白质引入细胞中或天然细胞的改变而被修饰或该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因或核酸，或以与其天然水平不同的水平表达天然(例如内源)基因，或以与其天然水平不同的水平表达额外或补充拷贝的天然的(例如内源性的)。根据本发明的分离的细胞是重组的，因为它包含至少一种根据本发明的慢病毒载体和/或至少一种根据本发明的慢病毒载体颗粒。
如本文所用，术语“重组”当关于载体使用时是通过本领域技术人员熟知的基因工程技术形成/获得的序列。
如本文所用，术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并且含有多于五个氨基酸残基的分子。氨基酸通过单字母或三字母名称来识别。本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且还可以指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用。多肽可以任选地被修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法呢基化、异戊二烯化、磺化等)以添加功能性。表现出活性的多肽可被称为酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，可以产生编码给定多肽的大量核苷酸序列。
本文使用的术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸序列元件物理连接并且彼此处于功能关系。例如，在根据本发明的慢病毒载体中，启动子可操作地连接至编码序列，本文也称为“抗原构建体”，因为启动子能够启动或调节抗原构建体的转录或表达，在这种情况下抗原构建体应理解为处于启动子的“控制下”。一般而言，当两个核酸序列可操作地连接时，它们将处于相同的方向并且通常也在相同的阅读框中。它们通常基本上是连续的，尽管这可能不是必需的。
术语“编码(encoding)”或“编码(coding for)”是指多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。
对于每个感兴趣的氨基酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考氨基酸序列具有特定百分比的氨基酸同一性的氨基酸序列。
由于明显的原因，在所有本说明书中，分别符合所考虑的核苷酸或氨基酸同一性的特定核酸序列或特定氨基酸序列应当进一步导致获得显示出所需生物活性的蛋白质(或抗原)。如本文所用，两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”由通过比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定。
因此，比较窗口中的核苷酸或氨基酸序列的部分可以包括添加或缺失(例如“缺口”)(与参考序列(其不包括这些添加或这些缺失)相比)，以获得两个序列之间的最佳比对。
术语“序列同源性”或“序列同一性”或“同源性”或“同一性”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，本文定义为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，为了最佳比较目的而对序列进行比对。为了优化两个序列之间的比对，可以在所比较的两个序列中的任何一个中引入空隙。这种比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可以在较短的长度上进行，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是两个序列在报告的比对区域中相同匹配的百分比。
序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。技术人员将意识到以下事实：若干不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同一性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison InD.Sankoff and J.B.Kruskal,(ed.),Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,pp.1-44Addison Wesley)。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过该算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。
为了本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.LongdenJ.and Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)pp276—277,http://emboss.bioinformatics.nl/).。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于替换矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可选参数是10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分。不添加末端空隙罚分。在输出部分中，响应“简要同一性和相似性”问题指示“是”并且“SRS成对”指示为输出比对格式。
在通过如上所述的程序NEEDLE比对之后，查询序列和本发明的序列之间的序列同一性百分比如下计算：比对中显示两个序列中相同氨基酸或相同核苷酸的相应位置的数目除以减去比对中空隙总数后的比对总长度。此处定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。
核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过使用几种其他本领域已知的算法的序列比对来确定，优选地使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)，使用hmmalign(HMMER包，http://hmmer.wustl.edu/)或使用可在例如https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/上获得的CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)或GAP程序(爱荷华大学的数学算法)或Myers和Miller的数学算法(1989-Cabios4:11-17)或Clone Manager9。使用的优先参数是它们在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/上设置的默认参数。
序列同一性(序列匹配)的等级可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程序中并入了类似的算法。使用BLASTN程序进行BLAST多核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与编码相关蛋白质的那些核酸同源的多核苷酸序列。
使用BLASTP程序进行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与SHC多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空隙的比对，如Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25,3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源作图技术来补充，例如Shuffle-LAGAN(Brudno M.,Bioinformatics 2003b,19Suppl 1:154-162)或马尔可夫随机场。当本申请中提及序列同一性的百分比时，如果没有另外具体说明，则这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。
在具体实施方案中，使用CLUSTAL O(版本1.2.4)确定两个序列之间的％同一性。
本文使用的术语“非致癌”以其传统含义使用，即它涉及不能引起肿瘤形成的元件，在本发明的情况下涉及抗原。如别处详述的，本发明中实施的抗原已被遗传修饰以变得非致癌的。根据这些术语的通常含义，这意味着编码本文所实施的抗原的核酸序列在自然界中没有被发现，并且通过引入或通过缺失或通过其核酸序列的修饰而被修饰，导致编码的也不天然存在于自然界中的氨基酸序列。
本领域技术人员长期以来已知多种在核酸序列中进行缺失、取代或引入的方法。
如本领域技术人员将理解的，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可能是有利的。遗传密码有64个可能的密码子，但大多数生物体通常使用这些密码子的子集。在一个物种中最常使用的密码子称为最佳密码子，而那些不经常使用的密码子被归类为稀有或低使用密码子。密码子可以被替换以反映宿主的优先密码子使用，这个过程有时被称为“密码子优化”或“控制物种密码子偏差”。其他宿主细胞的密码子优化可以使用密码子使用表轻松确定，或可以使用市售软件进行，例如来自Integrated DNA Technologies的CodonOp(www.idtdna.com/CodonOptfrom)。可以制备含有特定原核或真核宿主优选的密码子的优化编码序列(Murray等人,1989,Nucl Acids Res.17:477-508)，以例如增加翻译速率或产生具有所需特征的重组RNA转录物，例如与从非优化序列产生的转录物相比更长的半衰期。翻译终止密码子也可以被修饰以反映宿主偏好。例如，单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等人,1996,Nucl AcidsRes.24:216-8)。
“非整合型”慢病毒载体是指，当该慢病毒载体位于细胞内时，它不会整合到宿主细胞基因组中。非整合型慢病毒载体颗粒涉及包含非整合型慢病毒载体的慢病毒载体颗粒。其也可被称为整合缺陷型慢病毒载体或非整合型慢病毒载体。
HPV诱发的癌症也被称为与HPV(人乳头瘤病毒)相关的癌症。事实上，当被感染的宿主的免疫系统未能成功控制HPV感染时。当高风险HPV感染持续多年时，它可能导致细胞变化，如果不进行治疗，其可能会随着时间的推移变得更严重并变成癌症。
根据本发明的慢病毒载体
本发明人已经构思出针对HPV诱发的癌症的新型治疗性和预防性的基于慢病毒载体的疫苗。
具体地，本发明涉及包含选自特定非致癌HPV抗原的至少四种不同核酸序列的慢病毒载体。
不同的核酸序列是指慢病毒载体中包含的至少四种核酸序列全部不同，即它们中的每一个是特定非致癌HPV抗原组的不同成员。
非致癌HPV抗原组如下：
-编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列；
-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列；
-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列；和
-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列。
与大多数在HPV整合后丢失的HPV蛋白不同，E6和E7蛋白在HPV诱发的肿瘤中持续表达(Ghittoni,Raffaella等人Virus genes vol.40,1(2010):1-13；Morrow,Matthew P等人Expert review of vaccines vol.12,3(2013):271-83)。这些蛋白质干扰细胞功能，并且已知在HPV相关的癌症发生中发挥重要作用。(Vjekoslav.Cancers vol.8,1095.19Oct.2016；Ghittoni,Raffaella等人Virus genes vol.40,1(2010):1-13)。E6和E7被认为会干扰多种途径，但最重要的是，细胞中的E6蛋白表达通过与细胞E3泛素连接酶E6AP直接相互作用而导致肿瘤抑制因子p53的泛素介导的降解(Huibregtse,JM等人The EMBOjournal vol.10,13(1991):4129-35；Martinez-Zapien,Denise等人Nature vol.529,7587(2016):541-5)，并且E7与Rb蛋白结合，从而破坏Rb和E2F之间的相互作用，并释放E2F因子(Cassetti,M Cristina等人Vaccine vol.22,3-4(2004):520-7)。
由于E6和E7蛋白在所有HPV诱发的癌症中表达，因此决定在本发明的慢病毒载体中包含来自两种主要亚型(HPV 16和HPV 18)的这些蛋白的抗原。为了从E6和E7抗原开发疫苗，消除与这些蛋白质相关的致癌风险至关重要。
因此，在本发明中实现了非致癌E6和E7蛋白。“非致癌E6和E7 HPV蛋白”意味着它们的编码序列被修饰以去除p53、Mi2b和Rb结合位点以及PDZ结合基序。在一个具体的实施方案中，由于E6和E7 HPV蛋白的结合位点的部分突变不允许完全消除Rb结合，因此所述位点特别地从本发明中实施的序列中完全去除。
根据本发明的慢病毒载体可以是单链或双链的。根据本发明的慢病毒载体可以是RNA或DNA分子。
在本发明的上下文中，“慢病毒载体”是指用于用包含顺式作用慢病毒RNA或DNA序列的转基因转导宿主细胞并且需要反式提供的必需慢病毒蛋白(例如Gag、Pol和/或Env)和辅助蛋白(例如Tat、Rev)的非复制载体。慢病毒载体缺乏所有功能性HIV蛋白的表达。慢病毒载体基因组可以以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录病毒载体的生产或开发阶段。
在一个优选的实施方案中，本发明的慢病毒载体是非整合型慢病毒载体。
非整合型慢病毒载体旨在减轻与插入诱变事件(特别是用于疫苗接种目的)相关的潜在肿瘤发生的风险。非整合型慢病毒载体的例子在Coutant等人,PLOS ONE 7(11):e48644(2012),Karwacz等人,J.Virol.83(7):3094-3103(2009),Negri等人,MolecularTherapy15(9):1716-1723(2007)；和Hu等人,Vaccine 28:6675-6683(2010)中提供。因此，据报道，与整合型系统相比，非整合型慢病毒载体系统可以减轻插入诱变的潜在风险(Hu等人,Vaccine 28:6675-6683(2010))。据进一步报道，在一些功能分析中，DC定向整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)引发的免疫反应的程度和质量与其整合对应物相当。因此，整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)被认为是比整合型载体更安全的用于人类施用的载体，并且具有相当的有效性。
此外，自失活慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3'LTR的U3区域的缺失限制了内源启动子激活的可能性。这些对安全性的担忧直接涉及1998-1999年进行的SCID-X1基因治疗试验中获得的经验，该试验使用基于莫洛尼病毒的逆转录病毒载体对患有罕见形式的X连锁(SCID-X1基因)严重免疫缺陷疾病的儿童进行(Cavazzana-Calvo等人,2000,Science.,288(5466):669-72)。在此试验期间，由于莫洛尼衍生的逆转录病毒载体整合到与人类LM02原癌基因非常接近的位置，九名儿童中有四人患上了白血病(Hacein-Bey-Abina等人,2008,J.Clin.Invest.,118(9):3132-3142)。研究表明，恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强子与LM02原癌基因接近的结果。因此，安全性是向人类施用慢载体的主要问题。
因此，根据本发明的慢病毒载体可以包含本领域已知的顺式长末端重复(LTR)序列，并且特别地包含缺乏其U3启动子序列的3'长末端重复(LTR)(Miyoshi H等人,1998,JVirol.72(1 0):81 50-7；Zufferey等人,1998,J V/ro/72(12):9873-80)。
