JP2001169784A - Ｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なエイズワクチンを提供すること。 【解決手段】 ウイルスのコアタンパク質の少なくとも
一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイ
ルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコ
ードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡワクチンに
関し、例えば、エイズ（ＡＩＤＳ：Acquired Immune De
ficiency Syndrome（後天性免疫不全症候群））用のＤ
ＮＡワクチンに関する。より詳細には、本発明は、例え
ば、ヒト免疫不全ウイルス（本明細書中、ＨＩＶとも記
す）またはサル免疫不全ウイルス（本明細書中、ＳＩＶ
とも記す）などのウイルスの感染の予防、並びに、例え
ば、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズ発症などのよ
うなウイルス感染によるウイルス疾患の発症の予防及び
／治療のために用いることができるＤＮＡワクチンに関
する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトにおけるエイズの原因となるＨＩＶ
は、レトロウイルスの一種であり、１型及び２型などが
知られている。ＨＩＶは、血液を媒介として例えば感染
者との性交渉あるいは患者の血液輸血などによって感染
し、そして感染により血液中のＴ細胞が破壊され、免疫
機能が著しく低下し、カポシ肉腫、カリニ肺炎等に罹患
して死に至る疾患である。ＨＩＶ感染者数は近年、加速
度的に増加しており、特にタイ、アメリカ合衆国などの
諸国においては、エイズが国民の死亡原因の上位に位置
しており、その予防および治療法を確立することは極め
て重要である。エイズに対する予防および治療法につい
ては現在までに多くの研究がなされている。中でも、エ
イズワクチン開発は、社会的にも必要度が高く、最重要
課題である。このエイズワクチンに関する研究は、主に
マカクサルにおけるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感
染などの霊長類モデルにおいておこなわれている（John
son,R.P., Curr.Opin.Immunol. 8, 554-560(1996)；及
びAlmond, N.M.他、AIDS 12, 133-140(1998））。

【０００３】一般に、ワクチンにより誘導される感染防
御免疫としては、主に中和抗体による液性免疫とＴリン
パ球による細胞性免疫の２つが考えられており、エイズ
ワクチンにおいても両者の重要性は指摘されている(Dit
tmer, U. 他、Nature Med. 5,189-193 (1999))。このう
ち、液性免疫については、ＨＩＶの構造上の特異性およ
び多様性の問題等のため、充分有効な免疫誘導が容易で
はない(Shibata, R.他、Nature Med. 5,204-210 (199
9))。一方、近年特に、ＨＩＶあるいはＳＩＶ感染抑制
における細胞性免疫の重要性が指摘されている(Gerett
i, A.M. 他、J.Gen.Virol, 79, 415-421 (1998); Matan
o, T. 他、J. Virol, 72, 164-169 (1998);Scmits, J.
E. 他、Science 283, 857-860 (1999); Jin, X. 他、J.
Exp. Med.189, 991-998 (1999))。しかし、現時点で
は、これらの感染防御免疫を充分有効かつ安全に誘導す
るエイズワクチンは開発されていない。

【０００４】エイズワクチンの１つとして注目されてい
るものに弱毒化生ウイルスワクチンがある。これは、病
原性を持つＨＩＶに遺伝子操作を施すなどして病原性を
消失させたウイルスを免疫原として使用する方法であ
る。弱毒化したウイルスは接種された宿主に対して効果
が長期間持続する強い免疫原性を誘導する。弱毒化生ウ
イルスワクチンは霊長類を用いた動物実験レベルにおい
て比較的良好な有効性が確認されているが(Daniel,M.
D.,他、Science 258, 1938-1941(1992)；Shibata,R.,
他、J.Virol. 70, 4361-4369(1996)；及びShibata,R.,
他、J.Virol. 71, 814-8148(1997))、ウイルスの病原性
が回復したり、他のウイルスにより汚染されている可能
性が残る等といった安全性の問題が未解決であるため実
用化には至っていない（Baba,T.W.,他、Science 267, 1
820-1825(1995)；及びBaba,T.W.,他、Nature Med. 5, 1
94-203(1999)）。

【０００５】比較的安全と考えられるエイズワクチンと
しては、サブユニットワクチン・ウイルスベクターワク
チン・ＤＮＡワクチンが主なものであり、それぞれ、ア
ジュパンドとの併用あるいは他の方法との併用等も試み
られてきている(Letvin, N.L. 他、Science 280, 1875-
1880(1998))。サブユニットワクチンは、ＨＩＶの蛋白
質あるいはそれに含まれるペプチドを合成・精製し免疫
原として用いるものであるが、有効な抗エイズ感染防御
免疫は誘導できていない。抗原存続時間が短いこと、細
胞性免疫誘導機能が弱いこと等の理由が考えられてい
る。ウイルスベクターワクチンはワクシニアウイルスベ
クター等の組み換えウイルスベクターを用いてＨＩＶ蛋
白質を抗原として発現させるものであるが、ウイルスベ
クター由来のウイルス抗原に対する免疫反応が強く、Ｈ
ＩＶ抗原に対する免疫誘導能は不充分である。従って、
他の方法との併用を中心に検討されている。ＤＮＡワク
チンは、ＨＩＶ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
を投与することにより、ＨＩＶ抗原を発現させるもので
ある。細胞性免疫誘導能が比較的良好なこと等から近年
特に注目されているが、充分有効な抗エイズ感染防御免
疫は誘導できていない。(ウイルス複製を起こす弱毒化
生ウイルスワクチンと比較して、)抗原発現量が低いこ
とおよび抗原発現時間が短いこと等の理由が考えられて
いる。以上のように、現時点では、安全性と有効性の両
方を満たすエイズワクチンは開発されていない（Burto
n,D.R.他、Nature Med. 4, 495-498(1998)；Lu, S.,
他、J.Virol. 70, 3978-3991(1996)）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は新規なＤＮＡ
ワクチンを提供することを解決すべき課題とした。本発
明はまた、安全性が高いと同時に十分な感染防御免疫を
誘導できるＤＮＡワクチンを提供することを解決すべき
課題とした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、ＳＨＩＶ（ヒトおよ
びサル由来のキメラの免疫不全ウイルス）のｅｎｖ遺伝
子の一部をＦＭＬＶのｅｎｖ遺伝子に置き換えることに
よって作製した組み換えウイルスＤＮＡとＦＭＬＶレセ
プターをコードするＤＮＡとを一緒にサルに投与するこ
とにより、安全かつ有効にＳＩＶ感染防御細胞性免疫を
誘導できることを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ウイルスのコアタンパク質の少
なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白
血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも
一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルス
ＤＮＡが提供される。