增强子是顺式作用序列，其可以远距离充当转录激活子。它们已广泛应用于病毒衍生载体中，因为它们似乎对于在多种细胞类型，特别是DC中获得转基因强表达最有效(Chinnasamy等人,2000,Hum Gene Ther 11(13):1901-9；Rouas等人,2008,Cancer GeneTher9(9):715-24；Kimura等人,2007,Mol Ther 15(7):1390-9；Gruh等人,2008,J GeneMed 10(1)21-32)。然而，考虑到插入诱变的安全性问题，应从慢病毒载体构建体中缺失此类转录增强子序列，以消除增强子邻近效应的插入诱变的风险。这种增强子邻近效应是迄今为止最常见的插入诱变机制，并且是基因转移后致瘤事件的人类或动物案例中描述的唯一效应。
因此，根据本发明的慢病毒载体可以不包含组成型增强子序列。
先前的研究报道了由源自主要组织相容性复合物II类基因(MHC II类)(Kimura等人,2007,Mol Ther 15(7):1390-9)和dectin-2基因(Lopes等人,2008,J Virol 82(1):86-95)的DC特异性启动子取代病毒启动子。Lopes等人使用的dectin-2基因启动子含有推定的增强子和腺病毒保守序列(腺病毒启动子中的反向末端重复序列)(Bonkabara等人,2001,J.Immunology,167:6893-6900)。Kimura等人使用的MHC II类基因启动子不含任何已知的增强剂。
然而，在没有增强子的情况下，当静脉内施用时，发现MHC II类启动子不能在DC中提供足够的转基因表达。特别是，与CMV启动子/增强子观察到的免疫反应相反，包含MHC II类启动子的慢病毒载体不会在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反应。尽管在小鼠中注射后观察到整合和持续的转基因表达，但通过MHC II类启动子转录的慢病毒载体未能刺激抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应，即使在接种加强后也是如此。因此，这些研究的作者得出结论，MHC II类启动子的使用仅对寻求持续表达的如在基因替代疗法中的应用感兴趣，但在免疫疗法中则不然。值得注意的是，MHC II类启动子在大多数细胞类型中表达较差。
因此，MHC II类启动子不是用于慢病毒载体的用于通过IV注射诱导针对抗原的免疫应答的适当启动子。此外，dectin-2启动子在大多数细胞类型中表达较差，并且似乎含有增强子。因此，出于安全原因，dectin-2启动子并不是慢病毒载体的良好启动子。
因此，根据本发明的慢病毒载体可以包含MHC I类启动子，即根据本发明的编码慢病毒载体的抗原的核酸序列可以在MHC I类启动子的控制下。
合适的MHC I类启动子可以选自β2-微球蛋白启动子、HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-E启动子或HLA-F启动子，并且更具体地是β2-微球蛋白启动子。
MHC I类启动子是树突状特异性的(APC)，因为启动子在BDCA+树突状细胞中的表达高于肾、平滑肌、肝和心脏细胞中的表达。它们在其他转导的细胞类型中也具有相对较高的表达，例如，BDCA+树突状细胞中启动子的表达仅为骨骼肌细胞中该启动子表达的12-100倍，相比之下MHC II HLA-DRα启动子则为900倍。
该启动子特别驱动本发明的慢病毒载体中的编码HPV抗原的核酸序列的转录。
所述启动子可以是天然存在的或使用众所周知的分子生物学技术获得的合成的MHC I类启动子。
根据本发明的慢病毒载体可以包含cPPT/CTS序列，例如EP2169073中描述的。该cPPT/CTS序列可以特别是如序列SEQ ID NO：37所示的序列。
事实上，在非分裂细胞中的有效整合和复制通常需要在慢病毒基因组中心存在两个顺式作用序列，即中央多嘌呤束(cPPT)和中央终止序列(CTS)。这导致形成被称为中央DNA“瓣”的三链DNA结构，其充当核孔处预整合复合物的脱壳以及将表达盒有效导入非分裂细胞，例如树突状细胞的细胞核的信号。
本发明的慢病毒载体可以包含土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)，其允许转基因在体内更稳定的表达，并且特别是土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式。
突变的土拨鼠转录后调节元件(mWPRE)的特征在于引入点突变以避免WPRE区域中包含的X蛋白的表达，因为所述X蛋白可能具有致癌特性(Kingsman等人,GeneTher.2005Jan；12(1):3-4)。
包含在本发明的慢病毒载体中的土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变体形式尤其可以具有如序列SEQ ID NO：38所示的核酸序列。
在一个具体实施方案中，根据本发明的慢病毒载体，特别是本发明的非整合型慢病毒载体：
(i)包含至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列、至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列、至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列和至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV18)蛋白E7抗原的核酸序列；
(ii)包含缺乏其U3启动子序列的3'长末端重复序列(LTR)；
(iii)不包含组成型增强子序列；
(iv)包含MHC I类启动子，并且特别是β2-微球蛋白启动子；
(v)包含cPPT/CTS序列，特别具有序列SEQ ID NO：37所示的序列；和
(vi)包含土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式，其特别具有如序列SEQ ID NO：38所示的核酸序列。
如前所述，本发明的慢病毒载体的特征在于，其包含：
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，以及
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列。
本发明的编码慢病毒载体的HPV抗原的至少四种(特别是四种)不同的核酸序列可以特别地融合在一起，形成在单一启动子序列控制下编码单一抗原性融合蛋白的单一抗原性核酸序列，特别是(i)在至少四种不同核酸序列的每一个之间不存在任何连接序列(本文中也称为间隔区)或(ii)在至少四种不同核酸序列的至少两种之间具有连接序列(或间隔区)，并且更特别地，在至少四种不同核酸序列的每一种之间具有连接序列(或间隔区)。
编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
具体地，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性的核酸序列。
在一个具体的实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的核酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：12所示的氨基酸序列的氨基酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列尤其可以具有编码与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少68％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少68％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
具体地，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有与选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有编码与选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有编码选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的氨基酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少60％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
具体地，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有与选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的核酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码与选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在一个具体的实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列可特别具有编码选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的氨基酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有编码与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少83％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少83％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
具体地，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有与选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的核酸序列的核酸序列。
编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有编码与选自SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在一个具体实施方案中，编码非致癌人乳头瘤病毒18(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列可特别具有编码选自SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的氨基酸序列的核酸序列。
如上所述，本发明的慢病毒载体包含：
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原(本文也称为noE6-HPV16)的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原(本文也称为noE7-HPV16)的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原(本文也称为noE6-HPV18)的核酸序列，和
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原(本文也称为noE7-HPV18)的核酸序列。
在一个具体实施方案中，根据本发明的慢病毒载体，特别是本发明的非整合型慢病毒载体：
(i)包含编码非致癌人乳头瘤病毒16(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列；编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列；编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列和编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列；
编码非致癌HPV抗原的核酸序列特别地融合在一起，形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；其在单一启动子序列的控制下，更特别地在它们各自之间不存在任何连接序列；
(ii)包含缺乏其U3启动子序列的3'长末端重复序列(LTR)；
(iii)不包含组成型增强子序列；
(iv)包含MHC I类启动子，并且特别是β2-微球蛋白启动子；
(v)包含cPPT/CTS序列，其特别具有序列SEQ ID NO：37所示的序列；和
(vi)包含土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式，其特别具有序列SEQ ID NO：38所示的核酸序列。
根据本发明的慢病毒载体可以更具体地包含：
-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核酸序列的核酸序列具有至少80％的序列同一性，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核酸序列；
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核酸序列具有至少80％的序列同一性，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的核酸序列；
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的核酸序列具有至少80％的序列同一性，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：23所示的核酸序列；和
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列，所述核酸序列与选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的核酸序列具有至少80％的序列同一性，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的核酸序列；
编码非致癌HPV抗原的核酸序列特别地融合在一起，形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；其在单一启动子序列的控制下，更特别地在它们各自之间不存在任何连接序列。
在根据本发明的慢病毒载体，特别是本发明的非整合型慢病毒载体中，编码HPV抗原的至少四种(特别是四种)不同的核酸序列可以是传统的5'到3'阅读方向(从5'端到3'端)的任何顺序。
具体地，编码如上定义的HPV抗原noE6-HPV 16、noE7-HPV 16、noE6-HPV 18和noE7-HPV 18的四种不同的核酸序列可以是传统的5'端至3'端阅读方向的任何顺序，包括根据本发明的慢病毒载体，特别是根据本发明的非整合型慢病毒载体中的24种可能的组合。
在一个具体实施方案中，至少四种不同核酸序列从5'端到3'端的顺序选自：
(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列；
(b)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列；
(c)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列；和
(d)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，
编码非致癌HPV抗原的核酸序列特别地融合在一起，形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；其在单一启动子序列的控制下，更特别地在它们各自之间不存在任何连接序列。
这些顺序呈现在图8A至8D中。
在根据本发明的慢病毒载体中，至少四种不同核酸序列从5'末端到3'末端的顺序可以更具体地是：
(d)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，
编码非致癌HPV抗原的核酸序列特别地融合在一起，形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；其在单一启动子序列的控制下，更特别地在它们各自之间不存在任何连接序列。
优选地，在根据本发明的慢病毒载体中，至少四种不同核酸序列从5'端到3'端的顺序是：
(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，
编码非致癌HPV抗原的核酸序列特别地融合在一起，形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；其在单一启动子序列的控制下，更特别地在它们各自之间不存在任何连接序列。
更优选地，在根据本发明的慢病毒载体中，至少四种不同核酸序列从5'末端到3'末端的顺序是：
(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，
编码非致癌HPV抗原的核酸序列融合在一起并形成编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列；在单一启动子序列的控制下，在它们每个之间不存在任何连接序列。
抗原构建体的这四个不同的组已分别在本发明的实施例中实现：
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5759(上述顺序(a))；
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5760(上述顺序(b))；
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5761(上述顺序(c))；或者
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5762(上述顺序(d))。
因此，在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的抗原构建体具有如SEQ IDNO：41所示的以下核苷酸序列：
atgcccggagacacccccaccctgcacgaatacatgctggacctgcagcccgaaaccaccgaccccgaccgcgctcactacaacatcgttacattctgttgtaaatgcgactccaccctgagaagatgcgtgcagtccacccacgtggacatcaggaccctggaggacctcctcatgggaaccctgggtatcgtctgccccatcgcctcccaggcttttcaggacccccaggaaaggcccaggaagttgccccagctctgcaccgaactgcagaccaccattcatgacatcatcctcgaatgcgtgtactgcaagcagcagctcctgaggagggaggtgtacgatttcgccttcagagacggctgtatcgtctacaggaacccctatgccgtctgcgacaaatgcctgaagttttattccaagatctccgagtacaggcactattgctacagcctgtatgggaccaccctggagcagcagtacaacaagcccctgtgcgacctcctgatcaggtgcatcaactgccagaagcccctgaggttccacaacatccgcggcaggtggaccggaaggtgcatgtcctgctgcaggtccgccggccccggacctaaagccaccctccaggacatcgttctccacctggagccccagaacgagatccccgtggactcagaagaggagaacgacgagatcgacggcgtcaaccaccagcacctgcccgctcgcagagccgaaccccagagacacaccatgctctgcatgtgctgcaaatgcgaagcccggattaagttggtggtggaaagcagcgccgacgatctgagggccttccagcagctcttcctcaacaccctgtccttcgtgtgcccctgggtgggcgagcccggtagaaccatcccctacaagctgcccgatctgtgcacagagctgaacacctccctgcaggacatcgagatcacctgcgtctactgcaagaccgtgctggaactgaccgaggtgttcgaattcgccttcaaggacggcttcgtggtgtacagggacagcattccccacgccgcctgccataagctggagaaactgaccaacaccggactgtataacctgctgatcaggtgtctgaggtgccagaaggcagagaaactgagacatctgaacgagaaaaggaggttccacaatattgccgggcactgataa(SEQ ID NO：41)
并且编码SEQ ID NO：42所示的以下氨基酸序列：
MPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIASQAFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRSAGPGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWVGEPGRTIPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGH(SEQ ID NO:42)
在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体的抗原构建体具有如SEQ ID NO：43所示的以下核苷酸序列：
atgttccaggacccccaggagaggccccggaagttgccccagctgtgcaccgagctgcagaccaccatccacgacatcatcctcgaatgcgtgtactgcaagcagcagctgctgaggagggaggtgtatgactttgccttcagagacggatgcattgtctacaggaacccctacgccgtgtgcgacaaatgcctgaagttctactccaagatcagcgagtacaggcactactgctactccctgtacggcaccaccctcgaacagcagtacaacaaacccctgtgcgacctcctgattaggtgcatcaactgccagaagcccctcaggttccacaacatccgcggccgctggaccggccgatgcatgtcttgctgcaggggccccgacgacccctacaagctccccgacctgtgcaccgaactcaacacctccctgcaggacatcgagatcacctgcgtgtattgcaagaccgtgctggagctgaccgaggttttcgaatttgcctttaaggacggcttcgtcgtgtatagggactccatcccccacgccgcctgccataagctggagaagctcaccaacaccggactgtataatctgctgatcaggtgcctcaggtgccagaaggcagaaaagctgaggcatctcaacgagaagcgccggttccacaatattgccggccccggagacacccccacactccatgagtacatgctcgacctgcagcccgaaaccaccgaccccgacagagcccactacaacatcgtgaccttctgctgcaagtgcgactccaccctgagaagatgcgtgcagtccacccacgtggacatccgcacactcgaagacctgctgatgggaaccctgggcatcgtgtgccccatcggccccgatgacaaggccaccttgcaggacatcgtgctgcacctggaaccacagaacgagatccccgtcgactccgaagaagaaaacgacgaaatcgacggagtgaatcaccagcacctgcccgccagaagggccgagcctcagagacacaccatgctctgcatgtgctgcaaatgcgaagccaggattaagctggtggtggagagcagcgccgacgacctgagggccttccagcagctcttcctgaacacactgtccttcgtgtgcccctgggcctgataa(SEQ ID NO:43)
并且编码SEQ ID NO：44所示的以下氨基酸序列：
MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRGPDDPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIGPDDKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWA(SEQ ID NO:44)
在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体的抗原构建体具有如SEQ ID NO：45所示的以下核苷酸序列：
atgaggcggccctacaagctgcccgacctgtgcaccgagctgaacacctccctgcaggacatcgagatcacctgcgtgtactgcaagaccgtgctggagctgaccgaggtgttcgaattcgcattcaaggacggattcgtcgtgtatagggacagcattccacacgccgcctgccacaagctggagaaattgactaacaccggactgtataatctgctgatccggtgcctgaggtgtcagaaggccgagaagctgaggcatctgaacgagaaaaggagattccacaatatcgccggacacttccaggacccccaggagaggcccaggaaactgccccagttgtgcaccgagctccagacaaccatccacgacatcatcctggagtgcgtgtactgtaagcagcagttgctgaggagagaggtgtatgacttcgccttcagagacggatgcattgtctataggaacccctacgccgtgtgcgacaagtgcctgaagttctactccaagatcagtgagtacaggcattactgctacagcctgtatggaaccacactggaacagcagtacaacaagcccctgtgcgacctcctgattaggtgcatcaactgccagaagcccctcaggttccacaacatccggggcaggtggaccggaaggtgcatgtcctgctgcaggtccgccggccccggacctaaagccaccctccaggacatcgtgctgcacctggagccccagaacgagatccccgtcgactcagaggaggagaacgacgaaattgacggcgtcaaccaccagcacctgcccgctcgcagagccgaaccccagagacacaccatgctctgcatgtgctgcaaatgcgaggcccggattaagctggtggtggagagctccgccgacgatctgagagccttccagcagctcttcctgaacaccctgtccttcgtgtgcccctgggccggtcccggtgacacacctaccctgcacgagtacatgctcgatctgcagcccgagaccaccgaccccgatcgcgcacactacaacatcgtgaccttctgctgcaaatgtgacagcaccctgagacggtgcgtccagtccacccacgttgacatccgcaccctcgaagacctgctcatgggaaccctgggcatcgtgtgccccatcgcctgataa(SEQ ID NO:45)
并且编码SEQ ID NO：46所示的以下氨基酸序列：
MRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGHFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRSAGPGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIA(SEQ ID NO:46)
在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体的抗原构建体具有如SEQ ID NO：47所示的以下核苷酸序列：
atgggccctaaggccaccctgcaggacatcgtgctgcacttggagccccagaacgagatccccgtggacagcgaggaggagaacgacgaaatcgacggcgtgaaccaccagcacctgcccgcaagaagggccgaaccccagaggcacaccatgctctgcatgtgctgcaaatgcgaggccaggatcaagctggtggtggaaagcagcgccgacgatctgagggcattccagcagctgttcctgaacaccctctccttcgtgtgccctggggaacccggcaggaccatcccctataaactgcccgacctctgcaccgagctgaacacctccctgcaggacattgagatcacctgcgtctactgcaaaaccgtcctggaactgaccgaggtgttcgagttcgccttcaaagacggcttcgtcgtgtacagggacagcatcccccacgccgcctgccataagctggagaaactgaccaacaccggcctgtacaacctgctgatccggtgcctgagatgtcagaaggccgagaaactgaggcacctcaacgagaaaaggagattccacaatattgccgggcccggcgacaccccaaccctgcacgaatacatgctcgacctgcagcccgaaaccaccgaccccgacagagcccactacaacatcgtgaccttctgctgcaagtgcgactccaccctgagaagatgcgtgcagtccacccacgtggacatccgcacactcgaagacctgctgatgggaaccctgggcatcgtgtgccccatcgcttcccaggcctttcaggacccccaggaacggccaagaaagctgccccagctctgcaccgaactgcagaccaccatccacgacatcatcctggaatgcgtctactgtaagcagcagttgctgaggagggaggtgtatgatttcgccttcagagacggctgcatcgtctacaggaacccctacgccgtgtgcgacaaatgcctgaagttctactccaagatctccgaatacagacactattgctacagcctgtacggcaccaccctcgaacagcagtacaacaaacccctgtgcgacctcctgatcaggtgcatcaactgccagaagcccctccggttccacaacatccgaggaagatggaccggccggtgcatgtcctgctgcaggtcctgataa(SEQ ID NO:47)
并且编码SEQ ID NO：48所示的以下氨基酸序列：
MGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPGEPGRTIPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIASQAFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRS(SEQ ID NO:48)
根据本发明的慢病毒载体可以特别地包含编码与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列特别是核酸序列SEQID NO：41。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％同一性的氨基酸序列。
因此，根据本发明的慢病毒载体可以更特别选自在CNCM提交的保藏号为I-5759、I-5760、I-5761和I-5762的慢病毒载体，并且特别是在CNCM提交的保藏号为I-5762慢病毒载体。根据本发明的慢病毒载体可以优选地是在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体，并且因此优选地包含核酸序列SEQ ID NO：41。
根据本发明的慢病毒载体颗粒
本发明的另一个目的涉及慢病毒载体颗粒，其包含至少一种根据本发明的慢病毒载体，并且特别是至少一种如上所定义的慢病毒载体。
根据本发明的含有根据本发明的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒可以通过本领域已知的重组技术在用以下不同的DNA质粒瞬时转染细胞例如HEK 293T人培养细胞时产生：
(i)包装质粒，其至少表达Gag、Pol、Rev、Tat，并且在一些情况下表达包装转移构建体所必需的结构蛋白和酶促蛋白；
(ii)根据本发明的慢病毒载体，其含有表达盒(抗原)和包装、逆转录和整合所必需的HIV顺式作用因子；和
(iii)包膜编码质粒，在大多数情况下是编码水疱性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白，这是一种允许形成混合颗粒(假型)的蛋白质，所述混合颗粒可以靶向多种细胞，特别是主要组织相容性细胞(MHC))抗原呈递细胞(APC)，包括DC。