【０００８】好ましくは、ウイルスのコアタンパク質の
少なくとも一部をコードするＤＮＡは、レトロウイルス
のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ
と、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部を
コードするＤＮＡである。好ましくは、レトロウイルス
はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全
ウイルス（ＳＩＶ）である。好ましくは、ウイルスのコ
アタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡは、
コードされる蛋白質が免疫原性を有し、当該蛋白質によ
ってウイルス粒子が再構成されるようなＤＮＡである。
好ましくは、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬ
Ｖ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮ
Ａは、当該ＤＮＡを含む組み換えウイルスＤＮＡ由来の
ウイルスがＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたは
サルの細胞には感染不可能で、ＦＭＬＶレセプターを発
現する細胞には感染可能であるようなＤＮＡである。

【０００９】好ましくは、本発明の組み換えウイルスＤ
ＮＡは、ウイルスのコアタンパク質をコードするＤＮＡ
と、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎ
ｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有す
る組み換えウイルスＤＮＡであり、より好ましくは、レ
トロウイルスのＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、レ
トロウイルスのＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フ
レンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白
質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み
換えウイルスＤＮＡであり、さらに好ましくは、ヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス
（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質をコードするＤＮＡと、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイル
ス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質をコードするＤＮＡと、フ
レンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白
質の少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有する組み
換えウイルスＤＮＡである。本発明の一態様によれば、
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少な
くとも一部をコードするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）のＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコード
するＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬ
Ｖ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮ
Ａとを有する、組み換えウイルスＤＮＡが提供される。
本発明の別の態様によれば、サル免疫不全ウイルス（Ｓ
ＩＶ）のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤ
ＮＡと、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白
質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、フレンドマ
ウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少な
くとも一部をコードするＤＮＡとを有する、組み換えウ
イルスＤＮＡが提供される。

【００１０】本発明の別の側面によれば、本発明の組み
換えウイルスＤＮＡを含む、ワクチンが提供され、好ま
しくはエイズワクチンが提供される。本発明のワクチン
は好ましくは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡ
を有する発現ベクターと一緒に用いられる。本発明の別
の側面によれば、本発明の組み換えウイルスＤＮＡと、
ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベ
クターとを含むワクチンが提供され、好ましくはエイズ
ワクチンが提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法および実
施態様について詳細に説明する。本発明の組み換えウイ
ルスＤＮＡは、ウイルスのコアタンパク質の少なくとも
一部をコードするＤＮＡ（好ましくは、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩ
Ｖ）などのようなレトロウイルスのＧａｇ蛋白質の少な
くとも一部をコードするＤＮＡと該ウイルスのＰｏｌ蛋
白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ）と、フレン
ドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の
少なくとも一部をコードするＤＮＡとを有するキメラＤ
ＮＡであることを特徴とする。本明細書で言うウイルス
の種類は特に限定されず、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウ
イルスでもよく、また一本鎖ウイルスでも二本鎖ウイル
スでもよい。好ましいウイルスの具体例としては、レト
ロウイルスが挙げられる。本明細書で言うレトロウイル
スは通常の意味を有し、ＲＮＡウイルスの中で遺伝子Ｒ
ＮＡをＤＮＡに変換する生活環をもつウイルスである。
レトロウイルスの具体例としては、例えば、マウス白血
病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉおよび
ＨＴＬＶ−II、ある種の癌ウイルス、並びにエイズウイ
ルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または
サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）など）などが挙げられ
る。レトロウイルスは通常、タンパク質をコードする３
種の遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをもって
いる。本明細書で言う「ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）」または「サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）」と
は、ヒトまたはサルに感染する免疫不全ウイルスの全て
を包含する最も広い意味を有し、あらゆるウイルスタイ
プまたはそれらの変異体の全てを包含する。

【００１２】本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ウイ
ルスのコアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤ
ＮＡを含み、特に好ましくはＨＩＶまたはＳＩＶなどの
レトロウイルス由来のＧａｇ蛋白質の少なくとも一部と
Ｐｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含
む。即ち、本発明のウイルスＤＮＡによりコードされる
ウイルスのコアタンパク質は完全蛋白質でも部分蛋白質
でもよい。Ｇａｇ蛋白質及び／又はＰｏｌ蛋白質などの
コアタンパク質の部分蛋白質をコードするＤＮＡを用い
る場合には、コードされる部分蛋白質が免疫原性を有す
るようなＤＮＡが好ましく、またコードされる部分蛋白
質によってもウイルス粒子が再構成され得るようなＤＮ
Ａが好ましい。本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好ま
しくは、Ｇａｇ蛋白質の完全蛋白質とＰｏｌ蛋白質の完
全蛋白質をコードするＤＮＡを有する。本発明の組み換
えウイルスＤＮＡは更に、フレンドマウス白血病ウイル
ス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコー
ドするＤＮＡを有する。Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮ
Ａについても、コアタンパク質と同様に、完全蛋白質を
コードするＤＮＡでも部分蛋白質をコードするＤＮＡで
もよいが、好ましくは完全Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤ
ＮＡである。また、Ｅｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ
は、ＨＩＶまたはＳＩＶ由来のＥｎｖ蛋白質をコードす
るＤＮＡの一部のみをＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部を
コードするＤＮＡに置き換えたものでもよい。この場
合、ＦＭＬＶのＥｎｖ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ
を有する本発明の組み換えＤＮＡ由来のウイルスは、Ｆ
ＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたはサルの細胞に
は感染せず、ＦＭＬＶレセプターを発現する細胞のみに
感染できることが好ましい。