这种方法允许产生根据本发明的重组载体颗粒，包括以下步骤：
i)用本发明的慢病毒载体转染合适的宿主细胞；
ii)用包装质粒载体转染所述宿主细胞，所述包装质粒载体含有编码逆转录病毒(优选慢病毒)的至少结构和聚合酶活性的病毒DNA序列；此类包装质粒例如在本领域中有描述(Dull等人,1998,J Virol,72(11):8463-71；Zufferey等人,1998,J Virol 72(12):9873-80)。
iii)培养所述转染的宿主细胞以获得所述慢病毒载体的表达并将其包装到慢病毒载体颗粒中；和
iv)收获所述培养的宿主细胞中的由步骤iii)的表达和包装所产生的慢病毒载体颗粒。
为了假型化本发明的逆转录病毒颗粒，可以用一种或多种编码病毒包膜蛋白、优选VSV-G包膜蛋白的包膜DNA质粒进一步转染宿主细胞。
该程序允许通过转染的细胞获得慢病毒颗粒载体的瞬时产生。然而，慢病毒颗粒载体也可以通过将包装基因、原病毒编码DNA和包膜基因稳定插入细胞基因组而由细胞连续产生。这允许细胞连续产生慢病毒颗粒载体，而不需要瞬时转染。当然，可以使用这些程序的组合，其中一些DNA/质粒整合到细胞基因组中，而另一些则通过瞬时转染提供。
慢病毒载体颗粒可以是非整合型慢病毒载体颗粒。非整合型载体颗粒具有一种或多种突变，其消除了慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力。例如，非整合型载体颗粒可能在由慢病毒pol基因编码的整合酶中含有突变，导致整合能力降低。
根据本发明的慢病毒载体颗粒特别包含本发明的非整合型慢病毒载体。
根据本发明的慢病毒载体颗粒可以包含水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)，特别是VSV-G Indiana血清型或VSV-G New Jersey血清型。
在疫苗接种策略方面，当免疫系统已经对慢病毒产生免疫力时，假型化慢病毒载体颗粒更有可能逃脱免疫系统。当需要连续注射相似的颗粒载体来对患者进行针对疾病的免疫时，这特别有用。
慢病毒载体颗粒可以包含HIV-1Gag和Pol蛋白，并且特别是HIV-1亚型D Gag和Pol蛋白。
本发明的另一个目的涉及分离的细胞，其包含(即转化有)根据本发明的慢病毒载体或本发明的慢病毒载体颗粒。
根据本发明的细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。特别优选的是人类非分裂细胞。
本发明的另一个目的涉及包含根据本发明的慢病毒载体、根据本发明的慢病毒载体颗粒或根据本发明的细胞的疫苗组合物。
根据本发明的疫苗组合物包含药学上可接受的介质。
“药学上可接受的介质”是指用于溶解和递送根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞至个体的任何溶液。理想的药学上可接受的载体是盐水。在期望的实施方案中，药学上可接受的介质包括佐剂。
合适的生理学上可接受的介质及其制剂是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,(20th edition),ed.A.Gennaro,2003,Lippincott Williams&Wilkins。
根据本发明的实施方式
本发明的一个目的涉及用作药物或疫苗的本发明的慢病毒载体、本发明的慢病毒载体颗粒或本发明的分离的细胞。
具体地，本发明的一个目的涉及用于治疗或预防HPV诱发的癌症及其转移，特别是HPV诱发的癌症的本发明的慢病毒载体、本发明的慢病毒载体颗粒或本发明的分离的细胞，特别是以根据本发明的疫苗组合物的形式。
如前所述，HPV诱发的癌症是由HPV感染诱发的癌症。用于检测癌症中HPV的方法是本领域已知的(Aldo Venuti and Francesca Paolini；Head Neck Pathol.2012Jul；6(Suppl 1):63-74)。
HPV诱发的癌症可特别选自宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌。
根据本发明的此类癌症的转移瘤尤其可以是肺转移瘤。
这种预防和/或治疗意味着将所考虑的活性物质、特别是如上文所定义的本发明的疫苗组合物施用至需要的个体。
有需要的个体是动物，特别是哺乳动物，并且可以更特别是人类。
本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物通过常规方法以足以引发免疫应答的剂量施用至有需要的个体，该剂量可以由本领域技术人员容易地确定。
因此，根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物可以如下所述静脉内或肌内施用。
或者，根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物可以鼻内施用。这种施用途径特别适用于治疗或预防口咽癌和/或肺转移瘤。
根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物以治疗有效量施用，并且特别地可以以对应于至少1x106、2x106、5x106、107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108或至少1x109TU(转导单位)的根据本发明的慢病毒载体的剂量，特别是对应于至少1x 107、2×107、5×107、1×108TU或至少1×109TU的根据本发明的慢病毒载体的剂量施用。在一个优选的实施方案中，根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物以对应于至少1×107TU的根据本发明的慢病毒载体、更特别地至少1×108TU的根据本发明的慢病毒载体，特别是至少1×109TU的根据本发明的慢病毒载体的剂量施用。
“治疗有效量”例如是指在受试者中产生一种或多种以下效果所需的根据本发明的慢病毒载体或慢病毒载体颗粒、细胞或疫苗组合物的量：针对HPV诱发的肿瘤的免疫应答；HPV诱发的肿瘤尺寸减小，即与施用时肿瘤的大小相比在15至45天内减小至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；施用后5至45天内，HPV诱发的肿瘤中CD8+和/或CD4+浸润增加；施用后5至45天内，HPV诱发的肿瘤中CD25+FoxP3+CD4+调节性T细胞(Treg)减少。
施用可以使用众所周知的途径进行，包括例如静脉内、肌内、鼻内、腹膜内或皮下注射，并且特别是静脉内、鼻内或肌内，并且可以是静脉内或肌内。
取决于许多因素，适当的剂量和方案显然会在物种和个体之间不同。例如，与小鼠相比，人类通常需要更高的剂量以产生有效的免疫反应。
根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物可以例如以单剂量施用，如实施例中所示，或进行两次或更多次施用。在每种情况下，从业者将确定用于施用根据本发明的活性物质的适当的方案和剂量。
根据本发明的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒、细胞和疫苗组合物可以有利地与至少一种免疫检查点抑制剂(ICI)组合施用。
根据本发明的免疫检查点抑制剂(ICI)可以特别是抗体，特别是抗PD-1、抗PD-L1(PD-1配体)、抗CTLA-4(细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)、抗NKG2A、抗TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)、抗TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)或抗LAG-3(淋巴细胞激活基因3)抗体。更具体地，根据本发明的至少一种免疫检查点抑制剂可以是选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A、抗TIM-3，抗TIGIT和抗LAG-3单克隆抗体的单克隆抗体。甚至更具体地，根据本发明的至少一种免疫检查点抑制剂可以是选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A、抗TIM-3和抗TIGIT单克隆抗体的单克隆抗体。
根据本发明的免疫检查点抑制剂(ICI)可以更特别地是抗体，特别是抗PD-1、抗PD-L1(PD-1配体)、抗CTLA-4(细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)、抗NKG2A、抗TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)、抗TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)或抗LAG-3(淋巴细胞激活基因3)抗体，甚至更具体地是抗体，特别是抗PD-1、抗PD-L1(PD-1配体)、抗CTLA-4(细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)、抗NKG2A、抗TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)或抗TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)抗体。更具体地，根据本发明的至少一种免疫检查点抑制剂可以是选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A、抗TIM-3，抗TIGIT和抗LAG-3单克隆抗体的单克隆抗体，并且特别地可以是选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A，抗TIM-3和抗TIGIT单克隆抗体的单克隆抗体。
抗PD-1单克隆抗体可以例如选自纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗。
抗PD-L1单克隆抗体可以例如选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗。
抗CTLA-4单克隆抗体可以例如选自伊匹单抗、曲美木单抗和quavonlimab。
抗NKG2A单克隆抗体可以例如是莫那利珠单抗。
抗TIM-3单克隆抗体可以例如选自Sym023和sabatolimab。
抗TIGIT单克隆抗体可以例如是替瑞利尤单抗。
抗LAG-3单克隆抗体可以例如是瑞拉利单抗。
特别地，ICI可以是抗PD-L1或抗PD-1单克隆抗体，并且特别是抗PD-1单克隆抗体。
根据本发明使用的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞和免疫检查点抑制剂可以同时或分开施用。
考虑到如实施例中所证明的，当将根据本发明的慢病毒载体与免疫检查点抑制剂组合时获得的意想不到的协同有利特性，可以预期，用根据本发明的慢病毒载体进行疫苗接种可以增加适合免疫检查点抑制剂治疗(尤其是抗PD-1)的患者数量。
“同时”应理解为(i)疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞和(ii)免疫检查点抑制剂可以同时施用或最多同一天或几天施用。在这种情况下，它们可以在相同的组合物中或在单独的组合物中施用。
应当理解，(i)根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞和(ii)免疫检查点抑制剂可以在不同的至少几天、例如至少两天施用。
具体地，当(i)疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞和(ii)免疫检查点抑制剂分开施用时，可以在免疫检查点抑制剂之前施用根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞。
有利地，根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞可以在施用免疫检查点抑制剂之前至少2天、特别是至少4天施用。因此，免疫检查点抑制剂可以有利地在根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞后至少2天、特别是至少4天施用。更具体地，免疫检查点抑制剂可以在根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞后4天至1个月，特别是4天至15天施用，并且更特别地在根据本发明的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞后4天至10天施用。
根据本发明使用的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞以及免疫检查点抑制剂可以通过相同途径或通过不同途径施用。
本文中的至少一种免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用，即产生其施用所要达到的效果的剂量。免疫检查点抑制剂的确切剂量将取决于治疗的目的并且可由本领域技术人员使用已知技术确定。
本发明还涉及一种用于在有需要的个体中治疗和/或预防HPV诱发的癌症的方法，包括向所述个体施用至少一种本发明的慢病毒载体、本发明的慢病毒载体颗粒或分离的细胞(特别是以根据本发明的疫苗组合物的形式)。
本发明进一步涉及至少一种本发明的慢病毒载体、本发明的慢病毒载体颗粒或本发明的分离的细胞(特别是以根据本发明的疫苗组合物的形式)用于在有需要的个体中治疗和/或预防的HPV诱发的癌症的用途
以下实施例和附图以举例说明的方式给出，并不暗示对本发明的限制。
实施例
材料和方法
小鼠
C57BL6jRj小鼠购自Janvier Labs(Le Genest-Saint-Isle，France)。所有动物均维持在专门的无病原体条件下，所有程序均根据批准的动物方案以及正确使用和护理实验动物的建议进行。所有动物实验均按照法国和欧洲实验动物护理和使用法规制定的指南进行。
肽、抗体和试剂
为了测试根据本发明的疫苗的反应性，从GenScript Biotech(Netherlands)订购纯度≥80％的15聚体重叠肽。抗CD4-VioBlue(克隆REA604)、抗CD45-VioGreen(克隆REA737)、抗FoxP3-Vio515(克隆REA788)、抗CD279(PD1)-PE(克隆REA802)、抗CD8a-PE-Vio770(克隆REA601)、抗CD25-APC(克隆REA568)、抗CD11c-FITC(克隆REA754)、抗CD11b-APC-Vio770(克隆REA592)购自Miltenyi Biotec。抗小鼠H-2kb(克隆AF6-88.5)、抗CD274(PD-L1)-APC(克隆MIH5)和抗CD16/CD32(克隆2.4G2)购自BDBiosciences。
将抗体与含有1％FCS(Gibco)的PBS混合在一起。
环磷酰胺购自Sigma，使用前重悬于PBS(Gibco)并保存于-20℃。
细胞
如前所述生成表达HPV-16E6和E7的TC-1肿瘤细胞(Lin等人Cancer Res.1996Jan1；56(1):21-6)：用HPV-16E6和E7基因和使用表达pVEJB的激活的人c-Ha-ras癌基因转化C57BL6小鼠的原代肺细胞。TC-1细胞系在Glutamax RPMI培养基(补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的Gibco)中培养。
慢病毒载体构建
将抗原(Ag)构建体克隆到pFlap-B2m-Ag-WPREMutee骨架中(骨架参见例如WO2016012623)。抗原质粒含有对于转导非有丝分裂细胞是必需的cPPT/CTS序列(序列SEQID NO：37)。U3启动子序列从3'长末端重复序列(LTR)中缺失，以避免载体复制。Beta-2微球蛋白(β2m)启动子控制所有转导的细胞中疫苗抗原的表达，因此抗原将优先在APC(抗原呈递细胞)中表达。此外，它缺乏可能诱导诱变和/或基因毒性作用的任何已知的增强子序列。抗原质粒含有土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式(序列SEQ IDNO：38)。野生型WPRE区域包含WHV X蛋白的截短形式，其可能具有致癌特性(Kingsman等人,Gene Ther.2005Jan；12(1):3-4)。我们的构建体中使用的WPRE的突变形式通过在X蛋白起始密码子内包含点突变来阻止截短的X蛋白的表达。这种突变的WPRE序列似乎不具有致癌特性(Themis等人,Mol Ther.2005Oct；12(4):763-71)。
包装质粒(pNDK)包含来自HIV-1亚型NDK(GenBank登录号：A34828)的gag-pol序列。蛋白质nef、vif、vpr、env不表达。此外，HIV-1整合酶蛋白序列(pol基因)中第64位(D64V)的天冬氨酸(D)替换为缬氨酸(V)足以抑制整合，而不干扰体外转基因表达。本发明的慢病毒颗粒是非整合颗粒。
包膜质粒：pCMV-VSV-G INDco(Indiana)和pCMV-VSV-GNJco(New Jersey)载体通过亚克隆水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白(VSV-G)Indiana(GenBank登录号J02428)构建)和NewJersey(GenBank登录号P04882)血清型插入到pVAX1表达载体(Invitrogen)中。将编码来自以下水泡病毒的糖蛋白的哺乳动物密码子优化的合成基因(GeneArt)克隆到pVAX1质粒(Invitrogen)中：水泡性口炎病毒Indiana血清型(GenBank FW591952)、New Jersey血清型(GenBank FW591956)和科卡尔病毒(GenBank:AF045556.1)。
慢病毒载体颗粒的生产
在含有1％青霉素/链霉素和10％FCS的DMEM中扩增HEK 293T细胞(ATCC)后，通过用3种质粒(病毒抗原质粒、包膜表达质粒和包装质粒)按照本领域众所周知的方法磷酸钙瞬时共转染HEK 293T细胞(ATCC)产生非整合型慢病毒颗粒。24小时后将培养基更换为无血清培养基。转染后48小时通过2500rpm离心收获和澄清上清液。通过超速离心(22000rpm/88250g、4℃下1小时)浓缩病毒颗粒，并重悬于保存缓冲液(20mM Pipes、75mM NaCl和2.5％蔗糖)中。
载体滴定
转导细胞(HEK 293T)后通过定量PCR测定慢病毒载体滴度。在转导前24小时将阿非迪霉素添加到HEK293T细胞中，并在整个滴定过程中保持不变。将细胞与含有50μg/mlRNaseA(sigma)的裂解缓冲液(200mM Tris、1％NP40和1％Tween20)一起孵育30分钟。将蛋白酶K(0.2mg/ml)添加到悬浮液中并在56℃下孵育4小时。RRE(Ag载体元件)和GAPDH(宿主细胞中)特异的引物对用于定量PCR。滴度滴度表示为转导单位(TU)/mL载体。
HPV疫苗的设计
如本文先前所讨论的，选择和修饰所实施的非致癌免疫原性E6和E7蛋白序列。
特别地，设计了4种不同的疫苗，其包含以下慢病毒载体：
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5759；
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5760；
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5761；或者
-于2021年10月21日在国家微生物菌种保藏中心(CNCM)提交的慢病毒载体，保藏号为I-5762。
通过载体滴定定量并表示为转导单位(TU)的包含这些功能性慢病毒载体的这些慢病毒载体颗粒在以下实施例中实施。
慢病毒载体疫苗(LV疫苗)的体内免疫原性
通过在50μL稀释剂中肌内(i.m.)注射，用根据本发明的LV疫苗(即，包含本发明的功能性慢病毒载体的本发明的慢病毒载体颗粒)对幼稚C57BL6雌性小鼠进行疫苗接种。14天后，准备脾细胞并用4个不同的HPV肽库(每个肽最终浓度为2μg/mL)重新刺激过夜以用于IFNg ELISPOT。每个肽库对应于以下非致癌抗原变体之一：HPV 16的E6蛋白的非致癌变体、HPV 16的E7蛋白的非致癌变体、HPV 17的E6蛋白的非致癌变体和HPV 17的E7蛋白的非致癌变体。它们由与完全选择的抗原相对应的重叠15聚体(具有11个氨基酸的重叠)组成。
体内肿瘤疫苗接种治疗
对于体内肿瘤实验，将1.106个TC-1细胞皮下注射(s.c.)到7至9周龄C57BL/6小鼠的右胁腹(注射前用电动剃须刀装置给小鼠剃毛)。当平均肿瘤体积达到预期范围时，将小鼠随机分组并通过肌内(i.m)注射用本发明的LV疫苗进行注射。通过每周3次用卡尺测量肿瘤直径来监测小鼠的肿瘤生长。由于伦理原因，肿瘤>1500mm3的小鼠必须被安乐死。
本发明的慢病毒疫苗在人PBMC中的免疫原性
将冷冻的人PBMC(StemCell)轻轻解冻，并在37℃下用0.5μMCFSE(Thermofischer)染色10分钟。然后将细胞在圆底96孔板中(每孔0.2x106个细胞)在完全RPMI中培养：10％FCS、10mM Hepes(Gibco)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)。7天后，离心细胞并添加新的完全RPMI(预热)。再过7天(总共14天)，细胞用荧光抗体染色，并通过流式细胞术(MACSQuant分析仪)获取数据
肿瘤免疫浸润的细胞计数分析
用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi)处理肿瘤。然后将细胞悬浮液通过70μm孔径的过滤器过滤，用红细胞裂解缓冲液(Sigma)处理，然后洗涤并在1200rpm下离心5分钟。如下对回收的细胞进行染色。
为了检测NK，使用近红外LD(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(克隆2.4G2，BD Biosciences)、APC-抗CD11b(克隆N418，BD Biosciences)、BV421-抗NKp46(克隆29A1.4，Biolegend)。
在Attune NxT细胞计数仪(Invitrogen)中采集样品，并通过FlowJo软件(Treestar,OR,USA)分析数据。
细胞内细胞因子染色
通过组织匀浆并通过100μm尼龙过滤器(Cell Strainer，BD Biosciences)获得来自免疫小鼠的脾细胞，并以4×106个细胞/孔铺在24孔板中。在10μg/mL同源肽或对照肽、1μg/mL抗CD28(克隆37.51)和1μg/mL抗CD49d(克隆9C10-MFR4.B)mAb(BD Biosciences)的存在下在6h内刺激脾细胞。在孵育的最后3小时内，用BD Biosciences的Golgi Plug和GolgiStop的混合物处理细胞。PE-Cy7-抗-CD107a(克隆1D4B，BioLegend)mAb也在此步骤添加到培养物中。然后收集细胞，用含有3％FBS和0.1％NaN3的PBS(FACS缓冲液)洗涤，并在4℃下与近红外Live/Dead(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(克隆2.4G2)、PerCP-Cy5.5-抗CD3ε(克隆145-2C11)、PE-Cy7-抗CD4(克隆RM4-5)和BV711-抗CD8(克隆53-6.7)mAb(BD Biosciences或eBioscience)的混合物一起孵育25分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，然后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDBioscience)进行透化。然后用Cytofix/Cytoperm试剂盒中的PermWash 1X缓冲液洗涤细胞两次，并与BV421-抗-IL-2(克隆JES6-5H4)、FITC-抗-TNF(MP6-XT22)、APC-抗-IFN-γ(克隆XMG1.2)和BV605-抗-IL-17A(克隆TC11-18H10)mAb(BD Biosciences)或适当对照Ig同种型的混合物在4℃下孵育30分钟。然后将细胞在PermWash中洗涤两次，在FACS缓冲液中洗涤一次，然后用Cytofix(BDBiosciences)在4℃下固定过夜。在Attune NxT细胞计数仪系统(Invitrogen)中采集细胞，并使用FlowJo软件(Treestar,OR,USA)进行数据分析。
实施例1：本发明的HPV疫苗在体内具有免疫原性
为了测量本发明的疫苗诱导免疫应答的能力，用4种疫苗免疫受体小鼠(每个测试疫苗的一组5只小鼠，以及对照组)。
小鼠经肌内注射1x107TU的慢病毒载体颗粒(包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体、在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体或在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体)或50μL稀释剂。14天后，准备脾细胞并用4个不同的肽库(每个肽最终浓度为2μg/mL)重新刺激过夜以用于IFNgELISPOT。获得的结果如图1所示。
实施例2：本发明疫苗的HPV疫苗完全消除体内良好植入的肿瘤TC-1肿瘤细胞已被广泛用作临床前模型来研究HPV诱发的肿瘤(Kim,J W等人Gene therapy vol.11,12(2004):1011-8)。这些肺肿瘤细胞被修饰以表达来自HPV 16的E6和E7(Lin等人CancerRes.1996Jan 1；56(1):21-6)。
向小鼠s.c.(皮下)注射TC-1细胞之后，在注射部位迅速发现实体瘤，并且未经治疗的动物肿瘤在30-40天内生长达到伦理终点。为了测试本发明的慢病毒载体颗粒的功效，皮下注射TC-1细胞，每隔一天测量肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为70mm3时，对小鼠进行随机分组并肌内接种1x108TU的LV-GFP Indiana(作为对照)、包含I-5759的Indiana慢病毒载体颗粒、包含I-5760的Indiana慢病毒载体颗粒、包含I-5761的Indiana慢病毒载体颗粒或包含I-5762的Indiana慢病毒载体颗粒。
获得的结果如图2所示。
在用包含在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体和在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒疫苗接种的100％的动物、在用在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体疫苗接种的87.5％的动物以及在用在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体疫苗接种的75％的动物中观察到肿瘤的快速且非常有效的消除。
包含含有在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒和含有在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒的疫苗显示出相同的肿瘤消除率(高于I-5760和I-5761)，但I-5759疫苗接种平均可以在37.5天(+/-7.4SD)内完全消除肿瘤，而I-5762疫苗接种后需要54.7天。
我们令人惊讶地观察到，最具免疫原性的载体并不是最具保护性的，并且免疫原性的排名并不适用于抗肿瘤功效。事实上，包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒是最有效的抗肿瘤疫苗，而包含在CNCM提交的保藏号为I-5760和I-5762的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒在测量IFN-γ产生时是更具免疫原性的载体。
实施例3：本发明施用的单一HPV疫苗可有效对抗肿瘤复发
复发在大多数癌症类型中都很常见，被定义为在一段时间的改善后疾病的复发。这通常是由于一些肿瘤细胞在最初的治疗中存活下来，并在治疗后数周、数月甚至数年形成新的肿瘤。
A：为了在我们的模型中模拟复发，在第60天时对消除原发肿瘤的小鼠的另一胁腹进行重新攻击。对照小鼠(未经治疗)也进行了皮下注射以检查肿瘤细胞注射情况。
获得的结果如图3所示。
该图显示在对照小鼠中s.c.注射TC-1细胞允许在不到30天的时间内形成达到伦理极限大小的实体瘤。再次攻击的小鼠(之前在疫苗接种后消除了右胁腹肿瘤)中的肿瘤生长明显减少。在前6天内观察到肿瘤生长，随后开始肿瘤消除。
肿瘤甚至在植入后13-16天被完全消除。对荷瘤小鼠施用单剂量疫苗接种允许完全消除原发性肿瘤，并且由于这些小鼠迅速消除了继发性肿瘤，因此强有力地防止复发。
B.进行了一项额外的实验，对在第一次植入后119天用1.106个TC-1肿瘤细胞消除另一胁腹的原发肿瘤的小鼠进行重新攻击，并在没有任何治疗的情况下维持。对照小鼠(未经治疗)也进行了皮下注射以检查肿瘤细胞注射情况。
获得的结果如图11所示。
所有再次攻击的小鼠在初次肿瘤攻击后145天仍然存活，这证明单次注射根据本发明的疫苗有效地促进了强烈的抗肿瘤记忆保护性免疫反应，其有效地塑造了T细胞对新攻击的反应。
实施例4：本发明的抗HPV疫苗的治疗效果是剂量依赖性的
为了确定较低剂量疫苗的效果，对携带TC1肿瘤的小鼠进行了功效研究。用根据本发明的包含慢病毒载体颗粒的疫苗以1x108或1x107TU/小鼠对小鼠进行疫苗接种，所述慢病毒载体颗粒包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体。
具体而言，将1x106个TC-1细胞注射到动物的胁腹中，每周两次测量肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为80mm3时，将小鼠随机分组并接种稀释液(对照)、1x107TU或1x108TU(i.m.)的I-5759疫苗。
获得的结果如图4所示。
虽然接种1x108TU疫苗允许完全和快速的肿瘤消除(接种后不到20天)，但我们观察到1x107TU疫苗接种剂量对肿瘤生长有部分影响。3/6(50％)的小鼠在接种疫苗后22天后肿瘤消失，其他小鼠在接种疫苗(5-10天内)后15-18天首先出现下降，但随后肿瘤生长无法得到控制。
根据本发明的疫苗的单次低剂量(1x107)显示出与用基于腺病毒载体的疫苗的3次注射所观察到的结果(Rice,AE等人Cancer gene therapy vol.22,9(2015):454-62)相当的部分抑制。这表明最佳剂量的根据本发明的疫苗将比腺病毒平台更有效。此外，疫苗的第二次注射很可能提高低剂量的功效。
实施例5：根据本发明的疫苗接种在所治疗的肿瘤中增加了CD4+和CD8+T细胞浸润
并减少了Treg
研究肿瘤浸润以进一步了解用本发明的慢病毒载体接种后诱导的抗肿瘤机制。将1x106个TC1肿瘤细胞注射(s.c.)在动物的胁腹上，每周两次测量肿瘤体积(卡尺测量)。当平均肿瘤体积为80mm3时，将小鼠随机分组并接种稀释剂(对照)或1x107TU的I-5759或1x108TU(i.m.)的I-5759。
接种疫苗后十天，收集肿瘤，消化并通过流式细胞术进行分析。根据本领域熟知的方法进行FACS染色并在Macsquant facs上获取数据。
获得的结果如图5所示。
与对照肿瘤相比，接种疫苗的小鼠的肿瘤浸润有更多的CD8+和CD4+T细胞。肿瘤中CD8+T细胞和CD4+T细胞的百分比分别增加约4倍和3倍。另一方面，在接受治疗的动物中，肿瘤中CD25+FoxP3+CD4+调节性T细胞(Treg)的百分比大幅降低。
这些观察结果非常重要，因为它们表明包含本发明的慢病毒载体的疫苗改善了CD8+T细胞和CD4+T细胞向肿瘤的募集，但也降低了肿瘤中Treg的百分比。
实施例6：本发明的HPV疫苗完全消除体内大肿瘤
众所周知，良好建立的肿瘤比小的早期肿瘤更难消除。大多数在TC1模型上测试的疫苗在较晚的时间点施用时效果较弱(Rice,AE等人Cancer gene therapy vol.22,9(2015):454-62；Berraondo,Pedro等人Cancer research vol.67,18(2007):8847-55)。将1x106个TC1肿瘤注射(s.c.)在动物的胁腹上。当平均肿瘤体积约为300mm3时，将小鼠随机分组并用稀释剂(对照)或1x108TU(i.m.)的根据本发明的包含慢病毒载体颗粒的疫苗进行疫苗接种，所述慢病毒载体颗粒包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体。每周用卡尺测量肿瘤体积两次。
获得的结果如图6所示。
可以看出，根据本发明的疫苗在完全消除良好建立的HPV诱发的肿瘤方面非常有效。
实施例7：本发明的HPV疫苗在体外诱导人PBMC活化
为了验证根据本发明的疫苗可以在人细胞中诱导T细胞应答，用CFSE标记人PBMC(干细胞)并在不存在(未刺激条件)或存在根据本发明的疫苗(I-5759)的情况下培养。培养两周后测量细胞增殖和活化。
通过在培养物中添加本发明的慢病毒载体增加CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖(通过CFSE稀释测量)和CD25激活标记物的表达。