【００１３】また、本発明の組み換えウイルスＤＮＡ
は、コアタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮ
Ａと、Ｅｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮ
Ａとを有するが、各々のＤＮＡのコピー数は少なくとも
１以上であれば、そのコピー数は限定されず、２コピー
以上のＤＮＡ断片を１つの組み換えウイルスＤＮＡ中に
含んでいてもよい。また、上記３種類の蛋白質の少なく
とも一部をコードする各々のＤＮＡの位置関係も特には
限定されない。本発明の組み換えウイルスＤＮＡは、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Adachi,A.,他、J.Viro
l.59,284-291(1986);及びShibata,R.,他、J.Virol.69,4
453-4462(1986)）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩ
Ｖ）（Kestler,H.,他、Science.248,1109-1112(1990)）
またはＨＩＶとＳＩＶの一部ずつを含んで成るキメラウ
イルス（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176, 362-373
(1997)等に記載）遺伝子などのような任意の公知のウイ
ルス遺伝子を出発材料として使用して、その中に含まれ
るＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードする領域を、
常法のＤＮＡ組換え技術を用いてフレンドマウス白血病
ウイルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部
をコードするＤＮＡに置き換えることによって作製する
ことができる。

【００１４】本発明の組み換えウイルスＤＮＡは好まし
くは、ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する
発現ベクターと一緒にワクチンとして用いられる。ＦＭ
ＬＶレセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクタ
ーは好ましくは発現プラスミドベクターである。発現ベ
クターの作製において有用なベクターとしては、構成性
プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモ
ーターを含むベクターなどが挙げられるが、これらに限
定されるわけではない。

【００１５】構成性プロモーターの具体例としては、例
えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、ラウス肉
腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、シミアンウイルス−４０
（ＳＶ４０）由来、あるいは単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）由来のプロモーターなどのウイルス由来の強力な
プロモーターが挙げられる。組織特異的プロモーターの
具体例としては、筋βアクチンプロモーターが挙げられ
る。誘導性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモ
ン調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあ
るプロモーター、あるいは抗生物質誘導性プロモータ
ー、あるいは亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター
などが挙げられる。

【００１６】ＦＭＬＶレセプターの発現ベクターの構築
のために用いるベクターは、プロモーター（例えば、上
記の構成性または誘導性プロモーター）ＤＮＡ配列を含
む発現制御配列を含むことが好ましい。ベクターはさら
に、エンハンサー要素、ポリアデニル化シグナル（例え
ば、ＳＶ４０あるいはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由
来）、スプライシングシグナル・イントロン配列などの
ＲＮＡプロセシング配列、あるいはＣｐＧモチーフ等の
免疫刺激ＤＮＡ配列の１又は２以上のコピーを含んでい
てもよい。また、ベクターは、細菌の複製起点配列およ
び／または抗生物質耐性（例えば、カナマイシン）ある
いは非抗生物質耐性（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子）に用いられ得る選択マーカー用のＤＮＡ配列を含
んでいてもよい。

【００１７】本発明はまた、上記した本発明の組み換え
ＤＮＡを含む、ワクチンを提供する。ウイルスとしてＨ
ＩＶまたはＳＩＶなどのエイズウイルスを選択した場合
には、本発明の組み換えＤＮＡを含むワクチンはエイズ
ワクチンとして使用できる。本明細書において、「ワク
チン」という用語は免疫応答を生じ得る物質を意味す
る。本明細書において、「エイズワクチン」という用語
は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染予防ワクチン、ＨＩＶまた
はＳＩＶ感染によるエイズ発症の予防ワクチン、並びに
ＨＩＶまたはＳＩＶ感染症の治療ワクチンを含む広い意
味で用いられる。

【００１８】本発明のワクチンはヒトまたはサルなどの
哺乳動物に投与され、投与を受けた動物には、対応する
ウイルス疾患に対する免疫が生じる。本発明の組み換え
ＤＮＡによってコードされるウイルスの蛋白質が生体内
で合成され、これが抗原となって細胞傷害性Ｔ細胞が活
性化されて細胞性免疫が喚起され（場合によってはＢ細
胞も抗体産生細胞へと分化し、体液性免疫も喚起され
る）、ウイルスに対する免疫が生じることになる。細胞
性免疫が喚起されることは、エイズなどのウイルス疾患
の発症や進行の抑制にも有用であることから、本発明の
ワクチンを用いる免疫は、エイズなどのウイルス疾患の
予防のみでなく治療にも役立つものである。

【００１９】本発明のワクチンは、例えば、薬学的に許
容可能な担体（トランスフェクション試薬など）または
アジュバンドと一緒に配合して医薬組成物の形態で提供
することができる。

【００２０】本発明で用いることができる薬学的に許容
可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトラ
ンスフェクションするのに適したものである。このよう
な薬学的に許容可能な担体の具体例としては、リポソー
ム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランス
フェクション試薬が挙げられる。当業者はこのようなト
ランスフェクション試薬を用いて、本発明で用いるＤＮ
Ａを適宜処方することができる。

【００２１】医薬組成物を調製するために用いることが
できる免疫用アジュバントは当技術分野で周知である。
当業者は、医薬組成物を形成するための適切なアジュバ
ントを適宜選択することができる。本発明で用いること
ができるアジュバントの具体例としては、ＣｐＧアジュ
バント(Krieg A. 他、Nature 374, 546-549 (1995))な
どが挙げられる。本発明のワクチンは、カプセル剤、懸
濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の投与形態で
用いることができる。

【００２２】また、本発明のワクチンは、他のワクチン
と併用することができる。この場合、同時に投与する場
合と前後して投与する場合がありうる。具体例として
は、サブユニットワクチン、ウイルスベクターワクチ
ン、他のＤＮＡワクチン等との併用がある。

【００２３】単回投与量のワクチンＤＮＡを含む医薬組
成物を調製するために担体物質と組み合わせるべきワク
チンＤＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方
法、用いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現さ
れる抗原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活
性（免疫原性）、被験者の性別、年齢、体重、全体的な
健康状態、予防または治療の対象となるウイルス疾患の
種類やタイプ等を含む多くの要因に依存する。投与すべ
きＤＮＡの量はまた、薬学的に許容可能な担体（トラン
スフェクション試薬）およびアジュバンドの種類および
量にも依存する。