获得的结果如图7所示。
由此可以得出结论，来自PBMC的抗原呈递细胞能够被根据本发明的HPV疫苗转导并且加工抗原以激活T细胞。
实施例8：本发明的HPV疫苗诱导的全身T细胞免疫和效应T细胞的表型
为了进一步了解所诱导的T细胞反应的质量，来自注射了Ctrl Lenti(LV-空Indiana)或根据本发明的包含慢病毒载体颗粒(包含在CNCM下提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体)的疫苗的小鼠的脾细胞未经处理或在体外用ETTDPDRAHYNIVTF和PDRAHYNIVTFCCKC E7HPV16衍生肽(其含有免疫显性H-2Db-限制性RAHYNIVTF表位)(FeltkampMC等人.Eur J Immunol1993；23:2242-9)的混合物进行刺激并通过细胞内染色(ICS)针对IL-2、TNF-α和IFN-γ进行分析。
获得的结果如图9A所示。
在用根据本发明的慢病毒载体疫苗接种的小鼠中，用这些肽刺激检测到CD8+T细胞应答。功能性CD8+T细胞效应子主要分布在IFN-γ+(单阳性)、TNF-α+IFN-γ+或IL-2+IFN-γ+(双阳性)和IL-2+TNF-α+IFN-γ+(三重阳性)子集中(参见图9B)。
大多数IFN-γ+CD8+T细胞还表达表面CD107a脱粒标记物，显示这些T细胞的效应特性(参见图9B)。
实施例9：接种本发明的HPV疫苗的小鼠中肿瘤细胞和肿瘤浸润先天免疫细胞的特
征
在疫苗接种后第11天以及因此在肿瘤消退阶段通过细胞计数法表征肿瘤内浸润物，显示来自接种本发明的疫苗(包含含有在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的慢病毒载体颗粒)的小鼠的消退肿瘤中天然杀伤(NK)细胞的比例的显著增加。
结果如图10所示。
实施例10：次优的Lenti-HPV-07疫苗接种与抗PD1免疫疗法协同作用
本发明人进一步研究了次优剂量的Lenti-HPV-07(I-5759)疫苗接种和抗PD-1疗法之间的潜在协同作用。
在注射根据本发明的包含慢病毒载体颗粒(包含在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体)的疫苗(D13，即向小鼠皮下注射TC-1细胞后13天)后四天(D17，即向小鼠皮下施用TC-1细胞后17天)开始抗PD-1治疗。进行抗PD-1的几次注射(如上所述的D17，然后是D20、D22、D24、D28和D31)。
特别地，对相同的三组肿瘤移植小鼠进行了实验。在第一组(10只小鼠-对照组)中，给小鼠施用LV空Indiana(D13)(作为对照)，四天后施用抗PD-1单克隆抗体(D17，然后是D20、D22、D24、D28和D31)。在第二组(12只小鼠-对照组)中，对小鼠施用根据本发明的疫苗(I-5759)(D13)，四天后施用对照抗体(同种型ctrl)(D17，然后D20，D22，D24、D28和D31)。在第三组(14只小鼠)中，对小鼠施用根据本发明的疫苗(D13)(I-5759)，四天后施用mAb抗PD-1(D17，然后D20、D22、D24、D28和D31)。
结果如图12A和12B所示。
次优剂量的疫苗(其诱导不足的抗肿瘤T细胞反应)与抗PD-1药物协同作用以提高肿瘤消退率。
14只小鼠中有6只实现了完全肿瘤消退，另外2只小鼠显示出部分肿瘤消退。在后者中，肿瘤体积缩小了67％，然后在抗PD-1治疗结束后6至7天肿瘤复发，这突出表明需要重复注射抗PD-1直到肿瘤完全消失。单独用次优剂量的本发明疫苗治疗的12只小鼠中只有3只表现出部分肿瘤消退。因此，与用次优剂量的Lenti-HPV-07治疗的小鼠相比，组合治疗组中的小鼠存活率显著增加(图12B)。因此，当Lenti-HPV-07疫苗候选物与抗PD1检查点抑制治疗相结合时，可以实现协同抗肿瘤作用。
实施例11：单次注射根据本发明的疫苗治愈了具有由静脉内注射TC1-nLuc细胞诱
导的肺转移灶的小鼠
用在泛素(UBC)启动子下编码纳米荧光素酶报告因子和嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(用于选择)的整合慢病毒载体稳定转导TC1亲代细胞系。用嘌呤霉素筛选后，将细胞亚克隆以获得TC1-nLuc细胞系。
对购自Janvier Laboratory的六周大的C57BL/6JRj小鼠静脉注射150000个TC1-nLuc细胞。第5天，通过肌内途径给小鼠注射单剂量的1.109TU/小鼠的Lenti-HPV-07或对照Lenti(空载体)。
使用与电荷耦合器件相机耦合的IVIS成像系统(IVIS Spectrum，Perkin Elmer)对活体动物进行生物发光成像。在生物发光成像之前，用氧气中2％的异氟烷麻醉小鼠，并在成像过程中通过鼻锥维持氧气中1.5％异氟烷的控制流量。将底物呋喃嗪(Z108)(由Dr.Yves Janin,Institut Pasteur提供)以2mg/ml溶解在酸性乙醇中。在静脉注射之前，Z108在无菌D-PBS中进一步稀释至所需浓度(0.4mg/kg)。然后立即将小鼠放入成像室中并成像。在自动曝光设置下拍摄连续图像，最大曝光时间为2分钟。
使用Living Image Software(版本2.50.1Xenogen)分析每个实验组的图像。对感兴趣的区域进行测量，并将发光值评估为总通量(光子/秒)。小鼠腹部和躯干被剃毛以提高信噪比。基线信号是从未经治疗的小鼠获得的，即既没有注射TC1-nLuc细胞，也没有注射慢病毒载体，但注射了Z108。
获得的结果表示在图13A和13B中。
本发明人已经确信，单次肌内注射根据本发明的Lenti-HPV-07疫苗(I-5759)在100％的动物中完全根除皮下移植的TC1肿瘤。然而，在人类中，许多癌症，包括HPV诱发的癌症，都位于粘膜部位。
因此，本实验评估了Lenti-HPV-07抑制粘膜部位肿瘤生长的能力。
为了解决这个问题，开发了稳定表达纳米荧光素酶报告基因(TC1-nLuc)的TC1细胞系。TC1-nLuc静脉注射后，小鼠很容易出现肺转移灶。
通过生物发光成像跟踪活体动物的纵向肿瘤生长。
肿瘤注射五天后，小鼠接受单次肌内注射的Lenti-HPV-07(1.109TU/小鼠)或对照Lenti(空载体)(图13A)。
所有接受Lenti-HPV-07的小鼠均在肿瘤注射后第22天治愈，而对照组的肺转移灶继续生长。两组中观察到的生物发光信号平均值之间的差异在很大程度上具有统计显著性(图13A和B)。
该观察结果以明确的方式表明，根据本发明的疫苗能够与皮下建立的肿瘤一样有效地根除肺部肿瘤。
序列
SEQ ID NO：1是编码来自HPV 16的E6蛋白的核酸序列(NC_001526.4)
ATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
SEQ ID NO：2是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
GACCCCCAAGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGCTGAGAAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTGTGCATCGTGTACCGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGATGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACCGGCCGGTGCATGAGCTGCTGCAGA
SEQ ID NO：3是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
ATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCGACCCCCAAGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGCTGAGAAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTGTGCATCGTGTACCGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGATGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACCGGCCGGTGCATGAGCTGCTGCAGA
SEQ ID NO：4是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
ATGGACCCCCAAGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGCTGAGAAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTGTGCATCGTGTACCGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGATGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACCGGCCGGTGCATGAGCTGCTGCAGA
SEQ ID NO：5是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
TTTCAGGACCCCCAGGAAAGGCCCAGGAAGTTGCCCCAGCTCTGCACCGAACTGCAGACCACCATTCATGACATCATCCTCGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTCCTGAGGAGGGAGGTGTACGATTTCGCCTTCAGAGACGGCTGTATCGTCTACAGGAACCCCTATGCCGTCTGCGACAAATGCCTGAAGTTTTATTCCAAGATCTCCGAGTACAGGCACTATTGCTACAGCCTGTATGGGACCACCCTGGAGCAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTCCTGATCAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGAGGTTCCACAACATCCGCGGCAGGTGGACCGGAAGGTGCATGTCCTGCTGCAGG
SEQ ID NO：6是编码来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
TTCCAGGACCCCCAGGAGAGGCCCAGGAAACTGCCCCAGTTGTGCACCGAGCTCCAGACAACCATCCACGACATCATCCTGGAGTGCGTGTACTGTAAGCAGCAGTTGCTGAGGAGAGAGGTGTATGACTTCGCCTTCAGAGACGGATGCATTGTCTATAGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGTGAGTACAGGCATTACTGCTACAGCCTGTATGGAACCACACTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTCCTGATTAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTCAGGTTCCACAACATCCGGGGCAGGTGGACCGGAAGGTGCATGTCCTGCTGCAGGTCC
SEQ ID NO：7是来自HPV 16的野生型(WT)E6蛋白的氨基酸序列
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
SEQ ID NO：8是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
DPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCR
SEQ ID NO：9是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
MGTLGIVCPIDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCR
SEQ ID NO：10是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
MDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCR
SEQ ID NO：11是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
FQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCR
SEQ ID NO：12是来自HPV 16的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
FQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRS
SEQ ID NO：13是编码来自HPV 16的E7蛋白的核酸序列(NP-041326.1)
ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
SEQ ID NO：14是编码来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
ACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACAACCGACCCCGACCGGGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATT
SEQ ID NO：15是编码来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
CCCGGAGACACCCCCACCCTGCACGAATACATGCTGGACCTGCAGCCCGAAACCACCGACCCCGACCGCGCTCACTACAACATCGTTACATTCTGTTGTAAATGCGACTCCACCCTGAGAAGATGCGTGCAGTCCACCCACGTGGACATCAGGACCCTGGAGGACCTCCTCATGGGAACCCTGGGTATCGTCTGCCCCATC
SEQ ID NO：16是来自HPV 16的野生型(WT)E7蛋白的氨基酸序列
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
SEQ ID NO：17是来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
TPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPI
SEQ ID NO：18是来自HPV 16的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
PGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPI
SEQ ID NO：19是编码来自HPV 18的E6蛋白的核酸序列(MF288727.1)
ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAACACGGCGACCCTACAAGCTACCTGATCTGTGCACGGAACTGAACACTTCACTGCAAGACATAGAAATAACCTGTGTATATTGCAAGACAGTATTGGAACTTACAGAGGTATTTGAATTTGCATTTAAAGATTTATTTGTGGTGTATAGAGACAGTATACCGCATGCTGCATGCCATAAATGTATAGATTTTTATTCTAGAATTAGAGAATTAAGACATTATTCAGACTCTGTGTATGGAGACACATTGGAGAAACTAACTAACACTGGGTTATACAATTTATTAATAAGGTGCCTGCGGTGCCAGAAACCGTTGAATCCAGCAGAAAAACTTAGACACCTTAATGAAAAACGACGATTCCACAACATAGCTGGGCACTATAGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAAAGACTCCAACGACGCAGAGAAACACAAGTATAA
SEQ ID NO：20是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
CCCTACAAGCTGCCTGACCTGTGTACAGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGTGTGTATTGCAAGACCGTGCTGGAACTGACCGAGGTGTTCGAGTTTGCCTTCAAGGATCTGTTCGTGGTGTACCGGGACAGCATCCCCCACGCCGCCTGCCACAAGCTGGAAAAGCTGACCAACACCGGCCTGTACAACCTGCTGATTCGGTGCCTGCGGTGTCAGAAGCCTCTGAACCCCGCCGAGAAGCTGCGGCACCTGAACGAGAAGCGGAGATTCCACAATATCGCC
SEQ ID NO：21是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
CCCTACAAGCTGCCTGACCTGTGTACAGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGTGTGTATTGCAAGACCGTGCTGGAACTGACCGAGGTGTTCGAGTTTGCCTTCAAGGATCTGTTCGTGGTGTACCGGGACAGCATCCCCCACGCCGCCTGCCACAAG
SEQ ID NO：22是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
CCCTACAAGCTGCCCGATCTGTGCACAGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGCGTCTACTGCAAGACCGTGCTGGAACTGACCGAGGTGTTCGAATTCGCCTTCAAGGACGGCTTCGTGGTGTACAGGGACAGCATTCCCCACGCCGCCTGCCATAAGCTGGAGAAACTGACCAACACCGGACTGTATAACCTGCTGATCAGGTGTCTGAGGTGCCAGAAGGCAGAGAAACTGAGACATCTGAACGAGAAAAGGAGGTTCCACAATATTGCCGGGCACTGATAA
SEQ ID NO：23是编码来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的核酸序列
ATGAGGCGGCCCTACAAGCTGCCCGACCTGTGCACCGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGCGTGTACTGCAAGACCGTGCTGGAGCTGACCGAGGTGTTCGAATTCGCATTCAAGGACGGATTCGTCGTGTATAGGGACAGCATTCCACACGCCGCCTGCCACAAGCTGGAGAAATTGACTAACACCGGACTGTATAATCTGCTGATCCGGTGCCTGAGGTGTCAGAAGGCCGAGAAGCTGAGGCATCTGAACGAGAAAAGGAGATTCCACAATATCGCCGGACAC
SEQ ID NO：24是来自HPV 18的野生型(WT)E6蛋白的氨基酸序列
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV
SEQ ID NO：25是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
PYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIA
SEQ ID NO：26是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
PYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHK
SEQ ID NO：27是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
PYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGH
SEQ ID NO：28是来自HPV 18的E6蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
MRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGH
SEQ ID NO：29是编码来自HPV 18的E7蛋白的核酸序列(NC_001357.1)
ATGCATGGACCTAAGGCAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACCTTCTATGTCACGAGCAATTAAGCGACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAGTTAATCATCAACATTTACCAGCCCGACGAGCCGAACCACAACGTCACACAATGTTGTGTATGTGTTGTAAGTGTGAAGCCAGAATTGAGCTAGTAGTAGAAAGCTCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTGTTTCTGAACACCCTGTCCTTTGTGTGTCCGTGGTGTGCATCCCAGCAGTAA
SEQ ID NO：30是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
AAGGCCACACTGCAGGATATCGTGCTGCACCTGGAACCCCAGAACGAGATCCCCGTGGACAGCGAGGAAGAGAACGACGAGATCGACGGCGTGAACCACCAGCATCTGCCCGCCAGAAGGGCCGAGCCCCAGAGACACACCATGCTGTGCATGTGTTGCAAATGCGAGGCCCGGATCAAGCTGGTGGTGGAAAGCAGCGCCGACGACCTGCGGGCCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAACACCCTGTCCTTCGTGTGCCCTTGG
SEQ ID NO：31是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
GGACCTAAAGCCACCCTCCAGGACATCGTGCTGCACCTGGAGCCCCAGAACGAGATCCCCGTCGACTCAGAGGAGGAGAACGACGAAATTGACGGCGTCAACCACCAGCACCTGCCCGCTCGCAGAGCCGAACCCCAGAGACACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAGGCCCGGATTAAGCTGGTGGTGGAGAGCTCCGCCGACGATCTGAGAGCCTTCCAGCAGCTCTTCCTGAACACCCTGTCCTTCGTGTGCCCCTGG
SEQ ID NO：32是编码来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的核酸序列
GGACCTAAAGCCACCCTCCAGGACATCCGTCTGGAGCCCCAGAACGAGATCCCCGTCGACTCAGAGGAGGAGAACGACGAAATTGACGGCAACCACCAGCACCTGCCCGCTCGCAGAGCCGAACCCCAGAGACACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAGGCCCGGATTAAGCTGGTGGTGGAGAGCTCCGCCGACGATCTGAGAGCCTTCCAGCAGCTCTTCCTGGATTCCTTCGTGTGCCCCTGG
SEQ ID NO：33是来自HPV 18的野生型(WT)E7蛋白的氨基酸序列
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO：34是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
KATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPW
SEQ ID NO：35是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
GPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPW
SEQ ID NO：36是来自HPV 18的E7蛋白的非致癌变体的氨基酸序列
GPKATLQDIRLEPQNEIPVDSEEENDEIDGNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLDSFVCPWSEQ ID NO：37是编码cPPT/CTS序列的核酸序列
AATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT
SEQ ID NO：38是编码土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式的核酸序列
TTCCCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC
SEQ ID NO：39是包含RAHYNIVTF H-2Db-限制性T细胞表位的合成E7HPV16-衍生肽
ETTDPDRAHYNIVTF
SEQ ID NO：40是包含RAHYNIVTF H-2Db-限制性T细胞表位的合成E7HPV16-衍生肽
PDRAHYNIVTFCCKC
SEQ ID NO：41是编码在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体的抗原构建体的核酸序列
ATGCCCGGAGACACCCCCACCCTGCACGAATACATGCTGGACCTGCAGCCCGAAACCACCGACCCCGACCGCGCTCACTACAACATCGTTACATTCTGTTGTAAATGCGACTCCACCCTGAGAAGATGCGTGCAGTCCACCCACGTGGACATCAGGACCCTGGAGGACCTCCTCATGGGAACCCTGGGTATCGTCTGCCCCATCGCCTCCCAGGCTTTTCAGGACCCCCAGGAAAGGCCCAGGAAGTTGCCCCAGCTCTGCACCGAACTGCAGACCACCATTCATGACATCATCCTCGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTCCTGAGGAGGGAGGTGTACGATTTCGCCTTCAGAGACGGCTGTATCGTCTACAGGAACCCCTATGCCGTCTGCGACAAATGCCTGAAGTTTTATTCCAAGATCTCCGAGTACAGGCACTATTGCTACAGCCTGTATGGGACCACCCTGGAGCAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTCCTGATCAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGAGGTTCCACAACATCCGCGGCAGGTGGACCGGAAGGTGCATGTCCTGCTGCAGGTCCGCCGGCCCCGGACCTAAAGCCACCCTCCAGGACATCGTTCTCCACCTGGAGCCCCAGAACGAGATCCCCGTGGACTCAGAAGAGGAGAACGACGAGATCGACGGCGTCAACCACCAGCACCTGCCCGCTCGCAGAGCCGAACCCCAGAGACACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAAGCCCGGATTAAGTTGGTGGTGGAAAGCAGCGCCGACGATCTGAGGGCCTTCCAGCAGCTCTTCCTCAACACCCTGTCCTTCGTGTGCCCCTGGGTGGGCGAGCCCGGTAGAACCATCCCCTACAAGCTGCCCGATCTGTGCACAGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGCGTCTACTGCAAGACCGTGCTGGAACTGACCGAGGTGTTCGAATTCGCCTTCAAGGACGGCTTCGTGGTGTACAGGGACAGCATTCCCCACGCCGCCTGCCATAAGCTGGAGAAACTGACCAACACCGGACTGTATAACCTGCTGATCAGGTGTCTGAGGTGCCAGAAGGCAGAGAAACTGAGACATCTGAACGAGAAAAGGAGGTTCCACAATATTGCCGGGCACTGATAA
SEQ ID NO：42是在CNCM提交的保藏号为I-5759的慢病毒载体编码的抗原构建体的氨基酸序列
MPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIASQAFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRSAGPGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWVGEPGRTIPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGH
SEQ ID NO：43是编码在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体的抗原构建体的核酸序列
ATGTTCCAGGACCCCCAGGAGAGGCCCCGGAAGTTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTCGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGCTGAGGAGGGAGGTGTATGACTTTGCCTTCAGAGACGGATGCATTGTCTACAGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAATGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGCGAGTACAGGCACTACTGCTACTCCCTGTACGGCACCACCCTCGAACAGCAGTACAACAAACCCCTGTGCGACCTCCTGATTAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTCAGGTTCCACAACATCCGCGGCCGCTGGACCGGCCGATGCATGTCTTGCTGCAGGGGCCCCGACGACCCCTACAAGCTCCCCGACCTGTGCACCGAACTCAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGCGTGTATTGCAAGACCGTGCTGGAGCTGACCGAGGTTTTCGAATTTGCCTTTAAGGACGGCTTCGTCGTGTATAGGGACTCCATCCCCCACGCCGCCTGCCATAAGCTGGAGAAGCTCACCAACACCGGACTGTATAATCTGCTGATCAGGTGCCTCAGGTGCCAGAAGGCAGAAAAGCTGAGGCATCTCAACGAGAAGCGCCGGTTCCACAATATTGCCGGCCCCGGAGACACCCCCACACTCCATGAGTACATGCTCGACCTGCAGCCCGAAACCACCGACCCCGACAGAGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACTCCACCCTGAGAAGATGCGTGCAGTCCACCCACGTGGACATCCGCACACTCGAAGACCTGCTGATGGGAACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCGGCCCCGATGACAAGGCCACCTTGCAGGACATCGTGCTGCACCTGGAACCACAGAACGAGATCCCCGTCGACTCCGAAGAAGAAAACGACGAAATCGACGGAGTGAATCACCAGCACCTGCCCGCCAGAAGGGCCGAGCCTCAGAGACACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAAGCCAGGATTAAGCTGGTGGTGGAGAGCAGCGCCGACGACCTGAGGGCCTTCCAGCAGCTCTTCCTGAACACACTGTCCTTCGTGTGCCCCTGGGCCTGATAA