【００２４】本発明のワクチンをヒトに投与する場合、
対象となるウイルス疾患の予防または治療に有効な量で
投与されるが、一般的には、１μｇ〜２０００μｇを筋
肉あるいは皮膚に直接投与する。遺伝子銃を使用して本
発明のワクチンを投与することもできる。皮下注入、皮
内導入、経皮圧入及び他の投与法、例えば、腹腔内、静
脈内又は吸入投与、経口投与も可能であり、投与経路は
特に限定されない。また、追加免疫接種を行うことも可
能である。

【００２５】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのウイ
ルスのｅｎｖ遺伝子をフレンドマウス白血病ウイルス
（ＦＭＬＶ）のｅｎｖ遺伝子に置き換えることによって
作成したキメラ組み換えウイルスＤＮＡを、ＦＭＬＶの
レセプターをコードするＤＮＡと一緒に投与することに
よって、複製により比較的長期の高い抗原発現量を達成
して有効性を獲得すると同時に、感染される細胞をＦＭ
ＬＶのレセプターをコードするＤＮＡを保持する細胞に
限定することにより安全性を確保することにも成功した
ものである。本発明は従来にない全く新しいシステムに
よるワクチンを提供するものであり、これにより有効性
および安全性の両方の面で優れたワクチンを提供するこ
とが可能になった。以下の実施例により本発明をより具
体的に説明するが、本発明は実施例によって限定される
ことはない。

【００２６】

【実施例】（１）材料と方法 （ａ）ＤＮＡの調製 ＳＨＩＶ MD14YE（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176,
362-373(1997)）のＥｎｖ表面蛋白質（ＳＵ）をコード
する遺伝子断片を取り除き、ＦＭＬＶｅｎｖ遺伝子（Pa
tuleia,M.C.他、Cancer Res. 27:726-730(1967)；及びM
atano,T.,他、J.Virol. 67, 2026-2033(1993)）（フレ
ンドリッチの番号付によるヌクレオチド５７６９−７８
０５［GenBank accession no.X02794］（Koch,W.,他、
J.Virol.45:1-9(1983),26））に置き換え、ＦＭＳＩＶ
感染性クローンＤＮＡ（ＦＭＳＩＶ ＤＮＡ）を得た。
ｎｅｆ遺伝子の５’側を欠失させた。即ち、ＦＭＳＩＶ
ＤＮＡは、ＳＩＶ由来のＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉ
ｆ及びｖｐｘと、ＨＩＶ−１由来のｔａｔ及びｒｅｖ
と、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖを有する。図２に、ＦＭＳＩ
Ｖ ＤＮＡの構造を示す。図２において、白い部分はＳ
ＩＶ由来の領域を示し；点線の部分はＨＩＶ−１由来の
領域を示し；黒い部分はＦＭＬＶ由来の領域を示す。な
お、参考のために図１には、ＨＩＶ−１由来のｇａｇと
ｐｏｌと、ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み
換えウイルスＤＮＡであるＦＭＨＩＶの構造を示す模式
図を示す。

【００２７】２種類のｍＣＡＴ１ ＤＮＡ（ｍＣＡＴ１
発現プラスミドＤＮＡ）を使用した。一つ目のｐＪＥＴ
（Albritton,L.M.,他、Cell 57, 659-666(1989)）は、
J.M.Cunningham氏から供与されたものである。二つ目の
ｐＣＭＶｍＣＡＴ１は、ｐＣＭＶβ（クローンテック
社）からβ−ｇａｌ遺伝子を取り除き、ｍＣＡＴ１をコ
ードする遺伝子に置き換えることによって構築した。

【００２８】（ｂ）マカクサル 動物個体におけるＦＭＳＩＶの複製の確認実験には、１
頭のカニクイサルを使用した。ワクチン接種実験には、
年齢が同じ5頭の雄の赤毛サルを使用した。サルは全て
ＳＩＶ、ＳＲＶ（サルＤ型レトロウイルス）、およびサ
ルＴリンパ球性白血病ウイルス１型に対して陰性である
ことを試験した。血液採取、リンパ節（ＬＮ）生検、ワ
クチン接種、およびウイルス接種はケタミン麻酔下で行
った。

【００２９】（ｃ）ＤＮＡ−ＰＣＲ ＤＮＡはリンパ節（ＬＮ）リンパ球から調製し、ネステ
ィドＤＮＡ ＰＣＲは既報の通り（Shibata,R.,他、J.In
fect.Dis. 176, 362-373(1997)）行った。１ｓｔＰＣＲ
で用いたプライマーはTGGCAGATTGAGCCCTGG（配列番号
１）およびCCTCTTCCTCTGACAGGCC（配列番号２）であ
る。２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーは、AAGCTAGTGTGT
GTTCCCATC（配列番号３）およびAACTCGAGCTTCCAAACTCTT
CTGGG（配列番号４）である。

【００３０】（ｄ）ＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）
のＳＩＶ Ｇａｇ特異的誘導 ＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞)は、既報の通り（Shibata,
R.,他、J.Infect.Dis.176, 362-373(1997)）全血液試料
から調製し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Hyclon
e）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Life Technologie
s）中で培養した。ＳＩＶＧａｇを発現する組み換えセ
ンダイウイルスベクター（SeV-SIVgag）に感染したＰＢ
ＭＣをＳＩＶ Ｇａｇ特異的刺激用細胞として使用し、
対照センダイウイルスベクター（SeV-Control）に感染
したＰＢＭＣを非特異的刺激用細胞として使用した（Ha
san,M.他、J.Gen.Virol., 78, 2813-2820(1997)）。Ｓ
ＩＶＧａｇ特異的刺激培養を、９６ウエルプレートのウ
エル当たり５×１０⁵のＰＢＭＣと１×１０⁵のＧａｇ特
異的刺激用細胞とを混合することにより開始し、非特異
的刺激培養を、５×１０⁵のＰＢＭＣと１×１０⁵の非特
異的刺激用細胞とを混合することにより開始した。混合
培養開始後３日目から、細胞を１０ユニット／ｍｌのヒ
トインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Boehringer-Man
nheim）を含有する培地中で培養した。上清を３日目と
６日目に回収し、上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡ
（Biosourse）で定量した。このアッセイにおける検出
の下限値は１５ｐｇ／ｍｌである。ＮＤは未測定を示
す。

【００３１】（ｅ）ＣＴＬアッセイ Ｇａｇ特異的刺激培養におけるＰＢＭＣをエフェクター
細胞として使用した。それぞれのサル個体から得たＰＢ
ＭＣにヘルペスウイルスパピオを感染させて確立したＢ
細胞株に、ＳＩＶ Ｇａｇを発現する組み換えワクシニ
アウイルスベクター（Ｖｖ−ＳＩＶｇａｇ）を感染させ
た細胞を、ＳＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＴＬの標的細胞とし
て使用し、対照ワクシニアウイルスベクター（Ｖｖ−Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ）を感染させたＢ細胞を、非特異的標的細
胞として使用した（Voss,G.,他、J.Virol.Methods 39,
185-95(1992)；及びMackett,M., Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA79, 7415-9 (1982)）。⁵¹Ｃｒ−放出アッセイは既報
の通り（Voss,G.,他、Virology 208, 770-775(1995)）
行った。アッセイでは１０％を超える値について陽性と
判断した。

【００３２】（ｆ）ＲＴ−ＰＣＲ 血漿ＲＮＡをHigh Pure Viral RNAキット（Boehringer-
Mannheim）を使用して抽出した。逆転写および１ｓｔＰ
ＣＲはＲＮＡ ＰＣＲキット（Takara）を用いて行っ
た。以下のＳＩＶｅｎｖ−特異的プライマーを使用し
た；１ｓｔＰＣＲで用いたプライマーは、ATGGGATGTCTT
GGGAATC（配列番号５）およびCCAAATCTGCAGAGTACCAAG
（配列番号６）であり、２ｎｄＰＣＲで用いたプライマ
ーは、CAGCTTGGAGGAATGCG（配列番号７）およびCTTGTTC
CAAGCCTGTGC（配列番号８）である。ＲＮＡ試料の定量
は、既報の通り（Shibata,R.,他、J.Infect.Dis. 176,
362-373(1997)；及びReed,L.J.,他、Am.J.Hyg.27, 493-
497(1938)）、限界希釈法に基づいておこなった。この
アッセイにおける検出の下限値は１．０×１０²コピー
／ｍｌであった。

【００３３】（２）方法と結果 （ａ）ＦＭＳＩＶ複製 ＦＭＳＩＶ ＤＮＡは、キメラのサル/ヒト免疫不全ウ
イルス（ＳＨＩＶ）感染性クローンＤＮＡからそのｅｎ
ｖをＦＭＬＶｅｎｖに置き換えることによって構築した
（図２を参照）。ＦＭＳＩＶの発現および感染を培養霊
長類細胞株で試験した。

【００３４】図３には、ＦＭＳＩＶの発現の結果を示
す。細胞を１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Life T
echnologies）中で培養し、６ウエルプレートの各ウエ
ル中のＣＯＳ−１細胞にリポフェクトアミン（Life Tec
hnologies）を用いて２μｇの図２に示したＤＮＡをト
ランスフェクションし、上清を２日後に回収した。上清
中のｐ２７の濃度はＥＬＩＳＡ（Coulter）により定量
した。図３において、ＦＭＬＶはＦＭＬＶ感染性クロー
ンＤＮＡ（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(199
3)）を示し、ＦＭＳＩＶはＦＭＳＩＶ感染性クローンＤ
ＮＡを示し、ＳＨＩＶはＳＨＩＶ MD14YE感染性クロー
ンＤＮＡを示す。

【００３５】図４には、ＦＭＬＶＥｎｖの発現の結果を
示す。ＤＮＡトランスフェクションまたはＦＭＳＩＶ感
染の２日後に、細胞を［³⁵Ｓ］メチオニン及び［³⁵Ｓ］
システインを含有する［³⁵Ｓ］Ｐｒｏ−ｍｉｘ（Amersh
am）で標識した。ポリクローナル抗−ｇｐ７０（ＭＬＶ
ＳＵ）抗体（National Cancer Institute, lot79S000
713）を用いて細胞ライセート（レーン１〜４）又はウ
イルスペレット（レーン５〜６）の免疫沈降を既報の通
り（Matano,T.,他、J.Virol.67, 2026-2033(1993)；及
びMatano,T.,他、J.Gen.Virol.76, 3165-3169(1995)）
行った。図４において、レーン１と６はＦＭＬＶ Ｅｎ
ｖ発現プラスミドＤＮＡでトランスフェクションしたＣ
ＯＳ−１細胞の結果を示し、レーン２はＳＨＩＶ MD14Y
EＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の
結果を示し、レーン３と５はＦＭＳＩＶ ＤＮＡでトラ
ンスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の結果を示し、レ
ーン４はｍＣＡＴ１発現プラスミドＤＮＡでトランスフ
ェクションし、ＦＭＳＩＶを感染させたＣＯＳ−１細胞
の結果を示す。

【００３６】図３および図４の結果から分かるように、
ＦＭＳＩＶ ＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ
−１細胞は、その上清中にＳＩＶ Ｇａｇキャプシド蛋
白質ｐ２７を発現し（図３を参照）、ＦＭＬＶ Ｅｎｖ
は上清からのウイルスペレットに検出された（図４を参
照）。これらの結果は、ＦＭＬＶ Ｅｎｖを有するキメ
ラＳＩＶであるＦＭＳＩＶの産生を示している。

【００３７】ＦＭＳＩＶ上清を使用して偽トランスフェ
クションまたはｍＣＡＴ１をトランスフェクションした
ＣＯＳ−１細胞に感染させ、ＦＭＳＩＶ感染性を試験し
た。６ウエルプレートの各ウエルのＣＯＳ−１細胞に偽
−またはｍＣＡＴ１−発現プラスミドＤＮＡをトランス
フェクションし、１日後、１ｍｌのＦＭＳＩＶまたはＳ
ＨＩＶ（ＦＭＳＩＶまたはＳＨＩＶ MD14YEをトランス
フェクションしたＣＯＳ−１細胞からの濾過上清）と一
緒に培養した。４時間のインキュベーション後に、上清
を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２
回洗浄し、培養液を加えて培養した。３日後、上清を回
収し、そのｐ２７濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結
果を図５に示す。

【００３８】図５に示される通り、ｐ２７産生は、ｍＣ
ＡＴ１でトランスフェクションした後ＦＭＳＩＶを加え
た細胞のみで観察された。免疫沈降分析によって、ＦＭ
ＬＶＥｎｖの発現をＦＭＳＩＶを感染させたｍＣＡＴ１
トランスフェクションＣＯＳ−１細胞で確認した（図４
を参照）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶはＣＯＳ−１細
胞には感染できないが、ｍＣＡＴ１発現ＣＯＳ−１細胞
には感染できることを示している。

【００３９】ＦＭＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ１ ＤＮＡ
の両方を投与した場合にインビボにおいてＦＭＳＩＶの
複製を誘導できるかどうかを試験するために、１００μ
ｇのＦＭＳＩＶ ＤＮＡと１００μｇのｍＣＡＴ１ Ｄ
ＮＡとを１頭のカニクイサルの外科的に露出した左側鼠
蹊リンパ節（ＬＮ）に注入した。１００μｇのＦＭＳＩ
Ｖ ＤＮＡのみを対照として反対側(右側)の鼠蹊ＬＮに
注入した。ＤＮＡ注入の１週間後に得た各ＬＮからＤＮ
Ａを調製し、ネスティドＰＣＲに付した。ＳＩＶ ２−
ＬＴＲ環状ＤＮＡ（Coffin,J.M.,他、Retroviruses, CS
HL press, N.Y.(1997)）は、右側のＬＮでは検出されず
左側のＬＮで検出された（図６を参照）。図６におい
て、レーン１は、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡを注入した右側の
ＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示し、レー
ン２は、ＦＭＳＩＶとｍＣＡＴ１のＤＮＡを注入した左
側のＬＮのリンパ球から調製したＤＮＡの結果を示す。
２−ＬＴＲ環状ＤＮＡを示す予測されたＰＣＲ産物は、
４４５ベースペア（ｂｐ）の長さであった（図６におい
て矢印で示す）。レーン３は、ＤＮＡ分子量マーカーを
示す（Life Technologies）。上記の結果は、インビボ
でのＦＭＳＩＶ複製を示している。

【００４０】（ｂ）細胞性免疫応答の誘導 以下の表１に示す通り５頭の年齢が同じ雄の赤毛サルを
用いることによって各々のワクチン投与系を評価した。

【００４１】

【表１】

【００４２】３頭の赤毛サル（２０２９７１１０２０
（＃２０）、２０２９７１１０２１（＃２１）および２
０２９７１１０１８（＃１８））にＦＭＳＩＶ ＤＮＡ
およびｍＣＡＴ１ ＤＮＡの両方をワクチン接種した。
マカクサル＃２０には、最初のＤＮＡ注入後０、１、
２、６及び１２週目に、１００μｇのＦＭＳＩＶ ＤＮ
Ａと１００μｇのｍＣＡＴ１ ＤＮＡの筋肉内投与、お
よび５μｇのＦＭＳＩＶＤＮＡと５μｇのｍＣＡＴ１
ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。マカクサル＃２
１および＃１８には、０、１、２、６及び１２週目に、
２００μｇのＦＭＳＩＶ ＤＮＡと２００μｇのｍＣＡ
Ｔ１ ＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇのＦＭＳＩ
Ｖ ＤＮＡと１０μｇのｍＣＡＴ１ ＤＮＡの遺伝子銃
による投与を行った。マカクサル＃１８にはさらに２回
の追加の処置を施した。先ず、１μｇのＦＭＳＩＶ Ｄ
ＮＡと１μｇのｍＣＡＴ１ ＤＮＡを外科的に露出した
鼠蹊ＬＮに遺伝子銃によって０週目に注入した。次に、
皮膚から調製した同原ファイブロブラスト様細胞にＦＭ
ＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ１ ＤＮＡを各々インビトロ
でトランスフェクションした。２日後に、両方の細胞を
混合し、１日間一緒に培養し、マカクサル＃１８に筋肉
内注入した。マカクサル２０２９７１１０１７（＃１
７）には、０、１、２、６及び１２週目に、２００μｇ
のＦＭＳＩＶ ＤＮＡの筋肉内投与、および１０μｇの
ＦＭＳＩＶ ＤＮＡの遺伝子銃による投与を行った。こ
のマカクサル＃１７における、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみ
の投与は、従来のような複製を生じないタイプのＤＮＡ
ワクチンに相当する対照ワクチンとして用いられた。

【００４３】ワクチン接種により誘発されるＳＩＶＧａ
ｇ特異的細胞性免疫を調べる目的で、ワクチン接種開始
後７週目と１４週目にマカクサルから採取した血液より
分離したＰＢＭＣ(末梢血液単核細胞）を、ＳＩＶＧａ
ｇ発現細胞との混合培養によって刺激した。混合培養開
始後３日目および６日目に回収した上清中におけるイン
ターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ)の濃度をＥＬＩＳＡ
を用いて測定した（この結果を図７に示す）。ＩＦＮ−
γは、ＴＨ１サイトカインの一つである（Leonard, W.
J., p.741-774, In paul, W.E.(ed.), Fundamental imm
unology, 4th ed., Lippincott-Raven Publishers, Phi
ladelphia (1999)）。図７の黒グラフは、ＳＩＶ Ｇａ
ｇ特異的刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度であり、白グ
ラフは、対照実験となる非特異的刺激培養上清中のＩＦ
Ｎ−γ濃度である。

【００４４】対照実験としてＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみを
ワクチン接種したマカクサル＃１７においては、ＳＩＶ
Ｇａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導は認められなか
った。一方、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ１ ＤＮＡ
の両方をワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、
＃２１及び＃１８）では、３頭すべてにおいて、ＳＩＶ
Ｇａｇ特異的刺激によるＩＦＮ−γ誘導が検出された
(図７参照)。マカクサル＃２１は、７週目においてマカ
クサル＃２０よりも効率的なＩＦＮ−γ誘導を示した
が、これらはともに１４週目には同様のレベルのＩＦＮ
−γ誘導を示した。ＳＩＶＧａｇ特異的ＴＨ１サイトカ
イン誘導はマカクサル＃１８において最も効率的であっ
た。

【００４５】さらにＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ(細胞傷
害性Ｔリンパ球）活性を測定した。ここでは、ＳＩＶＧ
ａｇ発現組み換えワクシニアウイルスベクター(Ｖｖ−
ＳＩＶｇａｇ)を感染させたＢ細胞を、ＳＩＶＧａｇ特
異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用し（図８中
において、Ｏで示す）、対照ワクシニアウイルスベクタ
ー(Ｖｖ−Ｃｏｎｔｒｏｌ)を感染させたＢ細胞を、非特
異的ＣＴＬ反応における標的細胞として使用した（図８
中において、×で示す）。図８に示す通り、ＳＩＶＧａ
ｇ特異的ＣＴＬ活性はＦＭＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ１
ＤＮＡの両方をワクチン接種した３頭のマカクサル
(＃２０、＃２１、＃１８)全てにおいて検出されたが、
ＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみを投与したマカクサル＃１７で
は検出されなかった。これらの結果は、ＦＭＳＩＶ Ｄ
ＮＡのみによるワクチンと比較して、本発明によるＦＭ
ＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ１ ＤＮＡの両方を用いたワ
クチンは、ＳＩＶ特異的細胞性免疫を、より効率よく誘
導することを示している。

【００４６】（ｃ）ＳＩＶｍａｃ２３９感染に対する抵
抗性 ワクチン接種した４頭の赤毛サル(＃１７、＃２０、＃
２１、＃１８)および未接種の対照マカクサル２０２９
７１１０２２（＃２２）に対して、２４週目に、１００
ＴＣＩＤ₅₀のＳＩＶｍａｃ２３９ウイルス（Kestler,
H.,他、Science 248, 1109-1112(1990)；およびLewis,
M.G.,他、AIDS Res.Hum.Retroviruses 10, 213-220(199
4)）を静脈内接種した（表１を参照）。ＳＩＶ接種後、
血漿中のＳＩＶ ＲＮＡコピー数（図９）、血漿中のｐ
２７濃度（図１０）、体重（図１１）、末梢血液中のＣ
Ｄ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（図１２）を測定した。図
１０のｐ２７濃度の検出下限値は１００ｐｇ／ｍｌであ
る。図１１において、体重の相対値(Relative body wei
ght)は、ＳＩＶ接種時点の体重を１００とし、このＳＩ
Ｖ接種時点の体重に対する相対値で示した。また、ＣＤ
４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の測定（図１２）において
は、モノクローナルマウス抗−ヒトＣＤ４抗体（Becton
Dickinson, CD4-PE[Leu-3a]）及びモノクローナルマウ
ス抗−ヒトＣＤ２９抗体（Coulter, 4B4-FITC）を用い
てフローサイトメトリーを行って測定した。

【００４７】ワクチン未接種の対照マカクサル＃２２に
おいて、血漿中のＳＩＶウイルス量は、ＳＩＶ接種後２
週目にピーク(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は１×１０⁷／ｍ
ｌ以上、ｐ２７濃度は１×１０⁴／ｍｌ以上)を示し、そ
の後も高値(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は１×１０⁷／ｍｌ
以上、ｐ２７濃度は１×１０³／ｍｌ以上)を維持した
（図９、図１０）。ＳＩＶ接種後、著しい体重減少およ
び末梢血中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数の減少が認め
られ（図１１、図１２）、１７週目に重症の下痢を伴っ
て死亡した。解剖所見として、リンパ節・脾臓の萎縮が
みられ、リンパ球は脱落(涸渇)していた。

【００４８】ＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみをワクチン接種し
たマカクサル＃１７は、ワクチン未接種の対照マカクサ
ル＃２２と比較して、ＳＩＶ接種後の血漿ＳＩＶウイル
ス量は低値を示し、ＳＩＶ接種後２週目のＳＩＶ ＲＮ
Ａコピー数はマカクサル＃２２の約１／１０であった
(図９)。血漿ｐ２７も低値であったが、検出可能レベル
であった（図１０）。血漿ウイルス量は、ＳＩＶ感染急
性期の後、一度は低下したが(ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は
おおよそ約１×１０⁵／ｍｌ、ｐ２７は検出限界レベル
以下)、１５週目から再び上昇し始めた(図９、図１
０)。体重はＳＩＶ感染急性期にわずかな減少を示し、
その後増加に転じたが、１５週目に再度減少し始めた
（図１１）。マカクサル＃２２と同様、末梢血中ＣＤ４
陽性ＣＤ２９陽性細胞数は、ＳＩＶ接種後減少した（図
１２）。これらの結果は、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみによ
るワクチン接種では、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)
の発病を防止するのに不十分であることを示している。

【００４９】ＦＭＳＩＶ ＤＮＡ及びｍＣＡＴ１ ＤＮ
Ａをワクチン接種した３頭のマカクサル（＃２０、＃２
１及び＃１８）では、ＳＩＶ接種後、感染は成立した
が、血漿ＳＩＶウイルス量は、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡのみ
のワクチン接種をしたマカクサル＃１７と比較して有意
に低値を示した。血漿中ＳＩＶ ＲＮＡコピー数は、マ
カクサル＃１７の場合の１／１０以下であり、マカクサ
ル＃２２の１／１００以下であった（図９）。血漿中ｐ
２７は検出されなかった（図１０）。体重変化について
は、ＳＩＶ感染急性期に若干の増加遅延を示しただけで
あった（図１１）。末梢血液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽
性細胞数については、マカクサル＃２０及び＃２１で
は、ＳＩＶ感染急性期に一時的な減少を示したが、１２
週目には接種前のレベルに回復した（図１２）。マカク
サル＃１８では、末梢血液中ＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細
胞数の有意な減少は認められなかった。よって、ＦＭＳ
ＩＶＤＮＡおよびｍＣＡＴ１ ＤＮＡのワクチン接種に
より、ＳＩＶ感染による疾患(免疫不全)の発病を遅延ま
たは防止できる可能性が示された。以上の結果は、本発
明によるＦＭＳＩＶ ＤＮＡおよびｍＣＡＴ１ ＤＮＡ
の両方を用いたワクチンが、従来の方法より効率よく感
染防御免疫を誘導できること、つまりその有効性を示し
ている。

【００５０】図３、図４、図５、図６に示した結果か
ら、培養細胞レベルだけでなく、サル個体レベルにおい
ても、ＦＭＳＩＶの複製は、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡ単独投
与では誘導できないが、ＦＭＳＩＶ ＤＮＡとｍＣＡＴ
１ ＤＮＡの両者を投与することにより可能となること
が明らかとなった。従って、このＦＭＳＩＶ複製は、ｍ
ＣＡＴ１発現細胞のみに限局されていると考えられる。
さらに、ワクチン接種後３週目、１４週目、２４週目の
血漿中ＦＭＳＩＶ ＲＮＡを、ＦＭＬＶｅｎｖ特異的プ
ライマーを用いたＰＣＲにて調べたが、検出レベル以下
であった。これらの結果は、このＦＭＳＩＶ複製の安全
性を示している。以上により、本発明によるＦＭＳＩＶ
ＤＮＡとｍＣＡＴ１ ＤＮＡの両者を用いたワクチン
は、安全かつ効果的にエイズウイルスに対する防御免疫
を付与することができることが確認された。

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば、ＨＩＶまたはＳＩＶの
感染の予防、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染によるエイズの予
防あるいは治療などに効果的でかつ安全なＤＮＡワクチ
ンを提供することができる。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tetsuro Matano et al <120> DNA vaccine <130> A01435A <160> 8 <210> 1 <211> 18 ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ｏｔｈｅｒ ＤＮＡ ＜４００＞ １ ｔｇｇｃａｇａｔｔｇ ａｇｃｃｃｔｇｇ １８ ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ １９ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ｏｔｈｅｒ ＤＮＡ ＜４００＞ ２ ｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃ ｔｇａｃａｇｇｃｃ １９ ＜２１０＞ ３ <211> 21 <212> DNA <213> other DNA <400> 3 aagctagtgt gtgttcccat c 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> other DNA <400> 4 aactcgagct tccaaactct tctggg 26 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> other DNA <400> 5 atgggatgtc ttgggaatc 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> other DNA <400> 6 ccaaatctgc agagtaccaa g 21 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> other DNA <400> 7 cagcttggag gaatgcg 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> other DNA <400> 8 cttgttccaa gcctgtgc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＩＶ−１由来のｇａｇとｐｏｌと、
ＦＭＬＶ由来のｅｎｖとを有するキメラ組み換えＤＮＡ
であるＦＭＨＩＶの構造を示す模式図である。

【図２】図２は、実施例で用いたキメラ組み換えＤＮＡ
であるＦＭＳＩＶの構造を示す模式図である。

【図３】図３は、ＦＭＳＩＶの発現を示すグラフであ
る。

【図４】図４は、ＦＭＬＶ Ｅｎｖの発現を示す写真で
ある。

【図５】図５は、ＦＭＳＩＶの感染を示すグラフであ
る。

【図６】図６は、サル個体でのＦＭＳＩＶ複製を示す写
真である。

【図７】図７は、ＩＦＮ−γのＳＩＶＧａｇ特異的誘導
を示すグラフである。

【図８】図８は、ＳＩＶＧａｇ特異的ＣＴＬ活性を示す
グラフである。

【図９】図９は、ＳＩＶを接種したサルにおける血漿Ｓ
ＩＶ ＲＮＡコピー数（コピー／ｍｌ）の変化を示すグ
ラフである。

【図１０】図１０は、ＳＩＶを接種したサルにおける血
漿ｐ２７濃度（ｐｇ／ｍｌ）の変化を示すグラフであ
る。

【図１１】図１１は、ＳＩＶを接種したサルにおける体
重の変化を示すグラフである。

【図１２】図１２は、ＳＩＶを接種したサルにおける血
液中のＣＤ４陽性ＣＤ２９陽性細胞数（／μｌ）の変化
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスのコアタンパク質の少なくとも
   一部をコードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイ
   ルス（ＦＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコ
   ードするＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ウイルスのコアタンパク質の少なくとも
   一部をコードするＤＮＡが、レトロウイルスのＧａｇ蛋
   白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと、レトロウ
   イルスのＰｏｌ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤ
   ＮＡである、請求項１に記載の組み換えウイルスＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス
   （ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）であ
   る、請求項２に記載の組み換えウイルスＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ウイルスのコアタンパク質の少なくとも
   一部をコードするＤＮＡが、コードされる蛋白質が免疫
   原性を有し、当該蛋白質によってウイルス粒子が再構成
   されるようなＤＮＡである、請求項１から３のいずれか
   １項に記載の組み換えウイルスＤＮＡ。
5. 【請求項５】 フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬ
   Ｖ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮ
   Ａが、当該ＤＮＡを含む組み換えウイルスＤＮＡ由来の
   ウイルスがＦＭＬＶレセプターを発現しないヒトまたは
   サルの細胞には感染不可能で、ＦＭＬＶレセプターを発
   現する細胞には感染可能であるようなＤＮＡである、請
   求項１から４のいずれか１項に記載の組み換えウイルス
   ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ウイルスのコアタンパク質をコードする
   ＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬＶ）
   のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮＡと
   を有する、組み換えウイルスＤＮＡ。
7. 【請求項７】 レトロウイルスのＧａｇ蛋白質をコード
   するＤＮＡと、レトロウイルスのＰｏｌ蛋白質をコード
   するＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＭＬ
   Ｖ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードするＤＮ
   Ａとを有する、組み換えウイルスＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または
   サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＧａｇ蛋白質をコー
   ドするＤＮＡと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）また
   はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＰｏｌ蛋白質をコ
   ードするＤＮＡと、フレンドマウス白血病ウイルス（Ｆ
   ＭＬＶ）のＥｎｖ蛋白質の少なくとも一部をコードする
   ＤＮＡとを有する、組み換えウイルスＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項１から８の何れか１項に記載の組
   み換えウイルスＤＮＡを含む、ワクチン。
10. 【請求項１０】 エイズワクチンである、請求項９に記
    載のワクチン。
11. 【請求項１１】 ＦＭＬＶレセプターをコードするＤＮ
    Ａを有する発現ベクターと一緒に用いられる、請求項９
    又は１０に記載のワクチン。
12. 【請求項１２】 請求項１から８の何れか１項に記載の
    組み換えウイルスＤＮＡと、ＦＭＬＶレセプターをコー
    ドするＤＮＡを有する発現ベクターとを含む、ワクチ
    ン。
13. 【請求項１３】 エイズワクチンである、請求項１２に
    記載のエイズワクチン。