SEQ ID NO：44是在CNCM提交的保藏号为I-5760的慢病毒载体编码的抗原构建体的氨基酸序列
MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRGPDDPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIGPDDKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWA
SEQ ID NO：45是编码在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体的抗原构建体的核酸序列
ATGAGGCGGCCCTACAAGCTGCCCGACCTGTGCACCGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATCGAGATCACCTGCGTGTACTGCAAGACCGTGCTGGAGCTGACCGAGGTGTTCGAATTCGCATTCAAGGACGGATTCGTCGTGTATAGGGACAGCATTCCACACGCCGCCTGCCACAAGCTGGAGAAATTGACTAACACCGGACTGTATAATCTGCTGATCCGGTGCCTGAGGTGTCAGAAGGCCGAGAAGCTGAGGCATCTGAACGAGAAAAGGAGATTCCACAATATCGCCGGACACTTCCAGGACCCCCAGGAGAGGCCCAGGAAACTGCCCCAGTTGTGCACCGAGCTCCAGACAACCATCCACGACATCATCCTGGAGTGCGTGTACTGTAAGCAGCAGTTGCTGAGGAGAGAGGTGTATGACTTCGCCTTCAGAGACGGATGCATTGTCTATAGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGTGAGTACAGGCATTACTGCTACAGCCTGTATGGAACCACACTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTCCTGATTAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTCAGGTTCCACAACATCCGGGGCAGGTGGACCGGAAGGTGCATGTCCTGCTGCAGGTCCGCCGGCCCCGGACCTAAAGCCACCCTCCAGGACATCGTGCTGCACCTGGAGCCCCAGAACGAGATCCCCGTCGACTCAGAGGAGGAGAACGACGAAATTGACGGCGTCAACCACCAGCACCTGCCCGCTCGCAGAGCCGAACCCCAGAGACACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAGGCCCGGATTAAGCTGGTGGTGGAGAGCTCCGCCGACGATCTGAGAGCCTTCCAGCAGCTCTTCCTGAACACCCTGTCCTTCGTGTGCCCCTGGGCCGGTCCCGGTGACACACCTACCCTGCACGAGTACATGCTCGATCTGCAGCCCGAGACCACCGACCCCGATCGCGCACACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAATGTGACAGCACCCTGAGACGGTGCGTCCAGTCCACCCACGTTGACATCCGCACCCTCGAAGACCTGCTCATGGGAACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCGCCTGATAA
SEQ ID NO：46是在CNCM提交的保藏号为I-5761的慢病毒载体编码的抗原构建体的氨基酸序列
MRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGHFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRSAGPGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIASEQ ID NO：47是编码在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体的抗原构建体的核酸序列
ATGGGCCCTAAGGCCACCCTGCAGGACATCGTGCTGCACTTGGAGCCCCAGAACGAGATCCCCGTGGACAGCGAGGAGGAGAACGACGAAATCGACGGCGTGAACCACCAGCACCTGCCCGCAAGAAGGGCCGAACCCCAGAGGCACACCATGCTCTGCATGTGCTGCAAATGCGAGGCCAGGATCAAGCTGGTGGTGGAAAGCAGCGCCGACGATCTGAGGGCATTCCAGCAGCTGTTCCTGAACACCCTCTCCTTCGTGTGCCCTGGGGAACCCGGCAGGACCATCCCCTATAAACTGCCCGACCTCTGCACCGAGCTGAACACCTCCCTGCAGGACATTGAGATCACCTGCGTCTACTGCAAAACCGTCCTGGAACTGACCGAGGTGTTCGAGTTCGCCTTCAAAGACGGCTTCGTCGTGTACAGGGACAGCATCCCCCACGCCGCCTGCCATAAGCTGGAGAAACTGACCAACACCGGCCTGTACAACCTGCTGATCCGGTGCCTGAGATGTCAGAAGGCCGAGAAACTGAGGCACCTCAACGAGAAAAGGAGATTCCACAATATTGCCGGGCCCGGCGACACCCCAACCCTGCACGAATACATGCTCGACCTGCAGCCCGAAACCACCGACCCCGACAGAGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACTCCACCCTGAGAAGATGCGTGCAGTCCACCCACGTGGACATCCGCACACTCGAAGACCTGCTGATGGGAACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCGCTTCCCAGGCCTTTCAGGACCCCCAGGAACGGCCAAGAAAGCTGCCCCAGCTCTGCACCGAACTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTCTACTGTAAGCAGCAGTTGCTGAGGAGGGAGGTGTATGATTTCGCCTTCAGAGACGGCTGCATCGTCTACAGGAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAATGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCTCCGAATACAGACACTATTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTCGAACAGCAGTACAACAAACCCCTGTGCGACCTCCTGATCAGGTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTCCGGTTCCACAACATCCGAGGAAGATGGACCGGCCGGTGCATGTCCTGCTGCAGGTCCTGATAA
SEQ ID NO：48是在CNCM提交的保藏号为I-5762的慢病毒载体编码的抗原构建体的氨基酸序列
MGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPGEPGRTIPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDGFVVYRDSIPHAACHKLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKAEKLRHLNEKRRFHNIAGPGDTPTLHEYMLDLQPETTDPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPIASQAFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLRFHNIRGRWTGRCMSCCRS
Claims (26)
1.一种慢病毒载体，特别是非整合型慢病毒载体，其包含选自以下的至少四种不同核酸序列：
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列，
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列，以及
-至少一种编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其中所述编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其中所述编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少68％序列同一性的氨基酸序列，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的慢病毒载体，其中所述编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的慢病毒载体，其中所述编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列编码与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少83％序列同一性的氨基酸序列，所述核酸序列特别选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：32。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的慢病毒载体，其中编码抗原的所述至少四种不同核酸序列融合在一起，形成在单一启动子序列控制下编码单一抗原融合蛋白的单一抗原核酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的慢病毒载体，其中所述至少四种不同核酸序列从5’端至3’端的顺序选自以下：
(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列；
(b)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列；
(c)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列；和
(d)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的慢病毒载体，其中所述至少四种不同核酸序列从5'端到3'端的顺序是：(a)编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 16)蛋白E6抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E7抗原的核酸序列-编码非致癌人乳头瘤病毒(HPV 18)蛋白E6抗原的核酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的慢病毒载体，其包含编码与SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列特别是核酸序列SEQ ID NO：41。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的慢病毒载体，其选自在CNCM提交的保藏号为I-5759、I-5760、I-5761和I-5762的非整合型慢病毒载体，和特别是在CNCM提交的保藏号为I-5759的非整合型慢病毒载体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含MHC I类启动子，并且特别是β2-微球蛋白启动子。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含cPPT/CTS序列，特别是如序列SEQ ID NO：37所示的cPPT/CTS序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含缺乏其U3启动子序列的3’长末端重复序列(LTR)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含组成型增强子序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的非整合型慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)的突变形式，并且特别地具有如序列SEQ ID NO：38所示的序列。
16.一种慢病毒载体颗粒，特别是非整合型慢病毒载体颗粒，其包含至少一种如权利要求1至15中任一项所定义的慢病毒载体。
17.根据权利要求16所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含功能性慢病毒整合酶蛋白。
18.根据权利要求16或17所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)，特别是VSV-GIndiana血清型或VSV-G New Jersey血清型。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体颗粒包含HIV-1亚型D Gag和Pol蛋白。
20.一种分离的细胞，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的慢病毒载体或根据权利要求16至19中任一项所述的慢病毒载体颗粒。
21.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的慢病毒载体、根据权利要求16至19中任一项所述的慢病毒载体颗粒或根据权利要求20所述的细胞。
22.根据权利要求21的疫苗组合物，其用于治疗或预防HPV诱发的癌症，特别是选自宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌及其转移瘤，特别是其肺转移瘤。
23.根据权利要求1至15中任一项所述的慢病毒载体、根据权利要求16至19中任一项所述的慢病毒载体颗粒或根据权利要求20所述的细胞，其用作药物或疫苗。
24.根据权利要求23所述的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞，其用于治疗或预防HPV诱发的癌症，特别是选自宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌及其转移瘤，特别是其肺转移瘤。
25.根据权利要求22所述使用的疫苗组合物，或根据权利要求23或24所述使用的慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞，其中所述疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞与至少一种免疫检查点抑制剂组合施用，所述至少一种免疫检查点抑制剂特别选自抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗NKG2A、抗TIM-3、抗TIGIT和抗LAG-3单克隆抗体的至少一种单克隆抗体，更特别地与至少一种抗PD-1单克隆抗体组合施用。
26.根据权利要求25所述使用的疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂同时或分开施用，并且特别地，所述至少一种免疫检查点抑制剂在施用所述疫苗组合物、慢病毒载体、慢病毒载体颗粒或细胞后至少2天并且特别是至少4天施用。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| EP21306581.6 | 2021-11-15 | ||
| US63/279,945 | 2021-11-16 | ||
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |